Zbornik predavanj, 7. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2017 30 Uvod Zaradi uspešnega delovanja organiziranega držav- nega programa zgodnjega odkrivanja predrakavih sprememb materničnega vratu (DP ZORA) se je in- cidenca raka materničnega vratu v Sloveniji zmanj- šala skoraj za polovico. Leta 2003, ko se je program začel izvajati, je bila groba incidenčna stopnja raka materničnega vratu (RMV) 20,7. Dvanajst let kasne- je, leta 2015, pa le še 11,4 (1). To je izjemen uspeh tako v slovenskem kot tudi v svetovnem merilu. V Sloveniji in drugih deželah z dobro razvito in kakovostno citologijo se za odkrivanje predraka- vih sprememb materničnega vratu uporablja ci- topatološka preiskava brisa materničnega vratu (BMV). BMV je najuspešnejši do sedaj uporabljeni presejalni test sploh, vendar ima svoje slabosti in omejitve. Dobre rezultate daje le v okoljih s kako- vostno citologijo in z dobro razvitim sistemom za zagotavljanje in nadzor kakovosti. V Sloveniji je prav kakovostna citologija v državnem programu ZORA pomembno pripomogla k zmanjšanju inci- dence RMV. Slabost citopatološke preiskave BMV je, da sta občutljivost in specifičnost za odkrivanje predrakavih in rakavih sprememb na materničnem vratu odvisni od stopnje celične atipije, ki jo opre- delimo s citopatološko preiskavo. Za citopatološke ocene ploščatocelična intraepiteliska lezija visoke stopnje ali več (PIL-VS+) je verjetnost, da ženska že ima predrakave spremembe visoke stopnje CIN2+ dovolj velika, da opravičuje takojšnjo kolposkopi- jo. Težava so citopatološke ocene ploščatocelična intraepitelijska lezija nizke stopnje (PIL-NS) in ati- pične ploščate celice neopredeljene (APC-N), kjer je verjetnost, da ženska že ima CIN2+ premajhna, da bi opravičevala takojšnjo kolposkopijo, obenem Triaža žensk s pozitivnim izvidom presejalnega testa HPV s testom p16/Ki-67 Veronika Kloboves Prevodnik Oddelek za citopatologijo, Onkološki inštitut Ljubljana, Zaloška 2, Ljubljana Povzetek Dvojno imunocitokemično barvanje p16/Ki67 je občutljiv in specifičen test za odkrivanje predraka- vih in rakavih sprememb materničnega vratu. Njegova vloga v presejalnih programih za odkrivanje raka materničnega vratu zaenkrat še ni določena. Predvideva se, da bi lahko imel pomembno vlogo v triaži žensk s pozitivnim izvidom presejalnega testa HPV in tudi v triaži žensk s citopatološkimi ocenami atipične ploščate celice neopredeljene (APC-N) in ploščatocelična intrepitelijska lezija nizke stopnje (PIL-NS). Ključne besede: dvojno imunocitokemično barvanje p16/ki-67, triažni test, presejanje raka mater- ničnega vratu pa je 5-letno tveganje za nastanek cervikalne in- trepiteliske lezije in raka (CIN3+) 5,2 % in 2,6 %. To tveganje je previsoko, da bi le na osnovi teh citopa- toloških ocen izključili CIN3+, zato je v teh primerih potrebna dodatna diagnostika in dolgotrajno spre- mljanje žensk. V večini držav, kjer je presejalni test citopatološka preiskava BMV, se po oceni APC-N in PIL-NS priporoča ponoven odvzem BMV za cito- patološko preiskavo, testiranje na visoko tvegane HPV, če je rezultat testiranja na HPV pozitiven pa kolposkopija in biopsija s histološko preiskavo (2). V Slovenji za triažo žensk s citopatološko oceno APC-N in PIL-NS uporabljamo ponovni odvzem BMV za citopatološko preiskavo in triažni test na visoko tvegane HPV z metodo Hibrid Capture 2 (3). Triažni test na visoko tvegane HPV je zelo občutljiv, vendar nespecifičen, ker s testom ni možno ločiti med prehodno okužbo z visoko tveganim HPV, ki spontano izzveni, in dolgotrajno okužbo, ki je povezana z razvojem predrakavih in rakavih spre- memb na materničnem vratu (4). V primeru pozi- tivnega testa na visoko tvegane HPV je test zato potrebno čez eno leto ponoviti (3). Tak način dela daje dobre rezultate, vendar je obremenjujoč za ženske in zdravstveni sistem, ker so potrebni števil- ni obiski ginekologa in ponovitve testov. Poseben problem predstavljajo tudi tesnoba, negotovost in zaskrbljenost žensk zaradi nejasnih rezultatov testov. Zato v svetu potekajo številne raziskave, katerih glavni cilj je razviti občutljiv in specifičen triažni test, s katerim bi za ženske s citopatološko oceno APC-N in PIL-NS lahko zanesljivo ocenili tve- ganje za CIN2+ (5). Imunocitokemično barvanje p16/Ki-67je eden od potencialnih triažnih testov, ki veliko obetajo. Narejene so bile številne študije, ki so pokazale, da je test nekoliko manj občutljiv Zbornik predavanj, 7. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2017 31 kot testiranje na visoko tvegane HPV, vendar veliko bolj specifičen (2). Evropske smernice za presejanje raka materničnega vratu uporabe triažnega testa p16/Ki-67 zaenkrat še ne priporočajo (6). Dvojno imunocitokemično barvanje p16/Ki-67 Proteina p16 in Ki-67 sta biološka označevalca, ki se v citologiji in histologiji že dalj časa uporabljata za diagnostiko predrakavih in rakavih sprememb na materničnem vratu (5). V celicah s predrakavimi in rakavimi spremembami se zaradi deregulacije celič- nega ciklusa, ki je posledica dolgotrajne infekcije z visoko tveganimi HPV, oba proteina kopičita. Njuno prisotnost v celicah dokažemo z imunocitkemično oziroma imunohistokemično metodo. S posame- znim imunocitokemičnim barvanjem za prikaz pro- teina p16 ali Ki-67 v BMV ne prikažemo le celic s pre- drakavimi in rakavimi spremembami, ampak tudi nekatere normalne celice ali celice z neneoplastični- mi spremembami. Imunocitokemično barvanje p16 je lahko pozitivno v endocervikalnih celicah in celi- cah ploščatocelične in tubarne metaplazije, imuno- citokemično barvanje Ki-67 pa v normalnih celicah, ki proliferirajo zaradi vnetnih in drugih reaktivnih patoloških sprememb. Specifičnost posameznega določanja proteinov p16 in Ki-67 v vzorcih BMV je zato slaba in neprimerna za klinično uporabo (7, 8). Da bi premostili premajhno specifičnosti posame- znega proteinskega označevalca p16 in Ki-67, so razvili dvojno imunocitokemično barvanje p16/Ki- 67, ki v BMV praviloma prikaže le celice s predraka- vimi in rakavimi spremembami. Princip dvojnega imunocitokemičnega barvanja je, da na eni celici istočasno prikažemo izražanje dveh različnih anti- genov (9). V celicah, ki so transformirane zaradi infekcije z vi- soko tveganimi HPV, se prekomerno izražata tako p16 kot tudi Ki-67 protein (Slika 1), v normalnih celicah ali celicah z neneoplastičnimi sprememba- mi pa le eden od obeh proteinov (Slika 2). Zato je dvojno imunocitokemično barvanje p16/Ki-67 po- zitivno le v celicah, ki so neoplastično transformi- rane. Imunocitokemično barvanje je pozitivno, če se jedro celice obarva rdeče (Ki67), citoplazma pa rjavo (p16). Za pozitiven test zadostuje le ena po- zitivna celica (Slika 1). Morfološke značilnosti celic pri interpretaciji rezultatov dvojnega imunocitoke- mičnega barvanja p16/Ki-67 niso pomembne, zato je ponovljivost rezultatov dobra. Dvojno imunoci- tokemično barvanje p16/Ki-67 je klinično dobro občutljiv in specifičen test (9) . Interpretacija rezultatov dvojnega imunocitoke- mičnega barvanja p16/Ki-67 je bolj zahtevna od interpretacije rezultatov drugih imunocitokemič- nih barvanj, ki jih uporabljamo v citopatologiji. Problem je ocena imunocitokemičnih reakcij v ce- ličnih skupinah in celicah, kjer je rezultat reakcije šibko pozitiven, zato je laboratorijske delavce, pre- sejalce in citopatologe, ki bodo sodelovali pri inter- pretaciji rezultatov dvojenga imunocitokemičnega Slika 1. Pozitiven rezultat dvojnega imuncitokemičnega barvanja p-16/Ki-67. Imunocitokemično barva- nje je pozitivno, če se jedro celice obarva rdeče, citoplazma pa rjavo (celica označena s puščico). Zbornik predavanj, 7. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2017 32 barvanja p16/Ki-67, potrebno ustrezno izobraziti. V laboratorijih, kjer metodo uvajajo na novo, je po- trebno vzpostaviti možnost konzultacij z ustanova- mi, ki imajo s testom izkušnje in preverjeno dobre rezultate (10, 11). Možnosti uporabe testa p16/Ki-67 v presejalnih programih za odkrivanje raka materničnega vratu V literaturi najdemo številne raziskave o možni uporabi dvojnega imunocitokemičnega barvanja p16/Ki-67 za odkrivanje predrakavih in rakavih sprememb na materničnem vratu v BMV. Raziska- ve so bile narejene na kolposkopskih in presejalnih populacijah, kjer so najpogosteje primerjali obču- tljivost in specifičnost testa p16/ Ki-67 za odkriva- nje CIN2+ s citopatolološkim pregledom BMV in testom na visoko tvegane HPV. Glavni zaključek teh raziskav je, da je test p16/Ki-67 enako ali neko- liko bolj občutljiv kot citopatološki pregled BMV, specifičnost testa pa je precej boljša (12, 13). V pri- merjavi z testom na visoko tvegane HPV pa je test nekoliko manj občutljiv in precej bolj specifičen (Tabela 1) (2, 12). Rezultati do sedaj objavljenih raziskav so pokaza- li, da bi dvojno imunocitokemično barvanje p16/ Ki-67 lahko uporabili predvsem kot triažni test za ženske s citopatološko oceno APC-N ali PIL-NS v BMV (Tabela 1) in kot triažni test za HPV-pozitivne ženske (2, 13). Rezultati multicentrične evropske PALMS raziskave so pokazali, da bi test p16/Ki-67 lahko uporabljali tudi kot presejalni test predvsem za mlajše ženske, kjer testiranje na visoko tvega- ne HPV ne daje dobrih rezultatov zaradi številnih prehodnih okužb s HPV (Tabela 2) (12). Polman s sodelavci je v nedavno objavljeni raziskavi poka- zal, da bi test p16/Ki-67 lahko uporabljali kot test ozdravitve za ženske po zdravljenju CIN2+ (14). Še- koranja s sodelavci pa je pokazala, da bi test p16/ Ki-67 lahko uporabljali za triažo žensk z BMV s ci- topatološko oceno atipične ploščate celice, ni mo- goče izključiti ploščatocelične intraepitelijske lezije visoke stopnje (APC-VS) (15). Kljub velikemu številu objavljenih raziskav vloga testa p16/Ki-67 v prese- jalnih programih za odkrivanje RMV še ni dorečena. metaplastična celica Slika 2. Negativen rezultat dvojnega imuncitokemičnega barvanja p16/Ki-67. Imunocitokemično barva- nje je negativno, če se jedro in/ali citopazma celice obarva le rjavo ali le rdeče (celica označena s puščico). Zbornik predavanj, 7. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2017 33 Zaključek Smernic za umestitev testa p16/Ki-67 v presejalne programe za odkrivanje predrakavih in rakavih spre- memb na materničnem vratu zaenkrat še ni. Večina raziskovalcev ga vidi kot možen triažni test za žen- ske s citopatološko oceno APC-N in PIL-NS (Tabela 1) ali kot triažni test za HPV-pozitivne ženske (2, 13). Keisser s sodelavci je nedavno objavila metaanalizo o uporabnosti testa p16/Ki-67 za triažiranje žensk s citopatološko oceno APC-N in PIL-NS. Zaključila je, da rezultati do sedaj objavljenih raziskav ne zado- ščajo, da bi test lahko začeli uporabljati v presejal- nih programih. Meni, da bodo potrebne nadaljnje strogo načrtovane prospektivne raziskave, ki bodo pokazale, ali je test res boljši od testa na visoko tve- gane HPV. Poleg tega Keisserjeva predvideva, da bo glavni javnozdravstveni doprinos uporabe testa v zmanjšanju števila diagnostičnih postopkov in po- tencialno v preprečevanju prekomernega zdravlje- nja. Na zmanjšanje umrljivosti za rakom maternične- ga vratu uporaba testa najverjetneje ne bo vplivala (2). Izsledki nedavno objavljene ATHENA raziskave pa so potrdili, da je dvojno imunocitokemično bar- vanje p16/Ki-67 boljši triažni test za HPV-pozitivne ženske kot citopatološki pregled BMV (16). Vloga testa p16/Ki67 v primarnem HPV presejanju med strokovnjaki zaenkrat še ni bila dorečena. Tabela 1. Občutljivost in specifičnost triažnega testa p16/Ki-67 in testa na visoko tvegane HPV za detekci- jo CIN2+ pri ženskah s citološko oceno APC-N in PIL-NS (prirejeno po viru 2). PIL-NS: ploščatocelična intraepitelijska lezija nizke stopne, APC-N: atipične ploščate celice, najverjetneje neoplastične, ICK: imunocitokemične reakcije, HPV: človeški papilomavirus (angl. Human papillomavirus, HPV), CI: interval zaupanja (angl. Confidence interval, CI) Citopatološka ocena/ Raziskava Število primerov p16/Ki67 Občutljivost/specifičnost (CI) Test HPV Občutljivost/specifičnost (CI) PIL-NS Schmidt et al. 415 0,94 (0,89-0,97) 0,68 (0,62-0,73) 0,96 (0,91-0,98) 0,19 (0,15-0,24) Loghavi et al. 92 0,98 (0,81-1,00) 0,43 (0,32-0,55) 0,92 (0,52-0,99) 0,37 (0,21-0,56) Wentzensen et al. 264 0,86 (0,78-0,92) 0,58 (0,50-0,65) 0,92 (0,84-0,96) 0,35 (0,29-0,43) Waldstrom et. al. 469 0,88 (0,80-0,93) 0,51 (0,46-0,56) 0,92 (0,84-0,96) 0,36 (0,32-0,41) APC-N Edgerton et al. 63 0,64 (0,39-0,84) 0,53 (0,39-0,66) / / Schmidt et al. 361 0,92 (0,84-0,96) 0,81 (0,76-0,85) 0,91 (0,82-0,96) 0,36 (0,31-0,42) Loghavi et al. 96 0,91 (0,62-0,98) 0,61 (0,51-0,71) 0,91 (0,62-0,98) 0,44 (0,34-0,55) Wentzensen et al 140 0,82 (0,66-0,91) 0,63 (0,53-0,71) 0,97 (0,85-1,00) 0,26 (0,18-0,35) Tabela 2. Občutljivost in specifičnost dvojnega imunocitokemičnega barvanja p16/Ki-67, citopatološke preiskave BMV in testa na visoko tvegane HPV za CIN2+ v PALMS raziskavi (prirejeno po viru 2). HPV: človeški papilomavirus (angl. Human papillomavirus, HPV), CI: interval zaupanja (angl. Confidence interval, CI) Starost (leta) Število primerov p16/Ki67 Občutljivost/specifičnost (CI) Citopatologija Občutljivost/specifičnost (CI) Test HPV Občutljivost/specifičnost (CI) 18-65 25.577 86,7 (81,1-90,9) 95,2 (94,9-95,4) 68,5 (61,2-75,0) 95,4 (95,1-95,6) / / 18-29 6.372 89,4 (80,2-94,6) 92,0 (91,2-92,6) 71,9 (59,8-81,5) 92,6 (92,0-93,3) / / 30-65 19.205 84,7 (76,8-90,3) 96,2 (95,9-96,5) 65,9 (56,5-74,3) 96,3 (96,0-96,5) 93,3 (85,9-96,9) 93,0 (92,6-93,4) Zbornik predavanj, 7. izobraževalni dan programa ZORA – ZORA 2017 34 Literatura 1. Državni program ZORA [Internet]. Ljubljana: Onko- loški inštitut Ljubljana. Dostopno na: https://zora. onko-i.si/ [24. april 2017]. 2. Keisser A, Zechmeister-Koss A. A systematic review of p16/Ki67 immunotesting for triage of low grade cervical cytology. BJOG 2015; 122:64-70. 3. Smernice za celostno obravnavo žensk s predraka- vimi spremebami na materničnem vratu. Strokovna skupina za pripravo smernic: Marjetka Uršič Vrščaj et al. Urednica: Marjetka Uršič Vrščaj. Onkološki inštitut, Ljubljana, 2011. 4. Arbyn M, Martin-Hirsh P , Buntinx F, Van Ranst M, Para- skevaidis E, Dillner J. Triage of women with equivocal or low-grade cervical cytology results: a meta-anal- ysis of the HPV test positivity reate. J Cell Mol Med 2009; 13; 648-59. 5. Pogačnik A, Kloboves-Prevodnik V, Nolde N, Novaković S, Prosenc U, Grgić M, Ivanuš U, Primic- Žakelj M. Nove triažne metode pri HPV-pozitivnih ženskah. V: 5. izobraževalni dan programa ZORA, Brdo pri Kranju, 15. oktober 2014. Ivanuš Urška (ur.), Primic-Žakelj Maja (ur.). Zbornik predavanj. Ljubljana: Onkološki inštitut, 2014, str. 36-40. 6. European guidelines for quality assurance in cervi- cal cancer screening. Second eddtion, Supplements. Anttila A, Arbyn M, De Vuyst H, Dillner J, Dillner L, Franceschi S, Patnick J, Ronco G, Segnan N, Suonio E, Törnberg S, von Karsa L. Publication Office of Euro- pean Union, Luxemburg, 2015. 7. Wetzensen N, Bergeron C, Cas F, Eschenbach D, Vi- nokurova S, von Knebel Doeberitz M. Evaluation of nuclear score for p16 INK4a -stained cervical squamous cells in liquid based cytology sample. Cancer Cytopa- thology 2005; 105; 461-7. 8. Sahebali S, Depuydt CE, Buolet GAV, Arbyn M, Moeneclaey LM, Vereecken AJ, Van Marck EA, Bogers JJ. Immunocytochemistry in liquid-based cervical cytology: analysis of clinical use following a cross- section study. Int J Cancer 2006; 118: 1254-60. 9. Edgerton N, Cohen C, Siddiqui MT. Evaluation of CIN- tec PLUS® testing as an adjunctive test in ASC-US di- agnosed Surepath® preparations. Diagn Cytopathol 2011, 41(1); 35-40. 10. Wentzensen N, Fetterman B, Tougawa D, Shiffman M, Castle PE, Wood SN, Stiemerling E, Poirtas N, Lorely T, Kinney W. Interobserver reproducibility and accura- cy of p16/Ki67 dual-stain cytology in cervical cancer screening. Cancer Cytopathology 2014; 122; 914-20. 11. Allia E, Ronco G, Coccia A, Luparia P , Macrì L, Fiorito C, Maletta F, Deambrogio C, Tunesi S, De Marco L, Gil- lio-Tos A, Sapino A, Ghiringhello B. Interpretation of p16 INK4a /Ki-67 dual immunostaining for the triage of human papillomavirus-positive women by experts and nonexperts in cervical cytology. Cancer Cytopa- thol 2015; 123:212-8. 12.  Ikenberg H, Bergeron C, Schmidt D, Griesser H, Alam- eda F, Claudio Angeloni, Bogers J, Dachez R, Denton K, Hariri J, Keller T, von Knebel Doeberitz M, Neu- mann HH, Puig-Tintore LM, Sideri M, Rehm S, Ridder R, for the PALMS Study Group Screening for Cervical Cancer Precursors With p16/Ki-67 Dual-Stained Cy- tology: Results of the PALMS Study. J Natl Cancer Inst 2013; 105:1550-7. 13. Wentzensen N, Fetterman B, Castle P E, Schiffman M, Wood SN, Stiemerling, E Tokugawa D, Bodelon C, Poitras, N Lorey T, Kinney W. p16/Ki-67 Dual Stain Cytology for Detection of Cervical Precancer in HPV- Positive Women. JNCI J Natl Cancer Inst, 2015; 107: 1-8. 14. Polman NJ, Uijterwaal MH, Witte BI, Berkhof J, van Kemenade FJ, Spruijt JW, van Baal WM, Graziosi PG, van Dijken DK, Verheijen RH, Helmerhorst TJ, Steen- bergen RD, Heideman DA, Ridder R, Snijders PJ, Mei- jer CJ. Good performance of p16/ki-67 dual-stained cytology for surveillance of women treated for high-grade CIN. Int J Cancer 2017; 140: 423-30. doi: 10.1002/ijc.30449. Epub 2016 Oct 11. 15. Šekoranja D, Repše Fokter A. Triaging Atypical Squa- mous Cells-Cannot Exclude High-Grade Squamous Intraepithelial Lesion With p16/Ki67 Dual Stain. J Low Genit Tract Dis. 2017; 21:108-11. 16. Wright TC Jr, Behrens CM, Ranger-Moore J, Rehm S, Sharma A, Stoler MH, Ridder R. Triaging HPV-positive women with p16/Ki-67 dual-stained cytology: Re- sults from a sub-study nested into the ATHENA trail. Gynecol Oncol 2017; 144:51-6.