Vpliv fluvoksamina in maprotilina na sproščanje in farmakokinetiko histamina pri podgani in vivo* The influence of fluvoxamine and maprotiline on the release and kinetics of histamine in the rat in vivo*
Borut Jug**
Ključne besede
histamin sproščanje - učinki zdravil
fluvoksamln
maprotilin
podgane
Izvleček. Antidepresivi prizadenejo farmakokinetiko histamina. Namen naše razsikave je bil natančneje oceniti vpliv različnih odmerkov antidepresivov fluvoksamina in maprotilina na inducirano sproščanje histamina in njegovo nadaljnjo eliminacijo ter opredeliti, ali na eliminacijo vpliva prerazporeditev histamina iz plazme v krvne elemente. Podganam (n = 24) smo vbrizgali po dva enaka odmerka antidepresiva v časovnem razdobju 24 ur. Uro po drugem odmerku antidepresiva smo i. v. vbrizgali sproščevalec histamina - spojino 48/80 (0,05 ig/g) ali eksogeni histamin (10 ig/g). Zatem smo iz skupne karotidne arterije odvzeli vzorce krvi 5 in 15 minut po dodaku sproščevalca, da bi v njih izmerili plazemske ravni histamina, oziroma 2 minuti po vbrizgu histamina, da bi lahko ločeno analizirali koncentracijo histramina v plazmi in krvi. Koncentracije histamina v vzorcih smo po dvostopenjskem prečiščevanju določili spektrofluorometrično. Oba antideperesiva sta zavrla povišanje plazemske ravni histamina zaradi delovanja sproščevalca. Povečale so se vrednosti hitrostnih konstant eliminacije histamina. Po vbrizgu eksogenega histami-na so bile njegove koncentracije v plazmi in krvi podgan z antidepresivom nižje kot pri kontrolnih podganah, ni pa se spremenilo razmerje histamin
v	plazmi: histamin v krvi.
Sklepamo, da antidepresiva zavirata inducirano sproščanje histamina in pospešita njegovo eliminacijo. Domnevamo tudi, da pospešena eliminacija histamina ni posledica njegovega prerazporejanja iz plazme v krvne elemente, pač pa ji verjetneje botrujeta pospešeno presnavljanje in/ali vezava hista-mina v druga tkiva. S tem lahko delno pojasnimo nekatere klinične učinke, ki jih imajo antidepresi-
vi	na vnetne in alergične procese.
Key words
histamine release - drug therapy
fluvoxamine
maprotiline
rats
Abstract. Antidepressants are known to influence the kinetics of histamine. The purpose of this study was twofold: to determine the influence of various doses of antidepressants fluvoxamine and maprotiline on induced histamine liberation and its further elimination and to find out whether histamine elimination is influenced by its redistribution from plasma to blood.
Rats (n = 24) were pre-treated with two doses of antidepressant at an interval of 24 hours. One hour after the administration of the second dose of antidepressants, the rats received histamine liberator - compound 48/80 (0.05 ig/g) or exogenous histmine (10 ig/g). Blood samples were taken from the carotid artery at 5 and 15 minutes after the injection of the histamine liberator - for measurements of plasma histamine levels, and at 2 minutes after the injection of exogenous histamine - for separate determinations of plasma and blood histamine levels. After a two-step purification procedure, hista-mine levels were measured by spectrofluorometry. Both antidepressants inhibited the rise of plasma histamine because of the effects of compound 48/80. The study animals showed significantly higher values of elimination constants than controls. It is assumed that antidepressants inhibit histamine liberation and promote its elimination. Rats pre-treated with antidepressants had lower plasma and blood hist-amine levels after exogenous histamine injection than control animals, while their plasma histamine/blood histamine ratio did not change significantly. We suppose that accelerated elimination of histamine is not the result of its redistribution from plasma to blood and blood elements but is rather the consequence of increased metabolism of histamine and/or its binding in other tissues.
"Objavljeno delo je bilo nagrajeno s Krklno nagrado za študente v letu 1998.
**Borut Jug, štud. med., Inštitut za farmakologljo in eksperimentalno toksikologijo, Medicinska fakulteta, Korytkova 2, 1000 Ljubljana.
Uvod
Histamin
Biosinteza, razgradnja in farmakokinetika histamina
Histamin (Hi, 4(5)-(2-aminoetil) imidazol) je biogeni amin. Nastane z dekarboksilacijo L-hi-stidina, pretežno pod katalitičnim vplivom encima dekarboksilaze histidina (EC 4.1.1.22), potreben pa je tudi koencim piridoksal-5'-fosfat (slika 1a) (1).
Hi se iz plazme eliminira zelo hitro, očiščevanje plazme poteka v dveh fazah - v prvi (hitri) se Hi prerazporedi iz plazme (osrednji farmakokinetični prostor) v tkiva (obrobni farmakokinetični prostor), v drugi (počasnejši) fazi pa se Hi v perifernih tkivih razkroji (2, 3). Njegova razgradnja poteka po dveh presnovnih poteh (slika 1b):
•	oksidativno deaminiranje, ki ga katalizira diaminooksidaza (EC 1.4.3.6) in vodi v nastanek imidazolocetne kisline, ki se z ribozo konjugira v 1-ribozil-imidazol-4-acetat ter v takšni obliki izloči s sečem;
•	metiliranje dušika N3 na imidazolovem obroču, ki ga katalizira histamin-N-metiltrans-feraza (EC 2.1.1.8); produkt reakcije je tele-metilhistamin, ki se z monoaminsko ok-sidazo nadaljnje oksidira v metilimidazolocetno kislino in nato izloči s sečem.
Porazdelitev histamina v organizmu
Hi je evolucijsko zelo ohranjen - zasledimo ga praktično pri vseh živalskih vrstah. V posameznih tkivih je različno porazdeljen, kar je povezano z njegovimi fiziološkimi in pa-tofiziološkimi funkcijami; največ ga zasledimo v koži, pljučih in želodcu (tabela 1).
V telesu vretenčarjev se Hi nahaja pretežno v mastocitih (tkivni bazofilci), pa tudi v gibljivih krvnih bazofilcih, ki so sicer maloštevilni, a vsebujejo v fizioloških pogojih 88-94% vsega Hi v krvi. Obe vrsti celic vsebujeta bazofilna metakromatska sekretorna zrnca, v katerih je Hi ionsko vezan s heparini visoke molekulske mase (makroheparini; v mastocitih vezivnega tkiva) ali redkeje hondroitinsulfatom (mastociti sluznic). Zrnca lahko vsebujejo tudi beljakovine (npr. kemotaktične dejavnike za eozinofilce in nevtrofilce, encime, kot sta triptaza in himotriptaza ipd.) ali druge biogene amine - serotonin (5-HT) pri glodalcih ali dopamin. Molarno razmerje Hi, heparina in drugih sestavin zrnc je 1 :3:6. Posamezen mastociti vsebuje 0,1-0,2 pmol Hi, posamezen bazofilec pa okoli 0,01 pmol Hi (11-14). Mastocitni Hi je vpleten predvsem v patološke procese.
Tabela 1. Koncentracije histamina v posameznih tkivih; primerjava med podgano in človekom (4-10).
Tkivo	Konc. pri podgani	Konc. pri človeku
Koža	27,4 pg/g	4,2-30,4 pg/g
Pljuča	5,4 pg/g	33,0 pg/g
Želodec	19,4 pg/g	17,0 pg/g
Kri	49,0 ng/ml	50,0 ng/ml
Plazma	17,0 ng/ml	0,35 ng/ml
Slika 1. Presnova histamina — (a) biosinteza in (b) razgradnja; DKH— dekarboksilaza histidina, HMT—hista-minska metiltransferaza; DAO — diaminooksidaza; MAO — monoaminska oksidaza.
V nekaterih tkivih (vrhnjica kože, sluznica želodca, osrednje živčevje, celice obnavlja-jočega se ali hitro rastočega tkiva itd.) nastaja Hi izven mastocitov (izvenmastocitni hi-stamin). V sluznici želodca nastaja Hi v celicah, ki so podobne enterokromafinim celicam, v osrednjem živčevju pa v histaminergičnih živčnih celicah. Izvenmastocitni Hi je rahlo vezan in se neprestano sprošča, zato je njegovo presnovno obračanje hitro. Ima fiziološko vlogo.
Sproščanje histamina
Hi se iz mastocitov in bazofilcev reaktivno sprosti zaradi različnih imunoloških in neimu-noloških spodbud:
•	fizikalnih dejavnikov (poškodbe, spremembe temperature ipd.),
•	vezave alergenov na predhodno senzibilizirani mastocit (prekrit s protitelesi IgE),
•	delovanja anafilatoksinov (sestavin komplementa C3a in C5a),
•	nevrokinih beljakovin (npr. snovi P, bradikinina, nevrokinina A),
•	sprostitvenega hormona za kortikotropin (CRH),
•	citokinov (npr. interlevkinov 1 in 8),
•	nekaterih učinkovin - npr. opioidov, d-tubokurarina, sestavin v strupih žuželk (npr. melitina iz čebeljega strupa), anestetikov idr.,
•	adenozina,
•	prostih kisikovih radikalov, ki se sproščajo med razgradnjo nekaterih učinkovin v ma-stocitu,
•	spojine 48/80, ki smo jo uporabili tudi pri naših poskusih za sproščanje Hi iz masto-citnih zalog (15-21).
Redkeje se Hi sprošča iz mastocitnih zalog počasi in kontinuirano - takšno obliko praznjenja zrnc opazimo pri vnetnih spremembah in zločestih procesih. Dejavniki, ki spodbujajo sproščanje Hi iz mastocitov, ne vplivajo na obračanje izvenmastocitnega Hi (22).
Protitelesa IgE, ki nastanejo v sklopu humoralnega imunskega odziva na alergene, se vežejo na receptorje za IgE, ki so na površini mastocitov (in bazofilcev) izjemno številni (105) - mastocit postane senzibiliziran. Zaradi ponovne izpostavitve alergenom in njihove vezave na protitelesa IgE na senzibiliziranem mastocitu pride do prečne povezave protiteles na površju mastocitov, kar vodi v zvečano prepustnost celične opne mastoci-ta za kalcijeve ione (Ca++). Spojina 48/80 tudi zviša koncentracijo Ca++ v citosolu ma-stocita, vendar tako, da sprosti Ca++ iz znotrajceličnih zalog (najverjetneje endoplazemskega retikuluma) (11, 12, 23).
Zvišana raven Ca++ vcitoplazmi vodi v degranulacijo mastocita- eksocitotično zlitje zrnc s celično opno in posledično sprostitev predhodno sintetiziranih molekularnih posrednikov (Hi, 5-HT, kemotaktičnih dejavnikov). Ca++ naj bi v celici sprožil plaz reakcij, ki vodijo v aktivacijo beljakovinskih kinaz in fosforilacijo beljakovin, ki so ključne za zlitje zrnc s celično opno (mikrotubuli, mikrofilamenti, intermediarni filament vimentin ter nekatere sestavine citoskeleta, kot so fodrini a in p, ankirin ter aktin) (24, 25).
Aktivacija receptorjev s protitelesi IgE spodbudi tudi presnovo arahidonske kisline; njeni presnovki (prostaglandini, levkotrieni, aktivacijski dejavnik za trombocite, številni citokini)
so pomembni molekularni posredniki, ki skupaj s Hi delujejo na krvožilje in gladko mi-šičnino ter s tem vzdržujejo vnetje (26).
Farmakolo{ki u~inki histamina
Histamin je avtakoid - biokemični posrednik, ki za razliko od hormonov deluje parakrino, svojega farmakološkega prijemališča pa ne doseže po krvi, pač pa je njegovo delovanje običajno omejeno na lokalno tkivo (npr. vnetišče). Svoje učinke sproža z vezavo na re-ceptorje za Hi. Trenutno so poznane tri podvrste receptorjev za Hi: H1, H2 in H3 (11, 12), novejše raziskave pa predpostavljajo tudi obstoj znotrajceličnih vezavnih mest za Hi (27). Vse tri podvrste membranskih receptorjev za Hi so sklopljene z beljakovino G: aktiva-cija receptorja in posledična aktivacija beljakovine G vodita v plaz znotrajceličnih reakcij, ki jim sledijo specifični biološki odzivi.
Receptorji H1 se nahajajo v gladkih mišicah črevesja in dihalnih poti, v steni žil in v osrednjem živčevju. Ob vezavi Hi na receptor H1 se sproži znotrajcelična obveščevalna pot fosforiliranih derivatov inozitola, ki preko specifičnih reakcij (mobilizacija znotrajceličnih zalog Ca++, aktivacija specifičnih encimov, npr. beljakovinske kinaze C itd.) pripelje do biološkega odgovora - krčenja gladkega mišičja v črevesju in maternici, zoženja dihalnih poti in sprememb v mikrocirkulaciji (razširitev arteriol in skrčenje endotela venul, ki vodi v zvečano prepustnost žilja in edem), ki so odgovorne za vlogo Hi v zgodnji fazi akutnega vnetja.
Receptorji H2 se nahajajo na parietalnih celicah želodčne sluznice, v gladki mišičnini stene žil, mišičju srca, glomerulih in osrednjem živčevju. Z vezavo agonista na receptor H2 se aktivira beljakovina G in z njo adenilatna ciklaza, zaradi česar se zviša znotrajcelična raven cAMP. Biološki odgovor se kaže kot povečano izločanje želodčnega soka, sprostitev gladkih mišičnih celic (razširitev žilja) oziroma povečano krčenje srčne mišice (ki utegne biti delno kompenzatorna posledica padca krvega tlaka zaradi vazo-dilatacije, povzročene prav z učinkovanjem Hi). Hi preko receptorjev H2 uravnava presnovo maščob in povratno zavira sproščanje Hi iz bazofilcev.
Receptorji H3 so značilni zlasti za osrednje živčevje, kjer se nahajajo presinaptično. Njihova vloga je povratno zaviranje proženja histaminergičnih nevronov in sproščanja Hi kot živčnega prenašalca v sinaptično špranjo, pa tudi uravnavanje sinteze Hi.
Hi je vpleten v številne patofiziološke procese: ključno vlogo ima v zgodnji fazi akutnega vnetja in pri imunskih preobčutljivostih tipa I po Coombesu (atopijah), kot so alergična astma, seneni nahod in koprivnica. Hi je endogeni algogen, saj zniža prag za proženje bolečinskih živčnih končičev. Zvišane ravni Hi beležimo pri mastocitozi, histi-dinemiji, pravi policitemiji, kroničnih mieloičnih levkemijah in drugih tumorskih raščah. Zvišana raven Hi v telesnih tekočinah povzroča značilne spremembe, ki segajo od kožnih reakcij (rdečina, koprivke, srbež) in sistemskih sprememb (povečano izločanje želodčnega soka, povečanje srčne frekvence z nevarnostjo fibrilacije prekatov, padec arterijskega krvnega tlaka, anafilaktični šok) do smrti zaradi zastoja srca (28).
Tabela 2. Farmakološki učinki histamina (Hi) glede na podvrsto receptorja za Hi in nahajališče le-tega (GMC -gladkomišična celica) (4, 11, 12).
Receptor	Nahajališče	Biološki odziv
	GMC v steni žilja endotelij venul GMC maternice GMC črevesja GMC dihalnih poti osrednje živčevje	razširitev arteriol, zoženje večjih žil zvečana prepustnost žilja krčenje maternice krčenje črevesja zoženje dihalnih poti posinaptična aktivacija
h2	parietalne celice želodca GMC stene žil glomeruli srčna mišica maščobne celice osrednje živčevje	zvečano izločanje želodčnega soka razširitev žil glomerulna filtracija zvečana kontraktilnost srca uravnava presnovo maščob posinaptična aktivacija
H3	osrednje živčevje	predsinaptično zaviranje
Fluvoksamin in maprotilin Nevrofarmakološka razlaga depresivnih motenj
Fluvoksamin in maprotilin sta antidepresiva (AD), ki se uporabljata pri zdravljenju depresivnih motenj razpoloženja in drugih psihiatričnih stanj (tesnobnosti, stresnih in so-matoformnih motenj, osebnostnih motenj, motenj hranjenja, migren, kroničnih bolečin idr.). Po nekajtedenskem jemanju AD se stanje izboljša 70-85% bolnikom, kar je v primerjavi z bolniki, ki so jemali placebo (15-40%), pomenljivo (29). Kmalu po odkritju zdravilnega učinka AD, so njihovo sposobnost izboljšati razpoloženje pri osebah z depresijo vzporedili s sposobnostjo AD, da zvišajo raven nekaterih živčnih prenašalcev v tistih področjih osrednjega živčevja, ki so odgovorna za čustvovanje in razpoloženje (30).
Depresijo z nevrobiološkega vidika danes razlagamo kot neravnovesje živčnega prenosa v osrednjem živčevju. V ospredju je izravnovešenje monoaminskih živčnih prenašalcev (monoaminska hipoteza depresije), zlasti naj bi bila motena dejavnost noradrenalina (NA) in 5-HT (31), čeprav se v strokovni literaturi pojavlja vse več domnev, da so v nastanek in razvoj motenj razpoloženja vključene tudi spremembe v delovanju dopamina, acetilholina, y-aminomaslene kisline ter nekaterih nevropeptidov (npr. CRH) (11, 32-34). V zadnjem času se uveljavlja tudi hipoteza, da motene ravni Hi v osrednjem živčevju tehtno prispevajo k razvoju depresije; Hi sam naj bi imel antidepresivne učinke (35), dokazana je tudi povezava med delovanjem serotoninergičnega sistema in ravnjo Hi v osrednjem živčevju (36-38). Hi je pomemben biogeni amin, ki utegne biti soudeležen v nastanku depresije, zato je poznavanje vpliva AD nanj tudi s tega vidika pomembno.
Monoaminska hipoteza že dolgo ni več zadovoljiva za razlago depresivnih motenj; njeno trdnost majeta časovni zamik med začetkom zdravljenja in pojavom zdravilnih učinkov AD (2-4 tedni) ter obstoj atipičnih AD, katerih mehanizem delovanja še ni docela pojasnjen (39).
Farmakološko delovanje antidepresivov
Farmakološko prijemališče AD je sinaptična špranja; AD zvišajo raven živčnih prena-šalcev v sinaptičnem prostoru, in sicer tako, da
•	zavrejo njihovo razgradnjo (npr. zaviralci monoaminske oksidaze - IMAO),
•	zavrejo njihov ponovni prevzem (npr. maprotilin zavre ponovni privzem NA, fluvoksamin pa 5-HT),
•	spremenijo občutljivost in število posinaptičnih in predsinaptičnih receptorjev in
•	agonistično delujejo skupaj s posameznimi amini (40).
Prve izboljšave kliničnega stanja bolnikov opazimo šele po 2-4 tednih, za ta časovni zamik pa še ni ustrezne razlage; domnevajo, da je zakasnjen antidepresivni učinek posledica dolgotrajnega prilagajanja pred- in posinaptičnih receptorjev na spremenjene ravni živčnih prenašalcev (»uravnavanje navzdol« adrenergičnih receptorjev a2 in p ter serotoninergičnih receptorjev 5-HT2) (11, 29, 30, 32).
Obstaja več razdelitev AD (tabela 3), vfarmakologiji pa je najbolj uporabljena delitev glede na farmakološko prijemališče zdravila, in sicer na:
•	AD tricikličnega tipa (TCA; mednje sodi tudi maprotilin),
•	selektivne zaviralce ponovnega privzema serotonina (angl. serotonin selective reuptake inhibitors, SSRI; mednje sodi fluvoksamin),
•	IMAO in
•	ostale AD.
V klinični praksi se čedalje bolj uveljavljajo SSRI (42). Medtem ko je bil leta 1992 v Sloveniji najpogosteje predpisan AD maprotilin in so imeli ostali AD zanemarljivo vlogo, so postali že leta 1995 opazni SSRI (zlasti fluoksetin, pa tudi fluvoksamin), čeprav je bil maprotilin še vedno najpogosteje predpisan AD (43). Novejši podatki, ki bi nam služili za bolj tehtno oceno, nam niso dostopni.
Čedalje bolj poudarjeno vlogo SSRI v psihiatriji gre pripisati dejstvu, da imajo SSRI manj stranskih učinkov kot starejši TCA. Med stranskimi učinki, ki jih navajajo bolniki, zdravljeni s fluvoksaminom, so zlasti prehodna slabost, neješčnost, vznemirjenost in nespečnost, ni pa motenj uravnavanja dejavnosti srca in ožilja (aritmije, hiper- ali hipotenzije), antiholinergičnih učinkov ali pretirane ješčnosti, ki jih zasledimo pri uporabi TCA; fluvoksamin ima tudi večjo terapevtsko širino (44, 45). Maprotilin povzroča antiholinergične učinke, sedacijo, njegova terapevtska širina je primerljiva s terapevtsko širino TCA, lahko povzroča alergične izpuščaje in konvulzije. Je zelo dolgo delujoč AD (njegov razpolovni čas je okoli 40 ur); maprotilin je tudi učinkovitejši od fluvoksamina pri zdravljenu depresivnega sindroma, ki mu je pridružena tesnobnost (46, 47) (tabela 4).
Tabela 3. Razdelitve antidepresivov (AD). SSRI-selektivni zaviralci ponovnega privzema serotonina (angl. selective serotonine reuptake inhibitors), IMAO—zaviralci monoaminske oksidaze, NA — noradrenalin, 5-HT— serotonin (5-hidroksitriptamin) (11, 29, 30, 40, 41).
Merilo za razdelitev
Farmakološko prijemališče AD tricikličnega tipa
SSRI
IMAO ostali AD
amitriptilin, doksepin,
klomipramin
maprotilin
fluoksetin, fluvoksamin, sertralin moklobemid trazodon, mianserin, viloksazin
Mehanizem delovanja (podrobnejši farmakološki)
zaviralci ponovnega privzema NA SSRI
zaviralci ponovnega privzema NA in 5-HT AD, ki večajo sintezo NA AD, ki zavirajo razgradnjo NA AD, ki krepijo delovanje NA
maprotilin
fluoksetin, fluvoksamin klomipramin, amitriptilin, trazadon, doksepin mianserin moklobemid
bupropion
Kemična struktura
monociklični
biciklični triciklični
tetraciklični
fluvoksamin, fluoksetin, bupropion
trazadon, paroksetin amitriptilin, desipramin, klomipramin maprotilin, mianserin
Klinično učinkovanje
amitriptilinski tip (sedativni AD) dezipraminski tip (timeretiki) imipraminski tip (timoleptiki)
amitriptilin, doksepin dezipramin, nortriptilin imipramin, klomipramin
Zgodovinska
AD prve generacije
AD druge in naslednjih generacij
triciklični AD, nereverzibilni IMAO tertraciklični AD, reverzibilni IMAO, SSRI
Primeri
Tabela 4. Primerjava fluvoksamina in maprotilina: delovanje, odmerjanje in stranski učinki (30, 40).
Generično	Fluvoksamin	Maprotilin
Tovarniško ime	Avoksin®	Ladiomil®
Molekulska masa	434,4	313,9
Običajni dnevni odmerek (mg)	100-200	100-150
Ekstremni odmerek (mg)	50-300	25-225
Oblika dajanja zdravila	oralno	oralno
Amin, na katerega vpliva	serotonin	noradrenalin
Afiniteta do receptorjev H1 (Km)	> 10.000 nM	2nM
Sedacija	0/+	++
Antiholinergični učinki	0	++
Hipotenzija	0	++
Učinki na srce in ožilje	0	++
Konvulzije	0	+++
Pridobitev telesne teže	0	+
Namen raziskovalne naloge
Namen naše razsikave je bil natančneje oceniti vpliv različnih odmerkov fluvoksamina in maprotilina na inducirano sproščanje Hi iz endogenih zalog in njegovo nadaljnjo eliminacijo ter opredeliti, ali na eliminacijo vpliva njegova prerazporeditev iz plazme v krvne elemente.
Pri raziskavi smo preučili vplive naslednjih AD:
•	fluvoksamin (Avoksin®; Krka, Novo mesto, Slovenija) in
•	maprotilin (Ladiomil®; Pliva, Zagreb, Hrvaška).
Metode dela
Uporabljeni pribor, kemikalije in učinkovine
Pribor: steklovina (epruvete, čaše, buče, erlenmajerice, kolone), pipete in kapalke, drobni kirurški pribor za oftalmološke posege, trokraki ventili, plastične kanile, brizgalke, injekcijske igle.
Kemikalije: bidestilirana voda, natrijev hidroksid (NaOH; 1 M, 2 M in 5 M), klorovodikova kislina (HCl; 0,1 M, 1 M, 2M, 3M in 4M), perklorna kislina (HClO4; 2M in 0,4M), fosfatni pufer (pH 6,5), n-butanol, heptan, orto-ftalaldehid (angl. orto-phtalaldehyde, OPT; 0,5% raztopina v metanolu), metanol, ionski izmenjevalec Dowex (Merk, Darmstadt, Nemčija).
Učinkovine: fiziološka raztopina (0,9% NaCl vvodi), heparin (ampule 25.000IE/5ml, Krka, Novo mesto), uretan (20% raztopina v fiziološki raztopini), spojina 40/80 (0,05^g/^l), raztopine Hi (Sigma, St. Louis, ZDA) (iz osnovne raztopine 1 mg/ml smo pripravili nižje koncentracije- standardne raztopine 0,5ng/ml, 1 ng/ml, 1,5ng/ml, 4ng/ml, 8ng/ml in 12ng/ml), antidepresiva fluvoksamin in maprotilin v fiziološki raztopini (velik odmerek
fluvoksamina- 2,7mg/kg oz. 6,2x10_6mol/kg, majhen odmerek fluvoskamina-1,0 mg/kg oz. 2,3 x10-6 mol/kg, velik odmerek maprotilina - 2,0 mg/kg oz. 6,3 x10-6 mol/kg, majhen odmerek maprotilina - 0,3 mg/kg oz. 9,6 x10-7 mol/kg).
Poskusne živali
Pri poskusih smo uporabili 24 odraslih albino podganjih samic seva Wistar, ki so bile težke od 170 g do 405 g (povprečno 229,96 g). Poskuse smo dokončali pri 21 podganah; 3 podgane so med eksperimentalnim delom poginile; iz znakov (hiperpnoe, tahip-noe in palpitacije) smo sklepali, da so poginile zaradi šokovnega stanja (bodisi anafilaktičnega zaradi nefiziološko povišanih ravni Hi bodisi hemoragičnega zaradi odvzema relativno velike količine krvi).
Živali smo stehtali in jim v potrebušnično votlino vbrizgali odmerek AD, 24 ur kasneje smo podgani ponovno vbrizgali enak odmerek istega AD. Trem podganam AD nismo vbrizgali, ker smo jih uporabili za kontrolno skupino.
Živali smo nato omrtvičili z vbrizgom 20% uretana (0,5 ml/100 g telesne teže). Čas do nastopa kirurške anestezije je bil v povprečju 7 minut, globino anestezije smo preverjali z ugotavljanjem refleksa očesne veznice. Omrtvičeno žival smo pritrdili na secirno mizico. Poseg ni potekal v aseptičnih pogojih, ker je žival ob koncu poskusa poginila. Med kirurško anestezijo smo v sprednjem vratnem predelu odprli polje podkožja in s topo preparacijo iz veziva v levem stranskem vratnem trikotniku osamili jugularno veno, v desnem pa skupno karotidno arterijo. V obe žili smo vstavili plastični kanili in ju s sukanci pritrdili. Kanila, vstavljena v levo jugularno veno, je bila s trokrakim ventilom pritrjena na brizgalki s heparinom in spojino 48/80 oziroma eksogenim Hi. Arterijo smo v zgornjem poteku prevezali s sukancem, v spodnji del smo vstavili kanilo in jo utrdili ter prehodno zapirali s stiščkom; izstopišče kanile smo usmerili v epruveto za lovljenje vzorcev.
Podganam smo odvzeli po dva vzorca krvi, zato smo 55 minut po dodatku AD v vratno veno skozi kanilo vbrizgali 0,5 ml heparina (7.500 IE/kg telesne teže) in tako preprečili strjevanje krvi.
V	poskusih na podganah št. 1-15, kjer smo preučevali vpliv AD na sproščanje Hi iz ma-stocitnih zalog in kinetiko eliminacije Hi iz plazme, smo 5 minut po dodatku heparina v veno vbrizgnili spojino 48/80 (0,05 ^g/g telesne teže).
V	dodatnih poskusih na podganah št. 16-24 smo hoteli podrobneje preučiti vpliv AD na prerazporejanje Hi po tkivih. Podganam smo v veno vbrizgali eksogeni Hi (10^g/g telesne teže) (slika 2).
Zaradi eksperimentalno povzročenih patoloških ravni Hi v plazmi podgane sta živali grozili huda bronhokonstrikcija in odpoved dihanja, zato smo podgano traheotomizirali, da smo ji omogočili preživetje do odvzema zadnjega vzorca krvi.
V	skladu z etičnimi priporočili za biomedicinsko preizkušanje na živalih (48) smo število poskusnih podgan omejili; če so se rezultati pri treh živalih ujemali (standardna napaka povprečja- S.E.M. <15,0%), poskusov nismo nadaljevali.
. Ar, 23 ur _ 55 minut ,	5 minut ,„,__ 5 minut ,, 15 minut ,,
a) AD-►AD-► heparin-► 48/80-► V5-►V,
15
,, 23 ur _ 55 minut , 5 minut b) AD-► AD-► heparin-► Hi 2 minuti
Slika 2. Shematski prikaz dodajanja učinkovin poskusni živali. (a)- poskusi na podganah št. 1-15, kjer smo preučevali vpliv antidepresivov (AD) na sproščanje histamina (Hi) zaradi delovanja spojine 48/80 na ma-stocite in kinetiko njegove eliminacije; 5 in 15 minut po indukciji sproščanja smo odvzeli vzorca krvi (V5 in V15); (b) — dodatni poskusi na podganah št. 16-21, kjer smo podrobneje preučevali vpliv AD na prerazpo-rejanje Hi iz plazme v kri poskusne živali; 2 minuti po dodatku eksogenega Hi smo podganam odvzeli vzorca krvi za ločeno analizo Hi v plazmi in krvi (Vpl in Vkri).
Odvzem in priprava vzorcev
V	prvem nizu poskusov smo 5 in 15 minut po dodatku sproščevalca Hi - spojine 48/80 iz skupne karotidne arterije odvzeli vzorce krvi za določitev ravni Hi v plazmi.
V	drugem nizu smo 2 minuti po vbrizgu zunajtelesnega Hi iz skupne karotidne arterije odvzeli dva vzorca - v prvem vzorcu smo določali raven Hi v plazmi, v drugem vzorcu smo določali koncentracijo Hi v krvi; iz rezultatov smo sklepali na preporazdelitev Hi v obeh telesnih tekočinah.
Pri odvzemu vzorca smo zavrgli prvih nekaj kaplijc; pri predhodnih poskusih se je namreč izkazalo, da stišček na žili najbrž poškoduje njeno steno in sprosti Hi iz bazofil-cev, kar potvori rezultate meritev (4).
Priprava plazme
Za analizo vzorca smo potrebovali vsaj 2-3 ml krvi, večji odvzemi pa bi pomenljivo prizadeli hemodinamiko pri podgani, kar bi bilo za naš poskus nesprejemljivo, saj se ravni Hi med hemoragičnim šokom patološko izravnovesijo (49, 50). Da bi preprečili takšno stanje, smo izgubljeno prostornino telesnih tekočin nadomeščali s sprotno počasno infuzijo fiziološke raztopine po prvem odvzemu krvi.
Vzorce smo dvakrat centrifugirali (25 minut pri 3.200 obratih in dobljeni supernatant še 10 minut pri 10.000 obratih). Plazmi iz supernatanta smo dodali polovično prostornino 2 M HClO4, da smo oborili beljakovine. Po centrifugiranju smo supernatant shranili pri -18°C do nadaljnje analize.
Priprava krvi
Za analizo je zadostoval 1 ml krvi. Vzorcem smo takoj po odvzemu dodali enako prostornino raztopine 1 M HClO4, da smo oborili beljakovine. Vzorce smo dobro premešali in jih zamrznili pri -18°C. Vzorce krvi smo nato odmrznili, jih centrifugirali (25 minut pri 3.200 obratih) in jih zopet zamrznili. Vzorce smo še enkrat odmrznili in centrifugirali
Vpl
Vkri
(25 minut pri 3.200 obratih), supernatant pa shranili pri -18°C do nadaljnje analize. Naprej smo z vzorci za analizo Hi v plazmi in krvi postopali enako.
Analiza vzorcev
Hi smo kondenzirali z OPT, vendar je kondenzacija nespecifična, saj so koncentracije Hi v plazmi podgane zelo nizke (tabela 1), OPT pa reagira tudi z drugimi amini (51). Zato je bilo pred kondenzacijo vzorce smotrno prečistiti v dveh stopnjah:
•	s tekočinsko kromatografijo na kolonah,
•	z izluženjem z organskimi topili (52).
Čiščenje s tekočinsko kromatografijo
Pri tekočinski kromatografiji so bili naši vzorci gibljiva faza, stacionarna faza pa je bil ionski izmenjevalec Dowex.
Stacionarno fazo smo pripravili iz 250 g Dowexa, ki smo mu primešali 2l bidestilirane vode. Ko se je Dowex usedel, smo vodo oddekantirali. Postopek smo ponovili še enkrat.
Suhemu Dowexu smo nato dodali 1 l 2 M NaOH in 30 minut mešali z magnetnim me-šalom; Dowex se je nato usedel, topilo smo oddekantirali, Doweks pa spirali z bidesti-lirano vodo do nevtralnega pH. Postopek smo ponovili z 1 l 2 M HCl. Tako pripravljen Doweks smo zmešali z bidestilirano vodo v razmerju 1:2 in shranili pri +4°C.
V posamezno kolono za tekočinsko kromatografijo smo nanesli po 1 ml te mešanice. Ko se je Doweks usedel, smo v vsako kolono dodali 12 ml 0,1 M fosfatnega pufra, da smo stacionarni fazi uravnali pH na 6,5.
Ko je iz kolone odtekel fosfatni pufer, smo vanje nanesli vzorec, ki smo mu predhodno dodali 4 ml 0,4 M HClO4 in uravnali pH na 6,5. V koloni smo vse skupaj splaknili še z 2 ml fosfatnega pufra. V kolone smo dolili 1 ml bidestillirane vode; ko je ta faza odtekla smo dolili 5 ml 1 M HCl in počakali, da je odtekla iz kolone. V kolonah je ostal Hi. S stacionarne faze smo ga sprostili s 3 ml 4 M HCl, ki smo jo ulovili v epruvete.
Izluženje z organskimi topili
Vzorcu, ki smo ga ulovili iz kolon (okoli 3 ml), smo dodali 0,4 g NaCl, 2,7 ml 5 M raztopine NaOH in 4,5 ml n-butanola. Tako pripravljeno mešanico smo stresali 5 minut in jo nato centrifugirali (5 minut pri 3.200 obratih). 3,5 ml butanolne faze smo prenesli v epruvete s 700 |il 0,1 N raztopine HCl in 3,5 ml n-heptana; mešanico smo tresli 5 minut in ponovno centrifugirali (5 minut pri 3.200 obratih) ter odsesali zgornjo fazo; v spodnji, vodni fazi je ostal Hi.
Kondenzacija in spektrofluorometrično določanje koncentracije histamina
Hi ne absorbira ali oddaja svetlobe v spektru, ki bi ga lahko uporabili za spektrofotome-trično analizo, zato smo Hi kondenzirali z OPT, da je nastal produkt, ki seva fluorescentno svetlobo (izsevalna svetloba), če ga vzbudimo s svetlobo primerne valovne dolžine (vzbujna svetloba) (53).
500 |il vzorca v 0,1 M HCl smo zmešali s 100 |il 1 M NaOH in premešali, nato smo v enakih časovnih intervalih (5 sekund) dodajali 50 |il 0,5% OPT. 4 minute po začetku dodajanja OPT smo vzorcu primešali 50|il 3M HCl v enakih časovnih intervalih. Pripravili smo tudi standardne vzorce Hi (4, 8 in 12 ng/ml Hi za vzorce podgan št. 1-15, kjer smo določali Hi v plazmi, ter 1, 2, 6 in 10 ng/ml Hi za vzorce iz dodatnega niza poskusov na podganah št. 16-24 - analiza Hi v krvi) in jih kondenzirali z OPT. Koncentracijo Hi v vzorcih smo izmerili s spektrofluorometrom. Jakost fluorescence smo merili pri 450 nm (iz-sevalna valovna dolžina) z ekscitacijo pri 360 nm (vzbujna valovna dolžina).
Statistično vrednotenje rezultatov
V okviru enega niza poskusov smo eksperimentalno delo ponovili na treh podganah. Vrednost posamezne koncentracije Hi smo tako izračunali iz 3 statističnih enot in jo izrazili s povprečjem ± standardno napako povprečja (x ± S.E.M).
Posamezne rezultate smo med seboj primerjali s testom t, ki temelji na Studentovi porazdelitvi, prilagojeni za majhne statistične vzorce (3 podgane). Za statistično pomenljivo smo vzeli vrednost p < 0,05 (54, 55).
Izračuni
Plazemske koncentracije Hi 5 minuti po dodatku spojine 48/80 podganam, ki so prejele AD, smo primerjali z ravnjo Hi v vzorcih plazme kontrolnih podgan, ki niso dobile AD. Iz te razlike smo izračunali delež zaviranja povišanja ravni Hi v plazmi (DZ) (56).
DZ _ °spr °5 x 100%
Cspr
DZ smo izračunali kot količnik med razliko koncentracij Hi 5 minut po sprostitvi pri podganah, ki so prejele AD (C5) in koncentracijo Hi 5 minut po sprostitvi pri podganah, ki niso dobile AD (C ).
v spr'
Kinetiko eliminacije smo ocenili iz spremembe ravni Hi v plazmi podgane med prvim in drugim vzorcem - 5 in 15 minut po indukciji sproščanja Hi s spojino 48/80. Podgana je majhna poskusna žival, zato smo ji lahko odvzeli le 2 vzorca krvi za analizo.
Hitrost eliminacije Hi smo količinsko opredelili s hitrostno konstanto eliminacije (kel), ob predpostavki, da nam organizem podgane predstavlja enoten farmakokinetični prostor, kar seveda okrni vrednost naših izsledkov. Koncentracija Hi s časom pada eksponentno (2), zato smo krivulje eliminacije prikazali kot odvisnost logaritmov koncentracij Hi od časa; slika 7 prikazuje eliminacijske krivulje (premice) Hi, katerih nakloni so ustrezne k .
, _ logC15 -logCs
kel _ -
12 -1
Hitrostno konstanto eliminacje Hi izračunamo kot količnik razlike logaritmov koncentracij 5 (log C5) in 15 minut po sprostitvi Hi (log C15) ter razlike časov, ob katerih smo dov-zeli vzorca (t1 in t2).
Pri dodatnih poskusih smo podganam vbrizgali eksogeni Hi (odmerek 10^g/g telesne teže) in jim 2 minuti zatem odvzeli vzorca krvi za ločeno analizo koncentracije Hi v plazmi in v krvi. Podgane št. 16-18 so bile kontrolna skupina, saj jim predhodno nismo dali AD, medtem ko smo podganam št. 19-24 24 ur in 1 uro pred dodatkom eksogenega Hi vbrizgali odmerek AD. Iz rezultatov smo izračunali delež kontrolne koncentracije (DKK), iz katerega smo lahko ocenili vpliv AD na spremembo ravni eksogenega Hi v plazmi oziroma krvi.
DKK = ^AAD
CHi
DKK je razmerje plazemskih koncentraciji Hi v plazmi po vbrizgu eksogenega Hi pri podganah, ki so predhodno dobile antidepresiv (CAD), in podganah, ki ga niso (CHi).
Izračunali smo tudi razmerje med koncentracijo Hi v plazmi in celokupno koncentracijo Hi v krvi (Rpl/kri), s čemer smo ocenil razporejanje Hi iz plazme v kri in ovrednotili vpliv, ki ga imajo aD na to prerazporeditev.
R
C
pl
pl/kri
Ckri
Rpl/kri je razmerje koncentracij Hi v plazmi (Cpl) in krvi (Ckri) podgan 2 minuti po vbrizgu eksogenega Hi.
Rezultati
Kontrolne meritve
V	predhodnih poskusih je bilo določeno, da je koncentracija Hi v plazmi podgane 5 minut po intravenskem vbrizgu heparina 2,8 ± 0,4ng/ml (2); to vrednost imenujemo osnovna raven.
V	drugem sklopu kontrolnih poskusov sta bili določeni koncentraciji Hi 5 in 15 po vbrizgu sproščevalca Hi - spojine 48/80. 5 minut po dodatku spojine 48/80 je bila koncentracija Hi v plazmi podgane 22,46 ± 0,712 ng/ml, po 15 minutah pa je raven Hi padla na 14,85 ± 0,94 ng/ml; kel je 0,0414 ± 0,003min-1 (57).
Te vrednosti smo uporabili za primerjavo z vrednostmi, ki smo jih dobili pri analizi vzorcev krvi podgan, ki so predhodno prejele AD; koncentracijo Hi v plazmi podgane 5 minut po sprostitvi Hi s spojino 48/80 (konc. Hi = 22,46 ± 0,712ng/ml) smo določili za 100% (DZ je 0%). S tem smo tudi količinsko opredelili vlogo AD pri zaviranju sproščanja Hi in pri spremembi kinetike eliminacije Hi iz plazme podgane.
Tabela 5. Ravni histamina (Hi) v plazmi kontrolnih skupin podgan, ki predhodno niso prejele antidepresi-vov (AD). (A) osnovne ravni Hi pri podgani. (B) koncentracije Hi 5 in 15 minut po dodatku spojine 48/80. C^ in C15 — koncentraciji Hi v plazmi 5 in 15 minut po dodatku učinkovin; kd — hitrostna konstanta eliminacije. Vrednosti so podane kot povprečje ± standardna napaka povprečja.
Kontrolna skupina	Učinkovine	C5 (ng/ml)	C,5 (ng/ml)	kel (min-1)
(A)	Brez AD in sproščevalca (B)	Brez AD, s sproščevalcem	heparin heparin, 48/80	2,8 ± 0,4 22,46 ±0,712	14,85 ±0,9	0,0414 ±0,003
Za sklop dodatnih poskusov, pri katerem smo podganam vbrizgali eksogeni Hi (10 ^g/g telesne teže), smo izvedli kontrolni poskus na treh podganah, ki predhodno niso prejele AD. Plazemska koncentracija Hi je bila 2 minuti po vbrizgu Hi 62,97 ± 8,99 ng/ml, raven Hi v krvi pa 118,75 ± 27,48 ng/ml. Obe koncentraciji sta nam služili kot kontroli, s katerima smo primerjali izmerjene vrednosti Hi v plazmi oziroma krvi tistih podgan, ki so pred dodatkom eksogenega Hi prejele AD.
Spremembe v koncentracijah histamina 5 in 15 minut po dodatku spojine 48/80 pri podganah, ki so prejele antidepresiv
Pri podganah, ki so prejele fluvoksamin tako v velikem kot tudi v majhnem odmerku, je bila raven Hi 5 minut po dodatku sproščevalca (1,46 ± 0,09 ng/ml oz. 8,96 ± 0,75 ng/ml) pomenljivo nižja kot pri kontrolni skupini podgan (22,46 ±0,712 ng/ml). DZ povišanja koncentracije je bil 93,75 ± 0,42% pri višjem oz. 60,27 ± 3,36 % pri manjšem odmerku (slika 3).
Tudi koncentracije Hi 15 minut po dodatku spojine 48/80 so bile pomenljivo nižje kot pri kontrolni skupini podgan: 1,36 ± 0,06 ng/ml pri velikem odmerku ter 7,21 ± 0,89 ng/ml pri nizkem. Pri podganah, ki so prejele velik odmerek fluvoksamina in pri katerih smo nato inducirali sprostitev Hi, je bila njegova raven v obeh vzorcih celo nižja od osnovne ravni Hi v plazmi (2,8 ng/ml) (tabela 6).
Konstanti eliminacije Hi iz plazme sta bili 0,0071 ± 0,002 min-1 za velik odmerek fluvoksamina in 0,0220 ± 0,005 min-1 za majhen odmerek.
Tabela 6. Rezultati poskusov pri podganah, ki so 24 ur in 1 uro pred dodatkom sproščevalca histamina — spojine 48/80 prejele odmerek antidepresiva (AD). Podganam smo 5 in 15 minut po dodatku spojine 48/80 odvzeli vzorce krvi in v njih določili koncentracije plazemskega Hi (C5 in C5); v tabeli so koncentracije podane s povprečjem ± standardnim odklonom povprečja. DZ — delež zaviranja sproščanja Hi; Kel - konstanta eliminacije Hi iz plazme poskusne živali
AD / odmerek	C5 (ng/ml)		C15 (ng/ml)		DZ (%)		Kel (min-1)	
Fluvoksamin 2,7 mg/kg	1,46	± 0,09	1,36	± 0,06	93,75	0,42	0,0071	0,002
Fluvoksamin 1 mg/kg	8,96	± 0,75	7,21	± 0,89	60,27	3,36	0,0220	0,005
Maprotilin 2 mg/kg	2,53	± 0,49	1,02	± 0,26	88,97	2,18	0,0920	0,015
Maprotilin 0,3 mg/kg	9,42	± 0,74	4,14	± 1,23	58,21	3,32	0,0848	0,026
25
20
E
15
if
« 10 -
5
0
fluvoksamin fluvoksamin maprotilin	maprotilin	kontrola
2,7 mg/kg	1,0 mg/kg	2,0 mg/kg	0,3 mg/kg
Slika 3. Primerjava koncentracij histamina (Hi) 5 in 15 minut po dodatku spojine 48/80 pri kontrolni skupini podgan, ki niso prejele AD, in podganah, ki so 24 ur in 1 uro pred dodatkom sproščevalca Hi prejele odmerek antidepresiva (ADD) — 2,7mg/kg (6,2 x 10-6 mol/kg) ali 1,0mg/kg (2,3 x 10-6 mol/kg) fluvoskamina ter 2,0 mg/kg (6,3 x 10-6 mol/kg) ali 0,3 mg/kg (9,6 x 10-7 mol/kg) maprotilina. Prikazane so povprečne vrednosti (n = 3).
□ 5 minut ■ 15 minut
□	fluvoksamin 2,7 mg/kg ■	fluvoksamin 1,0 mg/kg
□	maprotilin 2,0 mg/kg
□	maprotilin 0,3 mg/kg
100 -90 -80 --„ 70 -<s 60 -C
> 50 --cs
N
3 40 -(D
3020 -10 0
Slika 4. Deleži zaviranja (DZ) porasta koncentracije histamina (Hi) pri podganah, ki so 24 ur in 1 uro pred dodatkom sproščevalca Hi- spojine 48/80prejele odmerek antidepresiva (AD) — 2,7 mg/kg (6,2 x 10-6 mol/kg) ali 1,0mg/kg (2,3 x 10-6 mol/kg) fluvoskamina oziroma 2,0mg/kg (6,3 x 10-6mol/kg) ali 0,3 mg/kg (9,6 x 10-7 mol/kg) maprotilina. Rezultati so predstavljeni kot povprečje ± standarna napaka povprečja (n = 3).
0,25
0,2 -
0,15-
0,1 --
0,05
0
□	fluvoksamin 2,7 mg/kg
■	fluvoksamin 1,0 mg/kg
□	maprotilin 2,0 mg/kg
□	maprotilin 0,3 mg/kg
■	kontrola
Slika 5. Hitrostne konstante eliminacije (k) histamina (Hi), sproščenega s spojino 48/80 pri kontrolni skupini podgan, ki niso prejele antidepresiva (AD), in podganah, ki so 24 ur in 1 uro pred dodatkom sprošče-valca Hi prejele odmerek AD — 2,7 mg/kg (6,2 x 10-6 mol/kg) ali 1,0 mg/kg (2,3 x 10-6 mol/kg) fluvoskamina ter 2,0 mg/kg (6,3 x 10-6 mol/kg) ali 0,3 mg/kg (9,6 x 10-7 mol/kg) maprotilina. Rezultati so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja (n = 3).
100 T
10
fluvoskamin (24 ur+1 ura pred 48/80) fluvoskamin (1 ura pred 48/80) kontrola
5 minut
15 minut
Čas odvzema
Slika 6. Upadanje plazemskih koncentracij histamina (Hi), sproščenega s spojino 48/80pri (a) kontrolni skupini podgan, ki niso prejele antidepresiva (AD), (b) pri podganah, ki so 1 uro pred dodatkom sproševalca Hi prejele en odmerek 2,7mg/kg fluvoskamina (57), ter (c) pri podganah, ki so odmerek 2,7mg/kg fluvok-samina prejele dvakrat, 24 ur in 1 uro pred indukcijo spročanja Hi. Podane so srednje vrednosti (n = 3).
10 T
1 --
±
o c
ü CO O
0,1 --
0,01
5 minut	15 minut
čas odvzema
Slika 7. Primerjava eliminacije histamina (Hi). Časovna odvisnost koncentracij histamina (Hi) po dodatku spojine 48/80 pri kontrolni skupini podgan, ki niso prejele antidepresiva (AD), in podganah, ki so 24 ur in 1 uro pred dodatkom sproscevalca Hi prejele odmerek AD — 2,7mg/kg (6,2 x 10-6 mol/kg) ali 1,0mg/kg (2,3 x 10-6 mol/kg) fluvoskamina oziroma 2,0mg/kg (6,3 x 10-6 mol/kg) ali 0,3 mg/kg (9,6 x 10-7mol/kg) maprotilina. Podane so srednje vrednosti (n = 3).
Tudi maprotilin je tehtno vplival na ravni Hi. Velik odmerek maprotilina je povzročil 88,97 ± 2,18% zaviranje povišanja koncentracije Hi v plazmi podgane 5 minut po dodatku spojine 48/80, saj je bila raven Hi v plazmi tedaj 2,53 ± 0,49ng/ml. 15 minut po sprostitvi Hi je bila njegova raven v plazmi 1,02 ± 0,26 ng/ml. Obe koncentraciji sta tudi nižji od osnovne ravni Hi. Konstanta eliminacije je bila pri tem odmerku maprotilina 0,0920 ±0,015min-1.
Majhen odmerek maprotilina je povzročil 58,21 ± 3,32% zavrtje povišanja koncentracije Hi po sprostitvi s spojino 48/80; koncentracija 5 minut po sprostitvi je bila 9,42 ± 0,74 ng/ml, 15 minut po sprostitvi pa 4,14 ± 1,23 ng/ml. Konstanta eliminacije Hi je pri podganah, ki so dobile majhen odmerek maprotilina, 0,0848 ± 0,026 min-1 (tabela 6). Izsledki so grafično ponazorjeni na slikah 3-7.
-X-
fluvoksamin 2,7 mg/kg fluvoksamin 1,0 mg/kg maprotilin 2,0 mg/kg maprotilin 0,3 mg/kg kontrola
Spremembe v koncentracijah histamina v plazmi in krvi po dodatku eksogenega histamina podganam, ki so prejele antidepresiv
V tabeli 7 so povzete koncentracije, izmerjene v krvi in plazmi 2 minuti po vbrizgu eksogenega Hi (10 |ig/g) podganam, ki so 24 ur in 1 uro pred tem prejele odmerka 0,1 mg/kg fluvoksamina in 0,3 mg/kg maprotilina.
Tabela 7. Rezultati poskusov, opravljenih na podganah, ki so 24 ur in 1 uro pred vbrizgom eksogenega hi-stamina (Hi) prejele antidepresiv (AD) — odmerek 1,0mg/kg (2,3 x 10-6 mol/kg) fluvoksamina oziroma odmerek 0,3 mg/kg (9,6 x 10-7 mol/kg) maprotilina. Podganam smo 2 minut po dodatku Hi odvzeli vzorce krvi in v njih določili koncentracije Hi v plazmi (C ) in krvi (Ckrj). Rezultati so podani kot povprečje ± standardna napaka povprečja (n = 3). DKKpl — delež kontrolne koncentracije Hi v plazmi; DKKkH - delež kontrolne koncentracije Hi v krvi; RpUkri - razmerje koncentracij Hi v plazmi in krvi (delež plazemskega Hi glede na celokupni Hi v krvi).
AD	Cp, (ng/ml)	DKp, (%)	C M (ng/ml)	DKKM (%)	Rpl(M
Fluvoksamin 1,0mg 11,26± 3,64 17,88 ±5,78 16,26± 4,02 13,70 ±3,38 0,69±0,13
Maprotilin 0,3mg 9,80 ±3,33 15,56 ±5,28 14,17±1,77 11,94 ±1,49 0,68±0,16
Tako pri podganah, ki so prejele fluvoksamin, kot pri podganah, ki so bile podvržene odmerku maprotilina, je bila plazemska koncentracija Hi pomenljivo nižja kot pri kontrolni skupini (62,97 ± 8,99 ng/ml). Plazemska raven Hi je bila pri podganah, ki so prejele fluvoksamin, 11,26 ± 3,64 ng/ml (DKK = 17,88 ± 5,78 %), pri podganah, ki so prejele maprotilin, pa smo izmerili 9,8 ± 3,33 ng/ml (DKK = 15,56 ± 5,28 %) (tabela 7).
Tudi raven Hi v krvi je bila pomenljivo nižja kot pri kontrolnih podganah (118,75 ± 27,48 ng/ml): fluvoksamin je koncentracijo Hi znižal na 13,70 ± 3,38% kontrolne ravni, maprotilin pa na 11,94 ± 1,49 % kontrolne ravni. Koncentraciji Hi v krvi sta bili 16,26 ± 4,02 ng/ml pri fluvoksaminu in 14,17 ± 1,77 ng/ml pri maprotilinu. Razmerje med plazemskim Hi in celokupnim Hi v krvi je bilo pri podganah, ki so dobile fluvoksamin, 0,69 ± 0,13, pri podganah z maprotilinom pa 0,68 ±0,16 (tabela 7). Razlika med razmerjema je statistično
120 t
100 --
E
80 --
^ 60 --
£
40 --
20
□ plazma ■ kri
fluvoksamin 1,0 mg/kg
maprotilin 0,3 mg/kg
kontrola
Slika 8. Primerjava koncentracije histamina (Hi) v plazmi in krvi 2 minuti po dodatku eksogenega Hi (10^g/g) pri kontrolni skupini podgan, ki ni prejela antidepresiva (AD), pri skupini, ki je prejela odmerek 1,0 mg/kg (2,3 x 10-6 mol/kg) fluvoksamina, in pri skupini, ki je prejela 0,3 mg/kg (9,6 x 10-7 mol/kg) maprotilina. Ponazorjene so povprečne vrednosti meritev (n = 3).
0
□	fluvoksamin 1,0 mg/kg ■ maprotilin 0,3 mg/kg
□	kontrola
0
Slika 9. Primerjava razmerij med koncentracijo histamina (Hi) v plazmi in celokupno koncentracijo Hi v krvi 2 minuti po dodatku eksogenega Hi (10 ^g/g) pri kontrolni skupini podgan, ki ni prejela antidepresiva (AD), pri skupini, kije prejela odmerek 1,0mg/kg (2,3 x 10-6 mol/kg) fluvoksamina, in pri skupini, kije prejela 0,3 mg/kg (9,6 x 10-7 mol/kg) maprotilin. Ponazorjene so srednje vrednosti ± standardne napake povprečja.
nepomembna (p > 0,05), njuna razlika z razmerjem pri podganah kontrolne skupine, ki predhodno niso dobile AD (Rpl/kri = 0,54 ± 0,12), pa je zelo majhna. Izsledke smo grafično povzeli na slikah 8 in 9.
Razpravljanje
V raziskavi smo poskušali oceniti vpliv, ki ga imata AD flvuvoksamin in maprotilin na sproščanje in kinetiko eliminacije Hi pri podganah in vivo. Poskusi in vivo omogočajo razčlembo farmakokinetičnih parametrov in medsebojnega vpliva posameznih učinkovin (AD in Hi), kar je bil tudi namen naše raziskave. Res pa je, da homeostatski mehanizmi delno popačijo farmakološke interakcije, zaradi motečega vpliva homeostaze tudi ne moremo zanesljivo opredeliti, kako je do takšnih interakcij med zdravili prišlo. Poskusi in vitro ponujajo natančnejši vpogled v celične in molekularne mehanizme takšnih interakcij, vendar je projiciranje izsledkov iz strokovne literature, ki so bili dobljeni pri poskusih in vitro, v dognanja naših študij zapleten.
Pri naših poskusih smo uporabili premedikacijo (antikoagulacijsko zaščito - heparin, omrtvičenje - uretan), ki pomenljivo vpliva na ravni Hi v organizmu poskusne živali. Heparin naj bi zavrl inducirano sproščanje Hi (58, 59), sam pa povzroča spročanje Hi (60). Tudi uretan spodbuja sproščanje Hi (61, 62), zato smo bili pri vrednotenju izsledkov previdni in smo pri vseh podganah postopali enako, da bi se izognili morebitnim potvorbam rezultatov. Pazljivi smo bili tudi pri laboratorijskem delu; najbolj kočljiva faza je bil odvzem vzorcev, saj bi s fizično poškodbo žile lahko sprostili mastocitni Hi in iznakazili izsledke raziskave.
Na raven Hi vplivajo tudi pogoji poskusnega dela - koncentracije Hi so odvisne od temperature, plazemske ravni Hi cirkadiano nihajo, spreminjajo se tudi z letnimi časi. Zunanje
pogoje poskusov smo poskusili čim bolj poenotiti: vzorce smo vedno odvzeli ob istem času dneva (9-10 ura zjutraj), temperatura okolja je bila dokaj stalna (T = 22 ± 4°C). Na koncentracije Hi vplivajo tudi razlike med posameznimi poskusnimi živalmi - razlike v aktivnosti encimskih sistemov za razgradnjo Hi (histaminska metiltransferaza, dia-minska oksidaza, monoaminska oksidaza), prisotnost morebitnih preobčutljivosti (atopij) in različna odzivnost posamezne podgane na stres (sproščanje CRH) so individualno pogojene.
Na farmakokinetiko AD v organizmu poskusne živali vplivajo zlasti razlike v telesni teži in zgradbi. AD se v organizmu široko porazdelijo (63), vendar je za to potrebno primerno časovno obdobje. Fluvoksamin oziroma maprotilin smo podgani vbrizgali 24 ur in 1 uro pred dodatkom spojine 48/80 oziroma eksogenega Hi. S tem smo dosegli, da se je AD prerazporedil iz osrednjega farmakokinetičnega prostora v obrobnega. Učinkovine smo odmerjali glede na telesno težo podgan, pri čemer smo predpostavili, da se zdravilo prerazporedi po vsem organizmu poskusne živali enakomerno, kar pa se ne bi zgodilo, če AD ne bi imel časa, da se iz plazme razširi drugam po telesu. Podgane se v telesni teži razlikujejo predvsem zaradi deleža maščobnega tkiva - težje podgane imajo več maščevja (večji obrobni farmakokinetični prostor), prostornina osrednjega farmakokinetičnega prostora pa se pri posameznih podganah ne razlikuje pomenljivo. Ker so odmerki normirani na telesno težo, bi se AD, dodan le nekaj ur pred vbrizgom spojine 48/80 oz. eksogenega Hi, pri podganah še zadrževal v osrednjem farmakokinetičnem prostoru ne glede na telesno težo in telesno zgradbo živali. Plazemska koncentracija AD bi bila v tem primeru pri bolj zamaščenih podganah, ki so na račun večje telesne teže prejele večji odmerek zdravila, višja - preiskovani vplivi AD bi zaradi tega bili navidezno (lažno) okrepljeni, to pa bi nas zavedlo v napačno razlago izsledkov.
Vpliv antidepresivov na spro{~anje histamina
Pri podganah št. 1-15 smo s spojino 48/80 sprožili sproščanje Hi; vzorce smo odvzeli 5 in 15 minut po dodatku sproščevalca. Ravni Hi so bile pri vseh podganah, ki so predhodno prejele AD, statistično pomenljivo nižje kot pri kontrolni skupini podgan (p < 0,05).
Fluvoksamin je v velikem odmerku zmanjšal predvideno povečanje ravni Hi za 93,75 ± 0,42%, v majhnem odmerku pa za 60,27%; DZ maprotilina v velikem odmerku je bil 88,97 ±2,18%, v nizkem pa 58,21 ±3,32%. Pri velikih odmerkih fluvoksamina in maprotilina so bile izmerjene koncentracije celo nižje od osnovne ravni Hi (2,80 ng/ml).
DZ je le posredni pokazatelj zaviralnega učinka AD na sproščanje Hi iz endogenih zalog. Zaviranje sproščanja smo predpostavili, ker je bila plazemska koncentracija Hi po sprostivi pri podgani, podvrženi AD, nižja od pričakovane (kontrolne). Ali gre res za zavrto sproščanje, bi lahko potrdili le s poskusi na osamljenih mastocitih in vitro, kjer bi sproščanju Hi sledili z molekulami Hi, ki bi bile predhodno označene z radioaktivnimi izotopi.
Nizke ravni Hi in visoke vrednosti DZ lahko razložimo s hipotezo, da AD zavirajo sproščanje Hi iz mastocitov, kar potrjujejo rezultati različnih raziskav, čeprav sam mehanizem zaviranja še ni natančno poznan. Ferjanova in sod. (64) so s poskusi in vitro pokazali,
da je zaviralni učinek AD bolj poudarjen, ko vzunajceličnem okolju ni Ca++, sposobnost zaviranja pa narašča z hidrofobnostjo molekule AD. AD so amfifilne spojine - imajo hi-drofobni del (ciklično strukturo), ki se vključi v celično opno, in protonirani polarni del (stransko verigo), ki naj bi tekmoval s Ca++ za vezavno mesto na kalmodulinu in drugih beljakovinah v celici. Potrjeno je bilo, da se nekateri AD vežejo na znotrajcelične beljakovine, ki se sicer aktivirajo ob vezavi Ca++; s tem bi AD utegnili ovirati plaz znotrajce-ličnih reakcij, ki vodijo v degranulacijo mastocita (65). Možno je tudi, da AD s samo vključitvijo v celično opno prizadenejo delovanje nekaterih membranskih encimov (fos-folipaze A2, fosfolipaze C, beljakovinske kinaze C), ki so vključeni v mehanizem sproščanja mastocitnega Hi (64).
Zaviranje sproščanja Hi bi lahko bilo tudi posledica precejšnje afinitete AD do receptor-jev za Hi (66). Dokazano je bilo, da imajo nekateri AD zaradi afinitete do receptorjev za Hi podobne lastnosti kot fenotiazinski antagonisti receptorjev H1, ki v nizkih koncentracijah (do 1 mmol/l) zavirajo sproščanje Hi med preobčutljivostnimi reakcijami (67). Pri naših poskusih je takšna razlaga vprašljiva: fluvoskamin ima sicer precejšnjo afiniteto do receptorjev za Hi, kar pa za maprotilin ne velja.
Tudi dognanja Purcella in sod. (68) so v skladu z našimi izsledki. Potrdila so namreč, da AD prizadenejo ponovni privzem 5-HT, ne ovirajo pa privzema Hi, katerega sproščanje je zaradi delovanja AD sicer prizadeto. Da AD vplivanjo na mehanizem inducira-nega sproščanja Hi in ne na osnovno raven Hi v plazmi, sklepamo iz rezultatov preliminarnih poskuskov (69), pa tudi histomorfološka analiza sproščanja Hi iz masto-citov ni dokazala, da bi AD sami vplivali na proces degranulacije (70).
Iz podatkov o DZ za posamezne odmerke AD lahko ocenimo, da je vpliv, ki ga imata preučevana AD na (ne)sproščanje Hi, odvisen od odmerka. Večja odmerka obeh AD sta bolj zavrla povišanje plazemske koncentracije Hi. Ocenimo lahko tudi, da velik odmerek fluvoksamina bolj zavre predvideno povečanje ravni Hi kot velik odmerek mapro-tilina, vendar je razlika DZ majhna (4,36 ± 2,18%), čeprav statistično pomenljiva (p < 0,05). Primerjava zaviralnega učinka majhnih odmerkov ni mogoča; razliki nista statistično pomembni, poleg tega je v majhnem odmerku fluvoksamina 2,3 x10-6 mol/kg telesne teže poskusne živali, v majhnem odmerku maprotilina pa le 9,6x10-7mol/kg.
Rezultate, dobljene pri poskusih na podganah št. 1-3, ki so 24 ur in 1 uro pred sprostitvijo Hi iz mastocitnih zalog prejele velik odmerek fluvoksamina (2,7 mg/kg -6,2x10-6mol/kg), smo primerjali z izsledki Majcnove (57), ki je enak odmerek Hi podganam dodala le enkrat, uro pred dodatkom spojine 48/80. 5 minut po dodatku spojine 48/80 je izmerila koncentracijo Hi 5,8 ± 0,4 ng/ml, 15 minut po sprostitvi pa 3,4 ± 0,76 ng/ml; kel je 0,052 ± 0,012 min-1, DZ pa 74,0 ± 2,1 %. Primerjava izsledkov je pokazala, da so bile ravni Hi v plazmi naših podganah, ki so prejele dva odmerka fluvoksamina v razmiku 24 ur, pomenljivo nižje (slika 6). Sklepamo, da se je AD uspel široko porazdeliti po organizmu in dosegel vsa tkiva, v katerih je nato delovala spojina 48/80; fluvoksa-min je tudi imel možnost, da doseže svoja farmakološka prijemališča in v njih prizadene mehanizem sprostitve, privzema in morda tudi razkroja Hi. Pri podganah, ki so dobile le en odmerek fluvoksamina uro pred sprostitvijo Hi, je bil AD najverjetneje omejen
v osrednjem farmakokinetičnem prostoru (plazmi), zato pa je spojina 48/80 delovala tudi v farmakokinetičnem obrobju (posamezna tkiva) in od tu brez zaviralnega učinka AD lahko sprostila Hi, katerega raven je bila v primerjavi z našimi izsledki zato tudi višja
Vpliv antidepresivov na kinetiko eliminacije histamina iz plazme in njegovo prerazporeditev v kri
Vrednosti kel so bile pri majhnem odmerku fluvoksamina ter pri obeh odmerkih maprotilina pomenljivo večje kot pri kontrolni skupini podgan. Pri velikem odmerku fluvoksamina pa je kel 0,0071 ± 0,002 min-1, torej manjša kot pri kontrolni skupini podgan (0,0414 ± 0,003 min-1), vendar sta ravni Hi 5 in 15 minut po dodatku spojine 48/80 izjemno nizki (1,46 ± 0,09 in 1,36 ± 0,06 ng/ml), med seboj pa se ne razlikujeta pomenljivo, zato je vrednost te kel kot pokazatelja eliminacije vprašljiva.
Hitrostna konstanta eliminacije Hi iz plazme podgan, ki so prejele majhen odmerek fluvoksamina oz. majhen in velik odmerek maprotilina, je pomenljivo večja kot pri podganah, ki AD niso prejele. Sklepamo, da AD vplivajo na eliminacijo Hi. Podobne izsledke so dobili pri raziskavah, ki preučevale vpliv TCA amitriptilina na eliminacijo Hi iz plazme podgane (71). Spremembe v koncentraciji Hi 5 in 15 minut po njegovi sprostitvi so nam služile zgolj za oceno očiščevanja Hi iz plazme, nismo pa iz teh poskusov mogli natančneje opredeliti, kateri procesi in v kolikšni meri doprinesejo k eliminaciji iz plazme. Raven merljivega Hi v plazmi je odraz ravnovesja med njegovima sproščanjem in eliminacijo. V naših poskusih smo sprožili eksplozivno sproščanje Hi s spojino 48/80, ki Hi iz mastocitnih zalog sprosti takoj, ko doseže ciljne celice - mastocite. Eliminacija, ki sledi sproščanju Hi s spojino 48/80, je počasnejša od eliminacije eksogenega Hi, ki je podgani vbrizgan (72). Temu botruje postopno razporejanje spojine 48/80 po tkivih; v trenutku, ko spojina 48/80 doseže tkivo, bogato z mastociti, sprosti Hi, ki se lahko in situ razgradi, še preden bi spojina 48/80 utegnila sprostiti večje količine Hi v tkivih, ki jih doseže kasneje. Proces eliminacije prevlada nad procesom sproščanja, zato naj bi se spremenila kel. S tem smo poskušali razložiti vpliv, ki ga imata fluvoskamin in ma-protilin na kinetiko eliminacije Hi. AD dosežeta tkiva, preden vbrizgamo spojino 48/80, saj jih dodamo 24 ur in 1 uro pred sproženjem sproščanja; v tem času AD že delujeta na mastocite in vzpostavita mehanizem zaviranja. Ko spojina 48/80 doseže mastocit, je mehanizem za sproščanje Hi pri njem že zavrt, količina sproščenega Hi manjša, eliminacija manjših količin Hi pa zato bolj učinkovita in pospešena.
Z dodatnimi poskusi na podganah št. 16-24 smo poskušali dopolniti ali ovreči to hipotezo. Z dodatkom eksogenega Hi smo se izognili postopnemu izločanju Hi in predhodnemu vplivu AD na njegovo sproščanje. Meritve so pokazale statistično pomenljivo (p < 0,05) znižanje ravni Hi v primerjavi s kontrolno skupino podgan, ki AD niso prejele. Iz tega sklepamo, da AD neposredno pospešita eliminacijo Hi iz plazme. Farmakokine-tika eliminacije Hi je dvostopenjska: v prvi (hitri) fazi prihaja do prerazporeditve Hi iz osrednjega farmakokinetičnega prostora v obrobje; v drugi (počasni) fazi je nižanje plazemske ravni Hi posledica njegove presnove. AD bi utegnili vplivati na drugo stopnjo, in sicer na encimski mehanizem razgradnje Hi. Trditve, ki smo jih v zvezi s to možnostjo zasledili v strokovni literaturi, si prihajajo v navzkrižje. Nowak in sod. (73) so hipotezo, da AD
prizadenejo razkroj Hi, ovrgli, medtem ko Purcell in sod. (74) takšno tezo zagovarjajo in celo predpostavljajo, da zaviralni vpliv AD na sproščanje Hi ni posledica zavrtega izločanja, pač pa izključno posekretornih mehanizmov - pospešene razgradnje in privzema Hi v tkiva.
Koncentracija Hi v plazmi kontrolne skupine podgan, ki smo jim Hi vbrizgali, ne da bi jim predhodno dali AD, je bila 62,97 ± 8,99 ng/ml, kar je 53,03% celokupnega Hi v krvi (118,75 ± 27,48 ng/ml). Irmanova in sod. so določili, da je v plazmi podgan, ki niso prejele eksogenega Hi, osnovna raven plazemskega Hi 18,84 ± 1,40% celokupnega Hi v krvi, kar je pomenljivo manj, kot smo izmerili mi po dodatku eksogenega Hi. Ugotovili so tudi, da razmerje celokupni Hi v krvi :Hi v plazmi po vbrizgu eksogenega Hi s časom narašča (72), kar se ujema z izsledki naših kontrolnih meritev v dodatnem sklopu poskusov.
Domnevamo, da takšnim izidom botruje postopno prerazporejanje eksogenega Hi iz plazme (osrednji farmakokinetični prostor) v tkiva in celice, ki so v našem primeru kri oziroma krvni elementi (obrobni farmakokinetični prostor). Na celični ravni je vzrok lahko pospešen privzem Hi v celice (krvne elemente), bolj poudarjena razgradnja Hi ali kombinacija obojega. Na ravni organizma bi dinamiko tega prerazporejanja, ki sledi zakonom dvoprostorskega farmakokinetičnega modela, lahko natančneje opredelili le, če bi razpolagali z večjim številom vzorcev krvi, odvzetih v različnih časovnih razdobjih.
V naši raziskavi smo hoteli natančneje osvetliti vpliv AD na prerazporejanje Hi iz plazme v kri. V literaturi smo zasledili, da je privzem Hi v krvne celice zelo hiter (75, 76) in domnevali smo, da utegnejo AD pospešiti ta privzem. AD vplivajo na ločeni privzem 5-HT in Hi v celice; celo zavrto sproščanje Hi bi utegnilo biti odraz spremenjenega prevzema Hi in 5-HT v mastocit (77).
Domnevali smo, da AD prizadenejo privzem 5-HT v mastocit (kot to počnejo v osrednjem živčevju), kar potrjujejo izsledki nekaterih raziskav in vitro. Mastocit favorizirano privzema 5-HT pred Hi (74); zaradi oviranega privzema 5-HT bi bil povečan privzem Hi, kar bi se v naših poskusih in vivo odražalo v pospešeni eliminaciji Hi iz plazme. Pomanjkljivost takšne razlage je predvsem dejstvo, da maprotilin ne vpliva na prevzem 5-HT. Poleg tega moramo poudariti, da se 5-HT nahaja skupaj s Hi le v sekretornih zrncih mastocitov glodalcev in bi bilo zato projiciranje naših rezultatov v humano medicino vprašljivo.
Pri podganah smo 2 minuti po vbrizgu eksogenega Hi (10 |ig/g) izmerili nižjo koncentracijo tako plazemskega kot tudi krvnega Hi v primerjavi z ustreznimi koncentracijami pri kontrolni skupini. Namen dodajanja eksogenega Hi je bil potrditi hipotezo, da preiskovana AD vplivata na hitrost eliminacije Hi iz plazme neodvisno od sproščanja Hi iz mastocitov. Koncentracije Hi pri podganah, ki so prejele AD, so bile v obeh primerih pomenljivo nižje kot pri kontrolni skupini, ki ni dobila AD. Sklepamo, da sta AD pospešila eliminacijo in tako izpolnila naše predpostavke.
Domnevali smo tudi, da je pospešena eliminacija posledica privzema Hi v celice in njegove vezave v tkivih. Našo domnevo bi potrdil vzpon ravni Hi v krvi na račun zmanjšane koncentracije Hi v plazmi, kar bi se kazalo v spremembi količnika Rpl/kri - nižja vrednost
tega količnika bi bila posredni pokazatelj razporeditve Hi iz plazme v kri (krvne elemente). Eksperimentalni podatki so ta del naše hipoteze ovrgli, saj je bil Rpl/kri pri podganah, ki so prejele fluvoksamin (Rpl/kri = 0,69 ± 0,13) in maprotilin (Rpl/kri = 0,68 ± 0,16), celo višji od Rpl/kri pri kontrolni skupini podgan (Rpl/kri = 0,54 ± 0,12). Sklepamo, da fluvoksamin in maprotilin eliminacije Hi ne pospešita tako, da bi spodbujala njegovo vezavo v krvne elemente. Domnevamo lahko, da je pospešena eliminacija Hi posledica njegove vezave v druga tkiva (jetrno tkivo, mišičnina, maščevje), ki bi jo utegnili spodbuditi AD. V tkivih naj bi se Hi nadaljnje razkroji, zato je njegova raven izrazito padla tako v plazmi kot v krvi. Manj verjetno je, da Hi in AD kemično reagirata; nastala spojina bi bila v primerjavi z (bazično - polarno) molekulo Hi bolj hidrofobna in bi zato lažje prehajala v lipofilne farmakokinetične prostore (maščevje). Upoštevati moramo tudi možnost, da je AD omogočil vezavo Hi na beljakovine; ker smo jih med analizo vzorcev oborili, koncentracije tako vezanega Hi ne bi mogli izmeriti - ugotovljene nizke ravni Hi bi bile artefakt. Z nadaljnjimi raziskavami in vitro bi lahko pojasnili takšne hipoteze, ki so brez podrobnejših izsledkov zgolj na ravni špekulacij.
Preverili smo, da AD pri našem načinu določanja Hi ne vplivajo na fluorecsenco končnega produkta, zato verjamemo, da preiskovana AD povzročita take farmakološke (biološke oziroma fizikalno-kemijske) spremembe v telesu, ki omogočajo hitrejšo eliminacijo Hi iz plazme.
Z izsledki naše raziskave lahko delno pojasnimo, zakaj se AD empirično priporočajo kot učinkovito zdravilo pri blaženju nekaterih oblik koprivnice nepojasnjenega izvora (78-80). Prav tako lahko delno razložimo analgetični učinek AD, saj nižajo ravni Hi kot endogenega algogena (81, 82). AD zmanjšujejo eksperimentalno vnetje pri podgani (83, 84), kar utegne tudi biti povezano s sposobnostjo AD, da zavrejo sproščanje Hi in pospešijo njegovo eliminacijo, kot smo dokazali v naši raziskavi.
Zaključki
V naši raziskavi smo ugotovili, da fluvoksamin v odmerkih 2,7 mg/kg in 1,0 mg/kg ter maprotilin v odmerkih 2,0 mg/kg in 0,3 mg/kg pomenljivo vplivata na farmakokinetiko Hi pri podgani in vivo. AD smo podganam dali 24 ur in 1 uro pred dodatkom eksogenega Hi oziroma sproščevalca Hi iz mastocitnih zalog - spojine 48/80, s čemer smo dosegli, da se je AD široko porazdelil po organizmu in izzval maksimalne učinke.
Vsi odmerki obeh AD zavrejo predvideno povišanje koncentracije Hi po dodatku spojine 48/80. Odmerek 2,7 mg/kg fluvoksamina je v naši raziskavi pomenljivo bolj zavrl to povišanje kot enak odmerek fluvoksamina, ki je bil podgani dan le v enem odmerku uro pred indukcijo sproščanja Hi. Sposobnost zaviranja je bila odvisna tudi od odmerka AD -večji odmerki so izzvali bolj izrazito zaviranje.
Majhen odmerek fluvoksamina ter velik in majhen odmerek maprotilina so povzročili pospešeno eliminacijo Hi iz plazme poskusne živali.
Fluvoksamin in maprotilin v majhnih odmerkih pomenljivo znižata raven Hi, ki smo ga podgani dodali eksogeno, tako v krvi kot v plazmi. Nobeden od AD pa ne povzroči prerazporeditve Hi iz plazemske tekočine v kri.
Zahvala
Iskreno se zahvaljujem svoji mentorci, doc. dr. Tatjani Irman - Florjane, ki mi je s svojo iskrivo domiselnostjo odstrla prenekatero neznanko in me s svojim energičnim razumom popeljala v zapleteni svet znanstvenega raziskovanja.
Zahvaljujem se Mojci Kranjec in Neni Dolžan, ki sta s svojo potrpežljivostjo, delovnim elanom, spretnostjo in zanesljivostjo omogočili, da so se abstraktne zamisli udejanile v praksi.
Hvaležen sem vsem zaposlenim na Inšitutu za farmakologijo in eksperimentalno toksi-kologijo, ki so s svojo toplino in prijaznostjo omogočili, da sem preživel nepozabno leto.
Posebna zahvala gre vsem mojim, ki so mi bili vedno ob strani, ko sem jih potreboval. Nalogo posvečam Nini in Janu.
Literatura
1.	Coomes MW. Amino acids metabolism. In: Devlin TM, ed. Textbook of biochemistry with clinical correlations. New York: Willey, 1997: 445-88.
2.	Irman - Florjanc T, Erjavec F. Kinetics of histamine and tele-methylhistamine elimination from rat plasma. Agents Actions 1993; 38: 304-6.
3.	Sheinmann BD, Devalia JL, Wylie G, Davies RJ. Histamine and N-t-methylhistamine in the circulation during intravenous infusion of histamine in normal volunteers. Agents Actions 1988; 25: 263-6.
4.	Babe KS, Serafin WE. Histamine, bradikykinin and their antagonists. In: Hardman JG, Limbird LE, Molinoff PB, Ruddon RW, Goodman Gillman A, eds. Goodman & Gillman's the pharmacological basis of therapeutics, 9th ed. New York: McGraw, 1996: 581-600.
5.	Rang HP, Dale MM, Ritter JM. Pharmacology. 3rd ed. Edinbourgh: Churchil, 1996: 214-45, 576-95.
6.	Kalisnik M. Oris histologije z embriologijo. Ljubljana: DZS, 1990: 6-22.
7.	Benyon RC. The human skin mast cell. Clin Exp Allergy 1989; 19: 375-87.
8.	Irman - Florjanc T. Prispevek k poznavanju kinetike histamina in tele-metilhistamina v organizmu poskusne zivali [doktorska disertacija]. Ljubljana: Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, 1993.
9.	Irman - Florjanc T, Carman - Krzan M, Erjavec F. A comparative study of histamine and methylhistamine levels in various species under physiological conditions. Iugoslav Physiol Pharmacol Acta 1978; 14:92-4.
10.	Oosting E, Neugebauer E, Keyzer JJ, Lorenz W. Determination of histamine in human plasma: the European external quality study 1988. Clin Exp Allergy 1990; 20: 348-57.
11.	Khandelwal JK, Hough LB, Morrishow AM, Green JP. Measurement of tele-methyhistamine and hi-stamine in human cerebrospinal fluid, urine, and plasma. Agents Actions 1982; 12: 583-90.
12.	Bracket DJ, Hamburger SA, Lerner MR, et al. An assesment of plasma histamine concentrations during doumented endotoxic shock. Agents Actions 1990; 31: 263-74.
13.	Alam MK, Sasaki M, Watanabe T, Maeyama K. Simultaneous determinations of histamine and N-tau-methylhistamine by high-performance liquid chromatography-chemiluminescence coupled with imobilized diamine oxidase. Analytic Biochem 1995: 229: 26-34.
14.	Keyzer JJ, Breukelman H, Wollhers BH, Richardson FJ, De Monchy JGR. Measurement of N-methy-histamine concentrations in plasma and urine as a parameter for histamine release during anaphylac-toid reactions. Agents Actions 1985; 16: 76-9.
15.	Theoharides TC, Singh LK, Boucher W, et al. Corticotropin-releasing hormone induces skin mast cell degranulation and increased vascular permeability, a possible explanation for its proinflamatory effects. Endocrinology 1998; 139: 403-13.
16.	Kubota Y. Effects of tubocurarin on plasma histamine concentration in the rat. Corelation with the release of histamine from isolated mast cells. Br J Anaesth 1986; 58: 1397-403.
17.	Cross LJ, Heaney LG, Ennis M. Histamine release from human bronhoalveolar lavage mast cells by neurokinin A and bradykinin. Inflamm Res 1997; 46: 306-9.
18.	Fozard JR, Pfannkuche HJ, Schuurman HJ. Mast cell degranulation following adenosine A3 receptor activation in rats. Eur J Pharmacol 1996; 298: 293-7.
19.	Di Bello MG, et al. Histamine release from rat mast cells induced by metabolic activation of drugs of abuse into free radicals. Inflamm Res 1998; 47: Suppl 1: 122-30.
20.	Reeves JJ, Jones CA, Sheehan MJ, Vardey CJ, Whelan CJ. Adenosine A3 receptors promote degranulation of rat mast cells both in vitro and in vivo. Inflamm Res 1997; 46: 180-4.
21.	Sakurai E, Gunji E, Iizuka Y, Hikichi N, Maeyama K, Watanabe T. In vivo measurement of histamine in rat blood effects of compound 48/80 and histamine receptor antagonists. J Pharm Toxicol Methods 1993; 29: 105-9.
22.	Johnson HJ, Beaven FJ, Erjavec F, Brodie BB. Selective labeling and release of nonmast-cell histamine. Life Sci 1966; 5:115-23.
23.	Paton WDM. Compound 48/80: a potent histamine liberator. Br J Pharmacol 1951; 6: 499-508.
24.	Kassel O, Amrani Y, Landry Y, Bronnet C. Mast cell activation involves plasma membrane potential and thapsigargin-sensitive calcium pools. Fundam Clin Pharmacol 1995; 9: 531-9.
25.	Neugebauer E, Rixen D, Garcia - Caballero M, Scheid B, Lorenz W. Time sequence of histamine release and formation in rat endotoxic schock. Schock 1994; 1: 299-306.
26.	Cotran RS, Kumar V, Robbins SL. Robbin's Pathologic basis of disease, 5th ed. Philadelphia: Saunders, 1994: 64-75.
27.	Brandes LJ, Queen GM, LaBella FS. Potent interaction of histamine and polyamines at microsomal cytochrome P450, nuclei, and cromatin from rat hepatocytes. Cell Biochem 1998; 69: 233-43.
28.	Horvat M. Anafilaktični šok. In: Kocjančič A, Mrevlje F, eds. Interna medicina. Ljubljana: EWO & DZS, 1998: 126-7.
29.	Kaplan HI, Sadock BJ, Cancro R. Synopsis of psychiatry: Behavioural sciences/Clinical psychiatry. Baltimore: Williams & Willkins, 1997: 933-1125.
30.	Baldessarini RJ. Drugs and the treatment of psychiatic disorders: Depression and mania. In: Hardman JG, Limbird LE, Molinoff PB, Ruddon RW, Goodman Gillman A, eds. Goodman & Gillman's the pharmacological basis of therapeutics, 9th ed. New York: McGraw, 1996: 431-59.
31.	Erjavec F. Pregled učinkov serotonina in njegovih antagonistov na osrednje živčevje. Med Razgl 1985; 2: 193-206.
32.	Sket D. Patofiziološke osnove antidepresivnega zdravljenja. In: Romih J, Žmitek A, eds. Zdravljenje z an-tidepresivi. Begunje: Psihiatrična bolnišnica Begunje, 1996: 30-56.
33.	Leonard BE. Mechanism of action of antidepressants. CNS Drugs 1995; 4: 1-12.
34.	Leonard BE. Fundamentals of Psychopharmacology. New York: Willey, 1998: 107-24.
35.	Lamberti C, Ipponi A, Bartolini A, Schunack W, Malmberg-Aiello P. Antidepressant-like effects of endogenous histamine and of two histamine H1 receptor agonists in the mouse forced swimm test. Br J Pharmacol 1998; 123: 1331-6.
36.	Jorgensen H, Knigge U, Kjaer A, Warberg J. Interactions of histaminergic and serotoninergic neurons in the hypothalamic regulation of prolactin and ACTH secretion. Neuroendocrinology 1996; 64:329-36.
37.	Laitinen KSM, Tuomisto L, Laitinen JT. Endogenous serotonin modulates histamine release in the rat hypothalamus as measured in vivo microdialisys. Eur J Pharmacol 1995; 285: 159-64.
38.	Fleckstein AE, Lookingland KJ, Moore KE. Effects of histamine on 5-hydroxytryptaminergic neuronal activity in the rat hypothalamus. Eur J Pharmacol 1994; 254; 35-42.
39.	Leonard BE. New approaches to treatment of depression. J Clin Psychiatry 1996; 57: Suppl 4: 26-33.
40.	Frazer A. Pharmacology of antidepressants. J Clin Psychopharmacol 1997; 17: Suppl 1: 1-18.
41.	Jakovljevic M. Klinična farmakologija antidepresivov: dileme, miti, dejstva. In: Romih J, Žmitek A, eds. Zdravljenje z antidepresivi. Begunje: Psihiatrična bolnišnica Begunje, 1996: 57-81.
42.	Hyttel J. Pharmacological characterization of selective serotonin reuptake inhibitors (SSRIs). Int Clin Psychopharmacol 1994; 9: Suppl 1: 19-26.
43.	Lokar J. Uporaba antidepresivov v praksi. In: Romih J, Žmitek A, eds. Zdravljenje z antidepresivi. Begunje: Psihiatrična bolnišnica Begunje, 1996: 97-108.
44.	Newhouse P. Use of serotonin selective reuptake inhibitors in geriatric depression. J Clin Psychiatry 1996; 57: Suppl 5: 12-22.
45.	Wilde MI, Plosker GL, Benfield P. Fluvoxamine. An updated review of its pharmacology, and therapeutic use in depressive illness. Drugs 1993; 46: 895-924.
46.	Kasper S, Dotsch M, Kick H, Vieira A, Moller HJ. Plasma concentrations of fluvoxamine and mapro-tiline in major depression: implications on therapeutic efficacy and side effects. Eur Neuropsychophar-macol 1993; 3: 13-21.
47.	Hewer W, Rost W, Gattaz WF. Cardiovascular effects of fluvoxamine and maprotiline in depressed patients. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 1995; 246: 1-6.
48.	Dolenc A. Medicinska etika in deontologija. Ljubljana: Tangram, 1993: 126-7.
49.	Nagy S, Nagy A, Adamicza A, Szabó I, Tárnoky K, Traub A. Histamine level changes in the plasma and tissues in hemorrhagic shock. Circ Shock 1986; 18: 227-39.
50.	Johnson KB, Charya RV, Wiesmann WP, Pearce FJ. Plasma and tissue histamine changes during hemorrhagic shock in the rat. Shock 1995; 3: 343-9.
51.	Izumi H, Hoshi S, Mue S, Takishima T, Sato H, Aoki T. The determination of blood histamine in asthmatic patients with a simple and sensitive method. Tohoku J Exp Med 1984; 143: 79-85.
52.	Lorenz W, Neugebauer E. Fluorometric assays. In: Uvnas B, ed. Histamine and histamine antagonists. Berlin: Springer-Verlag, 1991: 9—30.
53.	Shore PA, Burkhalter A, Cohen VH. A method for the fluorometric assay of histamine in tissues. J Pharmacol Exp Ther 1959; 127: 138-41.
54.	Adamič S. Temelji biostatistike. Ljubljana: Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, 1989: 44-53, 65-81.
55.	Ludbrook J. Issues in biomedical statistics: comparing means under normal distribution theory. AustNZJ Surg 1995; 65: 267-72.
56.	Bourne DWA, Triggs EJ, Eadie MJ. Pharmacokinetics for the non-mathematical. Lancaster: MTB Press, 1969: 63-6,
57.	Majcen M. Vpliv antidepresivov na sproščanje histamina pri podgani [raziskovalna naloga]. Ljubljana: Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Inštitut za farmakologijo in eksperimentalno toksikologijo, 1997.
58.	Inase N, Schreck RE, Lazarus SC. Heparin inhibits histamine release from canine mast cells. Am J Physiol 1993; 264: 387-90.
59.	Lucio J, D'Brot J, Guo CB, et al. Immunologic mast cell-mediated responses and histamine release are attenuated by heparin. J Appl Physiol 1992; 73: 1093-101.
60.	Lorenz W, et al. Histamine release in man by propanidid and thiopentone: Pharmacological effects and clinical consequences. Br J Anaesth 1972; 44: 355-69.
61.	Modrzejewski E, Bobyk A, Strobel - Kaminska T. Effect of urethane anaesthesia on histamine liberation. Acta Physiol Pol 1967; 18: 247-52.
62.	Moss J. Histamine release in anaesthesia and surgery. N Engl Reg Allergy Proc 1985; 6: 28-36.
63.	DeVane CL, Gill HS. Clinical pharmacokinetics of fluvoxamine: applications to dosage regimen design. J Clin Psychiatry 1997; 58: Suppl 5: 7-14.
64.	Ferjan I, Erjavec F. Characteristics of the inhibitory effect of tricyclic antidepressants on histamine release from rat peritoneal mast cells. Inflamm Res 1996; 45: Suppl 1: 17-8.
65.	Theoharides TC, Kops SK, Bondy PK, Askenase PW. Differential release of serotonin without comparable histamine under diverse conditions in the rat mast cell. Biochem Pharmacol 1985; 34: 1389-98.
66.	Velasco A, Alamo C, Hervas J, Carvajal A. Effects of fluoxetine hydrochloride and fluvoxamine maleate on different preparations of isolated guinea pig and rat organ tissues. Gen Pharmacol 1997; 28: 509-12.
67.	Lichtenstein LM, Gillespie E. The effects of the H1 and H2 antihistamines on allergic histamine release and its inhibition by histamine. J Pharmacol Exp Ther 1975; 192: 441-50.
68.	Purcell WM, Hanahoe TH. Differential release of histamine and 5-hydroxytriptamin from rat mast cells: the contribution of amine uptake to the apparent pattern of secretion. Agents Actions 1990; 30: 38-40.
69.	Irman - Florjanc T. Amytriptilinne affects the kinetics of histamine in cat and in rat. Inflamm Res 1998: (v pripravi).
70.	Berlin G, Enerback L. Non-differential inhibition of histamine and serotonin release from mast cells by amitriptyline. Agents Actions 1986; 18: 89-91.
71.	Irman - Florjanc T, Stanovnik L. Tricyclic antidepressants change plasma histamine kinetics after its secretion induced by compound 48/80 in the rat. Inflamm Res 1998; 47: Suppl 1: 26-7.
72.	Irman - Florjanc T, Erjavec F. Histamine and tele-methylhistamine ratios in rat blood as a function of time after i. v. injection of compound 48/80 or histamine. Agents Actions 1992; spec conf issue: 394-7.
73.	Nowak JZ, Zawilska J. Histamine in the rat brain: effect of acute and chronic treatment with tricyclic antidepressants and Hl-antihistaminics. Polish J Pharmacol Pharmacy 1985; 37: 147-62.
74.	Purcell WM, Cohen DL, Hanahoe TH. Contribution of post-secretory mechanisms to the observed pattern of histamine and 5-hydroxytryptamine secretion from peritoneal rat mast cells in response to compound 48/80. Int Arch Allergy Appl Immunol 1989; 90: 347-94.
75.	Tasaka K. Histamine in blood. In: Uvnas B, ed. Histamine and histamine antagonists. New York: Springer-Verlag, 1991: 511-20.
76.	Corbel S, Schneider E, Lemoine FM, Dy M. Murine hematopoetic progenitors are capable of both hi-stamine synthesis and uptake. Blood 1995; 86: 531-9.
77.	Ferjan I, Erjavec F. Changes in histamine and serotonin secretion from rat peritoneal mast cells caused by antidepressants. Inflamm Res 1996; 45: 141-4.
78.	Omerod AD. Urticaria. Recognition, causes and treatment. Drugs 1994; 48: 717-39.
79.	Sabroe RA, Kennedy CT, Archer CB. The effects of topical doxepin on responses to histamine, substance P and prostaglandin E2 in human skin. Br J Dermatol 1997; 137: 386-90.
80.	Sheehan - Dare RA, Henderson MJ, Cotterill JA. Anxiety and depression in patients with chronic urticaria and generalised pruritus. Br J Dermatol 1990; 123: 769-74.
81.	Terenius L. Biochemical mediators in pain. Triangle 1981; 20: 19-26.
82.	Butler SH, Weil - Fugazza J, Godefroy F, Besson J. Reduction of arthritis and pain behaviour following chronic administration of amitryptiline or imipramine in rats with adjuvant-induced arthritis. Pain 1985; 23: 159-75.
83.	Michelson D, Misiewicz - Poltorak B, Raybourne RB, Gold PW, Sernberg EM. Imipramine reduces the local inflammatory response to carrageenin. Agents Actions 1994; 42: 25-8.
84.	Bianchi M, Rossoni G, Sacerdote P, Panerai AD, Berti F. Effects of clomipramine and fluoxetine on subcutaneous carrageenium-induced inflammation in rat. Inflamm Res 1995; 44: 466-9.
Prlspelo 29.10.1998