Alginat v dostavnih sistemih s prirejenim sproøœanjem Alginate in controlled drug delivery systems Polona Smrdel, Marija Bogataj, Aleš Mrhar Povzetek Dostavni sistemi s prirejenim sproøœanjem nudijo v mnogih primerih, tako s staliøœa uœinkovitosti kot tudi varnosti, prednost pred farmacevtskimi oblikami s takojønjim sproøœanjem. Za doseganje prirejenega sproøœanja zelo pogosto uporabimo najrazliœnejøe polimere. Alginat je naraven polisaharid, ki ga pridobivamo iz razliœnih vrst rjavih alg. Je linearen polimer, sestavljen iz homogenih odsekov D- manuronske in L-guluronske kisline in odsekov, kjer se kislini izmenjujeta. Njegova lastnost je tvorba dveh vrst gelov – t.i. kislinski gel v kislem in ionotropni gel v prisotnosti veœvalentnih kationov. Zaradi sposobnosti geliranja in nabrekanja ter nekaterih drugih lastnosti je zelo primeren za pripravo dostavnih sistemov s prirejenim sproøœanjem. Priprava alginatnega ogrodja pod milimi pogoji omogoœa tudi vgradnjo celic in biomolekul, kot so proteini, encimi in DNK, brez izgube bioloøke aktivnosti. Izbira ustreznega tipa alginata in strukture ter sestave dostavnega sistema omogoœa pripravo farmacevtske oblike s œasovno in/ali prostorsko nadzorovanim sproøœanjem. Kljuœne besede: alginat, ogrodni sistem, ionotropno geliranje, prirejeno sproøœanje Abstract Controlled drug delivery systems frequently offer significant benefit in comparison with immediate release dosage forms from the efficiency and safety viewpoint. Controlled release can be achieved using various polymers. Alginate is naturally occurring polysaccharide extracted from kelp. It is linear polymer, composed of homopolymeric D-mannuronic and L-guluronic acid blocks and heteropolymeric blocks where the monomers alternate. An important property is the formation of two types of gel, i.e. an acid gel in acidic medium and ionotropic gel in the presence of multivalent cations. Due to its ability to gel and swell and some other properties, alginate is very suitable for the design of controlled release drug delivery systems. Furthermore, the preparation of alginate matrix under mild conditions enables also the incorporation of cells and biomolecules like proteins, enzymes and DNA with retention of full biological activity. By the selection of an appropriate type of alginate and structure and composition of drug delivery system time and/or region controlled delivery can be achieved. Key words: alginate, matrix system, ionotropic gelation, controlled release 1 Uvod Razvoj sistemov s prirejenim sproøœanjem uœinkovine je izredno napredoval, saj uporaba tovrstnih sistemov v primerjavi s farmacevtskimi oblikami s takojønjim sproøœanjem v mnogih primerih nudi vrsto prednosti, ki se odraæajo v uœinkovitejøem, varnejøem in pacientu sprejemljivejøem naœinu zdravljenja (1). S farmacevtskim oblikami s prirejenim sproøœanjem lahko sproøœanje uœinkovine œasovno in prostorsko nadzorujemo, kar omogoœa zmanjøanje dnevnih odmerkov in øtevila odmerjanj ter pripomore k manjøemu nihanju plazemskih koncentracij uœinkovine, vse to pa prispeva k manj izraæenim stranskim uœinkom in uœinkovitejøi terapiji Prirejeno sproøœanje najpogosteje doseæemo z uporabo polimerov, ki tvorijo ogrodni sistem ali oblogo, ki kontrolirata sproøœanje uœinkovine Med obilico danes dostopnih polimerov postajajo vedno bolj zanimivi nekateri naravni polisaharidi, katerih glavne prednosti v primerjavi s sinteznimi so netoksiœnost, øiroka dostopnost in niæja cena (2). V skupino naravnih polisaharidov spada tudi alginat, ki se æe dalj œasa uporablja v prehrambeni industriji kot zgoøœevalo, gelirno sredstvo in utrjevalo, vedno bolj pogosto pa ga lahko sreœamo tudi v farmacevtski industriji. Namen œlanka je predstaviti moænosti uporabe alginata v farmaciji s poudarkom na ogrodnih sistemih s prirejenim sproøœanjem. 2 Alginat 2.1 Struktura alginata Alginska kislina je naraven polisaharid, ki se v glavnem nahaja v razliœnih vrstah rjavih morskih alg v obliki kalcijevih, natrijevih, stroncijevih, barijevih in magnezijevih soli. Kemijsko je to linearen nerazvejan polisaharid, sestavljen iz monomernih enot, b-D-manuronske (M) in a-L-guluronske (G) kisline, povezanih z 1,4 glikozidno vezjo. Kislini sestavljata homogene poli-M in poli-G odseke, ki so loœeni s predeli, kjer se monomerni enoti izmenjujeta (MG, slika 1). Fizikalne lastnosti alginata so odvisne od molekulske mase in sestave (razmerja med monomernimi enotami in dolæine posameznih dr. Polona Smrdel, mag. farm., Katedra za biofarmacijo s farmakokinetiko, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana, in Lek d.d., Verovøkova 57, 1526 Ljubljana izr. prof. dr. Marija Bogataj, mag. farm., Katedra za biofarmacijo s farmakokinetiko, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana prof. dr. Aleø Mrhar, mag. farm., Katedra za biofarmacijo s farmakokinetiko, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aøkerœeva 7, 1000 Ljubljana farm vestn 2008; 59 293 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles blokov). Slednjo pogojujejo vrsta organizma in del alge, iz katere se alginat pridobiva, pa tudi rastiøœe in letni œas æetve (3-6). 2.2 Tvorba gela Alginska kislina je v neionizirani obliki v vodi netopna, medtem ko je topnost njenih soli odvisna tako od pH kot od vrste prisotnih kationov. Alginat tvori dve vrsti gela: • kislinski gel: pri doloœenih pogojih lahko z zniæevanjem pH raztopine pod pKa guluronske (pKa= 3.65) in manuronske (pKa = 3.38) kisline preide raztopina alginata iz sol v gel stanje in nastane t.i. kislinski gel, ki je domnevno stabiliziran z intramolekularnimi vodikovimi vezmi. Zniæevanje pH-ja mora potekati poœasi, saj se ob hitri spremembi pH alginska kislina izobori. Glavni gradniki tega gela so poliguluronski odseki, vendar pa k tvorbi gela nekoliko prispevajo tudi polimanuronski odseki. Najmoœnejøi gel nastane iz Slika 1: Struktura polimanuronskega (M) in poliguluronskega (G) odseka alginata ter odseka, kjer se manuronski in guluronski kislini izmenjujeta (MG) (4). Figure 1: Structure of polymannuronic (M) and polyguluronic (G) blocks of alginate and block with alternating sequence of uronic acids (MG) (4). Slika 2: Shematski prikaz nastanka ionotropnega gela z modelom økatle za jajca (4) Figure 2: Shematic presentation of ionotropic gelation process using egg box model (4). alginatov z visokim deleæem guluronskih odsekov in nizkim deleæem alternirajoœih odsekov (9, 10). • ionski (ionotropni) gel: nastane z interakcijo veœvalentnih kationov, kot so Ca2+, Ba2+, Sr2+, Al3+, itd in polimernih verig. Izjema so alginatne soli magnezijevih ionov, ki tako kot soli monovalentnih ionov tvorijo v vodi viskozne koloidne raztopine. Pri ionotropnem geliranju gre za izmenjavo natrijevih ionov s soli guluronskih kislin z npr. Ca2+ ioni, ki poveæejo odseke guluronskih kislin in povzroœijo njihovo preureditev tako, da nastane urejena tridimenzionalna struktura, dodatno stabilizirana z vodikovimi vezmi, ki spominja na økatlo za jajca (slika 2). Interakcije niso le elektrostatske narave, temveœ tudi koordinativne z veœvalentnim kationom kot kelatnim centrom. Za razliko od kislinskega gela, v tem primeru k tvorbi gela prispevajo le poliguluronski odseki, ki imajo zaradi prostorske razporeditve kisikovih atomov v hidroksilnih in karboksilnih skupinah veœjo afiniteto do veœvalentnih kationov (4, 5, 10, 11). Dejavniki, ki vplivajo na lastnosti ionotropnega gela, so predstavljeni v Preglednici 1. 2.3 Uporaba alginata v farmaciji Sposobnosti geliranja in nabrekanja omogoœata øiroko uporabo alginata v farmaciji. Nekateri avtorji govorijo tudi o mukoadhezivnosti alginata. V øtevilnih preglednih œlankih pa so navedene tudi druge lastnosti alginata, kot so biokompatibilnost, biorazgradljivost in netoksiœnost, œeprav je o teh lastnostih relativno malo podatkov, ki si vœasih celo nasprotujejo (4, 5, 6, 7). V prebavnem traktu se alginat razgradi v debelem œrevesju z encimi, ki jih izloœajo bakterije kolonske mikroflore. Pri peroralni uporabi alginata ni bilo opaæenih veœjih imunskih reakcij in avtorji (6) za ta naœin aplikacije navajajo, da je alginat netoksiœen in biorazgradljiv polimer. Glede biokompatibilnosti in biorazgradljivosti alginatnih vsadkov pa v literaturi najdemo nasprotujoœe si podatke. Nekateri avtorji navajajo, da v æivalsko tkivo implantirano alginatno ogrodje na mestu vsadka ne povzroœa izrazitega vnetja (imunogenost naj bi bila posledica neœistot v alginatu) in da ogrodje s œasom izgine, se resobira (4, 5), drugi pa ugotavljajo, da alginat na mestu vsadka povzroœi fibrotiœno reakcijo, se ohrani dalj œasa in ga je potrebno operativno odstraniti (13). V sistemih s prirejenim sproøœanjem za peroralno aplikacijo lahko alginat uporabimo kot ogrodni polimer za izdelavo veœenotnih ogrodnih sistemov ali enoenotnih ogrodnih tablet, kot polimer za oblaganje farmacevtskih oblik ali za izdelavo mikrokapsul (3, 4, 14). Alginat pa uporabljamo tudi v oblogah za vlaæno celjenje ran, v obliki raztopine za okularno ali peroralno aplikacijo, ki po stiku z veœvalentnimi kationi in situ gelira, intenzivno pa se raziskuje tudi v biotehnologiji kot ogrodje za vgradnjo biomolekul in celic, namenjeno uporabi v tkivnem inæenirstvu (3, 7, 8). 3 Alginat v veœenotnih ogrodnih sistemih 3.1 Metode priprave alginatnih delcev z ionotropnim geliranjem V primeru veœeenotnih alginatnih ogrodnih sistemov se najpogosteje raziskujejo delci pripravljeni z metodo ionotropnega geliranja 294 farm vestn 2008; 59 (Preglednica 2). Pri t.i. kapljiœni metodi kapljamo koloidno raztopino alginata v raztopino veœvalentnega kationa (najpogosteje kalcija). V raztopini polimera lahko dispergiramo razliœne uœinkovine in pomoæne snovi. Po interakciji kapljic disperzije alginata z veœvalentnimi ion nastanejo kroglice gela, delci, v katerih je uœinkovina enakomerno porazdeljena po celotnem ogrodju kroglice. Slab izkoristek vgradnje majhnih vodotopnih uœinkovin zaradi difuzije uœinkovine v medij za utrjevanje lahko izboljøamo z optimizacijo œasa utrjevanja delcev (15 16,17) ali s kapljanjem alginatne disperzije v raztopino utrjevalca nasiœeno z uœinkovino (15, 18, 19), v primeru ionskih uœinkovin pa lahko s spreminjanjem pH medija za utrjevanje vplivamo na topnost uœinkovine in poslediœno na izkoristek vgradnje (25) Manjøe delce (mikrosfere) lahko izdelamo z razprøevanjem oz. atomizacijo alginatne disperzije z uœinkovino v raztopino za utrjevanje ali z emulzifikacijsko metodo (Preglednica 2) 3.2 Sprošcanje ucinkovin iz vecenotnih ogrodnih alginalnih sistemov Delci iz kalcijevega alginata so hidrofilni ogrodni sistem, ki lahko nabreka. Uœinkovina se lahko sproøœa po dveh mehanizmih: z difuzijo raztopljene uœinkovine skozi pore ogrodja in/ali z erozijo povrøine ogrodja. Dejavniki, ki pogojujejo sproøœanje uœinkovine iz alginatnih delcev, so navedeni v Preglednici 3 in podrobneje predstavljeni v nadaljevanju • Lastnosti medija za sprošcanje Nabrekanje delcev je odvisno od pH medija, pa tudi od ionske sestave in ionske moœi medija (27). V kislem (npr. v æelodcu) se kalcijev alginat pretvori v netopno alginsko kislino, zato je nabrekanje delcev zanemarljivo. V tem primeru se uœinkovina sproøœa z difuzijo skozi netopno ogrodje. Nasprotno v nevtralnem (npr. v tankem œrevesu) delci intenzivno nabrekajo, zato sproøœanje uœinkovine pogojujeta nabrekanje in erozija alginatnega ogrodja (3). Nabrekanje je posledica ionske izmenjave kalcijevih ionov v delcih z natrijevimi ioni prisotnimi v mediju za raztapljanje. V zaœetni fazi se izmenjajo natrijevi ioni s kalcijevimi ioni, vezanimi na karboksilne skupine manuronskih odsekov. Nastali elektrostatiœni odboj med negativno nabitimi karboksilnimi skupinami pospeøi nabrekanje ogrodja. V drug fazi nabrekanja se zaradi izstopa kalcijevih ionov, ki povezujejo homoguluronske odseke, razrahlja moœna struktura ogrodja, ki spominja na økatlo za jajca. To omogoœi vstop dodatnih koliœin vode v ogrodje in sœasoma popolno raztopitev alginatnega ogrodja (11) • Lastnosti alginatnega ogrodja Hitrost in obseg nabrekanja pogojujejo tudi vrsta in koliœina iona za premreæitev ter sestava, koncentracija in molekulska masa alginata (Preglednica 1) • Lastnosti ucinkovine Doseganje prirejenega sproøœanja z vgradnjo uœinkovine v alginatne delce je odvisno tudi od lastnosti uœinkovine. Uœinkovine z majhno molekulsko maso Sproøœanje majhnih molekul je odvisno od njihove topnosti v mediju za raztapljanje. V primeru majhnih v vodi dobro topnih uœinkovin je njihovo sproøœanje le z vgradnjo v delce kalcijevega alginata teæko nadzorovati. Uœinkovina se namreœ hitro raztopi v mediju, ki vstopi v Preglednica 1: Dejavniki, ki vplivajo na lastnosti ionotropnega gela (4, 5, 9, 11, 12). Table 1: Factors influencing ionotropic gel properties (4, 5, 9, 11, 12). Dejavnik Lastnosti gela Lastnosti alginata • Kemijska sestava (4, 5) Visok deleæ G enot • Stabilni, mehansko bolj odporni na erozijo, porozni Visok deleæ M enot • Elastiœni, manj porozni, manj odporni na erozijo • Molekulska masa (5, 9) • Pod doloœeno molekulsko maso je sposobnost geliranja omejena, nad molekulsko maso 2,4×105 je jakost gela neodvisna od molekulske mase • Sekvenœna sestava (4) Dolæina / øtevilo MM, GG in MG odsekov • Alginati z daljøimi in øtevilœnejøimi G sekvencami imajo veœjo afiniteto do premreæitve • Afiniteta do premreæitve naraøœa v naslednjem zaporedju MM Ba2+ > Cu2+ > Ca2+ > Ni2+ > Co2+ > Mn2+ • Ioni z veœjo afiniteto tvorijo bolj rigiden gel, z grobo, nagubano povrøino Trivalentni • Premreæitev poteœe v treh plasteh • Velikost, premer iona (11) • Ioni z veœjim premerom zapolnijo veœji prostor med alginatnimi verigami, ° nastane stabilnejøi gel, ki manj nabreka, npr. Ba2+ (1,74 A) bolje zapolni ° prostor kot Ca2+ (1,14 A) farm vestn 2008; 59 295 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles ogrodje, in raztopljena difundira skozi pore iz ogrodja. Ogrodje kalcijevega alginata je dokaj porozno (velikost por suhega ogrodja je v obmoœju od 5 do 200 nm, (5)) in za majhne molekule ne predstavlja difuzijske bariere, ki bi bistveno upoœasnila sproøœanje. V primeru majhnih, v vodi slabo topnih uœinkovin je sproøœanje iz alginatnih delcev odvisno od hitrosti raztapljanja uœinkovine, pa tudi od nabrekanja in erozije alginatnega ogrodja. V kislem mediju je sproøœanje slabo topnih uœinkovin iz alginatnih delcev minimalno, medtem ko je v nevtralnem, zaradi nabrekanja delcev, poveœan vstop medija za raztapljanje, kar omogoœa raztapljanje uœinkovine. Raztopljena uœinkovina difundira iz ogrodja, neraztopljena pa se sproøœa z erozijo ogrodja in raztapljanjem, ki sledi eroziji (28). Zato velja, da je za doseganje prirejenega sproøœanja ogrodje iz kalcijevega alginata primerno za slabo topne uœinkovine in uœinkovine z veliko molekulsko maso. Kljub temu je v literaturi moœ najti nekaj pristopov za upoœasnitev sproøœanja majhnih, dobro topnih molekul iz alginatnih delcev, ki temeljijo tudi na premreæitvi alginata z naravnimi ali sinteznimi polikationskimi polimeri (npr. hitosan (29), polilizin (30)) ali s kemijskimi premreæevalci (npr. formaldehid, glutaraldehid (4), epiklorhidrin (21)). Slednji kovalentno premreæijo polimer, posledica œesar je nastanek bistveno bolj stabilnega ogrodja z manjøimi porami, ki poœasneje erodira. Kemijski premreæevalci so s staliøœa toksiœnosti nesprejemljivi, zato je veliko boljøi pristop uporaba polikationov, ki premreæijo alginat preko ionskih interakcij. Najpogosteje se te polikatione uporabi za tvorbo obloge, sestavljene iz kompleksa med alginatom in polikationom. Tako je npr. Ueng s sodelavci (30) z oblaganjem alginatnih delcev s poli-L-lizinom uspel zadræati sproøœanje vankomicina, Sezer in Akabuga (29) pa sta alginatne delce dodatno obdelala s hitosanom, kar je omogoœilo prirejeno sproøœanje timolol maleata. Uœinkovine z veliko molekulsko maso Pri uœinkovinah z veœjo molekulsko maso (npr. cepiva, proteini in polipeptidi) ponuja vgradnja v alginatne delce veœ moænosti za doseganje prirejenega sproøœanja (4). Tudi v tem primeru je sproøœanje nadzorovano z difuzijo uœinkovine skozi polimerno ogrodje in z erozijo ogrodja. Nadzor sproøœanja z difuzijo je bolj zaæelen, saj se v primeru razpada alginatnega ogrodja uœinkovina sprosti naenkrat, hitro in nenadzorovano (6). Hitrost difuzije je odvisna tako od lastnosti alginatnega ogrodja kot od molekulske mase uœinkovine. Kikuchi in Okano (31) sta s poskusi z dekstranom razliœnih molekulskih mas ugotovila, da je hitrost difuzije obratno sorazmerna z molekulsko maso dekstrana, pri molekulski masi 145000 pa se je uœinkovina sproøœala le z erozijo alginatnega ogrodja. Do enakih zakljuœkov je s proteini razliœnih molekulskih mas priøel tudi Martinsen s sodelavci (32). S preskuøanjem alginatov razliœne sestave so ugotovili, da alginati z viøjim deleæem guluronskih enot tvorijo bolj rigidne gele, ki se manj skrœijo in je zato velikost por veœja, posledica œesar je lahko hitrejøa difuzija makromolekul. Po drugi strani pa so tovrstni geli bistveno bolj odporni na erozijo v primerjavi z geli iz alginatov z visokim deleæem manuronskih enot, in lahko zato dalj œasa nadzorujejo sproøœanje. Na lastnosti alginatnih delcev in poslediœno na hitrost sproøœanja makromolekul vplivajo tudi pogoji priprave delcev, kot npr. œas in naœin suøenja, œas utrjevanja, vrsta in Preglednica 2: Metode za pripravo alginatnih delcev z ionotropnim geliranjem Table 2: Methods for preparation alginate beads using ionotropic gelation Metoda Prednosti Slabosti Kapljiœna metoda (3-5) • Kapljanje disperzije alginata in uœinkovine v vodno raztopino veœvalentnega kationa • Delci > 1 mm • Lastnosti delcev (vsebnost, kinetika sproøœanja, oblika, morfologija) odvisne od (15-24): Æ lastnosti alginata in sestave dostavnega sistema (vrsta uœinkovine, tip, koncentracija alginata, razmerje uœinkovina/alginat, dodatek pomoænih snovi) Æ procesnih parametrov (œas utrjevanja, vrsta, koncentracija veœvalentnih ionov, naœin suøenja...) • Atomizacija, razprøevanje alginatne disperzije Æ delci < 1 mm • Enostavna metoda • Mili pogoji priprave Æ vgradnja proteinov, encimov, celic • Difuzija majhnih vodopnih molekul v medij za utrjevanje Æ slab izkoristek vgradnje Emulzifikacijska metoda (4, 5, 21, 26) • Emulzija tipa voda v olju, notranja faza: vodna disperzija alginata in snovi, ki jo æelimo vgraditi, zunanja faza: organsko topilo • Interna premreæitev: dodatek netopnega kalcijevega kompleksa (kalcijev karbonat, citrat) v alginatno disperzijo, kalcijevi ioni se sprostijo ob nakisanju – dodatku ledocetne kisline v zunanjo fazo • Eksterna premreæitev: dodatek raztopine CaCl2 v organsko fazo – koalescenca ob stiku s kapljicami alginatne disperzije • Velikost delcev odvisna od hitrosti meøanja in hitrosti dodajanja raztopine utrjevalca • Priprava majhnih delcev (1-150 mm) • Uporaba organskih topil 296 farm vestn 2008; 59 koncentracija utrjevalca, velikost delcev (31-33). Zlasti naœin suøenja delcev izrazito vpliva na velikosti por. Delci posuøeni z liofilizacijo imajo bistveno veœje pore kot delci posuøeni na zraku, ki se s suøenjem moœno skrœijo. Prav zaradi skrœenja lahko pri delcih posuøenih na zraku ogrodje na povrøini poœi, kar lahko pri ponovni rehidraciji v mediju za raztapljanje olajøa erozijo na povrøini in pospeøi sproøœanje (5). Vpliv procesnih parametrov na sproøœanje uœinkovine je bistveno bolj izrazit pri uœinkovinah z veœjo molekulsko maso. Zaradi pH odvisnega nabrekanja delci iz kalcijevega alginata v kislem mediju uœinkovito nadzorujejo sproøœanje majhnih slabo topnih molekul in makromolekul. Problematiœen je dokaj hiter razpad delcev v nevtralnem mediju, posledica œesar je nenadna nenadzorovana sprostitev preostale uœinkovine. Kot æe razloæeno lahko razpad alginatnega ogrodja prepreœimo z dodatnim premreæenjem, stabilnost v medijih z viøjim pH pa se poveœa tudi s kovalentnimi kemijskimi modifikacijami alginata. Taka primera sta alginat, na katerega je z amidno vezjo vezan L-cistein (tioliran alginat), in amfifilni derivat alginata, ki ima prek esterskih vezi na polisaharidno ogrodje vezane dolge alkilne verige. Obe modifikaciji izredno pripomoreta k odpornosti alginata na erozijo, tioliran alginat pa, zaradi moænosti Preglednica 3: Poglavitni dejavniki, ki vplivajo na sproøœanje uœinkovine iz alginatnih delcev Table 3: Factors influencing drug release from alginate beads Dejavnik Opombe pH medija • Pogojuje nabrekanje ogrodja in poslediœno mehanizem sproøœanja uœinkovine (3, 27) Æ v kislem: difuzija raztopljene uœinkovine skozi netopno ogrodje alginske kisline Æ v nevtralnem: difuzija raztopljene uœinkovine skozi nabreklo zvezno plast in z erozijo ogrodja Lastnosti uœinkovine Velikost in topnost • Majhne, dobro topne uœinkovine (5, 28) sproøœanje z difuzijo, praktiœno neodvisno od pH medija • Veœje, slabo topne uœinkovine (5, 6, 31-33) sproøœanje odvisno od velikosti in hitrosti raztapljanja uœinkovine ter nabrekanja in erozije ogrodja Æ v kislem: sproøœanje minimalno Æ v nevtralnem: difuzija raztopljene uœinkovine skozi nabreklo plast in z erozijo ogrodja Æ hitrost difuzije obratno sorazmerna z molekulsko maso uœinkovine Naboj • Pozitivno nabite uœinkovine -» relativno poœasnejøe sproøœanje (4-6) • Negativno nabite uœinkovine -» relativno hitrejøe sproøœanje • Vpliv naboja v kislem manj izrazit Lastnosti ogrodja Kemijska sestava alginata • Veœji vpliv pri uœinkovinah z veœjo molekulsko maso (Preglednica 1) Premreæitev • Veœvalentni kation pomembna vrsta, valenca, velikost kationa (Preglednica 1) • Polikationski polimeri (hitosan, polilizin) tvorba polielektrolitskega kompleksa z alginatom Æ upoœasnitev sproøœanja (29, 30) • Kovalentni premreæevalci (formaldehid, glutaraldehid, epiklorhidrin) kovalentna premreæitev ogrodja, manjøe pore, bolj stabilno ogrodje, odporno na erozijo Æ upoœasnitev sproøœanja (4, 21) Kovalentne kemijske • Alginat s kovalentno vezanim cisteinom, amfifilni derivat alginata z alkilnimi verigami) Æ poveœana modifikacije alginata odpornost ogrodja na erozijo (6) tvorbe disulfidnih vezi z cisteinskimi tiolnimi skupinami na glikoproteinih mukusa, pridobi øe boljøe mukoadhezivne lastnosti (6). Naboj uœinkovine Tako pri uœinkovinah z nizko kot z veliko molekulsko maso lahko na sproøœanje iz alginatnih delcev izjemno vpliva naboj uœinkovine. Pozitivno nabiti proteini (5, 6) in uœinkovine (4) lahko interagirajo z negativno nabitim alginatom, kar zavira sproøœanje iz ogrodja. V primeru proteinov lahko tovrstna interakcija povzroœi celo njihovo inaktivacijo. Ta problem so v primeru TGFb1 reøili z dodatkom anionskega polimera akrilne kisline, ki je zaøœitil TGFb1 pred interakcijo z alginatom in ohranil njegovo aktivnost (6). V nasprotju s pozitivno nabitimi uœinkovinami je sproøœanje negativno nabitih uœinkovin iz alginatnega ogrodja zaradi odbojnih interakcij hitrejøe. Tako privlaœne kot odbojne interakcije med uœinkovino in alginatom so v kislem mediju, kjer so karboksilne skupine alginata v neionizirani obliki, bistveno manj izrazite kot v nevtralnem mediju (4). 4 Alginat v ogrodnih tabletah Alginat se pogosto uporablja tudi kot pomoæno sredstvo pri tabletiranju. Njegova vloga je odvisna od uporabljene koliœine. V farm vestn 2008; 59 297 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles koncentracijah od 1 do 5% oz. od 2 do 10% deluje kot vezivo oziroma razgrajevalo (34, 35). Kot je æe uvodoma predstavljeno, je alginat hidrofilni polimer, ki v vodi nabreka in tvori viskozno koloidno raztopino, zato ga lahko v veœjih koncentracijah uporabimo tudi kot polimerni nosilec za izdelavo ogrodnih tablet s prirejenim sproøœanjem. 4.1 Sprošcanje ucinkovin iz alginalnih ogrodnih tablet Ob stiku ogrodne tablete iz hidrofilnega polimera z vodnim medijem hidrofilna koloidna komponenta nabreka, kar vodi v nastanek viskozne koloidne plasti na povrøini tablete. Ta plast nadzoruje vstop vode v ogrodje ter izstop raztopljenih snovi iz ogrodja. Sproøœanje uœinkovin iz takih sistemov poteka po dveh mehanizmih: vodotopne uœinkovine se v glavnem sproøœajo z difuzijo raztopljene uœinkovine skozi nabreklo plast (plast gela), medtem ko se slabo topne uœinkovine sproøœajo preteæno z erozijo ogrodja. Vpliv posameznega mehanizma na sproøœanje uœinkovine je odvisen tako od topnosti uœinkovine kot tudi od mehanskih in fizikalnih lastnosti nabrekle plasti okrog tablete (36, 37). Dejavniki, ki vplivajo na sproøœanje uœinkovine iz ogrodnih alginatnih tablet, so navedeni v Preglednici 4 in podrobneje predstavljeni v nadaljevanju • pH medija in topnost ucinkovine Hodsdon in sodelavci (36) so preuœevali vpliv pH medija na sproøœanje klorfeniramin maleata kot modelne dobro topne uœinkovine in hidroklortiazida kot modelne slabo topne uœinkovine iz ogrodnih tablet iz natrijevega alginata. Sproøœanje uœinkovin iz tablet so vrednotili loœeno v umetnem æelodœnem soku s pH 1,2 in umetnem œrevesnem soku s pH 7,5. Ugotovili so, da pH medija vpliva na nabrekanje alginata oz. strukturo hidratirane plasti, kar se odraæa tudi v kinetiki sproøœanja uœinkovine. Avtorji navajajo, da se v kislem alginat pretvori v alginsko kislino, ki je v vodi netopna, vendar nabreka. Zato je v kislih pogojih zunanja plast tablete manj hidratirana, œvrsta in elastiœna, s porozno in zrnato strukturo. Sestavljena je iz predelov, kjer je veœina polimera neraztopljenega in zato le-ta ne prispeva k difuzni barieri. V nevtralnem mediju natrijev alginat intenzivno nabreka, kar vodi v nastanek zvezne viskozne plasti na povrøini tablete, ki predstavlja uœinkovito difuzijsko bariero. Za dobro topno uœinkovino je omenjena skupina raziskovalcev ugotovila, da je v kislem na raœun veœje poroznosti hidratirane plasti v prvi uri sproøœanje iz alginatne ogrodne tablete hitrejøe kot v mediju s pH 7,5. Sproøœanje uœinkovine je potekalo s kinetiko, ki jo opisuje Higuchijeva enaœba (linearno s kvadratnim korenom iz œasa), kar nakazuje, da je v kislem sproøœanje iz alginatnega ogrodja nadzorovano predvsem z difuzijo raztopljene uœinkovine skozi netopno ogrodje. V nevtralnem k sproøœanju pomembno prispeva tudi erozija ogrodja, kar je v profilu sproøœanja opazno kot odklon od omenjene linearnosti. Pri slabo topni uœinkovini hidroklortiazidu so bile ugotovitve ravno obratne. Medtem ko se je v nevtralnem iz alginatnih ogrodnih tablet v 4 urah sprostilo 83% uœinkovine, se je v kislem mediju sprostilo le 15%. Tako izrazita razlika v sproøœanju je pogojena s topnostjo oz. stabilnostjo alginatnega ogrodja v odvisnosti od pH. V nevtralnem namreœ Preglednica 4: Dejavniki, ki vplivajo na sproøœanje uœinkovine iz ogrodnih alginatnih tablet (36, 37) Table 4: Factors influencing drug release from alginate matrix tablets (36, 37) Dejavnik pH medija Kisel Nevtralen • vpliva na strukturo hidratirane plasti • pogojuje mehanizem sproøœanja uœinkovine • difuzija raztopljene uœinkovine skozi netopno ogrodje alginske kisline • difuzija raztopljene uœinkovine skozi nabreklo zvezno plast • erozija ogrodja Lastnosti alginata aSestava • vpliv odvisen od hitrosti / obsega nabrekanja alginata • sproøœanje bolj zadræano pri alginatih z viøjim deleæem M enot • sproøœanje bolj zadræano pri alginatih z viøjim deleæem G enot aViskoznost • vpliv odvisen od hitrosti / obsega nabrekanja alginata • sproøœanje bolj zadræano pri alginatih z niæjo viskoznostjo • sproøœanje bolj zadræano pri alginatih z viøjo viskoznostjo bVelikost delcev • manjøi delci -» tvorba bolj hidratirane bolj zvezne difuzne bariere -» poœasnejøe sproøœanje Lastnosti uœinkovine • Majhne, dobro topne uœinkovine se sproøœajo z difuzijo • Veœje in/ali slabo topne uœinkovine se sproøœajo z difuzijo in erozijo ogrodja a Naœin vpliva sestave in viskoznosti alginata odvisen od pH medija za sproøœanje b Naœin vpliva velikosti delcev alginata neodvisen od pH medija za sproøœanje 298 farm vestn 2008; 59 alginatno ogrodje erodira, medtem ko ostane v kislem mediju mocno elasticno ogrodje tablete. To potrjuje, da je glavni mehanizem sprošcanja slabo topnih ucinkovin iz alginatne ogrodne tablete nadzorovan z erozijo ogrodja (36). • Lastnosti alginata Velikost delcev alginata Liew in sodelavci (37) so sistematicno ovrednotili vpliv velikosti delcev, viskoznosti in kemijske sestave natrijevega alginata na sprošcanje iz alginatnih ogrodnih tablet. V poskusih so nazorno pokazali, da se z zmanjševanjem velikosti delcev alginata do mejne vrednosti 80 - 100 um hitrost sprošcanja ucinkovine upocasni in zmanjša zacetno hitro sprošcanje (»burst« efekt). Pri konstantn kolicini alginata se z zmanjšanjem velikosti delcev poveca njihovo število, zato lahko ucinkoviteje prekrijejo površino tablete, s tem pa se zmanjša verjetnost nastanka predelov na tableti brez polimernih delcev, ki so kljucni za zacetno hitro sprošcanje pred nastankom zvezne difuzne plasti. Poleg tega manjši delci hitreje hidratirajo (nabrekajo), kar vodi v hitrejši nastanek difuzne bariere. Hkrati pa izboljšan stik med manjšimi delci pripomore k boljšemu združevanju polimernih delcev in nastanku manj permeabilne bariere, ki ucinkoviteje zadrži sprošcanje ucinkovine. Vpliv velikosti delcev alginata na sprošcanje je kljucnega pomena zlasti pri nižji vsebnosti alginata, ker je v tem primeru poroznost nabrekle plasti pogojena z zadostnim številom delcev na površini tablete. Pri višji vsebnosti alginata je delcev že zaradi vecje kolicine alginata dovolj, da tvorijo stabilno (zvezno) difuzno plast. Vpliv velikosti delcev je neodvisen od sestave alginata. Kemijska sestava alginata Velik vpliv na sprošcanje ima tudi kemijska sestava natrijevega alginata. Vpliv kemijske sestave je izrazitejši pri višjih vsebnostih alginata (30% in 50%) in je odvisen tudi od pH medija za sprošcanje V kislem alginat z vecjim deležem manuronskih enot hitreje nabreka, kar vodi v hitrejši nastanek difuzijske bariere in pocasnejše sprošcanje. Nasprotno pa je v nevtralnem sprošcanje bolj zadržano iz alginatne ogrodne tablete z višjim deležem guluronskih enot, kar je posledica tvorbe stabilnejšega gela, ki je v primerjavi z gelom alginata z visokim manuronskim deležem bolj odporen na erozijo (37). Viskoznost alginata Kot je že uvodoma predstavljeno, so fizikalne lastnosti alginata, med njimi tudi viskoznost alginatne raztopine odvisne od molekulske mase in sestave polimera (M/G razmerje, dolžine posameznih odsekov). V nadaljevanju besedila in Preglednici 4 se izraz »viskoznost alginata« nanaša na tip alginata z doloceno viskoznostjo; izmerjeno v 1% (ut./ut.) vodni raztopini alginata, pri 37°C. Vpliv viskoznosti alginata na sprošcanje iz ogrodnih tablet je prav tako pogojen s pH medija za raztapljanje. V kislem je sprošcanje iz tablet iz alginata z nižjo viskoznostjo pocasnejše kot iz tablet iz bolj viskoznega alginata. Nasprotno pa v nevtralnem sprošcanje ucinkovine bistveno bolj zadržimo z uporabo bolj viskoznega alginata. Vzrok temu nasprotujocemu vplivu v odvisnosti od pH pripisujejo razlikam v hitrosti nabrekanja razlicno viskoznih alginatov. Alginat z nizko viskoznostjo hitro nabreka takoj po stiku s kislim medijem za raztapljanje, medtem ko naj bi bila pri alginatu z višjo viskoznostjo v kislem upoœasnjena hidratacija alginatnih delcev, ki je nujna za hiter nastanek difuzijske bariere. Pri viøjem pH pa je situacija ravno obratna, saj alginat z viøjo viskoznostjo tvori bistveno bolj viskozno in na erozijo odporno nabreklo plast, ki izrazito upoœasni sproøœanje uœinkovine. Rezultati øtudije dokazujejo, da lahko s pravilno izbiro velikosti delcev, sestave in viskoznosti alginata izdelamo ogrodne tablete z æelenim profilom sproøœanja (37). 5 Alginat v dostavnih sistemih s ciljano dostavo S pomoœjo alginata lahko izdelamo dostavne sisteme, ki omogoœajo œasovno nadzorovano sproøœanje uœinkovine in dostavo le-te na æeleno mesto v prebavnem traktu (npr. æelodec, kolon). 5.1 Alginat v dostavnih sistemih s podaljøanim œasom zadræevanja v prebavnem traktu Œas zadræevanja v æelodcu je zlasti pomemben pri uœinkovinah z absorpcijskim oknom v zgornjem delu prebavnega trakta. Zadræevanje dostavnega sistema v æelodcu lahko podaljøamo z izdelavo plavajoœih dostavnih sistemov. Glavni pogoj za doseganje plovnosti je niæja gostota dostavnega sistema od æelodœne tekoœine (vsebine). Poroznost in poslediœno tudi gostota delcev iz kalcijevega alginata je odvisna od naœina suøenja. S suøenjem z zamrzovanjem (liofilizacija) dobimo zelo porozne delce z dovolj nizko gostoto, da plavajo na povrøini medija za raztapljanje. Na ta naœin je Whitehead s sodelavci pripravil plavajoœe alginatne delce z amoksicilinom (38). Plovnost delcev iz kalcijevega alginata pa lahko doseæemo tudi z vgradnjo dodatkov z niæjo gostoto, npr. rastlinskega olja. Tovrstni dodatki lahko izrazito vplivajo na sproøœanje uœinkovine. V primeru metronidazola so ugotovili, da je hitrost sproøœanja obratno sorazmerna s koliœino vgrajenega olja (39). Drugi pristop za podaljøanje œasa prehoda farmacevtske oblike skozi prebavni trakt je izdelava bioadhezivnih dostavnih sistemov. In vitro raziskave so pokazale, da ima alginat zaradi karboksilnih skupin odliœne bioadhezivne lastnosti, kar bi potencialno lahko prispevalo k podaljøanemu œasu zadræevanja alginatnih dostavnih sistemov na gastrointestinalni ali nosni sluznici in tako omogoœilo uœinkovitejøo dostavo uœinkovine (3, 5). Pri postavljanju zakljuœkov o podaljøanem œasu zadræevanja peroralno apliciranih dostavnih sistemov zaradi bioadhezije je potrebna previdnost. Namreœ nekateri avtorji zagovarjajo staliøœe, da je bioadhezija v prebavnem traktu vpraøljiva, predvsem zaradi hitre obnove mukusa. Œas zadræevanja bioadhezivnega sistema na œrevesni sluznici je namreœ omejen s œasom, potrebnim za obnovo mukusa (na œrevesni sluznici od 50 do 270 min), ker novonastali mukus izpodriva starega v lumen prebavnega trakta, s tem pa se odluøœi tudi adheriran dostavni sistem. Poleg tega lahko molekule odluøœenega mukusa v lumnu prebavnega trakta interagirajo z dostavnim sistemom in na ta naœin onemogoœijo njegovo adhezijo na sluznico œrevesne stene (40, 41). 5.2 Alginat v sistemih za ciljano dostavo v kolon Alginat je eden izmed øtevilnih polisaharidov, ki ga v prebavnem traktu selektivno razgradijo encimi kolonske bakterijske mikroflore. To farm vestn 2008; 59 299 Pregledni znanstveni œlanki - Review Scientific Articles lastnost alginata lahko izkoristimo za pripravo dostavnih sistemov s ciljano dostavo v kolon (42). Glavna omejitev polisaharidnih sistemov za ciljano dostavo v kolon je, da so to hidrofilni polimeri, ki sami po sebi ne uspejo zadræati sproøœanja uœinkovine do kolona. Z uporabo razliœnih polimernih oblog, ki se raztopijo po doloœenem œasu in/ali ob spremembi pH, lahko zagotovimo prihod dostavnega sistema v kolon brez prezgodnjega sproøœanja uœinkovine. Po prihodu alginatnega dostavnega sistema v kolon pa sproøœanje uœinkovine poteka zelo hitro zaradi razgradnje alginatnega ogrodja z bakterijskimi encimi. 6 Zakljuœek Alginat je naraven polisaharidni polimer, ki ga zaradi svojih lastnosti, kot so nabrekanje in geliranje v prisotnosti razliœnih premreæevalcev ali spremembi pH ter nekaterih drugih lastnosti, vedno pogosteje sreœamo v dostavnih sistemih s prirejenim sproøœanjem za razliœne uœinkovine, vkljuœno s proteini in encimi. Z izbiro ustreznega tipa alginata ter pogojev priprave alginatnega ogrodja lahko izdelamo dostavni sistem s œasovno in/ali prostorsko prirejenim sproøœanjem. 7 Literatura 1. Kumar MNVR, Kumar N. Polymeric controlled drug delivery systems: perspective issues and opportunities. Drug Dev Ind Pharm 2001; 27 (1): 1-30. 2. Bhardwaj TT, Kanwar M, Lal R et al. Natural gums and modified natural gums as sustained-release carriers. Drug Dev Ind Pharm 2000; 26 (10): 1025-1038. 3. T?nnesen HH, Karlsen J. Alginate in drug delivery systems. Drug Dev Ind Pharm 2002; 28: 621–630. 4. Shilpa A, Agrawal SS, Ray AR. Controlled delivery of drugs from alginate matrix. J Macromol Sci Polym Rev 2003; C43 (2): 187-221. 5. Gombotz WR, Wee SF. Protein release from alginate matrices. Adv Drug Del Rev 1998; 31: 267-285. 6. George M, Abraham TE. Polyionic hydrocolloids for the intestinal delivery of protein drugs: alginate and chitosan – a review. J Control Release 2006; 114: 1-14. 7. Malafaya BF, Silva GA, Reis RL. Natural-origin polymers as carriers and scaffolds for biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications. Adv Drug Deliv Rev 2007; 59: 207-233. 8. Coviello T, Matricardi P, Marianecci C. Polysaccharide hydrogels for modified release formulations. J Control Release, 2007; 119: 5-24. 9. Draget KI, Skja°k Braek G, Smidsr?d O. Alginic acid gels: the effect of alginate chemical composition and molecular weight. Carbohydrate Polym 1994; 25: 31-38. 10. Draget KI, Skja°k Braek G, Stokke BT. Similarities and differences between alginic acid gels and ionically crosslinked alginate gels. Food Hydrocoll 2006; 20: 170-175. 11. Bajpai SK, Sharma S. Investigation of swelling/degradation behaviour of alginate beads crosslinked with Ca2+ and Ba2+ ions. React Funct Polym 2004; 59: 129–140. 12. Ouwerx C, Velings N. Mestdagh MM et al. Physico-chemical properties and rheology of alginate gel beads with various divalent cations. Polym Gels Netw 1998; 6; 393-408. 13. Suzuki Y, Tanihara M, Nishimura Y et al. In vivo evaluation of a novel alginate dressing. J Biomed Mater Res (Appl Biomater) 1999; 48: 522-527. 14. Homar M, Øuligoj D, Gaøperlin M. Preparation of microcapsules with self-microemulsifying core by a vibrating nozzle method. J Microencapsul 2007; 24 (1): 72-81. 15. Smrdel P, Bogataj M, Podlogar F et al. Characterization of calcium alginate beads containing structurally similar drugs. Drug Dev Ind Pharm 2006; 32: 623-633. 16. Smrdel P, Bogataj M, Mrhar A. The influence of selected parameters on the size and shape of alginate beads prepared by ionotrop-ic gelatination. Sci Pharm 2008; 76: 77–89. 17. El – Kamel AH, Al–Gohary OMN, Hosny EA. Alginate–diltiazem hydrochloride beads: optimization of formulation factors, in vitro and in vivo availability. J Microencapsul 2003; 20 (2): 211-225. 18. ?stberg T, Vesterhus L, Graffner C. Calcium alginate matrices for oral multiple unit administration: II. Effect of process and formulation factors on matrix properties. Int J Pharm 1993; 97: 183–193. 19. Rousseau I, Le Cerf D, Picton L et al. Entrapment and release of sodium polystyrene sulfonate (SPS) from calcium alginate gel beads. Eur Polymer J 2004; 40 (12): 2709-2715 20. Almeida PF, Almeida AJ. Cross–linked alginate–gelatine beads: a new matrix for controlled release of pindolol. J Control Release 2004; 97: 431-439. 21. Fundueanu G, Nastruzzi C, Carpov A. Physico–chemical characterization of Ca–alginate microparticles produced with different methods. Biomaterials 1999; 20: 1427-1435. 22. Puttipipatkhachorn S, Pongjanyakul T, Priprem A. Molecular interaction in alginate beads reinforced with sodium starch glycolate or magnesium aluminium silicate, and their physical characteristics. Int J Pharm 2005; 293 (1-2): 51-62. 23. Zohar-Perez C, Chet I, Nussinovitch A. Irregular textural features of dried alginate-filler beads. Food Hydrocoll 2004; 18: 249-258. 24. Smrdel P, Bogataj M, Zega A et al. Shape optimization and characterization of polysaccharide beads prepared by ionotropic gelation. J Microencapsul 2008; 25 (2): 90-105. 25. Kedzierewicz F, Lombry C, Rios R et al. Effect of the formulation on the in–vitro release of propranolol from gellan beads. Int J Pharm 1999; 178: 129-136. 26. Poncelet D, Babak V, Dulieu C et al. A physico-chemical approach to production of alginate beads by emulsification-internal ionotropic gelation. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp 1999; 155: 171-176. 27. ?stberg T, Lund EM, Graffner C. Calcium alginate matrices for oral multiple administration: IV. Release characteristics in different media. Int J Pharm 1994; 112: 241-248. 28. Sugawara S, Imai T, Otagiri M. The controlled release of pred-nisolone using alginate gel. Pharm Res 1994; 11 (2): 272-277. 29. Sezer AD, Akbuga J. Release characteristics of chitosan treated alginate beads: II: Sustained release of a low molecular drug from chitosan treated alginate beads. J Microencapsul 1999; 16 (6): 686-696. 30. Ueng SW, Lee SS, Lin SS et al. Biodegradable alginate antibiotic beads. Clin Orthop 2000; 380: 250-259. 31. Kikuchi A, Okano T. Pulsatile drug release control using hydrogels. Adv Drug Del Rev 2002; 54: 53-77. 32. Martinsen A, Skja° k Braek G, Smidsr?d O. Alginate as immobilization material: I. Correlation between chemical and physical properties of alginate gel beads. Biotechnol Bioeng 1989; 33: 79-89. 300 farm vestn 2008; 59 33. Kim CK, Lee EJ. The controlled release of blue dextran from algi-nate beads. Int J Pharm 1992; 79 (1-3): 11-19. 34. McGinity JW, Repka MA. Alginic acid. In: Rowe CR, Sheskey PJ, Owen SC. Pharmaceutical excipients. London, Pharmaceutical Press, Electronic version, 2006. 35. Holte ?, Ons?yen E, Myrvold R et al. Sustained release of water soluble drug from directly compressed alginate tablets. Eur J Pharm Sci 2003; 20: 403-407. 36. Hodsdon AC, Mitchell JR, Davies C et al. Structure and behaviour in hydrophilic matrix sustained release dosage forms:3. The influence of pH on the sustained-release performance and internal gel structure of sodium alginate matrices. J Control Release 1995; 33: 143-152. 37. Liew CW, Chan LW, Ching AL et al. Evaluation of sodium alginate as drug release modifier in matrix tablets. Int J Pharm 2006; 309: 25-37. 38. Whitehead L, Collet JH, Fell JT. Amoxicillin release from a floating dosage form based on alginate. Int J Pharm 2000; 210 (1-2): 45-49. 39. Murata Y, Sasaki N, Miyamoto E. Use of floating gel beads for stomach-specific drug delivery. Eur J Pharm Biopharm 2000; 20 (2): 221-226. 40. Lehr CM. Lectin-mediated drug delivery: The second generation of bioadhesives. J Control Release 2000; 65: 19-29. 41. Junginger HE. Mucoadhesive hydrogels. Pharm Ind 1991; 53 (11): 1056-1065. 42. Bogataj M, Mrhar A, Lavriœ A, Œerne M, Tibaut D, Øtalc A, Urleb U, Mateoviå T, Cof G, Kerœ J, Dreu R, Yoneda F, Muraoka S. Gastroresistant pharmaceutical dosage form comprinsing N-(2-(2-phthalimidoethoxy-) acetyl)-L-alanyl-D-glutamic acid (LK-423). Publsh Int Patent Appl WO 2005/092295 A1, 6 October 2005. farm vestn 2008; 59 301