Strokovni œlanki - Professional Articles
Genska zdravila
Gene-based medicines
Irena Mlinariœ-Raĝœan
Povzetek: Genska zdravila so terapevtiki, ki vsebujejo rekombinanten genski material v obliki fragmentov nukleinskih kislin in se uporabljajo za nadomestitev genskega produkta ali za izniœenje njegove funkcije. Prednost terapije z genskimi zdravili je v vzroœnem pristopu k zdravljenju, pri katerem odpravljamo molekularno motnjo z dodajanjem ali odvzemanjem funkcije ciljnemu genu. Najĝibkejĝa toœka pri razvoju genskih zdravil je neuspeĝen transportni sistem, kar je vzrok slabemu ciljanju, toksiœnosti in kratkotrajnosti terapije ter pojavu imunskih reakcij. Zaœetki razvoja genske terapije so bili usmerjeni predvsem v nadomestno terapijo monogenskih dednih bolezni, medtem ko je veœina novih genskih zdravil namenjena zdravljenju kompleksnih obolenj kot so rak, imunska obolenja in nevrodegenerativne bolezni. Genska regulacije delovanja celic pri starostnikih je usmerjena predvsem v dvig kvalitete ĉivljenja. V skrbi za zdravje starostnikov vzbuja posebno veliko pozornosti genska terapija Alzheimerjeve bolezni.
Kljuœne besede: genska zdravila, Alzheimerjeva bolezen
Abstract: Gene-based medicines are therapeutic modalities of recombinant nucleic acids capable of interfering with gene function either by replacing its function or by silencing it. The main advantage of gene-based medicines is in targeting a molecular defect of treated pathogene-sis. Current methods of gene delivery are still inadequate for successful applications and high efficiencies, causing unwanted toxicity and immune reactions. Genetic disorders that arise from mutations in a single gene are the best candidates for gene therapy. Despite this, recent developments of gene therapy are largely focused on treatment of complex disorders with combined effects of variations in many genes such as cancer, immune dysfunctions and neurodegenerative disorders. Modulation of gene function in geriatric population is intended to improve the quality of life of older persons. Gene therapy of Alzheimer’s disease attracts a vast interest of researchers as well as geriatric population.
Key words: Gene therapy, Alzheimer’s disease
1 Uvod
Izraz genska zdravila uporabljamo za terapevtike, ki vsebujejo genski material, kot so fragmenti nukleinskih kislin DNA ali RNA. Uporabljajo se za nadomestitev manjkajoœega oziroma defektnega genskega produkta ali interferirajo z njegovim izraĉanjem. Zaœetki genske terapije segajo v leto 1990, ko je bila v ZDA odobrena prva kliniœna ĝtudija, in sicer za zdravljenje hude kombinirane imunske pomanjkljivosti (angl. severe combined immunodeficiency-SCID), vzrok katere je mutacija v genu za adenozin deaminazo. V celiœne kulture limfocitov T so z retorovirusnim vektorjem vnesli zdrav gen za adenozin deaminazo (1). Pozneje so bile odobrene in izvajane ĝe klin-iœne ĝtudije v Milanu, Parizu in Londonu, ki so se uspeĝno zakljuœile za 17 pacienov, pri katerih je priĝlo do rekonstrukcije imunskega sistema (2). Sicer uspeĝen razvoj genskega zdravljenja je leta 2003 zaustavilo nepriœakovano poroœilo o resnih stranskih uœinkih genskega zdravljenja, ki so se pojavili pri pacientih s hudo kombinirano imunsko pomanjkljivostjo, vezano na X kromosom (X-SCID). Tri leta po sicer uspeĝnem genskem prenosu in rekonstrukciji imunskega sistema so se pri treh od skupno 15 pacientov pojavili znaki levkemije, kar je bila posledica integracije retrovirusnega vektorja v protoonko-gen LMO 2 (3, 4). Ameriĝka agencija za hrano in zdravila (Food and drug administration, FDA) je po tem poroœilu zaustavila 27 kliniœnih poizkusov, pri katerih so uporabljali retrovirusne vektorje, kar je razvoj genske terapije zelo zavrlo (5).
Zaœetki razvoja genske terapije so bili usmerjeni predvsem v nadomestno terapijo dednih obolenj, torej v dostavo zdravih genov v
doc. dr. Irena Mlinariœ-Raĝœan, mag. farm., Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, 1000 Ljubljana
izbrane celice ali tkiva, medtem ko je veœina novih genskih zdravil usmerjena v zdravljenje rakastih obolenj in predstavlja v letu 2004 kar 60 odstotkov vseh kliniœnih poskusov na podroœju genskega zdravljenja. Razvoj genskih zdravil je po podatkih svetovalnega telesa amer-iĝkega inĝtituta za zdravje (National Institute of Health-NIH, Recombinant DNA Advisory Committee-RAC) v zadnjih petnajstih letih spremljalo okrog 900 kliniœnih ĝtudij, od tega okrog 600 v ZDA (6).
2 Genska zdravila
Gensko terapijo ali vnos genskih zdravil v celico izvajamo z namenom spremeniti funkcijo v genomu zapisani informaciji in s tem poseœi v dejanski vzrok bolezni, ki je lahko posledica pomanjkljivega izraĉanja genov ali tvorbe nefunkcionalnega proteina, kakor tudi prekomernega izraĉanja genov ali sinteze prekomerno aktiviranega proteina. Z gensko modulacijo tako v primeru pomanjkanja funkcije gena dodajamo ĉeleni gen, ki bo proizvajal manjkajoœi protein. V primeru prekomerne aktivnosti bomo gen utiĝali ali poskuĝali doseœi razgradnjo njegovih produktov. Z genskim zdravljenjem posegamo v bolezenska stanja, kjer je vzrok genske deformacije znan. Najuspeĝnejĝe so terapije monogenskih dednih boleznih, kot je primer cistiœne fibroze, kombinirane dedne pomanjkljivosti (SCID), nevrodegenerativnih obolenj, diabetesa in drugih. Genska zdravila pa se uveljavljajo tudi pri zdravljenju kompleksnih poligenskih disfunkcij kot so rak, starostne demence in imunske disfunkcije. Osnovni pogoj pri naœrtovanju genskega zdravila je dobro razumevanje molekularnih osnov bolezni (7).
farm vestn 2005; 56 71
Strokovni œlanki - Professional Articles
2. 1 Opredelitev tarœne molekule
Iskanje genske motnje nekega bolezenska stanja je do nedavnega temeljilo na druĉinski anamnezi in segregaciji bolezni, ki se je pojavljala v druĉini po kljuœu dedovanja. Prav tako je iskanje odgovornega gena omogoœala predhodna citogenetska analiza, ki je opredelila kromosomske nepravilnosti in poslediœno identifikacijo gena. Sodobni pristopi iskanja tarœnih molekul vkljuœujejo tehnologije visokih zmogljivosti, kot so DNA mikroœipi, ki omogoœajo presejanje celotnega genskega prepisa celice, torej nekakĝen odtis genske aktivnosti stanja celic. Primerjava genskih prepisov zdravih in patoloĝkih celic, takoimenovana analiza diferencialne ekspresije genov, prikaĉe razlike na molekularnem nivoju, kar vodi v identifikacijo osnovne genske motnje (8).
2. 2 Naœrtovanje genskih zdravil
Razvoj genskega zdravila je moĉen, ko je znan tarœni gen, funkcija kodiranega proteina in njegova ekspresija v specifiœnih celicah in tkivih. Centralna dogma molekularne biologije pravi, da se v genomu zapisana informacija izrazi s prepisom v informacijsko RNA (mRNA) in njenim prevajanjem v aminokislinsko zaporedje. Modulacija v genomu zapisane informacije je torej moĉna na vseh stopnjah od DNA preko mRNA do proteina. Genska zdravila oblikujemo z namenom, da moduliramo osnovno motnjo in hkrati zadovoljimo principom optimalne terapije.
Genski transfer. Potreba po dodajanju genske funkcije je izraĉena v primeru delecije gena ali pri korekciji mutiranega, nefunkcionalnega gena. Dodajanje genske funkcije se uporablja tudi pri vnosu t.i. ubijalskih genov, ki s svojo ekspresijo povzroœijo smrt celice, kar izko-riĝœamo pri genski terapiji raka. Naslednji primer je dodajanje de novo funkcije, kot je primer vnosa genskih zapisov encimov za aktivacijo predzdravil. Primer predstavlja citozin deaminaza, ki katalizira pretvorbo predzdravila v toksiœni 5-fluorouracil. Vnos in prepis celotnega gena je problematiœen predvsem pri velikih genih, kot je primer pri genu za distrofin, katerega mRNA je dolga 14 kb in predstavlja resno oviro za uspeĝno gensko terapijo pri pacientih z Dushenovo miĝiœno distrofijo (9).
Delecija genske funkcije. Oblikovanje genskih zdravil je moĉno tudi za utiĝanje genske funkcije ali izbris njegovega prepisa. Funkcijo prekomerno izraĉenega gena lahko moduliramo z dodatnim izraĉanjem mutirane kopije gena. Produkt mutiranega gena deluje po principu dominanto negativne funkcije (10). Najpogosteje se za utiĝanje genske funkcije uporabljajo oligonukleotidna zdravila. Tehnologija temelji na hibridizaciji komplementarnih fragmentov nukleinskih kislin, DNA in ali RNA. Protismiseleni oligonukleotidi so oblikovni komplementarni fragmenti ciljanega gena ali mRNA. Z vezavo na mRNA se tvori kompleks dvoveriĉne RNA, ki ga specifiœno prepoznajo RNaze in razgradijo. Pri uporabi alkilirajoœih oligonukleotidov ciljamo dvoveriĉno DNA, ki se zaradi poslediœnega zamreĉenja ne prepisuje v RNA. Interferirajoœe RNA sekvence predstavljajo najnovejĝe tipe genskih zdravil. Dvoveriĉna RNA (kratka, interferirajoœa, siRNA) se veĉe v encimski kompleks, ki jo denaturira in ji omogoœi vezavo na komplementarno mesto na tarœni mRNA, ki ga prepoznajo in razreĉejo RNaze (11).
2. 3 Dostavni sistemi
DNA je relativno obstojna molekula, ki tudi prosto prehaja v celice in iz njih. Uspeĝnost terapije je odvisna od doseganja kriterijev kot so; (a) zahtevana efektivna doza apliciranega genskega zdravila, (b) ciljan
vnos v celico in /ali v jedro, (c) ustrezna integracija v genom in (d) œas izraĉanja vnesenega gena. Uspeĝna genska terapija mora biti celiœno in tkivno specifiœna, kar zahteva naœrtovanje ciljnega dostavljanja. Izbira dostavnega sistema poteka soœasno z oblikovanjem genskega fragmenta in je pogojena z naravo genske motnje ter specifiko celice, v katero ĉelimo vnesti zdravilo. S tehnologijo rekombinantne DNA vnesemo genske fragmente v ustrezen vektor, ki bo omogoœil uspeĝen vnos dednega materiala v celico oziroma njeno jedro (12).
2.3.1  Nevirusni vektorji
Najenostavnejĝa metoda aplikacije bi bila seveda aplikacija gole DNA, vendar njen prehod v veœino celic in tkiv ni enostaven. Miĝiœne celice sicer lahko sprejmejo DNA, ko je elektroporirana ali injicirana v procesu obstreljevanja celice z DNA.
Uporaba kationskih liposomov omogoœa prenos linearne in plazmidne DNA ter RNA. Liposome lahko apliciramo tudi in vivo (i.v. ali v tkivo). Liposomi, ki vsebujejo terapevtsko DNA, so sposobni preiti plazemsko membrano tarœne celice. Vnos terapevtske DNA lahko doseĉemo tudi s kemiœno vezavo DNA na molekulo, ki se veĉe na specifiœne celiœne receptorje, nato pa se ovije s plazemsko membrano tarœne celice in prehaja v notranjost.
Liposomi, prekriti s polimeri polietilen glikola (PEG), se uporabljajo tudi za prenos genov v moĉgane, saj so virusni vektorji preveliki za prehod hematoencefalne bariere (13). Najnovejĝe raziskave dostavnih sistemov, ki prihajajo iz Univerze Case Western Reserve in Copernicus Therapeutics (Ohio, Cleveland), vkljuœujejo izdelavo tako imenovanih nano-liposomov premera 25 nm, ki lahko prenaĝajo terapevtsko DNA tudi skozi pore jedrne membrane (14).
2.3.2  Virusni vektorji
Za vnos genskih zdravil v celice se posluĉujemo virusnih vektorjev, ki so primerno modulirani, in izkoriĝœamo le njihovo sposobnost prodiranja v celico in vnosa genskega materiala (12). Retrovirusni vektorji se uporabljajo najpogosteje. Gre za RNA viruse, ki lahko okuĉijo le celice, ki se hitro razmnoĉujejo, preneseno genetsko informacijo prepiĝejo v DNA, ki se nato integrira v gostiteljski genom. Retrovirusne vektorje uporabljamo pri ex vivo modulacijah celic z zadovoljivo proliferacijsko sposobnostjo. Ne moremo jih uporabljati pri ĉivœnih, miĝiœnih, jetrnih ali pljuœnih celicah. Slaba stran retovirusne terapije je v slabi integraciji v genomsko DNA, saj se virusni vektor z DNA iz organizma odstrani ĉe po kakem tednu. Bolj uspeĝno se uporabljajo spremenjeni lentivirusi, med katere spada tudi HIV, sicer tudi RNA virus. Prednost lentivirusnih vektorjev je boljĝa integracija v genom in zadovoljiva ekspresija vnesenega gena, ki ostane stabilen do ĝest mesecev po vnosu, ter sposobnost infekcije celic, ki se ne delijo. Kot vektorji se uporabljajo tudi adenovirusi, ki so virusi z dvovi-jaœno DNA. Sposobni so infekcije celic v mirovanju in med delitvijo ter se ne integrirajo v genom inficirane celice, paœ pa se razmnoĉujejo ekstrakromosomsko. Prav tako se uporabljajo adeno-pridruĉeni virusi z enoveriĉno DNA, ki lahko vgradijo genetski material na toœno doloœeno mesto na kromosom 19.
2.4 Selekcija ciljnih celic
Moralna in etiœna naœela danaĝnje druĉbe dovoljujejo spremembo genskega materiala somatskih celic, medtem ko je genska manipulacija œloveĝkih zarodnih celic etiœno vpraĝljiva.
farm vestn 2005; 56
Gensko zdravilo se v celico lahko vnese zunaj telesa, modificirana celica se nato transplantira nazaj v pacienta, ali pa se zdravilo aplicira in se terapija izvaja v telesu (12). Ex vivo: celice najprej odstranimo iz pacienta ali darovalca in jih vzgajamo v kulturi ter jih genetsko modificiramo in vitro. Selekcionirane in pomnoĉene celice nato vnesemo v pacienta, kjer delujejo kot bioloĝka mikroœrpalka za izloœanje nekega proteina. In situ: Gensko zdravilo apliciramo lokalizirano v nek organ. In vivo: Gre za sistemski vnos genskega zdravila, ki kroĉi po organizmu, po moĉnosti pa se ciljno vsadi v ĉelene celice in direktno modificira gostiteljski genom. Prednosti in vivo genske terapije je predvsem v enostavnosti postopka, saj se vnos gena izvede z vbrizganjem vektorja v tarœni organ ali obtok. Med pomanjkljivosti pa sodijo nespeci-fiœnost infekcije tarœnih celic, toksiœnost in sproĉitev imunskega odziva. Prednosti ex vivo genskega vnosa so v moĉnosti selekcije izbranih celic, kar omogoœa ciljno dostavo, moĉnost izvedbe testov integracije, nivoja ekspresije in imunokompatibilnosti. Nujen pogoj za izvedbo terapije je, da se celice delijo in jih lahko vzdrĉujemo v in vitro pogojih, kot npr. primarne fibroblaste, matiœne celice, tumorske celice, Schwannove celice ali endotelne celice.
3 Genska terapija pri Alzheimerjevi bolezni
3.1 Alzheimerjeva bolezen kot posledica prekomerne smrti nevronov
Staranje celice in poslediœno organizma lahko razlagamo s teorijo poĝkodbe celice, ki naj bi bila rezultat akumuliranih mutacij, pa tudi s teorijo programiranega staranja, torej genetske regulacije procesa staranja celice. Vsaka celica ima namreœ kodiran program svoje smrti, njen propad je fizioloĝko reguliran proces, imenovan apoptoza. To je gensko reguliran proces, ki se sproĉi po vplivu dejavnikov iz okolja, dejansko pa gre za odgovor celice, ki ni veœ sposobna popravljati napak, ki jih povzroœi neka poĝkodba. Z razumevanjem molekularnega delovanja celic in vzdrĉevanjem homeostaze med proliferacijo in apoptozo lahko poseĉemo v proces staranja, v najpreprostejĝi obliki s prepreœevanjem faktorjev poĝkodb celice, kot so izogibanje ultravi-joliœnim ĉarkom ter s sodobnimi oblikami genske manipulacije (15).
Primer genske terapije, ki je ĝe prav posebej aktualna v starostnem obdobju, je genska modulacija nevronske aktivnosti pri Alzheimerjevi bolezni, ki je najpogostejĝa nevrodegenerativna bolezen, in sicer prizadene v Sloveniji okrog 10.000 bolnikov, v ZDA pa naj bi bilo pacientov veœ kot 10 milijonov. Predstavlja vzrok skoraj 60% vseh starostnih demenc. Ĝtevilo bolnikov naraĝœa predvsem zaradi staranja prebivalstva, saj bolezen veœinoma prizadene starejĝe od 65 let, in sicer je incidenca v tej starostni skupini 5-10%. Bolezen je posledica izgube nevronov v subkortikularnih bazalnih segmentih, ki so pomembni za sintezo ĉivœnih prenaĝalcev, kar se odraĉa v pomanjkanju acetilholina, noradrenalina in serotonina. Kliniœna slika bolezni, znaœil-na prisotnost amiloidnih plakov in izguba sinaps pri Alzheimerjevi bolezni korelirajo z degeneracijo holinergiœnega sistema, ki namreœ modulira aktivnost nevronov v tarœnih regijah in naj bi bil odgovoren za kognitivno sposobnost posameznika (16).
Zdravljenje Alzheimerjeve bolezni je simptomatsko, lajĝa posledice bolezni  in  upoœasni  napredovanje  znakov  bolezni.  Terapije,  ki
Genska zdravila
poskuĝajo zmanjĝati ali prepreœiti disfunkcijo holinergiœnih nevronov, izboljĝajo kognitivno funkcijo. Najpomembnejĝa zdravila spadajo v skupino zaviralcev acetilholinesteraze, ki poviĝujejo nivo acetilholina v moĉganih. Inhibitorji acetilholinesteraze imajo le skromen vpliv na ostale simptome, kot so nemir, depresija, motnje spanja. Razvoj novih terapevtikov je usmerjen v prepreœevanje izgube nevronov, kar naj bi omogoœilo dvig ĉivœnih funkcij ali celo prepreœilo izgubo celic. Veliko pozornosti se posveœa raziskavam rastnih faktorjev ĉivœnega sistema, za katere je znano, da poveœujejo preĉivetje in ohranjajo funkcijo nevronov (17).
3.2 Vloga ĉivœnega rastnega dejavnika
Ĉivœni rastni dejavnik (angl. nerve growth factor – NGF) spada med nevrotrofiœne molekule, ki v razvojnem obdobju ĉivœevja spodbujajo rast, diferenciacijo in preĉivetje razvijajoœih se ĉivœnih celic. V odraslem obdobju je NGF odgovoren za inhibicijo intrinziœnih mehanizmov apoptoze. Na ta naœin prispeva k ohranjanju njihovega fenoti-pa in morfoloĝkih znaœilnosti (18). Pomanjkanje trofiœne podpore povzroœi apoptozo ĉivœnih celic tako po poĝkodbi moĉganov (mehanske poĝkodbe, vnetje, virusne okuĉbe) kot tudi pri nevrode-generativnih boleznih, odgovorno pa naj bi bilo tudi za starostno odmiranje ĉivœnih celic. Prav zato so se v zadnjih letih raziskave usmerile v intenzivno prouœevanje njihove potencialne terapevtske vloge pri zdravljenju nevrodegenerativnih obolenj in poĝkodb ĉivœne-ga sistema. V centralnem ĉivœnem sistemu so identificirali ĝtevilne nevrotrofiœne molekule, ki jih glede na podobnost lahko razvrstimo v veœ druĉin. Najbolje preuœena je druĉina ğklasiœnega neutrofinaĞ, ki zdruĉuje NGF, neutrofin-3 in neutrofin-4/5. NGF je prototip druĉine, izloœajo ga nevroni hipokampusa in neokorteksa tekom celotnega ĉivl-jenskega obdobja, veĉe se na specifiœne receptorje, ki so prisotni na holinergiœnih aksonskih konœiœih. Nato se retrogradno transportira do telesc holinergiœnih celic. NGF deluje tudi lokalno na aksonski konœiœ, in sicer signalizira preko rTrkA in p75NTR receptorjev ter aktivira signalno pot preko tirozin kinaz. Nivo NGF proteina je pri Alzheimerjevih pacientih zniĉana v subkortikulranih nevronih, medtem ko je nivo ekspresije v korteksu in hipokampusu nespremenjen.
Pri delu na eksperimentalnih ĉivalskih modelih so odkrili, da vodi dodajanje NGF v odrasle moĉgane do manjĝe izgube holinergiœnih celic in reverzno holinergiœno atrofijo pri staranju. Na osnovi takih raziskav se je porodila domneva, da bi bilo lahko dovajanje NGF potencialna terapija pri Alzheimerjevih bolnikih. Moĉen naœin modu-lacije izraĉanja subkotikalnih nevronov je genska terapija, s katero doseĉemo lokaliziran, ciljan in omejen vnos NGF v moĉgane (19).
3.3 Genska terapija z rastnim faktorjem
Terapija z NGF naj bi predvsem doprinesla k regeneraciji subkortiku-larnih bazalnih holinergiœnih nevronov, kar predstavlja le delno regeneracijo nevronov. Za uspeĝno zdravljenje bo z vnosom veœ specifiœnih rastnih faktorjev potrebno ciljati tudi druge populacije nevronov. Koncept genskega vnosa rastnih faktorjev je lahko pomemben tudi pri zdravljenju drugih nevrodegenerativnih boleznih, npr. Parkinsonove bolezni, Huntingtonove bolezni in amiotrofne lateralne skleroze (20).
Julija 2004 se je priœela izvajati 1. faza kliniœne ĝtudije genske terapije z ĉivœnim rastnim faktorjem CERE-110 (21). Kot vektor se uporablja tip adeno-priduĉenega virusa. Namen prve faze ĝtudija je doloœiti
farm vestn 2005; 56 73
Strokovni œlanki - Professional Articles
potrebno dozo, tolerabilnost in bioloĝko aktivnost genskega zdravila oziroma uœinkovitost in varnost genskega transferja. V 1. fazi kliniœne ĝtudije bo vkljuœenih ĝest pacientov z milejĝo obliko bolezni. CERE-110 je oznaka za zdravilo, ki ima rekombinanten NGF vkljuœen v adeno-pridruĉen tip vektorja. Pacienti bodo podvrĉeni injeciranju genskega zdravila CERE-110 v regije moĉganov. Aplikacija zdravila je ciljana obojestransko v toœno predpisan segment moĉganov. Predviden je vnos dveh doz zdravila, nato ĝtiritedensko opazovanje. V primeru, da se bo zdravilo izkazalo za varno, bodo aplikacijo po treh mesecih ponovili. Opazovali bodo serijo varnostnih in nevrofizioloĝkih parametrov. Glavno vpraĝanje je, ali bo NGF znaœilno zmanjĝal upad kognitivnih funkcij in ali NGF poveœa aktivnost preostalih holinergiœnih nevronov v moĉganih zdravljenih pacientov.
4  Regulatorni postopki pri genski terapiji
Evropska agencija za zdravila (EMEA, European Medical Agency) ima oblikovano telo strokovnjakov za gensko terapijo, ki izdaja pri-poroœila na podroœju genske terapije. Sicer pa so v drĉavah evropske unije dovoljenja za izvajanje kliniœnih ĝtudij genske terapije v pristojnosti nacionalnih komisij za biomedicinsko etiko oziroma relevantnih ministrstev. Zakonodaja, interpretacija in dovzetnost za nove terapije se med posameznimi drĉavami EU razlikujejo (22). V ZDA izvajata nadzor nad postopki genske terapije FDA in NIH oziroma njegovo svetovalno telo RAC, ki svetuje o primernosti postopkov genske terapije, vodi pa tudi javno dostopno bazo podatkov o kliniœnih preskusih (23).
5  Zakljuœek
Razvoj genskih zdravil in terapevtskih postopkov je v razmahu, predvsem v letih po konœanem sekveniranju humanega genoma, ko so postali znani ĝtevilni novi geni in smo v fazi odkrivanja genskih osnov patologij. Tako razvoj tehnologije rekombinantne DNA in tehnologij visokih zmogljivosti kakor tudi poznavanje molekularnega ustroja celice omogoœata uspeĝne in ciljane manipulacije genetskega materiala od genomske DNA do informativne RNA (mRNA). Kljub ogromnemu napredku znanja in razumevanja mehanizmov pa je uveljavitev genske terapije v kliniœni praksi ĝe vedno v fazi kliniœnih testiranj in pod ostrim nadzorom strokovnih in regulatornih oblasti. Kritike, da genska terapija ne izpolnjuje priœakovanega hitrega napredka, so dejansko opraviœljive z velikim ĝtevilom razliœnih kliniœnih poskusov, ki se ukvarjajo z reĝevanjem kompleksnih genskih disfunkcij, kot so rakasta obolenja in nevrodegenerativne motnje.
6  Literatura
1.    Blaese RM, Culver KW, Anderson WF. The ADA human gene therapy clinical protocol. Hum Gene Ther 1990; 1: 331-337.
2.    Cavazzana-Calvo M, Fischer A. Efficacy of gene therapy for SCID is being confirmed. Lancet 2004; 364: 2155-2156.
3.    Cavazzana-Calvo M, Thrasher A, Mavilio F. The future of gene therapy. Nature 2004; 427: 779-781.
4.    Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey-Abina S, Fischer A. Gene therapy of X-linked severe combined immunodeficiency. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2002; 2: 507-509.
5.    Cellular & Gene Therapy. (10. 3. 2005). US Food and Drug Administration. Pridobljeno 1. 4. 2005 s svetovnega spleta: .
6.    Crofts C, Krimsky S. Emergence of a scientific and commercial research and development infrastructure for human gene therapy. Hum Gene Ther 2005; 16: 169-177.
7.    Mueller RF. Emery’s Elements of Medical Genetics. 11th ed. Leeds: Churchill Livingstone, 2001.
8.    Glenys T. Mapping of disease loci. V: Kalow W. Pharmacogenomics. 1st ed. New York: Marcel Dekker, Inc., 2001.
9.    Romero NB, Braun S, Benveniste O et al. Phase I study of dystrophin plas-mid-based gene therapy in Duchenne/Becker muscular dystrophy. Hum Gene Ther 2004; 15: 1065-1076.
10.  Suto R, Tominaga K, Mizuguchi H et al. Dominant-Negative Mutant of C-Jun Gene Transfer: A Novel Therapeutic Strategy for Colorectal Cancer. Gene Therapy 2004; 11: 187-193.
11. Ill CR, Chiou HC. Gene Therapy Progress and Prospects: Recent progress in transgene and RNAi expression cassettes. Gene Ther 2005; 7: [pred objavo]
12.  Gardlik R, Palffy R, Hodosy J et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Med Sci Monit 2005; 11: RA110-121.
13.  Huwyler J, Wu D, Pardridge WM. Brain drug delivery of small molecules using immunoliposomes. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93:14164-14169.
14.Gene Therapy. (19. 10. 2004). Human Genome Program. Pridobljeno 29. 4. 2005 s svetovnega spleta:
http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/genether apy.shtml.
15.  Mlinariœ-Raĝœan I. Molekularni mehanizmi programirane celiœne smrti. Farm Vestn 2000; 51: 295-299.
16.  Humpel C, Weis C. Nerve growth factor and cholinergic CNS neurons studied in organotypic brain slices. Implication in Alzheimer’s disease? J Neural Transm Suppl 2002; (62): 253-263.
17.  The role of nerve growth factor receptors in cholinergic basal forebrain degeneration in Alzheimer disease. J Neuropathol Exp Neurol 2005; 64: 263-272.
18.  Ullrich A, Gray A, Berman C et al. Human beta-nerve growth factor gene sequence highly homologous to that of mouse. Nature 1983;303: 821-825.
19.  Tuszynski MH, Sang H, Yoshida K et al. Recombinant human nerve growth factor infusions prevent cholinergic neuronal degeneration in the adult primate brain. Ann Neurol 1991; 30: 625–636.
20.  Tuszynski MH, Sang H, Alksne J et al. Growth factor gene therapy for Alzheimer disease. Neurosurg Focus 2002; 13:1- 5.
21.  CERE-110 in Subjects with Mild to Moderate Alzheimer’s Disease. ClinicalTrials.gov. (25. 5. 2005). US National Institutes of Health. Pridobljeno 29. 4. 2005.s svetovnega spleta: .
22.  Report from the CHMP Gene Therapy Expert Group Meeting. (27. 10. 2004). EMEA/CHMP/ 127803/2004.
23.  NIH and FDA Launch New Human Gene Transfer Research Data System. NIH News. (26. 3. 2004). National Institutes of Health. Pridobljeno 1. 4. 2005 s svetovnega spleta: .
farm vestn 2005; 56