1UVOD
Zaradi razvoja na področju biotehnologije, ugotovitev ba-
zičnih raziskav o tarčah in mehanizmih delovanja ter učin-
kovitosti pri terapiji številnih bolezni so proteini v zadnjih
desetletjih postali hitro rastoča skupina zdravilnih učinkovin.
Gre za velike in kompleksne molekule, ki imajo številne
funkcionalne skupine in več nivojev strukture. Za svoje de-
lovanje morajo imeti ohranjeno tridimenzionalno strukturo,
ANALIZNE
TEhNIKE ZA
VREDNOTENJE
(NE)STABILNOSTI
PROTEINOV
ANALYTICAL
TEChNIQUES FOR
EVALUATION OF
PROTEIN (IN)STABILITY
AVTORJA / AUThORS:
Nika Osel, mag. farm.
prof. dr. Robert Roškar, mag. farm.
Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 
Katedra za biofarmacijo in farmakokinetiko,
Aškerčeva cesta 7, 1000 Ljubljana
NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE:
E-mail: robert.roskar@ffa.uni-lj.si
POVZETEK
Proteinske učinkovine so v zadnjih desetletjih močno
preoblikovale trg zdravil. Gre za velike molekule z
zapleteno strukturo, ki so nagnjene k različnim obli-
kam nestabilnosti. Posledice nestabilnosti so lahko
zmanjšanje biološke aktivnosti ali povečanje imu-
nogenosti, zato je izbira ustreznih analiznih tehnik
za vrednotenje stabilnosti proteinov ključnega po-
mena za zagotavljanje kakovosti, učinkovitosti in
varnosti zdravila. V primerjavi z nizkomolekularnimi
učinkovinami je vrednotenje stabilnosti proteinov
kompleksen in večplasten analizni izziv. Pri tem mo-
ramo vključiti tri glavne vidike stabilnosti: fizikalno,
kemijsko in biološko stabilnost. Za celovito kvalita-
tivno in kvantitativno oceno nestabilnosti proteinov
je nujna uporaba kombinacije različnih analiznih teh-
nik. Poleg tega moramo vsak protein obravnavati
individualno. V tem prispevku podajamo pregled
analiznih tehnik, ki jih uporabljamo za vrednotenje
najrazličnejših sprememb, ki so posledica nestabil-
nosti proteinov. Pri tem imajo glavno vlogo masna
spektrometrija ter separacijske, spektroskopske in
imunokemijske tehnike. 
KLJUČNE BESEDE: 
analizne tehnike, masna spektrometrija, nestabil-
nost, proteini
ABSTRACT
Therapeutic proteins have significantly transformed
the pharmaceutical market in recent decades.
These large molecules with complex structures are
susceptible to various degradation pathways. Their
instability may result in a decrease in biological ac-
tivity or an increase in immunogenicity. Therefore,
the selection of appropriate analytical techniques
for the evaluation of protein stability is crucial to en-
sure quality, efficacy and safety of the medicine.
Compared to small molecules, the evaluation of
protein stability is a complex and multifaceted ana-
lytical challenge. Three main stability aspects have
to be considered: physical, chemical and biological
stability. A combination of different analytical tech-
niques is necessary for a comprehensive qualitative
and quantitative evaluation of protein instability.
Moreover, an individual approach is required for
each protein. This article reviews analytical tech-
252
A
N
A
LI
Z
N
E
 T
E
h
N
IK
E
 Z
A
 V
R
E
D
N
O
TE
N
JE
 (N
E
)S
TA
B
IL
N
O
S
TI
 P
R
O
TE
IN
O
V
farm vestn 2022; 73
vidike stabilnosti: ovrednotiti moramo fizikalno stabilnost z
vidika strukture proteina in agregacije, proučiti kemijske
spremembe proteina in rezultate podkrepiti z ovrednote-
njem biološke aktivnosti proteina (4). 
Izbira analiznih tehnik je odvisna od lastnosti proteina, for-
mulacije, mehanizma razgradnje, destruktivnosti analizne
metode in priprave vzorca (5). Trenutno ima le malo tera-
pevtskih proteinov svoje monografije v farmakopejah (9).
Splošne usmeritve za vrednotenje stabilnosti proteinov po-
dajajo smernice Mednarodne konference o harmonizaciji
(ICh) Q5C in Q6B. Smernica ICh Q5C podaja usmeritve
proizvajalcem glede stabilnostnih študij, ki jih morajo izvesti
za pridobitev dovoljenja za promet z biološkim zdravilom,
saj služijo kot podpora predlaganim pogojem shranjevanja
in roku uporabnosti (10). Smernica ICh Q6B pa podaja
glavne principe za izbiro in utemeljitev specifikacij za biolo-
ška zdravila (11). Obe smernici naslavljata tudi problematiko
analiznega vrednotenja stabilnosti proteinskih učinkovin. 
Za celovito kvalitativno in kvantitativno oceno stabilnosti
proteinov moramo uporabiti kombinacije ustreznih stabil-
nostno-indikativnih analiznih tehnik, največkrat spektro-
skopskih, separacijskih in imunokemijskih tehnik ter masne
spektrometrije (MS), s katerimi ovrednotimo fizikalno-ke-
mijske lastnosti, vsebnost in biološko aktivnost, v nekaterih
primerih pa tudi imunokemijske lastnosti proteina (10, 11).
Ovrednotiti moramo tudi čistost proteinske učinkovine, saj
lahko nečistote vplivajo na stabilnost in imunogenost pro-
teina (2, 7). Poleg tega morebitno prisotne nečistote otežijo
analizno vrednotenje proteina. Za vrednotenje čistosti upo-
rabljamo kombinacije specifičnih metod, kot so elektrofo-
rezne in kromatografske metode ter peptidno kartiranje,
rezultat analize pa je odvisen od izbrane metode (10, 11).
2.1 VREDNOTENJE KEMIJSKE
NESTABILNOSTI
Kemijska nestabilnost povzroči spremembe v primarni
strukturi proteina zaradi reakcij, kot so deamidacija, oksi-
dacija, hidroliza, izmenjava disulfidne vezi, izomerizacija,
racemizacija, β-eliminacija, glikacija in deglikozilacija (1–3).
Obseg kemijske spremembe je odvisen od formulacije,
razmer shranjevanja in intrinzičnih lastnosti proteina, njene
posledice pa so odvisne od lokacije sprememb (4, 12).
Kemijska nestabilnost povzroči spremembe v fizikalno-ke-
mijskih lastnostih proteina, kot so polarnost, masa, naboj
in optične lastnosti (8, 13). Za vrednotenje teh sprememb
najpogosteje uporabljamo kromatografske, elektroforezne
in spektroskopske tehnike ter MS (12).
ki se lahko pod vplivom različnih dejavnikov hitro poruši (1,
2).
Nestabilnost proteinov delimo na fizikalno in kemijsko. Pri
slednji pride do nastanka nove kemijske entitete zaradi ce-
pitve ali nastanka kovalentnih vezi. Pri tem se spremeni
primarna struktura proteina, posledično pa se lahko spre-
menijo tudi višji nivoji strukture (1–3). Pri fizikalni nestabil-
nosti molekula proteina kemijsko ostane nespremenjena,
pride pa do sprememb v sekundarni, terciarni ali kvartarni
strukturi proteina (3, 4). Med fizikalne oblike nestabilnosti
uvrščamo denaturacijo, agregacijo, adsorpcijo proteinov
na površine in obarjanje (1, 3, 5). Fizikalna in kemijska ne-
stabilnost sta pogosto medsebojno povezani, ena oblika
nestabilnosti lahko vodi do druge, tako pa se potencira
verjetnost za pretvorbo proteina (1,3). 
Posledice nestabilnosti so lahko zmanjšana aktivnost ali
povečana imunogenost proteina, kar je neposredno pove-
zano z učinkovitostjo in varnostjo zdravila (1, 6, 7). Zato je
izbira kombinacije ustreznih analiznih tehnik za vrednotenje
stabilnosti proteinov ključnega pomena za uspešen razvoj
zdravila.
2VREDNOTENJENESTAbILNOSTI PROTEINOV
V primerjavi z nizkomolekularnimi učinkovinami je vredno-
tenje stabilnosti proteinov precej bolj zapleteno. Stabilnosti
proteina namreč ne moremo opredeliti izključno na podlagi
njegove koncentracije ali odsotnosti razgradnih produktov
(4). Za razumevanje nestabilnosti proteinov in njihovo ustre-
zno stabilizacijo v zdravilih je potrebno podrobno analizno
ovrednotenje posameznega proteina (8). 
Zaradi velike raznolikosti možnih strukturnih sprememb je
vrednotenje stabilnosti proteinov kompleksen in večplasten
analizni izziv, ki zahteva uporabo širokega spektra analiznih
pristopov (slika 1) (5, 8). Pri tem moramo vključiti tri glavne
253 farm vestn 2022; 73
niques used for the evaluation of various changes
resulting from protein instability, with mass spec-
trometry, separation, spectroscopic and immuno-
chemical techniques playing a major role.
KEY WORDS: 
analytical techniques, instability, mass spectrometry,
proteins
P
R
E
G
LE
D
N
I Z
N
A
N
S
TV
E
N
I Č
LA
N
K
I  
254
A
N
A
LI
Z
N
E
 T
E
h
N
IK
E
 Z
A
 V
R
E
D
N
O
TE
N
JE
 (N
E
)S
TA
B
IL
N
O
S
TI
 P
R
O
TE
IN
O
V
farm vestn 2022; 73
MS je v zadnjih desetletjih postala nepogrešljivo orodje pri
analitiki proteinov. Najpogosteje jo uporabljamo za prido-
bivanje informacij o aminokislinskem zaporedju in točni
molekulski masi, za določevanje mesta in narave posttran-
slacijskih modifikacij ter tudi za proučevanje višjih nivojev
strukture in agregacije (14–16). Pomembno vlogo ima pri
stresnih študijah, kjer jo uporabljamo za identifikacijo raz-
gradnih poti in potencialnih kritičnih atributov kakovosti
(16). Vse to omogočajo različne izvedbe in načini delovanja
masnih spektrometrov, različni načini ionizacije, fragmen-
tacije in detekcije (8, 16). Za strukturno vrednotenje pro-
teinov rutinsko uporabljamo tri strategije: MS intaktnih
proteinov (top-down approach), MS po delni fragmentaciji
proteinov (middle-down / middle-up approach) in peptidno
kartiranje (bottom-up approach) (14–16). MS lahko upo-
rabljamo samostojno ali pa je sklopljena z različnimi kro-
Slika 1: Prikaz kompleksnosti vrednotenja nestabilnosti proteinov. 
Figure 1: Demonstration of the complexity of the evaluation of protein instability.
255 farm vestn 2022; 73
P
R
E
G
LE
D
N
I Z
N
A
N
S
TV
E
N
I Č
LA
N
K
I  
matografskimi tehnikami ali kapilarno elektroforezo (CE)
(16).
Številne kemijske reakcije povzročijo spremembe v naboju
ali porazdelitvi naboja, kar lahko proučujemo z ionsko-iz-
menjevalno kromatografijo (IEC), (kapilarnim) izoelektričnim
fokusiranjem in kapilarno consko elektroforezo (4, 8, 12,
13). Za proučevanje deamidacije kot ene najpogostejših
reakcij, pri katerih pride do spremembe naboja, obstajajo
tudi specifične tehnike, kot so visokozmogljivostna biolu-
miniscenčna metoda (17), jedrska magnetna resonanca
(NMR), 2D NMR in določitev nastalega amoniaka z en-
cimskim testom ali selektivno elektrodo (12, 13).
Kemijska nestabilnost lahko povzroči tudi spremembe v
hidrofobnosti proteinov, kar najpogosteje vrednotimo s kro-
matografskimi tehnikami, kot sta reverznofazna in hidrof-
obnointerakcijska kromatografija v kombinaciji z različnimi
načini detekcije (8, 9, 14, 18). Pomembno orodje pri prou-
čevanju kemijske nestabilnosti proteinov so tudi dvo- ali
večdimenzionalne tehnike, kot sta 2D-gelska elektroforeza
in dvo- ali večdimenzionalna tekočinska kromatografija (8).
Slednja se je v zadnjih letih zelo razvila predvsem zaradi
možnosti kombiniranja ortogonalnih separacijskih principov,
izboljšane selektivnosti, ločljivosti in občutljivosti v primerjavi
z enodimenzionalno kromatografijo, poleg tega pa omo-
goča uporabo MS-detekcije tudi pri vrstah kromatografije
(npr. IEC), ki niso združljive s tem načinom detekcije (8,
15).
Fragmentacija proteinov je najpogosteje posledica hidrolize
peptidne vezi ali redukcije intermolekularnih disulfidnih vezi.
Poleg nekaterih tehnik, ki jih uporabljamo za vrednotenje
agregacije proteinov (podpoglavje 2.2.3), za vrednotenje
fragmentacije uporabljamo tudi CE in tekočinsko kroma-
tografijo visoke ločljivosti (hPLC) z UV- ali elektrokemijsko
detekcijo (8, 13). Enake tehnike uporabljamo tudi pri prou-
čevanju sprememb zaradi tvorbe, cepitve ali izmenjave di-
sulfidne vezi. Za proučevanje β-eliminacije uporabljamo
voltametrijo s katodnim raztapljanjem, za proučevanje ra-
cemizacije pa uporabljamo polarimetrijo, MS pa le, ko do
racemizacije pride v devteritranem mediju (13). 
Vrednotenje sprememb v glikozilacijskih vzorcih je zaradi
njihove kompleksnosti in heterogenosti zelo zahtevno in
obsega štiri glavne analizne pristope: i) z analizo mase in-
taktnega proteina dobimo informacije o različnih glikofor-
mah posameznega glikoproteina; ii) analiza glikopeptidov
nam omogoča določitev mesta in stopnje glikozilacije; iii)
oligosaharidne profile proteina določimo z analizami sproš-
čenih glikanov; iv) z določanjem monosaharidov identifici-
ramo in kvantificiramo posamezne monosaharide (9, 16).
Pri tem ima glavno vlogo MS v kombinaciji z različnimi se-
paracijskimi tehnikami in uporabo reagentov za označeva-
nje (9, 14, 16).
2.2 VREDNOTENJE FIZIKALNE
STABILNOSTI
2.2.1 Vrednotenje višjih nivojev strukture
Zaradi delovanja različnih stresnih dejavnikov lahko pride
do sprememb na vseh nivojih strukture proteina (5, 8). Pri
fizikalni nestabilnosti se primarna struktura proteina ne
spremeni, spremenijo pa se višji nivoji strukture (1). V ta
namen uporabljamo kombinacije različnih ortogonalnih
analiznih tehnik, ki se med seboj razlikujejo po količini
pridobljenih informacij, ločljivosti, dostopnosti, enostav-
nosti, zmogljivosti ter potrebi po specializirani in dragi
opremi (8).
Za proučevanje višjih nivojev strukture primarno upora-
bljamo različne spektroskopske tehnike, ki jih v splošnem
uvrščamo med tehnike z nizko ločljivostjo (8, 12, 19). To
so cirkularni dikroizem (CD), infrardeča spektroskopija s
Fourierjevo transformacijo (FTIR), ramanska, UV- in fluo-
rescenčna spektroskopija, v nekaterih primerih tudi NMR
(4, 8, 15, 20, 21). S temi tehnikami lahko za molekulo pro-
teina pridobimo značilne spektroskopske prstne odtise in
opazimo večje spremembe v sekundarni, terciarni ali kvar-
tarni strukturi proteina, ki morajo biti prisotne pri relativno
velikem deležu molekul v vzorcu (8, 9). Slabost teh tehnik
pa je, da ne moremo zaznati majhnih razlik v konformaciji
proteinov in pridobiti specifičnih informacij o lokaciji spre-
memb in njihovi dinamiki, zato jih uporabljamo v t. i. pri-
merjalnih študijah (comparability studies) (8, 15). Med niz-
koločljivostne tehnike uvrščamo tudi metode termične
analize, kot so diferenčna dinamična kalorimetrija (DSC),
diferenčna dinamična fluorimetrija in izotermična kalorime-
trija (4, 9, 19, 20, 22). Tudi s temi tehnikami lahko pridobimo
le informacije, ki odsevajo globalne spremembe v strukturi
proteinov (9).
Z nekaterimi tehnikami pa lahko pridobimo specifične struk-
turne in prostorske informacije za posamezne domene,
funkcionalne skupine ali celo atome v molekuli proteina.
Temeljna visokoločljivostna tehnika za določanje strukture
proteinov je rentgenska praškovna difrakcija (XRPD). Krioe-
lektronska mikroskopija nam omogoča opazovanje nativne
strukture proteinov s skoraj atomsko ločljivostjo (8). NMR
je uveljavljena tehnika za proučevanje strukturnih sprememb
z visoko ločljivostjo, vendar je zaradi kompleksnosti, relativno
slabe občutljivosti, omejene prisotnosti aktivnih jeder v naravi
in omejitev pri velikosti proteinov (do 25 kDa) rutinsko ne
uporabljamo za vrednotenje višjih nivojev strukture (9, 21). 
256
A
N
A
LI
Z
N
E
 T
E
h
N
IK
E
 Z
A
 V
R
E
D
N
O
TE
N
JE
 (N
E
)S
TA
B
IL
N
O
S
TI
 P
R
O
TE
IN
O
V
farm vestn 2022; 73
Občutno izboljšanje omenjenih pomanjkljivosti je omogočil
razvoj 2D NMR (2D 13C NMR in 2D 1h/15N NMR). S to teh-
niko lahko pridobimo NMR prstne odtise proteinov z ločlji-
vostjo na nivoju posameznih aminokislin, kar lahko nepo-
sredno uporabimo v primerjalnih študijah (8, 21). Sodobnejša
tehnika, s katero lahko pridobimo komplementarne infor-
macije o višjih nivojih strukture, je MS (8, 16). Uporabljamo
različne pristope MS, in sicer MS ionske mobilnosti, kemično
premreženje v kombinaciji z MS-analizo ter izmenjavo vodika
in devterija v kombinaciji z MS (hDX-MS) (16). Predvsem
slednja postaja v zadnjih letih vedno bolj priljubljena, saj je
občutljiva, neomejena z velikostjo proteina, potrebna je
majhna količina vzorca, možna je tudi avtomatizacija (8, 9,
16). S hDX-MS lahko ovrednotimo konformacijske spre-
membe, jih lokaliziramo in proučujemo dinamiko zvijanja
proteina na nivoju 3–10 aminokislin velikih regij proteina (9,
16, 21). Pri tem moramo uporabiti vodne raztopine vzorcev
in mehke metode ionizacije (npr. elektrorazprševalna ioniza-
cija), da se nekovalentne interakcije ne porušijo (16). 
Alternativa uporabi tehnik z visoko ločljivostjo je izdelava
empiričnih faznih diagramov. Pri tem z več različnimi niz-
koločljivostnimi tehnikami izvedemo analize pri številnih po-
gojih, da pridobimo veliko količino podatkov, v katerih z
matematično analizo iščemo vzorce, ki kažejo na strukturne
spremembe (21).
Denaturacijo proteina lahko (kvantitativno) vrednotimo tudi
z reverznofazno hPLC, saj se pri denaturaciji izpostavijo
hidrofobne skupine iz notranjosti proteina, posledično pa
se spremeni hidrofobnost proteina. Da je prišlo do razvitja
proteinske strukture, lahko ugotavljamo tudi z imunoke-
mijskimi metodami, kot je encimskoimunski test (ELISA).
Za proučevanje kvinarne strukture, ki je značilna za neka-
tera monoklonska protitelesa, pa lahko uporabimo izklju-
čitveno kromatografijo (SEC) in 1h NMR spektroskopijo z
multivariantno analizo (4).
2.2.2 Vrednotenje strukture v trdnem
agregatnem stanju
Eden od načinov stabilizacije proteinov je izbira trdnih far-
macevtskih oblik, med katerimi so najpogostejši liofilizati
(1, 23). Na ta način proteine stabiliziramo, upočasnimo nji-
hovo razgradnjo, izboljšamo odpornost proteinov proti
temperaturnim spremembam in mehanskemu stresu, po-
daljšamo rok uporabnosti zdravila in se izognemo hladni
verigi (1, 5). Po drugi strani pa so proteini med sušenjem
izpostavljeni ostrim pogojem, kar je prav tako problemati-
čno z vidika stabilnosti (5, 23). 
Čeprav je že skoraj polovica zdravil s proteini v trdnih obli-
kah, je na voljo relativno malo analiznih tehnik za vredno-
tenje proteinov v trdnem agregatnem stanju (23). Z izbra-
nimi tehnikami lahko proučujemo lokalne in globalne spre-
membe v strukturi proteinov (24). Za proučevanje sekun-
darne in terciarne strukture proteinov najpogosteje
uporabljamo spektroskopske metode, kot so FTIR, bližnja
infrardeča in ramanska spektroskopija, CD ter fluorescen-
čna in UV-VIS-spektroskopija v trdnem stanju. DSC upo-
rabljamo za vrednotenje mobilnosti molekul, kinetike kri-
stalizacije, stopnje kristalizacije in denaturacije ter za
določanje temperature steklastega prehoda, ki jo rutinsko
določamo pri razvoju trdnih formulacij. XRPD nam omo-
goča ugotavljanje kristalnosti oziroma amorfnosti praška.
S hDX-MS proučujemo strukturo proteinov v trdnem stanju
z visoko ločljivostjo in tako odkrivamo spremembe v kon-
formaciji proteinov, ki kažejo na fizikalno nestabilnost. S
proteolizo devteriranih proteinov pa lahko te spremembe
ovrednotimo tudi na lokalnem nivoju (23, 24). Za prouče-
vanje interakcij med proteini in pomožnimi snovmi upora-
bljamo fotolitsko označevanje v trdnem stanju in NMR v
trdnem stanju (23). Slednjo poleg ozkokotnega nevtron-
skega sipanja uporabljamo tudi za vrednotenje strukturnih
in dinamičnih sprememb (24).
2.2.3 Vrednotenje agregacije
Najpogostejša, najkompleksnejša in najbolj raznolika oblika
fizikalne nestabilnosti proteinov je nastanek agregatov (4,
12). Agregati so skupki nativnih ali denaturiranih proteinskih
molekul (monomerov), ki so med sabo povezane s kova-
lentnimi ali šibkimi nespecifičnimi nekovalentnimi vezmi (4,
5). Pri tem nastanejo topni dimeri ali oligomeri ali pa večji
skupki nevidnih ali celo vidnih delcev (21, 25). Agregati se
razlikujejo po velikosti, morfologiji, proteinski strukturi, vrsti
medmolekulskih vezi, topnosti, mehanizmu nastanka in re-
verzibilnosti, nastanejo pa lahko tako v tekočih kot tudi
trdnih formulacijah (4–6, 8, 25). Trenutno sprejeta meja za
prisotnost topnih agregatov v proteinskih formulacijah je
5–10 % (5).
Največji izziv pri analizi agregatov predstavlja neznana na-
rava nastalih agregatov in ogromen razpon njihovih velikosti,
ki sega od nekaj nm do nekaj mm (25, 26). Z nobeno teh-
niko ne moremo določiti vseh želenih parametrov v celot-
nem območju velikosti, zato moramo za celovito ovredno-
tenje agregacije uporabiti kombinacijo komplementarnih
in ortogonalnih tehnik (12, 25, 26). 
Na voljo je velik nabor analiznih tehnik, ki se razlikujejo po
fizikalnem principu meritve, posledično pa nam omogočajo
ovrednotenje različnih vidikov agregacije (preglednica I) (8,
25, 26). Nekatere tehnike so farmakopejske (npr. vizualni
pregled), druge, predvsem robustne kvantitativne tehnike,
so primerne za uporabo v kontroli kakovosti (npr. SEC),
tretje so namenjene podpori pri razvoju izdelka ali pa potr-
ditvi ustreznosti metod za kontrolo kakovosti (npr. dinami-
čno sipanje svetlobe), nekatere tehnike, kot so samointe-
rakcijska in navzkrižnointerakcijska kromatografija ter
izotermična kalorimetrija, pa uporabljamo za napovedova-
nje agregacije (4, 21, 25). Analizne tehnike za vrednotenje
agregatov temeljijo na osnovi določanja velikosti, zato je
večina primerna tudi za vrednotenje fragmentacije proteinov
(8).
2.2.4 Vrednotenje adsorpcije proteinov
Proteini so površinsko aktivne molekule, ki se zlahka ad-
sorbirajo na hidrofobne površine in medfaze. Adsorpcija
vodi v zmanjšanje koncentracije proteina, lahko pa vpliva
tudi na stabilnost, povzroči strukturne spremembe ali izzove
agregacijo proteina (4, 5, 28). Proučevanje adsorpcije pro-
teinov je zahtevno zaradi povezanosti proteina s površino
in majhne količine adsorbiranega proteina. Izbira analizne
tehnike je odvisna od površine, količine adsorbiranega pro-
teina, kompleksnosti vzorca in želenih informacij (kinetika
adsorpcije, konformacija, orientacija in količina adsorbira-
nega proteina). 
S posameznimi tehnikami ne moremo opisati celotnega
procesa adsorpcije, zato tudi v tem primeru uporabljamo
kombinacije najrazličnejših tehnik, kot so radiooznačevalne,
imunokemijske (npr. ELISA), gravimetrične (npr. kvarčna
mikrotehtnica z meritvami disipacije), optične (npr. povr-
šinska plazmonska resonanca (SPR), elipsometrija), spek-
troskopske (npr. FTIR, CD, ramanska in fluorescenčna
spektroskopija) in mikroskopske (npr. mikroskopija na
atomsko silo) tehnike ter MS in metoda izpraznitve (28–
30).
2.3 VREDNOTENJE BIOLOŠKE
AKTIVNOSTI
Vzporedno s fizikalno-kemijskim vrednotenjem je treba
ovrednotiti tudi biološko aktivnost proteina (4, 9, 22). Bio-
loške teste uporabljamo le kot komplementarne teste, saj
ohranjena biološka aktivnost ne pomeni, da je struktura
proteina nespremenjena in torej niso zadosten dokaz za
stabilnost proteina (4). Uporabni pa so za oceno pomemb-
nosti ugotovitev iz študij stabilnosti z vidika kliničnih učinkov
(9).
Biološke teste delimo na teste in vivo in teste in vitro. Pri
testih in vivo učinkovino apliciramo živali in spremljamo
njen odziv (31, 32). Pomanjkljivosti testov in vivo so visoki
stroški, slabi specifičnost in občutljivost, visoka variabilnost
rezultatov med živalmi, časovna potratnost ter etični vidiki,
prednost pa boljša klinična relevantnost rezultatov, poleg
tega pa lahko opazimo tudi morebitne neželene učinke
(32).
S testi in vitro spremljamo in merimo odziv specifičnega
receptorja ali mikrobiološke ali tkivne celične linije po do-
datku proteinske učinkovine (31). Prednosti testov in vitro
pred testi in vivo so manjša variabilnost ter cenejša in hi-
trejša izvedba. Po drugi strani pa so testi in vitro le nado-
mestni kazalec biološke aktivnosti in ne odražajo dejanskih
razmer v okolju in vivo, predvsem kadar pri njihovi izvedbi
uporabimo spremenjene celice, poleg tega pa so lahko
podvrženi številnim interferencam (32). 
Biološke teste in vitro delimo na celične teste in na teste
vezave. Slednji temeljijo na ELISA ali SPR in jih pogosto
uporabljamo pri razvoju bioloških zdravil (8). S številnimi in
raznolikimi celičnimi testi spremljamo vpliv učinkovine na
proliferacijo, diferenciacijo in adhezijo celic, citotoksičnost,
izražanje genov, sintezo DNA, sproščanje citokinov, akti-
vacijo kinaznih receptorjev, izražanje in sintezo različnih
proteinov, ki jih sekundarno določamo z imunokemijskimi
testi, ter vrednotimo genotoksične učinke učinkovine (8,
31, 32). Z uporabo pristopa reporterskih genov se je razvoj
bioloških testov bistveno poenostavil (8).
3SKLEP
Stabilnost proteina je temeljna lastnost, ki določa, pod ka-
terimi pogoji je protein pravilno zvit in zato aktiven. Zaradi
prepletanja različnih dejavnikov in velike raznolikosti možnih
sprememb je opredelitev strategij za vrednotenje stabilnosti
proteinov ključnega pomena za uspešen razvoj zdravila in
predstavlja velik izziv za strokovnjake s področja analitike.
Poleg tega moramo analizne pristope zaradi raznolikosti
teh učinkovin individualno prilagoditi posameznim protei-
nom. Izbiramo lahko med številnimi tehnikami, kot so se-
paracijske, spektroskopske, imunokemijske in mikroskop-
ske tehnike, biološki testi, metode termične analize in druge. 
Nepogrešljivo orodje za analitiko proteinov in vrednotenje
njihove stabilnosti pa je v zadnjih desetletjih postala MS,
saj zaradi različnih izvedb in načinov delovanja masnih
spektrometrov ter možnosti sklopitve z drugimi tehnikami
omogoča proučevanje najrazličnejših sprememb, ki so po-
sledica tako kemijske kot tudi fizikalne nestabilnosti. Zaradi
257 farm vestn 2022; 73
P
R
E
G
LE
D
N
I Z
N
A
N
S
TV
E
N
I Č
LA
N
K
I  
258
A
N
A
LI
Z
N
E
 T
E
h
N
IK
E
 Z
A
 V
R
E
D
N
O
TE
N
JE
 (N
E
)S
TA
B
IL
N
O
S
TI
 P
R
O
TE
IN
O
V
farm vestn 2022; 73
Preglednica 1: Pregled analiznih tehnik za vrednotenje agregacije proteinov (4, 5, 8, 12, 25–27).
Table 1: Overview of analytical techniques used for the evaluation of protein aggregation (4, 5, 8, 12, 25–27).
* Novejša različica te tehnike je kvantitativna laserska difrakcija, s katero lahko ocenjujemo koncentracijsko porazdelitev proteinskih delcev s
premerom med 0,2 in 10 μm (12). 
Tehnika Opazovana lastnost Velikostni razred
Vizualni pregled ocenitev bistrosti, opalescence, motnosti > 50 μm – mm
Optična mikroskopija velikost in morfologija delcev, štetje delcev > 1 μm – mm
Metoda zatemnitve svetlobe (Light obscuration) koncentracija in velikost delcev 1–150 μm 
(4)
2–100 μm (25)
Pretočna mikroskopija (MFI) koncentracija, velikost in morfologija delcev (oblika,transparentnost, kompaktnost)
1–100 μm (12)
1–400 μm (25)
> 1 μm (4)
Fluorescenčna mikroskopija velikost in oblika (delci, amiloidni proteini) > 1 μm–mm
Coulterjev števec (EZS) koncentracija in velikost delcev 0,4–1200 μm
Laserska difrakcija* koncentracija in velikost delcev 20 nm – 2 mm
Dinamično sipanje svetlobe (DLS) hidrodinamska velikost, homogenost vzorca
0,3 nm – 10 μm (4)
1 nm – 5 μm (25)
10 nm – 5 μm (5)
Metoda sledenja nanodelcem (NTA) hidrodinamska velikost, koncentracija delcev (semikvantitativno)
20 nm – 1 μm (25)
30 nm – 0,8 μm (8)
30 nm – 1 μm (4)
40 nm – 1 μm (12)
Resonančno merjenje mase (RMM) koncentracija in velikost delcev, gostota delca
50 nm – 5 μm (4)
200 nm – 2 μm (8)
300 nm – 5 μm (12)
Pretočna citometrija štetje delcev, relativna velikost, intenziteta fluorescence, notranjakompleksnost (struktura) delca
0,2–150 μm (8)
> 500 nm (12)
Večkotno sipanje laserske svetlobe (MALLS) molekulska masa, velikost (polmer vrtenja) kDa – MDa
Nefelometrija, turbidimetrija optična gostota ali intenziteta sipanja svetlobe je odvisna odrazmerja med velikostjo delcev in koncentracijo Ni relevantno
Izključitvena kromatografija (SEC) molekulska masa, oblika, hidrodinamska velikost 1–50 nm
Nativna poliakrilamidna gelska elektroforeza elektroforetska mobilnost kDa – MDa
Poliakrilamidna gelska elektroforeza v
prisotnosti natrijevega lavrilsulfata (SDS-PAGE) navidezna molekulska masa, prisotnost disulfidnih vezi, čistost kDa – MDa
Kapilarna SDS elektroforeza (CE-SDS) navidezna molekulska masa, prisotnost disulfidnih vezi, čistost kDa – MDa
Pretočni sistem z asimetričnim prečnim
pretokom (AF4) hidrodinamska velikost 1 nm – nekaj μm
Elektronska mikroskopija (TEM, SEM, CryoEM) velikost in morfologija delcev (oblika, površinske lastnosti, sestava,atomska struktura) nm – mm
Mikroskopija na atomsko silo (AFM) velikost in morfologija delcev nm območje
Ozkokotno rentgensko / nevtronsko sipanje
(SAXS / SANS) velikost in oblika molekul / agregatov v raztopini nm območje
Nativna masna spektrometrija razmerje med maso in nabojem atomska ločljivostdo območja MDa
Spektrometrija ionske mobilnosti (IMS-MS) masa, štetje delcev 3–65 nm
Analitsko ultracentrifugiranje (AUC) molekulska masa, velikost, oblika 1–100 nm
Taylorjeva disperzijska analiza (TDA) hidrodinamska velikost, ocenjevanje polidisperznosti vzorca 0,1 nm – nekaj 100 nm
Vodna 1h jedrska magnetna resonanca (wNMR) kvantifikacija topnih in netopnih agregatov ter nevidnih delcev nekaj nm – nekaj μm
259 farm vestn 2022; 73
P
R
E
G
LE
D
N
I Z
N
A
N
S
TV
E
N
I Č
LA
N
K
I  
nenehnega razvoja pričakujemo, da bo MS v prihodnosti
še bolj uveljavila vlogo nenadomestljive tehnike za vredno-
tenje stabilnosti proteinov.
4LITERATURA
1. Temova Rakuša Ž, Roškar R. Stabilnost terapevtskih proteinov.
Farm Vestn. 2018;69:236–42. 
2. Banga AK. Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation,
Processing, and Delivery Systems. 3rd ed. Taylor & Francis
Group; 2015. 
3. Manning MC, Chou DK, Murphy BM, Payne RW, Katayama DS.
Stability of protein pharmaceuticals: An update. Pharm Res.
2010;27(4):544–75. 
4. Le Basle Y, Chennell P, Tokhadze N, Astier A, Sautou V.
Physicochemical Stability of Monoclonal Antibodies: A Review.
J Pharm Sci. 2020;109(1):169–90. 
5. Butreddy A, Janga KY, Ajjarapu S, Sarabu S, Dudhipala N.
Instability of therapeutic proteins — An overview of stresses,
stabilization mechanisms and analytical techniques involved in
lyophilized proteins. Int J Biol Macromol [Internet].
2021;167:309–25. Available from:
https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2020.11.188
6. Staub A, Guillarme D, Schappler J, Veuthey JL, Rudaz S. Intact
protein analysis in the biopharmaceutical field. J Pharm Biomed
Anal. 2011;55(4):810–22. 
7. Bratkovič Tomaž. Imunogenost bioloških zdravil. Farm Vestn.
2017;68:345–54. 
8. Crommelin DJA, Sindelar RD, Meibohm B. Pharmaceutical
biotechnology. 5th editio. Springer Nature Switzerland AG;
2019. 
9. Parr MK, Montacir O, Montacir H. Physicochemical
characterization of biopharmaceuticals. J Pharm Biomed Anal
[Internet]. 2016;130:366–89. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2016.05.028
10. ICH. Q5C - Quality of biotechnological products: Stability
testing of biotechnological / biological products [Internet]. [cited
2021 Feb 22]. Available from:
https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-
guideline/ich-topic-q-5-c-quality-biotechnological-products-sta
bility-testing-biotechnological/biological-products_en.pdf
11. ICH International Conference on Harmonization. Specifications:
Test Procedures and Acceptance Criteria for
Biotechnological/Biological Products Q6B [Internet]. 1999 [cited
2021 Oct 26]. Available from:
https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-
guideline/ich-q-6-b-test-procedures-acceptance-criteria-biotec
hnological/biological-products-step-5_en.pdf
12. Patke S. Current Status of Analytical Techniques for
Characterization of Protein Stability [Internet]. 2018 [cited 2021
Sep 29]. p. 1–7. Available from: https://biopharma-
asia.com/featured-article/current-status-of-analytical-technique
s-for-characterization-of-protein-stability/
13. Reubsaet JLE, Beijnen JH, Bult A, Van Maanen RJ, Marchal
JAD, Underberg WJM. Analytical techniques used to study the
degradation of proteins and peptides: Physical instability. J
Pharm Biomed Anal. 1998;17(6–7):979–84. 
14. Fekete S, Guillarme D, Sandra P, Sandra K. Chromatographic,
Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the
Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal
Chem. 2016;88(1):480–507. 
15. Graf T, Heinrich K, Grunert I, Wegele H, Haberger M, Bulau P,
et al. Recent advances in LC–MS based characterization of
protein-based bio-therapeutics – mastering analytical
challenges posed by the increasing format complexity. J Pharm
Biomed Anal [Internet]. 2020;186:113251. Available from:
https://doi.org/10.1016/j.jpba.2020.113251
16. Rathore D, Faustino A, Schiel J, Pang E, Boyne M, Rogstad S.
The role of mass spectrometry in the characterization of
biologic protein products. Expert Rev Proteomics [Internet].
2018;15(5):431–49. Available from:
https://doi.org/10.1080/14789450.2018.1469982
17. Hsiao K, Alves J, Patel R, Adams M, Nashine V, Goueli S. A
High-Throughput Bioluminescent Assay to Monitor the
Deamidation of Asparagine and Isomerization of Aspartate
Residues in Therapeutic Proteins and Antibodies. J Pharm Sci
[Internet]. 2017;106(6):1528–37. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.xphs.2017.02.022
18. Osel N, Parfant TP, Kristl A, Roškar R. Stability-indicating
analytical approach for stability evaluation of lactoferrin.
Pharmaceutics. 2021;13(7). 
19. Hamborg L, Horsted EW, Johansson KE, Willemoës M,
Lindorff-Larsen K, Teilum K. Global analysis of protein stability
by temperature and chemical denaturation. Anal Biochem.
2020;605(July). 
20. Jeong SH. Analytical methods and formulation factors to
enhance protein stability in solution. Arch Pharm Res.
2012;35(11):1871–86. 
21. Federici M, Lubiniecki A, Manikwar P, Volkin DB. Analytical
lessons learned from selected therapeutic protein drug
comparability studies. Biologicals. 2013;41(3):131–47. 
22. Ma H, Ó’Fágáin C, O’Kennedy R. Antibody stability: A key to
performance - Analysis, influences and improvement.
Biochimie. 2020;177:213–25. 
23. Chen Y, Mutukuri TT, Wilson NE, Zhou Q (Tony).
Pharmaceutical protein solids: Drying technology, solid-state
characterization and stability. Adv Drug Deliv Rev [Internet].
2021;172:211–33. Available from:
https://doi.org/10.1016/j.addr.2021.02.016
24. Bolje A, Gobec S. Analytical techniques for structural
characterization of proteins in solid pharmaceutical forms: An
overview. Pharmaceutics. 2021;13(4). 
25. Den Engelsman J, Garidel P, Smulders R, Koll H, Smith B,
Bassarab S, et al. Strategies for the assessment of protein
aggregates in pharmaceutical biotech product development.
Pharm Res. 2011;28(4):920–33. 
26. Khodabandehloo A, Chen DDY. Particle sizing methods for the
detection of protein aggregates in biopharmaceuticals.
Bioanalysis. 2017;9(3):313–26. 
27. Taraban MB, Depaz RA, Lobo B, Yu YB. Use of Water Proton
NMR to Characterize Protein Aggregates: Gauging the
Response and Sensitivity. 2019; 
28. Martins MCL, Sousa SR, Antunes JC, Barbosa MA. Protein
Adsorption Characterization. In: Navarro M, Planell JA, editors.
Nanotechnology in Regenerative Medicine Methods in
Molecular Biology (Methods and Protocols). Humana Press;
2012. p. 141–61. 
29. Nakanishi K, Sakiyama T, Imamura K. On the adsorption of
proteins on solid surfaces, a common but very complicated
phenomenon. J Biosci Bioeng. 2001;91(3):233–44. 
260
A
N
A
LI
Z
N
E
 T
E
h
N
IK
E
 Z
A
 V
R
E
D
N
O
TE
N
JE
 (N
E
)S
TA
B
IL
N
O
S
TI
 P
R
O
TE
IN
O
V
farm vestn 2022; 73
30. Hlady V, Buijs J, Jennissen HP. Methods for studying protein
adsorption. Methods Enzymol. 1999;309:402–29. 
31. Crommelin DJA, Sindelar RD, Meibohm B. Pharmaceutical
biotechnology. 3rd editio. Current Opinion in Biotechnology.
2008. 
32. Tang L, Persky AM, Hochhaus G, Meibohm B. Pharmacokinetic
aspects of biotechnology products. J Pharm Sci.
2004;93(9):2184–204.