RAZISKAVE IN RAZVOJ Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala Papirnica Vevče d.o.o., Biomatt 80 g/m 2 . Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala Papirnica Vevče d.o.o., Biomatt 80 g/m 2 . RAZISKAVE IN RAZVOJ Raziskujemo in razvijamo Raziskujemo in razvijamo | november 2018 | 20 | XLVI | november 2018 | 20 | XLVI 1 UVOD Papirniški mulj je največji stranski pro- izvod v papirniški industriji in predsta- vlja velik problem kar zadeva odstra- njevanja [1,2].Poznamo številne načine odstranjevanja papirniškega mulja, med najpogostejše prištevamo pokrivanje različnih površin in sežig [3]. Med alter- nativne metode pa vključujemo prede- lavo v hidravlično bariero za prikrivanje odlagališč [4] v postopku odstranjeva- nja metalnih ionov [5], kot absorbent za čiščenje vodne površine [3], ter kot gradbeni materiali [6]. Kljub številnim alternativnim rešitvam papirniški mulj še vedno predstavlja velik izziv, zaradi nje- govih ugodnih karakteristik. Papirniški mulj je sestavljeni iz celuloznih vlaken in anorganskih polnil (kalcijev karbonat in kaolinit), ter iz številnih raztopljenih kemikalij v vodi [3]. Poleg tega papirniš- ki mulj vsebuje težke kovine, klorirane organske spojine (dioksini in poliklori- rani bifenili) ter številna druga onesna- žila [7, 8]. Za glive je značilno, da lahko razgradijo številne lignocelulozne mate- riale, vključno z odpadki, ki nastajajo v kmetijski, gozdarski in živilski industriji [9, 10]. Glive imajo velik biotehnološki potencial, saj so zelo enostavne za upo- rabo, obenem pa imajo veliko ekonom- sko, ekološko in medicinsko vrednost [11–13]. Lignocelulozni odpadki pred- stavljajo obetavne substrate za gojenje gliv in nadaljnjo proizvodnjo hidrolit- skih in oksidativnih encimskih meša- nic glivnega izvora. Med temi encimi, ki se navadno uporabljajo pri izdelavi papirja, so najpomembnejši: (i) hidroli- tični encimi celulaza in ksilanaza, lipaze in mangan peroksidaze [9, 14]. V naši študiji smo se osredotočili na proizvo- dnjo hidrolitskih in oksidativnih encimov s pomočjo bukovega ostrigarja (Pleu- rotus ostreatus), kjer smo uporabili kot substrat dva različna papirniška mulja. 2 MATERIAL IN METODE Papirniška mulja DS (deinking proces) in PS (kemično mehansko čiščenje) sta bila pridobljena iz slovenske papirnice in sta bila uporabljena kot substrat za kultiva- cijo gliv. Sev bukovega ostrigarja (PLAB P . ostreatus) je bil pridobljen iz zbirke glivnih kulture MycoMedica d.o.o. v Podkornu (Slovenija). V procesu kultivacije gliv smo uporabili 300 g substrata. Kozarce z vsebino smo inokulirali z glivo bukov ostrigar in jih inkubirali pri 23°C ± 0,5°C . Vzorčenje je potekalo v različnih časovnih obdob- jih in sicer: 34., 40., 48., 53. in 61.dan. Za različna časovna obdobja smo se odločili z namenom, da preverimo kako se obnaša gliva in kakšne so aktivno- IZVLEČEK V naši študiji smo raziskovali rast glive Pleurotus ostreatus na papirniškem mulju. Natančneje smo raziskali primernost substrata DS (deinking proces) in PS mulja (kemično mehansko čiščenje) v procesu proizvodnje encimov s pomočjo glive P . ostreatus. Encimi, ki se proizvedejo tekom kultivacije glive igrajo pomembno vlogo za industrijo celuloze in papirja. Po kultivaciji smo ekstrahirali ekstracelularne proteine in določili specifične aktivnosti štirih encimov: aktivnosti celulaze, ksilanaze, lipaze in peroksidaze. Poleg tega so bili določeni učinki pH vrednosti ekstrakcijskega pufra na encimske aktivnosti. Preverili smo tudi kakšen učinek na rast glive in proizvodnjo encimov ima inkubacijski čas. Rezultati kažejo, da lahko P . ostreatus raste na trdnih odpadkih iz papirniške industrije, kar pripomore k zmanjšanju količine odpadkov in zmanjšanju ekološkega vpliva. Poleg tega so trdni odpadki papirniške industrije dober substrat za proizvodnjo komercialno zanimivih encimov. Ključne besede: celulaza, encim, lipaza, papir, papirniški mulj, peroksidaza, Pleurotus ostreatus, ksilanaza. ABSTRACT We studied the growth of Pleurotus ostreatus on pulp and paper industry wastes. Specifically, we investigated whether solid-state fermentation and growth substrates (de-inking paper mill sludge, primary sludge) are appropriate for the production of enzymes by P . ostreatus relevant to the pulp and paper industry. Following fermentation, the extracellular protein was extracted and the specific activities of four enzymes were determined: the cellulase, xylanase, lipase, and peroxidase activities. Furthermore, the effects of extraction buffer pH on these enzyme activities were determined, along with the effects of incubation time. These data show that P . ostreatus can grow on pulp and paper industry solid wastes, which helps to minimize the waste volume and to decrease the ecological impact. Additionally, these pulp and paper industry solid wastes are good substrates for the production of commercially interesting enzymes. Keywords: cellulase, enzyme, lipase, paper, paper mill sludge, peroxidase, Pleurotus ostreatus, xylanase. Mija SEŽUN 1 , Matej SKOČAJ 2 , Andrej GREGORI 3 , Maja GRUNDNER 2 , Kristina SEPČIĆ 2 POTENCIAL PAPIRNIŠKEGA MULJA V PROCESU PROIZVODNJE ENCIMOV POTENTIAL OF PAPER MILL SLUDGE IN THE PROCESS OF ENZYME PRODUCTION Slika 1: Rast micelija na substratu (papirniški mulj) Figure 1: Growth of mycelium on the substrate Slika 2: Encimski ekstrakt Figure 2: Enzyme extract Slika 3: Produkcija encimov tekom kultivacije glive P . Ostreatus Figure 3: Production of enzymes during the cultivation of P . Ostreatus sti posameznih encimov skozi časovna obdobja. Določanje suhe snovi substrata je bil v skladu s standardom SIST EN 14346: 2007 in celotni organski ogljik (TOC) v skladu s standardom SIST EN 13137: 2002. Vsebnost težkih kovin smo do- ločili po naslednjih standardih: Cu, DIN 38406-E7-2: 1991; Zn, SIST ISO 8288: 1996; Ni, DIN 38406-E11-2: 1991; Cd, SIST EN ISO 5961: 1996; Hg, SIST ISO 5666: 2000; Cr, SIST ISO 9174: 1999; Pb, DIN 38406-E6-2: 1998. Vsebnost celuloze smo določili po Kürschner et al. [15], vsebnost hemiceluloz po Wise in Karl [16] in vsebnost lignina po Fuku- shima et al. [17]. (mg/kg dry matter ) Cu Zn Ni Cd Hg Cr Pb DS 165 58 2 0,15 <0,01 5 21 PS 104 55 6 0,2 0,2 9 21 % celuloza lignin hemiceluloza DS 34 6 4 PS 33 8 6 Preglednica 1: Delež težkih kovin v substratu (mg/kg suhe snovi ) Table 1: Proportion of heavy metals in the substrate (mg/kg dry matter ) Tabela 2: Delež celuloze, lignina in hemiceluloze v substratu (%) Table 2: Proportion of cellulose, lignin and hemicellulose in the substrate (%) 3 REZULTATI Z RAZPRAVO Cilj te študije je bil oceniti DS in PS kot potencialne substrate za proizvodnjo encimov P . ostreatus v kultivacije buko- vega ostrigarja v različnih inkubacijskih obdobjih. Vsebnost TOC za DS in PS je bila 21,0 % oziroma 28,5 %. Vsebnost težkih kovin in vsebnost celuloze, ligni- na in hemiceluloze sta podani v Tabelah 1 in 2. Ker so vsebnosti celuloze, lignina in hemiceluloz v DS in PS primerljive; višja vsebnost TOC za PS bo spodbudila bolj- šo rast micelija v primerjavi s DS. Ne- katere težke kovine inhibirajo rast gliv, vendar inhibicije zaradi težkih kovin nismo zaznali. Aktivnosti celulaze in ksilanazo, so bile pri DS višje kot pri PS. Pri DS je bila celulazna aktivnost najvišja po 53 in 61 dneh inkubacije, medtem ko je aktiv- nost ksilanaze najvišjo aktivnost dosegla na 34. in 61. dan inkubacije. Aktivnosti teh encimov niso posebej vplivale na pH ekstrakcijskega pufra (slika 1), dokazali smo širok razpon odpornosti na pH, kot so poročali že Liguori et al. [18]. Aktivnosti lipaze, so bile primerljive za DS in PS in so bile najvišje pri pH 8, kar je skladno z literaturo [19]. Pri PS se je aktivnost lipaze zmanjšala s časom inkubacije. Ta trend ni bil viden pri DS, saj so aktivnosti, specifične za lipaze, močno nihale (slika 3). Najvišje aktiv- nosti peroksidaze določimo na 34. in 40. dan inkubacije. Najvišje aktivnosti peroksidaze pri DS in PS smo beležili pri kislem pH (slika 3). Proizvodnja oksidacijskih encimov, ki omogočajo rast gliv bele trohnobe na različnih lignoceluloznih substratih je močno odvisna od sestave rastnega me- dija, pH in temperature, pa tudi od faze rasti glive in njegove celice [20]. 4 SKLEPI Podatki naše študije kažejo, da so lignocelulozni odpadki (mulji) iz papir- ne industrije (DS in PS), dober substrat za rast glive (P . ostreatus). Produkcija posameznih encimov je tekom inkubaci- je različna in nelinearna. Takšni rezul- tati predstavljajo izziv pri optimizaciji maksimalnega izplena encimov tekom kultivacije gliv. Izboljšanje produkcije encimov bi lahko povečali tudi z vpe- ljavo co-substratov, ki imajo podob- ne karakteristike kot papirniški mulji. Takšen način reševanja problematike prekomernih količin odpadkov in prido- bivanja produktov z dodano vrednostjo (encimov) iz odpadnih materialov je iz vidika okoljske in stroškovne sprejemlji- vosti izjemno atraktiven tudi v procesu krožnega gospodarstva. Encime in druge topne ekstracelular- ne proteine smo ekstrahirali z dodat- kom 2 ml ustrezne puferske raztopine na 1 g substrata, 2 uri pri 4°C (stresa- nje). Učinek pH ekstrakcijskega pufra na encimske aktivnosti smo testirali z devetimi različnimi pufri z naraščajo- čimi vrednostmi pH na osnovi 50 mM MES (pH 4,0–6,0) in 50 mM TRIS (pH 6,5–8,0). Po ekstrakciji smo vzorce centrifugirali pri 13.200 × g 10 minut pri 4°C. Ugo- tovljene supernatante smo analizirali za encimske aktivnosti in skupni ekstrace- lularni protein. Koncentracije beljako- vin smo določili z uporabo komponent BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, ZDA). RAZISKAVE IN RAZVOJ Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala Papirnica Vevče d.o.o., Biomatt 80 g/m 2 . Papir za notranjost revije PAPIR je prispevala Papirnica Vevče d.o.o., Biomatt 80 g/m 2 . RAZISKAVE IN RAZVOJ Raziskujemo in razvijamo Raziskujemo in razvijamo | november 2018 | 20 | XLVI | november 2018 | 20 | XLVI Raziskave iz tujine 5 LITERATURA [1] BATTAGLIA, A., N. CALACE, E. NARDI., B.M. Paper mill sludge-soil mixture: Kinetic and ther- modynamic tests of cadmium and pollutants in pulp and paper mill sludge suggest that lead sorption capability, Microchem. J., 2003, 75, str. 97-102. [2] GENG, X., DENG, J., ZHANG, S.Y. Effects of hot-pressing parameters and wax content on the properties of fibreboard made from paper mill sludge, Wood Fiber Sci., 2007, 38, str. 736–741. [3] LIKON M., CERNEC F., SVEGL F., SAARELA J., ZIMMIE T. F. Papermill industrial waste as a sustainable source for high efficiency absor- bent production, Waste Management, 2011, 31, 6, str. 1350-1356. [4] KORTNIK J., ČERNEC F., HRAST K. Paper sludge layer as low permeability barrier on waste landfill, Soil & Sediment Contamination, 2008,17, 4, str. 381-392 [5] CALACE N., NARDI E., PETRONIO B., PI- ETROLETTI M., TOSTI G. Metal ion removal from water by sorption on paper mill sludge, Chemosphere, 2003, 51, 3, str. 797-803. [6] ČERNEC F., ZULE J., MOZE A., IVANUŠ A. Chemical and microbiological stability of waste sludge from paper industry intended for brick production. Waste Management & Research, 2005, 23, 2, str. 106-112. [7] Bauchamp C. J. Examination of environ- mental quality of raw and composting de-ink- ing paper sludge, Chemosphere, 2002, 46, str. 887-895. [8] MONTE M. C., FUENTE E., BLANCO A., NE- GRO C. Waste management from pulp and pa- per production in the European Union, Waste Management, 2009, 29, 1, str. 293-308. [9] DA LUZ, J.M.R., NUNES, M.D., PAES, S.A., TORRES, D.P ., SILVA, M. DE C.S. DA, KASUYA, M.C.M. Lignocellulolytic enzyme production of Pleurotus ostreatus growth in agroindus- trial wastes, Braz. J. Microbiol., 2012, 43, str. 1508-1515. [10] SANCHEZ, C. (2010) Cultivation of Pleu- rotus ostreatus and other edible mushrooms. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2010, 81, str. 1321-1337. [11] DE AZVEDO, J.L.D., ESPOSITO, E. Fungos: uma introdução à biologia, bioquímica e bio- tecnologia. EDUCS, 2005, Cincias Biol-gicas e Naturais edition. [12] SCHMIDT, P ., WECHSLER, F.S., DO NASCI- MENTO, J.S., JUNIOR, V., DE, F.M. Pretreatment effects on fiber degradation of brachiaria hay by Pleurotus ostreatus fungus. Rev. Bras. Zoo- tec., 2003, 32, str. 1866-1871. [13] ZHANG, C.K., GONG, F., LI, D.S. A note on the utilisation of spent mushroom composts in animal feeds. Biores. Tech., 1995, 52, str. 89-91. [14] RODRIGUES-COUTO, S. Industrial and environmental applications of white-rot fungi, Mycrosphere, 2017, 8, str. 456-466. [15] KÜRSCHNER, K., HOFFER, A., JEN- KINS, S.H., VIEWEG, W., SCHWARZKOPF, O., SCHRAMEK, W., SCHUBERT, C., VELTEN, H., HESS, K., TROGUS, C., ET AL. Cellulose und Cellulosederivate. Z. Für Anal. Chem., 1933, 92, str. 145-154. [16] WISE E.L., KARL, H.L., Cellulose and Hemi- celluloses in Pulp and Paper Science and Tech- nology, 1. izdaja, New York, Pulp.Eds. Earl. C.L. McGraw Hill-Book Co, str. 55-73. [17] FUKUSHIMA, R.S., KERLEY, M.S., RAMOS, M.H., PORTER, J.H., KALLENBACH, R.L. Com- parison of acetyl bromide lignin with acid de- tergent lignin and Klason lignin and correlation with in-vitro forage degradability. Anim. Feed Sci. Technol., 2015, 201, str. 25-37. [18] LIGUORI, R., IONATA, E., MARCOLONGO, L., PORTO DE SOUZA VANDENBERGHE, L., LA CARA, F., FARACO, V. Optimization of Arundo donax saccharification by (hemi)cellulolytic en- zymes from Pleurotus ostreatus. BioMed Res. Int., 2015, str. 1. [19] DIAZ, R.,TÉLLEZ-TÉLLEZ, M., SANCHEZ, C., BIBBINS MARTINEZ, M.D., DIAZ-GODINEZ, G., SORIANO-SANTOS, J. (2013) Influence of initial pH of the growing medium on the activ- ity, production and genes expression profiles of laccase of Pleurotus ostreatus in submerged fermentation. Env. Biotech., 2013, 16, str. 1-13. [20] KNOP , D., YARDEN, O., HADAR, Y. The ligninolytic peroxidases in the genus Pleurotus: divergence in activities, expression, and poten- tial applications. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2015, 99, str. 1025-1038. 1 Inštitut za celulozo in papir, Bogišićeva 8, 1000 Ljubljana, Slovenia 2 Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani, Večna pot 111, 1000 Lju- bljana, Slovenia 3 MycoMedica d.o.o., Podkoren 72, 4280 Kran- jska Gora, Slovenia POVZETKI IZ TUJE STROKOVNE LITERATURE ABSTRACTS FROM FOREIGN EXPERT LITERATURE Papir je zelo enostaven material za recikli- ranje. V Evropi recikliramo že več kot 70 % papirnih izdelkov. Porabljen papir zbi- ralci ustrezno sortirajo in stisnejo v bale, ki jih dostavijo predelovalcem. Ti bale običajno skladiščijo na odprtih prosto- rih, kjer je požarno tveganje zelo visoko. Uporaba IR tehnologije omogoča zgodnje odkrivanje ognja. Temelji na dejstvu, da vsi predmeti emitirajo elektromagnetno valovanje, in sicer predvsem v IR obmo- čju. Natančen IR spekter je odvisen od temperature predmeta, zato omogoča vgradnja IR senzorjev detekcijo ognja v začetni fazi, ko je temperatura še pod temperaturo vžiga. Janja Zule Infrardeča termografija v skladiščih papirja Infrared thermography in a waste paper storage yard Lantzsch, J.: Professional Papermaking 15 (2018) 1: 22 – 24 Slika 1: Infrardeča panoramska slika kaže temperaturo v vsaki točki merilnega območja Figure 1: The infrared panoramic image shows a temperature for every point in the monitoring area Slika 2: Radarski senzor in radiometrični merilni sistem Figure 2: Radar sensor and radiometric measurement system Radarske in radiometrične meritve Radar and radiometry measurement Lambrecht, J, Langensiepen, C.: Professional Papermaking 15 (2018) 1: 30 - 33 Nekontaktne metode merjenja z uporabo radiometričnih sen- zorjev so postale rutinske tudi v papirni industriji. Omogočajo določitve parametrov kakovosti na papirnem stroju ter merjenje nivojev in masnih tokov, hkrati pa ni vpliva zunanjih pogojev. Senzorji lahko zaznajo posamezne celulozne zvitke in pomagajo optimirati delovanje razpuščevalnika, s čimer se znatno pove- ča kapaciteta dela. Najnovejša generacija radarskih merilnikov za tekočine deluJe s pomočjo 80 GHz tehnologije. Tako visoke frekvence omogočajo precizno fokusiranje na merilno mesto, hkrati pa se izničijo vse interference iz okolja. Možno je na- tančno merjenje nivojev v vlakninskih suspenzijah med procesom razpuščanja. Radiometrični senzorji predstavljajo velik potencial v nadaljnjem razvoju papirništva. Janja Zule Popravek Correction V prejšnji številki revije Papir 19, XLVI (junij 2018) je prišlo pomotoma do zamenjave naslova članka avtorjev Hočevar, Bjelić in Grilc, ki je bil objavljen na strani 48. Pravilni naslov se glasi: Odpadna biomasa – nova su- rovina za pridobivanje kemikalij. Članek pod naslovom Rastlinska biomasa – možni alternativni vir papirnih vlaken avtorjev Zule, Fre- lih, Flajšman je bil objavljen v reviji Papir 18, XLV (no- vember 2017) na straneh 34 – 37. Uredniški odbor revije Papir se avtorjem iskreno opra- vičuje. In Paper Magazine 19 (XLVI, June 2018), the title of the article by Hočevar, Bjelić and Grilc, which was published on page 48, was inadvertently swapped. The correct title is Waste biomass – new raw material for the acquisition of chemicals. The article entitled Plant biomass – potential alter- native source of paper fibers by Zule, Frelih and Flajšman was published in Paper Magazine 18 (XLV, No- vember 2017) on pages 34–37. The Editorial Board of the Paper Magazine sincerely apologizes to the authors.