The analysis of cell-biomaterial interaction by advanced experimental techniques as the basis for biocompatibility studies of polymers : doctoral thesis
Raziskave interakcij med celicami in biopolimernimi materiali z naprednimi eksperimentalnimi metodami kot osnova za študij biokompatibilnosti polimerov : doktorska disertacija

angleški

doktorska dela

2015

biokompatibilnost nosilcev   cell adhesion dynamics   cell growth   dinamična mehanska analiza   dinamika pritrjevanja celic   disertacije   dissertations   dynamical mechanical analysis   electron paramagnetic resonance   elektronska paramagnetna resonanca   fluorescence microscopy   fluorescence microspectroscopy   fluorescenčna mikroskopija   fluorescenčna mikrospektroskopija   manipulacija posameznih celic   mechanical response   mehanski odziv   molekularna mobilnost polimerov   morfologija   morphology   nanoindentacija   nanoindentation   optical tweezers   optične pincete   polymer molecular mobility   rast celic   scaffold biocompatibility   single cell manipulation

Univerza v Mariboru, Fakulteta za naravoslovje in matematiko

Obdobje zadnjih dvajsetih let zaznamuje velik napredek na področju raziskav tkivnoinženirskih nosilcev za uporabo v regenerativni medicini. Poleg raziskav novih biomaterialov in načinov priprave nosilcev se daje velik pomen razumevanju biokompatibilnosti. V doktorski študiji smo proučevali vplive različnih fizikalnih lastnosti polimernih nosilcev iz želatine na molekularni kot tudi makroskopski skali na pritrjevanje in rast celic. Biokemijski vpliv na odziv celic smo izločili z uporabo enake kemijske sestave pri pripravi nosilcev. Porozne nosilce z različnimi fizikalnimi lastnostmi smo uspeli pripraviti s spreminjanjem temperature, pH in stopnje premreženja tekom sočasnega zamrzovanja in premreževanja. Za karakterizacijo fizikalnih lastnosti smo uporabili napredne biofizikalne eksperimentalne metode: elektronsko paramagnetno resonanco (EPR) s spinskim označevanjem molekul za analizo molekularne mobilnosti stranskih verig polimerov, reometrijo, dinamično mehansko analizo (DMA) in nanoindentacijo z mikroskopom na atomsko silo (AFM) za analizo mehanskih lastnosti nosilcev na makroskopski in mikroskopski skali ter konfokalno fluorescenčno mikroskopijo (CFM) za analizo poroznosti nosilcev na mikroskopski skali. Ugotovili smo, da med merjenimi lastnostmi anizotropija molekularne mobilnosti stranskih verig polimerov v premreženi želatinski strukturi najbolj korelira z rastjo celic v prvih dneh. Izmerili smo približno petkrat slabšo rast celic na nosilcih z izrazito, neomejeno prostorsko mobilnostjo stranskih verig polimerov v primerjavi z rastjo celic na nosilcih z omejeno mobilnostjo le teh. Rezultat nakazuje na to, da celice prepoznajo in se odzovejo na stopnjo molekularne mobilnosti polimerov, kjer je za uspešno pritrditev in uspešno rast le teh potrebna delno nemobilna faza polimerov v sami strukturi. Te fizikalne lastnosti v dosedanjih raziskavah vpliva lastnosti tkivno inženirskih materialov na odziv celic še niso natančno raziskovali in bi lahko predstavljala nov eksperimentalni pristop za boljše razumevanje biokompatibilnosti. Za nadaljnje razumevanje interakcije nosilec-celica, smo se v doktorski študiji posvetili analizi dinamike pritrjevanja celic - nastanek prvih vezi med celičnimi transmembranskimi proteini in specifičnimi ligandi na površini materiala.V doktorski študiji smo proučevali dinamiko pritrjevanja posameznih celic v realnem času na površinah želatinskih nosilcev z različnimi fizikalnimi lastnostmi s prostorsko nadzorovano manipulacijo celic s pomočjo optične pincete in detekcije s konfokalno fluorescenčno mikroskopijo. Želeli smo pojasniti ali dinamika pritrjevanja korelira z rastjo celic in ali na dinamiko lahko vpliva molekularna mobilnost polimerov. Silo tekom analize pritrjevanja smo kvantitativno določili s predhodno umeritvijo z viskozno silo okoliške tekočine in umeritvijo s sekvenčno dinamično manipulacijo posameznih celic. Izmerjena največja sila optične pincete na celico pri kateri še nismo zaznali termične poškodbe je bila 200 pN, pri čemer sila pada v približku linearno iz lege pincete na robu celice radialno v smeri proti težišču, centru celice. S podmikronsko prostorsko ločljivostjo manipulacije celic na stiku s površino nosilca smo natančno določili verjetnost za pritrditev celic, moč pritrditve celic in mehanizme pritrditve celic, med katerimi je tudi takšen preko nastalih membranskih izrastkov, ki upočasni proces pritrjevanja. Moč pritrditve celic smo razvrstili glede na premik pritrjene celice v smeri tangencialno na površino nosilca pod vplivom sile optične pincete. Pokazali smo, da dinamika pritrjevanja celic res korelira z rastjo celic v prvih dneh, medtem ko kaže, da je pritrjevanje res odvisno od molekularne mobilnosti polimerov na površini nosilca. Interakcije v prvih sekundah stika tako lahko zelo vplivajo oz. usmerjajo nadaljnji odziv celic. Razvito metoda analize pritrjevanja celic na površine 3D nosilcev lahko služi kot dobro orodje za določitev biokompatibilnosti nosilcev.

08.08.2023