Anžej Hladnik1*, Ivana Sedej2*, Vita Dolžan3, Miha Arnol4, Metka Lenassi5 Zunajcelični vezikli v urinu kot vir novih bioloških označevalcev okvare presajene ledvice Urinary Extracellular Vesicles as Novel Biomarkers of Kidney Allograft Injury IZvLEČEK KLJUČNE BESEDE: presaditev ledvic, biološki označevalci, zunajcelični vezikli, urin, okvara presajene ledvice, zavrnitev presadka, eksosomi, mikrovezikli Presaditev ledvice je oblika nadomestnega zdravljenja končne ledvične odpovedi z naj- boljšimi kliničnimi rezultati. Dolgoročno preživetje presajene ledvice je med drugim odvi- sno od razvoja zavrnitvenih reakcij, ki jih glede na mehanizem nastanka delimo na T-celično in s protitelesi posredovano zavrnitev, in drugih dejavnikov, ki prispevajo k okvari pre- sadka. Za odkrivanje okvare presadka in ustrezno zdravljenje bolnike spremljamo s pomoč- jo kliničnih in laboratorijskih meril (kot so serumski kreatinin, ocenjena glomerulna filtracija in proteinurija). Ker so ti nespecifični, dokončno diagnozo postavimo na podlagi histo- patološkega izvida igelne ledvične biopsije, ki je invazivna in posledično težko ponovljiva preiskava. To diagnostično vrzel bi lahko zapolnili novi označevalci okvare, ki bi bili pri- dobljeni neinvazivno in bi tako omogočali rednejše spremljanje in hitrejše odkrivanje okva- re presadka. Kot vir tovrstnih označevalcev je najprimernejši urin, saj njegova sestava posredno odraža stanje ledvic, poleg tega pa je enostavno pridobiti velike količine vzor- ca v pogostejših intervalih. Kot urinski označevalci okvare ledvic so najbolje raziskane številne beljakovine, pa tudi različne nukleinske kisline. Med izjemno obetavne nove ozna- čevalce ledvične okvare se uvrščajo zunajcelični vezikli. Zunajcelični vezikli so hetero- gena populacija z membrano obdanih kroglastih delcev, ki se sproščajo iz vseh celic in kopičijo v telesnih tekočinah. S svojimi biofizikalnimi lastnostmi in značilno molekularno sestavo posredno odražajo lastnosti in stanje starševskih celic. Poleg tega na različne nači- ne pomembno sodelujejo pri fizioloških ali patoloških procesih v tarčnih celicah, zaradi česar so prepoznani tudi kot možen vir sodobnih terapevtskih pristopov. V tem preglednem članku bomo predstavili zunajcelične vezikle v urinu kot nove neinvazivne biološke ozna- čevalce za odkrivanje okvare presajene ledvice. *Avtorja si delita mesto prvega avtorja. 1 Anžej Hladnik, dr. med., Osnovno zdravstvo Gorenjske, Zdravstveni dom Tržič, Blejska cesta 10, 4290 Tržič; Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana 2 Ivana Sedej, Klinični oddelek za nefrologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška cesta 7, 1000 Ljubljana 3 Prof. dr. Vita Dolžan, Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana 4 Prof. dr. Miha Arnol, Klinični oddelek za nefrologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška cesta 7, 1000 Ljubljana; Katedra za interno medicino, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana 5 Izr. prof. dr. Metka Lenassi, Inštitut za biokemijo in molekularno genetiko, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana; metka.lenassi@mf.uni-lj.si 81Med Razgl. 2022; 61 (1): 81–103 • Pregledni članek mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 81 reakcije. Glede na mehanizem nastanka jih delimo na T-celično (angl. T-cell media- ted rejection, TCMR) in s protitelesi posredo- vano zavrnitev (angl. antibody mediated rejection, ABMR). Ključni namen sledenja bolnikov po presaditvi je spremljanje delovanja in pravo- časna zaznava okvare presajene ledvice, preden ta postane nepopravljiva, ter diagnozi ustrezna prilagoditev zdravljenja. Delovanje presajene ledvice spremljamo s pomočjo kliničnih in laboratorijskih meril, kot so serumski kreatinin, ocena glomerulne filtracije (oGF) in proteinurija. Omenjeni označevalci so nespecifični, zato dokončno diagnozo postavimo na podlagi histopato- loškega izvida igelne ledvične biopsije. To je invaziven poseg z možnostjo zapletov, ki 82 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … aBSTRaCT KEY WORDS: kidney transplantation, biomarkers, extracellular vesicles, urine, kidney injury, allograft rejection, exosomes, microvesicles Kidney transplantation is the treatment of choice for end-stage kidney failure with the best clinical outcomes. Slovenia has been a member of Eurotransplant since 2000. The average number of kidneys transplanted annually is 26.4 per million. Among the various factors affecting long-term survival of a kidney transplant is allograft rejection, which can be classified as either T-cell or antibody-mediated, depending on etiopatho- logical mechanisms. To detect allograft injury, clinical laboratory markers (i.e., serum creatinine, estimated glomerular filtration rate, and proteinuria) are monitored regularly. However, these are nonspecific and the final diagnosis is based on the histopatological features of the tissue obtained by needle biopsy, which is an invasive procedure and there- fore not suitable for continuous monitoring. This diagnostic gap could be bridged with novel biomarkers obtained in a non-invasive way. Urine is the most suitable source for such biomarkers, as it is easy to obtain in large quantities and its composition indirect- ly reflects the (patho)physiological processes in the kidney. Proteins are the most stu- died urinary biomarkers of kidney injury, but various types of nucleic acids are also being investigated. Urinary extracellular vesicles are another promising new source of biomarkers. Extracellular vesicles are a heterogeneous population of membrane-bound particles that are secreted by all cells and accumulate in body fluids. Their biophysical properties and specific molecular composition indirectly reflect the properties and (patho)physiologi- cal processes of the parent cell. Moreover, they influence physiological or pathological processes in their target cells and are therefore being investigated as a source for new therapeutic strategies. In this review article, we present extracellular vesicles in urine as novel noninvasive biological markers for the detection of kidney transplant injury. UvOD Presaditev ledvice je oblika nadomestnega zdravljenja končne ledvične odpovedi z naj- boljšimi kliničnimi rezultati. Slovenija je od leta 2000 del mreže Eurotransplant, z dol- goletnim povprečjem števila presajenih ledvic 26,4 na milijon prebivalcev letno. V Sloveniji je za obdobje 2000–2016 eno- letno preživetje presadka znašalo 94,3 %, petletno preživetje pa 87,5 % (povprečje za evropske države je 92,0 % in 84,4 %). Dolgoročno preživetje presajene ledvice je odvisno od ishemično-reperfuzijske poškodbe (IRP) zaradi prekinitve prekrva- vitve ob odvzemu presadka darovalcu, ope- rativnega posega, kakovosti oskrbe po pre- saditvi in razvoja ter zdravljenja zapletov, med katere v prvi vrsti sodijo zavrnitvene mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 82 kaže zgolj na stanje vzorčnega dela pre- sadka, diagnoza pa je dodatno odvisna od subjektivne ocene patologa. To diagnosti- čno vrzel bi lahko zapolnili novi označevalci okvare, ki bi bili pridobljeni neinvazivno in bi tako omogočali rednejše spremljanje in hitrejše odkrivanje okvare presadka. Kot vir tovrstnih označevalcev je naj- primernejši urin, saj njegova sestava posred- no odraža stanje ledvic, poleg tega pa je eno- stavno pridobiti velike količine vzorca v pogostejših intervalih. Kot urinski ozna- čevalci okvare ledvic so najbolje raziskane številne beljakovine in različne nukleinske kisline. Med izjemno obetavne nove ozna- čevalce ledvične okvare se uvrščajo zunaj- celični vezikli (ZV). ZV so heterogena popu- lacija z membrano obdanih kroglastih delcev, ki se sproščajo iz vseh celic in ko- pičijo v telesnih tekočinah, tudi v urinu. Biofizikalne lastnosti in molekularna sesta- va ZV posredno odražajo lastnosti in fizio- loško stanje starševskih celic. ZV pomem- bno sodelujejo pri fizioloških ali patoloških procesih v tarčnih celicah, zaradi česar so prepoznani tudi kot vir za sodobne tera- pevtske pristope. V tem preglednem član- ku bomo predstavili ZV v urinu kot nove neinvazivne biološke označevalce za odkri- vanje okvare presajene ledvice. Opisali bomo trenutno poznano molekularno sesta- vo urinskih ZV, njihovo vlogo v uravnava- nju fizioloških in patoloških procesov v led- vicah ter njihovo klinično uporabnost v diagnostiki in terapiji. Glede na izredno aktualnost ZV pri razumevanju, diagnosti- ki in terapiji bolezni bo poznavanje tega področja vse pomembnejše tudi za stro- kovnjake različnih medicinskih strok. OZNaČEvaLCI OKvaRE PRESaJENE LEDvICE Ledvice so pomemben parni organ, saj so ključne za izločanje toksičnih presnovkov, uravnavanje krvnega tlaka ter vzdrževa- nje elektrolitskega, vodnega in kislinsko- -bazičnega ravnovesja v telesu. Imajo tudi pomembno endokrino vlogo, saj z izloča- njem eritropoetina v odgovor na hipoksijo povečajo hematopoezo. Delovanje ledvic je lahko okrnjeno zaradi različnih vzrokov, naj- pogostejša vzroka ledvične okvare sta arte- rijska hipertenzija in sladkorna bolezen. Omenjeni bolezni sta med prebivalstvom vse pogostejši, posledično pa narašča tudi pojavnost kronične ledvične bolezni (KLB) in njene končne stopnje – končne ledvične odpovedi. Ti bosta torej tudi v prihodnosti pomemben vzrok obolevnosti (1). Presaditev ledvice Presaditev ledvice je najboljši način nado- mestnega zdravljenja končne ledvične odpo- vedi (2). Po uspešni presaditvi ledvice imajo bolniki daljšo pričakovano življenjsko dobo in boljšo kakovost življenja kot bolniki, ki ostanejo zdravljeni z dializo (3). V Evropski uniji večina presadkov izvira od umrlih darovalcev, lahko pa jih darujejo tudi zdra- vi živi darovalci, ki so najpogosteje sorod- niki bolnika. Od leta 2000 je Slovenija del mreže Eurotransplant skupaj z Avstrijo, Belgijo, Hrvaško, Luksemburgom, Madžar- sko, Nemčijo in Nizozemsko. V celotni mreži je bilo po podatkih iz leta 2020 oprav- ljenih skupno 3.792 presaditev ledvic (27,5 presaditev ledvic na milijon prebivalcev), od tega 2.851 presaditev ledvic mrtvih darovalcev in 941 presaditev ledvic živih darovalcev. Leta 2020 je bilo kljub epide- miji koronavirusne bolezni 2019 (angl. coronavirus disease 2019, COVID-19) v Slo- veniji presajenih 46 ledvic (22,4 na milijon prebivalcev), od tega ena s sočasno presa- ditvijo jeter in dve s sočasno presaditvijo trebušne slinavke; 45 presajenih ledvic je bilo pridobljenih od umrlih darovalcev, ena pa od živega darovalca (4). Osnovni merili uspešnosti presaditev in kasnejšega zdravljenja sta eno- in petletno preživetje presadka ter bolnika. V Sloveniji je enoletno preživetje presadkov za obdob- je 2000–2016 znašalo 94,3 %, petletno pa 87,5 %. V raziskavi CTS (Collaborative 83Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 83 Transplant Study) je bilo v letih 2006–2015 povprečje za 21 evropskih držav 92,0 % in 84,4 %. Za slovenske bolnike je preživetje v omenjenem obdobju znašalo 98,1 % in 93,8 % (5, 6). Preživetje presadka je odvisno od mnogih dejavnikov, med njimi IRP zaradi prekinitve prekrvavitve ob odvzemu presadka od darovalca, operativnega pose- ga, kakovosti oskrbe po presaditvi in raz- voja ter zdravljenja zapletov, med katere v prvi vrsti sodijo zavrnitvene reakcije pre- sajene ledvice (2). Okvara presajene ledvice Ishemično-reperfuzijska poškodba V času med odstranitvijo darovalčevega organa oz. smrtjo darovalca in ponovno vzpostavitvijo prekrvavitve ob presaditvi je tkivo presadka brez prekrvavitve, kar vodi v IRP tkiva. Daljši je čas hladne ishemije, hujša je okvara tkiva, zato mora biti ta čim krajši, najbolje krajši od 12 ur. IRP se lahko kaže v zakasnelem delovanju presajene ledvice (angl. delayed graft function, DGF), ko se ne vzpostavi ustrezno delovanje pre- sadka neposredno po presaditvi. Bolniki zato potrebujejo premostitveno zdravljenje s hemodializo. Ob IRP se izražajo s poškod- bo povezani molekulski vzorci (angl. dama- ge associated molecular patterns, DAMP), ki so podobni s patogeni povezanim mole- kulskim vzorcem (angl. pathogen associated molecular patterns, PAMP). Te molekulske vzorce prepoznavajo vzorčno prepoznavni receptorji (angl. pattern recognition receptors, PRR), ki so ključni za aktivacijo imunske- ga odziva. Poleg omenjenega se ob IRP sproščajo tudi kemokini, provnetni citoki- ni in druge v imunski odziv vpletene spo- jine, zato IRP predstavlja pomemben dejavnik tveganja za razvoj zgodnje akut- ne zavrnitvene reakcije presajene ledvice (7). Zavrnitev presadka Presajena ledvica je razen v primeru eno- jajčnih dvojčkov genetsko različna od tkiva prejemnika – predstavlja tuje tkivo, zato se pri vseh presaditvah do neke mere razvije odziv gostiteljevega imunskega sistema na neskladne človeške levkocitne antigene (angl. human leukocyte antigen, HLA) pre- sajene ledvice. Da bi omejili oz. preprečili aloimunski odziv, vse prejemnike dosmrtno zdravimo z imunosupresivnimi zdravili v skladu z aktualnimi smernicami (8). Glede na časovni potek zavrnitvene reakcije lahko govorimo o hiperakutni, akut- ni in kronični zavrnitvi. Prva lahko nasta- ne v nekaj minutah do urah oz. kmalu po vzpostavitvi krvnega pretoka skozi presa- dek zaradi predhodno nastalih protiteles proti neskladnim HLA darovalca, priso- tnih na endoteliju kapilar presadka. Danes je hiperakutna zavrnitev presadka zaradi temeljite genotipizacije darovalca in pre- jemnika ter boljšega ujemanja v antigenih HLA zaradi vključenosti v program Euro- transplant izjemno redka (9). Akutna zavr- nitev se zgodi v kratkem časovnem obdob- ju (tedni do meseci) s hitrim upadom delovanja presadka. Verjetnost njenega pojava je največja v prvih treh mesecih po presaditvi, a se lahko pojavi tudi kasneje, pojavnost pa se zmanjšuje s časom od pre- saditve (10). V obdobju 2000–2016 se je v prvem letu po presaditvi pojavila pri 13,7 % slovenskih bolnikov s presajeno ledvico (5). Prenizki vzdrževalni odmerki imunosupresivnih zdravil, njihovo ukinja- nje ali neredno jemanje dolgoročno lahko vodijo v kronično zavrnitveno reakcijo, ki povzroča postopen upad delovanja presad- ka od več mesecev do let po presaditvi (11). Etiopatološki mehanizem zavrnitve pre- sadka v osnovi delimo na TCMR in ABMR, lahko pa se pojavijo tudi mešane oblike (slika 1). Prva omenjena reakcija predstav- lja odziv prirojenega imunskega sistema na antigene, ki jih predstavljajo darovalčeve antigen predstavitvene celice (APC). Slednje predstavijo antigene gostiteljevim cito- toksičnim limfocitom T CD (angl. cluster of differentiation) 8, ti pa neposredno poškodu- jejo celice presadka. Druga oblika je ABMR, 84 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 84 ki je posledica humoralnega odziva imun- skega sistema, pri katerem prejemnikove APC predstavijo darovalčeve antigene HLA limfocitom T-pomagalkam. Te aktivirajo ustrezne limfocite B, ki se namnožijo in dife- rencirajo. Tako nastanejo plazmatke, ki tvorijo za darovalca specifična protitelesa (angl. donor-specific antibodies, DSA), usmer- jena proti predstavljenim neskladnim daro- valčevim antigenom HLA. DSA se vežejo na tarčne antigene in sprožijo uničenje tarčnih celic (10). Zdravljenje zavrnitvenih reakcij se razli- kuje glede na etiopatološki mehanizem. Tako TCMR zdravimo z imunosupresivni- mi zdravili, pri čemer so ključni kortiko- steroidi. Pri težjih oblikah uporabljamo protilimfocitna protitelesa (npr. antitimo- citni globulin). Zdravljenje ABMR je zah- tevnejše; ključno je odstranjevanje protiteles s plazmaferezo, dodatno zdravljenje pa lahko predstavljajo tudi intravenski imuno- globulini in biološka zdravila (npr. anti- -CD20 protitelo – rituksimab) (8). Kronične spremembe presadka V presadku poleg že opisanih sprememb lahko nastanejo tudi kronične spremembe, ki so jih zgodovinsko opisovali kot kronično nefropatijo presadka, v modernejši literaturi pa je ta izraz zaradi njegove nespecifično- sti nadomestil krovni opisni izraz intersti- cijska fibroza s tubulno atrofijo (IFTA) (13). IFTA je neizbežna progresivna posledica imunoloških in neimunoloških vzrokov ter se v dveh letih po presaditvi razvije pri do 60 % presadkov (14, 15). Med imunološke vzroke IFTA spadajo že opisane zavrnitve- ne reakcije. Med njimi je najpogostejša kronična ABMR, ki je povezana z nezado- stno imunosupresijo, največkrat zaradi nesodelovanja bolnikov pri zdravljenju. Med neimunološke vzroke uvrščamo nefro- toksičnost zaviralcev kalcinevrina (ciklo- sporin, takrolimus), ponovitev osnovne bolezni, virusne okužbe presadka in druge (15). IFTA je pomemben vzrok dolgoročne odpovedi presadka; poročano desetletno preživetje presadkov z normalno histološko 85Med Razgl. 2022; 61 (1): Slika 1. Shematski prikaz etiopatoloških mehanizmov različnih oblik zavrnitvene reakcije presajene ledvi- ce (12). APC – antigen predstavitvene celice, TCMR – T-celično posredovana zavrnitev (angl. T-cell mediated rejection), ABMR – s protitelesi posredovana zavrnitev (angl. antibody mediated rejection). mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 85 sliko je večje od 95 %, ta delež se zmanjša na 82 % pri bolnikih z IFTA brez pridruže- ne okvare žilja in na 41 % pri IFTA s pri- druženo okvaro ledvičnega žilja (16). Spremljanje delovanja in okvare presajene ledvice Ključni namen sledenja bolnikov po pre- saditvi je spremljanje delovanja in pravo- časna zaznava okvare presajene ledvice, pre- den ta postane nepopravljiva, ter diagnozi ustrezna prilagoditev zdravljenja (slika 2). Protokol spremljanja delovanja presadka se razlikuje med centri za presaditev orga- nov, predvsem pa se prilagaja času po pre- saditvi in kliničnemu stanju vsakega bol- nika. Najpogosteje uporabljene metode za oceno delovanja ledvic v vsakdanji klinični praksi so raven kreatinina v serumu in na podlagi te oGF, poleg tega pa še raven pro- teinurije (8). Omenjeni parametri so neza- dostni označevalci za ugotavljanje zavrnit- venih reakcij in drugih vzrokov okvare presadka, njihova največja pomanjkljivost je majhna občutljivost. Merjeni parametri porastejo pozno, ko je lahko okvara presadka že obsežna in nepopravljiva. Poleg tega 86 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … obstaja tudi možnost subklinične okvare presadka, pri kateri je prisotna poškodba oz. patološki procesi, ki jih lahko zaznamo z biopsijo, a še ne kažejo kliničnih znakov okvare. Omenjeni označevalci so poleg tega nespecifični, saj se pojavijo pri vseh proce- sih, ki okvarijo presajeno ledvico, in poslab- šajo njeno delovanje (17, 18). Nezaznana in posledično nezdravljena okvara presadka na dolgi rok pomembno prispeva k razvoju kroničnih sprememb in slabšanju njegovega delovanja. Za oceno stanja zato po presaditvi tudi pri navidezno stabilno in dobro delujoči ledvici oprav- ljamo nadzorne igelne biopsije, navadno v prvem letu po presaditvi (8, 17, 18). V pri- meru, ko se delovanje presadka glede na zgoraj omenjene klinične parametre slab- ša in se ne odziva na podporno zdravljenje, opravimo indikacijsko ledvično biopsijo. Ta je zlati standard za končno diagnostiko vzroka okvare, saj poda informacije o histo- loški sliki tkiva presajene ledvice. To oce- nimo glede na klasifikacijo po Banffskih merilih, ki temeljijo na prisotnosti in obse- gu 15 različnih histopatoloških sprememb bioptata, iz te ocene pa lahko sklepamo Slika 2. Shematski prikaz možnosti uporabe različnih biooznačevalcev in pomen zaznavanja okvar ledvi- čnega presadka pri različnih kliničnih stopnjah (20). oGF – ocenjena glomerulna funkcija. , mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 86 o mehanizmu in klinični pomembnosti sprememb, ki se odvijajo v presadku (19). Biopsija kljub svojim prednostim ni idealna preiskava. Je invaziven poseg, pri katerem lahko pride do zapletov, predvsem krvavitve. Razlaga patohistološke slike je odvisna od subjektivne ocene patologa, poleg tega ni nujno, da odvzeti vzorec predstavlja dejansko stanje presadka, saj je proces v vzorčenem delu lahko manj izra- žen. Povezana je tudi z visokimi stroški in je obremenjujoča za center za presaditev organov ter bolnike. Za rednejše spremlja- nje stanja presajene ledvice in s tem ustrez- nejše vodenje in zdravljenje bolnikov potre- bujemo nadomestne neinvazivne označevalce okvare presajene ledvice (17). Novi urinski biološki označevalci za odkrivanje okvare presadka Za nove označevalce okvare presadka je ključno, da bi pokazali prisotnost, vrsto in mehanizem okvare v zgodnejših stopnjah kot trenutni klinični parametri in igelna biopsija ter tako omogočili hitrejše ukre- panje (slika 2). Pomembno je tudi, da bi to- vrstne označevalce lahko pridobili na ne- invaziven način iz telesnih tekočin. Izmed telesnih tekočin je pri ledvicah kot vir novih označevalcev najprimernejši urin (17, 18). Kot biološki označevalci okvare ledvic so trenutno najbolje raziskane številne beljakovine v urinu. Te se sproščajo v urin neposredno iz okvarjenih celic nefrona ali pa iz vnetnih celic, ki posredujejo poškod- bo. V prvo skupino spadajo beljakovine, kot so z ledvično poškodbo povezana moleku- la 1 (angl. kidney injury molecule-1, KIM-1), z nevtrofilno gelatinazo povezan lipokalin (angl. neutrophil gelatinase associated lipo- calin, NGAL) in cistatin C (21). Čeprav so nekatere izmed beljakovin te skupine zna- čilne za posamezne dele nefrona, pa so kot označevalke ledvične poškodbe nespecifi- čne – povišane so namreč pri širokem nabo- ru različnih patoloških stanj (22). Za bolj specifično zaznavanje akutnih zavrnitvenih reakcij so zanimive predvsem beljakovine iz druge skupine. Mednje spadata provnetna citokina kemokinski ligand z vzorcem C-X-C (angl. chemokine C-X-C motif ligand, CXCL) 9 in 10, ki sta vpletena v zbiranje in akti- vacijo limfocitov T (23, 24). V multicentri- čni raziskavi so povečano raven CXCL9 v urinu pri bolnikih z akutno zavrnitvijo presadka opazili že do 30 dni pred biopsi- jo (25). V drugi raziskavi pa so pokazali, da je urinski CXCL9 napovedni dejavnik TCMR, medtem ko je bil CXCL10 povezan z raz- vojem ABMR. Že en mesec po presaditvi je kljub stabilnemu delovanju presadka zvi- šana raven urinskega CXCL10 napovedovala kasnejšo akutno zavrnitveno reakcijo (26). Poleg beljakovinskih označevalcev so raziskovalci v urinu prepoznali tudi nu- kleinsko-kislinske označevalce okvare, a je to področje slabše raziskano. S pomočjo transkriptomike, ki omogoča hkratno ana- lizo prepisovanja velikega števila različnih genov, so prepoznali spremembe, značilne za posamezno obliko okvare presadka. Med njimi je najbolj zanimiv profil izražanja dveh različnih molekul informacijske RNA (angl. messenger ribonucleic acid, mRNA) (CD3ε mRNA, mRNA interferon-γ sprožil- na beljakovina 10 (angl. interferon-inducible protein 10, IP-10)) in ene molekule riboso- malne RNA (angl. ribosomal ribonucleic acid, rRNA) (18S rRNA), izoliranih iz urinskih celic, ki je omogočil razlikovanje med bol- niki z akutno zavrnitveno reakcijo in brez nje, ob tem pa tudi razlikovanje med TCMR in ABMR (27). Obetaven vir novih bioloških označe- valcev so tudi nekodirajoče molekule RNA, izmed katerih so dobro raziskane predvsem mikro RNA (angl. micro ribonucleic acid, miRNA). Raziskave so se osredotočale pred- vsem na povezanost izražanja miRNA v biopsijskih vzorcih ledvičnega tkiva, mononuklearnih celicah periferne krvi (angl. peripheral blood mononuclear cell, PBMC) ali v urinu prisotnih celicah ter klinično ali histopatološko sliko okvare presadka. Na 87Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 87 vzorcih ledvičnih biopsij so tako pokazali povečano izražanje sedmih miRNA pri DGF, med njimi sta najbolj izstopali miR- -182-5p in miR-21-3p (28, 29). Za akutno zavrnitveno reakcijo je bilo značilno pove- čano izražanje miR-142-5p, miR-155, miR- -223, miR-10b in miR-30a-3p, pri čemer je imela kombinacija prvih treh miRNA >90% občutljivost in specifičnost za napoved akutne zavrnitve (30). Glede na profile izra- žanja miR-142-3p, miR-142-5p, miR-155 in miR-223 v biopsijskem vzorcu ali že samo miR-142-3p in miR-223 v PBMC so lahko ločili med biopsijskimi vzorci z izraženo TCMR in biopsijskimi vzorci z normalnim histopatološkim izvidom (31). Med naj- obetavnejšimi miRNA je miR-155, saj je njeno izražanje odzivno na zdravljenje akut- ne zavrnitve, pri katerem se ob uspešnem zdravljenju raven miR-155 zniža (32). Spremembe v izražanju miRNA so opazili tudi pri kronični okvari delovanja presad- ka, ki je posledica IFTA. Najbolj izstopajo miRNA-21, katere izražanje je povečano v urinskih celicah, PBMC in biopsijskih vzorcih, ter že omenjeni miR-142-3p in miR-155, katerih izražanje je povečano v PBMC in urinskih celicah (33, 34). Kot obetaven biološki označevalec poškodbe presadka se v transplantacijski medicini vse bolj uveljavlja darovalčeva prostocelična DNA (angl. donor-derived cell- -free deoxyribonucleic acid, dd-cfDNA), ki se sprošča iz poškodovanih celic presadka in jo najdemo v urinu in krvi. Raven dd- -cfDNA, izražena kot delež skupne prosto- celične DNA (angl. cell-free deoxyribonucleic acid, cfDNA), odraža stopnjo okvare celic, ki vsebujejo darovalčevo DNA, in je zato nespecifičen znak. Raven dd-cfDNA v krvi bolnikov s presajeno ledvico je navadno < 1 %, a se značilno poveča ob akutni zavr- nitvi (35). V eni izmed raziskav je bil delež dd-cfDNA v krvi ob akutni zavrnitvi 1,6 %, v primerjalni skupini pa 0,3 %, raven dd- -cfDNA pa se je razlikovala tudi med razli- čnimi tipi zavrnitve in je bila višja pri ABMR kot pri TCMR (36, 37). Prednost uporabe dd-cfDNA pred klasičnimi ozna- čevalci okvare presadka je predvsem njena občutljivost, saj so povišane ravni dd-cfDNA opazili tudi do 31 tednov pred klinično dia- gnozo akutne zavrnitve (35, 38). Hkrati nizek delež dd-cfDNA (< 0,5 %) z veliko verjet- nostjo izključuje klinično pomembno okva- ro presadka. Trenutno se kot izjemno obetavni bio- loški označevalci številnih bolezni, tudi na področju transplantacijske medicine, uve- ljavljajo ZV. ZUNaJCELIČNI vEZIKLI IZ URINa ZV so heterogena populacija z membrano obdanih kroglastih delcev, ki se sproščajo iz celic tako in vitro kot tudi in vivo. ZV imajo pomembno vlogo pri sporazumevanju med celicami organizma ter med posameznimi organizmi, na kar nakazuje tudi evolucijska ohranjenost vloge ZV (39). Pri sesalcih so jih izolirali iz raznolikih telesnih tekočin, kot so kri, urin, bronhoalveolarni izpirek, sinovialna tekočina, plodovnica, sperma, mleko, slina, dokazali pa so tudi prisotnost veziklov, izvirajočih iz črevesne mikrobio- te, in njihovo pomembno vlogo pri delo- vanju imunskega sistema (40–42). ZV lahko le z vezavo ali vstopom in s sproščanjem svojega tovora vplivajo na delovanje sosed- njih tarčnih celic (parakrino) ali na bolj oddaljene celice (endokrino) (43, 44). ZV se med seboj razlikujejo po nastan- ku, celičnem izvoru, velikosti, molekular- ni sestavi ter biološki vlogi. Glede na nasta- nek in velikost ZV razlikujemo (slika 3A): vezikle endocitotskega izvora, imenovane eksosomi (premer 30–100 nm), mikrovezi- kle, ki nastanejo z brstenjem plazmaleme (premer 100–1.000nm), in apoptotska teles- ca, ki nastanejo med programirano celično smrtjo (premer 1.000–5.000 nm). Različni mehanizmi nastanka ZV so podrobneje opisani v predhodnih objavah (46). Razisko- valci se v svojih raziskavah osredotočajo 88 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 88 predvsem na preučevanje eksosomov in mikroveziklov, saj se ti sproščajo tako v fizio- loških kot tudi patoloških pogojih, do nastan- ka apoptotskih telesc pa prihaja le v času programirane celične smrti. Znotraj celic lahko hkrati prihaja do nastajanja več tipov ZV, za katere pa je z obstoječimi razisko- valnimi metodami težko nedvoumno dolo- čiti mehanizem nastanka, ki je ključen za pravilno poimenovanje npr. eksosomov ali mikroveziklov. Zato je mednarodno društvo za zunajcelične vezikle ISEV (International Society for Extracellular Vesicles) v svojih smernicah za raziskave zunajceličnih vezi- klov namesto izrazov eksosom/mikrovezikel predlagalo poimenovanje glede na velikost na majhne (< 200 nm) in velike (> 200 nm) ZV (47). Biofizikalne lastnosti ZV so pomemb- ne, saj odražajo izvor ZV, poleg tega pa vpli- vajo na njihovo biološko vlogo. Mednje uvrščamo velikost, koncentracijo, gostoto in optične lastnosti ZV ter mehanske last- nosti membran, kot sta elastičnost in naboj (ζ-potencial). Z analizo koncentracije in velikosti sproščenih veziklov lahko sprem- ljamo dogajanje v telesu. Spremembe kon- centracije ZV v krvi v povezavi z bolezen- skimi spremembami so opisali pri več vrstah raka (48, 49), srčno-žilnih in avto- imunskih boleznih (50, 51), pri tem pa naj bi bili ključni procesi hipoksija, avtofagija in stres. Pri številnih vrstah raka so opisa- li tudi spremembe v velikosti veziklov (52–55). Podtipi ZV imajo zelo podobno gostoto. Za eksosome je značilna gostota 1,13–1,19g/ml, medtem ko je za apoptotska telesca značilna gostota 1,16–1,28 g/ml, oboje pa se prekriva z gostoto lipoprotei- nov z visoko gostoto (angl. high density lipo- protein, HDL), kar lahko oteži izolacijo ZV iz krvi (56). Mehanske lastnosti ZV, kot sta elastičnost in naboj, vplivajo na kroženje ZV po telesu, privzem v celice in sproščanje tovora. Elastične membrane ZV se po stre- su povrnejo v prvotno obliko, medtem ko pla- stične membrane ZV ostanejo spremenjene. ζ-elektrokemijski potencial je pokazatelj koloidne stabilnosti ZV, ko se ti gibljejo v tekočem mediju, in določa stabilnost medsebojnega učinkovanja med posamez- nimi vezikli, vezikli s tekočino, vključno s težnjo veziklov k tvorbi skupkov (57). Mehansko togost oz. stabilnost ZV dolo- čata tudi njihova velikost in geometrija. Raziskave so že pokazale statistično zna- čilne razlike v spremembi oblike veziklov, izvirajočih iz rakavih ter nerakavih celičnih linij (58). Molekularni tovor ZV (slika 3B) pred- stavljajo različne beljakovine, lipidi, nuklein- ske kisline in ogljikovi hidrati (59, 60). Molekularna sestava je značilna za posa- mezni tip ZV, kot tudi tip starševske celi- ce. Izsledki obsežnih raziskav glede pri- sotnosti omenjenih molekularnih zvrsti v ZV so objavljeni v javno dostopnih poda- tkovnih bazah: Vesiclepedia, ExoCarta in EVpedia (61–63). V ZV so najpogosteje zastopane beljakovine, ki so vključene v nastanek in sproščanje veziklov, tetra- spanini, beljakovine v signalnih poteh, beljakovine, vključene v predstavitev anti- genov in transmembranske beljakovine (59–61). Razvrščanje beljakovinskega tovo- ra v vezikle lahko poteka odvisno od endo- somskega razvrščevalnega kompleksa, potrebnega za prenos (angl. endosomal sor- ting complex required for transport, ESCRT) ali od vključevanja v membranske domene, pri čemer so ključne številne posttransla- cijske spremembe beljakovin (64–66). Beljakovinska sestava ZV posredno vpliva na fiziološke in patološke učinke v njiho- vih tarčnih celicah (41). Beljakovine in lipi- di na površini ZV so lahko glikozilirani, pri čemer so za ZV iz različnih vrst tkiv in organizmov značilni različni glikozilacijski vzorci (66). Ti uravnavajo privzem ZV v tar- čne celice in s tem pomembno vplivajo na (pato)fiziologijo ZV (39). Glede lipidne sestave so membrane eksosomov obogatene s holesterolom, sfingomielinom, gliko- sfingolipidi in fosfatidilserinom, podobno 89Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 89 kot lipidni rafti (67, 68). In vitro so poka- zali, da ZV iz tumorskih in metastatskih celic vsebujejo več sterolov, sfingolipidov in glicerofosfolipidov (69, 70). Metabolom je najmanj raziskana molekulska zvrst ZV. Eksosomi naj bi vsebovali različne tipe molekul z nizko molekulsko maso, kot npr. organske kisline, aminokisline, sladkorje in njihove konjugate, nukleotide in nukleo- zide, ciklične alkohole, karnitine, aromat- ske spojine in vitamine (70). ZV vsebujejo raznolike molekule RNA, kot npr. mRNA, rRNA, prenašalne (angl. transfer ribonucleic acid, tRNA), najbolj pre- učevane miRNA, dolge nekodirajoče (angl. long non-coding ribonucleic acid, lncRNA), interakcijske (»piwi«) in krožne RNA (59, 71). Razvrščanje miRNA v ZV naj bi potekalo s pomočjo katalitične komponente argo- navtske beljakovine z RNA sproženega utiševalnega kompleksa 2 (angl. argonaute ribonucleic acid induced silencing complex catalytic component 2, AGO2) in GW182 ali možno tudi v ceramidni poti, odvisno pa je tudi od same strukture in zaporedja RNA (72–74). Molekule RNA v tarčnih celicah 90 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … uravnavajo izražanje genov ali prenesejo informacijo za izgradnjo funkcionalne belja- kovine (71, 75–77). Raziskave so dokazale prisotnost mitohondrijske in genomske DNA v ZV, vendar je ta tip molekul manj raziskan (78). Žive celice aktivno izločajo DNA preko ZV, vendar mehanizem še ni pojasnjen. DNA, ki je lahko eno- ali dvoverižna, ima povprečno dolžino 200 baznih parov (bp) v manjših ZV in do 2.000.000 bp v velikih ZV. Lahko se nahaja na površini ali pa v notranjosti ZV, kjer je še dodatno zašči- tena z lipidnim dvoslojem (79). Z analizo vezikularne DNA lahko pridobimo infor- macijo o celotnem genomu starševskega organizma, ponuja pa tudi vpogled v stanje somatskih mutacij v starševski celici (80–82). Prenos vezikularne DNA v tarčne celice lahko preko prepisa v mRNA in beljakovine vpliva na funkcijo celic (83, 84). Zunajcelični vezikli v urinu Urin vsebuje pester nabor anorganskih soli, presnovkov, organskih spojin (npr. beljakovine, hormone) in tudi ZV. Je lahko dostopna telesna tekočina z veliko pro- A B mikrovezikli eksosomi Slika  3. Shematski prikaz biogeneze (A) in značilne molekularne sestave (B) zunajceličnih veziklov. Podrobnejši opis je podan v besedilu (45). mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 90 stornino in je zato odličen vir neinvazivnih bioloških označevalcev okvare ledvic. Prisotnost ZV v urinu so opisali že leta 1990, prvič pa so ZV izolirali iz urina Pisitkun in sodelavci, ki so s proteomsko analizo prepoznali 295 različnih vezikularnih belja- kovin (85, 86). Urin vsebuje tudi visoke koncentracije uromodulina (drugo ime Tamm-Horsfallova beljakovina (angl. Tamm- -Horsfall protein, THP)), ki se sprošča iz Henleyjeve zanke in lahko tvori obsežne polimere, ter kristalov kalcijevega oksala- ta, ki otežujejo izolacijo ZV iz urina (87). Vir ZV v urinu so celice vsakega posa- meznega odseka nefrona, tj. celice epiteli- ja, glomerulni podociti, celice proksimal- nega tubula, Henlejeve zanke, distalnega tubula in zbiralc ter epitelne celice uro- genitalnega trakta (88). Raziskave so na- kazale na razliko v urinskih ZV pri živih darovalcih ledvic različnega spola, pri čemer so opazili višjo vsebnost ZV v urinu prejemnikov darovalk ženskega spola. V urinu so zaznali tudi povišane ravni ZV iz mezangijskih in parietalnih epitelijskih celic. Sproščanje eksosomov, zlasti iz juksta- glomerularnih celic in podocitov, naj bi se s starostjo zmanjševalo (89). Vezikularne beljakovine predstavljajo 3% mase beljakovin, ki jih najdemo v urinu (90, 91). Z uporabo tekočinske kromato- grafije, sklopljene s tandemsko masno spektrometrijo (angl. liquid chromatography with tandem mass spectrometry, LC/MS/MS), so prepoznali kar 1.412 edinstvenih belja- kovin v urinu zdravih ljudi, celokupno pa naj bi proteom urinskih ZV obsegal že več kot 3.000 beljakovin (90, 92). V ZV iz urina so pravzaprav zaznali vse prevladujoče apikalne ionske in vodne prenašalne belja- kovine (90). Najpogostejše beljakovine glede na izsledke proteomskih raziskav ZV iz urina so aneksini (angl. annexins, ANX) A1, A4 in A5 , znotrajcelični kloridni kanal 1 (angl. chloride intracellular channel 1, CLIC1), gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (angl. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), laktat dehidrogenaza B (LDHB), z Ras povezan substrat botulinskega toksina C3 1 (angl. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, RAC1) in stomatin (STOM) (93). ANX so membransko vezane beljakovine, ki imajo pomembno vlogo pri eksocitozi ter pri uravnavanju koagulacije ter imunske- ga odziva. CLIC1, RAC1 in STOM pa so inte- gralne membranske beljakovine ali z mem- brano povezane beljakovine, ki lahko vplivajo na prenos ionov in s tem na mem- branski potencial, bodisi neposredno z urav- navanjem prenosa klorida (CLIC1) bodisi posredno z uravnavanjem beljakovin, ki pre- našajo natrij (STOM) ali vodikov ion (RAC1). GAPDH in LDHB imata oksidoreduktivno aktivnost, ki lahko vpliva na lokalni pH in redoks potencial ter prispeva k ohranjanju aktivacijsko-inaktivacijskega stanja ZV v urinu med celično difuzijo. Raziskav glikozilacije ZV iz urina je razmeroma malo. Gerlach in sodelavci so z uporabo pretočne citometrije in lektinskih mikromrež raziskovali profil glikozilacije na površini ZV iz urina zdravih posa- meznikov (94). Prepoznali so širok nabor različnih oligosaharidov, pri čemer so bile razširjene bolj razvejane O-vezane strukture, manj pogosti pa O-vezani glikani mucin- skega tipa. Sami glikozilacijski profili ZV se med posamezniki niso bistveno razli- kovali, so se pa razlikovali od glikozilira- nega THP. Z uporabo masne spektrometrije v povezavi z lektinskimi mikromrežami so pokazali, da je površina urinskih ZV obogatena s kompleksnimi N-glikani ter s terminalnimi spremembami manoznih in fukoznih ostankov (95). Beljakovine na površini urinskih ZV naj bi sovpadale z glikozilacijskim profilom ledvičnih epi- telijskih celic, ta pa je odvisen od transla- cije, zvijanja, razvrščanja ter izločanja beljakovin. Spremembe površinske gliko- zilacije omenjenih ZV lahko neposredno odražajo patološka stanja (94). Pri ZV iz urina so zaznali različno vsebnost holesterola, sfingolipidov in fosfatidilserina 91Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 91 v primerjavi s celično membrano, pri čemer je bila vsebnost holesterola v ZV kar 63 %. Na podlagi lipidne sestave so uspeli razli- kovati med ZV obolelih za rakom prostate in zdravih posameznikov (69). Raziskave RNA tovora ZV v urinu so pokazale, da v njih prevladujejo nekodira- joče RNA, v največjem obsegu rRNA. V pri- merjavi z drugimi telesnimi tekočinami so urinski ZV najbolj obogateni z zaporedji, ki kodirajo beljakovine. Odkrili so namreč več kot 13.000 mRNA (96). Analiza slednjih je pokazala, da se znotraj veziklov nahaja- jo zaporedja genov, značilnih za vse odse- ke nefrona, sečevoda ter mehurja in pro- state, torej kodirajoča zaporedja, ki pokrivajo celoten urogenitalni trakt. Nekodirajoči del RNA tovora ZV pa vpliva na prepiso- vanje genov in posttranskripcijske spre- membe (97, 98). Pri urinskih ZV so najbolj preučevane mRNA in miRNA, njihovo paki- ranje v ZV pa je zelo selektiven proces (93). Dokazali so, da je v fizioloških pogojih vseb- nost miRNA v veziklih višja v primerjavi z miRNA v urinu in celicah iz urina, kar nakazuje, da so molekule RNA v veziklih zaščitene pred razgradnjo in zato bolj sta- bilne (99). Urinski ZV so tudi dober vir novih, redkejših vrst RNA, kot so krožne RNA. Vezikularne zvrsti RNA zato pred- stavljajo dober vir neinvazivnih bioloških označevalcev. DNA je najmanj raziskan tovor urinskih ZV (100). Lee in sodelavci so preučevali vezikularno DNA iz urina bolnikov z rakom sečnega mehurja in pokazali, da veziku- larna DNA neposredno odraža genomski profil tumorja (somatske mutacije, varia- cije v številu kopij) (101). Tudi na Kliničnem oddelku za nefrologijo Interne klinike Uni- verzitetnega kliničnega centra Ljubljana v povezavi z Inštitutom za biokemijo in molekularno genetiko Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani raziskujemo uporabo vezikularne DNA iz urina kot neinvazivnega biološkega označevalca okvare presajene ledvice. vLOGa ZUNaJCELIČNIH vEZIKLOv v URavNavaNJU FIZIOLOšKIH IN PaTOLOšKIH PROCESOv v LEDvICaH Fiziološka vloga zunajceličnih veziklov v ledvicah Sprva so raziskovalci menili, da je vloga ZV predvsem izločanje celici nepotrebnih celi- čnih gradnikov. Kmalu se je izkazalo, da imajo številne druge, pomembnejše vloge za vzdrževanje fiziološkega stanja v ledvi- cah. Te so povezane predvsem z vplete- nostjo ZV v medcelično sporazumevanje, saj so pomembni prenašalci različnih molekul v notranjosti in na membrani vezikla, ki so vpletene tudi v patološke procese. ZV se lahko vežejo na površino oz. receptorje tar- čnih celic in aktivirajo signalne poti, tarčne celice pa lahko tudi privzamejo ZV, v celi- ce sproščena vsebina pa nato vpliva na različne procese v tarčni celici. Pri tem je pomembno, da so ZV v primerjavi z drugi- mi načini medceličnega sporazumevanja (avtokrino, parakrino, endokrino) bolj dina- mični, saj je njihov učinek na tarčne celi- ce odvisen od njihove sestave, ta pa od sta- nja starševske celice (102). Med pomembnejše vloge ledvičnih ZV spada sporazumevanje med različnimi celicami znotraj organa. V tem oziru so led- vični ZV posebni, saj nepoškodovana glo- merulna bazalna membrana preprečuje prehod velike večine ZV iz plazme v filtrat – ledvični ZV izvirajo torej predvsem iz celic, prisotnih v ledvičnem tkivu (celice nefro- na, imunske celice). ZV v filtrat sproščajo večinoma celice proksimalnih delov nefro- na (podociti, celice proksimalnega tubula), nato pa ti s filtratom potujejo do distalnejših celic nefrona (celice distalnega tubula in zbiralca) (86, 103). Te jih privzamejo, s tem pa je omogočeno medcelično sporazume- vanje proksimalnega in distalnega dela nefrona. In vitro so pokazali, da ZV, sproš- čeni iz proksimalnih tubulnih celic, gojenih v prisotnosti agonista dopaminskih recep- torjev, zmanjšujejo nastajanje reaktivnih 92 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 92 kisikovih spojin in bi tako lahko delovali protivnetno (104). ZV lahko prenašajo molekule, vpletene v vzdrževanje homeostaze vode in elektro- litov v telesu. Primer tega je prenos akva- porina (angl. aquaporin, AQP) 2 z ZV med celicami zbiralca, ki v tarčnih celicah pov- zroči povečanje prenosa vode (105). ZV proksimalnih tubulnih celic prenašajo tudi aktiven GAPDH, ki zniža aktivnost epite- lijskih natrijevih kanalčkov (angl. epithelial sodium channels, ENaC) v celicah distalnih tubulov in zbiralca (106). Pomembno vlogo ZV igrajo tudi pri razvoju in samoobnovi ledvičnega tkiva. Posredujejo medcelično sporazumevanje med mezenhimskimi in epitelijskimi celi- cami ledvice. Z njihovo pomočjo lahko tubularne epitelijske celice sprožijo dife- renciacijo mezenhimskih stromalnih celic v epitelijske celice, kar je pomemben korak embrionalnega razvoja ledvic (107). vloga zunajceličnih veziklov pri ledvičnih boleznih ZV so bili opredeljeni kot pomemben del etiopatogenetskih mehanizmov pri kopici patoloških stanj, od KLB do raka. Obširno raziskana je vloga ZV pri KLB, posebej pri diabetični nefropatiji (DN). V urinu priso- tni ZV imajo pomembno vlogo v vseh orga- nih urogenitalnega trakta, a smo se pri pre- gledu literature osredotočili le na ledvice. ZV iz glomerulnih epitelijskih celic, gojenih v prisotnosti visokih koncentracij glukoze, prispevajo k aktivaciji epitelijsko-mezen- himskega prehoda in fibrotičnim spre- membam podocitov in mezangijskih celic pri DN (108). Visoke ravni glukoze v urinu prispevajo tudi k povečanemu sproščanju ZV iz makrofagov, kar nadalje povzroči pro- liferacijo mezangijskih celic in aktivira vnetno reakcijo, ki vodi v ledvično fibro- zo (109). Poleg KLB so glede na patološka stanja v ledvici najbolje raziskane vloge ZV pri karcinomu ledvičnih celic (KLC). Tumorsko tkivo vzpostavi lastno mikrookolje, ki vzpodbuja rast in razvoj tumorja. Zato ni presenetljivo, da imajo ZV pomembno vlogo pri tumorogenezi in napredovanju KLC. Ena izmed raziskav je pokazala, da so ZV iz primarnih celic pri svetloceličnem KLC bogati s spreminjajočim rastnim dejavnikom β1 (angl. transforming growth factor β1, TGF-β1) in znižajo odziv cito- toksičnih limfocitov T na rakave celice (110). V drugi raziskavi pa so pokazali, da ZV, sproščeni iz rakavih zarodnih celic bolni- kov s KLC, spodbujajo razmnoževanje in epitelijsko-mezenhimski prehod, ki sta pomembna za napredovanje KLC (111). Številne raziskave se osredotočajo tudi na zaščitni učinek ZV pri IRP. Tovrstna vloga ZV ima pomembne implikacije za pre- živetje presajenih ledvic preko zmanjšanja IRP. V ospredju raziskav so ZV, sproščeni iz mezenhimskih stromalnih celic. Povezani so z zmanjšano okvaro in hitrejšim izbolj- šanjem ledvičnega delovanja po IRP pri pod- ganah (112). Podoben učinek je imel tudi intravenski vnos ZV iz podganjih in človeških ledvičnih tubulnih celic (113, 114). Poleg omenjenega so ZV pomembni posredniki vnetnega odziva. Pri miših so pokazali, da visoko izražanje receptorja za kemokinski ligand z vzorcem C-C 2 (angl. C-C motif che- mokine ligand 2) na ZV lahko prispeva k zmanjšanemu učinku CCL2 na makrofage in s tem zmanjšanemu vnetnemu odzivu po IRP (115). KLINIČNa UPORaBNOST ZUNaJCELIČNIH vEZIKLOv IZ URINa Nabor lipidov, membranskih in citosolnih beljakovin ter nukleinskih kislin v ZV odse- va molekularno sestavo starševske celice, bodisi v navadnih fizioloških pogojih ali spremenjene zaradi patoloških procesov. Značilno stanje celice se lahko odraža tudi v količini ali velikosti izločenih ZV. Razi- skave so pokazale, da je pogostost sproš- čanja ZV odvisna od okolja, v katerem se 93Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 93 celica nahaja, npr. koncentracije raztoplje- nega kisika v tekočini, pH in tipa same star- ševske celice, pri čemer rakave celice izlo- čajo znatno višje število ZV (116–118). Molekule DNA in RNA so v sproščenih ZV zaščitene pred razgradnjo z DN-azami in RN-azami v urinu (119). Podobno pa bi lahko ZV zaščitili molekule pred ostalimi encimi, prisotnimi v urinu, kot so oksido- reduktaze, transferaze, hidrolaze in liaze (120). Zaradi vseh naštetih lastnosti so ZV pomemben neinvaziven vir bioloških ozna- čevalcev bolezni urogenitalnega trakta, kar se kaže tudi v vedno večjem številu raziskav (121, 122) (slika 4). Zunajcelični vezikli kot biološki označevalci okvare presajene ledvice ZV s površinskim označevalcem CD133 bi lahko služili kot biološki označevalci ledvične funkcije ter potenciala za samo- obnovo. Raziskave so namreč pokazale, da se ZV CD133 nahajajo v urinu zdravih posameznikov, odsotni pa so v urinu bol- nikov s končno ledvično odpovedjo. Že prvi 94 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … dan po presaditvi ledvic omenjenim bol- nikom so v urinu zaznali ZV CD133, njihova koncentracija pa se je s časom višala (124). Poročali so tudi o razlikah v vsebnosti pro- stih beljakovin NGAL in interlekvina-18 in njunih mRNA v eksosomih iz urina po presaditvi ledvic (22). Dodatno so ugotovili, da je povišana raven vezikularnega NGAL v urinu bolnikov, ki so jim presadili ledvi- ce, povezana z zakasnjenim delovanjem presadka. NGAL v ZV je tudi bolj občutljiv zgodnji biološki označevalec kot NGAL iz celične frakcije urina (125). Ob IRP ledvic pride do značilnega zmanjšanja ravni AQP1 v ZV iz urina. Ob primerjavi stanja ishemije-reperfuzije na podganjem modelu nefrotičnega sindroma ter bolnikov s proteinurijo pri slednjih niso zaznali sprememb v vezikularnem AQP1. Pri presaditvi organov prav tako pride do IRP, tako so tudi pri analizi ZV iz urina bolnika s presajeno ledvico opazili znižano raven AQP1. To nakazuje, da je vsebnost AQP1 v ZV označevalec IRP (126). Raziskava na področju bioloških ozna- čevalcev okvare presajene ledvice je pre- Slika 4. Zunajcelični vezikli v urinu so pomemben vir novih, neinvazivnih bioloških označevalcev okvare presajene ledvice (123). ZV – zunajcelični vezikli. mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 94 poznala nabor vezikularne mRNA za zazna- vanje okvare presajene ledvice in mRNA za razlikovanje med akutno TCMR ter ABMR (127). V ZV iz urina bolnikov s presajeno led- vico, pri katerih je prišlo do TCMR, so dodatno dokazali zvišane ravni vezikular- nega tetraspanina 1 in hemopeksina in ju predlagali kot diagnostična označevalca za TCMR (128). Pri bolnikih z zavrnitveno reakcijo so poročali tudi o povišani ravni urinskih ZV s površinskim označevalcem CD3 (123). Sigdel in sodelavci so z upora- bo masne spektrometrije pri bolnikih z akut- no okvaro presajene ledvice odkrili enajst beljakovin, ki so bile funkcionalno udeležene v vnetni in stresni odziv, ter tako dokazali, da vsebnost beljakovin v ZV iz urina odra- ža stanje presadka (129). Zunajcelični vezikli kot biološki označevalci ostalih ledvičnih bolezni Pri osebah s centralnim diabetesom insi- pidusom so pokazali, da je v urinu prišlo do povišanega izločanja AQP2 z ZV kot odziv na antidiuretik vazopresin, v primerjavi z bolniki z nefrogenim diabetesom insipi- dusom (130). Analiza ZV z vsebujočim AQP2 lahko tako razlikuje med centralnim in nefrogenim diabetesom insipidusom. DN predstavlja resen zaplet pri slad- korni bolezni in je povezana s povečano obo- levnostjo in smrtnostjo v primerjavi z dru- gimi vzroki bolezni ledvic. Spremlja jo proteinurija, ki je posledica napredujoče poškodbe in posledičnega propada glo- merulnih podocitov. Pri bolnikih s sladkorno boleznijo tipa 1 so ugotovili močno povi- šano količino urinskih ZV, izvirajočih iz podocitov, ki je bila vidna že pred spre- membami drugih bioloških označevalcev (albuminurija, nefrin). ZV iz podocitov bi tako lahko predstavljali zgodnji označeva- lec glomerulne okvare pri sladkorni bole- zni tipa 1 (131). Barutta in sodelavci so poka- zali, da med bolniki s sladkorno boleznijo tipa 1, ki imajo oz. nimajo DN, pride do razlik v izražanju nekaterih miRNA v urinskih ZV (miRNA-130a, miRNA-145, miRNA-155 in miRNA-424), pri čemer so vlogo veziku- larne miRNA-145 izpostavili kot pomem- bno pri razvoju bolezni (132). Nadalje so Zubiri in sodelavci (133, 134) v urinskih ZV odkrili nabor treh spremenjenih beljakovin (alfa-1 mikroglobulinski/bikuninski pre- kurzor (AMBP), histonska metiltransferazna levkemična beljakovina mešanega porekla 3 (angl. histone methyltransferase mixed- -lineage leukemia protein 3, MLL3) in nape- tostno odvisni anionsko selektivni kanal 1 (angl. voltage-dependent anion-selective chan- nel 1, VDAC1)), povezanih s prisotnostjo DN. Z analizo ZV-podocitov so avtorji ugotovi- li, da povišana raven mRNA z zapisom za onkoprotein Wilmsovega tumorja 1 (WT1) odraža poškodbo glomerulov pri bolnikih z DN v primerjavi z bolniki z najmanjšimi spremembami nefrotskega sindroma. Spremljanje ravni vezikularnega WT1 omo- goča razločevanje bolnikov glede na tve- ganje za pojav zapletov (135). Prisotnost vezikularnega WT1 v urinu so povezali tudi z okvaro podocitov (134). V ZV iz urina bolnikov z akutno ledvi- čno okvaro so v primerjavi z zdravimi pre- iskovanci odkrili povišano vsebnost Na+/H+ izmenjevalnega prenašalca 3 (angl. sodium- -hydrogen exchanger 3, NHE3), še posebej v primeru akutne tubulne nekroze. Veziku- larni NHE3 so predlagali kot označevalec tubulne okvare in za razlikovanje med akutno tubulno nekrozo in drugimi vzroki okvare ledvic (136). Zhou in sodelavci so poročali o glikozirani beljakovini fetuin A, za katerega se je izkazalo, da se v večjem obsegu nahaja v ZV pri akutni ledvični okva- ri kot pri zdravih ljudeh (137). V sklopu akut- ne okvare ledvic so kot označevalca poškodb tubulnih celic opisali še vezikularni akti- vacijski transkripcijski dejavnik 3 (angl. activating transcription factor 3, ATF3) (138). Na ZV iz urina so izvedli kvantitativ- no proteomsko analizo in prepoznali 83 različno izraženih beljakovin pri bolnikih 95Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 95 z avtosomno dominantno policistično bolez- nijo ledvic (ADPBL). Za to bolezen je značilna okvara v genih PKD1 ali PKD2, ki zapisu- jeta beljakovini policistin 1 (PC1) in poli- cistin 2 (PC2). Veliko zaznanih beljakovin je izviralo iz apikalne membrane in so bili vpleteni v signalne poti primarnih cilij (npr. PC1 in PC2), celični cikel, diferencia- cijo celic in signalizacijo preko ionov Ca2+. Povečano izražene beljakovine so bile vple- tene tudi v organizacijo citoskeleta in vzdrže- vanje polarnosti celic, kar sovpada z nastan- kom cist zaradi spremenjene zgradbe celic. Zaznali so nižjo vsebnost beljakovine AQP2 in jo povezali z razredčenim urinom pri teh bolnikih (139). Nadalje so primerjali pro- teome ZV iz urina bolnikov z ADPBL, bol- nikov z drugimi cističnimi boleznimi ledvic in zdravih posameznikov. Prepoznali so 30 beljakovin, ki so bile vsaj dvakrat bolj zastopane pri obolelih z ADPBL, pri čemer je izstopalo 5 beljakovin; citoskeletne belja- kovine vilin 1, periplakin, envoplakin in beljakovini sistema komplementa C3 ter C9. Avtorji so povečane vsebnosti beljakovin komplementa povezali z zgodnjim potekom, povečanje citoskeletnih beljakovin pa s kas- nejšimi stopnjami poteka bolezni (140). Pokazali so tudi, da je v primeru okvare gena PKD1 vsebnost beljakovin PC1 in PC2 v ZV nižja, vsebnost transmembranske beljako- vine 2 (TMEM2) pa povišana, in da bi lahko s pomočjo razmerja PC1/TMEM2 razliko- vali med posamezniki z okvaro gena PKD1 in brez nje (141). S proteomiko ZV iz urina lahko učinkoviteje spremljamo patološko stanje ledvic, saj je izplen redkih beljako- vin z možno patofiziološko in diagnostično vrednostjo tudi do 30-krat večji v primer- javi z izplenom iz ledvičnega tkiva (91). Tudi pri preučevanju bolnikov s cistin- urijo so se Bourderioux in sodelavci poslu- žili proteomske analize ZV iz urina (142). Izsledki so razkrili nabor 38 povišano izraženih beljakovin, med drugimi tudi beljakovino lipokalin 2. Ta je značilna za nevtrofilce, prisotna pa je tudi v ledvicah in služi kot biološki označevalec poškodb proksimalnih tubulov in akutne poškodbe ledvic. Nabor beljakovin je omogočil razli- kovanje med zdravimi in obolelimi ter med zmernimi in hudimi oblikami cistinurije. Pri glomerulonefritisu raven fibroblastno spe- cifične beljakovine 1 (angl. fibroblast-specific protein 1, FSP1), ki se iz podocitov sprošča z ZV, odraža aktivno in stalno poškodbo glo- merulov (143). Omenjena odkritja nakazu- jejo, da so ZV iz urina zelo pomemben vir bioloških označevalcev strukturnih bolezni ledvic (44). Terapevtski potencial zunajceličnih veziklov ZV s prenašanjem beljakovin, nukleinskih kislin in drugih presnovkov sodelujejo pri spreminjanju fizioloških ali patoloških procesov v tarčnih celicah. Lastnosti ZV pa lahko tudi priredimo in jih usmerimo do značilnih tarčnih celic. Natančneje, celice lahko genetsko spremenimo, da proizvedejo in na površino ZV vgradijo določeno povr- šinsko molekulo, ki jo prepoznajo značilne tarčne celice in privzamejo ZV (60). V ZV lahko tudi vgradimo terapevtska sredstva ali genetski material, ki so nato pred raz- gradnjo z DN-azami in RN-azami v telesnih tekočinah zaščiteni s fosfolipidnim dvo- slojem. Na osnovi omenjenih pristopov se razvijajo različni inovativni terapevtski pri- stopi, ob tem pa ostajajo izzivi v proizvod- nji, izolaciji in kvantifikaciji ZV za tera- pevtske namene (144). Mehanizmi delovanja ZV so bili anali- zirani na različnih modelih in vitro, med dru- gim tudi na modelu ledvičnih tubulnih epitelijskih in endotelnih celicah. V ome- njenih celicah so dokazali, da iz njih sproš- čeni vezikli oz. njihov tovor zmanjšuje izra- žanje vnetnih molekul, spodbuja celično proliferacijo in zavira apoptozo (145). Na primeru raka mehurja so odkrili, da raka- ve celice mnogo pogosteje privzemajo ZV v primerjavi z nespremenjenimi oz. zdra- vimi celicami urotelija (144). V primeru led- 96 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 96 vične fibroze so zasnovali ZV iz mezen- himskih matičnih celic s prekomerno izra- ženo miRNA let-7c, ki so po prevzemu v tarčne celice omilili ledvično poškodbo (146). Na modelu miši z akutno okvaro ledvic so dokazali proregenerativne last- nosti urinskih ZV, in sicer je vnos slednjih omilil stopnjo poškodbe tkiv, spodbudil proliferacijo tubulnih celic ter preprečil akti- vacijo provnetnih citokinov. Poročali so o močno zmanjšani vsebnosti dejavnika klotho v obolelih miših, nasprotno pa so po dodajanju urinskih ZV opazili izgradnjo dejavnika de novo in povrnitev njegove fiziološke ravni. Gre za dejavnik, ki ima v topni obliki dokazano protivnetno, anti- oksidativno in antifibrotično delovanje v ledvičnem tkivu (147). Vnos človeških eksosomov iz urina v podgane z DN je zavrl apoptozo podocitov in pospešil obnovo žil ter izboljšal preživetje celic (148). Pokazali so še, da vezikli iz ledvičnih mezenhimskih matičnih celic vsebujejo mRNA-zapise žil- nega endotelijskega rastnega dejavnika A (angl. vascular endothelial growth factor A, VEGF-A), inzulinu podobnega rastnega dejavnika 1 (angl. insulin-like growth factor 1, IGF-1) in fibroblastnega rastnega dejavni- ka (angl. fibroblast growth factor, FGF), ki spodbujajo endotelne celice in tvorbo novih žil pri ishemičnih poškodbah ledvičnega tkiva (149). In vitro so pokazali, da vnos eksosomov regulatornih celic T povzroči zavoro proliferacije celic, in vivo pa ome- njeni eksosomi zakasnijo zavrnitveno reak- cijo in s tem podaljšajo čas preživetja pre- sadka v podganjem modelu presajene led- vice (150). ZV bi lahko tako v prihodnosti služili za zdravljenje raznolikih ledvičnih bolezni, vključno okvare presajene ledvice. ZaKLJUČEK S pričujočim preglednim prispevkom smo bralcem na primeru problematike zazna- vanja okvare presajene ledvice želeli pred- staviti ZV in njihovo možno klinično upo- rabo. V zadnjih letih je vse več raziskav, ki raziskujejo lastnosti ZV in njihovo pato- fiziološko vlogo pri različnih boleznih. Hkrati hitro narašča tudi število raziskav, v katerih že uveljavljene ugotovitve posku- šajo prenesti v klinično prakso, kjer ZV obe- tajo kot možni biološki označevalci različnih bolezni, kot tarče za preprečevanje razvo- ja bolezni in celo kot dostavni sistem za zdravilne učinkovine. Zaradi širokega nabo- ra možnih uporab ZV in vse več dokazov o njihovem pomenu pri etiopatogenezi različnih bolezni bo v prihodnje poznava- nje tega področja vse pomembnejše tudi za strokovnjake različnih medicinskih strok. ZaHvaLa Avtorji se lepo zahvaljujemo Maruši Puschner in asist. dr. Mariji Holcar za pomoč pri pri- pravi slik. Zahvaljujemo se tudi Javni agen- ciji za raziskovalno dejavnost RS za pomoč pri financiranju (P3-0323, P1-0170). 97Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 97 LITERaTURa 1. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Chronic kidney disease and its complications. Prim Care. 2008; 35 (2): 329–44. 2. Suthanthiran M, Strom TB. Renal transplantation. N Engl J Med. 1994; 331 (6): 365–76. 3. Fiebiger W, Mitterbauer C, Oberbauer R. Health-related quality of life outcomes after kidney transplantation. Health Qual Life Outcomes. 2004; 2: 2. 4. Kidney transplants in 2020, by country, by donor type, by organ combination [internet]. Eurotransplant sta- tistics library; c2021 [citirano 2021 Nov 8]. Dosegljivo na: https://statistics.eurotransplant.org 5. Kandus A, Ponikvar Buturović J, Mlinšek G, et al. Kidney transplantation in Slovenia from 1970 to 2015. Therap Aph Dia. 2016; 20 (3): 229–33. 6. Coemans M, Süsal C, Döhler B, et al. Analyses of the short- and long-term graft survival after kidney trans- plantation in Europe between 1986 and 2015. Kidney Int. 2018; 94 (5): 964–73. 7. Nieuwenhuijs-Moeke GJ, Pischke SE, Berger SP, et al. Ischemia and reperfusion injury in kidney transplan- tation: Relevant mechanisms in injury and repair. J Clin Med. 2020; 9 (1): 253. 8. KDIGO clinical practice guideline for the care of kidney transplant recipients. Am J Transplant. 2009; 9 Suppl 3: S1–155. 9. Rifle G, Mousson C, Martin L, et al. Donor-specific antibodies in allograft rejection: Clinical and experimental data. Transplantation. 2005; 79 Suppl 3: S14–8. 10. Wood KJ, Goto R. Mechanisms of rejection: Current perspectives. Transplantation. 2012; 93 (1): 1–10. 11. Riella LV, Djamali A, Pascual J. Chronic allograft injury: Mechanisms and potential treatment targets. Transplant Rev (Orlando). 2017; 31 (1): 1–9. 12. Barra JM, Tse HM. Redox-dependent inflammation in islet transplantation rejection. Front Endocrinol. 2018; 9: 175. 13. Haas M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: What is in a name? Curr Opin Nephrol Hypertens. 2014; 23 (3): 245–50. 14. Isoniemi HM, Krogerus L, von Willebrand E, et al. Histopathological findings in well-functioning, long-term renal allografts. Kidney Int. 1992; 41 (1): 155–60. 15. Granata S, Benedetti C, Gambaro G, et al. Kidney allograft fibrosis: What we learned from latest translational research studies. J Nephrol. 2020. 16. Serón D, Moreso F, Ramón JM, et al. Protocol renal allograft biopsies and the design of clinical trials aimed to prevent or treat chronic allograft nephropathy. Transplantation. 2000; 69 (9): 1849–55. 17. Anglicheau D, Naesens M, Essig M, et al. Establishing biomarkers in transplant medicine: A critical review of current approaches. Transplantation. 2016; 100 (10): 2024–38. 18. Menon MC, Murphy B, Heeger PS. Moving biomarkers toward clinical implementation in kidney transplan- tation. J Am Soc Nephrol. 2017; 28 (3): 735–47. 19. Roufosse C, Simmonds N, Clahsen-van Groningen M, et al. A 2018 reference guide to the banff classification of renal allograft pathology. Transplantation. 2018; 102 (11): 1795–814. 20. Murray PT, Mehta RL, Shaw A, et al. Potential use of biomarkers in acute kidney injury: Report and summary of recommendations from the 10th Acute Dialysis Quality Initiative consensus conference. Kidney Int. 2014; 85 (3): 513–21. 21. Haase-Fielitz A, Haase M, Devarajan P. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a biomarker of acute kidney injury: A critical evaluation of current status. Ann Clin Biochem. 2014; 51 Suppl 3: 335–51. 22. Peake PW, Pianta TJ, Succar L, et al. A comparison of the ability of levels of urinary biomarker proteins and exosomal mrna to predict outcomes after renal transplantation. PLoS One. 2014; 9 (2): e98644. 23. Hirt-Minkowski P, De Serres SA, Ho J. Developing renal allograft surveillance strategies – urinary biomarkers of cellular rejection. Can J Kidney Health Dis. 2015; 2: 28. 24. Hirt-Minkowski P, Amico P, Ho J, et al. Detection of clinical and subclinical tubulo-interstitial inflammation by the urinary CXCL10 chemokine in a real-life setting. Am J Transplant. 2012; 12 (7): 1811–23. 25. Hricik DE, Nickerson P, Formica RN, et al. Multicenter validation of urinary CXCL9 as a risk-stratifying bio- marker for kidney transplant injury. Am J Transplant. 2013; 13 (10): 2634–44. 26. Rabant M, Amrouche L, Morin L, et al. Early low urinary CXCL9 and CXCL10 might predict immunological quies- cence in clinically and histologically stable kidney recipients. Am J Transplant. 2016; 16 (6): 1868–81. 27. Suthanthiran M, Schwartz JE, Ding R, et al. Urinary-cell mrna profile and acute cellular rejection in kidney allo- grafts. N Engl J Med. 2013; 369 (1): 20–31. 98 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 98 28. Wilflingseder J, Regele H, Perco P, et al. MiRNA profiling discriminates types of rejection and injury in human renal allografts. Transplantation. 2013; 95 (6): 835–41. 29. Wilflingseder J, Sunzenauer J, Toronyi E, et al. Molecular pathogenesis of post-transplant acute kidney injury: Assessment of whole-genome mRNA and miRNA profiles. PLoS One. 2014; 9 (8): e104164. 30. Anglicheau D, Sharma VK, Ding R, et al. MicroRNA expression profiles predictive of human renal allograft status. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106 (13): 5330–5. 31. Soltaninejad E, Nicknam MH, Nafar M, et al. Differential expression of microRNAs in renal transplant patients with acute t-cell mediated rejection. Transpl Immunol. 2015; 33 (1): 1–6. 32. Millán O, Budde K, Sommerer C, et al. Urinary miR-155-5p and CXCL10 as prognostic and predictive biomarkers of rejection, graft outcome and treatment response in kidney transplantation. Br J Clin Pharmacol. 2017; 83 (12): 2636–50. 33. Zununi Vahed S, Omidi Y, Ardalan M, et al. Dysregulation of urinary miR-21 and miR-200b associated with interstitial fibrosis and tubular atrophy (IFTA) in renal transplant recipients. Clin Biochem. 2017; 50 (1–2): 32–9. 34. Ben-Dov IZ, Muthukumar T, Morozov P, et al. MicroRNA sequence profiles of human kidney allografts with or without tubulointerstitial fibrosis. Transplantation. 2012; 94 (11): 1086–94. 35. Knight SR, Thorne A, Lo Faro ML. Donor-specific cell-free DNA as a biomarker in solid organ transplantation. A systematic review. Transplantation. 2019; 103 (2): 273–83. 36. Bloom RD, Bromberg JS, Poggio ED, et al. Cell-free DNA and active rejection in kidney allografts. J Am Soc Nephrol. 2017; 28 (7): 2221–32. 37. Whitlam JB, Ling L, Skene A, et al. Diagnostic application of kidney allograft-derived absolute cell-free DNA levels during transplant dysfunction. Am J Transplant. 2019; 19 (4): 1037–49. 38. García Moreira V, Prieto García B, Baltar Martín JM, et al. Cell-free DNA as a noninvasive acute rejection marker in renal transplantation. Clin Chem. 2009; 55 (11): 1958–66. 39. Deatherage BL, Cookson BT. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infect Immun. 2012; 80 (6): 1948–57. 40. Simpson RJ, Lim JW, Moritz RL, et al. Exosomes: Proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 2009; 6 (3): 267–83. 41. Yáñez-Mó M, Siljander PR, Andreu Z, et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 2015; 4: 27066. 42. Macia L, Nanan R, Hosseini-Beheshti E, et al. Host- and microbiota-derived extracellular vesicles, immune function, and disease development. Int J Mol Sci. 2019; 21 (1): 107. 43. Simons M, Raposo G. Exosomes–vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 2009; 21 (4): 575–81. 44. González E, Falcón-Pérez JM. Cell-derived extracellular vesicles as a platform to identify low-invasive disease biomarkers. Expert Rev Mol Diagn. 2015; 15 (7): 907–23. 45. Colombo M, Raposo G, Théry C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 2014; 30 (1): 255–89. 46. Ferdin J, Lenassi M. Zunajcelični vezikli in njihov klinični potencial. Med Razgl. 2016; 55 (1): 63–82. 47. Théry C, Witwer KW, Aikawa E, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018; 7 (1): 1535750. 48. Matsumoto Y, Kano M, Akutsu Y, et al. Quantification of plasma exosome is a potential prognostic marker for esophageal squamous cell carcinoma. Oncol Rep. 2016; 36 (5): 2535–43. 49. Fang S, Tian H, Li X, et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PLoS One. 2017; 12 (4): e0175050. 50. Sinning JM, Losch J, Walenta K, et al. Circulating CD31+/annexin V+ microparticles correlate with cardiovascular outcomes. Eur Heart J. 2011; 32 (16): 2034–41. 51. Pereira J, Alfaro G, Goycoolea M, et al. Circulating platelet-derived microparticles in systemic lupus erythe- matosus. Association with increased thrombin generation and procoagulant state. Thromb Haemost. 2006; 95 (1): 94–9. 52. Zhang W, Peng P, Kuang Y, et al. Characterization of exosomes derived from ovarian cancer cells and normal ovarian epithelial cells by nanoparticle tracking analysis. Tumour Biol. 2016; 37 (3): 4213–21. 99Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 99 53. Yang JS, Lee JC, Byeon SK, et al. Size dependent lipidomic analysis of urinary exosomes from patients with prostate cancer by flow field-flow fractionation and nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Chem. 2017; 89 (4): 2488–96. 54. Navarro-Tableros V, Gomez Y, Camussi G, et al. Extracellular vesicles: New players in lymphomas. Int J Mol Sci. 2018; 20 (1): 41. 55. Badovinac D, Goričar K, Zavrtanik H, et al. Plasma extracellular vesicle characteristics correlate with tumor differentiation and predict overall survival in patients with pancreatic ductal adenocarcinoma undergoing surgery with curative intent. J Pers Med. 2021; 11 (2): 77. 56. van der Pol E, Böing AN, Harrison P, et al. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacol Rev. 2012; 64 (3): 676–705. 57. Midekessa G, Godakumara K, Ord J, et al. Zeta potential of extracellular vesicles: Toward understanding the attributes that determine colloidal stability. ACS Omega. 2020; 5 (27): 16701–10. 58. Yokota S, Kuramochi H, Okubo K, et al. Extracellular vesicles nanoarray technology: Immobilization of indi- vidual extracellular vesicles on nanopatterned polyethylene glycol-lipid conjugate brushes. PLoS One. 2019; 14 (10): e0224091. 59. Abels ER, Breakefield XO. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 2016; 36 (3): 301–12. 60. Ståhl AL, Johansson K, Mossberg M, et al. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatr Nephrol. 2019; 34 (1): 11–30. 61. Kalra H, Simpson RJ, Ji H, et al. Vesiclepedia: A compendium for extracellular vesicles with continuous com- munity annotation. PLoS Biol. 2012; 10 (12): e1001450. 62. Keerthikumar S, Chisanga D, Ariyaratne D, et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 2016; 428 (4): 688–92. 63. Kim DK, Kang B, Kim OY, et al. EVpedia: An integrated database of high-throughput data for systemic analyses of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2013; 2. 64. van Niel G, D’Angelo G, Raposo G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 2018; 19 (4): 213–28. 65. Vasconcelos MH, Caires HR, Ābols A, et al. Extracellular vesicles as a novel source of biomarkers in liquid biopsies for monitoring cancer progression and drug resistance. Drug Resist Updat. 2019; 47: 100647. 66. Ageta H, Tsuchida K. Post-translational modification and protein sorting to small extracellular vesicles including exosomes by ubiquitin and UBLs. Cell Mol Life Sci. 2019; 76 (24): 4829–48. 67. Skotland T, Sagini K, Sandvig K, et al. An emerging focus on lipids in extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 2020; 159: 308–21. 68. Pienimaeki-Roemer A, Kuhlmann K, Böttcher A, et al. Lipidomic and proteomic characterization of platelet extracellular vesicle subfractions from senescent platelets. Transfusion. 2015; 55 (3): 507–21. 69. Skotland T, Ekroos K, Kauhanen D, et al. Molecular lipid species in urinary exosomes as potential prostate cancer biomarkers. Eur J Cancer. 2017; 70: 122–32. 70. Zebrowska A, Skowronek A, Wojakowska A, et al. Metabolome of exosomes: Focus on vesicles released by cancer cells and present in human body fluids. Int J Mol Sci. 2019; 20 (14): 3461. 71. Valadi H, Ekström K, Bossios A, et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mech- anism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 2007; 9 (6): 654–9. 72. Gibbings DJ, Ciaudo C, Erhardt M, et al. Multivesicular bodies associate with components of miRNA effector complexes and modulate miRNA activity. Nat Cell Biol. 2009; 11 (9): 1143–9. 73. Trajkovic K, Hsu C, Chiantia S, et al. Ceramide triggers budding of exosome vesicles into multivesicular endo- somes. Science. 2008; 319 (5867): 1244–7. 74. Koppers-Lalic D, Hackenberg M, Bijnsdorp IV, et al. Nontemplated nucleotide additions distinguish the small RNA composition in cells from exosomes. Cell Rep. 2014; 8 (6): 1649–58. 75. Hergenreider E, Heydt S, Tréguer K, et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nat Cell Biol. 2012; 14 (3): 249–56. 76. Montecalvo A, Larregina AT, Shufesky WJ, et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 2012; 119 (3): 756–66. 77. Kim KM, Abdelmohsen K, Mustapic M, et al. RNA in extracellular vesicles. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2017; 8 (4): 10. 78. Kouwaki T, Fukushima Y, Daito T, et al. Extracellular vesicles including exosomes regulate innate immune responses to hepatitis B virus infection. Front Immunol. 2016; 7: 335. 100 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 100 79. Malkin EZ, Bratman SV. Bioactive DNA from extracellular vesicles and particles. Cell Death Dis. 2020; 11 (7): 584. 80. Kahlert C, Melo SA, Protopopov A, et al. Identification of double-stranded genomic DNA spanning all chro- mosomes with mutated KRAS and p53 DNA in the serum exosomes of patients with pancreatic cancer. J Biol Chem. 2014; 289 (7): 3869–75. 81. Vagner T, Spinelli C, Minciacchi VR, et al. Large extracellular vesicles carry most of the tumour DNA circulating in prostate cancer patient plasma. J Extracell Vesicles. 2018; 7 (1): 1505403. 82. Thakur BK, Zhang H, Becker A, et al. Double-stranded DNA in exosomes: A novel biomarker in cancer detection. Cell Res. 2014; 24 (6): 766–9. 83. Holmgren L, Szeles A, Rajnavölgyi E, et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 1999; 93 (11): 3956–63. 84. Cai J, Han Y, Ren H, et al. Extracellular vesicle-mediated transfer of donor genomic DNA to recipient cells is a novel mechanism for genetic influence between cells. J Mol Cell Biol. 2013; 5 (4): 227–38. 85. Sato S, Zhu XL, Sly WS. Carbonic anhydrase isozymes IV and II in urinary membranes from carbonic anhy- drase II-deficient patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990; 87 (16): 6073–6. 86. Pisitkun T, Shen RF, Knepper MA. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101 (36): 13368–73. 87. Fernández-Llama P, Khositseth S, Gonzales PA, et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney Int. 2010; 77 (8): 736–42. 88. Pomatto MAC, Gai C, Bussolati B, et al. Extracellular vesicles in renal pathophysiology. Front Mol Biosci. 2017; 4: 37. 89. Turco AE, Lam W, Rule AD, et al. Specific renal parenchymal-derived urinary extracellular vesicles identify age-associated structural changes in living donor kidneys. J Extracell Vesicles. 2016; 5: 29642. 90. Gonzales PA, Pisitkun T, Hoffert JD, et al. Large-scale proteomics and phosphoproteomics of urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 2009; 20 (2): 363–79. 91. Dimov I, Jankovic Velickovic L, Stefanovic V. Urinary exosomes. ScientificWorldJournal. 2009; 9: 1107–18. 92. Bijnsdorp IV, Maxouri O, Kardar A, et al. Feasibility of urinary extracellular vesicle proteome profiling using a robust and simple, clinically applicable isolation method. J Extracell Vesicles. 2017; 6 (1): 1313091. 93. Merchant ML, Rood IM, Deegens JKJ, et al. Isolation and characterization of urinary extracellular vesicles: Implications for biomarker discovery. Nat Rev Nephrol. 2017; 13 (12): 731–49. 94. Gerlach JQ, Krüger A, Gallogly S, et al. Surface glycosylation profiles of urine extracellular vesicles. PLoS One. 2013; 8 (9): e74801. 95. Saraswat M, Joenväära S, Musante L, et al. N-linked (N-) glycoproteomics of urinary exosomes. [Corrected]. Mol Cell Proteomics. 2015; 14 (2): 263–76. 96. Everaert C, Helsmoortel H, Decock A, et al. Performance assessment of total RNA sequencing of human biofluids and extracellular vesicles. Sci Rep. 2019; 9 (1): 17574. 97. Taft RJ, Pang KC, Mercer TR, et al. Non-coding RNAs: Regulators of disease. J Pathol. 2010; 220 (2): 126–39. 98. Miranda KC, Bond DT, Levin JZ, et al. Massively parallel sequencing of human urinary exosome/microvesicle RNA reveals a predominance of non-coding RNA. PLoS One. 2014; 9 (5): e96094. 99. Cheng L, Sun X, Scicluna BJ, et al. Characterization and deep sequencing analysis of exosomal and non-exo- somal miRNA in human urine. Kidney Int. 2014; 86 (2): 433–44. 100. Elzanowska J, Semira C, Costa-Silva B. DNA in extracellular vesicles: biological and clinical aspects. Mol Oncol. 2021: 15 (6): 1701–14. 101. Lee DH, Yoon H, Park S, et al. Urinary exosomal and cell-free DNA detects somatic mutation and copy number alteration in urothelial carcinoma of bladder. Sci Rep. 2018; 8 (1): 14707. 102. Rigalli JP, Barros ER, Sommers V, et al. Novel aspects of extracellular vesicles in the regulation of renal phys- iological and pathophysiological processes. Front Cell Dev Biol. 2020; 8: 244. 103. Gildea JJ, Seaton JE, Victor KG, et al. Exosomal transfer from human renal proximal tubule cells to distal tubule and collecting duct cells. Clin Biochem. 2014; 47 (15): 89–94. 104. Bruno S, Porta S, Bussolati B. Extracellular vesicles in renal tissue damage and regeneration. Eur J Pharmacol. 2016; 790: 83–91. 105. Street JM, Birkhoff W, Menzies RI, et al. Exosomal transmission of functional aquaporin 2 in kidney cortical collecting duct cells. J Physiol. 2011; 589 (24): 6119–27. 106. Jella KK, Yu L, Yue Q, et al. Exosomal GAPDH from proximal tubule cells regulate ENaC activity. PLoS One. 2016; 11 (11): e0165763. 101Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 101 107. Chiabotto G, Bruno S, Collino F, et al. Mesenchymal stromal cells epithelial transition induced by renal tubular cells-derived extracellular vesicles. PLoS One. 2016; 11 (7): e0159163. 108. Wu XM, Gao YB, Cui FQ, et al. Exosomes from high glucose-treated glomerular endothelial cells activate mesangial cells to promote renal fibrosis. Biol Open. 2016; 5 (4): 484–91. 109. Zhu QJ, Zhu M, Xu XX, et al. Exosomes from high glucose-treated macrophages activate glomerular mesangial cells via TGF-β1/Smad3 pathway in vivo and in vitro. Faseb J. 2019; 33 (8): 9279–90. 110. Xia Y, Zhang Q, Zhen Q, et al. Negative regulation of tumor-infiltrating NK cell in clear cell renal cell carcinoma patients through the exosomal pathway. Oncotarget. 2017; 8 (23): 37783–95. 111. Wang L, Yang G, Zhao D, et al. CD103-positive CSC exosome promotes EMT of clear cell renal cell carcinoma: Role of remote MiR-19b-3p. Mol Cancer. 2019; 18 (1): 86. 112. Zhang G, Zou X, Huang Y, et al. Mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles protect against acute kidney injury through anti-oxidation by enhancing Nrf2/ARE activation in rats. Kidney Blood Press Res. 2016; 41 (2): 119–28. 113. Dominguez JH, Liu Y, Gao H, et al. Renal tubular cell-derived extracellular vesicles accelerate the recovery of established renal ischemia reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 2017; 28 (12): 3533–44. 114. Dominguez JM 2nd, Dominguez JH, Xie D, et al. Human extracellular microvesicles from renal tubules reverse kidney ischemia-reperfusion injury in rats. PLoS One. 2018; 13 (8): e0202550. 115. Shen B, Liu J, Zhang F, et al. CCR2 positive exosome released by mesenchymal stem cells suppresses macrophage functions and alleviates ischemia/reperfusion-induced renal injury. Stem Cells Int. 2016; 2016: 1240301. 116. King HW, Michael MZ, Gleadle JM. Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells. BMC Cancer. 2012; 12: 421. 117. Kucharzewska P, Belting M. Emerging roles of extracellular vesicles in the adaptive response of tumour cells to microenvironmental stress. J Extracell Vesicles. 2013; 2. 118. Chernyshev VS, Rachamadugu R, Tseng YH, et al. Size and shape characterization of hydrated and desic- cated exosomes. Anal Bioanal Chem. 2015; 407 (12): 3285–301. 119. Bryzgunova OE, Laktionov PP. Extracellular nucleic acids in urine: Sources, structure, diagnostic potential. Acta Naturae. 2015; 7 (3): 48–54. 120. Raab WP. Enzymes and isoenzymes in urine. Curr Probl Clin Biochem. 1968; 2: 17–83. 121. Roy S, Hochberg FH, Jones PS. Extracellular vesicles: The growth as diagnostics and therapeutics; a survey. J Extracell Vesicles. 2018; 7 (1): 1438720. 122. Gardiner C, Di Vizio D, Sahoo S, et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: Results of a worldwide survey. J Extracell Vesicles. 2016; 5: 32945. 123. Park J, Lin HY, Assaker JP, et al. Integrated kidney exosome analysis for the detection of kidney transplant rejection. ACS Nano. 2017; 11 (11): 11041–6. 124. Dimuccio V, Ranghino A, Praticò Barbato L, et al. Urinary CD133+ extracellular vesicles are decreased in kid- ney transplanted patients with slow graft function and vascular damage. PLoS One. 2014; 9 (8): e104490. 125. Alvarez S, Suazo C, Boltansky A, et al. Urinary exosomes as a source of kidney dysfunction biomarker in renal transplantation. Transplant Proc. 2013; 45 (10): 3719–23. 126. Sonoda H, Yokota-Ikeda N, Oshikawa S, et al. Decreased abundance of urinary exosomal aquaporin-1 in renal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Renal Physiol. 2009; 297 (4): F1006–16. 127. El Fekih R, Hurley J, Tadigotla V, et al. Discovery and validation of a urinary exosome mRNA signature for the diagnosis of human kidney transplant rejection. J Am Soc Nephrol. 2021; 32 (2): 994–1004. 128. Lim JH, Lee CH, Kim KY, et al. Novel urinary exosomal biomarkers of acute T cell-mediated rejection in kidney transplant recipients: A cross-sectional study. PLoS One. 2018; 13 (9): e0204204. 129. Sigdel T, Dinh V, Vitalone M, et al. Identification of transplant injury specific metabolites in the kidney transplant urine by metabolomics.: Abstract# A497. Transplantation. 2014; 98: 884–5. 130. Kanno K, Sasaki S, Hirata Y, et al. Urinary excretion of aquaporin-2 in patients with diabetes insipidus. N Engl J Med. 1995; 332 (23): 1540–5. 131. Lytvyn Y, Xiao F, Kennedy CR, et al. Assessment of urinary microparticles in normotensive patients with type 1 diabetes. Diabetologia. 2017; 60 (3): 581–4. 132. Barutta F, Tricarico M, Corbelli A, et al. Urinary exosomal microRNAs in incipient diabetic nephropathy. PLoS One. 2013; 8 (11): e73798. 133. Zubiri I, Posada-Ayala M, Sanz-Maroto A, et al. Diabetic nephropathy induces changes in the proteome of human urinary exosomes as revealed by label-free comparative analysis. J Proteomics. 2014; 96: 92–102. 102 Anžej Hladnik, Ivana Sedej, Vita Dolžan, Miha Arnol, Metka Lenassi Zunajcelični vezikli v urinu … mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 102 134. Zhou H, Kajiyama H, Tsuji T, et al. Urinary exosomal Wilms’ tumor-1 as a potential biomarker for podocyte injury. Am J Physiol Renal Physiol. 2013; 305 (4): F553–9. 135. Abe H, Sakurai A, Ono H, et al. Urinary exosomal mRNA of WT1 as diagnostic and prognostic biomarker for diabetic nephropathy. J Med Invest. 2018; 65 (3.4): 208–15. 136. du Cheyron D, Daubin C, Poggioli J, et al. Urinary measurement of Na+/H+ exchanger isoform 3 (NHE3) protein as new marker of tubule injury in critically ill patients with ARF. Am J Kidney Dis. 2003; 42 (3): 497–506. 137. Zhou H, Pisitkun T, Aponte A, et al. Exosomal fetuin-a identified by proteomics: A novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney Int. 2006; 70 (10): 1847–57. 138. Zhou H, Cheruvanky A, Hu X, et al. Urinary exosomal transcription factors, a new class of biomarkers for renal disease. Kidney Int. 2008; 74 (5): 613–21. 139. Pocsfalvi G, Raj DAA, Fiume I, et al. Urinary extracellular vesicles as reservoirs of altered proteins during the pathogenesis of polycystic kidney disease. Proteomics Clin Appl. 2015; 9 (5–6): 552–67. 140. Salih M, Demmers JA, Bezstarosti K, et al. Proteomics of urinary vesicles links plakins and complement to polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 2016; 27 (10): 3079–92. 141. Hogan MC, Bakeberg JL, Gainullin VG, et al. Identification of biomarkers for PKD1 using urinary exosomes. J Am Soc Nephrol. 2015; 26 (7): 1661–70. 142. Bourderioux M, Nguyen-Khoa T, Chhuon C, et al. A new workflow for proteomic analysis of urinary exosomes and assessment in cystinuria patients. J Proteome Res. 2015; 14 (1): 567–77. 143. Morikawa Y, Takahashi N, Kamiyama K, et al. Elevated levels of urinary extracellular vesicle fibroblast-specific protein 1 in patients with active crescentic glomerulonephritis. Nephron. 2019; 141 (3): 177–87. 144. Lv LL, Wu WJ, Feng Y, et al. Therapeutic application of extracellular vesicles in kidney disease: Promises and challenges. J Cell Mol Med. 2018; 22 (2): 728–37. 145. Rovira J, Diekmann F, Campistol JM, et al. Therapeutic application of extracellular vesicles in acute and chronic renal injury. Nefrologia. 2017; 37 (2): 126–37. 146. Greco KA, Franzen CA, Foreman KE, et al. PLK-1 silencing in bladder cancer by siRNA delivered with exosomes. Urology. 2016; 91: 241.e1–7. 147. Wang B, Yao K, Huuskes BM, et al. Mesenchymal stem cells deliver exogenous microRNA-let7c via exosomes to attenuate renal fibrosis. Mol Ther. 2016; 24 (7): 1290–301. 148. Grange C, Papadimitriou E, Dimuccio V, et al. Urinary extracellular vesicles carrying klotho improve the recovery of renal function in an acute tubular injury model. Mol Ther. 2020; 28 (2): 490–502. 149. Jiang ZZ, Liu YM, Niu X, et al. Exosomes secreted by human urine-derived stem cells could prevent kidney complications from type i diabetes in rats. Stem Cell Res Ther. 2016; 7: 24. 150. Yu X, Huang C, Song B, et al. CD4+CD25+ regulatory T cells-derived exosomes prolonged kidney allograft survival in a rat model. Cell Immunol. 2013; 285 (1–2): 62–8. Prispelo 21. 10. 2021 103Med Razgl. 2022; 61 (1): mr22_1_Mr10_2.qxd 30.3.2022 8:29 Page 103