Tine GREBEN^*, Lado KUTNAR**, Gregor BOŽIČ**, Miran čAS** udk 630*150 izbrani primeri studije biotske raznovrstnosti gozdnih ekosistemov na genski, vrstni in habitatni ravni Case studies of forest ecosystem biodiversity assessment at gene, species and habitat level Povzetek: Slovenija je ena najbolj gozdnatih držav v Evropi, v ta namen smo prikazali in izpostavili nekaj primerov ocene raznovrstnosti oziroma pridobivanja izvirnih podatkov za ocene pestrosti. Ocene biotske raznovrstnosti izbranih sestojev ali habitatov kažejo na visoko biotsko raznovrstnost na vseh opazovanih ravneh. Ločevanje osebkov in ocene pestrosti na habitatnem in vrstnem nivoju je splošno razširjeno in tesno vezano na morfološki koncept vrste. Pristop s pomočjo analize pestrosti enega ali več molekularnih markerjev omogoča pridobivanje velike količine podatkov, neodvisno od taksonomske skupine, ki jo analiziramo. Kritično ovrednotenje posameznega pristopa glede na raven pridobivanja informacije (habitat, vrsta ali gen) kaže, da so vsi pristopi primerni za uporabo v študijah biotske raznovrstnosti in nam omogočajo aplikacije v gozdarstvu. Ključne besede: biotska raznovrstnost gozda, habitatni tip, mikoriza, načrtovanje gospodarjenja, velike prostoživeče živali, vegetacija Summary: Slovenia is among the most forested countries in Europe. For this purpose we aimed present and validate several approaches biodiversity assessment. Preliminary estimations of biodiversity in forest ecosystems indicate high values at all applied levels. At the habitat and at the species level, species identification and species concept applied is crucial. Applying diversity analysis of one or more molecular markers enables us to obtain a large amount of data and can be applied for any taxonomic group. A critical evaluation of each approach (habitat, species, gene level) indicates reliable results at all levels of biodiversity assessment and results in information with applied consequences in forestry. Keywords: forest biodiversity, habitat type, mycorrhiza, management planning, large game, vegetation UVOD Slovenija je s 60,3 % ena najbolj gozdnatih držav v Evropi z visoko stopnjo pestrosti flore in favne kot posledice delovanja različnih klimatskih vplivov, reliefne in geološke pestrosti in ne nazadnje delovanja človeka (MKGP, 2008. Projekt Raba zemljišč). Kot eno od možnosti ocene biotske raznovrstnosti gozda lahko analiziramo pestrost bio- dr., Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, SI-1000 Ljubljana, Slovenija, e-pošta: tine.grebenc@gozdis.si ' dr., Gozdarski inštitut Slovenije, Večna pot 2, SI-1000 Ljubljana, Slovenija komponente ekosistema na več ravneh tako, da ločeno analiziramo pestrost habitatov, vrst in genov. V nadaljevanju obravnavamo primere značilnosti prevladujočih EU gozdnih habitatnih tipov v Sloveniji, vrstno pestrost ekto-mikoriznih gliv in primere analiz genske pestrosti divjega petelina, črnega topola ter rodu vrst gliv. Habitatni tip je rastlinska in živalska združba, ki predstavlja značilni živi del ekosistema in je povezana z neživimi dejavniki (tla, podnebje, prisotnost in kakovost vode, svetlobe, itd.) na prostorsko opredeljenem območju. Kot takega ga vključujemo k pojmu biotske raznovrstnosti, saj opre- » deljuje raznovrstnost ekosistema kot celote. Habitatne tipe uvrščamo v različne hierarhične sisteme in jih lahko po različnih kriterijih razmeroma jasno ločimo od drugih (Devillers in Devillers-Teschuren, 1996; Habitatna direktiva, 1992; EUNIS 2004, Jogan in sod., 2004). Čeprav za gozdne habitatne tipe (Habitatna direktiva, 1992; Natura 2000) veljajo določene splošne značilnosti (European Commission, 2007), pa zaradi lokalnih in regionalnih posebnosti lahko na njihovem celotnem arealu prihaja do določenih razlik. Eden najbolj razširjenih gozdnih habitatnih tipov v Evropi so Srednjeevropski kisloljubni bukovi gozdovi (habitatni tip 9110), katerih areal se razteza vse od španskih Pirenejev, prek srednje Evrope do Švedske in Baltskih držav na severu (European Commission, 2007; Ellmauer, 2005; Thauront, Stallegger, 2008). Poleg habitatnega tipa 9110, ki pokriva približno 9 % površine gozdov v Sloveniji, sta druga dva pogostejša habitatna tipa 91K0-Ilirski bukovi gozdovi (Anemonio-Fagion) (76 % površine gozdov) in 91 L0-Ilirski hrastovo-belogabrovi gozdovi (Erythronio-Carpinion) (7 %) (Habitatna direktiva, 1992; Kutnar in sod., 2009, 2011). Poznavanje pestrosti na vrstnem nivoju je tesno povezano s konceptom vrste, ki ga uporabljamo in je nujen za ločevanje vrst, glede na postavljene kriterije (De Queiroz, 2007). Poznavanje vrst je nujno v primeru uporabe organizmov v indikatorske namene, kot na primer pri mikobi-oindikaciji, pristopu, kjer za potrebe indikacij sprememb v okolju uporabljamo pojavljanje in zabeležene spremembe v združbi (vrstni sestavi in številu posamezne vrste) ek-tomikoriznih vrst gliv (Kraigher in sod., 1996). Metodologijo lahko uporabljamo tudi za primerjave različnih rastišč in pomena le-teh za biotsko raznovrstnost gozdnih tal. Raziskave pestrosti na genskem nivoju sodijo med modernejše pristope z visoko informacijsko vrednostjo. Analize genetskih markerjev za namen ugotavljanja pestrosti in primernosti metode smo uporabili na predstavnikih divjadi, vrste gozdnega drevja in izbranih vrst podzemnih gliv. Divji petelin (Tetrao urogallus L.), ki živi v zmernem pasu Evrope le še v habitatnih gozdovih v gorskih masivih, prekinjenih z dolinami, je zaradi vse intenzivnejše rabe in spreminjanja gozdnega prostora ter zaradi spreminjanja iglastih gozdov v bolj listnate zaradi klimatskih sprememb, otoplitev in onesnaženja zraka (Čas, 2006) ogrožena živalska vrsta (Ur. L. RS 1993/57). Divji petelin pa je marsikje v Evropi prisoten le še zaradi umetne naselitve. V Sloveniji se pojavljata dve, genetsko še ne opredeljeni populaciji. Alpsko populacijo predstavlja največja podvrsta T.u. major, v manjši meri pa populacija s področja Dinaridov. Z analizami nukleotidnih zaporedij variabilnih domen (genov) v mitohondrijski DNK smo želeli ugotoviti morebitne razlike med danes ločenima populacijama ter prikazati aplikacijo rezultatov kot praktičen primer izdelave smernic za dolgoročno izboljšanje habitatnih razmer in revitalizacijo populacij. Kot primer analize drevesnih vrst na ravni genske pestrosti smo analizirali populacije avtohtonega evropskega črnega topola (Populus nigra L.) s področja JZ areala vrste v Sloveniji. Namen naloge je bil analizirati genetsko strukturo črnega topola vzdolž izbranih rek. V analizo smo v izbranem prostoru zajeli šest genomskih markerjev, ki omogočajo zadovoljivo ločevanje na nivoju populacij in posameznih osebkov (Van der Schoot, 2000). Analize skupin osebkov na podvrstnem nivoju nam tako omogočajo razkritja struktur populacij, iskanje refugij in analize vzrokov za današnjo razprostranjenost, kot na primeru izbranih vrst podzemnih gliv (Gre-benc in sod., 2010) Z večnivojskim pristopanjem k analizi biotske raznovrstnosti bomo analizirali večji del dejavnikov, ki vplivajo na biotsko raznovrstnost gozdnih ekosistemov in posledično vplivajo na funkcije gozda in optimalno zagotavljajo izvajanje njegovih ekoloških, gospodarskih in socialnih komponent vključno z ozaveščanjem ljudi o njihovem pomenu. METODOLOGIJA Vsak od pristopov in vsaka skupina analiziranih organizmov ali združb ima specifične pristope k reprezentativnemu vzorčenju kvalitetnih vzorcev, ki omogočajo nadaljnje analize. Za analize habitatnih tipov v Sloveniji (Habitatna direktiva, 1992; Kutnar in sod., 2009, 2011) smo iz vseh EU gozdnih tipov izbrali površinsko prevladujoče habitatne tipe: 91K0-Ilirski bukovi gozdovi, 9110-Srednjeevropski kisloljubni bukovi gozdovi in 91L0-Ilirski hrastovo-belogabrovi gozdovi. Razlike in podobnosti med njimi smo opredelili na osnovi 34 pripadajočih gozdnih združb in 38 izbranih parametrov (fitogeografsko območje (6 parametrov), višinski pas (3), geološka matična podlaga (3) in značilne drevesne vrste (26)). Za karakterizacijo in opis gozdnih združb smo uporabili različno fitocenološko literaturo. Za analizo habitatnih tipov smo uporabili programski paket PC-ORD 5.32 (McCune, Mefford, 2006), s katerim smo ugotavljali indikatorsko vrednost posameznega parametra (Dufrene, Legendre, 1997). Vzorčenje za analize združb mikoriznih gliv poteka po postopkih, opisanih v Kraigher (1996) in Grebenc in sod. (2009). Podrobne sheme vzorčenja za genetske analize, metodologija in statistične analize rezultatov so opisane v Čas (2006) in Bajc in sod. (2011) za divjega petelina, v Božič in sod. (2003) za analize populacij drevesnih vrst, ter v Grebenc in sod. (2009) za glive. Za študije genske pestrosti pri divjem petelinu smo vzorčili rastišča na področju celotne Slovenije (Čas, 2006). Vzorčenje beljakovinskih tkiv (iztrebki, odpadla peresa) smo izvedli v spomladanskem času paritve (rastitve) divjega petelina prek lovskih družin (Lovska zveza Slovenije) in lovišč s posebnim namenom (Zavod za gozdove Slovenije). V analizah znotraj vrstne genetske pestrosti gliv smo uporabili materiale s celotnega areala izbranih vrst (Gre-benc in sod., 2010). V analize genske pestrosti evropskega črnega topola (Populus nigra L.) smo zajeli vzorec 18 odraslih dreves ozkega geografskega področja JZ Slovenije, in sicer 4 drevesa v povodju reke Reke na lokaciji Movraž, 3 ob Osapski reki v Ospu, 5 v dolini reke Glinščice na lokaciji Prešnica-Škofljek ter 6 dreves ob obrežnem pasu reke Dragonje. Raziskavo genetskih značilnosti črnega topola smo izvedli z metodo analize 6 mikrosatelitov WPMS16, WPMS20, WPMS14, PMGC14, WPMS09, WPMS18 po postopkih Van der Schoot in sod. (2000) ter Smulders in sod. (2001). Genetsko variabilnost znotraj populacije smo ocenili s parametri: delež polimorfnih lokusov (P %), povprečnim številom alelov na polimorfen lokus (na), povprečnim številom efektivnih alelov na polimorfen lokus (ne), parametrom heterozigotnosti (izražena kot stopnja dejanske heterozigotnosti (Ho) in stopnjo pričakovane heterozigotnosti (He)) ter oceno koeficienta inbreedinga (F), ki nakazuje, v kakšnem obsegu se dejanski heterozigotni deleži populacije razlikujejo od pričakovanih heterozigotnih deležev, ki nastanejo pri panmiktični oplodnji. Za preverjanje, kako se v populaciji ugotovljene frekvence genotipov pri posameznih lokusih ujemajo s frekvencami genotipov, pričakovanimi po Hardy-Weinbergovem ravnotežju, smo uporabili hi2 test po posameznih genskih lokusih. Za izračun parametrov variabilnosti znotraj populacije smo uporabili program GenAlEx 6.1 (Peakall in Smouse, 2006). REZULTATI IN DISKUSIJA Biotsko raznovrstnost lahko analiziramo na več nivojih in sledeč več konceptom. V nadaljevanju prikazujemo rezultate ter bistvene prednosti in slabosti izbranih študijskih primerov analize biotske raznovrstnosti na ravni habita-tov, vrst ter genov. Z analizo indikatorske vrednosti fitogeografskih območij in relativnih indikatorskih vrednosti za posamezen parameter na primeru analiziranih habitatnih tipov bukovja (preglednica 1), smo za izbrane habitatne tipe ugotovili, da je za tip 9110 (Srednjeevropski kisloljubni bukovi gozdovi) statistično značilno alpsko območje. Razmeroma visoko in-dikacijsko vrednost, vendar statistično neznačilno, ima za ta habitatni tip tudi predalpsko in preddinarsko območje. Podobno je dinarski element nekoliko bolj značilen za habitatni tip 91K0 (Ilirski bukovi gozdovi), medtem ko se habitatni tip 91L0 (Ilirski hrastovo-belogabrovi gozdovi) pogo- steje pojavlja v subpanonskem in preddinarskem območju. Geološka podlaga ima pomembno indikacijsko vrednost, saj so vse skupine geološke matične podlage statistično značilne. Karbonatne kamnine so značilne predvsem za habitatni tip 91K0 in deloma tudi za 91L0, na nekarbona-tnih kamninah pa dobimo predvsem habitatni tip 9110. Habitatni tip 91L0 pa se pogosteje pojavi tudi na mešanih kamninah. Drevesne vrste, ki dobro ločujejo habitatni tip (Ilirski hrastovo-belogabrovi gozdovi) od drugih dveh habitatnih tipov, so: maklen (Acer campestre L.), navadni ali beli gaber (Carpinus betulus L.), češnja (Prunus avium L.) in graden (Quercus petraea (Matt.) Liebl.). Vrste, ki jim lahko pripišemo večjo indikacijsko in diferencialno vrednost za habitatni tip 9110, so: pravi kostanj (Castanea sativa Mill.), navadna smreka (Picea abies (L.) Karsten), rdeči bor (Pinus sylvestris L.) in jerebika (Sorbus aucuparia L.). Vrsta, ki dobro ločuje habitatna tipa bukovij (91K0 in 9110) od Ilirskih hra-stovo-belogabrovih gozdov, je le bukev (Fagus sylvatica L.). Habitatni tip 91K0 je zelo heterogen, kar se kaže tudi v velikem številu različnih pripadajočih združb. Značilno je, da habitatni tip 91K0 na robu svoje ekološke niše prehaja v druga dva habitatna tipa, zato se lahko v prehodnih združbah pojavljajo skupne vrste obeh mejnih habitatnih tipov. Ocene habitatnih tipov so pomembne z vidika spremljanja in vzdrževanja ugodnega ohranitvenega stanja in trajno-stnega obstoja gozdov. Bistvena pri postopku ocenjevanja relativne indikatorske vrednosti in končne ocene habitatne pestrosti pa je tudi zanesljiva identifikacija. Biotsko raznovrstnost na medvrstnem nivoju in izpeljane indekse pestrosti smo na več lokacijah analizirali na primeru pestrosti ektomikorize na bukvi (Grebenc in Kraigher, 2007; Grebenc in sod., 2009; Mašek in Grebenc, 2011). Ekto-mikorizo smo identificirali na vrstnem nivoju po anatomski metodi in z uporabo molekularnih markerjev. Uporaba molekularnih metod z ustrezno ločevalno močjo na nivoju vrst pri glivah tako bistveno dopolnjuje identifikacije tipov ektomikorize na vrstnem in omogoča tudi umeščanje v višje taksonomske enote. S tovrstnim pristopom lahko razširimo nabor znanih taksonov na vrste, katerih ekto-mikoriza še ni bila opisana (Kraigher, 1996) in posledično omogočimo ustreznejšo interpretacijo dobljenih rezultatov (glej tudi Grebenc in sod., 2009). Molekularni pristopi v tem primeru bistveno doprinesejo k natančnejši oceni biotske raznovrstnosti ektomikorize na izbranem gostitelju. Hkrati, z identifikacijo rastlinskega partnerja v ektomikorizi, molekularni pristopi olajšujejo izločanje taksonov gliv, ki se pojavljajo na koreninah drevesnih vrst, ki niso vključene v študije. Težava uporabe molekularnih metod pri ločevanju na nivoju vrst pa je konflikt konceptov vrste, saj identifikacije (gliv, rastlin, živali) temeljijo v veliki meri na morfološkem konceptu, medtem ko sama metoda molekularnih analiz izhaja iz filogenetskega koncepta vrste. Rezultati Preglednica 1. Indikatorska vrednost parametrov (v %) po treh habitatnih tipih (91K0-Ilirski bukovi gozdovi, 9110-Srednjeevropski kisloljubni bukovi gozdovi in 91L0-Ilirski hrastovo-belogabrovi gozdovi) *** = p<0,001, ** = 0,001