I-13 Pregledni prispevek/Review article CITOGENETIČNE IN MOLEKULARNOGENETIČNE PREISKAVE PRI UGOTAVLJANJU KRONIČNE MIELOIČNE LEVKEMIJE IN SPREMLJANJU ZDRAVLJENJA THE ROLE OF CYTOGENETICS AND MOLECULAR GENETICS IN DIAGNOSIS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA AND MONITORING OF TREATMENT RESPONSE Helena Podgornik1, Tadej Pajič1, Nadja Kokalj-Vokač2, Andreja Zagorac 2, Ruth Rupreht3, Peter Černelč1 1 Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška cesta 7, 1525 Ljubljana 2 Laboratorij za medicinsko genetiko, Splošna bolnišnica Maribor, Ljubljanska 5, 2000 Maribor 3 Zavod RS za transfuzijsko medicino, Šlajmerjeva 6, 1000 Ljubljana Prispelo 2004-02-13, sprejeto 2004-03-23; ZDRAV VESTN 2004; 73: Suppl. I: 13–7 Keywords: standard cytogenetic analysis; FISH; quantita- tive PCR Abstract – Background. Chronic myeloid leukemia serves as a model for the disease where the knowledge as well as the development of different new methods from molecular bio- logy were successfully introduced into the clinical practice. Methods. Standard cytogenetic analysis was primarily used for detecting the translocation between chromosomes 9 and 22: t(9;22) while fluorescence in situ hybridization (FISH) and real time PCR (Q-RT-PCR) were mainly employed for monitoring of the disease. We evaluated the results of both molecular diagnostic methods. During the past few years the work has been done in the laboratory of the Department for haematology in Ljubljana and Laboratory for Medical Gene- tics in Maribor. Results. A good correlation of results obtained by both methods was confirmed for the period of time before the complete cytogenetic remission. We also established an initial BCR-ABL/ABL ratio of 0.94 which is a basis for later determination of a major molecular remission which is defined as ≥ 3 log reduction in BCR-ABL/ABL. Conclusions. Standard cytogenetic analysis of bone marrow cells is the basic diagnostic approach in haematologic malignancies. At the same time FISH and PCR can also be used for confirmation of recurrent chromosomal abnorma- lities. FISH is the most appropriate method for CML moni- toring during the first period of therapy. When cytogenetic remission is achieved, Q-RT-PCR is a method of choice. In acute leukaemia PCR is mainly used in remission for the detection of malignant clone. If the clone can not be detected even by nested RT-PCR, prognosis of the disease is rather good. Ključne besede: standardna citogenetična preiskava; FISH; kvantitativni PCR Izvleček – Izhodišča. Kronična mieloična levkemija (KML) je značilen primer klonske mieloproliferativne bolezni, pri kateri se citogenetična in molekularnogenetična znanja in na njih temelječe preiskave uporabljajo za natančno potrdi- tev bolezni, za učinkovito spremljanje zmanjševanja bole- zenskega klona celic med zdravljenjem, za spremljanje more- bitne ponovitve bolezni in minimalnega preostanka bolezni. Metode. Za potrditev bolezni določamo translokacijo t(9;22) s standardno citogenetično preiskavo, uspešnost zdravljenja pa spremljamo z dvema molekularnogenetičnima preiskavama, fluorescenčno in situ hibridizacijo (FISH) ter verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (Q-RT-PCR). Pregledali smo izsledke teh preiskav, ki smo jih opravili pri 40 bolnikih na Kliničnem oddelku za hematologijo v Ljubljani in Laboratoriju za medi- cinsko genetiko v Mariboru v zadnjih štirih letih. Rezultati. Za spremljanje KML v prvem obdobju do stabilne citogenetične remisije smo prisotnost kromosoma Philadel- phia potrjevali s preiskavo FISH. Po približno letu in pol je Ph (+) celic praviloma manj kot 5–10%, zato smo bolezen začeli spremljati s preiskavo Q-RT-PCR, nadaljevali pa smo tudi s preiskavo FISH. Ugotovili smo dobro ujemanje obeh metod pred popolno citogenetsko remisijo. Izračunali smo tudi iz- hodiščno vrednost razmerja prepisov BCR-ABL/ABL (0,94) in na njeni osnovi določili delež bolnikov, ki so dosegli dobro molekularno remisijo. Zaključki. Temeljna preiskava pri diagnosticiranju hemato- loških novotvorb je standardna citogenetična preiskava kost- nega mozga. Za ciljno potrjevanje pričakovanih kromosom- skih nepravilnosti ob odkritju bolezni lahko vzporedno izva- jamo tudi preiskavi FISH ter PCR. Pri bolnikih z akutno levke- mijo je v obdobju remisije raven rakastih celic tako majhna, da je večinoma najustreznejša preiskava PCR. Če z njo ne zaznamo prisotnosti rakastega klona, lahko zanesljivo napo- vemo ugoden potek bolezni. ZDRAV VESTN 2004; 73: 13–7 I-14 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I Uvod Molekularna citogenetika in molekularna genetika je doživela v zadnjih desetletjih izjemen razvoj, ki je pripeljal do uvedbe številnih novih preiskav in načinov zdravljenja v klinično hema- tologijo. Sorazmerno dobra dostopnost in homogenost vzorca krvi in kostnega mozga pri levkemijah in malignih limfomih je eden od razlogov, da so se prav na področju hematologije te preiskave uveljavile. Pri hematoloških obolenjih to pomeni sin- tezo vseh informacij, tako tradicionalnih citomorfoloških in imu- nofenotipskih kot tudi novejših genomskih, proteomskih in farmakogenomskih (1). Kronična mieloična levkemija (KML) je primer klonske mieloproliferativne bolezni, pri kateri se citogenetična in molekularnogenetična znanja in na njih teme- lječe preiskave uporabljajo za potrditev bolezni, učinkovito spremljanje zmanjševanja bolezenskega klona celic med zdrav- ljenjem, spremljanje morebitne ponovitve bolezni in minimal- nega preostanka bolezni (2). Kromosom Philadelphia (Ph) je bil prva ugotovljena ponavljajoča se kromosomska nenormal- nost, ki je bila povezana s pojavom maligne novotvorbe. S kla- sično citogenetično preiskavo so dokazali, da nastane zaradi recipročne translokacije t(9;22) (q34;q11.2). Molekularnoge- netične preiskave so kasneje potrdile, da ta translokacija vodi do fuzije protoonkogena ABL, ki leži na kromosomu 9 in BCR področja na kromosomu 22 (3). Za opredelitev bolezni upo- rabljamo standardno citogenetično preiskavo, zdravljenje pa spremljamo z molekularnocitogenetičnimi in molekularnoge- netičnimi preiskavami. Te preiskave trenutno omogočajo spre- mljanje odziva na zdravljenje pri približno polovici hematolo- ških novotvorb (4). Standardna citogenetična preiskava Standardna citogenetična preiskava ostaja temeljno, preprosto in učinkovito orodje za vpogled v genom (5). Pomembna je v vseh obdobjih bolezni: za opredelitev diagnoze, za določitev velikosti malignega klona, posredno za napoved prognoze, za potrditev remisije in ugotovitev ponovitve bolezni. Poleg teh neposredno uporabnih rezultatov pa je zelo pomembna tudi na področju osnovnih raziskav genov, ki so ključni za nastanek novotvorbe (6). Ugotavljanje specifičnih kromosomskih spre- memb, s pomočjo fluorescenčne in situ hibridizacije (FISH) in verižne reakcije s polimerazo (PCR), lahko povzroči, da spre- gledamo dodatne kromosomske preureditve, ki so prisotne že ob samem začetku bolezni, ali pa nastanejo med ali po zdravlje- nju. To je najbolj raziskano pri bolnikih s KML, pri katerih so med zdravljenjem z imatinib mezilatom nastale klonske kromosom- ske spremembe v celicah brez Ph kromosoma (1). Po smernicah ameriških medicinskih genetikov uporabimo preiskavo FISH po prej opravljeni standardni citogenetični preiskavi (7). Sterilno odvzet aspirat kostnega mozga za citogenetično preiskavo pre- nesemo v sterilno gojišče, ki omogoča ohranitev vitalnosti celic med prenosom vzorca v citogenetski laboratorij. Gojišču mora biti dodan Na-heparin, ki v nasprotju z nekaterimi antikoagu- lanti, npr. EDTA, ne deluje toksično in ne vpliva na kasnejšo delitev in zorenje celic v kulturi. Prenos do laboratorija mora biti hiter, na vsak način pa izveden prej kot v 24-ih urah. Poteka lahko pri sobni temperaturi, transport na ledu ni priporočljiv (8). Kariotip navadno razkrije ponavljajoče se in tudi preostale kromosomske nepravilnosti. Preiskave za potrjevanje specifičnih kromosomskih nepravilnosti Prenos po Southernu, FISH z molekulskimi sondami ter različ- ne izvedbe PCR so osnovne preiskave, ki jih uporabljamo za ugotavljanje pričakovanih specifičnih kromosomskih preure- ditev pri hematoloških novotvorbah. Tudi pri nas redno upo- rabljamo FISH in PCR preiskavi. Ker ima vsaka od preiskav določene prednosti in omejitve, različna je njuna občutljivost, stabilnosti tarčnih molekul ter zgradbi sond, je prav, da izbere- mo metodo, ki bo pri posameznem bolniku in bolezni dala najbolj zanesljiv in informativen podatek. Preiskava FISH V primerjavi s standardno citogenetično preiskavo je pred- nost preiskave FISH v tem, da obide največji problem klasične citogenetike – zadostno število delečih se tumorskih celic (6). Tarčna molekula je navadno DNK v interfaznem ali metafa- znem jedru celice, ta pa je pritrjena na predmetno mikro- skopsko steklo. S tako pritrjeno DNK hibridizira enostranska komplementarna sonda DNK. Nukleotidi sonde so označeni s fluorescenčnim barvilom, kar omogoči kasnejšo oceno ozna- čenih celic s pomočjo fluorescenčnega mikroskopa (9). Po zgradbi DNK sond ločimo različne vrste preiskav FISH. Pri določanju kompleksnejših kromosomskih preureditev lahko uporabimo tudi t.i. večbarvni FISH, pri katerem uporabimo 3 do 4 različno obarvane sonde. Pri določanju številčnih kromo- somskih nepravilnosti (monosomije, diploidije, trisomije) upo- rabljamo centromerne sonde. Molekulske sonde za FISH so lahko večje od sond in začetnih oligonukleotidov, ki jih upo- rabljamo pri preiskavi PCR, kar je v primerih, ko so točke preloma zelo oddaljene, velika prednost. Tako je npr. pri de- lecijah kromosoma 13q, ki so prognostično pomembne pri plazmocitomu, FISH najbolj razširjena za ugotavljanje ome- njene kromosomske nepravilnosti (10). Obenem FISH omo- goča zaznavanje določenih preureditev, ki jih s klasično kari- otipizacijo ne opazimo (11). Zato se je delež bolnikov, pri katerih odkrijemo kromosomske nepravilnosti, z uvedbo teh- nike FISH zelo povečal (12). Za potrditev KML je preiskava FISH posebno pomembna pri tistih bolnikih, pri katerih s stan- dardno citogenetično preiskavo kromosoma Ph ne ugotovi- mo. Pri preureditvah, ki na molekulski ravni vodijo do enakih posledic kot t(9;22), gre najbolj pogosto za vključitev 3´ABL gena v kromosom 22. Zato govorimo o zamaskiranem Ph kro- mosomu. S preiskavo FISH dokažemo tudi dodatni kromosom Ph, ki spada med najpogostejše dodatne kromosomske spre- membe, ki jih ugotovimo predvsem v blastni preobrazbi KML. Dodatni kromosom Ph nastane iz spremenjenega kromoso- ma 22 in ne kot posledica še ene translokacije. Je pomemben za oceno poteka bolezni (8). Preiskava FISH je ključna predvsem ob postavitvi diagnoze, v začetku zdravljenja ali ob ponovitvi bolezni, ko je količina nenor- malnih celic velika in je potrebna sorazmerno majhna analitska občutljivost. Za ugotavljanje minimalnega preostanka bolezni (MRD) po zdravljenju pa je FISH premalo občutljiv, saj pri naj- boljših molekulskih sondah občutljivost seže pod 1% (13). De- lež lažno pozitivnih izsledkov je zaradi naključnega prekrivanja signalov lahko sorazmerno velik. Na osnovi poskusov z zdravimi osebami so ugotovili, da je lahko lažno pozitivnih rezultatov celo 5% (14). Medtem ko je ujemanje med rezultati verižne reakcije s polimerazo v realnem času (Q-RT-PCR) pri kostnem mozgu in krvi zelo dobro, nekatere raziskave oporekajo zanesljivost FISH na vzorcih krvi brez razvrščanja celic bele vrste pred tem (15). FISH lahko izvedemo neposredno na celicah krvi (odvzeta z do- datkom Na-heparina) ali kostnega mozga, ki jih izoliramo. Nava- dno pa jih predhodno kratkotrajno gojimo kot za standardno ci- togenetično preiskavo. FISH pa je zlasti pomembna pri tistih vzor- cih, kjer klasična citogenetična preiskava zaradi odsotnosti me- tafaz ni mogoča (16). Preiskava PCR Ugotavljanje strukturnih kromosomskih nepravilnosti, trans- lokacij, delecij in inverzij oziroma iz njih nastalih združenih ali okvarjenih genov s PCR temelji na oligokonukleotidih (angl. primer), ki so komplementarni zaporedju DNK ob prelomih na kromosomih. Prelomna mesta se od bolnika do bolnika raz- likujejo, vendar ležijo znotraj določenih regij kromosoma. Pri I-15 levkemijah so te regije lahko široke tudi nekaj 100 kbp, tako da PCR na osnovi genomske DNK ni mogoča. Zato uporabimo himerično informacijsko RNK (mRNK), ki jo prepišemo v kom- plementarno DNK (cDNK) z uporabo naključnih ali specifič- nih oligonukleotidov in encima reverzna transkriptaza (RT). cDNK je osnova za PCR reakcijo, ki jo označimo kot RT-PCR (17). Ker je razvoj, vrednotenje in vzdrževanje velikega števi- la različnih PCR protokolov za prepoznavanje vse več kromo- somskih nepravilnosti zamudno in drago, se ob pojavu, pono- vitvi ter po zdravljenju bolezni s citotoksičnimi zdravili vse bolj uporablja hkraten PCR (multiplex PCR) (1). Ta omogoči, da lahko v eni reakciji z več pari oligonukleotidov ugotovimo več ciljnih segmentov cDNK, ki so značilni za posamezne kromo- somske nepravilnosti (18). S tem zmanjšamo stroške in skraj- šamo čas preiskav. Za vse PCR preiskave uporabimo perifer- no kri ali kostni mozeg, ki ju odvzamemo z dodatkom EDTA. Preiskave za določanje minimalnega preostanka bolezni (MRD) Če pride do ponovitve bolezni, je to posledica preostalega malignega klona celic, ki jih lahko ugotovimo le z najobčutlji- vejšimi preiskavami. Ta majhen klon malignih celic imenuje- mo tudi MRD. Cilj zdravljenja je, da dosežemo molekularno- genetično remisijo. Prisotnost klona malignih celic načeloma napoveduje ponovitev bolezni, čeprav zveza med preostan- kom malignih celic in ponovitvijo bolezni ni povsem jasna (7, 19). Občutljivost, ki je potrebna pri preiskavah za določanje MRD, je reda velikosti 10–5 do 10–6. Nadalje naj bi bilo mogoče ovrednotenje števila celic, bile naj bi hitro izvedljive, cenene in specifične (1). Merilu zadostne občutljivosti ter velike speci- fičnosti ustrezajo preiskave PCR (4). Med njimi ima posebno mesto vgnezdena PCR (angl. nested). Pri njej povečamo spe- cifičnost in občutljivost tako, da pridelek PCR iz prve reakcije v naslednji reakciji PCR pomnožimo z oligonukleotidi, ki se prilegajo znotraj prvega pridelka PCR. Preiskava je zelo obču- tljiva, vendar ugotovimo samo odsotnost ali prisotnost značil- nega segmenta genomske ali cDNK. Ne omogoči pa količin- skega vrednotenja (17). Za spremljanje MRD je zato bolj pri- meren t.i. kvantitativni PCR (Q-PCR). Najbolj uveljavljena je preiskava PCR v realnem času (Q-RT-PCR). Združuje pomno- ževanje in ugotavljanje iskanega zaporedja v enem koraku. Za ugotavljanje pomnoženih DNK ali cDNK molekul lahko upo- rabimo fluorescenčno barvilo, ki se po vsakem ciklusu reakci- je PCR vgradi med verigi DNK, ali fluorescenčno označen oli- gonukleotid – sondo. Sonda se veže na ustrezno mesto znotraj področja pomnoževanja PCR. Med izgradnjo verige DNK Taq polimeraza s 5'-nukleazno aktivnostjo razgradi vezano sondo. Pri tem se sprosti obveščevalno barvilo, ki po vzbujanju s sve- tlobo določene valovne dolžine flourescira. Vsak ciklus reakci- je merimo naraščajočo intenzivnost fluorescence, ki je sora- zmerna količini pridelka PCR. Po reakciji računalniški program določi tisti ciklus PCR reakcije, ko se intenzivnost flourescence loči od ozadja (ang. threshold cycle, C t ). Število kopij (ali količi- no) nukleotidnega zaporedja v vzorcu izračunamo iz umerit- vene krivulje na osnovi C t vrednosti. Umeritveno krivuljo pri- pravimo s pomočjo znane začetne količine RNK, cDNK, pose- bej za to pripravljenega plazmida ali DNK (20). Bolniki in metode Bolniki Med letoma 1999 in 2004 smo v Laboratoriju za medicinsko genetiko v Mariboru ugotovili pri 40 bolnikih prisotnost trans- lokacije t(9;22) s klasično citogenetično analizo. Pri vseh bolni- kih smo zdravljenje spremljali s FISH, pri desetih (10/40) pa smo translokacijo s FISH potrdili tudi ob postavitvi diagnoze. PCR preiskave smo naredili v laboratoriju Kliničnega oddelka za hematologijo v Ljubljani. 15 bolnikov (15/40) smo spremlja- li z obema preiskavama tudi v času prehoda v citogenetično remisijo, 20 bolnikov (20/40) pa v obdobju popolne citogene- tične remisije. Standardna in molekularna citogenetika Celice kostnega mozga smo kratkotrajno (24 h) gojili pri 37 oC v atmosferi s 5% CO 2 . Gojenje smo izvajali v dveh vzporednih kulturah. Uporabili smo dve različni komercialno dostopni go- jišči, KarrioMax (Gibco, Velika Britanija) in Amniomed (Bio- chrom, Nemčija), ki smo jima dodali timidin do končne kon- centracije 1 mM. Aspirat kostnega mozga, ki smo ga prej spra- li s Hanksovo raztopino, smo vcepili v gojišče, začetna koncen- tracije celic je bila 1*106/ml. Pol ure pred zaključkom gojenja smo kulturi dodali kolcemid, 0,1 µg/ml. Celice smo po običaj- nem postopku pripravili za citogenetično preiskavo (8). FISH preiskavo smo opravili s pomočjo molekulskih DNK sond BCR/ ABL ES (Vysis, ZDA). Molekularna genetika Postopek osamitve mRNK molekule iz celic kostnega mozga (5x106 levkocitov) smo izvedli na kolonah po protokolu High Pure RNA Isolation reagenčnega kompleta (Roche, Nemčija). Kolone so izdelane in oblikovane izključno za osamitev celot- ne RNK, po načinu adsorpcije na steklenih vlaknih (21). Obrat- no prepisovanje 1 µg RNK in Q-RT-PCR smo izvedli po usklaje- nem postopku Q-RT-PCR evropske mreže za ugotavljanje MRD pri levkemijah z uporabo načina TaqMan (Applied Bio- system, VB) (22). Za pripravo umeritvene krivulje smo za stan- dard uporabili komercialno pripravljene plazmide s serijskimi razredčitvami znanega števila kopij od 106 do 101 (Ipsogen, Francija). Rezultati z razpravljanjem Preiskave za sledenje specifičnih kromosomskih nepravilno- sti se pri nas sistematično uporabljajo šele zadnja štiri leta. Tako smo zbrali podatke z uporabo FISH in standardnega PCR, medtem ko je bil PCR v realnem času uveden zadnje leto. Zato je število doslej zbranih podatkov sorazmerno majhno. Tako kot v svetu imamo tudi mi največ podatkov za bolnike s KML, kjer so bile opisane preiskave uporabljene za časovno slede- nje poteka bolezni. To je postalo še zlasti pomembno po uved- bi zdravljenja z imatinib mezilatom. Znano je, da je ujemanje med številom BCR-ABL prepisov v krvi in številom Ph(+) meta- faz v kostnem mozgu zelo dobro (23). Večina objavljenih raz- iskav temelji na primerjavi rezultatov standardne citogenetič- ne preiskave ter Q-RT-PCR (1), mi pa predstavljamo izsledke dobljene s FISH preiskavo na interfaznih jedrih in Q-RT-PCR. Slika 1 prikazuje, kako se je v obdobju treh let spreminjal de- lež Ph(+) celic pri dveh bolnikih s KML, zdravljenih z imatinib mezilatom. Popolno citogenetično remisijo naj bi v letu in pol doseglo 76% bolnikov, zdravljenih z imatinib mezilatom oziro- ma 18% bolnikov, zdravljenih z interferonom α in hkrati cito- zin-arabinozidom (24). Skladno z navedenimi podatki je tudi pri naših bolnikih prišlo v letu in pol do t. i. citogenetične remi- sije. Takrat je dosežena spodnja meja občutljivosti tehnike FISH (5–10% pozitivnih celic) in nastopi obdobje, ko začnemo z zasledovanjem MRD. V začetku zdravljenja večinoma opaža- mo enakomerno zmanjševanje (bolnik 2), lahko pa tudi ciklič- no spreminjanje (19) deleža Ph(+) celic, kot prikazuje slika 1. Delež Ph(+) celic v času zasledovanja MRD ni več dovolj informativen, ker je časovna odvisnost njegovega zmanjševa- nja eksponentna. Slika 1B, kjer je uporabljeno logaritemsko merilo, pokaže, da se obe preiskavi, FISH in Q-RT-PCR, med- sebojno zelo dobro dopolnjujeta. S Q-RT-PCR začnemo v času med letom in letom in pol, če je seveda pri bolniku dosežen PODGORNIK H, PAJIČ T, KOKALJ-VOKAČ N ET AL. CITOGENETIČNE IN MOLEKULARNOGENETIČNE PREISKAVE I-16 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I Za sledenje KML v času remisije upo- rabljamo preiskavo Q-RT-PCR, ki naj bi jo prvi dve leti izvajali na 3 do 6 mese- cev, nato pa vsakega pol leta nadaljnji dve leti (27). Pred tem smo citogenetič- no remisijo KML spremljali s FISH. Od- stopanja med rezultati obeh preiskav so precejšnja. Po podatkih iz literature imajo bolniki v popolni citogenetični re- misiji vrednost BCR-ABL/ABL pod 1%, v našem primeru pa vrednosti dosegajo tudi 6% (28). Tako veliko odstopanje med metodama gre verjetno pripisati dejstvu, da tehnika FISH za oceno MRD ni primerna. Poleg tega smo šele uvajali preiskavo Q-RT-PCR. Bolniki, ki niso v citogenetični remisiji, imajo le izjemo- ma vrednost BCR-ABL/ABL pod 1% in tudi mi smo doslej ugotovili le en tak primer. Pri dveh bolnikih, ki sta bila po zgoraj navedenih merilih v dobri mole- kularnogenetični remisiji, je FISH po- kazal pozitiven rezultat. Vendar je bil ta zelo majhen (0,5%). V nobenem pri- meru pa s preiskavo FISH nismo dobili pozitivnega rezultata pri bolnikih, kjer s Q-RT-PCR nismo ugotovili malignega klona, kar je zelo pomembno s stališča zanesljivosti preiskave. Sl. 1. Določanje deleža Ph(+) celic s FISH (!) in Q-RT-PCR (!) pri dveh bolnikih s KML, zdravljenih z imatinib mezilatom. (A) Prikaz zmanjševanja deleža rakavega klona celic v času; (B) odvisnost logaritma deleža rakavih celic od časa. Figure 1. Proportion of Ph(+) cells as determined by FISH (!) and Q-RT-PCR (!) in two CML patients on imatinib mesilate. (A) Decrease of malignant clone in time; (B) logarithmic dependence of proportion of Ph(+) cell in time. pričakovan odgovor na zdravljenje. Meja zaznavanja Q-RT-PCR je 10–5, ko z vgnezdeno PCR še zaznamo maligni klon, ne mo- remo pa ga več količinsko ovrednotiti. Pod vrednostjo razmer- ja 10–6 malignega klona ne moremo več zaznati in z zdravlje- njem naj bi dosegli to mejo, t. i. popolno molekularno remisi- jo. Grafični prikaz podatkov je koristen, ker iz absolutnih vre- dnosti težje opazimo upočasnitev zmanjšanja deleža maligne- ga klona ali ustavljanje pri določeni vrednosti, ki je sicer majh- na (Sl. 1B, bolnik 1). Ob postavitvi diagnoze KML praviloma določimo zelo velike de- leže celic s Ph(+) s FISH kot tudi s standardno citogenetično pre- iskavo (Razpr. 1). Q-RT-PCR ob postavitvi diagnoze ni v funkciji določitve translokacije same, pač pa ima vlogo pri določitvi izho- diščne srednje vrednosti deleža BCR-ABL/ABL prepisov. Ta je bistvena za določitev obsega molekularnega odziva. Po nekate- rih raziskavah je omenjena srednja vrednost ob postavitvi dia- gnoze nad 1 (100%), kar razlagajo z velikim deležem nezrelih celic (23). Mi smo tako visoko vrednost določili le pri nekaj bol- nikih (3/10). Dober molekularen odziv je dosežen, če je delež BCR-ABL/ABL prepisov za tri velikostne razrede manjši od sred- nje vrednosti, ki smo jo določili pred začetkom zdravljenja na večjem številu bolnikov (25). Srednja vrednost razmerja m-RNK prepisov BCR-ABL/ABL ob postavitvi diagnoze je v našem labo- ratoriju 0,94 (Razpr. 1). Glede na tako določeno srednjo vrednost lahko govorimo o dobri molekularni remisiji, ko je razmerje BCR- ABL/ABL pod 0,00094. Po tem kriteriju (tri velikostne razrede pod osnovno črto) smo doslej določili dober molekularen odziv pri bolnikih, ki se zdravijo leto in pol ali manj, v 55% (11/20). Med- narodne raziskave navajajo nekoliko manjše (39%) vrednosti (25). Po navedbah nekaterih avtorjev je molekulrni odziv dober, če je vrednostjo razmerja m-RNK prepisov pod 0,00045 (26). Tako majhne vrednosti smo določili pri 30% bolnikov. Ker je šte- vilo razpoložljivih podatkov za določitev izhodiščne povprečne vrednosti zaenkrat majhno in zato velik standardni odklon, pred- videvamo, da se bodo s povečevanjem števila podatkov rezulta- ti v prihodnje nekoliko spremenili. Zaenkrat pa pri nas veljajo te navedene vrednosti. Razpr. 1. Ključni parametri za določitev citogenetične in molekularne remisije pri kronični mieloični levkemiji z metodama FISH in Q-RT-PCR. Table 1. Key parameters for determination of cytogenetic and molecular genetic remission at chronic myeloid leukaemia by FISH and Q-RT-PCR. Postavitev Prehod v cito- Dobra moleku- diagnoze genetično remisijo larna remisija First Cytogenetic Major molecular diagnosis remission remission Število analiz Number of analysis 10 15 20 Delež Ph(+) celic Amount of Ph(+) cells *99,1 ± 1,2 0–8 0 FISH (%) Razmerje BCR-ABL/ABL BCR-ABL/ABL ratio *0,944 ± 0,37 0,15–0,0012 < 0,00094 < 0,00045 Q-RT-PCR Število bolnikov 11/20 6/20 Number of patients (55%) (30%) * povprečna vrednost / mean value Zaključki Temeljna preiskava pri diagnostiki hematoloških novotvorb je standardna citogenetična preiskava kostnega mozga. Za ciljno potrjevanje pričakovanih kromosomskih nepravilnosti ob od- kritju bolezni lahko vzporedno izvajamo tudi preiskavo FISH ter PCR. Ko spremljanje zdravljenje KML velja, da v prvem obdobju do stabilne citogenetične remisije, prisotnost Ph kro- mosoma ugotavljamo s FISH preiskavo. Pri večini bolnikov, ki jih zdravimo z imatinib mezilatom, je to čas približno enega leta, ko opravimo tri do štiri preiskave FISH. Ko določimo vre- dnost Ph(+) celic pod 5–10%, začnemo spremljati bolezen s Q-RT-PCR, ki je bolj občutljiva kot FISH. Standardno citogene- tično preiskavo ponovimo pri spremembi poteka bolezni za- I-17 radi relativno pogostega pojavljanja dodatnih kromosomskih nepravilnosti, ki jih z molekularno genetičnimi preiskavami ne zasledimo. Pri bolnikih z akutno levkemijo, pri katerih smo ugotovili kromosomske spremembe, je v obdobju remisije ra- ven malignega klona tako majhna, da je najprimernejša pre- iskava PCR. Zaradi velike občutljivosti je kvantitativna ali vgne- zdena PCR preiskava zaenkrat tako dobra, da pri bolnikih, kjer z njo ne zaznamo prisotnosti malignega klona, lahko zaneslji- vo napovemo ugoden potek bolezni. Literatura 1. Braziel ML, Shipp MA, Feldman AL et al. Molecular diagnostics. In: Broudy VC, Prchal JT, Tricot GJ eds. Hematology 2003. San Diego: American Society of Hematology, 2003: 279–93. 2. Vardiman JW, Harris NL, Brunning RD. The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms. Blood 2002; 100: 2292–302. 3. Chen Z, Sandberg AA. Molecular cytogenetic aspects of hematological mali- gnancies: Clinical implications. Am J Med Gen 2002; 115: 130–41. 4. Lo Coco F, De Santis S, Esposito A, Divona M, Diverio D. Molecular monito- ring of hematologic malignancies and future issues. Semin Hematol 2002; 39: 14–7. 5. Dastugue N. The interest of standard and molecular cytogenetics for diagno- sis of acute leukemia. Pathol Biol 2003; 51: 337–45. 6. Schlegelberger B, Metzke S, Harder S, Zuhlke-Jenisch R, Zhang Y, Siebert R. Classical and molecular cytogenetics of tumor cells. In: Wegner RD ed. Diagnostic cytogenetics. Berlin: Springer, 1999: 151–85. 7. Jameson JL, Kopp P. Principels of human genetics. In: Braunwald E, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL eds. Principles of internal medicine. 15th edition. New York: McGraw-Hill, 2001: 375–418. 8. Kjeldsen E, Kolvraa S. FISH Technique, FISH probes and their application in medicine and Biology – An Overview. In: Raautenstraus BW, Liehr T eds. FISH Technology. Berlin: Springer, 2002: 3–50. 9. Liebisch P, Viardot A, Baßermann N et al. Value of comparative genomic hybridization and fluorescence in situ hybridization for molecular diagno- stics in multiple myeloma. Br J Haematol 2003; 122: 193–201. 10. Bernasconi P, Cavigliano PM, Boni M et al. Is FISH a relevant prognostic tool in myelodysplastic syndromes with a normal chromosome pattern on con- ventional cytogenetics? A study on 57 patients. Leukemia 2003; 17: 2107–12. 11. Drach J, Schuster J, Nowotny H et al. Multiple myeloma: high incidence of chromosomal aneuploidy as detected by interphase fluorescence in situ hybridization. Cancer Res 1995; 55: 3854–9. 12. Roulston D, Le Beau MM. Cytogenetic analysis of hematologic malignant diseases. In: Barch MJ, Knutsen T, Spurbeck JL eds. The AGT Cytogenetics Laboratory Manual. 3rd ed. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1997: 325–55. 13. Martin-Subero JI, Gesk S, Harder L, Grote W, Siebert R. Interphase cytogene- tics of hematological neoplasms under the perspective of the novel WHO classification. Anticancer Res 2003; 23: 1139–48. 14. Kowalczyk JR, Gaworczyk A, Winnicka D, Lejman M, Babicz M. Fluorescence in situ hybridization BCR/ABL fusion signal rate in interphase nuclei of healthy volunteer donors: a test study for establishing false positive rate. Cancer Genet Cytogenet 2003; 142: 51–5. 15. Reinhold U, Hennig E, Leiblein S, Niederwieser D, Deininger MWN. FISH for BCR-ABL on interphases of peripheral blood neutrophils but not of unselec- ted white cells correlates with bone marrow cytogenetics in CML patients treated with imatinib. Leukemia 2003; 17: 1925–9. 16. Van Dongen JJ Macintyre EA, Gabert JA et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concer- ted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13: 1901–28. 17. Anon. mD x HemaVision Multiplex RT-PCR System for Typing/Subtyping of leukemia BIO RAD, Instruction manual, 2001. 18. Wetzler M, Byrd JC, Bloomfield CD. Acute and chronic myeloid leukemia. In: Braunwald E, Fauci AS, Kasper DL, Hauser SL, Longo DL, Jameson JL eds. Principles of internal medicine, 15th edition. New York, McGraw-Hill, 2001; 706–14. 19. Anon. ABI Prism 7900HT. Sequence Detection System and SDS Enterprise Databased. Applied Biosystem, User Guide, 2002.  20. Anon. High Pure RNA Isolation kit, ROCHE, Instruction manual, 2000. 21. Gabert JA, Beillard EBW. European standardization and quality control programs of REAL-Time RT-PCR for minimal residual disease detection of fusion gene transcripts in multicentric disease of fusion gene transcripts in multicentric therapeutic trails for leukemia patients. Blood 2000; 96: 311a. 22. Branford S, Hughes TP, Rudzki Z. Monitoring chronic myeloid leukaemia therapy by real-time quantitative PCR in blood is a reliable alternative to bone marrow cytogenetics. British J Haematology 1999; 107: 587–99. 23. O’Brien SG., Guilhot F, Larson RA et al. Imatinib compared with interferon and low-dose cytarabine for newly diagnosed chronic-phase chronic mye- loid leukemia. Engl J Med 2003; 348: 994–1004. 24. Melo JV, Hughes TP, Apperley JF. Chronic myeloid leukemia. In: Broudy VC, Prchal JT, Tricot GJ eds. Hematology 2003. San Diego: American society of Hematology; 2003: 132–52. 25. Hochhaus A, Reiter A, Saußele S et al. Molecular heterogeneity in complete cytogenetic responders after interferon-x therapy for chronic myelo- genous leukemia: low levels of minimal residual disease are associated with continuing remission. Blood 2000; 95: 62–6. 26. Löwenberg B, Griffin JD, Tallman S. Acute myeloid leukemia and acute promyelocytic leukemia. In: Broudy VC, Prchal JT, Tricot GJ eds. Hematology 2003. San Diego: American society of Hematology, 2003: 82–101. 27. Hughes T, Branford S. Molecular monitoring of chronic myeloid leukemia. Semin Hematol 2003; 40: 62–8. PODGORNIK H, PAJIČ T, KOKALJ-VOKAČ N ET AL. CITOGENETIČNE IN MOLEKULARNOGENETIČNE PREISKAVE