483 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Elektropermeom: celični odgovor na elektroporacijo Avtorske pravice (c) 2022 Zdravniški Vestnik. To delo je licencirano pod Creative Commons Priznanje avtorstva-Nekomercialno 4.0 mednarodno licenco. Elektropermeom: celični odgovor na elektroporacijo The electropermeome: cellular response to electroporation Angelika Vižintin, Damijan Miklavčič Izvleček Povečano prepustnost celične membrane zaradi izpostavitve celic oz. tkiv električnemu polju imenujemo elektroporacija. Povzroči vrsto sprememb v celici, od strukturnih in kemijskih sprememb v celični membrani, strukturnih sprememb protei- nov oz. proteinskih kompleksov, prenosa snovi v celice in iz njih do aktiviranja signalnih poti in popravljalnih mehanizmov; ob določenih pogojih sproži tudi celično smrt. S pojmom elektropermeom označujemo tako permeabilizirano celico med ali tik po dovajanju električnih pulzov kot tudi vse poznejše procese, ki ostanejo aktivni še nekaj časa potem, ko ni več mo- goče opaziti povečanega transmembranskega transporta snovi, za katere je celična ovojnica običajno neprepustna, torej tudi po času, ko že ugotavljamo, da je zaceljena. Elektroporacija se uporablja na številnih področjih, vključno z ablacijo tkiv, gensko elektrotransfekcijo za vnos plazmidov v celice ter elektrokemoterapijo. Aplikacije elektroporacije v medicini so učinkovite in varne, vendar so zaradi delovanja električnih pulzov lahko prisotni tudi določeni neželeni stranski učinki, predvsem mišično krčenje in akutna bolečina. Za optimiziranje parametrov elektroporacije in s tem rezultatov na elektro- poraciji temelječih terapij je ključnega pomena nadaljnja razjasnitev osnovnih mehanizmov elektroporacije in vplivov po- sameznih parametrov električnega polja na elektropermeom. Namen prispevka je predstaviti celovit pregled mehanizmov elektroporacije ter elektropermeoma, tj. celičnega odgovora na elektroporacijo. Abstract The increased permeability of a cell membrane due to exposure of cells/tissues to an electric field is called electropora- tion. Electroporation induces a range of changes in the cell - from structural and chemical changes in the cell membrane, structural changes in proteins or protein complexes, transport of substances in and out of the cell, activation of signalling pathways, and repair mechanisms; it also triggers cell death under certain conditions. The term electropermeome is used to describe both the permeabilised cell during or immediately after the delivery of electrical pulses and all subsequent processes that remain active for some time after the increased transmembrane transport of substances for which the cell membrane is normally impermeable has ceased, i.e. even after the membrane has resealed. Electroporation is used in ma- ny areas, including tissue ablation, gene electrotransfer for plasmid delivery into cells and electrochemotherapy. Medical applications of electroporation are effective and safe, but the action of the electrical pulses can cause certain adverse side effects, notably muscle contractions and acute pain. Further elucidation of the underlying mechanisms of electroporation Zdravniški VestnikSlovenia Medical Journal Laboratorij za biokibernetiko, Fakulteta za elektrotehniko, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija Korespondenca / Correspondence: Damijan Miklavčič, e: Damijan.Miklavcic@fe.uni-lj.si Ključne besede: elektropermeabilizacija; električni pulzi; transmembranski transport; peroksidacija lipidov; celična smrt Key words: electropermeabilization; electrical pulses; transmembrane transport; lipid peroxidation; cell death Prispelo / Received: 10. 5. 2021 | Sprejeto / Accepted: 5. 4. 2022 Citirajte kot/Cite as: Vižintin A, Miklavčič D. Elektropermeom: celični odgovor na elektroporacijo. Zdrav Vestn. 2022;91(11–12):483–95. DOI: https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3267 eng slo element sl article-lang 10.6016/ZdravVestn. doi 10.5.2021 date-received 5.4.2022 date-accepted Physiology Fiziologija discipline Review article Pregledni znanstveni članek article-type The electropermeome: cellular response to electroporation Elektropermeom: celični odgovor na elektropo- racijo article-title The electropermeome Elektropermeom alt-title electropermeabilization, electrical pulses, transmembrane transport, lipid peroxidation, cell death elektropermeabilizacija, električni pulzi, trans- membranski transport, peroksidacija lipidov, celična smrt kwd-group The authors declare that there are no conflicts of interest present. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo nobeni konkurenčni interesi. conflict year volume first month last month first page last page 2022 91 11 12 483 495 name surname aff email Damijan Miklavčič 1 Damijan.Miklavcic@fe.uni-lj.si name surname aff Angelika Vižintin 1 eng slo aff-id Laboratory of Biocybernetics, Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana, Ljubljana, Slovenia Laboratorij za biokibernetiko, Fakulteta za elektrotehniko, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija 1 484 FIZIOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3267 1 Uvod Celice preko sistema ionskih kanalčkov in črpalk vzdržujejo razliko v električnem potencialu med no- tranjo in zunanjo stranjo celične membrane, kar ime- nujemo mirovna transmembranska napetost. Pri ev- kariontskih celicah se ta navadno giblje med –40 in –70 mV. Ob izpostavitvi celice električnemu polju pa se transmembranski napetosti prišteje še vsiljena tran- smembranska napetost, ki je prisotna v času izposta- vitve celice električnemu polju. Izpostavitev celic elek- tričnemu polju dovolj visoke jakosti lahko vsili znatno višjo transmembransko napetost od mirovne. Tako visoka transmembranska napetost in zaradi nje visoko električno polje v membrani vodi do vrste sprememb, vključno s strukturnimi spremembami v membrani in z modifikacijami molekul, ki sestavljajo membrano. Zato lahko preko membrane prehajajo molekule, za katere je membrana običajno neprepustna. Povečano prepustnost celične membrane, tj. permeabilizacijo membrane, zaradi izpostavitve celic/tkiv električnemu polju imenujemo elektroporacija oz. tudi elektroper- meabilizacija (1). Električno polje pri elektroporaciji vzpostavimo z dovajanjem električnih pulzov preko elektrod, ki so v stiku z vzorcem oz. tkivom. Elektroporacija se uporablja na številnih področ- jih, vključno z ablacijo tkiv, gensko elektrotransfekcijo za vnos plazmidov v celice ter elektrokemoterapijo, ki je lokalni postopek za zdravljenje raka s kombinacijo standardnega kemoterapevtika in kratkih električnih pulzov (2). Medicinsko apliciranje elektroporacij je učinkovito in varno. Pri elektrokemoterapiji in ablaciji z elektroporacijo celična smrt v glavnem ni posledica termičnih poškodb, ampak povečane prepustnosti ce- lične membrane. Zato se zdravo okoliško tkivo zaradi terapije ne poškoduje (3,4). Vendar zaradi delovanja električnih pulzov lahko nastanejo tudi nekateri neže- leni stranski učinki, predvsem mišično krčenje, ki lahko povzroča neprijetne občutke in celo bolečino; v neka- terih primerih pa je potrebno dovajanje pulzov uskla- diti z elektrokardiogrami, da preprečimo motnje srč- nega ritma (npr. sprožitev trepetanja srčnih prekatov). Za izboljšanje rezultatov pri aplikacijah, temelječih na elektroporaciji, je ključno razjasniti vpliv posameznih parametrov – od parametrov električnih pulzov (npr. and the effects of individual electric field parameters on the electropermeome is crucial to optimise the parameters of electroporation and consequently the results of electroporation-based therapies. The aim of the present paper is to pro- vide a comprehensive overview of the mechanisms of electroporation and the electropermeome, i.e. the cellular response to electroporation. napetost, trajanje in število pulzov) do geometrije in položaja elektrod – na uspešnost terapije (2). Tradici- onalno se v elektroporacijskih postopkih uporabljajo monofazni pulzi s trajanjem v velikostnem redu mi- kro- in milisekund, vendar se v zadnjih letih preučuje možnost uporabiti nanosekundne pulze in visokofre- kvenčne bifazne pulze v trajanju le nekaj mikrosekund, ker je z njimi možno preseči določene omejitve, ki se pojavljajo pri običajni elektroporaciji z monofaznimi mili- in mikrosekundnimi pulzi. Nanosekundni pulzi zmanjšajo mišično krčenje (5) in manj segrevajo tki- vo zaradi manjše dovedene energije (6). To zmanjšuje verjetnost za toplotne poškodbe, medtem ko uporaba bifaznih pulzov zmanjša mišično krčenje (7,8) in verje- tnost za pojav motenj srčnega ritma (7,9). Celovito optimizacijo parametrov električnih pul- zov za posamezne aplikacije omejuje nepopolno ra- zumevanje osnovnih mehanizmov elektroporacije. Namen prispevka je celovit pregled mehanizmov po- večanja prepustnosti celične membrane zaradi delova- nja električnih pulzov ter vseh nadaljnjih sprememb in procesov, ki jih sproži elektroporacija – od kemičnih sprememb membranskih lipidov in modulacije funk- cije proteinov do sprememb v izražanju genov in sinte- ze proteinov ter aktivacije celične smrti in imunskega odziva. 2 Mehanizmi povečanja prepustnosti membrane Eksperimentalni rezultati kažejo, da se povečanje prepustnosti membrane lahko zgodi v manj kot 10 ns, kar nakazuje na neposredno preureditev membranskih komponent (10). Trenutno uveljavljena razlaga elek- troporacije temelji na nastanku vodnih por v lipidnem dvosloju. Simulacije molekularne dinamike nakazuje- jo, da se (ob dovolj visoki vzpostavljeni napetosti na dvosloju oz. dovolj visokem električnem polju) nasta- janje pore prične z usmeritvijo vodnih molekul v smeri električnega polja in njihovo prodiranje v lipidni dvo- sloj z obeh (intra- in ekstracelularne) strani lipidnega dvosloja (Slika 1A). Molekule vode, usmerjene v sme- ri električnega polja, se z vodikovimi vezmi povežejo 485 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Elektropermeom: celični odgovor na elektroporacijo Slika 1: Nastanek pore v lipidnem (fosfatidilholinskem) dvosloju. (A) orientacija vodnih molekul v smeri električnega polja in penetracija v lipidni dvosloj, (B) pojav vodnih prstov, z vodikovimi vezmi povezanih gruč molekul vode, ki prodirajo v sredico lipidnega dvosloja, (C) združitev vodnih prstov v vodni kanal, imenovan hidrofobna pora, ki povezuje intra- in ekstracelularno stran lipidnega dvosloja, (D) reorientacija fosfolipidov tako, da svoje polarne glave obrnejo proti vodnemu kanalu, ki se na tej stopnji imenuje hidrofilna pora. Polarne glave fosfatidilholina so prikazane kot zeleni in beli krogi, lipidni repi pa zaradi jasnosti niso prikazani. v majhne gruče. Te gruče, imenovane vodni prsti, se povečujejo in vse bolj prodirajo v hidrofobno sredico lipidnega dvosloja (Slika 1B), dokler se ne združijo ta- ko, da povežejo obe strani (intra- in ekstracelularno) in tvorijo vodni kanal (Slika 1C). Tako strukturo ime- nujemo hidrofobna pora. Fosfolipidi se ob prisotnosti vodnih kanalov preusmerijo tako, da obrnejo svoje polarne glave proti nastalemu vodnemu kanalu, da »zaščitijo« nepolarne repe pred vodnimi molekulami. Preusmeritev fosfolipidov stabilizira poro, ki jo na tej stopnji imenujemo hidrofilna pora (Slika 1D). Stabi- lizacija pore omogoči, da v vodni kanal vstopi še več molekul vode in drugih polarnih molekul (1). Ko električno polje ni več prisotno, se pore prične- jo zapirati. Zapiranje por poteka v obratnem vrstnem redu od analognih stopenj nastanka por. Medtem ko se čas, potreben za nastanek por, eksponentno krajša z večanjem jakosti električnega polja (11), je čas, po- treben za zapiranje por, praktično neodvisen od jako- sti električnega polja, ki je sprožilo njihov nastanek; 486 FIZIOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3267 zapiranje por v lipidnih dvoslojih v simulacijah mole- kularne dinamike vedno traja od nekaj deset do nekaj sto nanosekund, kar nakazuje, da pore niso stabilne. V simulacijah ocenjeni čas, potreben za zaprtje por, pa je za več velikostnih redov krajši od eksperimentalno določenega časa, ki je potreben za zaceljenje membran (tj. čas, v katerem je opazen povečan transmembranski transport) (1). Povečano prepustnost celične membra- ne opazimo namreč še nekaj minut za tem, ko električ- no polje ni več prisotno, in to tudi pri uporabi pulzov s trajanjem le nekaj nanosekund. Je pa trajanje povečane prepustnosti celične membrane odvisno od tempera- ture (12-15), kar nakazuje, da je elektroporacija celič- nih membran kompleksnejši proces od zgolj nastanka kratkoživih por v lipidnem dvosloju. Več raziskav kaže na pomen kemičnih sprememb membranskih lipidov in modulacije funkcije proteinov pri povečanju pre- pustnosti membrane pri elektroporaciji (1). Elektroporacija povzroči vrsto sprememb v celič- ni membrani (nastanek lipidnih in proteinskih por, oksidacijo membranskih lipidov), depolarizacijo, na- stanek reaktivnih kisikovih zvrsti – RKZ (angl. ROS), iztekanje ATP in K+ iz celice, vdor Ca2+ v citoplazmo, vstop molekul iz celične zunanjosti v celico, osmotsko neravnovesje, reorganiziranje proteinov ali strukturne spremembe proteinov, vključno z odprtjem ionskih ka- nalov, porušitev citoskeleta, aktivacijo raznih signalih poti, spremembe v izražanju genov in sintezi proteinov ter tudi aktivacijo več celičnih popravljanih mehaniz- mov (Slika 2). Spremembe v permeabilizirani celični membrani, kot tudi vse poznejše procese, ki so aktivni tudi, ko ni več opaziti povečanega transmembranskega transporta snovi, za katere je celična membrana obi- čajno neprepustna, označujemo s pojmom elektroper- meom (16). 2.1 Kemične spremembe membranskih lipidov Elektroporacijski pulzi sprožijo nastanek ekstra- in intracelularnih RKZ (17-22). Oksidacija lipidov zara- di izpostavitve električnim pulzom, kot se uporabljajo pri elektroporaciji, spremeni sestavo in lastnosti tako lipidnih dvoslojev kot celičnih membran. Kemijske spremembe membranskih lipidov, zlasti peroksidacija, bi lahko pojasnile dlje trajajočo povečano prepustnost celičnih membran po elektroporaciji. Lipidna peroksi- dacija je oksidativna degradacija lipidov. Vključuje nastanek in razpad dikisikovih aduktov nenasičenih li- pidov, imenovanih lipidni hidroperoksidi (Slika 3). Re- akcijo sproži močan oksidant (npr. hidroksilni radikal), ki lipidu odvzame šibko vezani alilni vodik. Nadaljnja razgradnja hidroperoksidov, primarnih produktov li- pidne peroksidacije, je kompleksen proces, v katerem nastane veliko sekundarnih produktov, npr. aldehidi, ketoni, alkoholi, ogljikovodiki, estri, furani, laktoni, peroksidi. Hidroperoksidi in nekateri njihovi razpadni produkti, npr. mutageni malondialdehid (MDA), rea- girajo z aminokislinami, DNA in membranami (23). Pokazali so, da se koncentracija RKZ in obseg pe- roksidacije lipidov povečujeta z intenzivnostjo elek- tričnega polja, trajanjem pulza in številom pulzov pri bakterijskih, rastlinskih in živalskih celicah kot tudi pri liposomih, peroksidacija lipidov pa je povezana s povečano prepustnostjo celične membrane, časom, potrebnim za zaceljenje membrane, in celičnimi po- škodbami (17-20,22,24). 2.1.1 Peroksidacija membranskih fosfolipidov Celične membrane so v osnovi sestavljene iz dvo- sloja fosfolipidov in sterolov, v katerega so umeščeni proteini in druge molekule. Prisotnost oksidiranih lipidov v lipidnih membranah zmanjša urejenost li- pidov, vodi do lateralne širitve in stanjšanja dvosloja, zniža temperaturo faznega prehoda, spremeni hidra- cijo dvosloja, poveča gibljivost lipidov in pogostost t. i. »flip-flop« preskokov, vpliva na lateralno fazno orga- niziranost in spodbuja nastanek defektov v membrani. Zato so dvosloji z oksidiranimi lipidi bistveno bolj pre- pustni in prevodni od neoksidiranih dvoslojev (25-29). Eksperimentalno so pokazali prisotnost konjugiranih dienov v membranah elektroporiranih celic oziroma veziklov, kar nakazuje na prisotnost hidroperoksidov, primarnih produktov lipidne peroksidacije (17,22,24), kot tudi MDA, kar nakazuje na prisotnost sekundarnih produktov peroksidacije (24). Hidroperoksidi so dovolj stabilni, da so v lipidnem dvosloju prisotni še nekaj časa po oksidaciji. Rems in sod. (26) so s simulacijami molekularne dinamike kvantificirali prepustnost in prevodnost lipidnega dvo- sloja z različnim deležem hidroperoksidov, tj. primar- nih produktov peroksidacije lipidov. Pokazali so, da že majhen delež (okoli 1 %) hidroperoksidov učinkuje na prevodnost dvosloja. Vendar so ugotovili tudi, da je po- večanje prevodnosti in prepustnosti lipidnega dvosloja za ione zaradi prisotnosti zgolj hidroperoksidov pre- majhno, da bi v celoti pojasnilo eksperimentalno do- ločene vrednosti. V lipidnih dvoslojih s hidroperoksidi spontanega nastanka por niso opazili (26,30,31). Fosfolipidi z aldehidnimi skupinami na acilnih re- pih (sekundarni produkti peroksidacije fosfolipidov) bolj porušijo lipidni dvosloj od hidroperoksidov. V 487 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Elektropermeom: celični odgovor na elektroporacijo Sl ik a 2: S he m a el ek tr op er m eo m a – sp re m em b in p ro ce so v, k i s e do ga ja jo v c el ic i m ed in p o el ek tr op or ac iji . El ek tr op or ac ija m ed d ru gi m p ov zr oč i n as ta ne k lip id ni h in p ro te in sk ih p or , p er ok si da ci jo m em br an sk ih li pi do v, o dp rt je io ns ki h ka na lo v in N a+ /K + -A TP az e, v do r Ca 2+ v ci to pl az m o, iz te ka nj e AT P in K + i z ce lič ne n ot ra nj os ti in p os le di čn o os m ot sk o ne ra vn ov es je , n as ta ne k re ak tiv ni h ki si ko vi h zv rs ti (R KZ ), po ru ši te v ci to sk el et a, a kt iv ac ijo si gn al ni h po ti in p op ra vl ja ln ih m eh an iz m ov , t er sp re m em be v iz ra ža nj u ge no v in v si nt ez i p ro te in ov . 488 FIZIOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3267 eksperimentih (27,32) in simulacijah molekularne dinamike (28,30-33) so opazili znatno povečanje pre- pustnosti membrane z določenim deležem fosfolipi- dov z aldehidnimi skupinami, pa tudi spontano orga- nizacijo aldehidov v pore (27,30-34). Pore, ki nastanejo kot posledica prisotnosti produktov lipidne peroksida- cije, niso enake poram, ki nastanejo v neoksidiranem lipidnem dvosloju pod vplivom električnega polja. V simulacijah molekularne dinamike so bile pore iz pro- duktov lipidne peroksidacije z aldehidnimi skupinami Slika 3: Shema reakcij lipidne peroksidacije. Reakcijo sproži močan oksidant, ki nenasičeni maščobni kislini odvzame šibko vezani alilni vodik - tako nastane alkilni radikal maščobne kisline. Adicija molekularnega kisika na alkilni radikal vodi do nastanka konjugiranega peroksilnega radikala. Slednji odvzame alilni vodik drugi nenasičeni maščobni kislini, kar vodi do nastanka hidroperoksida, primarnega produkta lipidne peroksidacije, in novega alkilnega radikala. Ob zadostni količini molekularnega kisika in neoksidiranih nenasičenih lipidov, se ta korak lahko mnogokrat ponovi, vendar istočasno tudi tekmuje z več terminacijskimi reakcijami. Terminacija vključuje reakcijo med dvema alkilnima radikaloma, med dvema peroksilnima radikaloma, med alkilnim in peroksilnim radikalom ali reakcijo alkilnega/peroksilnega radikala z nelipidnim substratom (npr. fenolnimi antioksidanti, askorbatom, glutationom ali aminokislinskimi ostanki). Nadaljnja razgradnja hidroperoksidov, primarnih produktov lipidne peroksidacije, je zelo kompleksen proces, v katerem nastane veliko sekundarnih produktov, od katerih imajo nekateri pomembne biološke učinke. 489 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Elektropermeom: celični odgovor na elektroporacijo odprte nekaj mikrosekund, ob prisotnosti holesterola pa ves čas trajanja simulacije (tj. 5 µs) (33). 2.1.2 Oksidacija membranskih sterolov Steroli vplivajo na konformacijski red acilnih li- pidnih verig, debelino hidrofobnega dela membrane, lateralno organizacijo in prepustnost membrane. Ho- lesterol močno zmanjša prepustnost membrane za vo- do, kisik, ione in ostale majhne molekule. V večini bio- loških membran prevladuje en sam sterol. Pri sesalskih celicah je to holesterol (35). Oksidacija membranskega holesterola spreme- ni strukturo membrane. Holesterol se lahko oksidira encimsko ali neencimsko zaradi neposrednega napa- da RKZ. Oksidirane derivate holesterola z eno ali več dodatnimi kisikovimi funkcionalnimi skupinami ime- nujemo oksisteroli. Oksisterole lahko razdelimo v dve skupini: na tiste, pri katerih je oksidiran kratki nepo- larni rep, in tiste, pri katerih je oksidiran tetraciklinski obroč. Oksisteroli z oksidiranim repom podobno učin- kujejo na membrane kot holesterol, vendar povzročijo manjšo urejenost repov fosfolipidov in ne kondenzi- rajo lipidnega dvosloja toliko kot jih holesterol. Hitre preusmeritve oksisterolov z oksidiranimi repi povečajo prepustnost membrane (npr. za 25-hidroksiholesterol je znano, da poveča prepustnost membrane za kalcije- ve ione in glukozo). Oksisteroli z oksidiranim tetraci- klinskim obročem, ki lahko zavzamejo drugačno kon- formacijo, pa bolj porušijo strukturo membrane kot oksisteroli z oksidiranimi repi, saj povečajo mobilnost fosfolipidnih repov (35). Na voljo je le malo poročil raziskav, v katerih so proučevali oksidacijo sterolov pri elektroporaciji. Kaz- mierska in sod. (36) so opazili sorazmerno nizko po- večanje koncentracije oksisterolov (tako tistih z oksidi- ranim repom kot tistih z oksidiranim tetraciklinskim obročem) v rumenjakih, ki so bili izpostavljeni elek- tričnim pulzom. S povečanjem števila električnih pul- zov pa so izmerili višjo koncentracijo oksisterolov. 2.2 Modulacija funkcije proteinov V literaturi lahko zasledimo tudi dokaze o vplivu elektroporacije na proteine in njihovi vlogi pri po- večanju prepustnosti membran. Tako eksperimenti na lipidnih dvoslojih kot simulacije molekularne di- namike so nakazale, da prisotnost proteinskega ka- nalčka v lipidnem dvosloju stabilizira membrano, za- radi česar je potrebna višja jakost električnega polja, da pride do elektroporacije. V simulacijah niso opazili nastanka večjih por v bližini kanalčka (37,38). Vendar pa so Azan in sod. (39,40) s konfokalno Ramanovo mikrospektroskopijo dokazali modifikacije proteinov v živih celicah, ki so bile izpostavljene elektroporacij- skim pulzom. Žal uporabljena metoda ne omogoča razločevati modifikacije membranskih od citoplazem- skih proteinov. 2.2.1 Membranski proteini Submikrosekundni pulzi povzročijo odprtje nape- tostno odvisnih kalcijevih kanalov preko mehanizma, ki ne vključuje nastanka por v lipidnem dvosloju, se- grevanja ali depolarizacije membrane preko nape- tostno odvisnih natrijevih kanalov (41-43). Mikrose- kundni elektroporacijski pulzi pa povzročijo odprtje Na+/K+-ATPaze (44). Zaradi elektroporacije se tudi iz- gublja kadherin v celičnih stikih (45,46). Kadherini so transmembranski proteini, ki igrajo pomembno vlogo pri tvorbi adherentnih stikov, vrsti medceličnih stikov v epitelnih in endotelnih tkivih. Rems in sod. (47,48) so z uporabo električnih polj, ki povzročijo elektroporacijo, v simulacijah molekular- ne dinamike opazili nastanek por v domenah za zazna- vanje napetosti različnih napetostno odvisnih kanalov. V simulacijah je nastanku pore sledilo odvitje domene za zaznavanje napetosti ter stabilizacija por z glavami membranskih lipidov. Take pore so ostale stabilne tudi do konca simulacije (1 mikrosekundo za tem, ko ele- ktrično polje ni bilo več prisotno), kar je bistveno dlje od por v lipidnem dvosloju. Rems in sod. (47) sklepajo, da se pri večji porušitvi zgradbe proteinskega kanalčka ta ne more spontano zviti nazaj v nativno konformaci- jo, temveč celica popravi poškodbo preko mehanizma endocitotskega recikliranja. 2.2.2 Citoskelet Proteini citoskeleta (aktinski filamenti, interme- diarni filamenti in mikrotubuli) in z njimi povezani proteini vplivajo na prepustnost membrane – na na- stanek in širjenje por v membrani ter zaceljenje mem- brane po elektroporaciji. Porušitev omrežja aktinskih filamentov zniža energijsko pregrado za nastanek por v membrani (15). Pri elektroporaciji celic ali orjaških unilamelarnih veziklov z enkapsuliranim aktinom ni- so opazili velikih por mikrometerskega premera, ki so bile opažene pri elektroporaciji praznih veziklov (49). Pri celicah in veziklih z enkapsuliranim aktinom pa so opazili dlje trajajočo povečano prepustnost lipi- dnega dvosloja kot pri celicah, ki so bile inkubirane 490 FIZIOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3267 s toksinom, ki destabilizira aktinske filamente, ali pri praznih veziklih (15,50). Elektroporacija povzroči popravljivo porušitev tri- dimenzionalnih filamentoznih struktur aktinskih, tu- bulinskih in intermediarnih filamentov, ne pa tudi raz- gradnje monomernih proteinov citoskeleta. Citoskelet se ponovno sestavi v nekaj urah po elektroporaciji (45,46,51,52). Ni pa še povsem jasno, ali je porušitev citoskeleta neposredna posledica delovanja električnih pulzov oz. polja na proteine citoskeleta ali pa je pos- ledica odtekanja ATP iz celic, povišane koncentracije kalcijevih ionov v citoplazmi, hidrolize fosfatidilinozi- tol-4-5-bisfosfata (PIP2) in/ali nabreknjenja celic zara- di elektroporacije (49). Pakhomov in sod. (53) so namreč pokazali, da je porušitev aktinskih filamentov po elektroporaciji z na- nosekundnimi pulzi posledica nabreknjenja celic. Na- sprotno pa so raziskave, v katerih so uporabili pulze z drugačnimi parametri, nakazale, da se lahko porušijo aktinski filamenti tudi brez nabreknjenja celic oz. ve- ziklov, kar nakazuje na neposredne učinke električnih pulzov oz. polja na aktin (45,50). Z uporabo mikrosko- pije na atomsko silo so Louise in sod. (54) pokazali, da je nabreknjenje predvsem posledica destabilizacije interakcije med kortikalnim aktinom in membrano zaradi elektroporacijskih pulzov, ne pa zaradi depoli- merizacije aktinskih filamentov. S tem so potrdili iz- sledke o ločitvi membrane od citoskeleta pod vplivom električnih pulzov oz. polja (55). Marracino in sod. (56) so s simulacijami mole- kularne dinamike pokazali, da visokonapetostni na- nosekundni električni pulzi povzročijo spremembe v konformaciji C-terminalnega konca β-tubulina in spremembe v lokalnih elektrostatskih lastnostih GTP- -azne domene ter vezavnega mesta za večino molekul, ki se vežejo na β-tubulin. Njihovi izsledki nakazujejo, da nanosekundni električni pulzi lahko fizično vpliva- jo na dinamiko mikrotubulov. Chafai in sod. (57) so tudi eksperimentalno pokazali, da nanosekundni ele- ktrični pulzi spremenijo konformacijo C-terminalnega dela tubulina, ki zato polimerizira v različne strukture; od parametrov električnih pulzov pa je odvisno, ali je modulacija samoorganizacije tubulina reverzibilna ali ireverzibilna. Tudi modulacija s tubulinom povezanih proteinov (npr. kinezina) bi lahko spremenila dinami- ko omrežja mikrotubulov. S simulacijami molekularne dinamike so Průša in sod. (58) pokazali, da 30 ns traja- joči električni pulz spremeni kontaktno površino med kinezinom in tubulinom ter vezavna mesta za tubulin in mesta za hidrolizo nukleotidov na kinezinu. 3 Spremembe v izražanju genov in sintezi proteinov po elektroporaciji Elektroporacija sproži vrsto fizioloških dogovorov celic, kar se kaže tudi v spremembah izražanja genov in sinteze proteinov. Ker elektroporacijski pulzi povzroči- jo nastanek RKZ, se pričakuje, da se celice odzovejo na oksidativni stres. Pri kvasovki Saccharomyces cerevisi- ae je izpostavitev električnim pulzom povečala izraža- nje genov za proteine, ki sodelujejo pri odgovoru na oksidativni stres (GLR1, SOD1, SOD2 in GSH1) (59). Michel in sod. (60) pa so opazili povečano imunoci- tokemijsko obarvanje s protitelesi proti superoksidni dismutazi SOD-2 po elektroporaciji, inkubaciji s cisplatinom ter kombinaciji elektroporacije in cispla- tina (elektrokemoterapiji) pri metastaznih celicah raka trebušne slinavke. Povečanje izražanje gena za SOD-2 po elektroporaciji so izmerili tudi Dovgan in sod. (61) pri mezenhimskih stromalnih celicah iz popkovnične krvi in stromalnih celicah iz maščobnega tkiva. Morotomi-Yano in sod. (62) so s spremljanjem iz- ražanja različnih genov po elektroporaciji pokazali, da nanosekundni električni pulzi predstavljajo za celice drugačno vrsto stresa kot poškodbe endoplazemskega retikuluma, ultravijolična svetloba ali toplotni šok. Ce- lice se na fiziološki stres odzovejo z aktivacijo različ- nih mehanizmov. Ker sinteza proteinov porabi znaten delež celičnih gradnikov in energije, je med odzivi na različne vrste stresa zelo regulirana. Elektroporacija povzroči fosforilacijo evkariontskega faktorja za ini- ciacijo translacije eIF2a ter defosforilacijo proteina 4EBP1, kar nakazuje na supresijo translacije proteinov oz. sinteze proteinov nasploh (62), ter na zmanjšano izražanje genov, ki sodelujejo pri sintezi proteinov (63). Hojman in sod. (64) so po elektroporaciji v mišjih mišicah zaznali zmanjšano izražanje genov, vključenih v metabolizem (npr. genov za fosfoenolpiruvat karbo- ksikinazo in dipeptidazo), kar nakazuje na zmanjša- nje katabolizma. Elektroporacija povzroči tudi druge spremembe: zmanjšano izražanje histonov H2A in H4, ki so ključni za organizacijo kromatina (63,65), zmanj- šano izražanje genov za citoskeletne proteine (64) ter spremembe v genih oz. proteinih, ki so povezani s ce- lično smrtjo in imunskim odzivom (66). 3.1 Celična smrt in imunski odziv Celično smrt lahko v grobem razdelimo na patolo- ško (nekrozo) in programirano. Do nedavnega je apop- toza veljala za sinonim programirane celične smrti, 491 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Elektropermeom: celični odgovor na elektroporacijo vendar so v zadnjih letih odkrili tudi druge vrste pro- gramirane celične smrti, npr. piroptozo in nekroptozo. Apoptoza se v celici lahko sproži po več poteh, ki jih v glavnem razdelimo na ekstrinzično in intrinzično pot. Ekstrinzična pot se posreduje preko receptorjev na površini celične membrane (t.i. receptorji smrti). Pri ekstrinzični poti se kaspaza-8 aktivira ob celični mem- brani in nato neposredno aktivira efektorske kaspaze (kaspaza-3,-6 in -7). Intrinzična pot pa se posreduje preko mitohondrijev in je še posebej hitra, saj so vsi faktorji že prisotni in potrebujejo le še aktivacijo. Pri intrinzični poti se zaradi porušitve ravnotežja med proapoptočnimi (npr. Bid, Bax in Bak) in antiapopto- tičnimi (npr. Bcl-2) proteini iz mitohondrijev sprostijo proteini, ki sprožijo apoptozo (npr. citokrom c in indu- cirajoči dejavnik apoptoze, AIF), kar aktivira kaspaze. Za razliko od apoptoze je pri piroptozi ključna akti- vacija kaspaze-1, -4, 5- ali -11, ki nato sprožijo proces programirane celične smrti s cepitvijo proteina tvorca por gasdermina D. Ključni označevalci piroptoze so aktivacija kaspaze-1 in neaktivacija kaspaze-3 (slednja se povezuje z apoptozo). Na aktivacijo nekroptoze pa vpliva aktivacija kinaz RIPK3 in MLKL (67). Sprožitev apoptoze po elektroporaciji omenjajo predvsem v povezavi z nanosekudnimi pulzi (68-70), vendar so jo opazili tudi pri elektroporaciji celic z dalj- šimi pulzi. Ford in sod. (69) so v celicah mišjega mela- noma po elektroporaciji s pulzi dolžine 3 ns zaznali od električnega polja odvisno povišanje količine aktivira- nih kaspaz-3,-6,-7,-8 in -9. Niso pa opazili sprostitve citokroma c, AIF ali Smac/DIABLO iz mitohondrija. Njihovi izsledki nakazujejo, da nanosekundni pulzi sprožijo apoptozo po poti, ki je podobna ekstrinzič- ni poti aktivacije. Nasprotno pa so Beebe in sod. (68) pri elektroporaciji s 60 ns pulzi opazili, da je sprožitev apoptoze odvisna tako od aktivacije kaspaz kot od mi- tohondrijev, saj so pri celični liniji limfocitov T zaznali sprostitev citokroma c v citoplazmo. Zhang in sod. (71) so spremljali izražanje 17 genov, povezanih z apopto- zo. Že dve uri po elektroporaciji celic raka dojke z mi- krosekundnimi pulzi so opazili spremembe v izražanju kaspaz in genov, povezanih z receptorji smrti. Izražanje kaspaze-3 se je povečalo, izražanje kaspaze-6, -7 in -9 ter Bc1-2, Bid in FASLG pa se je zmanjšalo. Zaključili so, da je aktivacija apoptoze po elektroporaciji potekala pretežno preko intrinzične poti. Ker je kaspaza-3 vključena tako pri intrinzični kot ekstrinzični poti sprožitve apoptoze, lahko povečano izražanje kaspaze-3 nakazuje, da se je v celicah sprožil proces apoptoze, ne moremo pa določiti po kateri poti. Zhang in sod. (72) so zaznali več kaspaze-3 v celicah raka trebušne slinavke, ki so bile izpostavljene elektro- poracijskim pulzom, O'Brien in sod. (73) so po elektro- poraciji opazili imunohistokemijsko obarvanje ceplje- ne kaspaze-3 le na robu cone ablacije trebušne slinavke, Siddiqui in sod. (74) so zaznali cepljeno kaspazo-3 na celotni coni ablacije jeter, Mercadal in sod. (75) pa so zabeležili povečano izražanje kaspaze-3 oz. -7 pri ade- nokarcinomskih celicah trebušne slinavke. Vse tri razi- skave nakazujejo, da gre za sprožitev apoptoze. Michel in sod. (60) so opazili povečano imunocitokemijsko obarvanje s protitelesi proti kaspazi-3 po inkubaciji s cisplatinom, elektroporaciji z mikrosekudnimi pulzi ter kombinaciji elektroporacije in cisplatina (elektrokemo- terapiji) pri metastaznih celicah raka trebušne slinavke. Električni tok, ki teče skozi prevodnik (npr. suspen- zijo celic, tkivo …), povzroči njegovo segrevanje (t.i. Joulova toplota). Z ustrezno izbranimi parametri ele- ktričnih pulzov je mogoče doseči, da je povišanje tem- perature dovolj majhno, da ne pride do termičnih po- škodb celic/tkiva. Faroja in sod. (76) so želeli ugotoviti, ali visokoenergijski pulzi (tj. veliko število pulzov in/ ali velika jakost električnega polja) lahko povzročijo termične poškodbe jetrnega tkiva. Kadar temperatura pri elektroporaciji ni presegla 39 °C, so opazili apop- totične celice s cepljeno kaspazo-3 in praktično niso zaznali proteinov toplotnega šoka HSP70, za katere je značilno, da se njihovo izražanje močno poveča zaradi toplotnega stresa ali toksičnih kemikalij. Nasprotno so pri celicah, podvrženih elektroporacijskemu postopku, pri katerem je temperatura presegla 60° C, opazili izra- zito izražanje HSP70 in le minimalno izražanje kaspa- ze-3. Ben-David in sod. (77) pa so po elektroporaciji opazili razlike v imunohistokemijskemu obarvanju cepljene kaspaze-3 in HSP70 v različnih tkivih: v jetrih so zaznali močno obarvanje za cepljeno kaspazo-3 in omejeno izražanje HSP70, v mišičnih celicah obarvanja pa sploh niso zaznali, medtem ko so v ledvicah opazili minimalno obarvanje za cepljeno kaspazo-3 in znatno povišanje HSP70 v tkivu v okolici predela, kjer so do- vedli električne pulze. Kanthou in sod. (45) niso zaznali povečane akumulacije HSP70 po elektroporaciji endo- telnih celic žil popkovine, Mlakar in sod. (63) in Dov- gan in sod. (61) pa so po elektroporaciji celic maligne- ga melanoma oz. mezenhimskih stromalnih celicah iz popkovnične krvi in stromalnih celicah iz maščobnega tkiva opazili povečano izražanje proteinov iz družine proteinov toplotnega šoka HSP70. V nasprotju z večino literature so v raziskavi Merca- dal in sod. (75) celice adenokarcinoma trebušne slinav- ke po elektroporaciji umirale po poti, ki je neodvisna od kaspaze-3 oz. -7, Zhang in sod. (67) pa so 6 ur po 492 FIZIOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3267 elektroporaciji jeter opazili povečano izražanje cep- ljene kaspaze-1, gasdermina D, RIPK3 in MLKL ter zmanjšano izražanje cepljene kaspaze-3. Zaključili so, da rezultati nakazujejo na aktivacijo procesa piroptoze in nekroptoze, ne pa na apoptozo. Ringel-Scaia in sod. (78) so takoj po elektroporaciji celic raka mlečne žleze opazili spremembe v izražanju genov, ki so skladne z apoptozo. Čez čas pa so opazili spremembo v izraža- nju genov v smeri proti vnetnim vrstam celične smrti in nekroze – po 24 urah so zabeležili povečano izraža- nje genov, povezanih z nekrozo in piroptozo. Piroptozo povezujejo tudi z reguliranjem vzorčno prepoznavnih receptorjev (angl. pattern recognition receptors, PRR), zato ni presenetljivo, da so opazili tudi povečano iz- ražanje treh omrežij, ki so povezana z molekularnimi vzorci, povezanimi s poškodbami (angl. damage asso- ciated molecular patterns, DAMPs): signalizacijo RKZ, signalizacijo ATP in signalizacijo HMGB1. Zaznali pa so zmanjšano izražanje genov, povezanih s supre- sijo imunskega sistema, ter povečano izražanje genov, povezanih z vnetnim odzivom. Avtorji so opazili tudi zmanjšano izražanje genov, povezanih s celičnimi po- škodbami ter povečano izražanje genov, povezanih z regeneracijo. Peng in sod. (79) so 4 ure po elektroporaciji zazna- li povečano izražanje genov, povezanih z apoptozo/ nekrozo (kaspaza-8, bcl-w, Mt2 ter 7 genov iz družine citokromov P450) ter povečano izražanje več genov za kemokine, vključno z MIP-1α, MIP-1β, MIP-1γ, IP-10 in MCP-2 v skeletni mišici miši. Heller in sod. (80) so po elektroporaciji mišjih melanomov izmerili povišano raven mRNA za več vnetnih kemokinov in citokinov (MIP-1α, MIP-1β, IP-10, IL-6 in inducibilne sintaze dušikovega oksida). Zaznali so tudi povišano raven proteinov IL-1β in IL-6 po elektroporaciji. Goswami in sod. (81) pa so proučevali vpliv mikrosekundih elekro- poracijskih pulzov na trojno negativne celice raka doj- ke 4T1. Izmerili so povišano raven mRNA genov za IL-6, in za tumor nekrozni faktor TNF ter nižjo raven mRNA gena za TSLP po elektroporaciji. Nižje izražanje TSLP, ki ima pomembno vlogo pri napredovanju raka, so potrdili tudi na proteinski ravni. Zhang in sod. (71) so po elektroporaciji celic raka dojke opazili zmanjšano izražanje proteinov Ki-67 in TGF-β. Ki-67 se uporab- lja kot označevalec za deleče se celice in je povezan z rastjo in invazijo tumorjev, izražanje TGF-β pa korelira z invazivnostjo tumorjev. Mlakar in sod. (63) pa so po- kazali, da elektroporacija celic malignega melanoma ne spremeni izražanja glavnih tumor supresorskih genov in onkogenov. Vse te raziskave nakazujejo, da je elek- troporacija varna in nerakotvorna metoda. 4 Zaključek Elektroporacija je pojav, ki povzroči povečanje pre- pustnosti celične membrane zaradi izpostavitve celic/ tkiv električnemu polju. Povzroči vrsto sprememb v celici, med drugim: strukturne spremembe v celični membrani, peroksidacijo membranskih lipidov, vdor Ca2+ v citoplazmo, iztekanje ATP in K+ iz celične not- ranjosti, osmotsko neravnovesje, porušitev citoskeleta, spremembe v izražanju genov in v sintezi proteinov, na- stanek reaktivnih kisikovih zvrsti, aktivacijo signalnih poti in popravljalnih mehanizmov; ob določenih pogo- jih sproži tudi celično smrt. S pojmom elektropermeom označujemo takó permeabilizirano celico in dogajanje med ali tik po dovajanju električnih pulzov kot tudi vse poznejše procese, ki ostanejo aktivni še nekaj časa po- tem, ko ni več opaziti povečanega transmembranskega transporta snovi, za katere je celična membrana običaj- no neprepustna, torej tudi po času, ko že ugotavljamo, da se je membrana zacelila. Elektroporacija se uporablja na številnih področjih, vključno z elektrokemoterapijo, ablacijo tkiv ter gensko elektrotransfekcijo. Elektrokemoterapija se v klinični praksi uporablja že dobrih 15 let in se v številnih evrop- skih državah vključuje v smernice in standardno klinič- no prakso za zdravljenje različnih površinskih tumor- jev, vključno z melanomom, skvamoznim karcinomom in metastazami vseh histologij. V kliničnih raziskavah se je pokazalo, da je elektrokemoterapija izvedljiva, var- na in učinkovita tudi za globokoležeče tumorje (2,3). Za ablacijo mehkih tkiv se sicer rutinsko uporabljajo termične tehnike (ablacija z radiofrekvencami in mi- krovalovi, krioablacija), vendar vse bolj narašča za- nimanje za ablacijo z ireverzibilno elektroporacijo. Slednja je še zlasti zanimiva za uporabo na anatomskih mestih, kjer operacija in termične metode ablacije ne pridejo v poštev, npr. zaradi bližine vitalnih struktur, kot so velike krvne žile, črevesje, žolčne ali sečne poti. Zaradi pretežno netermičnega mehanizma delovanja ablacija z ireverzibilno elektroporacijo namreč ne po- škoduje okoliškega tkiva. Uspešnost in varnost ablacije z ireverzibilno elektroporacijo sta se izkazali v številnih kliničnih študijah za odstranjevanje globlje ležečih tu- morjev v jetrih, ledvicah, trebušni slinavki in prostati, pa tudi za izoliranje pljučnih ven pri zdravljenju fibri- lacije preddvorov (4,82). Klinične študije preučujejo tudi možnost uporabe elektroporacije kot metodo vno- sa nukleinskih kislin za gensko terapijo: za zdravljenje raka, za vnos cepiv na osnovi DNA ali RNA proti na- lezljivim boleznim in raku, za vnos komponent sistema CRISPR-Cas9 za urejanje genoma itd. (83). 493 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Elektropermeom: celični odgovor na elektroporacijo Aplikacije elektroporacije v medicini so učinkovite in varne, vendar so zaradi delovanja električnih pulzov lahko prisotni tudi določeni neželeni stranski učinki, predvsem mišično krčenje in akutna bolečina. Za op- timizacijo parametrov elektroporacije in rezultatov na elektroporaciji temelječih aplikacijah je ključna nadalj- nja razjasnitev osnovnih mehanizmov elektroporacije in vplivov posameznih parametrov električnega polja na elektropermeom. Izjava o navzkrižju interesov D. Miklavčič je svetovalec podjetju Medtronic. A. Vižintin nima navzkrižja interesov. Zahvala Raziskave so bile opravljene v okviru programa P2- 0249, Javna agencija za raziskovalno dejavnost Repu- blike Slovenije (ARRS). Avtorja se zahvaljujeta za fi- nančno podporo tudi podjetjema Medtronic in Pulse Biosciences ter M. Tareku za sliko, kako nastane pora. A. Vižintin je prejemnica štipendije Univerzitetne usta- nove inženirja Lenarčič Milana. Literatura 1. Kotnik T, Rems L, Tarek M, Miklavčič D. Membrane Electroporation and Electropermeabilization: mechanisms and Models. Annu Rev Biophys. 2019;48(1):63-91. DOI: 10.1146/annurev-biophys-052118-115451 PMID: 30786231 2. Geboers B, Scheffer HJ, Graybill PM, Ruarus AH, Nieuwenhuizen S, Puijk RS, et al. High-Voltage Electrical Pulses in Oncology: Irreversible Electroporation, Electrochemotherapy,Gene Electrotransfer, Electrofusion, and Electroimmunotherapy. Radiology. 2020;295(2):254- 72. DOI: 10.1148/radiol.2020192190 PMID: 32208094 3. Stepišnik T, Jarm T, Grošelj A, Edhemović I, Đokić M, Ivanecz A, et al. Elektrokemoterapija – učinkovita metoda zdravljenja tumorjev s kombinacijo kemoterapevtikain električnega polja. Zdrav Vestn. 2016;86(1):41-55. DOI: 10.6016/ZdravVestn.1453 4. Cindrič H, Kos B, Miklavčič D. Ireverzibilna elektroporacija kot metoda ablacije mehkih tkiv: pregled in izzivi priuporabi v kliničnem okolju. Zdrav Vestn. 2021(1-2):38-53. DOI: 10.6016/ZdravVestn.2954 5. Kim V, Gudvangen E, Kondratiev O, Redondo L, Xiao S, Pakhomov AG. Peculiarities of Neurostimulation by Intense Nanosecond Pulsed Electric Fields: Howto Avoid Firing in Peripheral Nerve Fibers. Int J Mol Sci. 2021;22(13):7051. DOI: 10.3390/ijms22137051 PMID: 34208945 6. Schoenbach KH, Beebe SJ, Buescher ES. Intracellular effect of ultrashort electrical pulses. Bioelectromagnetics. 2001;22(6):440-8. DOI: 10.1002/ bem.71 PMID: 11536285 7. Siddiqui IA, Latouche EL, DeWitt MR, Swet JH, Kirks RC, Baker EH, et al. Induction of rapid, reproducible hepatic ablations using next-generation, high frequencyirreversible electroporation (H-FIRE) in vivo. HPB (Oxford). 2016;18(9):726-34. DOI: 10.1016/j.hpb.2016.06.015 PMID: 27593589 8. Dong S, Yao C, Zhao Y, Lv Y, Liu H. Parameters Optimization of Bipolar High Frequency Pulses on Tissue Ablation and InhibitingMuscle Contraction. IEEE Trans Dielectr Electr Insul. 2018;25(1):207-16. DOI: 10.1109/TDEI.2018.006303 9. O’Brien TJ, Passeri M, Lorenzo MF, Sulzer JK, Lyman WB, Swet JH, et al. Experimental high-frequency irreversible electroporation using a single- needle deliveryapproach for nonthermal pancreatic ablation in vivo. J Vasc Interv Radiol. 2019;30(6):854-862.e7. DOI: 10.1016/j.jvir.2019.01.032 PMID: 31126597 10. Vernier PT, Sun Y, Gundersen MA. Nanoelectropulse-driven membrane perturbation and small molecule permeabilization. BMC Cell Biol. 2006;7(1):37. DOI: 10.1186/1471-2121-7-37 PMID: 17052354 11. Levine ZA, Vernier PT. Life cycle of an electropore: field-dependent and field-independent steps in porecreation and annihilation. J Membr Biol. 2010;236(1):27-36. DOI: 10.1007/s00232-010-9277-y PMID: 20623350 12. Pakhomov AG, Shevin R, White JA, Kolb JF, Pakhomova ON, Joshi RP, et al. Membrane permeabilization and cell damage by ultrashort electric field shocks. Arch Biochem Biophys. 2007;465(1):109-18. DOI: 10.1016/j. abb.2007.05.003 PMID: 17555703 13. Pucihar G, Kotnik T, Miklavčič D, Teissié J. Kinetics of transmembrane transport of small molecules into electropermeabilized cells. Biophys J. 2008;95(6):2837-48. DOI: 10.1529/biophysj.108.135541 PMID: 18539632 14. Pakhomov AG, Kolb JF, White JA, Joshi RP, Xiao S, Schoenbach KH. Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsedelectric field (nsPEF). Bioelectromagnetics. 2007;28(8):655-63. DOI: 10.1002/bem.20354 PMID: 17654532 15. Muralidharan A, Rems L, Kreutzer MT, Boukany PE. Actin networks regulate the cell membrane permeability during electroporation. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2021;1863(1):183468. DOI: 10.1016/j. bbamem.2020.183468 PMID: 32882211 16. Sözer EB, Levine ZA, Vernier PT. Quantitative limits on small molecule transport via the electropermeome measuringand modeling single nanosecond perturbations. Sci Rep. 2017;7(1):57. DOI: 10.1038/s41598- 017-00092-0 PMID: 28246401 17. Maccarrone M, Rosato N, Agrò AF. Electroporation enhances cell membrane peroxidation and luminescence. Biochem Biophys Res Commun. 1995;206(1):238-45. DOI: 10.1006/bbrc.1995.1033 PMID: 7818526 18. Maccarrone M, Bladergroen MR, Rosato N, Finazzi Agrò AF. Role of lipid peroxidation in electroporation-induced cell permeability. Biochem Biophys Res Commun. 1995;209(2):417-25. DOI: 10.1006/bbrc.1995.1519 PMID: 7733908 19. Gabriel B, Teissié J. Generation of reactive-oxygen species induced by electropermeabilization of Chinesehamster ovary cells and their consequence on cell viability. Eur J Biochem. 1994;223(1):25-33. DOI: 10.1111/j.1432-1033.1994.tb18962.x PMID: 8033899 20. Gabriel B, Teissié J. Spatial compartmentation and time resolution of photooxidation of a cell membraneprobe in electropermeabilized Chinese hamster ovary cells. Eur J Biochem. 1995;228(3):710-8. DOI: 10.1111/j.1432-1033.1995.tb20314.xPMID: 7737168 21. Nuccitelli R, Lui K, Kreis M, Athos B, Nuccitelli P. Nanosecond pulsed electric field stimulation of reactive oxygen species in human pancreaticcancer cells is Ca(2+)-dependent. Biochem Biophys Res Commun. 2013;435(4):580-5. DOI: 10.1016/j.bbrc.2013.05.014 PMID: 23680664 494 FIZIOLOGIJA Zdrav Vestn | november – december 2022 | Letnik 91 | https://doi.org/10.6016/ZdravVestn.3267 22. Breton M, Mir LM. Investigation of the chemical mechanisms involved in the electropulsation of membranesat the molecular level. Bioelectrochemistry. 2018;119:76-83. DOI: 10.1016/j. bioelechem.2017.09.005 PMID: 28917184 23. Frankel EN. Lipid oxidation: Mechanisms, products and biological significance. J Am Oil Chem Soc. 1984;61(12):1908-17. DOI: 10.1007/ BF02540830 24. Benov LC, Antonov PA, Ribarov SR. Oxidative damage of the membrane lipids after electroporation. Gen Physiol Biophys. 1994;13(2):85-97. PMID: 7806071 25. Vernier PT, Levine ZA, Wu YH, Joubert V, Ziegler MJ, Mir LM, et al. Electroporating fields target oxidatively damaged areas in the cell membrane. PLoS One. 2009;4(11):e7966. DOI: 10.1371/journal. pone.0007966 PMID: 19956595 26. Rems L, Viano M, Kasimova MA, Miklavčič D, Tarek M. The contribution of lipid peroxidation to membrane permeability in electropermeabilization:A molecular dynamics study. Bioelectrochemistry. 2019;125:46-57. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2018.07.018 PMID: 30265863 27. Runas KA, Malmstadt N. Low levels of lipid oxidation radically increase the passive permeability of lipidbilayers. Soft Matter. 2015;11(3):499-505. DOI: 10.1039/C4SM01478B PMID: 25415555 28. Wong-Ekkabut J, Xu Z, Triampo W, Tang IM, Tieleman DP, Monticelli L. Effect of lipid peroxidation on the properties of lipid bilayers: a molecular dynamicsstudy. Biophys J. 2007;93(12):4225-36. DOI: 10.1529/ biophysj.107.112565 PMID: 17766354 29. Sabatini K, Mattila JP, Megli FM, Kinnunen PK. Characterization of two oxidatively modified phospholipids in mixed monolayers withDPPC. Biophys J. 2006;90(12):4488-99. DOI: 10.1529/biophysj.105.080176 PMID: 16581831 30. Boonnoy P, Jarerattanachat V, Karttunen M, Wong-Ekkabut J. Bilayer Deformation, Pores, and Micellation Induced by Oxidized Lipids. J Phys Chem Lett. 2015;6(24):4884-8. DOI: 10.1021/acs.jpclett.5b02405 PMID: 26673194 31. Van der Paal J, Neyts EC, Verlackt CC, Bogaerts A. Effect of lipid peroxidation on membrane permeability of cancer and normal cells subjectedto oxidative stress. Chem Sci (Camb). 2016;7(1):489-98. DOI: 10.1039/C5SC02311D PMID: 28791102 32. Lis M, Wizert A, Przybylo M, Langner M, Swiatek J, Jungwirth P, et al. The effect of lipid oxidation on the water permeability of phospholipids bilayers. Phys Chem Chem Phys. 2011;13(39):17555-63. DOI: 10.1039/ c1cp21009b PMID: 21897935 33. Wiczew D, Szulc N, Tarek M. Molecular dynamics simulations of the effects of lipid oxidation on the permeabilityof cell membranes. Bioelectrochemistry. 2021;141:107869. DOI: 10.1016/j. bioelechem.2021.107869 PMID: 34119820 34. Cwiklik L, Jungwirth P. Massive oxidation of phospholipid membranes leads to pore creation and bilayer disintegration. Chem Phys Lett. 2010;486(4–6):99-103. DOI: 10.1016/j.cplett.2010.01.010 35. Kulig W, Olżyńska A, Jurkiewicz P, Kantola AM, Komulainen S, Manna M, et al. Cholesterol under oxidative stress-How lipid membranes sense oxidation as cholesterolis being replaced by oxysterols. Free Radic Biol Med. 2015;84:30-41. DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2015.03.006 PMID: 25795515 36. Kazmierska M, Rudzinska M, Jarosz B, Dobrzanski Z, Trziszka T. Changes of the fatty acid composition, cholesterol and cholesterol oxide contentsin whole egg after pulsed electric field treatment. Arch Geflugelkd. 2012;76(4):246-53. 37. Troiano GC, Stebe KJ, Raphael RM, Tung L. The effects of gramicidin on electroporation of lipid bilayers. Biophys J. 1999;76(6):3150-7. DOI: 10.1016/S0006-3495(99)77466-7 PMID: 10354439 38. Tarek M. Membrane electroporation: a molecular dynamics simulation. Biophys J. 2005;88(6):P4045-53. DOI: 10.1529/biophysj.104.050617 PMID: 15764667 39. Azan A, Untereiner V, Descamps L, Merla C, Gobinet C, Breton M, et al. Comprehensive Characterization of the Interaction between Pulsed Electric Fields andLive Cells by Confocal Raman Microspectroscopy. Anal Chem. 2017;89(20):10790-7. DOI: 10.1021/acs.analchem.7b02079 PMID: 28876051 40. Azan A, Untereiner V, Gobinet C, Sockalingum GD, Breton M, Piot O, et al. Demonstration of the Protein Involvement in Cell Electropermeabilization using ConfocalRaman Microspectroscopy. Sci Rep. 2016;2017(7):1-10. PMID: 28102326 41. Craviso GL, Choe S, Chatterjee P, Chatterjee I, Vernier PT. Nanosecond electric pulses: a novel stimulus for triggering Ca2+ influx into chromaffincells via voltage-gated Ca2+ channels. Cell Mol Neurobiol. 2010;30(8):1259-65. DOI: 10.1007/s10571-010-9573-1 PMID: 21080060 42. Semenov I, Xiao S, Kang D, Schoenbach KH, Pakhomov AG. Cell stimulation and calcium mobilization by picosecond electric pulses. Bioelectrochemistry. 2015;105:65-71. DOI: 10.1016/j. bioelechem.2015.05.013 PMID: 26011130 43. Burke RC, Bardet SM, Carr L, Romanenko S, Arnaud-Cormos D, Leveque P, et al. Nanosecond pulsed electric fields depolarize transmembrane potential via voltage-gatedK+, Ca2+ and TRPM8 channels in U87 glioblastoma cells. Biochim Biophys Acta Biomembr. 2017;1859(10):2040- 50. DOI: 10.1016/j.bbamem.2017.07.004 PMID: 28693898 44. Teissié J, Tsong TY. Evidence of voltage-induced channel opening in Na/K ATPase of human erythrocyte membrane. J Membr Biol. 1980;55(2):133- 40. DOI: 10.1007/BF01871155 PMID: 6251222 45. Kanthou C, Kranjc S, Serša G, Tozer G, Županič A, Čemažar M. The endothelial cytoskeleton as a target of electroporation-based therapies. Mol Cancer Ther. 2006;5(12):3145-52. DOI: 10.1158/1535-7163.MCT-06- 0410 PMID: 17172418 46. Meulenberg CJ, Todorović V, Čemažar M. Differential cellular effects of electroporation and electrochemotherapy in monolayersof human microvascular endothelial cells. PLoS One. 2012;7(12):e52713. DOI: 10.1371/journal.pone.0052713 PMID: 23300747 47. Rems L, Kasimova MA, Testa I, Delemotte L. Pulsed Electric Fields Can Create Pores in the Voltage Sensors of Voltage-Gated IonChannels. Biophys J. 2020;119(1):190-205. DOI: 10.1016/j.bpj.2020.05.030 PMID: 32559411 48. Ruiz-Fernández AR, Campos L, Villanelo F, Gutiérrez-Maldonado SE, Perez-Acle T. Exploring the conformational changes induced by nanosecond pulsed electric fieldson the voltage sensing domain of a Ca2+ channel. Membranes (Basel). 2021;11(7):473. DOI: 10.3390/ membranes11070473 PMID: 34206827 49. Graybill PM, Davalos RV. Cytoskeletal Disruption after Electroporation and Its Significance to Pulsed ElectricField Therapies. Cancers (Basel). 2020;12(5):29-32. DOI: 10.3390/cancers12051132 PMID: 32366043 50. Perrier DL, Vahid A, Kathavi V, Stam L, Rems L, Mulla Y, et al. Response of an actin network in vesicles under electric pulses. Sci Rep. 2019;9(1):8151. DOI: 10.1038/s41598-019-44613-5 PMID: 31148577 51. Harkin DG, Hay ED. Effects of electroporation on the tubulin cytoskeleton and directed migration of cornealfibroblasts cultured within collagen matrices. Cell Motil Cytoskeleton. 1996;35(4):345-57. DOI: 10.1002/ (SICI)1097-0169(1996)35:4<345::AID-CM6>3.0.CO;2-5 PMID: 8956005 52. Thompson GL, Roth CC, Kuipers MA, Tolstykh GP, Beier HT, Ibey BL. Permeabilization of the nuclear envelope following nanosecond pulsed electric fieldexposure. Biochem Biophys Res Commun. 2016;470(1):35- 40. DOI: 10.1016/j.bbrc.2015.12.092 PMID: 26721436 53. Pakhomov AG, Xiao S, Pakhomova ON, Semenov I, Kuipers MA, Ibey BL. Disassembly of actin structures by nanosecond pulsed electric field is a downstreameffect of cell swelling. Bioelectrochemistry. 2014;100:88-95. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2014.01.004 PMID: 24507565 54. Louise C, Etienne D, Marie-Pierre R. AFM sensing cortical actin cytoskeleton destabilization during plasma membrane electropermeabilization. Cytoskeleton (Hoboken). 2014;71(10):587-94. DOI: 10.1002/cm.21194 PMID: 25308626 495 PREGLEDNI ZNANSTVENI ČLANEK Elektropermeom: celični odgovor na elektroporacijo 55. Titushkin I, Cho M. Regulation of cell cytoskeleton and membrane mechanics by electric field: role oflinker proteins. Biophys J. 2009;96(2):717-28. DOI: 10.1016/j.bpj.2008.09.035 PMID: 19167316 56. Marracino P, Havelka D, Průša J, Liberti M, Tuszynski J, Ayoub AT, et al. Tubulin response to intense nanosecond-scale electric field in molecular dynamicssimulation. Sci Rep. 2019;9(1):10477. DOI: 10.1038/s41598-019- 46636-4 PMID: 31324834 57. Chafai DE, Sulimenko V, Havelka D, Kubínová L, Dráber P, Cifra M. Reversible and Irreversible Modulation of Tubulin Self-Assembly by Intense NanosecondPulsed Electric Fields. Adv Mater. 2019;31(39):e1903636. DOI: 10.1002/adma.201903636 PMID: 31408579 58. Průša J, Cifra M. Molecular dynamics simulation of the nanosecond pulsed electric field effect on kinesinnanomotor. Sci Rep. 2019;9(1):19721. DOI: 10.1038/s41598-019-56052-3 PMID: 31873109 59. Tanino T, Sato S, Oshige M, Ohshima T. Analysis of the stress response of yeast Saccharomyces cerevisiae toward pulsed electricfield. J Electrost. 2012;70(2):212-6. DOI: 10.1016/j.elstat.2012.01.003 60. Michel O, Kulbacka J, Saczko J, Mączyńska J, Błasiak P, Rossowska J, et al. Electroporation with Cisplatin against Metastatic Pancreatic Cancer: In Vitro Studyon Human Primary Cell Culture. BioMed Res Int. 2018;2018:7364539. DOI: 10.1155/2018/7364539 PMID: 29750170 61. Dovgan B, Miklavčič D, Knežević M, Zupan J, Barlič A. Intracellular delivery of trehalose renders mesenchymal stromal cells viable and immunomodulatorycompetent after cryopreservation. Cytotechnology. 2021;73(3):1-21. DOI: 10.1007/s10616-021-00465-4 PMID: 33875905 62. Morotomi-Yano K, Oyadomari S, Akiyama H, Yano K. Nanosecond pulsed electric fields act as a novel cellular stress that induces translationalsuppression accompanied by eIF2α phosphorylation and 4E-BP1 dephosphorylation. Exp Cell Res. 2012;318(14):1733-44. DOI: 10.1016/j.yexcr.2012.04.016 PMID: 22652449 63. Mlakar V, Todorović V, Čemažar M, Glavač D, Serša G. Electric pulses used in electrochemotherapy and electrogene therapy do not significantlychange the expression profile of genes involved in the development of cancer in malignantmelanoma cells. BMC Cancer. 2009;9(1):299. DOI: 10.1186/1471-2407-9-299 PMID: 19709437 64. Hojman P, Zibert JR, Gissel H, Eriksen J, Gehl J. Gene expression profiles in skeletal muscle after gene electrotransfer. BMC Mol Biol. 2007;8(1):56. DOI: 10.1186/1471-2199-8-56 PMID: 17598924 65. Mittal L, Camarillo IG, Varadarajan GS, Srinivasan H, Aryal UK, Sundararajan R. High-throughput, Label-Free Quantitative Proteomic Studies of the Anticancer Effectsof Electrical Pulses with Turmeric Silver Nanoparticles: an in vitro Model Study. Sci Rep. 2020;10(1):7258. DOI: 10.1038/s41598-020-64128-8 PMID: 32350346 66. Batista Napotnik T, Polajžer T, Miklavčič D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 2021;141:107871. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2021.107871 PMID: 34147013 67. Zhang Y, Lyu C, Liu Y, Lv Y, Chang TT, Rubinsky B. Molecular and histological study on the effects of non-thermal irreversible electroporationon the liver. Biochem Biophys Res Commun. 2018;500(3):665-70. DOI: 10.1016/j. bbrc.2018.04.132 PMID: 29678581 68. Beebe SJ, Fox PM, Rec LJ, Willis EL, Schoenbach KH. Nanosecond, high- intensity pulsed electric fields induce apoptosis in human cells. FASEB J. 2003;17(11):1493-5. DOI: 10.1096/fj.02-0859fje PMID: 12824299 69. Ford WE, Ren W, Blackmore PF, Schoenbach KH, Beebe SJ. Nanosecond pulsed electric fields stimulate apoptosis without release of pro- apoptoticfactors from mitochondria in B16f10 melanoma. Arch Biochem Biophys. 2010;497(1-2):82-9. DOI: 10.1016/j.abb.2010.03.008 PMID: 20346344 70. Beebe SJ, Fox PM, Rec LJ, Somers K, Stark RH, Schoenbach KH. Nanosecond pulsed electric field (nsPEF) effects on cells and tissues: apoptosis inductionand tumor growth inhibition. IEEE Trans Plasma Sci. 2002;30(1):286-92. DOI: 10.1109/TPS.2002.1003872 71. Zhang H, Liu K, Xue Z, Yin H, Dong H, Jin W, et al. High-voltage pulsed electric field plus photodynamic therapy kills breast cancer cellsby triggering apoptosis. Am J Transl Res. 2018;10(2):334-51. PMID: 29511429 72. Zhang Z, Li W, Procissi D, Tyler P, Omary RA, Larson AC. Rapid dramatic alterations to the tumor microstructure in pancreatic cancer followingirreversible electroporation ablation. Nanomedicine (Lond). 2014;9(8):1181-92. DOI: 10.2217/nnm.13.72 PMID: 24024571 73. O’Brien TJ, Passeri M, Lorenzo MF, Sulzer JK, Lyman WB, Swet JH, et al. Experimental high-frequency irreversible electroporation using a single- needle deliveryapproach for nonthermal pancreatic ablation in vivo. J Vasc Interv Radiol. 2019;30(6):854-862.e7. DOI: 10.1016/j.jvir.2019.01.032 PMID: 31126597 74. Siddiqui IA, Latouche EL, Dewitt MR, Swet JH, Kirks RC, Baker EH, et al. Induction of rapid, reproducible hepatic ablations using next-generation, high frequencyirreversible electroporation (H-FIRE) in vivo. HPB (xford). 2016;18(9):726-34. DOI: 10.1016/j.hpb.2016.06.015 PMID: 27593589 75. Mercadal B, Beitel-White N, Aycock KN, Castellví Q, Davalos RV, Ivorra A. Dynamics of Cell Death After Conventional IRE and H-FIRE Treatments. Ann Biomed Eng. 2020;48(5):1451-62. DOI: 10.1007/s10439-020-02462-8 PMID: 32026232 76. Faroja M, Ahmed M, Appelbaum L, Ben-David E, Moussa M, Sosna J, et al. Irreversible electroporation ablation: is all the damage nonthermal? Radiology. 2013;266(2):462-70. DOI: 10.1148/radiol.12120609 PMID: 23169795 77. Ben-David E, Ahmed M, Faroja M, Moussa M, Wandel A, Sosna J, et al. Irreversible electroporation: treatment effect is susceptible to local environmentand tissue properties. Radiology. 2013;269(3):738-47. DOI: 10.1148/radiol.13122590 PMID: 23847254 78. Ringel-Scaia VM, Beitel-White N, Lorenzo MF, Brock RM, Huie KE, Coutermarsh-Ott S, et al. High-frequency irreversible electroporation is an effective tumor ablation strategythat induces immunologic cell death and promotes systemic anti-tumor immunity. EBioMedicine. 2019;44:112-25. DOI: 10.1016/j.ebiom.2019.05.036 PMID: 31130474 79. Peng B, Zhao Y, Xu L, Xu Y. Electric pulses applied prior to intramuscular DNA vaccination greatly improve thevaccine immunogenicity. Vaccine. 2007;25(11):2064-73. DOI: 10.1016/j.vaccine.2006.11.042 PMID: 17239494 80. Heller LC, Cruz YL, Ferraro B, Yang H, Heller R. Plasmid injection and application of electric pulses alter endogenous mRNA and proteinexpression in B16.F10 mouse melanomas. Cancer Gene Ther. 2010;17(12):864-71. DOI: 10.1038/cgt.2010.43 PMID: 20706286 81. Goswami I, Coutermarsh-Ott S, Morrison RG, Allen IC, Davalos RV, Verbridge SS, et al. Irreversible electroporation inhibits pro-cancer inflammatory signaling in triplenegative breast cancer cells. Bioelectrochemistry. 2017;113:42-50. DOI: 10.1016/j.bioelechem.2016.09.003 PMID: 27693939 82. Štublar J, Žižek D, Jan M, Jarm T, Miklavčič D. Zdravljenje atrijske fibrilacije s katetrsko ablacijo. Zdrav Vestn. 2021;90:410-9. 83. Sachdev S, Potočnik T, Rems L, Miklavčič D. Revisiting the role of pulsed electric fields in overcoming the barriers to in vivogene electrotransfer. Bioelectrochemistry. 2022;144:107994. DOI: 10.1016/j. bioelechem.2021.107994 PMID: 34930678