Možnosti uporabe genskega dopinga in problemi njegove detekcije
Moĉnosti uporabe genskega dopinga in problemi njegove detekcije
An overview of gene doping applications and problems of its detection
Lovro Žiberna, Klemen Žiberna, Borut Štrukelj, Irena Mlinaric-Rašcan
Povzetek: Genski doping je neterapevtska uporaba celic, genov, genskih elementov ali modulacija genske ekspresije, katere cilj je izboljĝati sposobnosti ĝportnika. Namen vnosa genskega materiala v celice tarœnih tkiv je poveœana ekspresija proteinov, ki regulirajo signalne poti in povzroœijo izboljĝanje ĉelenih fizioloĝkih parametrov. Vnosi genskih zapisov za eritropoetin, IGF-1, inhibitorje miostatina, VEGF in PPAR-delta v celice tarœnih tkiv ĉivali izboljĝajo aerobne sposobnosti, podaljĝajo vzdrĉljivost in zveœajo miĝiœno moœ. Teĉave z uœinkovitostjo in specifiœnostjo prenosa genskega materiala v telo predstavljajo tveganje za organizem. Zaenkrat ĝe ne poznamo primernega testa za detekcijo genskega dopinga, ki bi imel ustrezno obœutljivost in specifiœnost ter bi bil hkrati neinvaziven.
Kljuœne besede: genski doping, eritropoetin, IGF-1, miostatin, VEGF, PPAR-delta, detekcija dopinga
Abstract: Gene doping is defined as the non-therapeutic use of cells, genes, genetic elements, or of the modulation of gene expression, having the capacity to enhance athletic performance. The purpose of gene insertion into the target cells is to improve physiological abilities by vast production of protein that amplifies or inhibits certain signalling pathways. Insertion of genes for erythropoietin, IGF-1, myostatin inhibitors, VEGF and PPAR-delta in animals has shown major rise in aerobic capabilities, prolonged endurance and increased muscle strength. However, several problems with efficiency and specificity of gene transfer exist and call attention to safety and health concerns. Also, no adequate non-invasive and sensitive detection method exists for gene doping.
Keywords: gene doping, erythropoietin, IGF-1, myostatin, VEGF, PPAR-delta, doping detection
1 Uvod
Doping v svoji definiciji zajema uporabo snovi ali metod, ki so potencialno ĝkodljive za ĝportnikovo zdravje, vendar lahko izboljĝajo doseĉke, oziroma prisotnost prepovedanih snovi v organizmu, iz katere je razvidna uporaba prepovedane tehnike. Omejitev dopinga je pomembna iz etiœnega in medicinskega vidika. Kontrolo in regulativo na tem podroœju izvajajo Mednarodni olimpijski komite (IOC), Svetovna antidopinĝka organizacija (WADA) in posamezne panoĉne mednarodne ĝportne organizacije z namenom omogoœiti enake tekmovalne pogoje vsem tekmovalcem in zagotoviti zdravje ĝportnikom. Vsako leto sprejmejo listo prepovedanih substanc in metod. Genski doping se je na tem seznamu prviœ pojavil leta 2003 in je uvrĝœen v skupino prepovedanih metod (1, 2).
Genski doping je definiran kot neterapevtska uporaba celic, genov, genskih elementov ali modulacija genske ekspresije, katere cilj je izboljĝati sposobnosti ĝportnika (1). Pri genskem dopingu gre za uporabo enakih metod dela kot pri genski terapiji s pomembno razliko, da je poseg namesto na bolniku opravljen na zdravem œloveku, ĝportniku. Glavni cilj je vstavitev genov z zapisi za tarœne proteine v
celice (tarœnega tkiva) z namenom doseœi zadostno ekspresijo le-teh in poslediœno izboljĝati delovanje celic in tkiv. Pomembno je poudariti, da za razliko od veœine ostalih dopinĝkih tehnik genski doping lahko povzroœa trajne spremembe na celiœnem nivoju.
2 Prenos genskega materiala v celico
Moĉnosti vnosa umetnega gena v telo so (slika 1):
•  direktna injekcija DNA v tkivo (lokalna in vivo tehnika)
•  uporaba virusnega vektorja (sistemska ali lokalna in vivo tehnika)
•  vstavitev zunaj telesa in vrnitev genetsko modificiranih celic nazaj v telo (ex vivo tehnika)
Za uspeĝnost vnosa ĉelenega zapisa za gen v celiœno jedro se mora zapis bodisi integrirati v kromosom tarœne celice ali pa se ohraniti v celiœnem jedru kot episom. Vstavljeni gen mora imeti dovolj veliko ekspresijo, œe ĉelimo dobiti zadostne koliœine terapevtskega proteina. Takĝne gensko spremenjene celice postanejo rezervoar, ki izloœa ĉelen protein v svoje okolje ali v krvni obtok.
Lovro Žiberna, mag. farm.; Medicinska fakulteta, Inštitut za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo, Korytkova 2, 1000 Ljubljana
Klemen Žiberna, študent medicine; Medicinska fakulteta, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana
prof. dr. Borut Štrukelj, mag. farm.; Fakulteta za farmacijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana
izr. prof. dr. Irena Mlinaric-Rašcan, mag. farm.; Fakulteta za farmacijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana
farm vestn 2007; 58 139
Originalni znanstveni œlanki - Scientific articles
Slika 1.      Shematiœni prikaz razliœnih moĉnosti vnosa umetnega gena v telo.
Figure 1.    Representation of basic approaches for gene insertion into the human body.
Tabela 1.   Vektorji, ki se uporabljajo za prenos genskega materiala v celice in njihove lastnosti.
Table 1.     Survey of vectors for gene transfer with their properties.
Genski prenos	Vektor	Lastnosti
Nevirusni	Liposomi Z DNA pokriti zlati delci DNA proteinski kompleksi Gola DNA	-  manj uspešna transdukcija -  prehodna ekspresija -  majhna imunogenost -  lažja priprava
Virusni	Adenovirusi	-  transfekcija mitoticnih in postmitoticnih celic -  majhna citotoksicnost -  pogost imunski odziv - velika kapaciteta za genski vložek (do 35 kb)
	Adeno-asociacijski virusi	-  majhna toksicnost -  majhna imunogenost - visoka perzistenca vstavljenega gena - majhna kapaciteta za genski vložek (<4,5 kb)
	Retrovirusi	-  majhna toksicnost -  majhna imunogenost - vecinoma okuži samo mitoticno aktivne celice (izjema rod Lentivirus, ki lahko ostane v citoplazmi mitoticno mirujocih celic kot linearni episom in se vgradi kasneje) - majhna kapaciteta za genski vložek (<8 kb)
	Herpes simplex virusi	- okuži mitoticne in postmitoticne celice - visoka kapaciteta -  pogost imunski odziv -  perzistira v celicah v CŽS
140 farm vestn 2007; 58
Za prenos genskega materiala v celice uporabljamo virusne ali nevirusne vektorje (tabela 1). Prednost nevirusnih vektorjev je v lažji pripravi, manjši toksicnosti kot tudi imunogenosti. Ceprav so razvili številne nove nevirusne vektorje, le-ti še vedno ostajajo v senci virusnih, saj njihovo uporabnost v genski terapiji omejujeta prehodna ekspresija in manj uspešen prenos DNA v celice.
Virusni vektorji predstavljajo le ogrodje virusnega genoma, saj se v procesu priprave odstranijo geni, ki omogocajo znotrajcelicno razmnoževanje virusa in posledicno smrt celice. Z odstranitvijo teh genov se ustvari prostor za vnos tarcnega zapisa za želeni gen v virusni genom. Uspešnost samega prenosa v tarcne celice je odvisna od sposobnosti virusa, da transficira celico. Vecina virusov se pritrdi na celico preko receptorja ter prenese svoj dedni material v citoplazmo celice, ki nato potuje s pomocjo virusnih in/ali celicnih proteinov do celicnega jedra.
3  Nevarnosti vnosa genskega materiala v celico
Nevarnosti uporabe genske terapije so številne. Delimo jih na tveganje odvisno od uporabljenega vektorja in tveganje odvisno od kodiranega gena, ki ga prenašamo. Pri izboru virusnih vektorjev vedno obstaja nevarnost, da bi le-ti pridobili patogenost z možnimi rekombinacijami, do katerih lahko pride med uporabo v telesu. Uporaba retrovirusov, ki se nakljucno vgradijo v genom, lahko pripelje do prekinitve normalnega nukleotidnega zaporedja kakega pomembnega celicnega gena, kar lahko vodi v razvoj novih genskih bolezni, tudi raka.
Varnost genske terapije je relativno velika, saj je bilo zdravljenih že okoli 3000 pacientov. Kljub vsemu je zabeleženih že nekaj tragicnih zapletov. Znan je primer osemnajstletnega pacienta v letu 1999, ki se je odlocil za gensko terapijo pomanjkanja ornitin-dekarboksilaze. Pri tem primeru je prišlo do prekomernega imunskega odziva na adenovirusni vektor, kar je pripeljalo do anafilakticnega šoka in posledicno do smrti (3). Ostali pogostejši stranski ucinki genske terapije so gripi podobni simptomi: vrocina, drget, mrazenje, obcutek slabosti in neugodja, suh kašelj, izguba apetita ter bolecine v sklepih in mišicah.
4  Možnost uporabe genskega dopinga v vrhunskem športu
Strokovnjaki so prepricani, da se bo genski doping že v bližnji prihodnosti zacel uporabljati za povecanje oksiforne kapacitete krvi zaradi povecane sinteze eritropoetina. Vse kaže tudi na to, da bo možno hitrejše povecanje mišicne mase ob hkratnem zmanjšanju kolicine mašcevja s pomocjo rastnih dejavnikov (npr. IGF-1) in z inhibicijo zaviralcev rasti (npr. miostatin). Temu pa lahko sledi povecanje prekrvavitve skeletne in srcne mišicnine s povecanjem števila žil, ki jo bodo omogocili endotelni rastni dejavniki (VEGF). Vstavljanje genov za endorfine in enkefaline bi lahko izboljšalo protibolecinsko terapijo.
4.1   Erilropoelin (EPO)
Eritropoetin je hormon, ki ga v 90% izlocajo ledvice in v 10% jetra in ostali organi. Povišana koncentracija eritropoetina v krvi stimulira eritropoezo  v  kostnem  mozgu.  To  vodi  do  povecanega  števila
Možnosti uporabe genskega dopinga in problemi njegove detekcije
eritrocitov v krvi in s tem poveœanega hematokrita in koncentracije hemoglobina v krvi. Na ta naœin se poveœa oksiforna kapaciteta krvi in s tem izboljĝa transport kisika do miĝiœnih tkiv, kar je kljuœnega pomena pri vzdrĉljivostnih ĝportih.
Ĉe leta 1997 so v skeletne miĝice miĝi in primatov z adeno-virusnim vektorjem uspeĝno vnesli gen za eritropoetin, ki se je stabilno izloœal tudi veœ kot eno leto (4). Hematokrit se je pri miĝih poveœal z 0,49 pri kontrolni skupini na 0,81 v testni skupini. Nekontrolirana poveœana sinteza eritropoetina je povzroœila nastanek hude policitemije in poveœane viskoznosti krvi. To je poslediœno privedlo do tromboze v razliœnih ĉilnih sistemih in s tem povezanih kliniœnih slik (akutni miokardni infarkt, cerebrovaskularni inzult, venska tromboza). Raziskovalci so morali v raziskavi, v kateri so vnesli gen za eritropoetin v skeletne miĝice pavianov, z veœkratno flebotomijo uravnavati policitemijo (5).
Takĝen naœin uravnavanja ni priroœen, saj je nenatanœen in na dolgi rok neprimeren za uporabo na ljudeh. Z namenom, da bi dosegli boljĝi nadzor, so razvili regulatorne sisteme, pri katerih je ekspresija gena uravnavana z umetno zgrajenim inducibilnim transkripcijskim dejavnikom. Gen za transkripcijski dejavnik je prav tako kot gen za eritropoetin umetno vnesen v celice s svojim vektorjem (npr. tetraciklinski inducibilni sistem, rapamicin inducibilni transkripcijski faktor (6)) .
Ĝe veœjo nevarnost kot nenadzorovana policitemija pri vnosu gena za eritropoetin predstavlja imunski odziv tako na ektopiœno kot tudi na entopiœno secerniran eritropoetin. Tak odziv lahko privede do hude in ponavadi smrtne avtoimune anemije. V eni ĝtudiji so poroœali, da so kar 3 od 9 opic z vnesenim genom za eritropoetin razvile protitelesa na endogeni in transgeni eritropoetin, pri tem sta dve opici umrli zaradi hude anemije (hematokrit je bil samo 0,25) (7).
3.2  Insulinu podoben rastni dejavnik 1 (IGF-1)
Insulinu podoben rastni dejavnik (IGF-1) se sintetizira v jetrih in v skeletni miĝiœnini ter ima anabolen uœinek. V miĝiœnih celicah sintetizirani IGF-1 deluje avto- in parakrino. Njegovo izloœanje se pospeĝi tako ob poveœani koncentraciji rastnega hormona (GH) v krvi, kot tudi ob poĝkodbi miĝiœnega vlakna. IGF-1 pospeĝuje sintezo miofilamentov in ostalih proteinov v miĝiœni celici in vzpodbuja proliferacijo satelitnih celic (8). Miĝiœne satelitne celice spadajo med zarodne celice, ki obdajajo miĝiœna vlakna. Ob porastu IGF-1 se z mitozo delijo in se zlijejo z miociti ter jim tako prispevajo svoje jedro in nove miofilamente. Na ta naœin potekata regeneracija in tudi hipertrofija miĝiœnega tkiva.
Zgoraj opisani mehanizmi uravnavanja regeneracije miĝiœnih celic so osnova za raziskovanje vpliva poveœane ekspresije gena IGF-1 na poveœanje miĝiœne mase. V ta namen so z adeno-asociacijskim virusom (AAV) v skeletne miĝice miĝi vstavili gen za IGF-1 nadzorovan s pomoœjo miĝiœno specifiœnega promotorja (9). Rezultati ĝtudije so pokazali, da je prekomerna ekspresija IGF-1 v povpreœju za 15% poveœala miĝiœno maso in za 14% poveœala miĝiœno moœ mladih miĝi. Prav tako se je pokazalo, da prekomerna ekspresija IGF-1 zmanjĝa starostno pogojeno izgubo miĝiœne mase. Stare miĝi z vnesenim genom za IGF-1 so imele v povpreœju 27% veœjo miĝiœno moœ kot kontrolna skupina enako starih miĝi.
Narejena je bila tudi raziskava, v kateri so ovrednotili, koliko prispeva k poveœanju miĝiœne mase vadba za moœ in koliko prekomerna ekspresija IGF-1 v skeletni miĝici (10). Prvi skupini podgan, ki je bila izpostavljena vadbi proti uporu, se je po 8 tednih v povpreœju poveœala miĝiœna masa miĝice flexor hallucis longus (FHL) za 23%. Drugi skupini podgan z vstavljenim genom za IGF-1 se je brez vadbe poveœala miĝiœna masa FHL za 15%. Tretji skupini podgan, ki so jim vstavili gen za IGF-1 in jih hkrati izpostavili vadbi proti uporu, pa se je miĝiœna masa FHL poveœala kar za 32%. Kombinacija vadbe za moœ in prekomerna ekspresija gena IGF-1 se je izkazala za najuœinkovitejĝi naœin pridobivanja miĝiœne mase. Merili so tudi hitrost izgubljanja miĝiœne mase FHL podgan po prekinitvi vadbe proti uporu pri miĝicah z in brez vstavljenega gena IGF-1. Po 12 tednih mirovanja se je miĝiœna masa FHL v podganah z vstavljenim genom za IGF-1 zmanjĝala za 4,8%, medtem ko se je miĝiœna masa FHL v podganah brez vstavljenega gena zmanjĝala za 8,3%. Rezultati te raziskave nakazujejo realno moĉnost zlorab ĝportnikov z vstavitvijo genov za IGF-1 v skeletne miĝice z namenom izboljĝati fiziœno pripravljenost kot tudi upoœasniti izgubljanje miĝiœne mase v œasu poœitka med dvema sezonama.
Vstavljanje gena za IGF-1, ki deluje predvsem lokalno, povzroœa manj neposrednih zapletov kot vstavljanje genskih zapisov za proteine, ki delujejo sistemsko. Velike koliœine izloœenega IGF-1 se veœinoma nahajajo v okolici celic, ki ga izloœajo. Prav zato je veliko manjĝa verjetnost neĉelenega imunskega odziva, kot je bil to primer hude anemije pri opicah z vstavljenim genom za eritropoetin. Veliko nevarnost predstavlja moĉnost, da se virusni vektor z genom za IGF-1 po krvi odplavi in vgradi v druge vrste tkiv, od koder bi se IGF-1 prekomerno izloœal v kri. Obstaja povezava med poviĝanimi serumskimi koncentracijami IGF-1 in poveœanim relativnim tveganjem za razvoj razliœnih karcinomov, saj ima IGF-1 moœne mitogene in antiapoptotiœne uœinke na maligne celice (11). Poleg tega pa nenaravno hitro pridobivanje miĝiœne mase kritiœno poveœa obremenitve na tetive in kosti in tako povzroœa skeletne deformacije ali celo zlome. Ĝe posebej je to nevarno pri posameznikih, ki imajo ĉe osteoporotiœne spremembe na kosteh.
3.3  Miostatin (GDF-8)
Miostatin (v preteklosti oznaœen kot GDF-8) spada v skupino transformirajoœih rastnih dejavnikov beta (TGF-ß). Deluje kot negativni regulator miĝiœne mase tako med samim embrionalnim razvojem kot tudi pri odraslem organizmu. Nukleotidno zaporedje gena za miostatin so doloœili leta 1997 s pomoœjo znane vrste izrazito miĝiœastih bikov “Belgian Blue”, ki imajo zaradi 11 baznih parov dolge delecije nefunkcionalen gen za miostatin (12). Ĉivali, ki imajo okvarjen ali odstranjen gen za miostatin, so veliko veœje in imajo 2- do 3- krat veœjo miĝiœno maso kot ĉivali z intaktnim genom za miostatin. Miĝiœna masa se poveœa zaradi kombinacije hiperplazije in hipertrofije miĝiœnih celic (13). V letu 2004 so pri neverjetno miĝiœastem otroku, ki se je rodil bivĝi profesionalni sprinterki, dokazali mutacijo gena za miostatin s poslediœno popolno izgubo funkcije miostatina (14). To odkritje je vzpodbudilo nadaljne raziskave, saj kaĉe na to, da miostatin pri œloveku deluje zelo podobno kot pri miĝih in govedu.
Predvideva se, da bi maso posameznih miĝic lahko poveœali z vstavitvijo genov v satelitne celice ob miĝiœnih celicah, ki bi inhibirali
farm vestn 2007; 58 1411
Originalni znanstveni œlanki - Scientific articles
kompleksno signalno pot miostatina (15). Ker ti dodatno sintetizirani proteini delujejo le lokalno, je možnost sistemskih zapletov na racun imunskega sistema relativno majhna. Skrb predstavlja le dejstvo, da bi zaradi inhibicije miostatina in posledicne hitre in množicne proliferacije satelitnih celic, le-te scasoma izgubile zmožnost delitve. V tem primeru bi se regenerativna zmožnost mišic kriticno zmanjšala, kar bi privedlo do kronicne mišicne degeneracije.
3.4   Ĉilni endotelijski rastni dejavnik (VEGF)
Žilni endotelijski rastni dejavnik (VEGF) je glavni modulator zelo kompleksnega sistema regulacije angiogeneze v embriogenezi in tudi med samo rastjo organizma (16). Prav tako je antiapoptotski faktor za endotelijske celice, inducira izlocanje NO iz endotelija, kar povzroci vazodilatacijo ter je odgovoren za tvorbo novih žil v casu hipoksije.
Zaradi potencialno ugodnih ucinkov angiogeneze pri bolnikih s periferno arterijsko boleznijo ali ishemicno srcno boleznijo potekajo raziskave za zdravljenje teh bolezni z vstavljanjem gena za VEGF. Genska terapija z VEGF se pri bolnikih z žilnimi boleznimi ni izkazala kot dovolj ucinkovita terapija. Kljub temu obstaja možnost, da bodo nekateri športniki v želji po vecji prekrvavitvi srca in skeletnih mišic posegli po tej metodi (17, 18). V teh primerih obstaja nevarnost nastanka imunskega odziva in tvorbe protiteles proti VEGF zaradi njegovega prevelikega izlocanja. To bi zmanjšalo njegovo delovanje in posledicno bi hitreje nastale kronicne žilne bolezni. Po drugi strani lahko prekomerno izlocanje VEGF vodi do nastanka angiomov, retinopatij, psoriaze in drugih obolenj povezanih s patološko vaskularizacijo (19).
3.5   Agonisti PPAR Delta
PPAR {Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) so proteini, ki spadajo v družino jedrnih receptorjev in delujejo kot transkripcijski dejavniki. Aktivacija PPAR poteka preko vezave ligandov, ki so vecinoma metaboliti znotrajcelicne presnove mašcob. PPAR proteini obstajajo v treh izotipih: a, g in d (znan tudi kot b). Izotip PPARd poveca katabolizem mašcobnih kislin in termogenezo z odklopniki v mitohondrijih v skeletni in srcni mišicnini ter v mašcobnem tkivu. Prav tako zmanjšuje od makrofagov odvisne vnetne odzive (20).
Ucinke PPARd na adipocite so preucevali v študiji transgenih miši z dodanim genskim zapisom za kontinuirano ekspresijo PPARd. Ugotovili so, da imajo transgene miši pri nespremenjeni dieti za 20% manjšo telesno težo in kar za 40% manj mašcob v ingvinalnem predelu kot kontrolna skupina (21). Prav tako dieta z zelo visokim odstotkom mašcob ni povzrocila povecanja telesne teže, hipertrofije adipocitov ali hipertrigliceridemije. Do podobnih rezultatov so prišli tudi v študijah miši brez vstavljenega gena za PPARd, kjer pa so z injiciranjem PPARd agonista dosegli povecano aktivacijo PPARd (21, 22). Transgene miši z vstavljenim genom PPARd kot tudi obicajne miši z injiciranim PPARd agonistom so imele v mišicnih vlaknih povecano ekspresijo genov za oksidacijo mašcobnih kislin in povecano število mitohondrijev (23). Podvojilo se je tudi število pocasnih mišicnih vlaken (tip 1) na racun zmanjšanega števila hitrih mišicnih vlaken (tip 2). Posledicno se je izrazito izboljšala vzdržljivost teh miši, saj so lahko do popolne izcrpanosti pretekle za 92% vecjo razdaljo kot kontrolna skupina. Ugodni ucinki PPARd na mišice in mašcevje napovedujejo uporabo te tehnike predvsem v vzdržljivostnih športih.
3.6  Endorfini in enkefalini
Bolecino lahko opredelimo kot senzoricno in custveno doživetje, povezano z dejanskim ali potencialnim delovanjem dražljajev, ki okvarjajo tkiva. Telo lahko samo modulira stopnjo bolecine. Obstaja vec vrst nevrotransmiterjev, ki sodelujejo na poteh za modulacijo nociceptivnega prenosa, pri cemer sta najbolj znana opioidna peptida endorfin in enkefalin.
Na modelu podgane s kronicno konstriktivno poškodbo živca (n. ischiadicus) so uspešno zmanjšali bolecino z vstavitvijo plazmida v hrbtenjaco s pomocjo elektroporacije. Plazmid je vseboval gen za proopiomelanokortin (POMO), ki je povzrocil povecanje koncentracije endorfinov v hrbtenjaci in s tem dvig praga bolecine (24). V drugem eksperimentu pa so na modelu glodalca z lumbalno radikulopatijo prav tako uspešno zmanjšali bolecino z vstavitvijo genov za proenkefalin in glutamatno dekarboksilazo s pomocjo vektorja na osnovi herpes simplex virusa (25).
Te oblike genske terapije veliko obetajo za lajšanje bolecin pri bolnikih v terminalni fazi rakave bolezni, a so še na zacetku razvoja in dalec od pricetka klinicnih raziskav. Mišicna izcrpanost po hudih telesnih naporih vodi v stanje metabolne acidoze, saj telo proizvede veliko energije v anaerobnih metabolnih procesih, katerih stranski produkt je laktat. Prekomerne kolicine le-tega in njegovo prepocasno odstranjevanje s Corijevim ciklom povzrocajo bolecino. Bolecina je celo pomembnejša od fizioloških omejitev telesa za nezmožnost dolgotrajnega vztrajanja na visoki intenzivnosti telesnega napora in prav zato vsakršno zmanjšanje obcutenja bolecine izboljša zmogljivost športnika (26).
4 Detekcija uporabe genskega dopinga
Ustaljene metode testiranja uporabe dopinga temeljijo predvsem na detekciji prepovedane snovi ali v vzorcu krvi ali v vzorcu urina. Genska terapija omogoca direktno aplikacijo genov v tarcna tkiva. S takim nacinom aplikacije se izogne sistemskemu krvnemu obtoku in detekcija genskih vektorjev s sedanjimi metodami testiranja je prakticno onemogocena (27).
Predvidevamo, da bo v zacetni fazi najpogostejši nacin uporabe genskega dopinga lokalno injiciranje vektorjev v skeletne mišice. Znacilnost te aplikacije je, da transformirani miociti izlocajo proteinske produkte predvsem lokalno, kjer so fiziološki ucinki tudi zaželeni. Možen nacin detekcije uporabe genskega dopinga je tako le iskanje morebitnih ostankov kemijskih snovi (v primeru uporabe nevirusnih vektorjev) ali ostankov virusnih vektorjev na mestu aplikacije. To pa je mogoce le z uporabo invazivnih metod kot je mišicna biopsija. Mišicna biopsija je invazivni kirurški poseg, ki poleg same poškodbe tkiva prinaša tudi možnost dolocenih perioperativnih zapletov, npr. preobcutljivostna reakcija na lokalne anestetike, okužba kirurške rane, postoperativna bolecina.
Številne oblike genskega dopinga ne potrebujejo direktnega injiciranja genov v tocno dolocena tkiva, temvec jih je moc vgraditi v katero koli tkivo v telesu, npr. gen za eritropoetin. V teh primerih je mesto injiciranja prakticno nemogoce ugotoviti. Upanje za detekcijo vzbuja raziskava, v kateri so ugotovili obstoj strukturnih razlik med nativnim
142 farm vestn 2007; 58
Možnosti uporabe genskega dopinga in problemi njegove detekcije
eritropoetinom (proizvedejo ga ledviœne celice) in eritropoetinom, ki ga izloœajo miociti po predhodni vstavitvi virusnega vektorja z genskim zapisom za eritropoetin (28). Do teh razlik pride zaradi drugaœne post-translacijske modifikacije v razliœnem tipu celic. Na tem mestu je ustrezno vpraĝanje, ali morda ne obstaja v telesu tkivo, ki lahko izvede identiœne post-translacijske modifikacije kot to poœno ledviœne celice. Takĝne celice bi namreœ proizvajale nativnemu eritropoetinu identiœni protein in detekcija ne bi bila mogoœa.
Trenutno poteka veœ raziskav, ki preuœujejo korelacijo med aplikacijo doloœene oblike genskega dopinga in spremembami v profilu genske ekspresije z uporabo tehnologije mikromreĉ (27, 29). Preuœujejo mRNA pri posameznikih, ki prejemajo gensko terapijo in jih primerjajo z rezultati kontrolne skupine (27). Razvoj poteka v smeri iskanja ustreznih proteinov, ki bi bili primerni za uporabo kot serumski biomarkerji za nadzor uporabe genskega dopinga (29). Potrebno bo tudi ugotoviti, kakĝne spremembe genske ekspresije celic povzroœa intenzivna in veœletna telesna obremenitev (v procesu treniranja) in v kakĝnem œasovnem okviru. Vpraĝljiv je predvsem prenos rezultatov raziskav, ki so izvedene na ljudeh, ki se le obœasno ukvarjajo s ĝportom, na vrhunske ĝportnike.
Raziskava, ki je preuœevala in vitro vpliv IGF-1 na celiœno kulturo miĝiœnih satelitnih celic C2C12, je pokazala, da pride do kompleksnih vzorcev spreminjanja genske ekspresije v razliœnih druĉinah genov. Podobne rezultate so dobili tudi, kadar so in vivo injicirali IGF-1 v razliœne organe. Ĝtudija je ĝe vedno v teku, saj ĉelijo opaĉene genetske in proteomske spremembe natanœno definirati, tako da bi lahko sluĉile kot dokaz uporabe IGF-1 kot genskega dopinga (30).
V teku je tudi razvijanje neinvazivnih molekularnih slikovnih metod za detekcijo genskega dopinga. Veliko se priœakuje od razvoja metode detekcije specifiœne mRNA v tkivih, kjer le-ta normalno ne nastaja, npr. detekcija mRNA za eritropoetin v miocitih. Princip zaznave mRNA temelji na hibridizaciji s primernimi protismernimi (angl. antisense) oligonukleotidnimi sondami, ki so ustrezno oznaœene, da omogoœajo detekcijo z uporabo pozitronske emisijske tomografije (PET oz. SPECT, Single Photon Emission Computed Tomography) tehnologije. Glavni izziv predstavlja konstrukcija ustrezno stabilnih oligonukleotidov, ki jih ne bodo razgradile RNaze H. Temu problemu se poskuĝajo izogniti z oblikovanjem peptidnih nukleinskih kislin (PNA), ki so visoko stabilne, imajo dobre farmakokinetiœne lastnosti in dobro penetracijo v celice (31, 32).
Kot je razvidno iz opisanega, zaenkrat ĝe ne poznamo primernega testa za detekcijo genskega dopinga, ki bi imel ustrezno obœutljivost in specifiœnost ter bil hkrati neinvaziven.
5 Zakljuœek
Podatkov o morebitni prisotnosti genskega dopinga med ĝportniki zaenkrat ĝe ni. Rezultati doseĉeni na ĉivalskih modelih dokazujejo, da bo z uporabo genskih tehnologij mogoœe poseœi v izboljĝanje telesne sposobnosti ĝportnika. Slednje seveda ni etiœno sprejemljivo, bo pa izredno zahtevno take posege identificirati. Odloœitev o naœinu in tipu uporabe genskega dopinga bi bila odvisna od posamezne ĝportne discipline. Take odloœitve bi temeljile na poznavanju kineziologije in obremenitvene fiziologije doloœenega ĝporta ter na natanœnem poznavanju telesne zgradbe in fizioloĝkih parametrov posameznega
ĝportnika. Cilji uporabe genskega dopinga bi bili izboljĝanje fizioloĝkih parametrov kot so poveœanje oksiforne kapacitete krvi, izboljĝanje prekrvavitve miĝiœnih tkiv, poveœanje koliœine encimov za aerobno pridobivanje energije, zmanjĝanje deleĉa maĝœobnega tkiva in doseganje ĉelenega razmerja med poœasnimi in hitrimi miĝiœnimi vlakni. To bi omogoœilo podaljĝan œas telesne obremenitve ali v aerobnem ali v anaerobnem obmoœju in tudi veœjo maksimalno miĝiœno moœ posameznih miĝiœnih skupin.
Posamezne raziskave na ĉivalskih modelih, kjer je priĝlo do resnih zapletov, nakazujejo potencialno nevarnost genskega dopinga za zdravje ĝportnika. Nevarnost je predvsem v nepredvidljivosti obnaĝanja vnesenih vektorjev v telesu kot tudi v nepredvidljivosti odziva organizma. Genski doping predstavlja neetiœen poseg v organizem ĝportnika, ki ga zaradi neustreznih detekcijskih tehnik trenutno ĝe ni mogoœe slediti.
6 Literatura
1.    The World Anti-Doping Code: The 2007 Prohibited List: International List. WADA, 2006.
2.    Kuipers, H. and G. Ruijsch van Dugteren. The prohibited list and cheating in sport. Int J Sports Med 2006; 27: 80-82.
3.    Raper, S.E., et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab 2003; 80: 148-158.
4.    Svensson, E.C., et al. Long-term erythropoietin expression in rodents and non-human primates following intramuscular injection of a replication-defective adenoviral vector. Hum Gene Ther 1997; 8: 1797-1806.
5.    Zhou, S., et al. Adeno-associated virus-mediated delivery of erythropoietin leads to sustained elevation of hematocrit in nonhuman primates. Gene Ther 1998; 5: 665-670.
6.    Rivera, V.M., et al. Long-term pharmacologically regulated expression of erythropoietin in primates following AAV-mediated gene transfer. Blood 2005; 105: 1424-1430.
7.    Chenuaud, P., et al. Autoimmune anemia in macaques following erythropoietin gene therapy. Blood 2004; 103: 3303-3304.
8.    Barton-Davis, E.R., D.I. Shoturma, and H.L. Sweeney. Contribution of satellite cells to IGF-I induced hypertrophy of skeletal muscle. Acta Physiol Scand 1999; 167: 301-305.
9.    Barton-Davis, E.R., et al. Viral mediated expression of insulin-like growth factor I blocks the aging-related loss of skeletal muscle function. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: 15603-15607.
10.  Lee, S., et al. Viral expression of insulin-like growth factor-I enhances muscle hypertrophy in resistance-trained rats. J Appl Physiol 2004; 96: 1097-1104.
11.Yakar, S., D. Leroith, and P. Brodt. The role of the growth hormone/insulin-like growth factor axis in tumor growth and progression: Lessons from animal models. Cytokine Growth Factor Rev 2005; 16: 407-420.
12.  McPherron, A.C. and S.J. Lee. Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene. Proc Natl Acad Sci U S A 1997; 94: 12457-12461.
13.  McPherron, A.C., A.M. Lawler, and S.J. Lee. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member. Nature 1997; 387: 83-90.
farm vestn 2007; 58 1431
Originalni znanstveni œlanki - Scientific articles
14.  Schuelke, M., et al. Myostatin mutation associated with gross muscle hypertrophy in a child. N Engl J Med 2004; 350: 2682-2688.
15.  Lee, S.J. Regulation of muscle mass by myostatin. Annu Rev Cell Dev Biol 2004; 20: 61-86.
16.  Ferrara, N., H.P. Gerber, and J. LeCouter. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med 2003; 9: 669-676.
17.  Yla-Herttuala, S. and K. Alitalo. Gene transfer as a tool to induce therapeutic vascular growth. Nat Med 2003; 9: 694-701.
18.  Markkanen, J.E., et al. Growth factor-induced therapeutic angiogenesis and arteriogenesis in the heart—gene therapy. Cardiovasc Res 2005; 65: 656-664.
19.  Tammela, T., et al. The biology of vascular endothelial growth factors. Cardiovasc Res 2005; 65: 550-563.
20.  Barish, G.D., V.A. Narkar, and R.M. Evans. PPAR delta: a dagger in the heart of the metabolic syndrome. J Clin Invest 2006; 116: 590-597.
21.  Wang, Y.X., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor delta activates fat metabolism to prevent obesity. Cell 2003; 113: 159-170.
22.  Tanaka, T., et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor delta induces fatty acid beta-oxidation in skeletal muscle and attenuates metabolic syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 15924-15929.
23.  Wang, Y.X., et al. Regulation of muscle fiber type and running endurance by PPARdelta. PLoS Biol 2004; 2: e294.
24.  Lin, CR., et al. Electroporation-mediated pain-killer gene therapy
for mononeuropathic rats. Gene Ther 2002; 9: 1247-1253.
25.  Lee, J.Y., D.J. Fink, and M. Mata. Vector-mediated gene transfer to express inhibitory neurotransmitters in dorsal root ganglion reduces pain in a rodent model of lumbar radiculopathy. Spine 2006; 31: 1555-1558.
26.  Sgherza, A.L., et al. Effect of naloxone on perceived exertion and exercise capacity during maximal cycle ergometry. J Appl Physiol 2002; 93: 2023-2028.
27.  Roberts, C Surrogate Markers For Transgene Expression - Global Gene Expression Analysis. In: WADA Stockholm Symposium on Gene Doping, 2005.
28.  Lasne, F., et al. “Genetic Doping” with erythropoietin cDNA in primate muscle is detectable. Mol Ther 2004; 10: 409-410.
29.  King, C Proteomics as a Tool to Detect Gene Doping: An Introduction to Protein Expression Profiling. In: WADA Stockholm Symposium on Gene Doping, 2005.
30.  Friedmann, T., et al. The effect of IGF-1 on Gene Expression and on the Proteome of Muscle Satellite Cells. In: WADA Stockholm Symposium on Gene Doping, 2005.
31.  Segura, J., J. Pacual, and Z. Nikolovski, Non-invasive Molecular Imaging of Gene Expression Useful for Doping Control: Pilot Study in Animals after Erythropoetin Gene Transfer. 2004; Institution Municipal Investigacio Medica, Pharmacology Research Unit: Barcelona, Spain.
32.  Zinn, K., T. Chaudhuri, and S. Frank. Potential for Non-Invasive Imaging in Anti-Doping Efforts. In: WADA Stockholm Symposium on Gene Doping, 2005.
144 farm vestn 2007; 58