Zdrav Vestn 2007; 76: 669–75 669 Strokovni prispevek/Professional article CITOKINSKI SISTEM OPG/RANKL/RANK PRI LEDVIČNI OSTEODISTROFIJI OPG/RANKL/RANK CYTOKINE SYSTEM IN RENAL OSTEODYSTROPHY Ivica Avberšek-Lužnik1, Breda Pečovnik-Balon2, Anton Adamlje3, Igor Rus4, Janja Marc5 1 Enota za laboratorijsko diagnostiko, Splošna bolnišnica Jesenice, Cesta maršala Tita 112, 4270 Jesenice 2 Oddelek za nefrologijo, Univerzitetni klinični center Maribor, Ljubljanska 5, 2000 Maribor 3 Center za dializo, Splošna bolnišnica Trbovlje, Rudarska cesta 9, 1420 Trbovlje 4 Center za dializo, Splošna bolnišnica Jesenice, Cesta maršala Tita 112, 4270 Jesenice 5 Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana Izvleček Izhodišča Metode Rezultati Zaključki Ledvična osteodistrofija je pogost zaplet pri bolnikih s končno ledvično odpovedjo, ki se zdravijo s hemodializo (HD). Ključni regulatorji kostnega obrata pri ledvični osteodistro-fiji, kalciotropni hormoni, delujejo preko sistema OPG/RANKL/RANK. Delovanje tega sistema modulirajo interlevkini, kalcitriol in paratiroidni hormon (PTH). Namen naše raziskave je dokazati, da ima ta sistem pomembno vlogo v patogenezi ledvične osteodistrofije in predstavlja enega od mehanizmov delovanja PTH na kostno tkivo. V raziskavo smo vključili 106 HD bolnikov (s povprečno starostjo 60 let) in 50 zdravih oseb (s povprečno starostjo 64 let). V serumskih vzorcih bolnikov in kontrolnih oseb smo izmerili koncentracije osteoprotegerina (OPG), liganda receptorja za aktivator jedrnega dejavnika ?B (RANKL), na tartarat rezistentne kisle fosfataze 5b (TRAP 5b), prečnih povezovalcev kolagena (CTX), kostne alkalne fosfataze (BALP), osteokalcina (OC) in PTH. Primerjali smo rezultate meritev pri kontrolni skupini in bolnikih na HD. Ocenili smo povezavo med OPG in RANKL ter kazalci kostnega obrata. Analizirali smo tri najpogostejše polimorfizme v promotorski regiji OPG in ovrednotili njihov vpliv na koncentracije OPG. Za statistično analizo smo uporabili statistični program SPSS za okolje Windows. Pri bolnikih na HD so približno 3-krat višje serumske koncentracije OPG (0,804 µg/l) kot pri zdravih osebah (0,272 µg/l), serumske koncentracije RANKL (1,36 pmol/l) pa 1,66-krat višje (0,82 pmol/l). Serumske koncentracije OPG se pri bolnikih, ki se zdravijo s kalcitri-olom, ne razlikujejo značilno (p = 0,355), medtem ko so koncentracije RANKL pri bolnikih s terapijo višje (p = 0,001) kot pri tistih brez nje. Tudi pri razdelitvi bolnikov na HD v tercile PTH so značilno višje koncentracije OPG v spodnjem, RANKL pa v zgornjem tercilu (p < 0,001). OPG ni koreliral s kazalci razgradnje, med kazalci tvorbe pa samo z osteokalci-nom. RANKL je v nasprotju z OPG dobro koreliral s PTH, z OC in CTX. Trije polimorfizmi (149 T › C, 163 A › G, 950 T › C) v promotorju gena za OPG ne vplivajo na izražanje gena in s tem posledično na njegove serumske koncentracije. Naši rezultati so potrdili dokaze študij in vitro o inhibicijskem delovanju PTH na tvorbo OPG in o njegovih stimulatornih učinkih na tvorbo RANKL. Koncentracije OPG so bile najvišje pri bolnikih na HD v prvem, koncentracije RANKL pa v tretjem tercilu PTH. Pri bolnikih na HD z visokim obratom je zaradi učinkov PTH porušeno ravnotežje v sistemu OPG/RANKL/RANK in pospešena razgradnja kostnega tkiva. Rezultati potrjujejo vpletenost citokinskega sistema OPG/RANKL/RANK v patogenezo ledvične osteodistrofije. Avtorica za dopisovanje / Corresponding author: Asist. dr. Ivica Avberšek-Lužnik, mag. farm., spec. med. biokem., Enota za laboratorijsko diagnostiko, Splošna bolnišnica Jesenice, Cesta maršala Tita 112, 4270 Jesenice, e-mail: ivica.avbersekluznik@gmail.com 670 Zdrav Vestn 2007; 76 Ključne besede osteoprotegerin (OPG); ligand receptorja za aktivator jedrnega dejavnika kB (RANKL); ledvična osteodistrofija Abstract Background Methods Results Conclusions Key words Renal osteodystrophy is one of the most common complications affecting patients with endstage renal disease treated with hemodialysis (HD). The action of calciotropic hormones in renal osteodystrophy is regulated by the OPG/RANKL/RANK system. Its function is modulated by interleukines, calcitriol and parathyroid hormone (PTH).The aim of our study was to confirm that this system is involved in the pathogenesis of renal osteodystrophy and supports the mechanism of PTH action on bone. 106 HD patients (mean age 60 years) and 50 healthy volunteers (mean age 64 years) were enrolled in the study. In serum samples of patients and controls we determined concentrations of OPG, RANKL, tartarat resistant acid phosphatase 5b (TRAP 5b), serum C-terminal telopeptide cross-links of type I collagen (CTx), bone specific alkaline phosphatase (BALP), osteocalcin (OC) and parathyroid hormone (PTH). We compared serum measurements of HD patients and controls and assessed the correlation of OPG and RANKL with bone markers. The most frequent OPG promotor gene polymorphisms were also determined. SPSS 12.1 for Windows was used for statistical analysis. Median OPG concentrations were approximately three times higher in HD patients (0.804 µg/l) than in healthy volunteers (0.272 µg/l). Mean serum RANKL concentrations were 1.66- fold higher in HD patients (1.36 pmol/l) than in controls (0.82 pmol/l). Serum RANKL levels significantly differed between patients with and without calcitriol therapy (p = 0.001). After dividing HD patients into tertiles according to PTH, we observed significantly higher OPG values in the lower and RANKL in the upper tertile (p < 0.001). OPG did not correlate with bone resorption markers. Only weak correlation of bone formation markers with osteocalcin was noted. In contrast to OPG, RANKL correlated well with PTH, OC and CTX. OPG promoter gene polymorphisms (149 T › C, 163 A › G, 950 T › C) do not influence OPG expression and consequently its serum levels. Our results support the outcomes of in vitro studies of PTH inhibitory action on OPG and PTH stimulatory action on RANKL synthesis. The highest OPG values were observed in the first tertile and RANKL levels in the third PTH tertile. In HD patients with high bone turnover, PTH action leads to disbalance in OPG/RANKL/RANK and consequently to accelerated bone resorption. We proved the role of the OPG/RANKL/RANK system in the pathogene-sis of renal osteodystrophy. osteoprotegerin (OPG); receptor activator of nuclear factor ?B ligand (RANKL); renal osteodystrophy Uvod Ledvična osteodistrofija je pogost zaplet pri bolnikih s končno ledvično odpovedjo, ki se zdravijo s hemo-dializo in peritonealno dializo. Predstavlja skupno ime za spremembe v kostni remodelaciji pri dializnih bolnikih. Dinamika kostne remodelacije je odvisna od aktivnosti kostnih celic in delovanja lokalnih medi-atorjev, npr. citokinov in rastnih dejavnikov, ki uravnavajo komunikacijo med osteoklasti in osteoblasti. Nastajajo v kostnih celicah in celicah hematopoetske-ga tkiva. Citokini in rastni dejavniki, ki so vpleteni v proces kostne remodelacije, so: IL-1, IL-6, IL-11, TNF-?, TGF 3 in IGF. IL-1 in TNF-? pospešujeta proliferaci-jo in diferenciacijo predhodnikov osteoklastov, IL-6 in IL-11 pa diferenciacijo dozorevajočih osteoklastov. TNF-? vpliva na razgradnjo kosti s pospeševanjem tvorbe IL-6, na tvorbo IL-6 pa deluje tudi PTH.1–3 Mon-talban, Haughers in sodelavci4, 5 so odkrili zvišano eks- presijo IL-1, TNF-?, IL-6 in njihovih receptorjev pri kronični ledvični odpovedi. Ti dokazi potrjujejo pomembno vlogo naštetih citokinov v patogenezi ledvične osteodistrofije. Študija Coena in sodelavcev6 kaže na vse večjo vlogo sistema OPG/RANKL/RANK v procesu osteoklastoge-neze. Osteoprotegerin (OPG) in ligand receptorja za aktivator jedrnega dejavnika ?B (RANKL) sta proteina osteoblastov, receptor za aktivator jedrnega dejavnika ?B (RANK) pa protein v osteoklastih. OPG predstavlja topni receptor za RANKL. Blokira interakcijo RANKL z RANK in tako zavira diferenciacijo oste-oklastov in napredujočo razgradnjo kostnega tkiva. Novejše razlage patogenetskih mehanizmov nastanka ledvične osteodistrofije se nagibajo k možnosti, da ključni regulatorji kostnega obrata pri tej bolezni, npr. kalciotropni hormoni, delujejo preko sistema OPG/ RANKL/RANK. Avberšek-Lužnik I, Pečovnik-Balon B, et al. Citokinski sistem OPG/RANKL/RANK pri ledvični osteodistrofiji 671 Dokazano je, da delovanje sistema OPG/RANKL/ RANK modulirata poleg interlevkinov tudi paratiro-idni hormon (PTH) in kalcitriol. Mehanizmi delovanja naštetih molekul niso razjasnjeni. Ker tvorbo OPG zavirata PTH in kalcitriol, je velika verjetnost, da so spremembe v ravnotežju sistema OPG/RANKL/RANK glavni vzrok za spremembe v kostni remodelaciji pri ledvični osteodistrofiji in pri drugih kostnih bole-znih.7–9 Namen naše raziskave je dokazati, da ima sistem cito-kinov OPG/RANKL/RANK pomembno vlogo v pato-genezi ledvične osteodistrofije in predstavlja enega od mehanizmov delovanja PTH na kostno tkivo. In vitro študije na celičnih kulturah so namreč pokazale, da delovanje sistema OPG/RANKL/RANK modulira PTH, ki pospešuje tvorbo RANKL in zmanjšuje tvorbo OPG. Preiskovanci in metode Preiskovanci V raziskavo smo vključili 106 dializnih bolnikov (s povprečno starostjo 60 let) in 50 zdravih oseb (s povprečno starostjo 64 let). Dializni bolniki so bili iz treh slovenskih centrov za dializo: Jesenice (35), Trbovlje (31) in Maribor (40). S postopki hemodialize se je zdravil 101 bolnik, z ambulantno peritonealno dializo pa 5 bolnikov. Povprečno trajanje dialize je bilo 57,8 meseca. Vzroki za končno ledvično odpoved pri hemodiali-znih (HD) bolnikih so bili različni: kronični glomeru-lonefritis, hipertenzivna nefroskleroza, kronični pielo-nefritis, analgetska nefropatija, policistična degeneracija ledvic in diabetična nefropatija. Bolniki so bili dializirani 3-krat tedensko, fosfatne ve-zalce je prejemalo 98 bolnikov v odmerkih, ki so bili individualno odrejeni (kalcijev karbonat je prejemalo 65 bolnikov, aluminijev hidroksid 13 bolnikov, oba navedena vezalca 14 bolnikov, sevelamer hidroklo-rid 6 bolnikov). Vitamin D terapijo (Rocaltrol, Calci-jex, D3 granulat) je prejemalo 26 bolnikov v intraven-skih odmerkih od 0,25 do 1 µg/dan po dializi. Preostala ledvična funkcija je bila ohranjena pri 32 bolnikih in je znašala v povprečju 0,05 ± 0,03 ml/s/1,73 m.2 Vsi preiskovanci so podpisali obrazec za prostovoljno vključitev v raziskavo. Pridobili smo tudi dovoljenje Komisije za medicinsko etična vprašanja Slovenije. V Razpredelnici 1 so zbrane osnovne značilnosti preiskovancev. Vzorci seruma in plazme Zaradi cirkadianih ritmov izločanja večine biokemičnih kazalcev smo venski odvzem krvi izvršili med 6. in 9. uro zjutraj pred dializo. Polno kri, odvzeto z anti-koagulantom (K3EDTA), in vzorce serumov smo do analize zamrznili na –70 °C. Vzorci krvi in izolacija DNK DNK so osamili iz levkocitov venske krvi v laboratoriju Katedre za klinično biokemijo na Fakulteti za farmacijo. Vzorci krvi so bili odvzeti z antikoagulantom (K3EDTA). Osamitev DNK je potekala s postopkom izsoljevanja.10 Merjenje biokemijskih kazalcev V biokemičnem laboratoriju Splošne bolnišnice Jesenice smo z imunokemijskimi metodami izmerili koncentracije sledečih kazalcev kostne presnove: OPG, RANKL, na tartarat odporne kisle fosfataze 5b (TRAP 5b), prečnih povezovalcev kolagena (CTX), kostne alkalne fosfataze (BALP), osteokalcina (OC) in PTH. Statistična analiza Rezultate smo izrazili kot povprečno vrednost s stan-_ dardno deviacijo ( x ± SD) in kot mediano z območjem (min – max vrednost) pri parametrih, katerih porazdelitev ni bila normalna. Porazdelitev rezultatov posameznega biokemičnega kazalca smo testirali s Kol-mogorov-Smirnovim testom. Za celovito statistično obdelavo smo uporabili naslednje teste: Oneway ANOVA, Kruskal-Wallisov test in Spearmanovo korelacijo. Meja statistične značilnosti je bila pod 0,05. Uporabili smo statistični program SPSS 12.1 za okolje Windows (SPSS, Inc. Chicago, USA). Rezultati OPG in RANKL ter serumski kazalci kostnega obrata pri bolnikih na HD Serumske kazalce kostnega obrata (OPG, RANKL, TRAP 5b, CTX, BALP, OC in PTH) smo izmerili pri 50 zdravih osebah in 106 bolnikih na HD. Osnovne značilnosti preiskovancev smo prikazali v Razpr. 1 in 2. Zaradi vpliva kalcitriola in PTH na tvorbo OPG in RANKL smo bolnike na HD razdelili v podskupini s terapijo s kalcitriolom in brez. Za ocenjevanje sprememb v kostni presnovi zdravniki še vedno najpogosteje uporabljajo plazemske koncentracije PTH, Razpr. 1. Osnovne značilnosti preiskovancev, zdravih oseb in HD bolnikov z in brez terapije s kalcitriolom. Table 1. General characteristics of patients, controls and HD patients without and with calcitriol therapy. Kontrolne Podskupina I Podskupina II osebe (brez terapije) (s terapijo) Subgroup I Subgroup II (without therapy) (with therapy) N 50 80 26 Moški: N (%) Males 26 (52,0) 38 (47,5) 16 (61,5) Ženske: N (%) Females 24 (48,0) 42 (52,5) 10 (38,5) Starost (leta) Age (years) 62 ± 17,1 59,7 ± 13,3 60,1 ± 12,9 HD (meseci) HD (months) - 35 (6-240) 42,5 (4-384) Fosfati (mmol/l) Phosphates 1,22 ± 0,16 1,66 ± 0,39 1,72 ± 0,35 Ca2+ (mmol/l) 2,34 ± 0,13 2,39 ± 0,24 2,34 ± 0,14 CaXP (mmol2/l2) 2,85 ± 0,15 3,96 ± 0,31 4,02 ± 0,21 Diureza (ml) Diuresis - 295 ± 240 240 ± 92 672 Zdrav Vestn 2007; 76 Razpr. 2. Osnovne značilnosti preiskovancev v terci-lih PTH. Table 2. General characteristics of patients in PTH ter-tiles. I. tercil PTH I II. tercil PTH II III. tercil PTH III Moški: N (%) Males Ženske: N (%) Females Starost (leta) Age (years) HD (meseci) HD (months) Fosfati (mmol/l) Phosphate Ca2+ (mmol/l) CaXP mmol2/l2 PTH (µg/l) Diureza (ml) Diuresis 26 14 (17,5) 12 (15,0) 65,3 ± 13,2 28 (6-231) 27 13 (16,3) 14 (17,5) 56,9 ± 12,8 35 (6-185) 1,59 ± 0,33 1,57 ± 0,40 2,41 ± 0,30 3,83 ± 0,32 29,3-103,0 2,40 ± 0,24 3,76 ± 0,32 109,7-263,0 270 ± 225 253 ± 245 27 11 (13,7) 16 (20,0) 57,2 ± 12,6 46 (3 - 240) 1,82 ± 0,42 2,38 ± 0,19 4,33 ± 0,31 362,0-1700,0 362± 187 0,048 0,033 0,039 0,446 0,083 0,325 0,079 < 0,001 0,611 Razpr. 3. Serumske koncentracije OPG, RANKL in kostnih kazalcev pri bolnikih na HD in kontrolnih osebah. Table 3. OPG, RANKL and bone markers in HD patients and controls. Parameter HD bolniki Kontrolne osebe Parameter HD patients Controls p N = 80 N = 50 RANKL (pmol/L) OPG (µg/L) PTH (pmol/L) CTX (µg/L) TRAP-5b (U/L) bALP (mkat/L) OC (µg/L) 1,36 ± 0,39 0,804 (0,342-3,144) 18,6 (3,1-310,2) 1,79 (0,43-6,85) 4,04 ± 1,35 0,51 (0,13-2,98) 18,6 (1,0-195,8) 0,82 ± 0,70 < 0,001 0,272 (0,109-0,552) < 0,001 3,9 (2,1-7,2) < 0,001 0,34 (0,22-0,46) < 0,001 2,98 ± 0,89 < 0,001 0,37 (0,18-0,57) < 0,001 7,6 (2,2-11,1) < 0,001 Razpr. 4. Serumske koncentracije OPG in RANKL pri dializnih bolnikih s terapijo z vitaminom D in brez. Table 4. OPG and RANKL in dialysis patients with and without calcitriol therapy. Parameter Bolniki s terapijo Bolniki brez terapije Parameter Patients with therapy Patients without therapy p n = 26 n = 80 zato smo se odločili, da bolnike na HD brez zdravljenja z vitaminom D razdelimo v tercilne skupine po vrednosti PTH (Razpr. 2). Tako smo zagotovili enotno porazdelitev bolnikov na znotraj tercilnih skupin, izognili pa smo se delitvi glede na koncentracije PTH, ki so jih, danes pa redkeje, uporabljali za delitev ledvične osteodistrofije v različne podtipe. Rezultati meritev biokemičnih parametrov pri kontrolni skupini in bolnikih na HD so podani v Razpr. 3. Mediana serumske koncentracije OPG je pri HD bolnikih 2,96-krat višja kot pri kontrolni skupini. Tudi povprečna vrednost serumske koncentracije RANKL je pri bolnikih na HD višja kot pri kontrolni skupini (1,66-krat). Pri bolnikih na HD so poleg OPG in RANKL značilno višje tudi koncentracije kazalcev tvorbe (BALP, OC) in kazalcev razgradnje (TRAP 5b, CTX), kar neodvisno potrjuje visok kostni obrat pri bolnikih na HD. Pri bolnikih na HD, ki prejemajo kalcitriol, smo dokazali značilno višje vrednosti RANKL, vrednosti OPG in ostalih kazalcev pa niso bile značilno višje (Razpr. 4). Zelo zanimivo, teoretično pričakovano in statistično značilno (p < 0,001) so se gibale koncentracije OPG in RANKL v PTH tercilnih skupinah (Razpr. 5). Koncentracije OPG so bile v prvem tercilu višje kot v tretjem, RANKL pa obratno (Sl. 1 in 2), kar kaže na učinke PTH, ki zavira tvorbo OPG, tvorbo RANKL pa pospešuje. Razpr. 5. Serumske koncentracije OPG, RANKL ter kostnih kazalcev v tercilih PTH. Table 5. OPG, RANKL and bone markers in PTH tertiles. OPG (µg/L) RANKL (pmol/L) PTH (pmol/L) TRAP 5b (U/L) CTX (µg/L) BALP (U/L) OC (µg/L) 0, 831 (0,534-2,196) 0, 804 (0,342-3,144) 0,355 1,65 ± 0,44 24,5 (4,1-226,4) 4,36 ± 1,74 1,97 (0,87-6,33) 0,60 (0,21-3,76) 27,0 (7,3-294,8) 1,36 ± 0,39 18,6 (23,1-310,2) 4,04 ± 1,35 1,79 (0,43-6,85) 0,51 (0,13-2,98) 18,6 (1,0-294,8) 0,001 0,088 0,697 0,355 0,147 0,072 ,1 OPG I vs. OPG III, p < 0,001 3000,0- 2000,0- < >1 J o1 1000,0- 0,0- OPG I OPG II OPG III Sl. 1. Serumske koncentracije OPG v tercilih PTH. Figure 1. Serum OPG in PTH tertiles. PTH I PTH II PTH III p N 26 27 27 RANKL (pmol/L) 1,23 ± 0,26 1,27 ± 0,42 1,54 ± 0,39 < 0,001 OPG (µg/L) 0,960 (0,498-3,144) 0,744 (0,360-1,884) 0,792 (0,342-1,62) < 0,001 BALP (µkat/L) 0,40 (0,13-1,54) 0,49 (0,22-0,98) 0,76 (0,16-2,98) < 0,001 OC (µg/L) 11,1 (1,0-81,0) 18,8 (5,5-73,4) 59,8 (9,4-195,8) < 0,001 TRAP 5b (U/L) 3,73 ± 1,00 3,83 ± 1,17 4,56 ± 1,67 < 0,001 CTX (µg/L) 1,33 (0,43-3,27) 1,75 (0,51-3,27) 3,1 (0,78-6,85) < 0,001 p Avberšek-Lužnik I, Pečovnik-Balon B, et al. Citokinski sistem OPG/RANKL/RANK pri ledvični osteodistrofiji 673 2,50- 2,0- 1,50- 1,00- 0,50- RANKLIvs. FRANKLIN, p < 0,0 O1 J1 O1 t 31 RANKLI RANKLII RANKL III Sl. 2. Serumske koncentracije RANKL v tercilih PTH. Figure 2. Serum RANKL in PTH tertiles. Korelacijske študije V nadaljevanju študije smo želeli oceniti povezavo med OPG in RANKL ter ostalimi biokemijskimi kazalci kostnega obrata (Razpr. 6). Več avtorjev11, 12 je dokazalo negativno korelacijo med OPG in PTH. Pri naših bolnikih je ta povezava negativna in neznačilna. Spearmanova korelacija ne kaže tesnih povezav med OPG in kazalci tvorbe oz. razgradnje. Tudi RANKL slabo korelira z merjenimi parametri. RANKL v nasprotju z OPG dobro korelira s PTH (r = 0,322), z OC (r = 0,231) in s CTx (r = 0,232). Vpliv polimorfizmov v genu za OPG na njegove serumske koncentracije Spremembe v promotorju gena za OPG bi lahko vplivale na vezavo različnih transkripcijskih dejavnikov in spremenile izražanje OPG in posledično tudi njegove serumske koncentracije ter učinke v kostnem mikrookolju. Z analizo polimorfizmov dolžin restrik-cijskh fragmentov (RFLP) smo določili polimorfizme (149 T › C, 163 A › G, 950 T › C) v promotorju gena za OPG (Razpr. 7). Za nobenega od preučevanih poli-morfizmov ni statistično značilne povezave s serumskimi koncentracijami OPG. Razpr. 7. Serumske koncentracije OPG pri dializnih bolnikih za polimorfizme 149T > C, 163A > G in 950T > C na genu za OPG. Table 7. Serum OPG and OPG polymorphisms 149T > C, 163A > G and 950T > C. Polimorfizem Genotip Frekvenca (%) Polymorphism Genotype Frequency OPG (µg/l) TT 94,1 0,807 (0,320-1,884) 149T > C TC 5,9 0,850 (0,334-2,028) 0,622 CC 0 / AA 78,6 0,725 (0,411-1,790) 163A > G AG 20,1 0,813 (0,420- 2,140) 0,705 GG 1,3 0,792 TT 30,1 0,760 (0,512-1,282) 950T > C TC 45,2 0,827 (0,344-1,884) 0,901 CC 24,7 0,790 (0,460-1,506) Razpravljanje Naši rezultati se ujemajo z dokazi Haasa,11 ki je dobil značilno nižje serumske koncentracije OPG pri bolnikih na HD z visokim kostnim obratom v primerjavi s tistimi, ki so imeli nizek kostni obrat. Haas je svoje izsledke podprl z rezultati kostne histomorfometrije, ki kažejo na nižjo stopnjo mineralizacije in hkrati na visoko aktivnost osteoklastov in osteoblastov pri bolnikih na HD s PTH nad 47,6 pmo/l. Pri teh bolnikih so bile koncentracije značilno nižje kot pri bolnikih s PTH pod 47,6 pmol/l. Kombinacijo PTH in OPG je priporočal kot uporabno pri napovedovanju ledvične oste-odistrofije z visokim kostnim obratom. Do enakih zaključkov je leta 2005 prišla tudi naša skupina,12 nasprotno pa je Coen13 dokazal rahlo, vendar neznačilno višje koncentracije OPG v serumu bolnikov z visokim kostnim obratom, zato obstaja dvom o diagnostični uporabnosti OPG pri napovedovanju kostnega obrata pri bolnikih na HD. Potrebne so načrtovane študije o diagnostični uporabnosti OPG. In vitro študije so že potrdile vlogo OPG pri negativnem uravnavanju razgradnje kostnega tkiva. O zviša-nih serumskih koncentracijah OPG pri bolnikih z ledvično osteodistrofijo so poročali Haas11 in Kazama14 marca 2002, Coen13 junija 2002 ter oktobra 2002 in marca 2005 naša skupina.12, 15 Avtorji enotno ocenjujejo, da so zvišane koncentracije OPG pri bolnikih na HD posledica učinkov PTH, ki ne pospešuje samo razgradnje kosti, temveč tudi mineralizacijo kosti z večanjem števila osteoblastov, v katerih poteka tvorba OPG. Nasprotno pa študije na genski ravni kažejo, da Razpr. 6. Korelacijski koeficienti testiranja povezav med OPG in kazalci kostnega obrata pri dializnih bolnikih. Table 6. Correlation studies between OPG and markers of bone turnover in dialysis patients. OPG RANKL PTH bALP OC TRAP CTX OPG - 0,031 - 0,118 0,024 -0,359* -0,092 -0,112 RANKL 0,031 - 0,322** 0,174 0,231* 0,048 0,232* PTH -0,118 0,322** - 0,474** 0,670** 0,361** 0,559** bALP 0,024 -0,075 0,474** - 0,544** 0,640** 0,590** OC -0,359** 0,231* 0,670** 0,544** - 0,441** 0,743** TRAP -0,092 -0,048 0,361** 0,640** 0,441** - 0,546** CTX -0,112 0,232* 0,559** 0,590** 0,743** 0,546** - p * p < 0,05, ** p < 0,01 674 Zdrav Vestn 2007; 76 PTH zavira ekspresijo gena za OPG in posledično tvorbo OPG. To pomeni, da bi pri dializnih bolnikih z visokim kostnim obratom dejansko lahko pričakovali nižje vrednosti OPG kot pri tistih z nizkim obratom. To je eden od razlogov, da smo v študiji preiskovance razdelili v tercile glede na koncentracije PTH. Zvišana koncentracija OPG v obtoku je lahko posledica kopičenja zaradi motenega izločanja preko ledvic, kar potrjuje normaliziranje serumskih koncentracij OPG pri ledvičnih bolnikih po uspešni presaditvi ledvic.16 Sedemindvajset naših preiskovancev (5 v prvem, 8 v drugem in 14 v tretjem tercilu) je imelo še delno ohranjeno ledvično funkcijo. Primerjava diurez pri preiskovancih med tercili ni pokazala značilnih razlik, kljub temu pa so se serumske koncentracije OPG in RANKL značilno razlikovale, zato menimo, da kopičenje teh proteinov v obtoku ni posledica motenega izločanja. Višje vrednosti OPG si razlagamo kot posledico kompenzacijskega odgovora organizma na porušeno homeostazo kalciotropnih hormonov (PTH, kalcitriol). Kalciotropni hormoni modulirajo delovanje sistema OPG/RANK/RANKL ter stimulirajo aktivnost osteoklastov in osteoblastov na celični in molekularni ravni. To delovanje potrjujejo tudi značilno višje koncentracije kazalcev tvorbe in razgradnje. Rezultati naše študije so pokazali, da so pri bolnikih na HD približno 3-krat višje serumske koncentracije OPG (0,804 µg/L) kot pri zdravih osebah (0,272 µg/L), serumske koncentracije RANKL (1,36 pmol/l) pa 1,66-krat višje (0,82 pmol/l). Serumske koncentracije OPG se pri bolnikih, ki prejemajo kalcitriol, ne razlikujejo značilno (p = 0,355), medtem ko so koncentracije RANKL pri bolnikih s terapijo višje (p = 0,001) kot pri tistih brez nje. Tudi pri razdelitvi bolnikov na HD v PTH tercile so značilno višje koncentracije OPG v spodnjem tercilu, RANKL pa v zgornjem tercilu (p < 0,001). In vitro študije so potrdile zaviralne učinke PTH in kalcitriola na tvorbo OPG oz. njuno stimulacijsko delovanje na tvorbo RANKL. Zaradi teh vplivov je lahko porušeno ravnotežje v sistemu OPG/RANK/RANKL, pospešena osteoklastogeneza in razgradnja kostnega tkiva. V celoti pa ne moremo izključiti možnosti, da je zvišan OPG v obtoku posledica nastajanja v drugih organih. Več avtorjev17, 18 je namreč dokazalo, da tvorba OPG poteka tudi v celicah pljuč, srca, žilja in ledvic, zvišuje se pri vnetjih in s starostjo. Več raziskovalcev je dokazalo, da zdravljenje z vitaminom D vpliva na izražanje oziroma tvorbo OPG in RANKL. Serumske koncentracije vitamina D se znižajo v zgodnji fazi razvoja ledvične odpovedi. Krajši čas je izraženo kompenzacijsko delovanje PTH, ki pospešuje tvorbo kalcitriola. Ko delovanje PTH odpove, nastopi čas za uvedbo zdravljenja s kalcitriolom, ki je povezano s strogim nadzorom nad pojavom hiper-kalciemije in razvojem adinamične kostne bolezni. Kalcitriol pospešuje izražanje RANKL v dozorevajo-čih preosteoblastih in izražanje OPG v zrelih osteobla-stih.19, 20 Zvišan RANKL pri bolnikih na HD z zdravljenjem ni le posledica delovanja PTH, ampak dodatnih učinkov kalcitriola, ki vpliva na nastajanje preosteobla-stov in na sorazmerno večjo tvorbo RANKL. Ker kal-citriol pospešuje tudi dozorevanje osteoblastov, po- sredno vpliva tudi na tvorbo OPG, ki je pri bolnikih, ki prejemajo kalcitriol, višji kot pri bolnikih brez terapije. Korelacijske študije OPG in RANKL z biokemičnimi kazalci kostne presnove pri bolnikih na HD so red-ke.11, 12 Ugotavljajo negativno korelacijo med OPG in PTH. Tudi pri naših bolnikih je ta povezava negativna in neznačilna. OPG ni koreliral s kazalci razgradnje, med kazalci tvorbe pa samo z osteokalcinom. Serumske koncentracije OPG verjetno ne odsevajo stanja v kostnem mikrookolju. Ta razlaga je podprta z dejstvom, da OPG nastaja v različnih tkivih (pljuča, srce, kosti, ledvica, žile), zato lahko sproščanje iz naštetih organov prispeva k zvišanju koncentracij OPG v obtoku. Tudi RANKL je slabo koreliral z merjenimi parametri, v nasprotju z OPG pa dobro s PTH, z osteokal-cinom in s CTx. Ti rezultati kažejo na to, da ima RANKL večjo možnost kot potencialni kazalec kostnega obrata pri bolnikih na HD. V več študijah so dokazali, da imajo bolniki s kronično ledvično odpovedjo zvišane serumske koncentracije OPG.11, 12 Skupaj z raziskovalno skupino Arko Bar-bare21 smo dokazali, da trije polimorfizmi (149 T › C, 163 A › G, 950 T › C) v promotorju gena za OPG ne vplivajo na izražanje gena in s tem posledično na njegove serumske koncentracije. Naši rezultati so potrdili dokaze in vitro študij o inhibi-cijskem delovanju PTH na tvorbo OPG in o njegovih stimulacijskih učinkih na tvorbo RANKL. Koncentracije OPG so bile najvišje pri bolnikih na HD v prvem, koncentracije RANKL pa v tretjem tercilu PTH. Pri bolnikih na HD z visokim obratom je zaradi učinkov PTH porušeno ravnotežje v sistemu OPG/RANKL/RANK in pospešena razgradnja kostnega tkiva. Rezultati potrjujejo vpletenost citokinskega sistema OPG/RANKL/ RANK v patogenezo ledvične osteodistrofije. Literatura 1. Hruska K. New concepts in renal osteodystrophy. Nephrol Dial Transplant 1998; 13: 2755–60. 2. Disthabanchong S, Gonzales EA. Regulation of bone cell development and function: implications for renal osteodystrophy. J Investig Med 2001; 49: 240–9. 3. Reichel H, Esser A, Roth HJ, Schmidt-Gayk H. Influence of PTH assay methodology on differential diagnosis of renal bone disease. Nephrol Dial Transplant 2003; 759–68. 4. Montalban C, Garcia-Unzueta MT, De Francisco AL, Amado JA. Serum interleukin-6 in renal osteodystrophy: Relationship with serum PTH and bone remodeling markers. Horm Metab Res 1999; 31: 14–7. 5. Haughes FJ, Howells GL. Interleukin-6 inhibits bone formation in vitro. Bone Miner 1993; 21: 28–8. 6. Coen G, Ballanti P, Calabria S, Fischer MS, Lifrieri F, Di Zazzo G, et al. Osteoprotegerin / osteoprotegerin – ligand (OPG/OPGL) system in renal osteodystrophy (RO). JN 2002; 15: 725–40. 7. Gonzales EA. The role of cytokines in skeletal remodelling: possible consequence for renal osteodystrophy. Nephrol Dial Transplant 2000; 15: 945–50. 8. Morony S, Capparelli C, Lee R, Shimamoto G, Boone T, Lacey DL, et al. A chimeric form of osteoprotegerin inhibits hyper-calcemia and bone resorption induced by IL-1 beta, TNF-alpha, PTH, PTHrP, and 1.25(OH)2D3. J Bone Miner Res 1999; 14: 1478–85. 9. Martin KJ, Olgaard K, Coburn JW. Diagnosis, assessment and treatment of bone turnover abnormalities in renal osteody-strophy. Am J Kidney Dis 2004; 43: 558–65. Avberšek-Lužnik I, Pečovnik-Balon B, et al. Citokinski sistem OPG/RANKL/RANK pri ledvični osteodistrofiji 675 10. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky N, White TJ. PCR protocol: A quide to methods and applications. San Diego: Academic Press; 1990. 11. Haas M, Leko-Mohr Z, Roschger P, Kletzmayr J, Schwarz C, Domer Zsontsich T, et al. Osteoprotegerin and parathyroid hormone as markers of high turnover osteodystrophy and decreased bone mineralization in hemodialysis patients. Am J Kidney Dis 2002; 39: 580–6. 12. Avberšek-Lužnik I, Pečovnik-Balon B, Rus I, Marc J. Increased bone resorption in HD patients: is it caused by elevated RANKL synthesis? Nephrol Dial Transplant 2005; 20: 566–70. 13. Coen G, Ballanti P, Balducci A, Calabria S, Fischer MS, Jankovic L, et al. Serum osteoprotegerin and renal osteodystrophy. Ne-phrol Dial Transplant 2002; 17: 233–8. 14. Kazama JJ, Shigematsu T, Yano K, Tsuda E, Miura M, Iwasaki Y, et al. Increased circulating levels of osteoclastogenesis inhibitory factor (osteoprotegerin) in patients with chronic renal failure. Am J Kidney Dis 2002; 39: 525–32. 15. Avberšek-Lužnik I, Malešič I, Rus I, Marc J. Increased levels of osteoprotegerin in hemodialysis patients. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 1019–23. 16. Kazama JJ, Shigematsu T, Yano K, Tsuda E, Miura M, Iwasaki Y, et al. Increased circulating levels of osteoclastogenesis inhibitory factor (osteoprotegerin) in patients with chronic renal failure. Am J Kidney Dis 2002; 39: 525–32. 17. Malyszko J, Malyszko JS, Wolczynski S, Mysliwiec M. Osteopro-tegerin and its Correlations with new markers of bone formation and bone resorption in kidney transplant recipients. Transplant Proc 2003; 35: 2227–9. 18. Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR, Kelley M, Chang M-S, Lüthy R. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulation of bone density. Cell 1997; 89: 309–19. 19. Lacey DL, Timms E, Tan H-L, Kelly MJ, Dunstan CR, Burgess T, et al. osteoprotegerin (OPG) ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 1998; 93: 165–76. 20. Hruska KA, Saab G, Chaudhary LR, Quinn CO, Lund RJ, Suren-dran K. Kidney-bone, bone-kidney, and cell-cell communications in renal osteodystrophy. Seminars in Nephrology 2004; 24: 25–38. 21. Arko B, Avberšek-Lužnik I, Marc J. Vpliv polimorfizmov v pro-motorju gena za OPG na njegovo serumsko koncentracijo pri dializnih bolnikih. Farm Vestn 2004; 55: 322–4. Prispelo 2007-03-29, sprejeto 2007-07-16