Mateja Plavsak
Izolacija normalnega huraanega gama makroglobulina in študij njegovega izginevanja iz zajčeve in Človekove krvi
Fredlozeno kot doktorsko delo Medicinski fakulteti
v Ljubljani
junija 1965
H.1963^8
Vsebina
Uvod. Problem in delovna hipoteza.........*....   Stran     1
Splosni opis antiteles.......................        "         3
Struktura antiteles........................        "       11
Biolosko važne karakteristike normalnih gama
makroglobulinov ............,................        "       17
Biosinteza antiteles........................        "       22
Katabolizem antiteles.......................        H       r.4
Pregled znanih preparativnih tehnik za izo-
lacijo normalnih gama makroglobulinov .......         "         28
Eksperimentalni  del
1.  Studij eksperimentalnih pogojev pri novi preparativni metodi za izolacijo gama makro-globulina (kombinacija kromatografije na A-50
in filtracije na gelu G-200 ...............  Strar T?
2. Priprava normalnega humanega gama makroglo-bulina za metabolicne poskuse
A.Kromatografija na DEAE in filtracija
skozi gel G-200......................    "  39
B. Filtracija skozi gel G-200 in pre~ parativna elektroforeza ............    "  42
C. Kromatografija na A~50 in filtracija
skozi gel G-200 ....................    "  45
3.  Bioloski eksperimenti
A. Material in metode .................            "       50
B. Vrednotenje eliminacijskih krivulj..            M       53
C. Rezultati in diskusija.............            "       55
4.   Zakljucki ................................            "       71
5.  Bibliografija
Uvod Problem in delovna hipoteza
V okviru zelo heterogene družine antiteles nastopa imunoke-mijsko enovita skupina molekul, poznana pod imenom gama makro-globulin. Da gre za visokomolekilarna antitelesa, je že dolgo poznano, vendar je njihova izredno visoka imunoloska speci-fičnost in pomembnost jasna sele v zadnjih letih. Njihova biosinteza je stimulirana izključno s prisotnostjo antigenov, kar za razliko od ostalih serumskih beljakovin velja za vsa antitelesa. Njihova razgradnja je neodvisna od koncentracij v serumu, kar kaže na to, da gre za avtonomen drgradacijski proces, razlicen od tistega pri 7S gama globulinih, kjer tako odvisnost lahko opazimo.
Kakšni mehanizmi urejajo specificni potek imunološke obrambne reakcije, rešujejo strokovnjaki na nivoju celicne biologije. Kako se odražajo strukturne razlike med posameznimi antite-lesi v njihovih bioloških funkcijal, je naloga specializi-ranih biokemikov. Moje raziskovalno prizadevanje je veljalo na eni strani študiju preparativnih metod za izolacijo gama makroglobulina iz seruma normalnih oseb, na drugi strani pa reševanju vprašanj, ki se pojavljajo v zvezi z negovira kata->-bolizmom. Dosedaj redki eksperimenti govorijo za to, da je življenska doba normalnega makroglobulina v cirkulaciji znatno krajša od življenjske dobe 7S gama globulinov. Prav nic ni znanega o tem, kje poteka njegova biološka degradacija.
Pri svojem delu sem zasledovala dve vprasanji: l,Kako se eli-minira humani makroglobulin iz organizraa zajca v primerjavi s 7S gama globulinom in 2. kako se katabolizira homologni makro-globulin v cloveku. Tu sem s preprostimi in relativno dosto-pnimi merilnimi in laboratorijskimi tehnikami poskušala ujeti skromen vpo^led v dogajanja, povezana z njegovira izginevanjem iz krvi in telesa.
Del eksperimentov sem izvedla v teku svojega studijskega bi-vanja na Wright-Fleming Institut of microbiology v Londonu, deloma pa na Zavodu za transfuzijdi krvi v Ljubljani, pri cemer je bilo neprecenljive vrednosti sode-.lovanje z Izotopskim labo-ratorijem Onkološkega instituta v Ljubljani. Delo sem razmno-žila in tehnicno opremila v casu, ko bivam kot gost Švicar-skega Rdecega križa na Theodor Kocher Institut v -Bernu.
V vseh teh letih, odkar se ukvarjam z antitelesi, sem se marsikaj važnega naucila. Zato se imam zahvaliti predvsem svojim angleškim kolegom, ki so mi dve leti pozrtvovalno pomagali preko zacetniških težav in dr. ?!arjanu Erjavcu, ki mi je odprl nove aspekte in možnosti ter mi nadvse tovariško pomagal.
^•ahvaliti se moram tudi kolektivu Zavoda za transfuzijo krvi in vsem tistim posameznikom, ki so mi pomagali omo-gociti moja strokovna potovanja.
Bern, 1. inaja 1965.                                                   M.P.
SPLOŠEN OFIS ANTITELES
Imunološka obramba živalskega in cloveškega organizma je vezana na kompleksno skupino beljakovin, imenovanih anti-telesa (protisnovi, obrambne snovi), ki je po mnogih krite-rijih sicer zelo heterogena, kaže pa izrazito sorodnost po svoji strukturi in funkciji. Prvotno so to frakcijo defini-rali kot komponento, ki se najpocasneje giblje v elektricnem polju pri alkalnem pH in 30 imenovali gama globulin (1,2), vendar so ze prav kmalu ugotovili, da gre za dve komponenti, ki se razlicno hitro gibljeta v centrifugalnem polju (1,5 ). Sele uporaba imunoelektroforetske tehnike je jjokazala, da gre vsaj za tri razlicne komponente v okviru gama globulinov (4,5) Zaradi velike imunoke-nijske in biološke sorodnoati jih zdru-žujemo v posebno skupino s kolektivnim imenom "imunoglobulini" (Heremans, 5). Danes poznamo tri tipe antiteles, za katere najdemo v literaturi naslednje sinonime:
i.  Gama globulin (s.s.), 7S gama globulin, IgG, Gama^ globulin
ii.   Gama makroglobulin, 19S gama globulin, IgM, Gama^f/j globulin, beta^jvj globulia
iii.   Gamaj^ globulin, beta^A globulin, IgA
Obrambna vloga prvih dveh je poznana že zelo dolgo (2,1), toda šele mnogo kasneje se je izkazalo, da je na frakcijo gaman . vezana aktivnost takozvanih "reaginov" ( 6,7 ) . 7S in 19S globuline so dosedaj dokazali pri vseh raziekova-nih sesalcih in celo pri nekaterih nižjih vretencarjih, med-tem ko je frakcija gamal  s sigurnostjo identificirana edino pri človeku,
V dolocenih proliferativnih stanjih plazmocitarnega in limfocitarnega sistema nastopajo v velikih kolicinah zelo
3
homogene frakcije paraproteinov, ki so po: strukturi mocno sorodni posameznim imunoglobulinom (8,9), ceprav njihova biološka funkcija še zdavnaj ni pojasnena. Ker jih je bilo relativno lahko izolirati v vecjih kolicinah in v zelo cisti obliki, so služili za izcrpne študije o fizikalno-kemijskih lastnostih in strukturi, ki so dale dragocene podatke, saj jih je bilo v vecini primerov mogoce aplicirati na normalne frakcije antiteles. Nekatere fizikalno-kemijske in bioloske karakteristike normalnih imunoglobulinov so razvidne iz sledece tabele:
Components	7S y-globulin	^jA-globulin	yiM-globulin
Synonyms	y-globulin	J32A-globulin	i    L2M-globulin
	y2-globulin		19S globulin
Serum Conc. g/100 ml	0-8-1-5	0-05-0-20	y-macroglobulin 0-05-0-10
Physico-chemical Properties			
%N	15-6	16-2	14-5
% Carbohydrate	2-5	10-5	10-0
% Hexose	1-2	4-8	5-2
% Fucose	0-3	0-2	0-6
% Hexosamine	1-1	3-8	2-9
% Sialic Acid	0-2	1-7	1-7
Electrophoretic Mobility			
pH8-6(— lO^cm^V^sec'1)	-0-6-+3-0	+ 1-2-+3-6	About +2
Sedimentation Coefficient	6-7	7 (80-85%)	18-20
Range of Salting Out	1-2-1-8 M	10-13 (15-20%) 1-3-1-8M	1-1-1-6M
(NH4)2SO4pH7			
Biological Properties			
Antibody Activity			i
Genotypic Specificity Gm			
Inv Placental Transmission	+	0	+ o
Skin Fixation		0	o
Combination with			
Rheumatoid Factor	+	0	0
Povzeto po Cohenu (10)
Nasplosno je precej enostavno izolirati iz seruma mesanico raznih antiteles(ll).Težave nastopijo, ko želimo frakcionirati posamezne tipe gama globulinov, posebno makroglobulin ali gama1A globulin.Preparativne metode slone na ralični topno-sti posameznih antiteles v vodi ali puferjih z nizko jonsko jakostjo, njihovem selektivnem obarjanju z dolocenimi kationi (npr. Zn++), njihovi razlicni sedimentacijski hitrosti v
4
centrifugalnem polju, elektroforetskih in kromatografskih lastnostih in razlicnih molekularnih dimenzijah.Tako je makro-globulin nasplošno v vodi netopen (5), medtem ko sta ostala dva topna . Edino gama^ ni mogoce oboriti s cinkovimi joni (5). Prav tako se medseboj razlikujejo po kromatografskih lastnostih na DEAE celulozi (12) in gibljivosti v elektro-forezi v škrobnem gelu.
Prav tako so se izkazale kot uspešne razne metode, kjer lahko izoliramo specifična antitelesa iz njihovih kompleksov z antigenom (13).
7 S GAMA GLOBULIN
Ta frakcija je najdalj casa poznana in je bila vsled tega tudi najizdatneje študirana. Fredstavlja 85-90^ celokupnega gama globulina. Kot ostali imunoglobulini je tudi ta zelo heterogena v svojih fizikalno-kemijskih karakteristikah , kaže pa izrazito enovitost v svoji strukturi in funkciji(l4). Njena velika heterogenost zaenkrat se ni pojasnena. Lahko da gre za veliko število raznih antiteles, ki so jih proizvedli razlicni celicni kloni (odtod moroa homogenost njenega pato-loškega ekvivalenta- mielomskega paraproteina ?). Ta domneva je sporna, saj so na eni strani avtorji našli, da so speci-ficna antitelesa skoro v vseh parametrih bolj homogena od povprecnega gamaglobulinskega pula (15,16), medtem ko ao spet drugi ugotovili pri obeh enako heterogenost (l7).Vendar je bilo mogoce razbiti gama globulin na številne kromatografske subfrakcije, v katerih je bila antitelesna aktivnost neenako-merno razporejena (18).Zaenkrat se ni razcišceno vprasanje "neimunega^ gama globulina in eventualnih strukturnih razlik med njim in antitelesi, Razen omenjenih eksperimentov, v
5
katerih so izolirana in purificirana specificna antitelesa pokazala vecjo homogenost od celotnega gama globulina, ni bilo zaenkrat mogoce dokazati nikakršnih razlik v fizikalno-kemij-skih lastnostih. Prav tako so sporne razlike med mielomskimi in normalnimi gama globulini (19) in edinole v enem porocilu zasledimo, da so bile pri purificiranih mielomskih globulinih dokazane antigene determinante, ki jih ni najti v pulu normal-nega gama globulina (20).
7S gama globulin ima veliko obmocje elektroforetske giblji-
—5  2 —1  —1 vosti (od 0.5 - 1,3 x 10 cm ~V~ sek" ) pri pH 8,6 in jonski
jakosti puferja 0,1 ter izoelektricno tocko med 6-8 (14).
o Sedimentacijska konstanta Spow je 6,5-6,7 in molekularna masa
150-190,.000 (21). Kaže veliko elektroforetsko (5) in kromato-grafisko heterogenost (22). Elektronsko-mikroskopske studije ali studij difuzije skozi kolodijske membrane znene velikosti por kazejo, da je molekula gama globulina asimetricna z dol-žinskim premerom 200-250 A in širinskim 30-40 A (30-70 A pri mielomskih gama globulinih) (23,24). Humani gama globulin vsebuje 2,5% ogljikovih hidratov, katerih sekvenca in nacin vezave na molekulo še nista znana. Toznana je tudi aminoki-slinska sestava (25)
Gama globulin daje posebno crto v imunoelektroforetskem testu in eno sarao v Ouchterlonijevem testu, vendar lahko s poseb-nimi antiserumi v omenjenih testih dobimo tudi podvojeno linijo. Mogoce je sklepati, da gre za skupini dveh razlicnih gama globulinov, ki se razlikujeta po antigenosti (da poleg skupnih nosita tudi vsaka zase specificne determinante (26), kar je v skladu s študijami, ki so odkrile dva antigensko raz-locljiva tipa med mielomskimi in Bence-Jones proteini (27). Mnogo je poznanega o genetskih variantah zivalskih in humanih gama globulinov (25), kot tudi o antigeni sorodnosti med posameznirai antitelesi.
6
GAMA 1A  GLOBULIN
Humani gama 1A globulin predstavlja okrog 5-10^ kolicine celokupnega gama globulina (4,5). ^elativno dobro je raz-iskan edinole pri cloveku, kjer se v velikih kolicinah naha-ja tudi v mleku, salivi in solzah in se izloca v urinu (28). Odgovarjajoca frakcija je bila opisana pri konjih, hiperimu-niziranih z diftericnim in tetanicnim toksinom, kjer je bilo v njej mogoce določiti večino antitoksične aktivnosti.(29) Zelo podobno frakcijo so naoli v serumu mocno imuniziranih rnorskih prešickov (30) in miši (31). V tej frakciji so našli aktivnost takozvanih "reaginov"  (6,7), insulinskih antiteles (32) in izoaglutininov
Gama 1A globulin je heterogen v svoji elektroforetski giblji-
vosti, ki je vecja kot pri 7S gama globulinu in mocno podobna
_5  2 -1  -1 gibljivosti makroglobulina : 1,2 - 3,6 x 10 cm V sek  pri
pH 8,6 in jonski jakosti puferja 0,1 (5).Povprečna vrednost njene sedimentacijske konstante S20w je ocenjena na 7S, vendar najdemo pri mielomskih proteinih tega tipa pogosto tudi hitreje sedimentirajoce komponente s sedimentacijskimi kon-stantami 10S, 13 in 15S, ki jih je mogoce z merkaptoetanolom razbiti na 7S enote (34). Vsebuje kvalitativno in kvantitativno podobno kolicino ogljikovih hidratov kot gama makroglobulin. Ker so ciste frakcije gama 1A globulina težko dostopne, je njegova struktura le slabo poznana.
7
8
19 S MAKROGLOBULIN
zastopa priblizno 5r-10fo celokupnega gama globulina v serumu in približno 1% celokupnih serumskih beljakovin (11). Dokazali so ga v serumu mnogih species, vključno zajca (35), miši (36), konja (37) in kokoši (38). Izkljucno na to frakcijo so vezane številne biološko važne substance, kot naprimer hladni aglu-tinini, antitelesa proti 0 Salmonella antigenu in reumatoidni faktor. Druge spet, kot naprimer izohematoaglutinini, anti-tiroglobulinska antitelesa in antitelesa v Wassermanski reak-ciji, nastopajo v 7S in 19S frakciji gama globulina.(39?40). Vse kaze na to, da predstavljajo makroglobulini v zgodnjih fazah imunizacije edini tip antiteles (glej prih. poglavje). Dokazana je najožja imunoloska sorodnost med normalnimi makro-globulini in paraproteini v takoimenovani Valdenstromovi makro-globulinemiji(4l), kar je razvidno iz številnih studij (39), ceprav kazejo drugi nekoliko vecjo homogenost in so se v lite-raturi celo pojavile trditve, da jim manjkajo določene antigene determinante, ki so sicer tipicne za norraalne makroglobuline(42).
Iz podatkov, dobljenih pri študiju najrazlicnejših preparacij makroglobulina (predvsem patoloških), je mogoce sklepati, da ima ta zelo veliko obmocje elektroforetske gibljivosbi, saj se pojavlja vcasih (običajno) v predelu gama globulina, najdeipo pa ga celo v predelu beta in alfa globulinov ali celo bliže
katodi. Elektroforetska gibljivost je bila tocno dolocena edino
-5  2 -1  -1 pri reumatskem faktorju(43), kjer znasa 1,1-1,5 x 10 cm "V sek
Izoelektrična tocka makroglobulinov je bila ocenjena na 5,1 -7,7 (44) in njegova sedimentacijska konstanta SpQw na 19S. Vendar najdemo v vseh preparacijah normalnih in pato-loskih makroglobulinov tudi komponente z višjimi sedimentacij-
skimi konstantami, ki kažejo imunolosko specificnost makroglobulinov (59» lastna izkustva).  Pri cloveku natancnih podatkov o molekularni masi makroglobulinov nimamo, vendar se ta nasplošno ocenjuje na 1,000.000, medtem ko je bila dolocena pri prešicu na 870.000 (45) in pri patoloških makroglobulinih na 745 + 20.000 (46).Podatki hidrodinamicnih metod (viskoznost, sedimentacija) ter elektronske mikrosko-pije kazejo na to, da je molekula gama makroglobulina sfe-ricne oblike z diametrom 120 - 250 A (46, 47), ki je kljub visoki hidrataciji makroglobulinske molekule enako velik, ce je merjen z elektronsko mikroskopijo ali v raztopini. i^akroglobulini so zelo bogati z ogljikovimi hidrati (10^), katerih vsebujejo mnogo vec kot 7S ali mielomski globulini. Ta vrednost je zelo stalna pri razlicnih normalnih ali patoloških makroglobulinih in se zelo približuje vrednostim, ki veljajo za alfa makroglobuline (59).
Stevilni avtorji so predpostavljali, da gre v primeru gama makroglobulinov za visje polimere, sestavljene iz pet do sest 7S enot in ne za samostojno vrsto antiteles. To domnevo so se posebno potrjala opazanja, da kažejo 7S in 19S gama globulini doloceno sorodnost v imuno-precipitacijskem testu ("cross reaction"). Vsi poskusi, da bi poliraer razbili v kislem ali alkalnem mediju ali v visokih koncentracijah sec-nine, so estali brez uspeha. Deutsch in Morton (48) ter dru-gim (49) je uspelo z merkaptoetanolom in drugimi sulfhidrili reducirati disulfidne mostove v makroglobulinski molekuli in to razbiti v monomerne enote s sedimentacijskimi kon-stantami 7S. Fri številnih makroglobulinih (antitelesih, reumatoidnem faktorju, krioglobulinih) je taki redukciji sle-dila popolna izguba antitelesne aktivnosti oz. aktivnosti reumatoidnega faktorja in krioprecipitacije. Ponovno zdru-
9
10
zerge tako dobljenih podenot lahko preprecimo, ce nastale sulfhidrilne skupine blokiramo z acetamidom. Ce pa z dializo previdno odstranimo merkaptoetanol, podenote spet reasoci-irajo v intaktne makroglobulinske molekule, ki se po fizi-kalno-kemijskih kriterijih ne razlikujejo od maticnih mole-kul in ki regenerirajo 25-75^ svoje antitelesne aktivnosti (48).50). ^e na reduktiven nacin obdelujemo antitelesa dveh specificnosti in jih po redukciji rekombiniramo? dobimo (imesana antitelesa" (51). To potrjuje, da je biološka aktiv-nost, izrazena v terciarni strukturi posameznih raolekul, v bistvu pogojena s primarno strukturo? ki je predetermi-nirana v casu sinžeze (52).
Geprav imajo monomeri makroglobulinskih molekul nekaj skupnih determinant s 73 gama globulinom, kažejo obenem dovolj izrazeno specificnost, da je vsak dvom v individu-alnost makroglobulinskih antiteles neupravicen.
11
STRUKTURA ANTITELES
Potreba po poznavanju bioloških funkcij posameznih antiteles in razumevanju genetskih mehanizmov, ki urejajo njihovo sin-tezo, je v zadnjih letih privedla do obsežnih studij nji -hove strukture. Podroben kronološki potek posameznih raz -iskav in njihovih rezultatov je razviden iz odlicnih revij-skih clankov Cohena in Porterja (25), ^ranklina (53) , Nisonoff + Thorbeckejeve (54) in drugih.
Na eni strani so avtorji poskušali s specificnimi proteo -litskimi encimi na točno definiranih mestih razbiti molekule antiteles (pretezno 7S gama globulina) v podrejene enote, ki bi ohranile bioloske lastnosti nativnih molekul(55, 56) Na drugi strani pa so z reduktivnim cepljenjem S-S vezi v molekuli gama globulina prišli do peptidnih verig, ki so posebno prikladne za imunokemijske študije (57,58, 59, 60 ). Eksperiments.ini podatki, dobljeni s kombinacijo obeh po-stopkov, so dali bazo za diagram, s katerim je Porter (6l) leta 1962 ponazoril strukturo gama globulina;
Alo S.r
AiP
Alo S«r Atp
5 cytt|n« I
s
s
I
5 tyitln«
 cyitin«
 cyttln«
in
 cyttln*
•Struktura zajcjega gama globulina (Forter, 196?)
S-S = bisulfidne vezi med posameznimi peptidi (A in B cleni)
...... = mesto hidrolitskega cepljenja s papainom
12
Proizvajalcem terapevtskih hiperimunih serumov je ze dalj casa poznano, da je mozno gama globulin hidrolitsko cepiti v manjše dele z molekularno maso okrog 100.000, ne da bi pri tem padla sposobnost precipitacije antigena (62). Porter (55) je pokazal, da je mogoče s kristalinicnim papainom, akti-viranim s cisteinom, razcepiti zajčji gama globulin v tri fragmente, ki jih lahko kromatografsko locimo.Fri tem raz-cepimo v molekuli peptidne in S-S vezi (63).Najvecji fragment ( III ) ima molekularno maso 80.000, z lahkoto kristalizira in nima antitelesne aktivnosti. Videti je, da so no. njega vezane determinante, ki odlocajo o prehodu skozi fetalne mem-brane, fiksaciji na kožo, aktivaciji komplementa in kombina-ciji z reumatoidnim faktorjem. Dela I in II sta simetrična, imata molekularno maso 50.000, ne precipitirata antigena, vendar pa inhibirata reakcijo intaktnih antiteles z antige-nom. Opisana sta kot "monovalentna" antitelesa, od katerih vsak obsega samo eno "combining site". Pepticno cepljenje zajcjega gama globulina uniči fragment III, ohrani pa del z molekularno maso 100.000, ki še vedno reagira z antigenom. Redukcija ene same disulfidne vezi da dva peptida z moleku-larno maso 50.000, ki sta zelo podobna papainskima fragmen-toma I in 11.(64). Reakcija je delno reverzibilna, tako da lahko z rekombinacijo peptidov d_")bimo fragment z molekularno maso 100.000, ki ima dvoje razlicnih combining sites. Papainsko cepljerge humanih gama globulinov je dalo podobne fragmente. Vecjemu delu, je analogen fragment S (slovr), ki se pocasneje giblje v elektroforezi na skrobu in zavzema dve tretini molekule. Preostala tretina je fragment F (fast)(65) Fragment S lahko razbijemo v dva simetricna dela A in C (analoga I in II pri Porterju), od katerih ima vsak po eno combinig site. ^ragment T? (ali B) nima antitelesne aktiv -nosti (66).
Po"-podatkih, ki jih je dalo encimatsko cepljenje gama globu-linske molekule, je postalo aktualno vprasanje, iz koliko peptidov je vsaka molekula pravzaprav sestavljena. Dolocanja N- terminalnih aminokislin z raznimi metodami (16,67) pri raznih species niso dala enotnih rezultatov, ceprav kažejo gama globulini raznih vrst nasplosno izredno podobnost. Edelmanu (57-)oiii;Edelmanu + Fouliku (68) je ust elo z red.uk-cijo gama globulina z merkaptoetanolom v visokih koncentra-cijah secnine dokazati, da ta sestoji iz vec peptidnih verig, ki so povezane medseboj z disulfidnimi mostovi, ki pri re-dukciji razpadejo. Ce je nastale produkte analiziral v elektro forezi v škrobnem gelu (v PM secnini, pH 3?5), je bilo mogo-ce razlikovati dve komponenti z razlicno gibljivostjo : H (heavy chain) in L (light chain), kateri je bilo mogoce preparativno lociti s kromatografijo na GM celulozi v razto-pini secnine. Izplen takih separacij je bil reven, prav tako so bile dobljene frakcije brez kakrsnekoli biološke aktiv-nosti in so bile topne le v visokih koncentracijah secnine. Cecil in Wake (69) sta prav takrat pokazala, da je s sulfiti mogoce reducirati interpeptidne disulfidne grupe, ne pa intra-peptidnih, in to v vodnih raztopinah, kar je napotilo Forterja in sodelavce (58), da so postopek redukcije z merkaptoetano-lom modificirali in ga izvedli v vodni raztopini, pri pH 8,P, pri cemer so reducirali pet disulfidnih skupin (glej diagram). Nastale sulfhidrilne skupine so blokirali z acetamidom, da bi preprečili reagregacijo, in nato po dializi proti N ocetni ali propionski kislini s pomočjo filtracije na gelu G~75 ločili dve koraponenti, imenovani clen A in clen B. Frakciji sta identični z Edelmanovim H in L clenom, co ju analiziramo v škrobni elektroforezi, z razliko, da ohranita precej bio-loskih sposobnosti in da je njihov izplen kvantitativen (74 % A in 26 % B ). Fiolekularna masa znasa za clen A
13
14
52.000 in clen B 20.000 (70), kar daje povod za zakljucek, da je vsaka molekula gama globulina sestavljena iz dveh pep-tidnih parov (en par tipa A in en par tipa B). To potrjujejo aminokislinske analize posameznih clenov in njihove primerja-ve z analizami  intaktnih molekul.(71).Vsi ogljikovi hidrati
so vezanl na clen A . Redukcija papainskih f ra( inentov I in II je dala dve komponenti, od katerih je ena po vseh analiziranih kriterijih identicna s clenom B, kar nakazuje roožnost, da je mesto hidrolitskega posega, ki ga izvrši papain, pravilno oznaceno (glej shemo).
 v okviru normalnih in patoloskih gama ^lobulinov je
raziskal Cohen (12). Pri redukciji (58) vseh treh tipov anti-teles ali odgovarjajočih paraproteinov, je dobil peptide A in B, ki so pri vseh nastopali v istera razmerju (75$ + ?5%). V elek-troforezi v škrobnem gelu (8M secnina v raravljicni kislini) je primerjal redukcijske produkte posameznih frakcij in pri-sel do zanimivih zakljuckov : cleni B vseh normalnih in pato-loskih antiteles se gibljejo z isto elektroforetsko hitrostjo, vendar pa.kažejo pri patoloških frakcijah izrazito vecjo
homogenost kot pri normalnih (ozka, definirana proga v pri-meri s širokim difuznim pasom pri normalnih frakcijah). Teptidne ve^ige A se pri posameznih tipih gibljejo z raz-licno hitrostjo, vendar je ta. ista za clen A pri normalnih in pa;oloških frakcijah v okviru istega tipa. Nadalje je ugotovil, da si cleni B delijo skupne antigcne de terminante (identicnost v imuno-difuzijskem testu) pri vseh normalnih in patoloških frakcijah. Feptidi A kazejo strogo specificnost, tako pri normalnih kot pri patoloških frakcijah vseh tipov. Zato je videti vec kot verjetno, da imajo posamezna antite-lesa ide^nticne (ali vsaj zelo podobne) clene B in da se raz-likujejo le po peptidnih vzorcih svojih clenov A. To domnevo mocno podpirajo ugotovitve avtorjev, ki so nasli, da se an-
15
tigena karakteristika (genetski faktor) Gm nahaja le pri 7S gama globulinu, medtem ko se druga, takozvani faktor Inv, pojavlja pri vseh treh tipih (73, 74). V zadnjem casu (75) so ugotovili, da se prva nahaja na clenu A, druga pa na B clenu gama globulinske molekule. \recnicno najbolj otipliva razlika med posameznimi cleni je razlika v kolicini njihovih oglji-
kovih hidratov, ki se tudi nahaja na členu A. Grupno speci-ficne determinante I in II, ki so skupne vsem gama globulinom, se nahajajo na clenu B.
Ker leži sposobnost za kombiniranje v papainskem fragmentu I + II , je bilo treba razcistiti, kateremu od obeh peptidov ta lastnost pripada in ali ne nastane šele po njuni kombi -naciji. Pri konju je bilo mogoce najti 70-80 $ sposobnosti za kombinacijo z antigenom v fragmentu A, kar utegne veljat^ za antitelesa vseh species. Nic se ni znanega o kemicni struk-turi posameznih aktivnih mest v molekuli. Zanimiva je bila ugotjvitev, da so antitelesa morskega presicka z razlicno spe-cificnostjo pokazala razlicne elektroforetske vzorce svojih B clenov (76), kar utegne navajati k zakljucku?da utegnejo budi B cleni prispevati k oblikovanju specifičnih, za kom-binacijo z antigenom dolocenih mest v molekuli antitelesa.
Z veliko verjetnostjo predpostavljaroo, da se clena A in B neodvisno sintetizirata, saj je naa eni strani studij genetsko kontroliranih lastnosti pokazal, da se te nahajajo loceno na posameznih clenih ; na drugi strani pa se v dolocenih patoloskih stanjih  (naprimer mielomatozah) clenu B soroden (identicen) peptid sintetizira v prebitku in izloca v urinu (Bence Jones protein). Cohen (77) je pokazal, da se v urinu normalnega odraslega izloci dnevno 5-10 mg beljakovin, ki nosijo determinante clena B. Na drugi strani pa je Edelman
16
ugotovil, da kazejo Bence Jones proteini ter cleni B,
pripravljeni iz normalnih ali mielomskih globulinov, isto
posebnost v termosolubilitetnem testu (78).
Na drugi strani pa je Franklin (79) odkril pacienta, pri
katerem gre za prebitek v sintezi clena A, ker je bilo
mogoce v serumu in urinu dolociti 3,5 S kornponente, ki so
kazale iste antigene determinante kot clen A.
V raznih laboratorijih so v teku zanimive raziskave o
sintezi antiteles,oziroma omenjenih peptidnih enot ,
na podlagi tkivnih kultur, pripravljenih iz razlicnih
organov imuniziranih zivali.(80).
17
BIOLOSKO VAZNE KARAKTERISTIKE NORMALNIH GAMA MAKROGLOBULIiNOV
Poznano je, da predstavljajo gama makroglobulini takoimeno-vani "zgodnji tip" antiteles v imunološki obrambni reakciji živali in cloveka, saj se kot prva pojavi  v odgovoru na antigeni dražljaj (53 in podrobneje 81-85 ) v primarnem imunoloskem odgovoru (primary response). Kasneje ugasne rgi-hova sinteza in nadomeste jih postopoma antitelesa tipa 7S, s cimer se imunoloski proces nadaljuje. Le v redkih prime-
rih 39 njihova sinteza dolgotrajnejša. Sistematsko sta ta pojav raziskala Talmage in Taliafero (86, 53), ki sta ugoto-vila, da imajo z< odnja antitelesa makroglobulinskega tipa izredno vi,qQko.hemolitsko aktivnost, ki je doKsti manjša pri kasnejsem 7S tipu. Najbrž je tudi pri cloveku hemolitska aktivnost vezana predvsem na makroglobulinski tip antiteles (87). Zanimivo je,  da kazejo zgodnja antitelesa izredno
visoko specificnost za antigen, to je, da le malo ali pa sploh ne reagirajo v navskriznem imunodifuzijskem poskusu s sorod-
nimi antigeni (62, 87, 88), naprimer plazma albumin dveh species, ki taksonomsko nista zelo oddaljeni. Pac pa imajo
za razliko od nizkomolekularnih antiteles makroglobulinska antitelesa (zg^drij^ antitelesa) manjso avidnost ( 62, 89,90)..-Pojm avidnosti pove, da je vez med antigenom in ustr-eznim antitelesom sibka in da kompleks laze razpade. V nadalnjih fazah imunizacije postanejo antitelesa manj specificna in bolj avidna.
Isto zaporedje v biosintezi obeh tipov antitcles opažamo tudi v ontogenezi(91> 92, 93 ).  Znano je5 da makroglobuli-ni ne prehajajo skozi placentalno bariero (94) in da so anti-telesa novorojencka, izvirajoca iz materinega krvotoka, iz~ kljucno 7S tipa. Po prvih 4-6 mesecih po rojstvu pade nivo gama globulina, nakar se zopet zacne pocasi dvigati ob
18
ociti proliferaciji plazmatskih celic in pri enem letu dose-že nivo normalnega odraslega. Do nedavnega je veljalo mnenje, da dojencek v prvih 4-6 mesecih ni sposoben proizvajati last-nih antiteles, vendar so Smith (91) in drugi (92, 93) doka-zali, da ob ustreznem antigenem stimulusu novorojencek rea-
gira s sintezo makroglobulinskih antiteles. Po dveh do štirih tednih sinteza makroglobulina pade, pri cemer jo nadomesti sinteza gama globulinskih molekul (7S). Silverstein (95) je
pokazal, da je imunoloska obrambna reakcija pri novorojencku kvalitativno in kvantitativno podobna tisti pri odraslem, le
da so kolicine proizvedenih antiteles pod spodnjo mejo dokaz-ljivosti. Pri novorojenckih traja 19S faza dalj casa kot pri odraslem (81) in je v dolocenih primerih podaljšana po obse-vanju z rentgenskimi žarki (96). Možno je, da slntetizirajo vsakega od obeh tipov antiteles razlicni celicni kloni, ali pa, da ista celica proizvaja oboje antiteles, pri čeraer je bila zaradi omenjencga posega njena diferenciacija1 zavrta ali pre-kinjena ( 54). Najnovejsa . porocila omenjajo, da je bilo rao-goce z zelo nizkimi dozami virusnih antigenov obdrzati sin-tezo antiteles v primarnem imunološkem responsu na stopnji
makroglobulinske sinteze brez formacije 7S antiteles, vsled cesar je izostal sekundarni (booster) response. Te studije ka-zejo, da je bila sinteza antiteles diskontinuirana zaradi po-manjkanja antigena in da je bilo  mogoce    po tem spet iz~ zvati normalen imunološki odgovor organizma preko zacetne sinteze makroglobulinskih antiteles (54, 97). V teh pojavih lezi nemara razlaga za takoimenovani "low dose paralysis cffect", ki ga opisuje Dresser (98). Zelo verjetno je, da obsega že primarni odgovor na antigen dve fazi : prvo, v kateri odgovori s sintezo makroglobulinskih antiteles, in drugo ( eventualni
booster , dosedaj opisan le v sekundarnem odgovoru na antigen)
19
v kateri ze proizvaja 7S antitelesa, ce je kolicina antigena zadošcala za ponovno stimulaci.jo^senzibiliziranih'1 celic (54),
°inteza 19S makroglobulina zacne kmalu po rojstvu in doseže normalne vrednosti odraslega pri 4-6 mesecih. Zanimivo je, da
vstopi sinteza gama 1A globulina mnogo kasneje( po 4-6 mčsecih
življenja) in da otroci šele po 12 letu dosežejo normalne vrednosti odraslega.
Precej podrobno nam je poznana razporeditev 7S gama globulina v organizmu, prav tako tudi njegova metabolična usoda. Malo pa je v obeh ozirih znanega o 19S makroglobulinu, ter prav
nic o gama 1A globulinu. Tezavnost leži predvsem v zahtevi po zelo čistih preparacijah omenjenih frakcij, od katerih vemo, da je predvsem makroglobulin zelo nestabilen tudi v procesu radioaktivnega jodiniranja. Do nedavnega edini po-datek nudita Cohen in Freeman (99), da se   J humani makro-globulin eliminira iz organizma mnogo hitreje kot -normalni
- "j gama globulin. Katabolicni razpolovni cas znasa za makroglobulin 2-3 dni, raedtem ko je ta za 7S gama globulin 21-26 dni. Medtem ko najdemo 50^ 7S gama globulina v ekstra-vaskularnem prostoru, je makroglobulin omcjen izkljucno na intravaskularni prostor. Taliafero + Talmage (100) sta se izognila nevarnosti denaturacije zaradi rB.dio-aktivnega marki-ranja s tem, da sta merila padec antitelesne aktivnosti pasinno prenesenih antiteles iz imuniziranih zajcev v ne-imunizirane (antitelesa proti ovcjim eritrocitom ali toplo-tno denaturirani stromi eritrocitov). Biološki razpolovni cas hemolitske aktivnosti, vezane na visokomolekularna antite-lesa, je znasal 2,81 +0,12 dni; v nasprotju z nehemolitsko aktivnostjo manjsih molekul, kjer je bil ta daljsi in je bil ocenjen na 5,55 + 0,12 dni. Od prvih je zapustilo cir-
20
kulacijo 17$, od drugih 60$. Mnogo visji razpolovni cas so dolocili pri makroglobulinih, pripravljenih iz seruraa makro-globulinemicnih bolnikov (101, 102), kjer so ugotovili, da znasa razpolovni cas 6,5-13 dni. Izdatne podatke nudi sele pred kratkim dostopna revija 7aheya in sodelavcev (103), ki analizira metabolizem normalnih in patoloških makroglobulinov
v zdravem in bolnem organizmu. Katabolicni razpolovni cas normalnih makroglobulinov znaša 5 dni, za razliko od 23 dni pri normalnih 7S gama globulinih. Po njegovih meritvah in iz-racunih se dnevno katabolizira 14> celokupnega makroglobulina (in le 3$ 7S gama globuliha). Koncentraciji obeh frakcij v serumu (0,1 g/100 ml za 19S in 1,29 g /100 ml za 7S gama globulin ) ne dajeta torej objektivne predstavo o kolicini njune sinteze. Tako predstavlja 19S makroglobulin le 5-10^ koncentracije 7S gama globulina, njegova dnevno sintetizirana kolicina pa znaša 15 -20^ dnevno sintetizirane kolicine 7S gama globulina. Le 18% celokupnega makroglobulina se nahaja v ekstravaskularnem prostoru, medtem ko ta vrednost doseže višino 60% pri 7S gama globulinu. Verjetno lezi tudi v tem dejstvu ena mnogih bioloških razlik med obema tipoma anti-teles, katere fiziološki pomen še ni znan: medtem ko humani 7S gama globulin senzibilizira kožo morskih presičkov za pasivno kutano anafilaksijo (se "fiksira"na eno od komponent kože, verjetno na žilni endotelij), 19S gama globulin te last-nosti nima ( niti gama 1A globulin). Ali naj to pomeni, da sta zivljenjski prostor in dclovišče makroglobulina omejena na intravaskularni prostor in ta ni zapleten v tkivne imunoloske reakcije?  Z ozirom na to, da so makroglobulinska antitelesa prva, ki se sintetizirajo v odgovor na antigeni drazljaj, je morda smotrno, da se zaidrzijjejo prejdjvsemv ozilju in skrbe za cim hitrejšo in cimuspesnejso eliminacijo antigena. Ko jim kasneje zaradi nepojasnenih mehanizmov slede antitelesa
21
z manjsimi molekulami, rgihova vloga zbledi in je morda celo ugodno, da se cimprej razgradijo (103). Na njihovo imunolosko "ucinkovitost!i lahko nemara sklepamo na podlagi podatkov o |    njihovi vale.nci, ki je dosti vecja kot pri 7S gama globuli-
nih (kjer je 2) in znasa lahko cr.lo do 12. V primeru reumatske-ga faktorja, katerega nasplošno opisujejo kot ?;anti-7S gama-antitelo", so ugotovili, da lahko vsaka molekula makroglobulina kombinira s pet do sest molekulami 73 gama globulina.
Reumatski faktor je poleg hladnih aglutiainov edino z goto-vostjo identificirano auto- antitelo makroglobulinskega tipa (105). V serumu bolnikov z reumatoidnim artritisom so dokazali imune komplekse s sedimentacijsko konstanto 22S, iz katerih so
lahko eluirali reumat)idni faktor, ki je kazal vse karakteristi-
ke in specificnost 19S makroglobulina in je tudi in vitro rea-giral z autolognim 7S gama globulinom.
Velike bioloske vaznosti je ze prej omenjeno dejstvo, da gaina makroglobulini ne prehajajo skozi fetalne membrane (kot tudi ne gama 1A globulini), saj v nasprotju od 7S gama globulinov ne ogrožajo fetusa v primerih ABO in Rh inkompatibilnosti ter eventualno drugih neskladnosti  z materjo.
22
BIGSIN-T&ZA • OTTETEIES^.
Prve in na.jvaznejse podatke o celularnem izvoru gama globulinov so dala razna klinicna opazanja, iz katerih je "bilo mogoce za-kljuciti, da je njihova sinteza vezana na celice limfocitarne in plazmocitarne vrste. V primerih kongenitalnih agamaglobuli-nemij se to izraza skoraj v popolnem izostanku plazmocitov in dc-lno limfocitov (106), kot pri novorojenckih (91) in eksperi-mentalnih zivalih, vzgajanih v asepticnem okolju (107). Na drugi strani pa je neoplasticna proliferacija plazmocitov in delno limfocitov pri raznih mielomatozah in Waldenstrbmovi makroglobulinemiji, kot tudi pri transplantaciji eksperimen-talnih tumorjev, povezana z nastankov velikanskih kolicin para-proteinov, ki se navidez ne locijo od normalnih gama globuli-nov.Kljub temu, da so pri novorojenckih dokazani aktivni obrambni mehanizmi proti H-antigenu Salmonelle typhi (91) v obliki sinteze makroglobulinskih antiteles, pri tem ni mogoce zaslediti formiranja plazmocitov, katerih proliferacija nastopi kasneje, med 4-6 mesecem zivljenja, ko istovrstna antigena stimulacija rezultira v tvorbi obojevrstnih antiteles (19S in nato 7S ).
Fluorescencne študije so pokazale, da lahko v plazmocitih naj-demo antitelesa vseh treh tipov (109), da pa se 19S gama glo-bulin lahko sintetizira tudi v odsotnosti tipicnih plazmoci-tov, verjetno v velikih limfoblastih, za katre je poznano,*a predstavljajo predhodnike plazmocitov, eventualno pa tudi limfocitov. Antitelesa sj dokazali tudi v malih limfocitih. Iz nepreglednega števila najrazlicnejsih podatkov je zaenkrat nemogoce razbrati vlogo posameznih vmesnih stopenj v razvoju plazmocitov in limfocitov in oceniti pomen celicne diferencia-cije z ozirom na ociti dvofazni potek imunoloskega odgovora. Vse kaže na to, da je sinteza antiteles povczana s celicnim
razmnozevanjem (111), kot tudi z replikacijo subcelularnih enot (112), na kar kaze tudi logaritmicni porast kolicine antiteles kot funkcija. stevila senzibiliziranih celic, kot tudi inhibitorni efekt, ki ga na sintezo antiteles izvaja sevanje rentgenskih žarkov ±n DNA anta^onisti (113), ter seveda laten-tna faza v imunološkem odgovjru, ki traja od administracije antigena do pojave prvih antiteles. v cirkulauiji. S studijemjraznih fenomenov, kot so v prvi vrsti imunoloska toleranca, bo v bodocnosti morda uspelo razcistiti nestc-ta vprašanja, ki  so danes se odprta in nakatere ne vemo odgovora. Kakšna je vloga primarnih lirafoidnih organov (timusa) v formi-ranju imunološke kompetence, vezane na sekundarne limfoidne organe (vranica in limfne zleze). K-akšni mehanizmi dirigirajo potek celicnih diferenciacij in ali so razlike med zgodnjimi in poznejšimi fazami imunološkega odgovora lc kvantitativne, ali pa tudi kvalitativne.Ali sta v sintezo zgodnjih in poznejših antiteles vmesana dva različna celicna tipa, oz.alt lahko ista celica, oziroma njeni neposredni potomci, proizvaja v zacetku 19S, in kasneje 7S antitelesa (Nossal, 114).
Brez dvoma je kontakt z antigenom bistveni (ce ne edini) faktor pri sintezi antiteles (115). Znano je, da organizem ne pokaze kompenzatoricne sintez^ antiteles" y primerihi ko 3© fijihov -katabolizem iz razlicnih vzrokov pospešen (gastroenteropatije, nef-roze) (103), čeprav je sinteza večkrat iz nepojasnenih vzrokov mocno zvišana (mielomatoze, Waldenstromova makroglo-bulinemija).Zvišano sintezo gama globulinov opazimo tudi v primerih kronicnih infekcij, naprimer pri malariji (116). Kaksni vzroki privedejo do podobnega zvišanja gama globulin-ske sinteze pri jetrni cirozi, se ni pojasneno.
23
24
KATABOLIZEM ANTITELES
iViasplosno velja mnenje? da poteka katabolizem imunih kompleksov (kompleksov antigen-antitelo) v retikuloendotelialnem sistemu ¦ (117), prav tako tudi katabolizem različno denaturiranih anti-teles. Pojavile so se domneve, da se odvija katabolizem nativ-nih antiteles v celicah, ki ga proizvajajo, to je v plazmoci-tih (118). Vendar so perfuzijski eksperimenti z antitelesi, ki so sla predhodno skozi bioloski "skreening", pokazali, da se naprimer v jetri, v kateri se antitelesa definitivno ne sin-tetizirajo, razgradi okrog 30% nativnega 7S gama globulina(ll9). Zelo verjetno je, da se nativna antitelesa katabolizirajo v celicah jetrnega parenhima in ne v Kupferjevih cclicah.Ekspe-rimenti z blokiranjem retikuloendotelialnega sistema so poka-zali, da je padel katabolicni iznos toplotno denaturiranih, ne pa nativnih antiteles (120).
Iz podatkov v literaturi je mogoče sklepati, da predstavljajo Kupferjeve celice selektivni sistem za fagocitozo vecjih kolo-idov. Raziskovanja na tem podrocju so se odprla z uporabo kolo-idnega zlata Au-198 (121), koloidnega fosforja P-32 (122) in predvsem po tem, ko je -^enaceraf (123) za slicno eksperimente uporabil molekularne agregate, dobljene s termicno obdelavo humanega albumina. Vse te omenjene metode so služile predvsem študiju hepatalne cirkulacije v diagnostične namene (124). Vendar se mi je v teku sodelovanja na teh problemih vsililo vprašanje, kako se vendar katabolizirajo makroglobulinska anti-telesa, ki odlocno padajo v red velikosti, ki je videti mero-daven za fagocitozo v Kupferjevih celicah. Te namrec fagociti-rajo delce v velikosti od 0,005 - 1,0 mikrona (125)(126), ne pa manjsih, medtem ko sc vecji agregati embolizirajo ze v pljucnih kapilarah.
** na jetra odpade le 10$ celokupnega katabolicnega iznosa pri nativnem albuminu (119).
25
Z elektronsko mikroskopijo in drugimi meritvami je bilo ugotovljeno (46,47), da so molekule makroglobulinskih anti-teles sfericne oblike in da znasa njihov premer 120-250 A (12-25 milimikronov) ali celo 300 A (30 milimikronov) (127). 0 veliki hitrosti njihove eliminacije v primeru z eliminacijo (katabolizmom) 7S gama globulina sem podrobno porocala ze v poglavju Bioloske karakteristike antiteles. Da je ta lahko v precejsnji meri odvisna od velikosti .-njegovrh molekul, je mogoce sklepati iz precej odgovarjajocih podatkov o elimina-ciji albuminskih mikroagregatov, katerih molekularni premer pada v isti red velikosti (124), lastnih eksperimentalnih podatkov o eliminaciji alfa makroglobulinov (19S),in se hitrej-se eliminacije hemocianina iz organizma poskusne živali(128)
Nadvse vzpodbudni so zaključki Bartha i.dr. (103), ki s podrobno analizo primerjajo katabolizem normalnega 7S in 19S gama globulina v zdravem organizmi in v raznih disproteine-micnih stanjih. Poleg že poznanega dejstva, da se makroglobu-lin hitreje elimini a iz organizma kot 7S gama globulin ±n da se v manjši meri sintetizira, so ugotovili, da njegov kata-bolicni iznos ni odvisen od njegove koncentracije v serumu oziroma njegovega intravaskularnega pula. Frezivetje makroglo-bulina ^njegov katabolicni "razpolovni cas" je bil v bistvu isti pri normalnih kontrolnih primerih, kot pri bolnikih z izrazito znizanim nivojem gama makroglobulina v serumu (agama-globulinemije)? ali pa pri mocno izrazenih mrkroglobuline-mijah. Frav tako neodvisno od serumske koncentracije se v katabolizmu obnašata fibrinogen (129) in ceruloplazmin (130), medtem ko je bilo mogoce ugotoviti direkten odnos med serum-sko koncentraci.30 in frakcijskim katabolicnim iznosom pri 7S gama globulinu {131, 132) in morda pri albuminu (133). Za razliko od makroglobulina, je katabolicni iznos pri 7S
26
zvisan pri vecini hiperproteinemij zaradi kronicnih infek-cij ali hiperimunizacije in pri multiplem mielomu s 7S gama pa-raproteinora, ter normalen ali celo znizan pri bolnikih z aga-maglobulinemijo ali makroglobulinemijo, kjer je bila količina 7S gama globulina znizana (103). Vsa ta opažanja lahko zdru-žimo v logicen zakljucek, da odlocata o katabolizmu 7S in 19S gama globulinov dva razlicna mehanizma.
S studijem katabolizma homolognih in heterolognih 7S gama glo-bulinov v veliki poskusni seriji (145) so ugotovili, da je molekularna struktura, ki odloca o hitrosti in nacinu eli-
minacije, locirana na papainskem fragmentu III. Fri vseh spe-
131 cies je bila hitrost eliminacije    J papainske frakcije III
korelirana s hitrostjo eliminacije odgovarjajocih nativnih (intaktnih) molekul 7S gama globulina, medtem ko sta papainska fragmenta I+II ter pepsinski fragment (ki odgovarja fragmento-ma I+II) bili rapidno katabolizirani. Aktivnost, prvotno veza-na na papainski fragment III, se je pojavljala v urinu v glavnem kot neproteinska radiaaktivnost, medtem ko sta bila fragmenta I+II  (in tudi pepsinski fragment) v veliki meri iz-ločena v obliki proteinsko vezane radioaktivnosti.Naj povdarim, da je vsled teh dognanj mocno omajana profilakticna vrednost na siroko uporabljanih konjskih antidiftericnih in antitetani-cnih serumov, ki jih proizvajalci (zaradi nevarnosti vsled njihove antigenicnosti) obicajno obdelujejo s papainsko hidro-lizo (v kateri razgradijo fragment m ;.  Preostali fragment I+II, ki ima sicer antitelesno aktivnost,se pretirano hitro izloci.
Mozno je, da se papainski fragment III reabsorbira v led-vičnih tubulih (146). Brez dvoraa so na ta fragment vezane ntransmisijskeMMdcterminante, potrebne za prehod skozi tkiva
27
(vezava na kozo, prehod skozi placentalno bariero, eventualno skozi stene kapilar ), ki varirajo od vrste do vrste (147,148).
Papainski fragm^nt III je peptidna. veriga, ki predstavlja del peptidnega clena A (glej shemo strukture gama globulina).
Y
Ce je na eni strani ugotovljena korelacija med hitrostjo, s katero se eliminira intaktna molekula 7S gama globulina, ter eliminacijo ustreznega fragmenta III (pri raznih vrstah), lahko verjetno išcemo vzrok za razlike v katabolizmu humanih 7S in 19S antiteles prav v razlicni kemicni sostavi in antigeni strukturi njunih peptidov A.
Malo prej omenjeno dejstvo , da se papainska fragnenta I+II izlocata v urinu v svoji proteinski obliki , sovpada s po-datki, opisanimi na strani 15. ^e namrec drži predposta,vka, da se peptida A in B sintetizirata ločeno (v istih ali raz-licnih celicah) in sta šele kasneje sestavljena v kompletno antitelesno molekulo, ni cudno, da organizem proizvede tudi v normalnem stanju prebitek clena B (ki ga najdemo v normal-nih urinih), saj ta sestavlja del rapidno eliminiranega papa-inskega fragmenta I ali II in se le kratek čas zadržuje v cirkulaciji ( potrjeno s Cohenovimi neobjavljenimi poskusi). V mielomatozah je ta sinteza izrazito asinhronicna in vodi do sinteze pretiranih količin B clena (ali Bence Jones proteina)
28
Pregled znanih preparativnih tehnik_ za_iz_o 1 acij.o__gama
mak: ro globulina.
Prvi poskusi izolacije gama makroglobulina slonijo na dejstvu, da sodijo makroglobulini med serumske proteine z najvisjo molekularno maso. Centrifugiranje v visokem gravitacijskem polju , eventualno z dodatkom NaCl ali saharoze za zvisanje gostote, nam omfcgoci  , da iz seruma izločimo frakcijo, ki je znatno obogatena z makroglobu-lini.(39) Nazalost pa ta sestoji iz mesanice alfa in gama makroglobulinov. Njihovo locbo je mogoce izr-esti b prepa-rativnca elektroforezo v primernih transportnih medijih, kot so celuloza(l35)., inizkbtočiekTilarhi^deket^anski gel (136) ali polivinilklorid (45, 137). Objavljene so metode, kjer je bilo s kombinacijo preparativnega ultracentrifugiranja in
kolonske elektroforeze (oziroma frakcioniranja z alkoholom) dobiti precej ciste preparate makroglobulina (138,139).
Vendar so avtorji obicajno uporabljali serume z visokimi koncentracijami patološkega makroglobulina, ki ga je bilo vcasih vsled njegove slabe topnosti mozno oboriti iz seruma ze z razredcevanjem z destilirano vodo (5) ali 0,005 M fosfat nemu puferju (140). Dosti teže je izolirati iz seruma nor-malne makroglobuline, ki nastopajo le v koncentraciji okrog 1% celokupnih beljakovin.
fjove možnosti za izolacijo makroglobulina je odprla kroma-
tografija na anionskem izmenjevalcu, DEAE celulozi (18,1?,
141, 142, 72).
Pri visokem pH in nizki jonski jakosti puferja veze ta iz-
menjevalec skoro vse serumske beljakovine, ki jih lahko nato stopnjevito ali pa v koncentracijskem in pH gradientu
29
eluiramo in pri tem dobimo distribucijski diagram, ki je v bistvu narobe obrnjena slika distribucije posameznih frakcij v elektroforezi. Edina izjema v tej korelaciji je gama makroglobulin. Le zaradi navidezno vecjega elektro-statskega naboja, verjetno pa zaradi nespecificne adsorb-cije vsled velikosti molekul, ga je mogoce zaslediti seie v zadnjih porcijah eluata.
Distribucija 7S gama, 19S gama in gama 1A normal-nega humanega seruma na DEAE celulozi.
Gradient: 0,02 M fosfatni pufer pH 8.0 -
0,3 M fosfatni pufer pH 8,0
Po Faheyu (12), 1962.
Z rekromatografiranjem ustreznega eluata in kombinacijo raznih postopkov je bilo mogoce dobiti relativno ciste preparate gama makroglobulina.
Nove separacijske možnosti je dala uporaba "molekularnih sit" to je., prečno-vezanih dekstranskih gelov tipa Sephadex (Fharmacia Uppsala) (143).
30
Tako je mogoce mesanico proteinov, ki jo dobimo v zadnji fazi zgoraj omenjene kromatografije na DEAE celulozi , uspesno lociti na gelu Sephadex G-200, kjer se v vodilnem (zacetnem)vrhu pojavlja makroglobulin, komponente z manjšo molekularno maso (predvsem albumin) pa sele v naslednjih vrhovih. V tem primeru smo se ze v teku kromatografije znebili alfa makroglobulina, ki bi tudi nastopil v prvem vrhu po separaciji na G-200, pac pa morarao racunati s kon-taminacijo alfa in "beta lipoproteinov in haptoglobinov tipa 2-2. (lastna izkustva, Chaplin H.Jr.- neobjavljeni eksperi-menti,  72).
Bistveno poenostavitev preparativne tehnike pri izolaciji gama makroglobulina pa je nastopila z uporabo naslednjega Pharmacia produkta - kombinacije dekstranskega gela G-50 in anionskega izmenjevalca DEAE, takozvanim Sephadex A-50. Na razpolago mi je bila kmalu nato, ko se je pojavila na tržiscu. Že na prvi pogled so presenetile zacetne porcije eluata s svojo opalescenco, ki je tipicna za gama makro-globulin. Tega smo v perjšnjih eksperimentih z DEAE celu-lozo nasli šele mnogo kasneje, kot ie zgoraj omenjeno. Kmalu je postalo jasno, da gre tokrat za pravilnejsi elu-cijski diagram, v katerem najdemo makroglobuline skupno s proteini, ki imajo priblizno isto izoelektricno tocko.
Da bi  raziskala pogoje, pod katerimi bi bilo mogoce z naj vecjim izplenom eluirati gama makroglobulin, sem izvedla posebno serijo eksperimentov, o katerih porocam v nasled-njem poglavju.
EKSPERIMENTALNI     DEL
31
 Študij eksperimentalnih pofio.jev pri novi preparativni metodi za izolaci.jo gama makroglobulina, obsto.ječi iz kromatografij e na_Se%hadex A~50 in fi11raciji skozi gel Sephadex G- 200.
Material in metode
Zaradi potrebe po cimvecjem izplenu in cimvisji cistosti izoliranega makroglobulina sem izvedla naslednjo serijo eksperimentov v navedfnem vrstnem redu:
1• Friprava eu^lobulina
Pul 1000 ml normalnega humanega seruma sem dva dni dia-
*                                                  o
lizirala v tekoci vodovodni vodi pri +4 C in nato dva dni
v dejonizirani vodi, ki sem jo večkrat menjala, tudi pri +4 C.
Dobljeni precipitat (euglobulin) sem raztopila v 0,15M fosfatnem puferju, pH 7,5, ga razdelila v alikvote in jih posamezno dializirala (ekvilibrirala) s puferji naslednje molamosti: 0,01 , 0,0?5, 0,05 , 0,1 , 0,15 .Z istimi puferji sem ekvilibrirala tudi ena.ko število kolon, na-polnjenih s Sephadexom A-50, z enotnimi dimenzijami 1,5 cm X 30 cm.  pH puferja je bil povsod 7,5.
2• Kromatografi.ja na A -50
Opisane porcije euglobulina sem filtrirala skozi kolone z odgovarjajocim pH, ekvilibrirane z ustreznim pu-ferjem. Pretočna hitrost skozi kolone: 60 ml /uro.Kolone sem kvantitativno izprala z istim puferjem, ki sem ga upo-rabila tudi pri koncentriranju eluata z dializo pod pritiskom.
 "Filtracija skozi gel G-200
Vsakega od opisanih eluatov sem filtrirala skozi kolono,
napolnjeno z gelom Sephadex G-200, ekvilibriranim z na.sled-
njim puferjem:  O,1M THIS + 0,2M NaCl (144). Dimenzije
kolone: 3cm x 140 cm. Pretocna hitrost? 15 ml/uro.
Ekstinkcije E230 so razvidne iz dia^ramov.
Posebej sera filtrirala mešanico humanega krioglobulina,
73 gama globulina in albumina (umeritvena krivulja).
^avedene ciste frakcije mi je podaril ^r.S.Cohen,
Wright-?leming Inst., London.
Eluate prvih vrhov v poskusni seriji, ki so v celoti
odgovarjali krioglobulinskemu vrhu umeritvene krivulje,
sem dializirala pod pritiskom do volumnov okrog 1 ml,
vsakokrat proti puferju, uporabljenem za opisanp filtracijo
Rezultati
1.   Eu^lobulin
Iz 1000 ml normalnega humanega seruma je bilo mogoče
oboriti in po nadaljni dializi obdržati v raztopini
naslednjo kolicijo euglobulina (Biuret):
konc.= 38,6 mg/ml V= 60 ml     Skupno 2316 mg
Za vsakega od eksperimentov v opisani seriji sem upora-
"bila naslednje alikvote;
konc.= 38,6 mg/ml V= 6,0 ml    Alikvot 230 mg kar odgovarja 100 ml izhodnega seruma. Posamezne izplene lahko v bodoce izražamo direktno kot izplen /100 ml normalnega seruma.
32
33
Koncentracijo euglobulina sem ponovno merila po koncani dializi proti puferjem razlicne molarnosti (Tabela). Njegova analiza v papirni in imunoelektroforezi kaze raesa-nico raznih globulinov z elektroforetsko gibljivostjo v predelu gama, beta in alfa globulinov in sledjo albumina.
Papirna elektroforeza naslednjih frakcij (od zgoraj navzdol) Normalni humani serum, euglobulin; nato frakcije, dobljene s kromatografijo na A-50, v naslednjem vrstnem redu: 0,05 M-0,025 M - 0,05L-M - 0,075 M -q,1 M - - 0,15 M.
 Kromatografija na A~50
Posamezni izpleni kromatografije na A-50 so razvidni iz ta"bele
(B), prav tako njihova elektroforetska sestava, ocenjena na
podlagi papirne in iraunoelektroforeze (Sl. 1 in 2).
Razen eluata, ki kaze le dvojno crto 7S gama globulina,
so si vsi naslednji v bistvu podobni po svoji sestavi,
le da kazejo kvantitativno narascanje eluiranih proteinov.
V eluatu 0,15 M je v papirni (verjetno tudi v irauno) elektro-
forezi videti novo frakcijo v predeli alfa-2, ki je pri
nizjih molarnostih ni opaziti.Povsod je dobro vidna crta
gama makroglobulina (verjetno raztopljena v njegovem pre-
bitku v 0,15 M eluatu).
Sl.?
Imunoelektroforetska analiza kromatografskih frakcij po filtraciji skozi Sephadex A-50.
Eluati od zgoraj navzdol: 0,01M - O,O25K - 0,05M - 0,-075M-, !•• O,1M - 0,15M.
34
2.
3» Filtraci.ja na G-200
Sl. 3-9 predstavljajo posamezne elucijske diagrame, dobljene s filtracijo na gelu G-200. Vsi kazejo merl. sabo veliko podobnost, le da se menjajo kvantitativna razmerja med posameznimi komponentami. Prvi vrhovi odgovarjajo makroglobulinskernu vrhu v • umeritveni krivulji. Mjihovi izpleni v posameznih locbah so razvidni iz Tabele (D). Koncentracijo proteinov sem dolocala le na podlagi eks-tinkcije E?oq in 1'iuretske metode. Vsaka od vrednosti v tabeli (D) odgovarja absolutnemu izplenu makroglobulina v 100 ml izhodne plazme.
Frakcije od O,O25M do O,1M sem analizirala v imunoelektro-forezi. Dale so eno samo? za makroglobulin tipicno crto, medtem ko je bila frakcija 0,15 ze oneciscena s kompo-nentami v predelu beta in alfa globulinov.
Molarnost	A	B	C	D
puferja	Euglcb- v	Izplen	Komponente	Izplen
A-50 krom	raztopini	A- 50	(p.elf.)	G -200
	mg	rag		mg
0,01 M	178,6	23,0	gama-	
0,025 M	188,0	32,4	gama+beta	3,8
0,05 M	226,0	50,7	gama+beta	7,3
O,O75M	232,0	46,0	gama+beta	5,9
0,1 M	216,0	53,0	gama+beta	6,0
0,15M	213,0	105,0	gama+beta+alfa^	5,9
Tabelaricen prikaz posameznih izplenov v teku ekvilibriranja euglobulina proti puferjem razne molarnosti, kromatografije na ^ephadex A-50 in filtracije skozi gel Sephadex G-200.
35
G-200 :j Q,025M
G-200 :   0, 05M
G-200 : O,O75M
G-200 : O,1M
%
37
G-200 : 0,15 M
G-200 : Umeritvena krivulja
Diskusija
Opisana senja eksperimentov me je utdila v prepricanju, da nudi uporaba novega Sephadex A-50 odlicne prednosti pri izo~ laciji normalnega humanega makroglobulina v primeri z dose-daj uporabljano DEAE celulozo. Uporaba nezveznega koncentra-cijskega gradienta z razponom od 0,01 M do 0,15 M pri kon-stantnem pH 7.5 daje elucijski diagram, ki je narobe obrnjena elektroforetska slika euglobulina, pri Čemer eluiramo garaa makroglobulin skupno z ostalimi gama in beta antitelesi, med katere sodi po svoji izoelektricni točki. Od njih ga je relativno lahko izolirati v filtraciji skozi gel G-200, ce se izognemo navzocnosti alfa makroglobulina (molarnosti nizje od 0,1). Nezadovoljiv je seveda izplen makroglobulina, kar je najbrz pogojeno z relativno visokim pH elucijskih sistemov v kromatografiji, z ozirom na to, da je bila koncentracija soli v primeri s Faheyevo finalno koncentracijo (pri kateri eluira makroglobulin), vendarle nizka, in pa na dejstvo, da markoglo-bulini mocno varirajo v svojih izoelektricnih tockah (44) v pH intervalu med 5,1 -7,7.
Nadaljnji, manj sistematski eksperimenti z variranjem obeh parametrov (pH in koncentracije soli v puferju), so pokazali, da lahko  zvišamo izkoristek, ne da bi trpela čistost makro-globulina, ce kromatografiramo euglobulin pri pH 6.0 v 0,1 M fosfatnem puferju in dobljeno frakcijo filtriramo skozi G-200. To metodo sem uporabila pri pripravi makroglobulina za metabo-licen poskus T-3 v zajcu ter vseh poskusih na človeku, ki so opisani kasneje. Cohen je iste pogoje uporabil za svoje ekspe-rimente in jih po mojem odhodu iz Londona samostojno objavil(7?) Sodim, da predstavlja opisana kombinacija postopkov relativno mil nacin za pripravo makroglobulina, ki ga uporabljamo v motabo-ličnih poskusih.
38
39
2. Priprava normalnega humanega gama makroglobulina za metabolicne poskuse.
A • KTi^TmRAJ IJ A_J A__DE AE__CELULOZI  IN FILTRACIJA
SKOZI^GEL SEPHADEX G- 200. (T-l).
200 ml normalnega gambijskega seruma * s haptoglobinskim tipom 1-1 sem destilirala proti dvajsetkratni količini dejonizirane vode (še prej pa 2 dni proti tekoci vodovodni vodi) v hlajenem prostoru na +4°C. Dobljeni euglobulin (1700 mg ) sem najprej raztopila v 0,1 M fosfatnem puferju, pH 7,0, nato pa z dializo ekvilibrirala z 0,02 M fosfat-nim puferjem, pH 8,0. Le 1500 mg euglobulina je ostalo v raztopini. Nanesla sem ga na predhodno odgovarjajoce ekvi-librirano kolono, napolnjeno z DEAE celulozo (3 cm x 50 cm) in ga eluirala v koncentracijskem in pH gradientu (0,02 M
fosfat, pH 8,0 --- 0,3 M fosfat, pH 5,0 ) preko mesalne
komore z volumnom 500 ml. Pretocna hitrost: 15 ml/uro. Zbirala 10 ml porcije eluata z avtomaticnim frakcijskim kolektorjem (glej diagram na prihodnji strani). Zadnji vrh sem razbila v dve loceni porciji (A in B) ter ju koncentri-rala z uporabo pozitivnega pritiska v dializirni cevi proti 0,1 M fosfatnem puferju, pH 8,0. Papirna elektroforeza obeh frakcij kaze, da se v zacetnem delu krivulje eluira tudi albumin, ki ga v drugem delu ni vec videti, da pa sicer predstavljata obe frakciji dve zelo podobni prote-inski mešanici. Analiza sedimentacijskih konstant v ultra-centrifugi je pokazala naslednjo sestavo (brez korekcije);
*serum afriških Črncev iz Gambije, iz katerega smo na Wright~Fleming Inst. izolirali hiperimuni anti-malaricni
gama globulin.
40
Kromatografija euglobulina, pripravljenega iz normalnega humanega seruma, na DEAE celulozi. Abscisa: kolicina eluata, ordinata: ekstinkcije pri 280um. Papirna elektroforeza frakcije A in B.
41
Mešanica A : 3,5S (albumin) in 15,67S (makroglobulin) Mesanica B : 1,71S, 6,75S (gama globulin) in 15,67 S
Z ozirom na to, da alburain ne moti pri nadaljnji separaciji v molekularnem situ G-200, sem obe porciji združila. Celo-kupna kolicina beljakovin v tej mesanici je znašala 350 mg (Biuret). Filtracija skozi kolono G-?00  (3cm x 100 cm), ki je potekala s pretocno hitrostjo 10-15 ml /uro, je dala tri vrhove, od katerih prvi odgovarja makroglobulinskemu vrhu v umeritveni krivulji in je znasal  65 mg, Uporabljeni pufer: 0,2 M acetatni pufer + 0,2 M NaCl, pH 5,1. Raztopina 10 mg/ml je dala v analitski ultracentrifugi naslednjo distribucijo:
Vidimo tri vrhove s sedimcntacijskimi konstantami 10S, 16S in 28S v procentualnem razmerju 12^, 65^ in (Dr.R.H. Pain, V/right-Fleming Institut, London). Elektro-foretska locba v skrobnem gelu pokaže komponento z giblji-vostjo beta globulinov, medtem ko makroglobulin sploh ne prodre v gel.
42
B•  FILTRACIJA. NA GELU G- 200 IN ELEKTR0?_0REZA_ fi4_.(b_25_ KOT .NOSILNEM MEDIJU. (T-2) .
T-2/2
7 ml svezega seruma (krvna grupa AB) sem cez noc (17 ur)
centrifugirala v 45$ glukozi (40,000 rot./min, T +4°G, MSE Superspeed 40 centrifuga ), da bi odstranila lažje lipoproteine. Spodnjo plast, priblizno 5 ml, sem porabila za nadaljno separacijo. (plasticno centrifugirno cevcico sem na dnu preluknjala in postopoma lovila raztopino, kot je odtekala).
Kolona Sephadex G-200 (3cm x 100 cm) v 0,2M TRISu, pH8,l je imela pretocno hitrost 10 ml/h. S filtracijo spodnje plasti centrifugiranega seruma sem dobila y elucijskem diagramu vodilni vrh, sestavljen iz mešanice alfa in gama raakroglobulinov, ki sem ga koncentrirala z dializo pod
pritiskom. Dobljeno kolicino ( pribl. 4 mg beljakovin) sem
131 markirala z radioaktivnim jodom    J , ki je bil inkorpo-
riran s celokupno aktivnostjo 104 uC (Metoda markiranja -glej v prihodnjem poglavju). Markiran,i frakciji sem do-dala 3 ml normalnega zajcjega seruma in vse skupaj cez noc dializirala proti naslednjemu puferju, ki sem ga uporabila za elektroforezo na koloni :0,lM TRIS, 0,004M EDTA, 0,0015 M borna kislina, pH 8,1 (136). Kot nosilni medij v preparativni elektroforetski locbi je sluzil Sephadex G-25 (coarse). Dimenzije kolone: 6 cm x 60 cm. Start v sredini. Elektroforeza: 600 V, 14 mA, 65 ur. Hlajenje z vodnim plas-cem (+10°C). Elucija z istim puferjem v 10 ml porcijah. Iz diagrama je razvidna distribucija radioaktivnosti vzdolz iolone (vsaka porcija eluata je bila posebej merjena v Ring- counterju), istocasno pa 30 je mogoče primerjati z distribucijo UV- ekstinkcij , ki je razvidna iz slike (zaj.s.)
Elektroforetska locba prvega vrha iz G-200 (mesanice alfa
in gama makroglobulinov) na G-25 kot nosilnem raedi.ju, o-o-o- Radioaktivnost 10 ml porcij eluata 9—o-c- UV ekstinkcije istocasno locenega zajcjega seruma7 ki smo ga dodali pred zacetkom elektroforeze.
4?
44
Radioaktivnost je bila izplenjena s 85^ in razporejena v dva razlicno velika vrha, od katerih odgovarja prvi alfa raakro-globulinu, drugi pa gama makroglobulinu. Vsakega zase sem koncentrirala do volumna okrog 2 ml in takoj pomešala z zaj-čjim serumom, da bi preprecila eventualno denaturacijo vsled velike specificne aktivnosti ( Alfa makroglobulin 5 uC /?ml, gama makroglobulin 52 uC /?ml )
T-2 /0 in T-2 /l
Opisani postopek sem dvakrat ponovila z normalnim gambij-skim seruraom. Za razliko od preparacije T-2/?/ sem dobila nekoliko drugačno distribucijo radioaktivnosti v teku elektroforeze. Za razliko od zgoraj opisane distribucije, v kateri odpade na gama makroglobulin le Q% izplenjene radio-aktivnosti, je ta vrednost dosti visja , ce sem uporabila serum gambijskih crncev {20%). To ne preseneca, saj je znano, da razpolagajo prebivalci predelov z endemicno malarijo z znatno višjimi koncentracijami antiteles (116).
45
C. KROMATOGRAFIJA NA  SEPHADEX A-5O IN7_ILTRA_CIJA SKOZI  SEPHADEX G- 200.
1000 ml normalnega serumskega pul# sem 5 dni dializirala proti 20 kratni kolicini dejonizirane vode pri +4°C . Dobljeni euglobulin sem veckrat izprala z ledenomrzlo vodo in ga nato raztopila v 0,1 M fosfatnem puferju, pH 6,0. Z istim puferjem sem ekvilibrirala kolono, napolnjeno z anionskim izmenjevalcem, Sephadex A- 50 . Dimenzije kolone: 3,5 cm x 38,0 cm . Proteinska mešanica je tekla skozi kolono s hitrostjo 20 ral/uro. Kolicina nanesenega euglobulina je znašala 2800 mg. Eluat. sem zbirala v vecjih porcijah toliko casa, da je UV ekstinkcija padla pod 0,1, ter ga nato kon-centrirala pod pritiskom in istocasno dializo do volumna 120 ml. Celokupna kolicina beljakovin je znašala 1400 mg (Kjeldahl). S tretino te kolicine sem izvedla separacijo na gelu Sephadex G- 200, ki je dala tri vodilne vrhove. Koncentri-rala sem prvi vrh, ,(Uporabljala sem naslednji pufer: 0,1 M TRI3, 0,2 M tfaCl, pH 8,0. ) , ki je v papirni elektro-forezi pokazal ^ibljivost hitrih gama globulinov ter dal v imunoelektroforetskem preparatu za makroglobulin tipicno linijo Izplen : 25 mg makroglobulina /100 ml seruma.
Imunoelektroforetska analiza gama makroglobulina, pri-pravljenega s kromatografijo na A-50 v 0,lM fosfatnem puferju ter filtracijo skozi Sephadex G-200. Konjski antihumani serum (Institut Pagteur, Paris)
*)defibriniranega plazmatskega pula, starega nekaj dni
46
Ta je pokazal tudi eno samo precipitacijsko crto v imuno-
difuzijskem testu z antiserumom (anti- humanim konjskira se-
rumom, Pasteur Institut, Faris) , ki sem ga predhodno ab-
sorbirala s humanim 7S gama. globulinom in ki * tem ni več
reagiral.
Analiza v analitski ultracentrifugi je dala naslednje
podatke:
Makroglobulinska frakcija vsebmje dve komponenti s sedi-mentacijskima konstantama 17S in 30S v razmerju 90a in 10$, (Dr. R.H. Pain, Wright-Fleming Institut, London)
Istocasno sem iz 500 ml plazmatskega pula pripravila frakcijo cistega 7 S gama globulina. Kolona Sephadex A-50 in serum sta bila ekvilibrirana z 0,01 M fosfatnim pufer-jem, pH 7,0 . Dimenzije kolone : 2cm x 30 cm. Pretocna hitrost nekontrolirana. Kolono sem kvantitativno izprala z istim puferjem in eluat koncentrirala pod pritiskom ob istocasni dializi proti O,1M fosfatnem puferju, pH 8,0. Izplen je znašal 300 mg 7S gama globulina /100 ml seruma.
47
Filtracija na gelu G-200 frakcije, ki smo jo dobili s kromatografijo na A-50 (O,1M fosfatni pufer, pH 6,0). Pufer pri filtraciji skozi G-200 :O,1M TRIS,0,2M NaCl,pH8,0
Imunoelektroforetske slike raznih frakcij v teku kroma-tografije na A-50 in filtracije na gelu G-200. Od zgoraj navzdol:  A) zgoraj euglobulin, spodaj pseudoglo-bulin ; B) 0,015 M eluat- A-50 ; C) 0,1 M eluat- A-50 ; C) prvi vrh -G-200 (zelo razredcen); D)drugi vrh -G-200; E)tretji vrh - G-200.
49
Koncno sem na analogen nacin izolirala iz seruma bolnika z gama plazmocitomom (Onkoloski institut v Ljubljani -dr.M. Erjavec) gama paraprotein. To je bil na zalost edini primer paraproteinemije, ki je bil v casu, ko sem vrsila eksperimente, dostopen.
Na isti koloni, uporabljeni za kromatografijo 73 gama globulina, sem pripravila (s predhodnim ekvilibriranjem izmenjevalnega gela in bolnikovega seruma) o,l M eluat (fosfatni pufer, pH 6,0), iz katerega sem oborila para-protein z dializo proti 0,01M fosfatnemu pufe^ju, pH 7,0. Precipitat sem veckrat oprala v ledenohladni dejonizirani vodi in ga nato raztopila v fizioloski raztopini NaCl.
Od zgoraj navzdol:
1) mielomski serum
2) O,1M eluat -A-50
3) Ppt po dializi z 0,01 M fosf.puferjem
4) beljakovine ostale v raztopini
50
3.   Bioloski  eksperimenti A.     MATERIAL    IN    METODE
Material
Za poskuse, opisane pod T-l, T-2 in T-3 sem uporabljala po lOmg
131
humanega   J gama makroglobulina, ki sem ga pripravila na
t/
razne nacine, opisane v poglavju Priprava normalnega gama
makroglobulina. Vsaka metoda nosi oznako eksperimanta, za ka-terega sem dobljeni makroglobulin pripravila. Metoda radio-jodiniranja je opisana kasneje. Za poskuse na cloveku sem uporabila po 20 mg makroglobulina, pripravljenega po metodi T-3. Povsod sem skrbela za to, da sem biološki eksperimant za-cela takoj po koncanem pridobivanju in neposredno po tem, ko sem izvršila markiranje z   J.
Zivalske eksperimante sem izvršila na hlevskih zajcih, kate-rim sem tri dni pred pricetkom dajala pitno vodo, ki je vsebo-vala 100 mg NaJ /100 ml(blokiranje šcitnice). Zajci, uporablje-ni za poskuse T-l in T-2 so bili imunotolerantni do gama makro-globulina. Takoj ob rojstvu so namrec dobili intraperitone-alno injekcijo 10-15 mg humanega makroglobulina, kateri je po 8 dneh sledila še ena s približno 20 mg. Zajci v poskusu T-3, kot tudi tista dva, uporabljena za inokulacijo 7S in mielomske-ga gama globulina, niso bili  tolerantni. Objekti humanih eksperimantov so bili bolniki Onkoloskega instituta v Ljubljani (dr.M.Erjavec), ki so po klinicni pre-soji pokazali normalno funkcijo jeter.Pri vseh je bila pred pricetkom eksperimanta šcitaica blokirana z lugolom.(124)
51
Metode
Inokulacije zajcev sem izvedla sama, ta.ko, da sem jih vbriz-gala v usesno marginalno veno  testirano beljakovinsko raz-topino, ki je bila vsakokrat pred aplikacijo sterilno filtri-rana.Prvi vzorec krvi sem iz iste vene odvzela po 5-10 minu-tah po inokulaciji in nato vsakokrat, kot je to razvidno iz casovne lestvice.
Inokulacije in punkcije sterilno filtriranega materiala je pri ljudeh izvedel Onkološki institut v Ljubljani.
Meritve radioaktivnosti v raztopinah in krvnih vzorcih sem izvedla v scintilacijskem stevcu z vell-typ NaJ kristalom pri širini kanala 9V po ustaljenih umerj^nih metodah V/right-Fleming Instituta ali Onkoloskega Instituta. V longitudi-nalnih studijah je bila specificna aktivnost vzorcev vedno korigirana z ozirom na radioaktivni razpad. Vsakokrat sem merila 2 ml vzorce plazme, ki sem jih dobila s centrifugi-ranjem krvi, ki ji je bila predhodno dodana manjša količina heparina v prahu. Frva meritev po 5-10 minutah predstavlja v vseh primerih empirično vrednost 100$. Vge naslednje vred-nosti so (bzražene v fo te vrednosti.
Fri zajcih T-3, 7S in mieloma gama (sl.l) in pri pacientih S.T. in P.L. smo merili tudi celotno telesno aktivnost , oziroma aktivnost nad temenom in jetri - obakrat z umerje-nimi kolimiranimi detektorji Onkoloskega instituta v Ljubl^. Prav tako je bila pri istih dveh bolnikih izvršena serija profilnih meritev vzdolz telesa s slot-kolimatorjem istega instituta.
V primeru bolnikov S.T. in P.L. sem v vseh odvzetih plaz-matskih vzorcih med 5 minutami in 15 urami dolocala razmerje med proteinsko in neproteinsko vezano radioaktivnostjo.
52
V treh ml plazme sem najprej merila celokupno radioaktiv-nost, nato pa sem celotno kolicino plazme oborila z enakim volumnom triklorocetne kisline (10%), precipitat odcentri-fugirala, dvakrat sprala z ledenohladno dejonizirano vodo, razredcila z O,1N NaOH do prvotnega volumna 3ml in ponovno merila radioaktivnost.
V primeru S.K. sem 5minutni in 100 minutni vzoreo plazme analizirala s filtracijo na gelu G-200. V prvem primeru sem nanesla na kolono 3 ml, v drugem 15 ml plazme. Eluat sem zbirala v 10 ml porcijah. Distribucija radioaktivnosti je razvidna iz diagrama (ordinata*: specificna aktivnost v lOml eluata/G-200, abscisa: ml eluata). Uporabila sem kolono iste dimenzije in isti puferski sistem kot v metodi 3C-3. Pri vseh meritvah je bila upostevana korekcija za razpad, ki se je izvrsil v času po vrednotenju 5 minutnega vzorca, kot tudi za razlike v volumnih plazme , nanesenih na kolono. Tako sta obe krivulji absolutno primerljivi.
131
Markiran.je z   J.
V poskusih T-l in T-2 sem uporabljala radiojod angleske, v vseh naslednjih pa francoske provinienca.*
Drzala sem se metode radioaktivnega markiranja po Mc Farlane-u (149) z vsemi predpisi in kriteriji. Inkorporacija joda je bila med 50-60% uporabljene aktivnosti, neproteinska aktiv-nost je znasala manj kot Vfc inkorporirane vrednosti. Totalna radioaktivnost v dozah, ki so jih sprejeli zajci, se je gibala med 5- 30 mikrokiriji, pri ijudeh od 50-100 nikro Co ..Volumen vbrizganih radioaktivnih beljakovin je znasal povsod 1,5-2,5 ml.
V vseh diagramih je na ordinati nanesena specificna aktiv. vzorcev kot število impulzov/sekundo/voluman .
(* v 0,lN NaOH brez prisotnosti reducirajocih snovi)
B. Vrednoten.je eliminaci.jskih krivul.j
Ge po tem, ko smo poskusni zivali ali cloveku vbrizgali radioaktivno beljakovino, v dolocenih casovnih presledkih merimo specificno aktivnost krvi (oz.plazme) ter to izra-zimo v % zacetne ( to je, 5 minutne vrednosti) dobirno kri-vulje, specificne za dolocen eksperimantalni sistem. Sterling (150) je predložil eksperimentalni model, po kate-rem si lahko katabolicno dogajanje, oziroma njegove posa-mezne faze, razlagamo na podlagi poznanih mehanizmov.
Nasplosno je za vse raziskane frakcije ugotovljeno, da se razgrajujejo v smislu ekspotencialne funkcije prve stopnje. Iz slike 1 je razvidno kompleksno dogajanje pri obstoju vsake posameznc bcljakovinske frakcije v organizmu.Ker so koncen-tracijo beljakovin v plazmi zdravega cloveka ponavadi kon~ stantne, prfdpostavljamo, da so si posamezni procesi med seboj v dinamicnem ravnotežju (x =koncentracija beljakovine v plazmi, Y- koncentracija v ekstravaskularnem prostoru, v= kolicina beljakovin, ki reagira s proteolitskimi encimi na mestu raz^radnje , k = konstante, ki povedo, koliko belja-kovin prohaja. iz enega prostora v drugega)
^4
Vsak hip dolocen procent zapusti cirkulacijo in difundira
v ekstracelularni prostor; prav tako se dolocen procent skozi
limfaticni sistem (ductus thoracicus) vrne v kri.
Slika 2
Slika 3
Ce vrednosti specificne krvne aktivnosti na.nesemo v semi-logaritmicni sistem, vidimo, da so sestavljene iz dveh delov Prvi dcl krivulje je ukrivljen in reprezentira zacetno iz-enačitev radioaktivnih molekul z ekstravaskularnim prosto-rom.To traja v vecini primerov 36-72 ur. Potem casu se kri-vulja podaljša v premico, ki karakterizira dejanski katabo-lizem, ko sta oba procesa že v dinamicnem ravnotežju. Tu se proces odvija po naslednjem izrazu:
pri cemer je AQ koncentracija v casu 0, At koncentracija v
času t in k]_ konsta.nta eliminacije.
Hitrost katabolicnega procesa obicajno izrazamo s takozva-
nim kataboličnim razpolovnim casom T/2, ki ga lahko ali di-
rektno odcitamo iz krivulje, ali pa izracunamo iz zgornjega
izraza:
At= 1/2 Ao
Slika 2 kaže, kako lahko graficno razrešimo dvofaznt sistem komponent, ki se različno hitro kataboliziratia . To^velja tudi za zacetni del vsake eliminaoijske krivulje, ce iraamo opraviti z delom beljakovin, ki je denaturiran in se ra-pidno izloci takoj po inokulaciji.
54 a
Na drugi strani pa lahko iz razlik   celotne telesne aktivnosti in intravaskularne aktivnosti izracunamo ekstravaskularno aktivnost (slika 3 ). Če v tocki, ko ta doseže maksimum, potegnemo tangento na krivuljo intravaskularne aktivnosti, lahko z ekstrapolacijo dobimo tocko na ordinati, ki pokaže razmerje med intna-vaskularnim in ekstravaskularnim pulom markiranih molekul. To moramo vsekakor storiti, predno odcitamo T/2 na podlagi  eliminacijske krivulje.
Navedena funkcija velja sevcda le, ^e runalna eliminacija prostega jodida dohiteva degradacijo beljakovin. Za večino serumskih beljakovin to ne igra posebne vloge, vendar pa bi utegnilo modificirati rezultate pri eli-minaciji denaturiranih agregatov ali eventualno gama makroglo"bulina, cigar razpolovni cas znaša v mojih eksperimentih približno toliko, kot je znano, da je razpolovni cas radioaktivnega jodida (ta znasa okrog 6,6 ur)(l50)
55
 REZULTATI  IN__DISKUSIJA
Zivljergska doba humanega makroglobulina
v organizmu normalnega in imuno-tolerantnega
zajca.
Slika 1 kaze padec celotne telesne radioaktivnosti treh
131 zajcev, katerim so bili vbrizgani z   J markirani 7S,
19S in gama mielomski gama globulin, izolirani iz humanega seruma. Vsaka krivulja je sestavljena iz dveh delov: zacetnega dela (1.-4. dan), ko se odvija normalna katabo-licna eliminaci.ja posameznih frakcij - ter drugega dela (po 4. dnevu), ko ji sledi imunološka eliminaci,ia ,ker spro-žijo heterologne humane beljakovine v zajcu produkcijo anti-teles. Zaradi poznane retencije razgradnih produktov v organizmu, tega preloma na sliki 1 ne vidimo dobro, pac pa postane jasen, ce pogledamo padec intravaskularne radioaktiv-nosti   J makroglobu aktivnosti v sliki 2.
131 nosti   J makroglobulina v primeri s krivuljo celotne telesne
Eksperiment na sliki 1 naj sluzi kot umeritveni eksperi-ment za vse nadaljne zakljucke, ki bi jih želeli oblikovati na podlagi metaboličnega obnasanja humanega makroglobulina v zajcur s predpostavko seveda, da upostcvamo pri kriticnem vrednotenju le zacetni del eliminacijskih krivulj.
Groba ocena nam da katabolicne razpolovne case, ki so za
7S gama globulin 2,5-3 dni
19S gama globulin   0,5 dneva
7S mielomski gl.  ^0,5 dneva
Slika 1
Slika 2.
56
Razpon	Fovpr.
4,5-7,5 dni	6,0 dni
3,7-5,8 "	5,0 »
2,9-3,7	3,3
1,6-1,8	1,7
1,4-1,8	1,6
1,2-1,7	1,5
57
Edini poznani podatek o kataboličnem razpolovnem casu T/2 humanega 7S gama globulina v organizmu zajca dajeta Spiegelberg+Weigle (145). Iz naved~ne tabele je razviden T/2 posameznih frakcij v zajcu:
T/2  zajčji (horaologni) 7S humani (heterologni)7S mor.pres.   " konjski    " bovini     M mišji      "
Temu lahko dodamo se podatke, ki jih za homologni 7S in 19S pri zajcih navajata Taliaferro+Talmage (100):
T/2 zajcja (homologna) 19Santitelesa  2,81 + 0,12 dni
3,0 + 0,33 "
zajcja (homologna) 7S antitelesa  5,5 + 0,12 "
ter podatke za obe frakciji v homolognem humanem ekspe-rimentu:
Cohen (99) T/2 humani(homologni) 7S gama globulin 21- 26 dni Barth(lO3) T/2 humani (homologni) 19S  "         5 dni
Iz primerjav lahko zaključimo, da se humani makroglobulin v homolognem eksperimentu eliminira 4-5 krat hitreje kot homo-logni 7S gama globulin in da je ta razlika precej manjša v homolognem zajčjem eksperimentu. Isto (humano) razmerje lahko najdemo s študijem humanih frakcij v zajcu (2,5 oz.0,5 dni). To pomeni, da poleg vrstno specificnih determinant , ki rela-tivno pospešijo razgradnjo heterolognih frakcij, o metaboli-cni usodi posameznih homolo^nih in heterolo^nih komponont
58
odlocajo predvsem njihove individualne determinante (karakteri-stke). Ce drži, da odlocajo o hitrosti razgrajevanja deli peptidne verige A, kot je dokazal Spiegelberg (145, glej tudi poglavje Katabolizem antiteles), nas ne preseneca, da je eliminacija humanega 7S, 19S in mielomskega paraproteina razlicna, saj vemo, da je na eni strani razlikujejo po svoji keraicni sestavi, na drugi strani pa po svoji antigeni speci-ficnosti , ki so vezane prav na clen A. (glej Struktura anti-teles).
Eliminacija intravaskularne in celotne telesne radioaktiv-nosti je prikazana na sliki 2. Le malo makroglobulina prodre v ekstravaskularni prostor. Krivulji potekata paralelno in se razideta le v fazi, ko nastopi imunoloska eliminacija.
Slika 3. predstavlja dva eksperimanta, kjer sem analizirala
131 eliminacijo   J alfa makroglobulina v netolerantnam zajcu.
T/2 intravaskularne aktivnosti je skoro popolnoma enak tiste-mu pri gama makroglobulinu. Imuna eliminacija alfa makro-globulina nastopi pri enem od zajcev že zelo zgodaj, pri drugem pa vsekakor ne pred 6. dnem po inokulaciji. Z ozirom na to, da sta si alfa in gama makroglobulin podobna po svoji molekularni masi, kot tudi po kolicini na posamezne molekule vezanih ogljikovih hidratov, lahko iz navedene koincidence izvajamo dalekosežne zakljucke.
Na sliki 4 so sumaricno prikazane krivulje intravaskularne aktivnosti raznih zajcev, inokuliranih z razlicnimi prepa-racijami gama makroglobulinov. Vsi zajci pri T-l in T-2 so bili tolerantni do gama makroglobulina, medtem ko T-3 ni bil. Povprečno in zelo grobo ocenjen T/2 je med 1/2 in 3/4 dneva. Neekspotencialni potek krivulje T-2/l s± lahko razlagamo z
59
Slika 3.: Eliminacija humanega alfa makroglobulina iz seruma zajca.
60
Slika 4: Eliminacije raznih preparacij normalnega humanega gama makroglobulina iz seruma zajcev.
(T-l in T-2 = imunotolerantni zajci)
61
neuspelo preparacijo, kjer je zaradi delno denaturiranih porcij prislo do hitrejse eliminacije (in istočasne ekvi-libracije razgradnih produktov z ekstravaskularnim prostorom) v zacetnih urah po inokulaciji. Krivulja T-3 je modificirana zaradi ze opisane imune climinacije.
Nevarno bi bilo delati kakršnekoli zakljucke o signifikan-tnosti razlik med posameznimi preparacijami. Kot vidimo iz podatkov Spiegelberga in Taliaferra, pokazejo zajci veliko variabilnost celo pri razgrajevanju lastnih antiteles. Na drugi strani pa se vedno obstoji vprašanje, ce so bili zajci v vseh primerih res tolerantni. Kako naj si sicer raz-lagamo , da dajo z istimi postopki pripravljeni makroglobuli-ni teoretsko pricakovano ekspotencialno eliminacijo v primeru T-2/0 in T-2/2, in - ce natancneje pogledamo - v primeru T-2/l precej podobno krivuljo kot T-3, kjer vemo, da zajec ni bil imunološko toleranten.
Brez dvoma se v vsakem metaboličnem poskusu s heterolognimi beljakovinami odvija dvojna igra : molekula humanega makro -globulina, ki smo 30 (v idelnem primeru) skrbno izlocili iz rgenega naravnega okoljarijnadaljuje svoje bivanje v orga-nizmu zajca, ki se vendarle po koncentracijah svojih proteo-litskih encimov in drugih pogojih loci od clovekovega , tako da je čas njenega preživetja modificiran. Na drugi strani pa zajec natancno "razlikuje" tuje makroglobuline od svojih ter odgovori s produkcijo antiteles, ki povzrocijo hitro eliminacijo tuje beljakovine.
Zaradi kompleksnosti , ki 30 le delno lahko predvidimo, je uporaba hetrrolognih eksperimentov za metabolicne posku-se le primer.jalne, ne pa absolutne vrednosti.
62
Eliminacija humanega   J gama makroglobulina iz cloveskega organizma.
Sliki 5 a in 5 b kazeta padec specificne intravaskulame
131 radioaktivnosti po inokulaciji   J humanega makroglobulina
v plazmi eksperimantalnih oseb S.T. in P.L.  V prvi krivulji so vsebovane vse meritve (zaradi velikega casovnega razpona nanesene v dvojno logaritmicnem sistemu), v drugi pa le meritve po dnevnih intervalih. ^a z'alost ne morerao dobljenih koordinat povezati v linearno semilogaritmicno funkcijo, ka-krsno predvidevia Sterlingov model in kakrsne dobiva 3arth(lO3) P~>dobna je Cohenovi (99), le da se od obeh razlikuje po mnogo krajšem T/2 , ki je po direktnem odcitku iz krivulje okrog 6 ur,  po unetni in zelo neprcpricljivi ekstrapolaciji zacet-nega dela krivulje ( ki pa se nikoli ne izravna v p^emico!) pa eventualno 12 ur  (pri cemer bi se 20-30^ intravaskularne mase ekvilibriralo z ekstrava.skularnim prostorom). Za to obsto™ jita dve razlagi: da je bil velik del pripravljenega makroglo-bulina denaturiran in do take raere "spremenjen" , da je nasto-pil nemudno bioloski "screening", ki rezultira v navidczno krajši dobi prezivetja nativnih molekul. Isti T/2 daje namrec toplotno denatururani albumin (124)  -  in na drugi strani hipoteticna možnost, da je katabolizem makroglobulina komplek-sen vecfa.zen model, ki ne odgovarja v svoji integralnosti preprosti ekspotencialni eliminaciji l.stopnje v Sterlingovem modelu. Na podlagi trenutnih podatkov je nemogoče presoditi tehtnost prve predpostavke. Nemara pa bodo navedcni eksperi-menti dali nekoliko vpogleda v dinamiko eliminacije in v intermediarne faze pri razgradrgi gama makroglobulina. Na slikah 6 a?b?c?d so registrirane profilne meritve (popol-noma identicne v obeh eksperimcntih) vzdolz telesa. Za topo-
Zgoraj   slika  5  a  ,   spodaj   slika 5b
63
64
Slika 6 a
Slika 6 b
Slika 6  c
Slika 6  d
65
grafsko orientacijo so navedene tocke: teme, jugulum, ksifoid, krista ilei, simfiza.Po 1 uri se prakticno vecina radioaktivnosti nahaja v predelu jetre in le manjži del v salivarnih zležah in mehurju.V naslednjih časovnih raz-makih aktivnost v jetri pada do pragu, ki velja najbrz za takratno povprecno aktivnost v krvi in tkivih. Da potekajo premiki v smislu degradacije, sodimo po tem, ker se ^šsoke vrednosti radioaktivnosti pojavljajo v urinu., medtem ko se prosti jod verjetno kopici v scitnici , kljub temu da je ta bila blokirana.
l'a opazanja lahko koreliramo z nadalnjo serijo zveznih serijskih meritev radioaktivnosti nad temenom (intra-in ekstravaskularna aktivnost) in nad jetri. Slika 7. Iz ne-kalibrirane skale je razvidno, da obstoji odlocna in pre-pričljiva zveza med specifično aktivnostjo krvi (oz.krvi+ ekstravaskularnega prostora) in aktivnostjo v jetri. Ta zacne takoj po začetku eksperimanta narašcati v jetri in doseže maksimum pri 15-20 minutah po inokulaciji.Istočasno pade aktivnost nad temenom, kar ima svoj minimum skoro isto-žasno, ko je koncentracija aktivnosti v jetri na,jvišja(209). Po 20 minutah se zacne aktivnost vračati iz jeter v kri, kjer po priblizno 100 minutah spet doseze izhodno vrednost in nato do 1000 mirmt (16,6 ur) enakomerno pada.Tu je z detek-torji ni bilo mogoce vec zasledovati.-^ejstvo, da je celo-kupna aktivnost nad temenom, ki v zacežr^ih fazah res nemara reprezentira pretežno intravaskularno radioaktivnost,enako visoka tudi po vrnitvi krvi iz jeter, ko venclar meritve specificne radioaktivnosti krvnih vzorcev jasno pokažejo
W
samo še 60?fc prvotne vrednosti, lahko pomeni le eno - namrec: 1. da merimo nad temenom skupno intra- in ekstravaskularno aktivnost
66
Slika 7. Merjenje radioaktivnosti nad jetri (zgoraj) in nad temenom v casovnih presledkih.
67
2. da se je moral makroglobulin že v teku prvih 100 minut razgraditi ter da so pri tem nastali produkti difundi-rali v ekstravaskularni prostor.  Po 2 50' (170 minutah) ko zasledimo aktivnost že v urinu, tudi pade absolutna aktivnost nad temenom.
Da bi razcistila to vprašanje, sem 5 rainutni in 100 minutni vzorec seruma testiranega S.K. analizirala s pomočjo filtra-cije skozi gel G-200. Slika 8. Medtera ko je v prvem vzorcu vsa radioaktivnost zbrana v lepern simetričnem vrhu, ki od-govarja makroglobulinu (simetričnost je dokaz, da ni bilo vmes vecjih agregatov- razen, ce so se ti , kar je teore-tično tudi verjetno, takoj ujeli v jetri? ) in le 5^ iz-plenjene aktivnosti se nahaja v drugem vrhu (7S). To 100 minutah je celokupen izplen radioaktivnosti seveda manjši (50% zacetne vrednosti - kar ustreza krvni krivulji), vendar je distribucija aktivnosti razporejena med prvim vrhom (50%) in med dvema, ki se poja.v3.jata kasneje v elucij-skem diagramu (skupno 50%). To pomeni, da je pri 100 minutah 50% apliciranega makroglobulina depolimeriziranega v manjše enote, po velikosti odgovarjajoce velikosti 7S gama globulinu in albuminu v umeritvenem diagramu. Evrntualno : makroglo-bulin - 7S enote makroglobulina - A clen (55.000 M.W.) Irehod med prvim in drugim vrhom je zvezen, medtem ko nasto-pa tretji vrh samostojno.
¦Ce temu dodamo še vrednosti proteinsko vezane aktivnosti v posameznih vzorcih , odvzetih v zacetnih fazah eksperi-menta (identicni rezultati za S.T. inP.L.), smo pravzaprav svoje informacije izčrpali:
68
Slika 8.
S minutni in 100 minutni vzorec seruma po filtraciji skozi gel G-200
69
5	minutni vzorec	100
10		90
20	ti	90
40	ii	87
80		82
172	n	78
342	n	72
Po 100 minutah je torej okrog 20% proteinske aktivnosti ze v oBIlki, ki je ne moremo vec oboriti s triklorocetno kisli-no( saj imamo ze po 1 uri aktivnost v urinu !) Prestalih 80$ oborimo sicer s triklorocetno kislino, kar pa ne pove, v kaksni obliki se te pravzaprav nahajajo. Znano je namrec, da na ta način oborimo intaktne molekule, kot tudi nekatere visje peptide.
Ali lahko na podlagi vseh navedenih eksperimentov zaklju-cimo, da poteka raz&radnja makroglobulina v obliki zvezne depolimerizacije preko 7S podenot do peptidov, od katerih ima vsak spet svojo lastno razpolovno dobo in se eventualno z razlicno hitrostjo ekvilibrira z ekstravaskularnim pulom;; i^asa krvna krivulja v tem primeru predstavlja rezultanto razlicnih neodvisnih katabolicnih krivulj in se zravna v premico eventualno šele, ko usahne vir intaktnih makroglo-bulinskih molekul. Ker lahko domnevamo, da so jetra v veliki meri zapletena v ta dogajanja, bi to lahko pricakovali morda po 29 urah  (slika 6d)? ko v njih ni vec bistvenih količin makroglobulina. Na to bodo lahko odgovorili le nadaljni eksperimenti, v katerih bi eventualno uporabili umetno pripravljene makroglobulinske podenote 7S tipa, na drugi strani pa izolirali hipoteticne depolimerizirane enote direktno s pomocjo filtracije na G-200 in jih anali-zirali v posebnem katabolicnem poskusu. Prav tako bi iz-vedli kompletnejso longitudinalno študijo po ze nakaza.nem konceptu (slika 8).
70
T/2 makroglobulina, katerega odcitamo iz eliminacijske kri-vulje je torej po teh zakljuckih le indeks, ki se nanasa pred-vsem na populacijo še intaktnih molekul ter tisti del nje-nih metabolitov, ki so po ekvilibriranju z ekstravaskularnim prostorom še ostali v cirkulaciji  (in ki eventualno se opravljajo svoje biološke funkcije). Ce to drži za vsak makro-globulin ali samo za tistega, ki sem ga za opisane eksperi-mente uporabila, je vprašanje.  Primerjava z eliminacijo to-plotno denaturiranih albuminskih kompleksov (124) je dala sicer v mnogih ozirih podobne podatke o kinetiki clearensa, z minimumom nad temenom pri 15minutah in ponovnim maksimumom v krvi po 1 uri. Vendar je bilo ob tera casu mogoce oboriti s triklorocetno kislino le^O^ radiaaktivnosti (pri makroglo-bulinih 85^), kar pomeni, da je potekel proces degradacije pri albuminskih kompleksih mnogo radikalnejše. V teoretskem delu nakazana dispozicija o eventualni vlogi molekularnih dimenzij za hitrost razgradnje nemara ni popolno-ma zgresena. Mogoce drzi, da so večje molekule sicer fagoci-tirane, da pa obstoji diskriminacijski mehanizem, ki nativne molekule podvrže normalnemu fiziološkemu razpadu (pipeko raanj-sih, morda še ucinkovitih fragmentov), delno spremenjene ali celo denaturirane pa bolj radikalni proteolizi.Ker se eni in drugi razpadni produkti ekvilibrirajo z ekstravaskularnim pro-storom, eliminacijske krivulje nemara ne pokažejo kvalita-tivnih razlik med obema dogajanjima.
S kakršnimikoli dalekoseznejsimi zaključki bi raje pocakala, dokler ne izvedem nadaljnih poskusov, ki smo jih že zasno-vali s kolegi radiologi in matematiki, sodelavci Onkološke-ga instituta v Ljubljani.
71
Zakljucki ob pregledu rezultatov
Obstojijo možnosti za izolacijo imunokemijsko čistega normalnega humanega gama makroglobulina. Vendar je nji-hova uporaba za metabolicne študije §e sporna zaradi možnosti, da so bili v teku preparativnih postopkov ali radioaktivnega jodiniranja spremenjeni in se pretirano hitro eliminirajo.
Predložen je metabolični model makroglobulinskega kata-bolizma z naznaČeno verjetnostjo, da se ta odvija v jetri; Nerazčišcen je ostal problem, Se so makroglobulini sledili analogiji z albuminskim agregatom zaradi svoje molekularne velikosti, ali zato, ker so bili delno denaturirani. Omenjenih je nekaj smernic, po katerih nameravam v bo-docnosti analizirati nakazana vprašanja.
Heterologni eksperimenti  z analizo elirainacije humanih makroglobulinov, 7S gama globulinov in mielomskega glo-bulina v zajcih imajo doloceno orientacijsko vrednost. Vidim doloceno možnost za njihovo uporabo v klinicne namene pri diagnosticiranju paraproteinemij, Če bi serig.-ska opažanja pokazala, da se paraproteini v celoti hitre-je eliminirajo iz zajcjega organizma kot ustrezne frakcije normalnih antiteles.
1.

3.
Bibliografija
1.  Heidelberger,M. , Pedersen,K.O.: The molecular vreight of antibodies.
J.expt.Med. 6L 1393 (1937)
2.  Tiselius,A. and Kabat,E.A.: An electrophoretic study of immune sera and purified antibodies. J.expt.Med.62:119 (1939)
3.  Kabat, E.A.: 1he molecular veight of antibodies. J.expt.Med. 62:103 (1939)
4.  Heremans, J.F., Heremans, M.Th. and Schultze,H.E.: Isolation and description of a few properties of the beta ?A globulin of human serum. Clin.Chim.Acta 4:96 (1959)
5.  heremans,J.F.: Les globulines seriques du systeme gamma, Arscia, Bruxelles (1960).
6.  Heremans, J.F. and Vaerman, J.P.:
Beta 2A globulin as a possible carrier of allergic reaginic activity. Nature 193:1091(1962)
7.   "ireman,?., Vannier,V.E. and Goodman,H.C. J.expt.Med.117:603 (1963)
8.  ^ahe^,J.L.: heterogeneity of human ^amma globulins. Advan.Immunology 2:42 (1962)
9.  Cohen,S.: Properties of the peptide chains of normal and pathological human gamma globulins. Biochem.J.89:334 (1963)
10. Gohen S.:Heterogeneity of gamma globulins. Modern Trends in Immunology, str.25 (1963) Butterworths, London.
11. Futnam; The Flasma Proteins Academic Press, London,N.Y. (1960)
12. Fahey,J.L.: Chromatographic studies of anomalous gamma 2A and macroglobulins and normal gamma globulins in myeloma and macroglobulinemic sera. J.Biol.Chem.^237:440 (1962)
II
13.  IslikerjHiC,: The- chlmical^ftature of antibedies Adv.Frot.Chem. 12;287 (1957)
14.  Kabat,E.A.; Experimental Immunochemistry. C.C.Thomas, Springfield (1961)
15.  Edelman,G.M., Benaceraf,B., Ovary,Z. and Paulik,^.D.: Structural differences among antibodies of different specificities.
Proc.^at.Acad.Sci.47:1751 (1961)
16.  Porter, R.R.:Gamraa globulins and antibodies.
V "The Plasma Froteins". Academic Press (1960).
17.  Askonas, B.A., Farthing, C.P., Humphrey,J.H.;
The significance of multiple antibody components in serum of immunised rabbits. Immunology 3:336 (1960).
18.  Sober,H.A. in Peterson,E.A. Frotein chroraatography on ion exchange cellulose.
Fed.Proc. 17:1116 (1958)
19.  Futnam,F,W.: Ilasma cell myeloma and macroglobulinemia I New England J.Med. 261-902 (1959)
20.  Kunkel, H.G., Mannik, M. , V/illiams, R.G.:
Individual antigenic specificity of isolated antibodies. Science 140:1218(1963)
21.  Porter, R.R. Gamma globulins and antibodies.
In The Flasma Proteins.Ed.Putnam. Ac.Press (1960).
22.   Sober, H.A., GutterF.J., Wyckhof,M.M., Feterson,E.A. Ghromatography of proteins.II.
J.Am.Chem.Soc. 78:756 (1956)
23.  Hall, C.E,Nisonoff,A., Slayter,H.C.
iilectron microscopic observations of rabbit antibodies J.Bioph.Biochem.Cytol. 6^407 (1959)
24.   Smarda,J.? Wiederman N.:Ultrafiltration measurement of paraprotein particles in four cases of macroglo-bulinemia.
Experientia l^: 397 (1957)
25.  Cohen,S., Porter, R.R.: ^tructure and biological activity of immunoglobulins. Adv.Immunol. 4:287(1964)
III
26.  Korngold,L., Van Leeuwen,G.»
The use of cross reacting antiserums for the study
of antigenic heterogeneity of mammalian gamma 2 glob.
Int.Arch.Allergy 12:271 (1961)
27.  -Pahey, J.L. , Solomon,A. : Two tipes of gamma and beta 2A myeloma proteins,macroglobulins and Bence Jones prot. J.Clin.Inv.42:811 (1963)
28.  Tomasi,T., Ziegelbaum,S.i The excretion of garama globulin in human saliva, colostrum and urine. Arthr.Reum.L:662(l962).
29»  Schultze,H.E.: The synthesis of antibodies and proteins Glin.Chim.Acta 4:610 (1959).
30.  Benaceraf,B., 0vary,Z., Bloch,K.J., ^ranklin, E.C.: J.Exptl.Med.117:937 (1963)
31.  Clausen,J,, heremans,J., Heremans, M.Th., Rask-Nielsen,R, Immunoelectrophoretic studies of serums from mice carriing transplantable plasma cell leucemias. J.^at.Cancer Inst. 22:57 (1959)
32.  Yagi,Y., Maier,!., Pressman,D., Arbesman,0., Reisman,R., Lenzrer,A,.:Multiplicity of insulin binding antibodies in human sera.
J.Immunol. 90:76© (1963)
33.  Kinkel,H.G. , Rockey,J.H.: -t>eta ?A and other immune globulins in isolated anti A- antibodies. rroc.Soc.Exp.Biol.K.Y. 112:278 (1963)
34.  Franklin,E.C. : Two tipes odf gamma 1A globulin in sera from normals and patients vith multiple myeloma. ttature 195:392 (1963)
35.  Thorbecke ,G.J., Franklin,E.C.:Antigenic cross- reacti-vity betvreen 7S and 19 S rabbit gamma globulin. J.Immunol. 87:753 (1961)
36.  Rask-Nielsen R., Loutie,R., Clausen,G., Christensen,H.E. fieremans,J.F., Brauns G.: Rev.Franc.Etud.Clin.Biol. 5:1000, (1960)
37.  Van der Scheer,J., Lagsdin,J.B.,Wycoff,R.G.W.: Electrophoretic and ultracentrifugal analyses of antipneumococcal horse sera. J.Immunol.41:209 (1941)
IV
38.  Makinodan,T., uengozian,N., &anning,R.E.: ^emonstration of normal serum macroglobulin copreci-pitating with the bovine serum albumin-chicken anti bovine serum albumin precipitate.
J.Immunol. 8^:439 (1960
39.  'Kunkel,H.G.: Macroglobulins and high molecular
antibodies v The Plasma Froteins.Ac.Fress (1960)
40.  Fahey,J.L., Goodman, H.C.: Characterisation of anti-thyroglobulin factors in human serum. J-Clin.Inv. 32^1259 (1960)
41.  V/aldenstrbm, J.; Incipient myelomatosis or essential hyperglobulinemia with fibrinogenopenia- new sindrom? Acta Med.Scand.ll7:2l6 (1944).
42.  Korngold,L., Van Leeuwen:Macroglobulinemia II. J.Exp.Med.lO6:477 (1957)
43.  Kunkel, H.G., l^ranklin, K.C., Muller-Eberhart,H. J.: Studies on the isolation and characterisation of the "rheumatoid factor".
J.Clin.Invest. ^8:424 (1959)
44.  Deutsch,H.F., Morton J.J.: Human serum macroglobulins and dissociation units.
J.Biol. Chem. 231:1107 (1958)
45.  Franek ?.• Isolation and some molecular characte-ristics in pig gamma raacroglobulin. Chech.Chem.Commun. 27^2808 (1962)
46.  Kovacz,A.M., Daune,Ivi.: wasse et dimensions d'une molecule d^ macroglobulin. Biochim.Biophys.Acta 50-249 (1961)
47.  Valentine,". ^.The shape of protein molecules suggested by electron microscopy.
iMature 184-1838(1959)
48.  Beutsch H.F., Morton, J.J. Dissociation of human serum macroglobulin. Science, 125:600 (1957)
49.  Glenchur,H., Zinneman,H.H., Briggs, D.R. ^acroglobulinemia. Report of tvo cases. Ann. Int. Med.48:1055 (1958)
V.
50.  Kunkel, H.G., Rockley J.H., Tomasi, T.:
Immunologic Approaches to Problems in Microbiologv. Rutgers Univ.Press, A"ew Brunswick, N.Y. (1961).
51.  Isliker, H.J. na NRC meeting on gamma globulins. Vashington (196?).
52.  Anfinsen, C,B., Maber,E.: Studies on the reduction and reformation of protein disulphide bonda. J.Biol.Chem.L26:1361 (1961).
53.  Franklin,E.• The iramune globulins- their structure and function and some techniques for their isolation. Progress in Allergy, Vol.VIII (1964).
54.  Nisonoff,A., Thorbecke, G.J.:Immunochemistry Ann.Rev.Biochem.31:119 (1959)
55.  Porter,R.R.: The hydrolysis of rabbit gamma globulin and antibodies with cristalline papain. Biochem.J.7^:119(1959)
56.  fjisonoff ,A. , V/oernley,D.C. : Effect of hydrolysis by papain on the combining side of antibody.
Natute 182:13?5 (1959)
57.  Edelman,G.M.: Dissociation of gamma globulin. J.Am.Chem.Soc*81:3155(1959)
58.  Fleischman,J.B.,Porter,R.R., Pain,P.H.: Reduction of gamma globulin. Arch.Biochim., Suppl.1:174 (1962)
59.  ?ranek,F.: Dissociation af animal 7S gamma globulin by cleavage of disulphide bonds. Biochem.Biophys. Res.Comm.4:28 (1961)
60.  Ramel,A., Stellwagen,E., Schachman,H.K.: Subunits of proteins.
Fed. Proc.20:1387. (1961)
61.  Porter,R.R.:The structure of gamma globulins and antibodies. ^ymposium on Basic Froblems of Neoplastic Dieease.Ed. ^^.Gellhorn and E.Hirschberg.
Columbia University Iress (1962)
62. Humphrey,J.H. and Vhite,1?. G. : Immunology for Students
of Medicine.Second Edition.
Blackwell Scientific Publication, 0xford (1964)
VI
63.  Cebra,J.J.,Givol,D., Bilman,H.J., Katchalsky,E.: A two stage cleavage of rabbifc gamma globulin by water insoluble papain preparation followed by cysteine.
J.Biol.Chem.256:1720(1961)
64.  Nisonoff,A.,Markus,G., Wissler,F.C.:
^eparation of univalent fragments of rabbit antibody by reduction of a single, labile disalphide bond. Nature 189:293 (1961)
65.  Edelman,G.M. , rierem^ns, J.F. , Heremans,M. Th. , Kunkel,H.G. Immunological studies of human gamma globulin. J.Exp.Med.112:20^ (1960)
66.  Franklin,E.C. t ^tructural units of human 7S gamma glob. J.Glin.Inv.29j_1933 (1960)
67.  Erikkson,S., Sjbcjuist,J.: Quantitative determination of N terminal amino acids in serum proteins. Biochem.Biophys.Acta 45:290 (1960)
68.  Edelman,G.M.,Poulik,M.D.:Studies on structural units of the gamma globulins.
J.Exp.Med.ll :861 (1961)
69.  Gecil,R., Wake,R.G.: Biochem.1.82:401 (196?)
70.  Pain, R.H.: Molecular veight of reduced chains in gamrna globulins.
Biochem.J.88c-P34 (1963)
71.  Crumpton, M.J., V/ilkinson, J.M. : Araino acid analvsis of reduced gamma globulins.
Biochem.J.88;?28 (1963)
72.  Cohen,S.: Iroperties of the peptide chains of normal and pathological human gamma globulins. Biochem.J.82:334 (1963)
73.  Harhoe,M., Osterland,G.K., Kunkel,H.G.: Localisation of two genetic factors (Gm and Inv) to dif-^erent areas of 7S gamma globulin molecules.
Science 116:979 (196?)
74.  Franklin,E.C.,Fudenberg,H., ^eltzerM.,Stanvorth,D.R.: The structural basis for genetic variations of normal human gamma globulins Proc.nat.acad.Sci.Vash. 48:914 (1962)
VII
75.  Lawler ,S.D., Cohen,S.t in press
76.  Edelman,G.M., Benaceraf,B., Ovary,Z., ?oulik,M.D.; Structural differences among antibodies of dif^erent specificities.
Froc.Nat.Acad.Sci.47:1751 (1961)
77.  Cohen,S. osebno sporocilo
78.  Edelman,G.M. , Galley,J.A.: l"he nature of Bence Jones proteins, chemical similarities to polipeptide chains of myeloma globulins and normal gamma globulins. J.Exp.Med.116:207 (1962)
79-  Franklin,E.C., Meltzer,M., Guggenheim,?., Lowenstein,J.: Feder.iroc.22^264 (1963)
80.  Referati in razgovori na kongresu o imunotoleranci, Locarno, maj 1965.
81.  Lo Spalluto,J., Miller,V/.Jr. , Dov/ard,B.D. ,
The formation of macroglobulin antibodies I. Studies on adult humans. J.Clin.Inv.41:1415(1962)
82.  Bauer,"0.C, ^athies,?4. J. , StaYitsky?A.B. : Seauences of synthesis of gamma 1 macroglobulin and gamma 2 globulin antibodies during primary and secundary response to proteins, ^almonella antigens and phage. J.Exp.Med. 117:889(1963)
83.  Uhr,J.W. , Finkelstein,M.S.: Antibody formation IV. "Pormation of rapidly and slowly sedimenting antibodies and immunological memory to phage 0X174. J.Exp.Med.117;457(1963)
84.  Kim,Y.B., Bradley, S. G. , Watson,D,V/. : Characterisation of earlj^ 19S and late 7S immunoglobulins in mouse. J.Immunol.93:798 (1964)
85.  Nezlin,R.Z.  Abstrakt Biohimija 29:548 (1964)
86.  Talmage,D.W. , Freter,G.G., 1'aliaferro,W.H. :
The antibodies of related specificity but different hemolitic efficiency separated by centrifugation. J.Inf.Dis.98:300 (1956)
VIII
87.  Humphrey, JtH.:  Pogovori o neobjavljenih eksperimentih, maja 1965.
88.  Jaroskova,L. : Molecular and cellular "basis of antibody formation. Simpozij. Ceska Akad.Znanosti, Praga (1964)
89.  Farr,R.S.: J.Inf.Dis. 103:239 (1958)
90.  Grey,H.M.: feder. Iroc. 22:326 (1963)
91.   Smith,R.T.: Response to active immunisation of human infants during neonatal period. Cellular Aspects of Immunity. Ciba Foundation Symposium, Boston (1960)
92.  Fink,C.W., Milles, W.E.Jr., Doward,B., Lo Spalluto,J.: The formation of macroglobulin antibodies.II.Studies on neonatal infants and other children. J.Clin.Inv.41:1422 (1962)
93.  Uhr,J,W., ^anciSjJ., Franklin,E.C., Finkelstein,M.S., Lewis,E.W.:The antibody response to bacteriophage
0X 174 in newborn premature infants. J.Clin.Invest. 41^1509 (1962)
94.  Hitzig,N.H.: Die physiologische Entvicklung der Immunoglobuline.Helv.pediat.Acta 1L:596 (1957)
95.   Silverstein,JVLM. , Uhr,J. , Kraner,K., Lukes,R.: Fetal response to antigen stimulus.II. J.exp.Med.117:799 (1963)
96.  Robbins,J.B., Mc Canley,J., Smith,R.T.; ^' r.Proc. 22:499 (1963)
97.   Svehag,S., Mandel,B.: J.Expt.Med. 119:1 (1964)
98.  Dresser,D. W. : Immunological paralysis (bnduced by protein antigens.
International Symposium on immunological tolerance, Locarno, maj 1965.
99.  Cohen,S., Freeman,T.: Metabolic heterogeneity of gamma globulins.
Biochem.J.76:475 (1960)
100. 1'aliaferro H. , $almage, D.W. :  Antibodies in  the rabbit with different rates of metabolic decay.
J.inf.Dis. 99:21 (1956)
IX
101.  Drivsholm,A.: Turnover rate of myeloma proteins in serum and in urine determined after intravital la-belling with glycine l-C-14-
Acta Med.Ecand. 169:503 (1961)
102.  Labuzda? T.G.: The turnover and distribution odf
J labelled myeloma and macroglobulin proteins. J.Lab.clin.Med. 59:65 (1962)
103.  Barth,W.F., Wochner,R.D., Waldman,T.A., Fahey,J.L.: Metabolism of human gamma macroglobulins. Jour.Clin.Inv. 43:1036 (1964)
104.  Pappenheimer, A.M.Jr.: ^alence of antibodies v Pappenheimerjevi; The nature and the significance of the antibody response. Golumbia University Press 1953.
105.  Kunkel, H.G., Tan E.M.: Autoantibodies in disease. Adv.Immun. 4:351 (1964)
106.  Good R.A., Rotstein J.i Progress in Allergy, 6:187 (1962)
107.  Thorbecke G.J., Gordon H.A., Wostman B., Wagner,M., Reyniers J.A.
J.inf.Dis. 101: 237 (1957).
109.  Mellors R.C., Korngold, L.J.: Expt.Med. 118:387 (1963)
110.  Gowans,J.L.:
Proc. Royal Soc. London. V tisku.
111.   Schooley, J.C.;Autoradiographic observations in plasma cell forraation.
J.Immunol. 86:331 (1961)
112.  Taliaferro, W.H., Jaroslaw, B.N.:
The restoration of hemolysin formation in Xrayd rabbits by nucleic acid drrivatives and antagonists of nucleic acid synthesis. J.inf.Dis.107:341 (1960)
113.  Dutton,R.W., Dutton, A.G., Vaughan,J.H.:
The effect of 5-"bromouracil desoxiriboside in the synthesis of antibodies in vitro. Biochem.J.75:230 (1960)
114.  Nossal,G.J.V. : Fur-ther elaboeattbon of the clonal deletion theory. ^eferat na kongresu o imunotoleran-ci, Locarno, 1965.
115.  Sell S. , -Fahey, J.L.: Metabolism of gamma globulins in germ-free mice. V tisku.
115.  Cohen, S.: Gamma globulin metabolism. Brit.Med. Bull. 19:202 (1964)
117.  ^enaceraf B., ^ebastyen,M., Cooper,N.S.:
The clearens of antigen-antibodies complexes from the blood by the reticulo-endothelial system. J.Immunol. 82:131 (1959)
118.   Soons, J.B.J., Westerbrink, H.G.K.: Bull.Soc.Chim.Biol. 40:1803 (1958)
119.  Cohen,S., Gordon, A.H., Mathews C.M.E.: Catabolism of the garama globulin by the perfused isolated rat liver.
Biochem.J.82:197 (1962)
120.  Freeman,T., Gordon,A.H., Humphrey,J.H.; Distinction between catabolism of native and denatured proteins by the isolated perfusedT liver after carbon loading.
Brit.Jour.exp.Path.39:459 (1958)
122.  Dobson,E.L., Jones,H.B.:The behaviour of intra-venously injected particulate material.
Acta med.Scand.144: 273 (1952).Supplementum.
121.  Vetter et al.: The disappearence rate of colloidal gold fr gold from the circulation.
J.Clin.Inv.3.3 (1954)
123.  Benaceraf, B. in drugi: A study of the phagocytic activity of the RES toward heat treated serum albu-min taggerd with J-131.
Res.Bull.L:19 (1956)
124.  Erjavec,M., Vakseljj,M. , Cevc,P., Snajder,J., Flavsak,M.: Razvoj topografske detekcije primarnih tumorjev in metastaz s pomocjo radioaktivnih izotopov.II.
Delo za sklad B.Kidrica (1964).
125.   Taplin,G.V. in drugi: fteticuloendothelial function in man. Isotope in Klinik und Forschumg,5.Bd. Urban in Scgvrarzenberg (1963).
X
XI
126.  Taplin G.V. et al.:Organ visualisation by photo-scanning. Symp.on Med.Rad.Scanning, 1964.
127.  Valentine, R.C.:Nature 184; 1838 (1959)
128.  D:U:trich,F.M. (Ciba, Basel) osebno
129«  Gitlin D., Borges, W.H.: Studies on the metabolism of fibrinogen in two patients with congenital afibrinogenemia. Blood 8:679 (1953)
130.  Sternlieb J. , Morell,A.G., Tuckes,V/.D. , Greene,M.W. , Scheinberg, J.H. : 'l'he incorporation of copper into ceruloplasmine.
J.Clin.Inv. 40:1834 (1961)
131.   Solomon A. , Waldman,T.A. ,"Pahey, J.L. : Metabolism of normal 6,6S gamma globulin in normal
subjects and patients with macroglobulinemia and multiple myeloma. J.Lab.Clin.Med. 62:1 (1963)
132.  Fahey,J.L., Hobinson,A.G.: Factors controlling serum gamma globulin concentration. J.Exp.Med.118:845 (1963)
133.  Bartter,F.C., Steinfeld,C. J. , Waldman,T. ,^elea C. S. : Metabolism of infused scrum albumin in the hypo-proteinemia of gastrointestinal protein loss and
in analbuminemia. Trans.Ass.Amer,Phycns 74: 180 (1960)
134.  Miiller-Eberhart H.J., Kunkel,H.C.: Clin.Chem.Acta 4:252 (1959)
135.  Porath,J.: Biochim.et Biophys.Acta 22:151 (1956)
136.  Gelotte,B., ^lodin^P., Killander,J.: Fractionation of human ptasma proteinš by gel filtration and zone electrophoresis or ion-exchange chromatography.
Arch.Bioch.Biophys.,Suppl.1:319 (1962)
137.  Heide,K., Haupt,H., Schmidtberger : Behringwerkc Mitteilungen 37:29 (1959)
138.  Muller-Ebcrhard,H.J., Kunkel, H.G., Franklin,E.G.: Troc. Soc.exp.Biol.Med. 93:146 (1956)
XII
139.  Edelman,G.M., Kunkel,H.G., Franklin,E.G.; Interaction of rheumatoid factor with antigen-anti-bodies complexes and aggeegated gamma globulin J.Exp.Med.108:105 (1958)
140.   Schultze,H.E. , Ha.upt,H., Heide,K., Moschlin,G., Schmidtberger,R., Schwick,G.:
Untersuchungen uber gamma Makroglobuline des menschlichen Serums.
Zeitschrift fur Naturforschung,17Bd»Heft 5:313(1962)
141.  Lospalluto,J., Chegoriansky J., Lewis,A., Ziff,M.: Ghromatographic SKkasiHHK properties of gamma globulin. Behaviour of serum macroglobulin. J.Glin.Inv.39:473 (1960)
142.  Albert,A., Johnson,P.; Macroglobuline I. Studies on the isolation and physical propertics of pathological macroglobulins.
Biochem.J.81:658 (1961)
143.  ^extran Gels and their application in Gel filtration. Fharmacia, Uppsala, Sweden.
144. Flodin, F., Killander,J.: Fractionation of human serura proteins by gel filtration.
Biocho.et Biophys. Acta 63:403 (1962)
145.   Spiegelberg, H.L., V/eigle, V/.0.:
The catabolism of homologous and heterologous 7S gamma globulin fragments. J.Exp.Med. 121 :223 (1965)
146.  Spector, W. G. : The rea^sorption of labdled proteins in normal and nephrotic rat kidney.
J.path. and bact. 68:187 (1954)
147.  Franklin,E.C., 0vary Z.:0n sensitizing properties of some normal and pathological human immunoglobu-lins anfl  fragments obtained by papain or popsin digestion.
Imraunology 6:434 (1963)
148.  Brambell,F.W.T?. , Hemmings,W.A. , 0akley C.L. ,Forter,R.R. The relative transmission of the fraction of papain fe hydrolised homologous gamma globulin from the utcrine cavity to the foetal circulation of the rabbit. Roy.Soc.London Scries B, 151:434 (1963)
XIII
149«  Mc Farlane , A.S.: Metabolism of plasma proteins. v Mammalian Frotein Metabolism, Ed.Munroe+Allison, Acadcraic Press, 1964
150.  Sterling, K.J.:
JClin.Inv. 30: 1228 (1950)
NFIRODNR   IN  UNIUERZITETNfi KNJI2NICR
00000437979