UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Marjeta MENCIN IZBOLJŠANJE DOSTOPNOSTI IN ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI VEZANIH FENOLNIH SPOJIN IZ SEMEN PIRE ( Triticum spelta L.) Z IZBRANIMI BIOTEHNOLOŠKIMI PROCESI DOKTORSKA DISERTACIJA Ljubljana, 2022 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Marjeta MENCIN IZBOLJŠANJE DOSTOPNOSTI IN ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI VEZANIH FENOLNIH SPOJIN IZ SEMEN PIRE ( Triticum spelta L.) Z IZBRANIMI BIOTEHNOLOŠKIMI PROCESI DOKTORSKA DISERTACIJA IMPROVEMENT OF ACCESSIBILITY AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF BOUND PHENOLIC COMPOUNDS OF SPELT ( Triticum spelta L.) SEEDS BY SELECTED BIOTECHNOLOGICAL PROCESSES DOCTORAL DISSERTATION Ljubljana, 2022 II Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in sklepa Komisije za doktorski študij Univerze v Ljubljani z dne 18. 5. 2021 je bilo potrjeno, da kandidatka izpolnjuje pogoje za opravljanje doktorata znanosti na Interdisciplinarnem doktorskem študijskem programu Bioznanosti, znanstveno področje živilstvo. Za mentorico je bila imenovana doc. dr. Petra Terpinc. Doktorska disertacija je zaključek interdisciplinarnega doktorskega študijskega programa Bioznanosti. Raziskovalno delo je bilo opravljeno na Katedri za tehnologije rastlinskih živil in vino, Katedri za biotehnologijo, mikrobiologijo in varnost živil in Katedri za biokemijo in kemijo živil, Oddelka za živilstvo, ter na Katedri za sadjarstvo, vinogradništvo in vrtnarstvo, Oddelka za agronomijo, Biotehniške fakultete, Univerze v Ljubljani. Mentorica: doc. dr. Petra TERPINC Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: prof. dr. Blaž CIGIĆ Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo Član: prof. dr. Helena PROSEN Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Oddelek za kemijo in biokemijo Član: doc. dr. Boris KOVAČ Univerza na Primorskem, Fakulteta za vede o zdravju Datum zagovora: Doktorandka: Marjeta MENCIN III Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd DK UDK 633.111.5:581.142:631.531:547.56(043)=163.6 KG pira, vezane in ekstraktibilne fenolne spojine, antioksidativna aktivnost, kaljenje, fermentacija, encimska obdelava, abiotski stres, biološka dostopnost, znotrajcelična oksidacija, in vitro gastrointestinalna prebava AV MENCIN, Marjeta, mag. inž. živ. SA TERPINC, Petra (mentorica) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinarni doktorski študijski program Bioznanosti, znanstveno področje živilstvo LI 2022 IN IZBOLJŠANJE DOSTOPNOSTI IN ANTIOKSIDATIVNE AKTIVNOSTI VEZANIH FENOLNIH SPOJIN IZ SEMEN PIRE ( Triticum spelta L.) Z IZBRANIMI BIOTEHNOLOŠKIMI PROCESI TD Doktorska disertacija OP X, 125 str., 2 sl., 3 pril., 138 vir. IJ sl JI sl/en AI V doktorski disertaciji smo preučili vpliv različnih biotehnoloških procesov (kaljenja, fermentacije, encimske obdelave) na vsebnost in dostopnost ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin v semenih pire in na njihovo in vitro ter in vivo antioksidativno aktivnost. Glavne identificirane fenolne spojine v pirinih semenih so bile ferulna, p-kumarna, kavna in p-hidroksibenzojska kislina. Pri iskanju optimalnih pogojev abiotskega stresa med kaljenjem semen za čim večji prirast fenolov, je kaljenje pri povečani slanosti in osmolarnosti brez aplicirane mehanske poškodbe najbolj povečalo vsebnost fenolnih spojin in izboljšalo njihovo antioksidativno aktivnost. Kombiniranje različnih biotehnoloških procesov predstavlja bistveno učinkovitejši način za povečanje vsebnosti fenolnih spojin kot posamezen proces. Največjo absolutno vsebnost ekstraktibilnih in vezanih posameznih fenolnih kislin smo določili v kaljenih semenih, fermentiranih s S. cerevisiae. Nadalje je obdelava kaljenih in fermentiranih semen s petimi hidrolitičnimi encimi znatno povečala vsebnost ekstraktibilnih fenolnih spojin, hkrati pa je imela negativen vpliv na vsebnost vezanih fenolnih spojin. Fenolne spojine iz kaljenih semen niso zaščitile modelnega organizma S. cerevisiae pred oksidacijo, medtem ko je večina ekstraktibilnih fenolnih spojin iz fermentiranih in encimsko obdelanih semen znižala znotrajcelično oksidacijo. Večji celični privzem fenolnih spojin ne pomeni nujno tudi večje antioksidativne aktivnosti in vivo, poleg količine je pomembna tudi oblika fenolnih spojin, ki vstopajo v celico. Rezultati kažejo na spremembe v sestavi ekstraktov med simulirano in vitro prebavo, saj so antioksidanti istega ekstrakta pokazali drugačen odziv proti različnim prostim radikalom v primerjavi z neobdelanimi semeni. Največjo vsebnost biološko dostopnih fenolnih spojin smo ugotovili v kaljenih semenih, fermentiranih s S. cerevisiae. Izgube fenolnih spojin po prebavi so bile velike, kljub temu pa so biološko obdelana semena imela še vedno znatno večjo vsebnost fenolnih spojin v primerjavi z neobdelanimi semeni. IV Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KEY WORD DOCUMENTATION ND Dd DC UDC 633.111.5:581.142:631.531:547.56(043)=163.6 CX spelt, bound and extractable phenolic compounds, antioxidant activity, germination, fermentation, enzymatic treatment, abiotic stress, bioaccessibility, intracellular oxidation, in vitro gastrointestinal digestion AU MENCIN, Marjeta AA TERPINC, Petra (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Interdisciplinary Doctoral Programme in Biosciences, Scientific Field Food Science PY 2022 TI IMPROVEMENT OF ACCESSIBILITY AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF BOUND PHENOLIC COMPOUNDS OF SPELT ( Triticum spelta L.) SEEDS BY SELECTED BIOTECHNOLOGICAL PROCESSES DT Doctoral dissertation NO X, 125 p., 2 fig., 3 ann., 138 ref. LA sl AL sl/en AB Within the scope of the doctoral dissertation, we investigated the influence of different biotechnological processes (germination, fermentation, enzymatic treatment) on the content and accessibility of extractable and bound phenolic compounds in spelt seeds, as well as on their antioxidant activity in vitro and in vivo. The major phenolic compounds identified in spelt seeds were ferulic, p-coumaric, caffeic and p-hydroxybenzoic acids. When searching for the optimal conditions of abiotic stress during seed germination to produce the greatest increase in phenolics, germination at increased salinity and osmolarity without applied mechanical damage showed the highest increase in phenolic compounds content and antioxidant activity. Combining different biotechnological processes represents the more effective way to increase the content of phenolic compounds than a single process. The highest absolute content of extractable and bound individual phenolic acids was found in germinated seeds fermented with S. cerevisiae. Moreover, treatment of germinated and fermented seeds with five hydrolytic enzymes significantly increased the content of extractable phenolic compounds, but at the same time had a negative effect on the content of bound phenolic compounds. Phenolic compounds of germinated seeds could not protect the model organism S. cerevisiae from oxidation, whereas most extractable phenolic compounds from fermented and enzymatic treated seeds reduced intracellular oxidation. Greater cellular uptake of phenolic compounds does not necessarily mean greater antioxidant activity in vivo, in addition to the quantity, the form of phenolic compounds entering the cell is also important. The results suggest changes in the composition of the extracts during simulated in vitro digestion, since antioxidants of the same extract showed a different response against various free radicals compared to the raw seeds. The highest content of bioaccessible phenolic compounds was found in germinated seeds fermented with S. cerevisiae. Losses of phenolic compounds after digestion were high, however, the bioprocessed seeds still contained higher content of phenolic compounds compared to raw seeds. V Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO VSEBINE str. KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA III KEY WORD DOCUMENTATION IV KAZALO VSEBINE V KAZALO ZNANSTVENIH DEL VII KAZALO SLIK VIII KAZALO PRILOG IX OKRAJŠAVE IN SIMBOLI X 1 UVOD S PREDSTAVITVIJO PROBLEMATIKE, CILJEV IN HIPOTEZ 1 1.1 NAMEN DELA 11 1.2 RAZISKOVALNE HIPOTEZE 13 2 ZNANSTVENA DELA 14 2.1 KOMBINIRAN ABIOTSKI STRES IZBOLJŠA FENOLNI PROFIL IN AKTIVNOSTI EKSTRAKTIBILNIH IN VEZANIH ANTIOKSIDANTOV IZ SEMEN KALJENE PIRE ( Triticum spelta L.) 14 2.2 IZBOLJŠANJE DOSTOPNOSTI IN BIOLOŠKE AKTIVNOSTI ANTIOKSIDANTOV neobdelanih, KALJENIH IN ENCIMSKO OBDELANIH SEMEN PIRE ( Triticum spelta L.) S FERMENTACIJO 31 2.3 ENCIMSKA OBDELAVA NEOBDELANIH, KALJENIH IN FERMENTIRANIH SEMEN PIRE ( Triticum spelta L.) IZBOLJŠA DOSTOPNOST IN ANTIOKSIDATIVNO AKTIVNOST NJIHOVIH FENOLNIH SPOJIN 51 2.4 SIMULACIJA GASTROINTESTINALNE PREBAVE BIOLOŠKO OBDELANIH PIRINIH SEMEN: BIOLOŠKA DOSTOPNOST IN AKTIVNOST FENOLNIH SPOJIN 67 3 RAZPRAVA IN SKLEPI 88 3.1 RAZPRAVA 88 3.1.1 Vpliv kaljenja na vsebnost fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost 88 3.1.2 Vpliv fermentacije na vsebnost fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost 93 3.1.3 Vpliv encimske obdelave na vsebnost fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost 97 VI Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3.1.4 Vpliv biološke obdelave pirinih semen na biološko dostopnost fenolnih spojin 100 3.2 PRISPEVEK K RAZVOJU ZNANOSTI 105 3.3 SKLEPI 105 4 POVZETEK (SUMMARY) 109 4.1 POVZETEK 109 4.2 SUMMARY 111 5 VIRI 114 ZAHVALA PRILOGE VII Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO ZNANSTVENIH DEL 1. Mencin M., Abramovič H., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2021a. Abiotic stress combinations improve the phenolics profiles and activities of extractable and bound antioxidants from germinated spelt ( Triticum spelta L.) seeds. Food Chemistry, 344: 128704, doi:10.1016/j.foodchem.2020.128704: 12 str. 15 2. Mencin M., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2022a. Improving accessibility and bioactivity of raw, germinated and enzymatic-treated spelt ( Triticum spelta L.) seed antioxidants by fermentation. Food Chemistry, 394: 133483, doi:10.1016/j.foodchem.2022.133483: 12 str. 32 3. Mencin M., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2022b. Enzymatic treatments of raw, germinated and fermented spelt ( Triticum spelta L.) seeds improve accessibility and antioxidant activity of their phenolics. LWT, 169: 114046, doi:10.1016/j.lwt.2022.114046: 13 str. 52 4. Mencin M., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2022c. Simulated gastrointestinal digestion of bioprocessed spelt seeds: bioaccessibility and bioactivity of phenolics. Antioxidants, 11, 9: 1703, doi: 10.3390/antiox11091703: 20 str. 68 VIII Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO SLIK Slika 1: Enostaven shematski prikaz biosintezne poti fenolnih kislin, ki izhaja iz šikimske kisline. Encimi: (E1) fenilalanin amonijak liaza, (E2) oksidaza, (E3) benzojska kislina- 4-hidroksilaza, (E4) p-hidroksibenzojska kislina-3-hidroksilaza, (E5) protokatehujska kislina-5-hidroksilaza, (E6) protokatehujska kislina-3- O-metiltransferaza, (E7) vanilinska kislina-5-hidroksilaza in vanilinska kislina-5- O-metiltransferaza, (E8) cimetna kislina-4-hidroksilaza, (E9) tirozin amonijak liaza, (E10) p-kumarna kislina- 3-hidroksilaza, (E11) kavna kislina-3- O-metiltransferaza, (E12) ferulna kislina-5- hidroksilaza in kavna kislina/5-hidroksiferulna kislina- O-metiltransferaza (povzeto po Heleno in sod., 2015). 3 Slika 2: Poenostavljena predstavitev zamreženja med strukturnimi komponentami rastlinske celične stene in fenolnimi spojinami. Prikaz kovalentnih vezi: etrske vezi med fenolnimi spojinami in ligninom; estrske vezi med fenolnimi spojinami in strukturnimi ogljikovimi hidrati, proteini (povzeto po Acosta-Estrada in sod., 2014). 5 IX Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO PRILOG PRILOGA A: Dovoljenje za uporabo članka Mencin in sod. (2021a) iz revije Food Chemistry. PRILOGA B: Dovoljenje za uporabo članka Mencin in sod. (2022a) iz revije Food Chemistry. PRILOGA C: Objavljen članek Mencin in sod. (2021b). X Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ABTS 2,2'-azino-bis-3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina (ang. 2,2'- azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) C4H cinamat-4-hidroksilaza (ang. cinnamate 4-hydroxylase) C4L p-kumarat-CoA ligaza (ang . p-coumarate-CoA ligase) DNK deoksiribonukleinska kislina (ang. d eoxyribonucleic acid) DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (ang. 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) GI prebava gastrointestinalna prebava (ang . gastrointestinal digestion) HPLC-MS/MS tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (ang. high-performance liquid chromatography) sklopljena s tandemsko masno spektrometrijo (ang. mass spectrometry) ICO znotrajcelična oksidacija (ang. intracellular oxidation) MKB mlečnokislinske bakterije (ang. lactic acid bacteria) O •- 2 superoksidni anionski radikal (ang. superoxide anion radical) PAL fenilalanin amonijak liaza (ang. phenylalanine ammonia-lyase) ROO• peroksilni radikal (ang. peroxyl radical) ROS reaktivne kisikove zvrsti (ang. reactive oxygen species) SPE ekstrakcija na trdno fazo (ang. solid phase extraction) SS suha snov (ang. dry weight) TE trolox ekvivalent (ang. trolox equivalent) TPC skupne fenolne spojine (ang. total phenolic content) 1 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1 UVOD S PREDSTAVITVIJO PROBLEMATIKE, CILJEV IN HIPOTEZ Reaktivne kisikove zvrsti (ROS) so kemijsko reaktivne zvrsti (superoksidni anion, vodikov peroksid, hidroksilni radikal, singletni kisik), ki imajo sposobnost, da s svojim delovanjem škodujejo vitalnim celičnim komponentam, vključno z lipidi, proteini in DNK, kar lahko povzroča številne bolezni. Naravni antioksidanti (fenolne spojine, vitamini in karotenoidi) so učinkoviti pri preprečevanju bolezni, povezanih z oksidativnim stresom (Van Hung, 2016). Predvideva se, da fenolne spojine z ohranjanjem ravnovesja med oksidanti in antioksidanti igrajo pomembno vlogo v boju proti oksidativnemu stresu v človeškem telesu (Babbar in sod., 2014). Antioksidanti delujejo na različne načine, kot reducenti, lovilci prostih radikalov in/ali kot kelatorji kovin. Na dva različna prosta radikala se lahko isti antioksidant različno odzove (Prior in sod., 2005). Fenolne spojine lahko reagirajo z radikali po dveh glavnih mehanizmih, in sicer preko prenosa vodikovega atoma, kjer fenolna spojina odda vodikov atom radikalu, pri tem se cepi vez med kisikom in vodikom v hidroksilni skupini fenolne spojine, posledično nastane fenolni radikal. Lahko pa fenolne spojine reagirajo z radikali preko prenosa elektrona, kjer fenoksidni anion, ki nastane pri deprotonaciji hidroksilne skupine fenolne spojine, odda elektron (Huang in sod., 2005). Fenolne spojine so spojine z vsaj enim aromatskim obročem, na katerega je vezana ena ali več hidroksilnih skupin. Običajno se fenolne spojine delijo na fenolne kisline (C6-C1 in C6-C3), flavonoide (C6-C3-C6), kumarine (C6-C3), tanine (hidrolizabilni in kondenzirani), stilbene (C6-C2-C6), lignane (C6-C3)2 in lignine (C6-C3)n. Fenolne kisline delimo na hidroksibenzojske kisline (C6-C1): vanilinska, siringična, salicilna, protokatehujska, p- hidroksibenzojska kislina; in hidroksicimetne kisline (C6-C3): p-kumarna, ferulna, kavna, sinapinska kislina, itd. Večje vsebnosti hidroksicimetnih kislin najdemo v različnih semenih, kjer so hkrati tudi prekurzorji za nastanek molekul, kot so stilbeni, halkoni, lignini, lignani, kumarini in flavonoidi (Alam in sod., 2013). Funkcionalne skupine, kot sta hidroksilna in metoksi skupina, narekujejo molekularno strukturo fenolnih spojin, kar vpliva na njihovo bioaktivnost. V žitih so bile določene predvsem vezane oblike p-kumarne, ferulne, protokatehujske, p-hidroksibenzojske in vanilinske kisline (Alves in sod., 2016). Za pirina semena so značilne relativno nizke vrednosti ekstraktibilne siringične, galne, kavne (Gawlik-Dziki in sod., 2012), protokatehujske, sinapinske in ferulne kisline (Starzyńska-Janiszewska in sod., 2019). Vendar pa so vezane fenolne spojine v piri zastopane v bistveno večjih količinah, med katerimi izstopajo p-kumarna, ferulna, p-hidroksibenzojska, kavna (Mencin in sod., 2021a), sinapinska in klorogenska kislina (Gawlik-Dziki in sod., 2012). Poleg fenolnih kislin sodi med fenolne spojine tudi obsežna skupina flavonoidov (C6-C3-C6). Osnovno strukturo flavonoidov sestavljata dva aromatska obroča in med njima heterociklični obroč s kisikovim atomom. Njihova struktura je odvisna od vezave in orientacije različnih funkcionalnih spojin na aromatskem in heterocikličnem obroču. Flavonoidi so lahko prisotni tako v topni prosti kot netopni vezani obliki. Žita so glavni naravni vir vezanih flavonoidov (Shahidi in Yeo, 2016). 2 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Fenolne spojine so sekundarni metaboliti, katerih največja vloga je zaščita rastline pred biotskim in abiotskim stresom (slika 1) (Santos-Sánchez in sod., 2019). Dejavniki, kot so UV sevanje, temperatura, suša, poškodbe lahko vplivajo na sintezo in akumulacijo fenolnih spojin. Poleg abiotskega stresa pa rastlini predstavljajo stres še biotski dejavniki, to so škodljivi organizmi (Liu, 2007). Zaradi funkcij, ki jih imajo fenolne spojine, njihova sinteza in akumulacija poteka v rastlinskih celicah tkiv, ki so bolj izpostavljena biotskemu in abiotskemu stresu (celice povrhnjice). Procesi za nastanek sekundarnih metabolitev se ponavadi začnejo takrat, ko v rastlinskih celicah nastaja premalo primarnih antioksidantov za detoksifikacijo ROS, lahko pa se začnejo tudi zaradi izpolnjevanja fizioloških vlog (privabljanje opraševalcev, očvrstitev celične stene, itn). Rastline se proti abiotskemu stresu borijo z različnimi mehanizmi, delimo jih na encimatske in neencimatske. Encimatski mehanizmi vključujejo antioksidativne encime (superoksid dismutaza, glutation peroksidaza, katalaza, gvajakol peroksidaza, itd.) in encime askorbatno-glutationskega cikla (Caverzan in sod., 2016). Med neencimske antioksidante pa prištevamo askorbinsko kislino, glutation, kot tudi tokoferole, karotenoide in fenolne spojine (Caverzan in sod., 2016). Biosinteza fenolnih spojin lahko poteka po večih poteh, med katerimi je najpomembnejša šikimatna pot, predstavljena na sliki 1, kjer kot produkt pretvorbe šikimske kisline nastaneta dve aromatski aminokislini fenilalanin in tirozin (Shahidi in Yeo, 2016). Aminokislina fenilalanin predstavlja glavni prekurzor sinteze fenilpropanoidov (fenilpropanoidna pot) in fenolnih spojin, ki nastanejo iz njih. Eden najpomembnejših encimov pri biosintezi fenolnih spojin je fenilalanin amonijak liaza (PAL), ki katalizira pretvorbo fenilalanina v trans-cimetno kislino in hkrati predstavlja vezni člen med primarnim in sekundarnim metabolizmom. trans- Cimetna kislina se s hidroksilacijo pretvori v p-kumarno kislino, reakcijo katalizira encim cinamat-4-hidroksilaza (C4H) (Petersen in sod., 2010). p-Kumarna kislina predstavlja prekurzor za hidroksicimetne kisline (kavno, klorogensko, ferulno kislino). Kavna kislina se sintetizira z vezavo hidroksilne skupine na mesto 3, nadalje se ferulna kislina sintetizira z metilacijo kavne kisline. Fenolne kisline nastanejo predvsem z reakcijami deaminiranja, hidroksiliranja in metiliranja (Heleno in sod., 2015). Hidroksicimetne kisline so metabolno bolj ali manj nereaktivne, zato je za nastanek njihovih derivatov potrebno aktivirati karboksilne skupine z encimom p-kumarat-CoA ligaza (C4L). p-Kumarna, ferulna in kavna kislina se smatrajo za dobre substrate omenjenemu encimu (Petersen in sod., 2010). Tvorba benzojske kisline, ki je prekurzor hidroksibenzojskih kislin, je lahko posledica razgradnje – skrajšanja stranske verige cimetne kisline za dva ogljikova atoma (slika 1). Tako kot pri cimetni in p-kumarni kislini, lahko iste reakcije hidroksiliranja in metiliranja potekajo na aromatskem obroču benzojske kisline, pri čemer nastajajo ustrezni derivati (protokatehujska kislina, p-hidroksibenzojska kislina, itd.) (Heleno in sod., 2015). Biosinteza fenolnih spojin je kompleksen proces, ki poteka predvsem na citoplazemski površini endoplazmatskega retikuluma, iz katerega se nastale fenolne kisline transportirajo do vakuole ali do matrice celične stene s pomočjo citoplazemskih veziklov ali transmembranskih prenašalnih proteinov (Shahidi in Yeo, 2016). 3 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 1: Enostaven shematski prikaz biosintezne poti fenolnih kislin, ki izhaja iz šikimske kisline. Encimi: (E1) fenilalanin amonijak liaza, (E2) oksidaza, (E3) benzojska kislina-4-hidroksilaza, (E4) p-hidroksibenzojska kislina-3-hidroksilaza, (E5) protokatehujska kislina-5-hidroksilaza, (E6) protokatehujska kislina-3- O- metiltransferaza, (E7) vanilinska kislina-5-hidroksilaza in vanilinska kislina-5- O-metiltransferaza, (E8) cimetna kislina-4-hidroksilaza, (E9) tirozin amonijak liaza, (E10) p-kumarna kislina-3-hidroksilaza, (E11) kavna kislina-3- O-metiltransferaza, (E12) ferulna kislina-5-hidroksilaza in kavna kislina/5-hidroksiferulna kislina- O-metiltransferaza (povzeto po Heleno in sod., 2015). Na kemijske in biološke lastnosti fenolnih spojin vpliva tako število kot tudi vrsta vezanih skupin. S povečanjem števila hidroksilnih skupin in sladkornih enot narašča topnost fenolnih spojin v vodi, medtem ko metilacija hidroksilnih skupin povzroča padec topnosti. Proste hidroksilne skupine so bolj reaktivne kot glikozilirane in metilirane hidroksilne skupine, kar pomembno vpliva na njihovo antioksidativno aktivnost (Halbwirth, 2010). Piro ( Triticum spelta L.) taksonomsko uvrščamo v družino trav ( Poaceae), rod pšenice ( Triticum) in predstavlja najstarejšo obliko heksaploidne pšenice. Pira izvira iz Bližnjega vzhoda, v Evropi pa so jo gojili predvsem v višje ležečih predelih, saj velja za nezahtevno in prilagodljivo poljščino. Pridelava pire se je v začetku 20. stoletja močno zmanjšala, v zadnjih časih pa postaja pomembna alternativa navadni pšenici in ostalim žitom, zaradi večjega povpraševanja po ekološko pridelani hrani in pozitivnih učinkov na zdravje ljudi (Bojňanská in Frančáková, 2011). Prednosti pire so nizki stroški pridelave, primerna je za gojenje brez pesticidov, saj ima dobro odpornost proti boleznim in škodljivcem, raste tudi v težkih pridelovalnih razmerah, vendar pa je hektarski pridelek nižji kot pri pšenici. Pira v primerjavi s pšenico vsebuje več beljakovin (Pruska-Kedzior in sod., 2008), prostih sladkorjev (Zörb in sod., 2007), maščobnih kislin in lipidov (Ruibal-Mendieta in sod., 2005). Pri vsebnosti bioaktivnih spojin nekateri avtorji navajajo, da večjih razlik med piro in pšenico ni mogoče opaziti (Bonafaccia in sod., 2000), medtem ko drugi avtorji pripisujejo pirini moki večjo vsebnost antioksidantov kot navadni pšenični moki (Wang in sod., 2020). Bioaktivne spojine se v žitnih zrnih večinoma nahajajo v zunanjih plasteh zrna, zato med 4 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 bolj zdrave živilske izdelke sodijo polnozrnati izdelki. V žitnih semenih so najpogostejše bioaktivne spojine: prehranske vlakinine (β-glukani, arabinoksilani, rezistentni škrob), fenolne spojine (fenolne kisline, flavonoidi), antociani, karotenoidi, izoflavoni, steroli, fitati, itd. (Gani in sod., 2012). Fenolne spojine žitnih semen glede na način ekstrakcije delimo na ekstraktibilne, ki jih lahko ekstrahiramo z mešanico vodnega in organskega topila, in vezane, ki med ekstrakcijo ostanejo v celičnih stenah, njihova sprostitev iz matrice pa je mogoča s kislinsko ali alkalno hidrolizo. Tako kislinska kot alkalna hidroliza nista specifični in lahko privedeta do strukturnih sprememb fenolnih spojin, zato težko sklepamo, kakšna je bila izhodna struktura spojin v vzorcu. Bolj specifična in učinkovita metoda je encimska hidroliza, kjer z uporabo različnih encimov (hidrolaz) cepimo glikozidne vezi in razgradimo celično steno (Carboni Martins in sod., 2022). Obe obliki fenolnih spojin (ekstraktibilno in vezano) je potrebno upoštevati, če želimo dobiti čim bolj reprezentativne in pravilne rezultate (Madhujith in Shahidi, 2009). Fenolne spojine se v rastlinski celici nahajajo v topni obliki, kamor spadajo proste in konjugirane fenolne spojine, ter v netopni vezani obliki. Proste fenolne spojine so v nevezani obliki, konjugirane pa so vezane na topne molekule z majhno molekulsko maso (sladkorji, maščobne kisline), običajno pride med njimi do tvorbe kovalentnih vezi, lahko pa tudi do nekovalentnih vezi, vodikovih vezi ali hidrofobnih interakcij med različnimi molekulami. Večina topnih fenolnih spojin se nahaja v vakuolah rastlinskih celic (Shahidi in Yeo, 2016; Xu in sod., 2020). Polisaharidi, ki spadajo med topne prehranske vlaknine, predstavljajo sterično oviro, ki lahko zaščiti fenolne spojine pred oksidacijo. Topni polisaharidi, naj bi po mnenju nekaterih raziskovalcev imeli sposobnost, da iz svojega aktiviranega reducirajočega konca donirajo vodik oksidiranim fenolnim spojinam in tako sinergistično izboljšajo antioksidativno aktivnost slednjih (López-Perea in sod., 2019; Xu in sod., 2020). Proste in konjugirane fenolne spojine tako uvrščamo med ekstraktibilne fenolne spojine, netopne vezane fenolne spojine pa med neekstraktibilne (Xu in sod., 2020). Količinsko najbolj zastopana oblika pa so netopne vezane fenolne spojine (slika 2). Karboksilna skupina fenolnih kislin (benzojske in cimetne kisline) lahko tvori estrske vezi s hidroksilno skupino komponent celične stene (strukturni ogljikovi hidrati, proteini). Med hidroksilnimi skupinami fenolnih spojin in komponentami celične stene (lignin) se lahko tvorijo etrske vezi (Acosta-Estrada in sod., 2014). Nadalje se lahko med ogljikovim atomom fenolnih spojin in ogljikovim atomom komponent celičnih sten tvorijo tudi C-C vezi (C-glikozidi) ali pa fenolne spojine sodelujejo pri tvorbi vodikovih in elektrostatskih vezi (Shahidi in Yeo, 2016). Vzpostavljene kovalentne vezi med fenolnimi spojinami in komponentami celične stene imajo pomembno vlogo pri krepitvi rigidne strukture matrice celične stene. Prav tako vezane fenolne spojine ščitijo pred vdorom številnih patogenih mikroorganizmov, s trpkostjo odvračajo insekte in ostale živali ter ščitijo pred UV-poškodbami (Shahidi in Yeo, 2016). 5 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 2: Poenostavljena predstavitev zamreženja med strukturnimi komponentami rastlinske celične stene in fenolnimi spojinami. Prikaz kovalentnih vezi: etrske vezi med fenolnimi spojinami in ligninom; estrske vezi med fenolnimi spojinami in strukturnimi ogljikovimi hidrati, proteini (povzeto po Acosta-Estrada in sod., 2014). Različne raziskave so v žitih potrdile prevlado vezane oblike fenolnih spojin nad ekstraktibilno obliko. Vezane fenolne spojine predstavljajo glede na skupno količino fenolnih spojin: 92 % v piri (Mencin in sod., 2022a), 69 % v koruzi (Van Hung, 2016), 75 % v pšenici in ovsu, 74 % v rižu (Adom in Liu, 2002), v ječmenu pa med 73 % in 82 %, odvisno od sorte (Madhujith in Shahidi, 2009). Vezane fenolne spojine se nahajajo v otrobih žitnih semen, zato je pomembno poudariti, da uživanje žitnih izdelkov pripomore k večjemu vnosu fenolnih spojin le pri uživanju polnozrnatih izdelkov. Nadalje so Wang in sod. (2020) ugotovili, da polnozrnata pšenična moka vsebuje 2-5-krat večjo vsebnost antioksidantov kot bela pšenična moka. Ferulna kislina je najbolj pogosta hidroksicimetna kislina v rastlinskem svetu, hkrati je tudi prevladujoča fenolna kislina v žitnih zrnih (Boz, 2016; Coghe in sod., 2004; Gani in sod., 2012). Ferulna kislina obstaja v prosti, konjugirani in vezani obliki (Fazary in Ju, 2007). Na splošno je ferulna kislina nakopičena v zunanjem sloju žitnih semen (otrobi), najmanjšo vsebnost ferulne kisline pa so določili v endospermu (Ndolo in sod., 2013). Znano je, da se delež proste ferulne kisline v žitnih zrnih giblje od 0,2 do 0,5 %, večina pa je vezane na komponentne celične stene. Pšenični otrobi vsebujejo približno 0,8–2 g ferulne kisline/kg suhe snovi (SS), kar predstavlja 90 % vseh fenolnih spojin v pšenici (Oghbaei in Prakash, 2016). Podoben trend smo opazili tudi pri piri, kjer je ferulna kislina predstavljala 92 % vseh identificiranih fenolnih kislin (Mencin in sod., 2022a). V naši raziskavi (Mencin in sod., 2022a) smo poročali, da neobdelana pirina semena vsebujejo 0,74 g skupne ferulne kisline/kg SS, od tega 99 % v vezani obliki. Do podobnih rezultatov so prišli tudi Gawlik-Dziki in sod. (2012), saj so ugotovili, da pirina semena vsebujejo 0,2–0,8 g skupne ferulne 6 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 kisline/kg SS, od tega 84–99 % vezane oblike. Ferulna kislina se lahko z etrskimi vezmi veže z ligninom in z estrskimi vezmi s polisaharidi in strukturnimi proteini in tako deluje kot povezovalec med polimeri celične stene (de Oliveira Silva in sod., 2015). Nadalje je možen nastanek dimera ferulnih kislin dveh sosednjih arabinoksilanov, ki prispeva k zamreženosti in tako ovira delovanje hidrolaz, kar posledično zmanjša učinkovitost encimske razgradnje in prebavljivosti polisaharidov celične stene. Zamreženost komponent celične stene s ferulno kislino in njenimi dimeri vpliva na lastnosti celične stene, kot so adherenca, raztegljivost, dostopnost in biološka razgradljivost (de Oliveira Silva in sod., 2015). Struktura matrice otrobov in način, kako so fenolne spojine vključene v matrico, močno vplivata na njihovo biološko dostopnost. Zato so se razvile različne tehnologije, s katerimi olajšamo cepitev vezi, povečamo količino sproščenih vezanih fenolnih spojin in posledično izboljšamo njihovo biološko dostopnost (Wang in sod., 2014). Biotehnološki procesi, kamor spadajo kaljenje, fermentacija in encimska obdelava, trenutno predstavljajo eno izmed najbolj aktualnih tem s področja izboljšanja dostopnosti in razpoložljivosti fenolnih spojin. Kaljenje predstavlja ekonomično in učinkovito naravno metodo, ki zmehča strukturo in izboljša prehransko vrednost semena - poveča se vsebnost bioaktivnih spojin, hkrati pa se zmanjša vsebnost antinutritivnih komponent (Singh in Sharma, 2017). Kaljenje poveča aktivnost hidrolitičnih encimov (amilaz, proteaz, itd.), spodbudi nastanek novih in aktivacijo tistih, ki so v nekaljenem semenu v neaktivnem stanju. V začetni fazi kaljenja pride do razgradnje makrohranil (ogljikovih hidratov, proteinov, lipidov), kar poveča količino njihovih presnovnih produktov (enostavnih sladkorjev, prostih aminokislin, organskih kislin), istočasno pa se sproži sinteza sekundarnih metabolitov. Z razgradnjo makrohranil se posledično sproščajo tudi vezane fenolne spojine, kar v začetni fazi kaljenja pomeni upad vezane frakcije in porast proste (Terpinc, 2019). Na omenjene spremembe lahko dodatno vpliva abiotski stres med kaljenjem. Rastline se na stresne pogoje odzivajo tako, da inducirajo sintezo različnih zaščitnih spojin, tudi številnih fenolnih spojin, ki omogočajo preživetje in nadaljnjo rast v takšnih pogojih (AL-Quraan in sod., 2013; Chen in sod., 2019; Falcinelli in sod., 2017; Ma in sod., 2019; Randhir in sod., 2004). Različne raziskave so pokazale, da je količina fenolnih spojin in razmerje med ekstraktibilnimi in vezanimi fenolnimi spojinami odvisno od obdelave semen pred kaljenjem - pogojev namakanja (Xu in sod., 2009; Yang, 2001) in od pogojev, v katerih seme kali: temperature (Chavarín-Martínez in sod., 2019; Mencin in sod., 2021a; Paucar-Menacho in sod., 2017), časa kaljenja (Kim in sod., 2018; Paucar-Menacho in sod., 2017; Terpinc in sod., 2016), načina osvetljevanja (Xiang in sod., 2017), relativne vlage (Yang, 2001). Drugi segment povečanja biološke dostopnosti in razpoložljivosti bioaktivnih spojin predstavljajo različni tipi fermentacije (alkoholna, mlečnokislinska, spontana, itd.) (Angelino in sod., 2017). Prednost tega procesa je, da poleg encimov iz žit sodelujejo tudi encimi mikroorganizmov, ki pripomorejo k razgradnji celične stene. Prav tako pa 7 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 fermentacija spodbuja sintezo novih spojin kot tudi encimsko transformacijo že prisotnih bioaktivnih spojin. Dosedanje študije o vplivu fermentacije na vezane fenolne spojine v različnih žitih so potrdile povečanje njihove biološke dostopnosti in razpoložljivosti (Wang in sod., 2014). Moore in sod. (2006) so potrdili, da obdelava s kvasovkami ( Saccharomyces cerevisiae) znatno poveča skupno vsebnost prostih fenolnih spojin in antioksidativno aktivnost pšeničnih otrobov. Avtorji študije so izpostavili različno zmožnost kvasovk za presnavljanje posameznih fenolnih spojin. Do podobnih ugotovitev so pri fermentaciji ječmena in ovsa s probiotičnimi bakterijami prišli tudi Hole in sod. (2012), kjer se je znatno povečala vsebnost prostih fenolnih kislin. Spaggiari in sod. (2020) so v fermentiranih pšeničnih otrobih ugotovili relativno veliko vsebnost kavne kisline, kar nakazuje na metabolno aktivnost mikroorganizmov. Že Žilić in sod. (2015) so v svoji študiji na pšenici izpostavili, da lahko bakterije Lactobacillus spp. proizvajajo kavno kislino iz klorogenske kisline. Vpliv fermentacije na fenolne spojine je v glavnem odvisen od vrste semen (Đorđević in sod., 2010), vrste mikroorganizmov (Đorđević in sod., 2010; Katina in sod., 2007b; Mencin in sod., 2022a) in pogojev fermentacije (temperatura, pH, čas) (Boskov Hansen in sod., 2002; Katina in sod., 2007b). Fermentacija z mlečnokislinskimi bakterijami (MKB) povzroči znižanje pH vrednosti, nižja pH vrednost pa spodbudi aktivnost hidrolaz in tako prispeva k razpadu arabinoksilanov in k hidrolizi estrov in glikozidov fenolnih spojin (Gänzle, 2014). Naslednja učinkovita metoda za sproščanje vezanih fenolnih spojin iz komponent celične stene je encimska obdelava. Pri encimski obdelavi semena in otrobe obdelamo neposredno s hidrolitičnimi encimi, s čimer izboljšamo biološko dostopnost in razpoložljivost fenolnih spojin. Encimi, ki hidrolizirajo celično steno (celulaze, ksilanaze, esteraze itd.), so bili že večkrat uporabljeni za razgradnjo matrice žitnih otrobov (Acosta-Estrada in sod., 2014; Bei in sod., 2018; Mencin in sod., 2022b; Moore in sod., 2006; Sørensen in sod., 2003). Feruloil esteraze spadajo v skupino esteraz, ki hidrolizirajo estrsko vez med hidroksicimetnimi kislinami (npr. ferulno kislino) in hemicelulozo, prisotno v celični steni rastlin. Prav tako je feruloil esteraza sposobna katalizirati cepitev kovalentne vezi med dvema ferulnima kislinama, ki sta pritrjeni na sosednja arabinoksilana. Encim postane aktiven tudi med kaljenjem, njegova aktivnost pa med kaljenjem počasi pada. Prisotnost encima so našli tudi pri laktobacilih, prisotnih v našem črevesju (Faulds in sod., 2004; Gänzle, 2014). Znanstveni viri (Mathew in Abraham, 2004; Moore in sod., 2006; Sancho in sod., 2001; Sørensen in sod., 2003) opisujejo sinergistične interakcije med ksilanazo, ki katalizira razgradnjo polisaharidov v fragmente z nižjo molekulsko maso, in med feruloil esterazo, ki sprošča fenolne spojine, pri čemer slednja olajša dostopnost ksilanaze do komponent celične stene. V povezavi z razgradnjo celične stene se omenjajo tudi α-amilaze in proteaze. Proteini v pirinih otrobih predstavljajo okoli 15–17 %, zato ne preseneča, da je bila proteaza del teh raziskav (Singh in sod., 2016). Ker lahko med karboksilnimi in hidroksilnimi skupinami fenolnih kislin in škrobom ali drugimi polisaharidi pride do tvorbe vodikovih vezi, kovalentnih vezi ali kelacije, lahko hidroliza škroba in polisaharidov z uporabo α-amilaze 8 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 sprosti pomemben del fenolnih spojin. Uporaba omenjenega encima je smotrna, ko so v vzorcu prisotni otrobi žitnih semen, ki vsebujejo veliko fenolnih spojin. Endosperm, ki je sestavljen predvsem iz škrobnih zrnc, vsebuje relativno malo fenolnih spojin, zato razgradnja škroba z α-amilazami sprosti malo fenolnih spojin (Yu in sod., 2001). Za encimsko obdelavo velja, da je okolju prijazna, energetsko učinkovita in sprošča le specifične spojine, ne da bi poškodovala ostale spojine (Ferri in sod., 2020). Narejenih je bilo tudi nekaj študij na področju kombiniranja fermentacije in kaljenja ter fermentacije in encimske obdelave različnih žit. Kaljenje prispeva k večji količini fermentacijskih virov (sladkor/dušik), hkrati pa kaljenje, fermentacija, dodatek ustreznih encimov pripomorejo k večji koncentraciji in aktivnosti hidrolitičnih encimov. Literaturni viri kažejo na sinergističen učinek pri sočasni uporabi različnih biotehnoloških procesov. Katina in sod. (2007b) so poročali, da je fermentacija kaljenih rženih semen z uporabo kvasovke S. cerevisiae znatno povečala vsebnost skupnih fenolnih spojin v primerjavi z zgolj kaljenimi semeni. Raziskava, ki so jo naredili Montemurro in sod. (2019), je pokazala, da fermentacija kaljenih zrn pšenice, ječmena in kvinoje s kislim testom ne vpliva zgolj na povečanje fenolnih spojin, ampak tudi na povečanje vsebnosti peptidov, prostih aminokislin, γ-aminomaslene kisline ter zmanjša koncentracijo fitinske kisline, kondenziranih taninov, rafinoze in inhibitorjev tripsina. V drugi raziskavi so Anson in sod. (2009) raziskovali vpliv kombiniranja kvasne fermentacije in obdelave s hidrolitičnimi encimi na biološko dostopnost fenolnih spojin iz pšeničnih otrobov. Ugotovili so, da je bila vsebnost prostih fenolnih kislin v pšeničnih otrobih večja za 1,6-krat, kot če so jih podvrgli zgolj fermentaciji. Razlago za tako izboljšavo so pripisali hidrolitičnim encimom, ki omogočajo hidrolizo različnih polimerov, kar privede do povečane razgradnje celične stene. Zaradi omenjenega razloga so obdelani pšenični otrobi pokazali znatno izboljšanje biološke dostopnosti in/ali razpoložljivosti fenolnih spojin, določenih z in vitro testi (Anson in sod., 2009) in s kliničnimi študijami (Anson in sod., 2011). Uživanje bioaktivnih komponent je ključno predvsem zaradi njihovih pozitivnih učinkov na naše zdravje. Preden lahko posamezni spojini pripišemo pozitivno delovanje, je potrebno poznati njeno biološko dostopnost in razpoložljivost v človeškem organizmu. V kolikšnem obsegu bodo spojine učinkovite v našem telesu, je odvisno od vrste in količine zaužite snovi, njihove zmožnosti sprostitve iz hrane, sprememb, ki se zgodijo med prebavo, metabolizma in prenosa snovi po krvnem obtoku. Biološka dostopnost (ang. bioaccessibility) je definirana kot količina snovi, ki se lahko sprosti iz matrice hrane v prebavni trakt in je na voljo za absorpcijo v tankem črevesu. Biološka razpoložljivost (ang. bioavailability) pa je definirana kot količina snovi, ki se je prebavila in je sposobna prehajati skozi črevesni epitelij in sčasoma doseči tarčno tkivo, kjer izvaja svoje biološke aktivnosti. Proces biološke razpoložljivosti je sestavljen iz biološke dostopnosti in aktivnosti. Biološka aktivnost je proces, ko bioaktivne spojine dosežejo krvno-žilni obtok, preko katerega se transportirajo do tarčnih tkiv, kjer potekajo interakcije z ostalimi molekulami (Cilla in sod., 2018). 9 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Razgradnja hrane, ki je ključna za biološko dostopnost in razpoložljivost, se prične v ustih, nadaljuje pa se v želodcu in v črevesu. Kako učinkovit bo proces prebave, je odvisno od različnih dejavnikov: sestave in količine matrice, sinergizma oz. antagonizma snovi v njem, od fizikalno-kemijskih parametrov, kot so pH, temperatura in tekstura matrice. Biološka dostopnost neke spojine se lahko močno razlikuje od njene biološke razpoložljivosti, saj prevladujoča bioaktivna komponenta v zaužitem živilu ni nujno tudi najbolj zastopan metabolit v tarčnem tkivu (Liu, 2007). Poznavanje bioloških učinkov bioaktivnih spojin v človeškem organizmu je še vedno precej okrnjeno (Heleno in sod., 2015). Približno 5–10 % celotnega prehranskega vnosa fenolnih spojin se lahko absorbira v tankem črevesu (Vitaglione in sod., 2008). Sproščene topne fenolne spojine so v tankem črevesu podrvržene konjugaciji, ki povzroči spremembe v njihovi strukturi. Reakcije glukuronidacije, metilacije ali sulfatacije privedejo do nastanka različnih derivatov fenolnih spojin. Strukturne spremembe, ki nastanejo, lahko izboljšajo ali zmanjšajo biološko aktivnost zaužitih fenolnih spojin (Heleno in sod., 2015). Vezane fenolne spojine niso dostopne encimom gastrointestinalnega (GI) trakta. Več kot 90 % fenolnih spojin v žitnih semenih ima tako nizko biološko dostopnost (Vitaglione in sod., 2008). Neabsorbirane fenolne spojine se transportirajo v debelo črevo, kjer njihovo razgradnjo deloma katalizirajo encimi črevesne mikrobiote, zlasti ksilanaze in esteraze. Številne raziskave, ki se ukvarjajo z biološko učinkovitostjo fenolnih spojin, spregledajo vprašanje njihove dostopne koncentracije in presnovne oblike, v kateri fenolne spojine vstopajo v krvni obtok. Za določanje biološke dostopnosti se najpogosteje uporabljajo in vitro prebavni modeli, s katerimi posnemamo prebavo v ustih, želodcu in tankem črevesu, včasih pa tudi prebavo v debelem črevesu (fermentacijo) (Rocchetti in sod., 2018). In vitro statični prebavni modeli so razmeroma poceni in preprosti za uporabo, so hitri in nimajo etičnih omejitev, pogoje prebave je mogoče nadzorovati, vzorčenje je preprosto in rezultati so ponovljivi. Bili so že uporabljeni za posnemanje fiziološkega sproščanja fenolnih spojin iz nekaterih žit in žitnih izdelkov (Gawlik-Dziki in sod., 2009; Mencin in sod., 2022c; Saura-Calixto in sod., 2007). Te raziskave so pokazale, da se fenolne spojine lahko sprostijo iz matrice hrane med simulirano in vitro GI prebavo, zaradi česar postanejo biološko dostopne. V ustnem delu prebave se doda encim α-amilazo pri pH 7, prebava v ustih ponavadi traja okoli 2 min, sledi želodčna faza prebave, kjer se doda encim pepsin, hrana je izpostavljena pH 2 za 2 h, na koncu sledi še simulacija pogojev tankega črevesa, kjer se pH dvigne nazaj na 7, doda se pankreatin in žolčne soli (Brodkorb in sod., 2019; Minekus in sod., 2014). Na ta način se določi biološka dostopnost določene snovi, ki se lahko absorbira, vendar pa te raziskave ne prikažejo, koliko snovi dejansko vstopi v naš krvni obtok. Biološko razpoložljivost se nadalje lahko določi z in vivo poskusi na živalih ali ljudeh, kjer pa je potrebno pridobiti dovoljenje etične komisije. Biološka razpoložljivost je najbolj odvisna od same strukture bioaktivne snovi, saj se fenolne spojine najpogosteje nahajajo v glikozilirani obliki kot estri oz. polimeri, ki se morajo najprej hidrolizirati na mono- in dimere, da se lahko absorbirajo skozi celice tankega črevesa. Med prebavo pa lahko fenolne spojine pridejo v stik tudi z 10 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 drugimi snovmi, kot so ogljikovi hidrati, proteini, lipidi in vlaknine. Fenolne spojine se lahko povežejo tudi s prehranskimi vlakninami, kar pa preprečuje stik encimov s substratom in posledično fenolne spojine prehajajo v vezani, nerazgrajeni obliki do debelega črevesa. Nadalje so črevesni mikroorganizmi sposobni pretvoriti nekatere fenolne spojine v aktivnejše spojine, ki se lažje absorbirajo (Călinoiu in Vodnar, 2018; Gong in sod., 2018). Metabolizem fenolnih spojin s strani MKB je povezan z delovanjem dekarboksilaz, ki omogočajo dekarboksiliranje hidroksibenzojskih ali hidroksicimetnih kislin in nastanek ustreznih 4-vinil derivatov, in z delovanjem reduktaz, ki hidrogenirajo dvojne vezi. Različni sevi lahko omogočijo nastanek različnih metabolitev iz istega substrata (Călinoiu in Vodnar, 2018). Potrebno je poudariti, da absorpcija fenolnih spojin še vedno ni povsem pojasnjena, zato je potreba po raziskavah na tem področju velika. Fenolne spojine zaradi svoje strukture izražajo antioksidativno aktivnost. Prostim radikalom oddajo elektron ali vodikov atom in jih na ta način stabilizirajo (Terpinc in Abramovič, 2010). Novejše raziskave ugotavljajo, da imajo fenolne spojine pozitiven vpliv na sestavo črevesne mikrobiote, kar ima velik pomen za pravilno delovanje prebave in imunskega sistema, hkrati pa zavirajo rast patogenih mikroorganizmov (Espín in sod., 2017). Različne študije poročajo, da imajo hidroksicimetne kisline antioksidativne in protivnetne lastnosti ter sposobnost zaviranja razvoja različnih kroničnih bolezni (Alam in sod., 2013). Kot že omenjeno, je ferulna kislina po kvantiteti gotovo najpomembnejši antioksidant iz pire, številne raziskave pa so podkrepile tudi njeno učinkovitost. Antioksidativna aktivnost ferulne kisline je močno povezana s hidroksilno skupino, ki je vezana nanjo, saj je ta, preko mehanizma lovljenja radikalov, sposobna ustaviti verižno reakcijo oksidacije (de Oliveira Silva in Batista, 2017; Nenadis in Tsimidou, 2002; Shahidi in Chandrasekara, 2010). Drug zanimiv antioksidativni mehanizem ferulne kisline je, da deluje tudi kot UV absorber (de Oliveira Silva in Batista, 2017). Ferulna kislina ima veliko sposobnost lovljenja prostih radikalov, ki sicer povzročijo oksidativne poškodbe celične membrane in DNK. Pripisujejo ji tudi zmanjšanje tveganja za nastanek kroničnih bolezni, kot so diabetes, srčno-žilne bolezni, rak (Boz, 2016), hkrati naj bi ferulna kislina delovala protimikrobno in protivnetno (de Oliveira Silva in Batista, 2017). Prav tako pa na naše zdravje pozitivno vplivajo tudi presnovni produkti fenolnih spojin. Terpinc in sod. (2011) so v svoji raziskavi ugotovili, da se je presnovni produkt ferulne kisline, 4-vinil gvajakol, izkazal kot uspešnejši antioksidant pri lovljenju alkilperoksilnega radikala v emulziji od ferulne kisline. Glede na različne študije, kjer so z in vitro testi ugotavljali antioksidativno aktivnost, so ugotovili, da vezane fenolne spojine izkazujejo znatno večjo antioksidativno aktivnost v primerjavi s prosto in konjugirano obliko (Acosta-Estrada in sod., 2014; Chen in sod., 2017; Pang in sod., 2018). V in vivo raziskavi, ki so jo naredili Costabile in sod. (2008) na 32 zdravih prostovoljcih, starih med 20 in 42 let, so ugotovili, da uživanje polnozrnate pšenice prispeva k povečani koncentraciji ferulne kisline v krvi, hkrati pa so ugotovili, da so pripravki za zajtrk iz polnozrnate pšenice pozitivno vplivali na črevesno mikrobioto, saj se je povečala populacija bifidobakterij in MKB. 11 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1.1 NAMEN DELA V okviru raziskave smo želeli ugotoviti vpliv različnih biotehnoloških procesov na sproščanje vezanih fenolnih spojin iz pirinih semen in posledično na njihovo vsebnost, dostopnost in in vitro ter in vivo antioksidativno aktivnost . Glavni poudarek je bil na povečanju vsebnosti zdravju koristnih bioaktivnih spojin, predvsem hidroksicimetnih in hidroksibenzojskih kislin, ki so v žitnih semenih najbolj zastopane. Želeli smo preveriti možnost uporabe posameznih biotehnoloških procesov ali kombinacije le-teh z namenom izboljšanja biološke dostopnosti fenolnih spojin v pirinih semenih. Tako obdelana semena bi nadalje lahko dodajali v živila, kot so kruh in drugi pekovski izdelki, saj bi z zauživanjem teh izdelkov povečali vnos antioksidantov in posledično pozitivno vplivali na zdravje ljudi. Kar nekaj raziskav je bilo že narejenih na področju vpliva posameznih biotehnoloških procesov na sproščanje vezanih fenolnih spojin iz drugih žitaric, medtem ko so podatki za piro skopi. Kombiniranje različnih biotehnoloških procesov med seboj in njihov vpliv, ne samo na in vitro antioksidativno aktivnost, ampak tudi na antioksidativno aktivnost v živi kvasni celici, ki nam da vpogled v in vivo okolje, do sedaj še ni bilo podrobno raziskano in je v literaturi samo omenjeno. Z optimiziranjem biotehnoloških procesov lahko povečamo sproščanje vezanih fenolnih spojin iz celične stene, zato smo si zadali naslednje cilje:  preučiti vpliv abiotskega stresa (temperatura, voda, svetloba, mehanska poškodba, raztopina NaCl in raztopina sorbitola) med kaljenjem pirinih semen na razmerje med vsebnostjo ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin in na njihovo antioksidativno aktivnost;  preveriti vpliv posameznih mikroorganizmov (kvasovke S. cerevisiae, MKB L. plantarum, avtohtona mikrobiota) na učinek fermentacije pirinih semen za sprostitev fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost;  raziskati, kakšen vpliv (sinergističen, antagonističen) ima kombiniranje postopkov kaljenja in fermentacije oz. kaljenja in encimske obdelave pirinih semen na sprostitev fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost;  na modelnem organizmu kvasovke S. cerevisiae preučiti vpliv ekstraktov iz pirinih semen na celični privzem posameznih fenolnih spojin;  z in vitro oralno, gastro in intestinalno prebavo ugotoviti dostopnost fenolnih spojin. Raziskava predstavlja velik doprinos tako za znanost kot tudi za tehnologijo in proizvodnjo izdelave funkcionalnih živil, ki bi vsebovala biološko obdelana semena pire z izboljšano biološko dostopnostjo fenolnih spojin. Poskus 1: Vpliv različnih pogojev abiotskega stresa med kaljenjem pirinih semen na vsebnost ekstraktibilnih in vezanih skupnih in individualnih fenolnih spojin ter na njihovo antioksidativno aktivnost 12 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Dosedanja literatura poroča, da kaljenje povzroča povečano aktivnost hidrolitičnih encimov, posledično pride do razgradnje makrohranil, istočasno pa se sproži sinteza sekundarnih metabolitov. Na obseg opisanih sprememb lahko vplivamo z aplikacijo abiotskega stresa, saj se rastline na stresne pogoje odzivajo tako, da inducirajo sintezo različnih zaščitnih spojin, tudi številnih fenolnih spojin. Za kaljenje pod različnimi stresnimi pogoji smo izbrali oluščena pirina semena sorte Ostro. Cilj raziskave je bil preučiti, kateri pogoji abiotskega stresa najbolje vplivajo na povečanje vsebnosti fenolnih spojin in njihove antioksidativne aktivnosti med kaljenjem, zato smo za kontrolo namesto nekaljenih semen izbrali semena, kaljena pri optimalnih pogojih. S predposkusi smo ugotovljali pogoje za čim večji prirast fenolnih spojin. Po koncu kaljenja smo pirinim semenom določili ekstraktibilne in vezane skupne fenolne spojine (TPC), fenolni profil s HPLC-MS/MS metodo ter in vitro in in vivo antioksidativno aktivnost. Pri tem poskusu smo dali poudarek na interakcijo pirinih antioksidantov z različnimi prostimi radikali (DPPH•, ABTS•+, O •- 2 , ROO•), kot tudi njihovi reaktivnosti v homogenem in heterogenem mediju, zato smo uporabili štiri različne in vitro antioksidativne teste. Rezultate smo obdelali z multivariatno analizo. Poskus 2: Vpliv različnih tipov fermentacije na sprostitev fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost v neobdelanih, kaljenih in encimsko obdelanih pirinih semenih Dosedanje študije o vplivu fermentacije na vezane fenolne spojine v različnih žitih so potrdile povečanje biološke dostopnosti fenolnih spojin, saj so med postopkom fermentacije vključeni tako encimi iz žitnih semen kot tudi mikroorganizmov. Vpliv fermentacije na fenolne spojine je v glavnem odvisen od vrste mikroorganizmov (MKB, kvasovke, avtohtona mikrobiota) in pogojev fermentacije (temperatura, pH, čas), zato smo te parametre v predposkusih optimizirali. Fermentacija je potekala na neobdelanih (semena, ki niso bila obdelana z nobenim biotehnološkim procesom), kaljenih in encimsko obdelanih pirinih semenih sorte Ostro. Cilj poskusa je bil ugotoviti učinek različnih tipov fermentacije pirinih semen na sprostitev fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost ter nadalje raziskati, kakšen vpliv ima kombiniranje postopkov kaljenja in fermentacije oz. encimske obdelave in fermentacije pirinih semen na sprostitev fenolnih spojin. Določili smo ekstraktibilne in vezane TPC, fenolni profil s HPLC-MS/MS metodo ter in vitro in in vivo antioksidativno aktivnost. Rezultate smo obdelali z multivariatno analizo. Poskus 3: Vpliv encimske obdelave na sprostitev fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost v neobdelanih, kaljenih in fermentiranih pirinih semenih Pri encimski obdelavi semena obdelamo neposredno s hidrolitičnimi encimi. Encimski pristop k razgradnji osnovnih elementov celične stene se je pokazal kot učinkovit z uporabo ksilanaz, β-glukanaz in celulaz v kombinaciji s feruloil esterazami. S poskusom smo preverili, kako različne kombinacije encimov vplivajo na sproščanje vezanih fenolnih spojin iz celične stene pirinih semen ter ali kombiniranje omenjenih biotehnoloških procesov vpliva sinergistično ali antagonistično na vsebnost fenolnih spojin in na njihovo antioksidativno aktivnost. Pirina semena smo obdelali s petimi različnimi encimi: s celulazami, ksilanazami, 13 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 feruloil esterazami, proteazami in α-amilazami. Čas, razmerje med vzorcem in pufrom in aktivnost posameznih encimov smo določili na podlagi predposkusov. Po 4 h encimske obdelave pirinih semen smo vzorce liofilizirali in ekstrahirali ter jim določili ekstraktibilne in vezane TPC, fenolni profil s HPLC-MS/MS metodo ter in vitro in in vivo antioksidativno aktivnost. Rezultate smo obdelali z multivariatno analizo. Poskus 4: Vpliv biološke obdelave pirinih semen na biološko dostopnost fenolnih spojin sproščenih med in vitro prebavo Z metodo in vitro prebave poskušamo predvideti biološko dostopnost fenolnih spojin, tako da posnemamo in vivo fiziološke pogoje, z upoštevanjem prisotnosti in koncentracije prebavnih encimov in soli, pH vrednosti, časa in temperature prebave. Vzorce, ki so bili izpostavljeni GI prebavi, smo izbrali na podlagi naših treh predhodnih raziskav, kjer smo ugotavljali, s katerimi biotehnološkimi procesi in njihovimi kombinacijami najbolj povečamo vsebnost fenolnih spojin iz semen pire. Simulacija prebave je vključevala oralno (2 min), gastro (2 h) in intestinalno (2 h) fazo. Po končani prebavi je supernatant (ekstraktibilne fenolne spojine) predstavljal biološko dostopne fenolne spojine, medtem ko je hidrolizat (vezane fenolne spojine) predstavljal biološko nedostopne, ampak stabilne fenolne spojine. Prebavljenim vzorcem smo določili vsebnost ekstrabilnih in vezanih TPC, fenolni profil s HPLC-MS/MS metodo ter in vitro antioksidativno aktivnost, izračunali smo tudi odstotek biološko dostopnih in stabilnih fenolnih spojin v posameznem vzorcu. Določali smo korelacijo med neprebavljenimi in prebavljenimi ekstraktibilnimi fenolnimi spojinami ter korelacijo med deležem ekstraktibilnih fenolnih spojin in njihovo biološko dostopnostjo. Rezultate smo obdelali z multivariatno analizo. 1.2 RAZISKOVALNE HIPOTEZE Postavili smo naslednje raziskovalne hipoteze:  H1: Kaljenje pirinih semen pod kontroliranim abiotskim stresom pripomore k izboljšanju antioksidativne aktivnosti fenolnih spojin.  H2: Učinkovitost fermentacije z namenom povečanja fenolnih antioksidantov je večja z uporabo izbranih mikroorganizmov (kvasovk, mlečnokislinske bakterije) kot v primeru spontane fermentacije.  H3: Kaljenje in fermentacija učinkujeta sinergistično na povečanje dostopnosti fenolnih spojin.  H4: Vsebnosti posameznih fenolnih spojin so odvisne od pogojev fermentacije in kaljenja.  H5: Antioksidativna aktivnost, določena v celicah kvasovke S accharomyces cerevisiae, ni v korelaciji z antioksidativno aktivnostjo, določeno z različnimi in vitro testi. 14 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2 ZNANSTVENA DELA 2.1 KOMBINIRAN ABIOTSKI STRES IZBOLJŠA FENOLNI PROFIL IN AKTIVNOSTI EKSTRAKTIBILNIH IN VEZANIH ANTIOKSIDANTOV IZ SEMEN KALJENE PIRE ( Triticum spelta L.) Mencin M., Abramovič H., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2021a. Abiotic stress combinations improve the phenolics profiles and activities of extractable and bound antioxidants from germinated spelt ( Triticum spelta L.) seeds. Food Chemistry, 344: 128704, doi:10.1016/j.foodchem.2020.128704: 12 str. Namen študije je bil raziskati vpliv kaljenja pirinih semen pod različnimi stresnimi pogoji na antioksidativne lastnosti njihovih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin. V kombinaciji z ustreznimi pogoji abiotskega stresa smo ugotovili, da kaljenje pirinih semen pri 25 °C ob dodatku 25 mM NaCl in 50 mM sorbitola brez aplicirane mehanske poškodbe znatno pripomore k povečanju vsebnosti skupnih fenolov in omogoča učinkovitejše lovljenje prostih radikalov (DPPH•, ABTS•+, O •- 2 , ROO•). Alkalna hidroliza netopnega ostanka kaljenih pirinih semen je omogočila določitev večine prisotnih fenolnih kislin, med katerimi sta bili ferulna in p-kumarna kislina najbolj zastopani. Vezane fenolne spojine so izražale večjo antioksidativno aktivnost kot ekstraktibilne fenolne spojine. Med ekstraktibilnimi fenolnimi spojinami se je najbolj povečala vsebnost heksozida p-kumarne kisline (146 %), medtem ko je bilo med identificiranimi vezanimi fenolnimi spojinami največje relativno povečanje ugotovljeno pri p-kumarni kislini (171 %). Ekstraktibilne in vezane fenolne spojine iz kaljenih semen niso znižale znotrajcelične oksidacije v celicah kvasovk Saccharomyces cerevisiae. 15 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 16 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 17 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 18 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 19 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 20 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 21 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 22 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 23 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 24 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 25 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 26 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 27 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 28 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 29 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 30 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 31 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2 IZBOLJŠANJE DOSTOPNOSTI IN BIOLOŠKE AKTIVNOSTI ANTIOKSIDANTOV NEOBDELANIH, KALJENIH IN ENCIMSKO OBDELANIH SEMEN PIRE ( Triticum spelta L.) S FERMENTACIJO Mencin M., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2022a. Improving accessibility and bioactivity of raw, germinated and enzymatic-treated spelt ( Triticum spelta L.) seed antioxidants by fermentation. Food Chemistry, 394: 133483, doi:10.1016/j.foodchem.2022.133483: 12 str. Mlečnokislinska, alkoholna, kombinirana in spontana fermentacija neobdelanih, kaljenih in encimsko obdelanih pirinih semen je znatno izboljšala vsebnost ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin in pomembno povečala razmerje med ekstraktibilnimi in vezanimi fenolnimi spojinami ter tako pozitivno vplivala na dostopnost pirinih antioksidantov. Največjo vsebnost ekstraktibilnih in vezanih posameznih fenolnih spojin in in vitro antioksidativno aktivnost smo določili v ekstraktih po fermentaciji kaljenih pirinih semen s Saccharomyces cerevisiae, medtem ko je bila za encimsko obdelana semena najučinkovitejša fermentacija z Lactobacillus plantarum (samostojno ali v kombinaciji s S. cerevisiae). Med ekstraktibilnimi fenolnimi spojinami se je najbolj povečala vsebnost trans-ferulne kisline in sicer v kaljenih semenih, fermentiranih s kvasovkami (2922 %); medtem ko smo pri vezanih fenolnih spojinah največji relativni prirast določili pri cis-ferulni kislini, prav tako pri fermentaciji s kvasovkami, vendar v neobdelanih pirinih semenih (466 %). Spontana fermentacija kaljenih in encimsko obdelanih vzorcev je najučinkoviteje znižala znotrajcelično oksidacijo, verjetno zaradi apigenin derivatov. Celični privzem vezanih hidroksicimetnih kislin je bil znatno večji kot privzem ekstraktibilnih hidroksicimetnih kislin; vendar so bile slednje učinkovitejši antioksidanti v in vivo pogojih. 32 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 33 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 34 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 35 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 36 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 37 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 38 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 39 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 40 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 41 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 42 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 43 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 44 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 45 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 46 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 47 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 48 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 49 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 50 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 51 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.3 ENCIMSKA OBDELAVA NEOBDELANIH, KALJENIH IN FERMENTIRANIH SEMEN PIRE ( Triticum spelta L.) IZBOLJŠA DOSTOPNOST IN ANTIOKSIDATIVNO AKTIVNOST NJIHOVIH FENOLNIH SPOJIN Mencin M., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2022b. Enzymatic treatments of raw, germinated and fermented spelt ( Triticum spelta L.) seeds improve accessibility and antioxidant activity of their phenolics. LWT, 169: 114046, doi:10.1016/j.lwt.2022.114046: 13 str. Namen naše študije je bil raziskati učinek celulaze, ksilanaze, feruloil esteraze, α-amilaze in proteaze na sproščanje fenolnih spojin iz semen pire ter ugotoviti vpliv kombiniranja encimske obdelave, kaljenja ali fermentacije na vsebnost fenolnih spojin in njihovo in vitro in celično antioksidativno aktivnost. Obdelava pirinih semen z različnimi kombinacijami celulaze, ksilanaze, feruloil esteraze, α-amilaze in proteaze je povečala sproščanje vezanih fenolnih spojin iz matrice pirinih semen. Vzorci, obdelani z vsemi petimi encimi skupaj, so pokazali znatno povečanje vsebnosti ekstraktibilne p-kumarne, ferulne in p- hidroksibenzojske kisline, učinkovitejšo antioksidativno aktivnost, še posebno pri ABTS testu, in največjo vsebnost ekstraktibilnih TPC. S kombiniranjem encimske obdelave s kaljenjem oz. s fermentacijo so se ekstraktibilne TPC povečale za 28 % oz. 458 %. Kombinacija encimske obdelave s kaljenjem oz. fermentacijo je nadalje vodila do velikega povečanja vsebnosti ekstraktibilne trans-ferulne kisline (5899 % oz. 8263 %). Vezana frakcija encimsko obdelanih neobdelanih semen je imela nižjo antioksidativno aktivnost v celici kot pripadajoča ekstraktibilna frakcija, vendar pa kar 24-krat večji celični privzem hidroksicimetnih kislin. Analiza glavnih komponent je pokazala nekatere podobnosti med ekstraktibilnimi in vezanimi frakcijami encimsko obdelanih neobdelanih, kaljenih in fermentiranih vzorcev, predvsem na račun povečanja vsebnosti ekstraktibilnih kislin, še posebej cis-ferulne, kavne in p- hidroksibenzojske kisline. To delo je ponujeno pod Creative Commons Priznanje avtorstva-deljenje pod enakimi pogoji 4.0 International licenca. 52 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 53 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 54 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 55 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 56 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 57 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 58 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 59 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 60 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 61 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 62 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 63 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 64 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 65 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 66 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 67 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.4 SIMULACIJA GASTROINTESTINALNE PREBAVE BIOLOŠKO OBDELANIH PIRINIH SEMEN: BIOLOŠKA DOSTOPNOST IN AKTIVNOST FENOLNIH SPOJIN Mencin M., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2022c. Simulated gastrointestinal digestion of bioprocessed spelt seeds: bioaccessibility and bioactivity of phenolics. Antioxidants, 11, 9: 1703, doi:10.3390/antiox11091703: 20 str. Cilj te raziskave je bil ovrednotiti vpliv različnih biotehnoloških procesov na izboljšanje biološke dostopnosti fenolnih spojin iz pirinih semen. Kljub negativnemu vplivu gastrointestinalne prebave je fermentacija kaljenih semen znatno povečala biološko dostopnost skupnih fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost v primerjavi s prebavljenimi neobdelanimi semeni. Encimsko obdelana fermentirana semena so pokazala največjo relativno biološko dostopnost p-kumarne in trans-ferulne kisline, medtem ko je bila njihova absolutna vsebnost znatno večja pri »kaljenih + fermentiranih« semenih. Naša raziskava nakazuje, da predobdelava pirinih semen s hidrolitičnimi encimi omogoča lažji dostop mikroorganizmov do strukturnih elementov, zaradi česar smo uspeli določiti večjo vsebnost ekstraktibilne in vezane trans-ferulne kisline. Znatno višjo biološko stabilnost fenolnih spojin smo določili pri neobdelanih semenih. Ker so antioksidanti istega ekstrakta pokazali drugačno relativno zmanjšanje sposobnosti lovljenja DPPH• in ABTS•+ radikalov v primerjavi z neobdelanimi semeni ali njihovimi pripadajočimi neprebavljenimi ekstrakti, predvidevamo, da med prebavo pride do kvalitativnih sprememb v sestavi ekstraktov. Pomembno je, da z biološko obdelavo povečamo vsebnost ekstraktibilnih antioksidantov v semenih, saj se njihova vsebnost med prebavo močno zmanjša. To delo je ponujeno pod Creative Commons Priznanje avtorstva-deljenje pod enakimi pogoji 4.0 International licenca. 68 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 69 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 70 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 71 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 72 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 73 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 74 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 75 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 76 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 77 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 78 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 79 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 80 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 81 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 82 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 83 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 84 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 85 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 86 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 87 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 88 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3 RAZPRAVA IN SKLEPI 3.1 RAZPRAVA Osnovni namen naše raziskave je bil z različnimi biotehnološkimi procesi obdelati semena pire ( Triticum spelta L.), s čimer bi izboljšali biološko dostopnost fenolnih spojin, njihovo vsebnost in antioksidativno aktivnost. Zanimala nas je tako vsebnost ekstraktibilnih in vezanih TPC, določena s Folin-Ciocalteu metodo, njuno razmerje, hkrati pa tudi identifikacija in kvantifikacija posameznih fenolnih spojin, določena s HPLC-MS/MS metodo. Ekstraktibilne fenolne spojine smo ekstrahirali z absolutnim metanolom. Zaradi več hidroksilnih skupin, ki so polarne, in aromatskega obroča, ki je nepolaren, je večina fenolnih spojin dobro topna v polarnih in srednje nepolarnih topilih. Po metanolni ekstrakciji pa netopne vezane fenolne spojine praviloma še vedno ostajajo vezane na celične stene (Domínguez-Rodríguez in sod., 2017), zato smo jih s pomočje alkalne hidrolize sprostili iz vezane oblike. Za njihovo izolacijo smo razvili nov pristop in ga tudi optimizirali (Priloga C) (Mencin in sod., 2021b). 3.1.1 Vpliv kaljenja na vsebnost fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost Prvi sklop raziskav je obsegal iskanje optimalne kombinacije pogojev abiotskega stresa z namenom izboljšanja fenolnega profila in aktivnosti ekstraktibilnih in vezanih antioksidantov iz semen kaljene pire. Vsebnost fenolnih spojin, ki jih neka rastlina sintetizira in kopiči med kaljenjem, je predvsem odvisna od odziva rastline na stresne dejavnike (Hübner in Arendt, 2013). Večina raziskav je poročala, da se med kaljenjem poveča vsebnost topnih fenolnih spojin, kar pripisujejo sintezi de novo in različnim biološkim transformacijam (Gan in sod., 2017; Kim in sod., 2018). Kar se tiče vezanih fenolnih spojin, raziskave poročajo, da na začetku kaljenja njihova vsebnost pada, kasneje pa začne ponovno naraščati (Hung in sod., 2011). Domneva se, da je vsebnost vezanih fenolnih spojin odvisna od njihove stopnje sprostitve in konjugacije. V zgodnji fazi kaljenja se ogljikovi hidrati in proteini razgradijo, hkrati pa se opazi povečanje vsebnosti enostavnih sladkorjev in aminokislin (Wang in sod., 2014), zato se tudi vezane fenolne spojine, konjugirane s komponentami celične stene, začnejo sproščati. Z daljšim časom kaljenja se tvorijo rastlinske celice z novimi celičnimi stenami in sintetizirane topne fenolne spojine se lahko vežejo z novo nastalimi komponentami celične stene in tako tvorijo nove vezane fenolne spojine. Tako so vezane fenolne spojine vključene v dinamičen proces, njihovo sproščanje in stopnja konjugacije pa se lahko razlikuje med različnimi vrstami kaljenih semen (Gan in sod., 2017). Antioksidativna aktivnost je najbolj pogosto raziskovana biološka aktivnost kaljenih semen in večina raziskav kaže, da kaljenje znatno izboljša antioksidativno aktivnost topnih ekstraktibilnih fenolnih spojin, v primerjavi z nekaljenimi semeni. Povečano antioksidativno aktivnost lahko pripišemo povečanju vsebnosti antioksidativnih komponent v kaljenih semenih. Rezultati raziskav kažejo, da se med kaljenjem žit poveča tudi antioksidativna aktivnost vezanih fenolnih spojin (Ti in sod., 2014; Žilić in sod., 2015). 89 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 V naši raziskavi smo ugotavljali vpliv različnih stresnih pogojev na vsebnost ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin ter njihovo in vitro in in vivo antioksidativno aktivnost v 144 h kaljenih pirinih semenih. Pred kaljenjem smo mehansko oluščena semena pire pregledali ter poškodovana semena odstranili. Različne stresne dejavnike smo preverjali na neprečiščenih ekstraktih. Kontrolo so predstavljala pirina semena, ki smo jim dodali 24 mL vode in so 144 h kalila pri 20 °C. Opozoriti je potrebno, da je bil cilj študije raziskati vplive različnih stresnih pogojev, apliciranih med kaljenjem pirinih semen, in ne učinek samega kaljenja na fenolne spojine in njihov antioksidativni potencial, zato smo za kontrolo izbrali semena, kaljena pri optimalnih pogojih, in ne nekaljenih semen. Po končanem kaljenju smo semena tudi vizualno pregledali glede morebitne prisotnosti plesni. Pri semenih, ki so kalila pri 40 °C smo našli prisotno plesen, zato smo ta semena izločili iz nadaljnih analiz. Manjši dodatek vode semenom (12 mL) je znatno zmanjšal vsebnost ekstraktibilnih in vezanih TPC ter njihovo sposobnost lovljenja DPPH• in ABTS•+ radikalov. Vse dodane koncentracije NaCl (25–200 mM) so rezultirale v znatnem povečanju sposobnosti lovljenja ABTS•+ radikalov vezane freakcije, v primerjavi s kontrolo. Povečana osmolarnost ob dodatku raztopine sorbitola in kaljenje pri 10 °C oz. 30 °C so znatno znižali vsebnost ekstraktibilnih in vezanih TPC in njihovo sposobnost lovljenja ABTS•+ radikalov. Po drugi strani pa sta dodatek raztopine sorbitola in sprememba temperature kaljenja znatno izboljšala sposobnost lovljenja DPPH• radikalov. Mehanske poškodbe kalčkov so vodile k zmanjšanju vsebnosti ekstraktibilnih in vezanih TPC, medtem ko je bil učinek na antioksidativno aktivnost ekstraktibilne in vezane frakcije odvisen od vrste prostih radikalov; negativen v primeru ABTS•+ in pozitiven v primeru DPPH• radikalov. Nadalje smo v našem poskusu ugotavljali vpliv kombiniranja različnih stresorjev, kar je rezultiralo v višjih vsebnostih ekstraktibilnih in vezanih TPC. Znatno se je povečala tudi sposobnost lovljenja DPPH• radikalov, medtem ko se je sposobnost lovljenja ABTS•+ radikalov minimalno povečala v primerjavi s kontrolo. Ker lahko prisotni sladkorji, organske kisline in druge polarne komponente v neprečiščenih pirinih ekstraktih vplivajo na TPC in antioksidativno aktivnost, smo pred nadaljnjimi analizami vzorce prečistili z ekstrakcijo na trdno fazo (SPE). Štiri vzorce, ki so pokazali najvišjo antioksidativno aktivnost pri neprečiščenih ekstraktih, smo prečistili in jim nadalje določili vsebnost skupnih in individualnih fenolnih spojin ter njihovo in vitro in in vivo antioksidativno aktivnost. Ti vzorci so bili: dodatek raztopine NaCl (25 mM) po 48 h in 96 h kaljenja (vzorec NN); dodatek raztopine sorbitola (50 mM) po 48 h in 96 h kaljenja (vzorec SS); dodatek raztopine NaCl (25 mM) po 48 h in dodatek raztopine sorbitola (50 mM) po 96 h kaljenja (vzorec NS); dodatek raztopine NaCl po 48 h in dodatek raztopine sorbitola po 96 h kaljenja z apliciranim mehanskim stresom pri 72 h kaljenja (vzorec NSM). Vzorci so bili kaljeni pri 25 °C, 144 h. Ne glede na abiotski stres, so bile opazne razlike v kvantiteti med ekstraktibilnimi in vezanimi fenolnimi spojinami, saj se približno dve tretjini fenolnih spojin iz kaljenih semen ni ekstrahiralo z metanolom, ampak so se sprostile šele po alkalni hidrolizi. Ugotovili smo, da kaljenje pirinih semen ob dodatku 25 mM NaCl in 50 mM sorbitola brez aplicirane mehanske poškodbe med preizkušenimi kombinacijami abiotskega stresa v splošnem najbolj pripomore k povečanju vsebnosti fenolnih spojin in 90 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 učinkovitejšemu lovljenje prostih radikalov (DPPH•, ABTS•+, O •- 2 , ROO•) v primerjavi s kontrolo. Ferulna, p-kumarna, kavna in p-hidroksibenzojska kislina so bile glavne predstavnice identificiranih vezanih antioksidantov v kaljeni piri; pri p-kumarni in trans- ferulni kislini je vezana oblika predstavljala kar 99 % od skupne vsebnosti posamezne kisline. Vsi štirje stresni pogoji (NN, SS, NS, NSM) so zmanjšali vsebnost posameznih ekstraktibilnih fenolnih kislin, največje zmanjšanje pa smo zaznali pri vzorcu NSM v primerjavi s kontrolo. Očitno smo ekstraktibilne fenolne kisline zgubili z apliciranjem mehanskega stresa, saj smo eno tretjino kalčkov odrezali. Po drugi strani pa se je vsebnost vezanih fenolnih kislin zvišala v vzorcih, ki so bili izpostavljeni povišani slanosti in osmolarnosti brez apliciranega mehanskega stresa. NSM obdelava je znatno zvišala le vsebnost vezane p-kumarne kisline. Ne glede na vse, naši rezultati nakazujejo, da imajo obdelave z raztopinama NaCl in sorbitola različne vplive na transformacije ekstraktibilnih in vezanih fenolnih kislin med kaljenjem pirinih semen. Tako lahko potrdimo, da različni stresni pogoji značilno vplivajo na razmerje med ekstraktibilnimi in vezanimi fenolnimi spojinami. Zanimivo je, da so vzorci, ki so pokazali povečanje vsebnosti vezane p-kumarne in trans-ferulne kisline, pokazali tudi višje TPC in boljšo antioksidativno aktivnost, glede na kontrolo. To nakazuje na pomembno vlogo teh dveh fenolnih kislin pri izražanju celokupne antioksidativne aktivnosti kaljenih pirinih semen in reaktivnosti na Folin-Ciocalteu reagent. Prav tako smo opazili, da so ekstraktibilne frakcije izkazovale relativno visoko antioksidativno aktivnost, čeprav so vsebovale manj fenolnih kislin v primerjavi z vezanimi frakcijami. Sestava ekstraktibilne frakcije je bila precej bolj heterogena, a koncentracijsko manj pomembna. Katera fenolna kislina je najbolj prispevala k aktivnosti kaljenih semen, ostaja še vedno odprto vprašanje. Omeniti velja, da so ekstraktibilne frakcije kaljenih semen vsebovale kar nekaj neznanih spojin, ki jih nismo identificirali in bi lahko pomembno prispevale k vsebnosti TPC in antioksidativni aktivnosti. Kaljena semena, ki so bila izpostavljena dodatku raztopin 25 mM NaCl in 50 mM sorbitola, so na splošno pokazala največjo vsebnost ekstraktibilnih in vezanih TPC in izražala najboljšo antioksidativno aktivnost tako v homogenem (vodna ali organska raztopina) kot tudi v heterogenem (emulzija linolne kisline v vodi) mediju, ter največjo vsebnost vezane p- kumarne, trans-ferulne in kavne kisline. Chu in sod. (2020) so v kaljenem kitajskem divjem rižu določili precejšnjo pozitivno linearno korelacijo (r = 0,834–0,862) med aktivnostjo PAL, ki transformira fenilalanin v cimetno kislino, in vsebnostjo p-kumarne, ferulne in p- hidroksibenzojske kisline. Na splošno obstajajo tri možne poti za nastanek ekstraktibilnih fenolnih spojin med kaljenjem. Prvič, njihovo prirast lahko pripišemo sproščanju vezanih spojin. Hidrolitični encimi povzročijo hidrolizo strukturnih komponent, del katerih so tudi fenolne spojine. Drugič, med kaljenjem semen se lahko proteini, škrob in lipidi razgradijo v aminokisline, glukozo in acetil CoA, ki predstavljajo neposredne ali posredne substrate za de novo sintezo fenolnih spojin. Posledično je pomembno tudi povečanje aktivnosti encimov, ki so odgovorni za pretvorbo teh substratov v fenolne spojine (Carciochi in sod., 2016). Tretjič, tudi regulacija prekomerne koncentracije ROS je ena izmed možnih poti za 91 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 povečanje ekstraktibilnih fenolnih spojin. Med kaljenjem semen se namreč tvorijo številne ROS, več prostih radikalov bi lahko spodbudilo gen, ki sproži produkcijo encimov za zaščito organelov pred napadom prostih radikalov. Po drugi strani se lahko vsebnost ekstraktibilnih fenolnih spojin med kaljenjem tudi zmanjša. Eden od mehanizmov je, da so slednje vključene v nevtralizacijo ROS. Ekstraktibilne fenolne spojine lahko donirajo vodik ali elektron za lovljenje prostih radikalov, ki tako postanejo relativno stabilni radikali fenolnih spojin. Nadalje, med kaljenjem se v semenih poveča količina encimov fenol-oksidaz in peroksidaz. Ti encimi lahko oksidirajo široko paleto donorjev vodika, vključno s fenolnimi kislinami, flavonoidi, polifenoli, itd. (Richard-Forget in Gauillard, 1997) in posledično pripomorejo k zmanjšanju vsebnosti ekstraktibilnih fenolnih spojin. Drugi mehanizem, ki je lahko odgovoren za zmanjšanje vsebnosti ekstraktibilnih fenolnih spojin je, da se lahko ekstraktibilne spojine prenesejo na celično steno z vezikli, kjer se transformirajo v vezano obliko (Xu in sod., 2020). Da bi podali čim bolj celovito oceno antioksidativne aktivnosti prisotnih fenolnih spojin v naši rastlinski matrici, smo uporabili različne analizne metode. Metodi določanja sposobnosti lovljenja DPPH• in ABTS•+ radikalov temeljita na mehanizmu prenosa elektrona ali vodikovega radikala in vključujeta redukcijo obarvanega oksidanta, kot taki sta podobni Folin-Ciocalteu testu (Dawidowicz in Olszowy, 2013). Pomembno je poudariti, da sta DPPH• in ABTS•+ radikala različno dovzetna za reakcije s fenolnimi spojinami različnih kemijskih struktur. Nenadis in Tsimidou (2002) sta poročala, da so najvišjo antioksidativno aktivnost, določeno z metodo lovljenja DPPH• radikala, pokazale spojine z več hidroksilnimi skupinami (npr. kavna kislina), sledile so jim monofenolne spojine z metoksi skupino (npr. sinapinska, ferulna kislina). V primerjavi z DPPH•, ABTS•+ radikal bistveno bolje reagira z monofenolnimi spojinami (ferulno, p-kumarno kislino). Ker kaljena pirina semena vsebujejo veliko p-kumarne in ferulne kisline, je bila večja sposobnost lovljenja ABTS•+ radikalov kot DPPH• pričakovana. Prav tako so Abramovič in sod. (2017) poročali, da sestava topila in pH močno vplivata na reaktivnost antioksidantov pri DPPH in ABTS testu. Določitev sposobnosti lovljenja superoksidnega anionskega radikala (O •- 2 ) je metoda, kjer antioksidant in tarčna molekula (nitrotetrazol modro) tekmujeta za O •- 2 . Naša analiza kakovosti pirinih antioksidantov je pokazala, da njihovo sposobnost lovljenja DPPH•, ABTS•+ in O •- 2 radikalov najbolj izboljšamo, če semena izpostavimo povišani slanosti in osmolarnosti (vzorec NS). Glede na dobljene rezultate lahko predvidevamo, da se različne spojine sintetizirajo pri različnih stresnih pogojih, pri čemer je bila odločilna izbira med dodatkom 50 mM sorbitola ali 25 mM NaCl po 48 h kaljenja. Metoda beljenja β-karotena se od ostalih treh metod razlikuje po tem, da reakcija med antioksidantom in radikalom poteka v sistemu emulzije linolne kisline v vodi. Ker so živila po svoji sestavi večfazni in heterogeni sistemi, predstavlja ta metoda enega bolj realnih medijev, saj antioksidativna aktivnost spojin ni odvisna le od sposobnosti lovljenja radikalov, ampak tudi od porazdelitve med vodno in lipidno fazo. Antioksidanti, prisotni v analiziranem vzorcu, tekmujejo z β-karotenom v reakciji s peroksilnimi (ROO•) radikali. V naši raziskavi se je kot najučinkovitejši med 92 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ekstraktibilnimi TPC izkazal vzorec NS. Ugotovili smo, da so pri koncentraciji 15 mg ekvivalent Troloksa (TE)/L bolj učinkoviti lovilci ROO• radikalov vezane fenolne spojine kot ekstraktibilne. Dodatek vezanih fenolnih spojin je pri vseh obdelavah upočasnil beljenje β-karotena vsaj za polovico, kar nakazuje na opazno antioksidativno aktivnost v emulziji ne glede na uporabljene stresne dejavnike. Vezani antioksidanti iz mehansko poškodovanih kalčkov so pokazali slabšo učinkovitost pri lovljenju DPPH•, ABTS•+ in O •- 2 radikalov, po drugi strani pa je mehanski stres izboljšal njihovo antioksidativno učinkovitost v emulziji. Glede na rezultate predvidevamo, da mehanski stres rezultira v sintezi in tvorbi manj polarnih oz. nepolarnih fenolnih spojin. Naša in vitro raziskava kaže, da je kaljenje pod abiotskim stresom dober način za izboljšanje antioksidativne aktivnosti pirinih semen. Proces kaljenja, ki vključuje kontrolirane stresne pogoje, kot so temperatura, svetloba, voda, slanost, povečana osmolarnost in mehanske poškodbe, nam omogoča pridobitev pirinih semen s povečano hranilno vrednostjo. Ali bodo bioaktivne spojine delovale kot antioksidanti v in vivo sistemih, je odvisno od številnih faktorjev, kot so koncentracija, struktura in substrat, ki ga morajo zaščititi (Maurya in Devasagayam, 2010). Na podlagi rezultatov, določenih z in vitro metodami, ne moremo predvideti antioksidativne aktivnosti kaljenih semen v in vivo sistemu, zato smo določali znotrajcelično oksidacijo (ICO) v modelnem organizmu S. cerevisiae. Ugotovili smo, da ekstraktibilne in vezane frakcije kaljenih pirinih semen niso pokazale nobene statistično značilne razlike v znotrajcelični oksidaciji v primerjavi z netretiranimi celicami modelnega organizma. S pomočjo HPLC-MS/MS metode smo nadalje ugotavljali celični privzem posameznih fenolnih spojin ekstraktibilnih in vezanih frakcij, pred in po tretiranju kvasnih celic. Sklepamo, da glavni antioksidanti iz kaljenih pirinih semen ne morejo direktno vstopiti v celico in jo zaščititi pred oksidacijo, ampak se morajo pred tem najverjetneje preoblikovati. Cigut in sod. (2011) so ugotavljali celični privzem treh hidroksicimetnih kislin in fenetilnih estrov kavne kisline (CAPE), prehod v celico je bil ugotovljen samo pri CAPE, medtem ko ostale analizirane spojine niso vstopile v celico. Kot poročajo avtorji, je prehod spojin v celico povezan s polarnostjo spojine; CAPE so veliko manj polarni kot pripadajoča kavna kislina. Kljub temu, da so CAPE vstopili v celico, pa tam niso znižali znotrajcelične oksidacije, zato avtorji predvidevajo, da so verjetno ostali na celični membrani. Celični privzem in hkrati tudi znižanje znorajcelične oksidacije so opazili le pri srednje polarni frakciji etanolnih ekstraktov propolisa, ki je večinoma vsebovala flavonoide. Slednje sovpada z našo ugotovitvijo, da identificirane spojine, ki so bolj ali manj polarne, zelo slabo korelirajo s koeficientom antioksidativne aktivnosti določene v emulziji ( C AA). Zanimivo je, da so Masisi in sod. (2016) v pregledu literature o in vivo raziskavah antioksidantov izpostavili, da se fenolne spojine iz pšeničnih otrobov relativno dobro absorbirajo v GI traktu in lahko delujejo antioksidativno. Naša raziskava kaže, da je biosinteza in transformacija fenolnih spojin odvisna od specifičnih stresnih razmer med kaljenjem. Kaljenje pod abiotskim stresom velja za varen, 93 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 dostopen in enostaven proces, zato pričakujemo, da bi bili potencialni izdelki z izboljšano prehransko vrednostjo dobro sprejeti med potrošniki. 3.1.2 Vpliv fermentacije na vsebnost fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost Nadalje smo z uporabo fermentacije pirinih semen želeli izboljšati dostopnost fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost. Različne tipe fermentacij smo kombinirali z ostalima biotehnološkima procesoma – kaljenjem in encimsko obdelavo. Naši vzorci niso bili sterilizirani, saj smo glede na preliminarne poskuse ugotovili, da s sterilizacijo izgubljamo enormne količine fenolnih spojin, naš primarni cilj pa je bilo povečanje njihove vsebnosti. Vpliv fermentacije na fenolne spojine je v glavnem odvisen od vrste uporabljenih mikroorganizmov in pogojev fermentacije, kot sta temperatura in čas. Mlečnokislinska, alkoholna, kombinirana (mlečnokislinska + alkoholna) in spontana fermentacija neobdelane, kaljene in encimsko obdelane pire so znatno izboljšale vsebnost ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin ter pomembno zmanjšale razmerje med vezanimi in ekstraktibilnimi fenolnimi spojinami in tako pozitivno vplivale na dostopnost pirinih antioksidantov. Zanimivo je, da smo zaznali kar velike razlike v razmerju med ekstraktibilnimi in vezanimi TPC pri različnih vrstah fermentiranih semen (neobdelana, kaljena, encimsko obdelana). Pri neobdelanih semenih je bilo razmerje med ekstraktibilnimi in vezanimi TPC znatno manjše kot pri kaljenih ali encimsko obdelanih semenih. Najnižje razmerje med ekstraktibilnimi in vezanimi TPC je bilo ugotovljeno pri neobdelani nefermentirani piri, po fermentaciji pa se je razmerje povečalo za kar 2-krat. Največje razmerje smo našli pri kaljenih semenih, hkrati fermentiranih z L. plantarum in S. cerevisiae in samo s S. cerevisiae. Ne glede na vrsto fermentacije so vezane fenolne spojine prevladovale. Naša raziskava kaže, da tako biološka obdelava pirinih semen s kaljenjem oz. encimsko obdelavo pred fermentacijo, kot tudi vrsta fermentacije vplivata na spremembe vsebnosti skupnih fenolnih spojin. Kaljena semena, uporabljena v tej raziskavi, se lahko obravnava kot material, bogat z encimi za sledečo fermentacijo (Katina in sod., 2007a). Kombinacija kaljenja in fermentacije vodi do sinergističnih učinkov, saj kaljenje prispeva k večji količini fermentabilnih virov (sladkor/dušik), hkrati pa tako kaljenje kot fermentacija pripomoreta k večji koncentraciji in aktivnosti encimov, ki razgrajujejo celične stene, kar lahko prispeva k večji biološki dostopnosti fenolnih kislin (Wang in sod., 2014). Encimska obdelava, kot tehnika za biološko obdelavo semen, omogoča sprostitev fenolnih spojin iz komponent celične stene in tako izboljša biološko dostopnost teh spojin (Angelino in sod., 2017). Vsebnosti bioaktivnih spojin se med fermentacijo spreminjajo zaradi metabolne aktivnosti mikroorganizmov. Med fermentacijo pirinih semen lahko prisotni encimi v semenih in/ali encimi, ki jih proizvajajo mikroorganizmi, razgradijo estrske vezi in hidrolizirajo β-glukozidne vezi, pri čemer se sproščajo fenolne spojine (Adebo in Medina-Meza, 2020). Poudariti pa moramo, da na vsebnost fenolnih spojin med fermentacijo lahko vpliva tudi endogena sinteza fenolnih spojin v mikroorganizmih (Chrzanowski, 2020; Marienhagen in Bott, 2013). 94 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Katina in sod. (2007a) so poročali, da je fermentacija kaljenih rženih semen z uporabo kvasovke S. cerevisiae znatno povečala vsebnost skupnih fenolnih kislin in sicer za kar 110 % (zgolj s kaljenjem je bilo povečanje 87 %) v primerjavi z nekaljenimi semeni. Fermentacija je bistveno pripomogla k dvigu vsebnosti prostih fenolnih kislin, zabeležili pa so tudi dvig vsebnosti zaestrenih, glikoziliranih in vezanih fenolnih kislin. Liu in sod. (2017) so poročali, da je fermentacija z dvema MKB izboljšala vsebnost ekstraktibilnih TPC v riževih otrobih, ki so bili predhodno obdelani z α-amilazami. Ugotovili so tudi, da je fermentacija in obdelava z α-amilazami, proteazami in celulazami riževih otrobov povečalo ekstraktibilne TPC za 59 % glede na neobdelan vzorec. Hole in sod. (2012) so pokazali, da fermentacija z MKB poveča vsebnost vezanih TPC v ječmenu, po drugi strani pa zmanjšuje njihovo vsebnost v ovsu. Povečanje vsebnosti vezanih fenolnih spojin v ječmenu so povezali s povečano vsebnostjo topnih prehranskih vlaknin in posledično lažjo ekstrakcijo vezane frakcije. Zdi se, da so topne prehranske vlaknine boljši substrat za feruloil esteraze v primerjavi z netopnimi prehranskimi vlakninami. Povečanje topnih prehranskih vlaknin je lahko posledica delovanja različnih endogenih encimov, ki hidrolizirajo polisaharide (Hole in sod., 2012). Največjo vsebnost posameznih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin in njihovo in vitro antioksidativno aktivnost smo določili pri kaljenih semenih fermentiranih s kvasovko S. cerevisiae, medtem ko je bila pri encimsko obdelani piri najučinkovitejša fermentacija z MKB L. plantarum. Med ekstraktibilnimi fenolnimi spojinami se je vsebnost trans-ferulne kisline najbolj povečala in to za kar 2922 % pri s kvasovko S. cerevisiae fermentirani kaljeni piri. Med vezanimi fenolimi spojinami je cis-ferulna kislina pokazala največje relativno povečanje vsebnosti pri neobdelani piri, fermentirani s kvasovko, in sicer za 466 %. Spremembe pH med različnimi vrstami fermentacije bi lahko zagotovile pH, optimalen za delovanje različnih encimov, ki razgrajujejo celične stene. Na primer, močno povišana vsebnost ekstraktibilnih fenolnih kislin, predvsem trans-ferulne kisline, ki se je pojavila med alkoholno fermentacijo, je bila lahko posledica aktivacije feruloil esteraze zaradi spremembe pH (Boskov Hansen in sod., 2002). Anson in sod. (2009) so poročali, da lahko fermentacija pšenice s S. cerevisiae poveča biološko dostopnost ferulne kisline. Nadalje so Moore in sod. (2006) dokazali, da sevi S. cerevisiae proizvajajo encime, vključno z β-glukozidazami, karboksilesterazami in morda tudi feruloil esterazami. To nakazuje, da je izvor feruloil esteraz mogoče pripisati semenom ali pa kvasovkam. Rezultati naše raziskave se ujemajo tudi z rezultati avtorjev Konopka in sod. (2014), ki so poročali, da alkoholna fermentacija poveča vsebnost proste ferulne kisline v pšenici in rži za kar 10-krat. Prav tako so Antognoni in sod. (2019) ugotovili, da sevi bakterije L. plantarum uspešno obogatijo testo s prosto ferulno kislino, vendar pa je bila vsebnost proste ferulne kisline, kljub razmeroma velikemu povečanju, še vedno precej nižja od vsebnosti vezane oblike. Encimska obdelava in fermentacija sta učinkovali sinergistično na vsebnost posameznih fenolnih kislin, še posebej fermentacija z MKB, ki je rezultirala v velikem povečanju 95 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 vsebnosti ekstraktibilne p-kumarne (881 %), trans-ferulne (385 %) in kavne (838 %) kisline. Hkrati pa je ista fermentacija imela negativen vpliv na njihove vezane oblike. O zmanjšanju vsebnosti vezanih fenolnih kislin, še posebno p-kumarne in trans-ferulne kisline med fermentacijo, so poročali tudi Spaggiari in sod. (2020). Predvidevali so, da razlog tiči v metabolnih lastnostih mikroorganizmov, ki lahko transformirajo fenolne kisline v različne metabolite. V naši raziskavi se je pokazalo, da imajo eksterni encimi potencial za sproščanje najbolj netopnih vezanih fenolnih spojin iz pirinih semen, saj je prišlo do povečanja vsebnosti ekstraktibilne in zmanjšanja deleža vezane frakcije. Razmerje med količinami identificiranih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih kislin se je po fermentaciji povečalo za kar 10-krat pri neobdelanih semenih, za 19-krat pri kaljenih semenih in za 11-krat pri encimsko obdelanih semenih. Metabolizem fenolnih kislin v MKB poteka s pomočjo reduktaz in dekarboksilaz. Fenolne kisline se dekarboksilirajo v ustrezne fenolne in vinilne derivate. Fermentacija z različnimi vrstami mikroorganizmov vključuje različne encimske reakcije, posledično se sproščajo različne fenolne spojine. Kar zadeva količinsko najbolj zastopano fenolno spojino v pirinih semenih, ferulno kislino, mikrobna razgradnja ferulne kisline vključuje oksidacijo ali redukcijo stranske verige, pri čemer nastane vanilin, sledi nastanek vanilinske kisline z oksidacijo aldehidne skupine in na koncu še tvorba gvajakola in protokatehujske kisline (Bento-Silva in sod., 2020). Metabolizem ferulne kisline s pomočjo L. plantarum in S. cerevisiae med fermentacijo poteka predvsem po dveh presnovnih poteh. Prva vključuje aktivnost dekarboksilaz, ki so odgovorne za pretvorbo ferulne kisline v 4-vinil gvajakol. Aktivnost dekarboksilaz so identificirali tako v MKB kot tudi v kvasovki. Druga pot pa je redukcija ferulne kisline v dihidroferulno kislino, ki jo povzročajo reduktaze fenolnih kislin (Boudaoud in sod., 2021). Reduktazna aktivnost je bila identificirana v MKB, medtem ko je pri kvasovki S. cerevisiae niso odkrili. Zanimivo je bilo, da v naši raziskavi nismo našli in identificirali pričakovanih metabolitov p-kumarne, ferulne in kavne kisline. Rezultati so bili tako v nasprotju z raziskavami, ki so poročale, da bakterija L. plantarum proizvaja dekarboksilaze, ki so sposobne dekarboksilirati p-kumarno, ferulno in kavno kislino do pripadajočih vinil derivatov (Filannino in sod., 2015). Eden od možnih razlogov, zakaj nismo našli metabolitov fenolnih kislin je, da je mogoče dekarboksilirati samo ekstraktibilne fenolne kisline v ustrezne vinil derivate (Filannino in sod., 2018). V naši raziskavi pa so neobdelana, kaljena in encimsko obdelana semena pred fermentacijo vsebovala nizko vsebnost ekstraktibilnih fenolnih kislin. Po drugi strani pa so Coghe in sod. (2004) poročali, da višja vsebnost ferulne kisline ne vodi nujno do višje vsebnosti 4-vinil gvajakola. V ekstraktibilni frakciji fermentiranih pirinih semen smo identificirali in kvantificirali tudi pet flavonoidov (apigenin derivati, C-glikozil derivat in galokatehin), ki so bili prisotni v dokaj visokih koncentracijah. Poznavanje mehanizmov sinteze in regulacije fenolnih spojin med fermentacijo je trenutno zelo omejeno. 96 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Na splošno so fermentirana neobdelana, kaljena in encimsko obdelana pirina semena, ki so vsebovala večje vsebnosti TPC izkazala tudi večjo sposobnost lovljenja DPPH• in ABTS•+ radikalov. V naši raziskavi antioksidativne lastnosti niso bile odvisne samo od vrste fermentacije, temveč tudi od vrste substrata. S fermentacijo neobdelanih semen ali s kombinacijo tehnik za biološko obdelavo (npr. encimsko obdelavo in fermentacijo) smo dosegli močno izboljšanje antioksidativne aktivnosti. Pri fermentiranih kaljenih semenih je bilo relativno povečanje antioksidativne aktivnosti manjše, vendar pa je bila absolutna antioksidativna aktivnost večja kot pri ostalih biološko obdelanih vzorcih. Sinergizem med antioksidanti v biološko obdelanih vzorcih rezultira v antioksidativnih aktivnostih, ki niso odvisne le od koncentracije antioksidantov, temveč tudi od njihove strukture in interakcij med antioksidanti (Adebo in Medina-Meza, 2020). Zaradi tega se lahko vzorci s podobno vsebnostjo skupnih fenolnih spojin močno razlikujejo glede na svojo antioksidativno aktivnost. Pri določanju antioksidativne aktivnosti fermentiranih pirinih semen v celici modelnega organizma S. cerevisiae smo ugotovili, da so vzorci, ki so pokazali antioksidativno aktivnost in vivo, bile predvsem ekstraktibilne frakcije fermentiranih neobdelanih, kaljenih in encimsko obdelanih semen, kjer je spontana fermentacija kaljenih in encimsko obdelanih semen najučinkoviteje znižala znotrajcelično oksidacijo v modelnem organizmu. Očitno je pestrost avtohtone mikrobiote pirinih semen pripomogla k večji raznolikosti nastalih metabolitov, ki so lažje vstopili v celico. Pokazali smo, da nekatere ekstraktibilne in vezane frakcije fermentiranih pirinih semen izkazujejo antioksidativno aktivnost v in vivo sistemu. Gre za pomembno odkritje, saj fenolne spojine samo kaljenih pirinih semen pri izpostavitvi abiotskemu stresu niso vstopile v modelni organizem in niso izkazale antioksidativne aktivnosti in vivo. Fermentacija vključuje sintezo novih spojin, kot tudi encimsko transformacijo že prisotnih različnih bioaktivnih spojin. Naši rezultati so pokazali, da je ključni dejavnik za izkazano antioksidativno aktivnost in vivo za fermentirana neobdelana in kaljena semena razmerje med različnimi fenolnimi spojinami, ki vstopajo v celico. Pri večji količini flavonoidov in manjši količini hidroksicimetnih kislin, ki so prehajale v celico, smo zabeležili nižjo znotrajcelično oksidacijo. Med vezanimi frakcijami sta samo tisti iz spontano fermentiranih in nefermentiranih encimsko obdelanih semen pokazali znižanje znotrajcelične oksidacije. Celični privzem vezanih hidroksicimetnih kislin je bil znatno večji kot pri ekstraktibilnih kislinah, vendar so bile slednje učinkovitejše pri znižanju znotrajcelične oksidacije. Tako lahko sklepamo, da imajo ekstraktibilne fenolne spojine boljšo antioksidativno aktivnost in vivo kot vezane fenolne spojine. Pri drugem sklopu raziskav smo ugotovili, da je kombiniranje biotehnoloških procesov najučinkovitejši način za znatno povečanje vsebnosti ekstraktibilnih in vezanih skupnih in posameznih fenolnih spojin, njihove antioksidativne aktivnosti in vitro ter v nekaterih primerih in vivo. Naši rezultati kažejo, da se lahko fermentacija pirinih semen uporablja za 97 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 izboljšanje vsebnosti fenolnih spojin in antioksidativne aktivnosti, kar bi lahko dodatno izboljšalo njihovo biološko dostopnost. 3.1.3 Vpliv encimske obdelave na vsebnost fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost Tretji biotehnološki proces, s katerim smo biološko obdelali pirina semena, je encimska obdelava. V raziskavi smo z različnimi kombinacijami uporabe celulaz (C), ksilanaz (X), feruloil esteraz (E), α-amilaz (A) in proteaz (P) uspešno sprostili vezane fenolne spojine pirinih semen. Encimske obdelave so izboljšale vsebnost ekstraktibilnih TPC pirinih semen do 5-krat v primerjavi z neobdelanimi semeni, medtem ko se je vsebnost vezanih fenolnih spojin zmanjšala po encimski obdelavi. Med vsemi različnimi encimskimi obdelavami je obdelava pirinih semen z vsemi petimi encimi (C+X+E+A+P) najbolj povečala vsebnost ekstraktibilnih TPC. Naši rezultati so pokazali, da uporaba samo feruloil esteraz pri obdelavi semen ne poveča bistveno ekstraktibilnih TPC, kar nakazuje na to, da uporabljene esteraze niso sposobne samostojno hidrolizirati estrskih povezav med hidroksicimetnimi kislinami in hemicelulozo v pirinih semenih zaradi možne sterične ovire, ki jo povzroča struktura polisaharidov, s čimer je omejena tudi migracija encimov. So pa zato vse tri obdelave, ki so vključevale kombinacijo feruloil esteraz in proteaz, pokazale veliko sposobnost sproščanja vezanih TPC v ekstraktibilne. Ti rezultati potrjujejo, da feruloil esteraze in proteaze sodelujejo pri razgradnji celične stene, tako da feruloil esteraze hidrolizirajo estrsko in etrsko vez med fenolnimi spojinami in strukturnimi komponentami celične stene pirinih semen ter tako sprostijo vezane fenolne spojine (Acosta-Estrada in sod., 2014). Proteaze pa so vključene v hidrolizo strukturnih proteinov, na katere so vezane fenolne spojine, posledično pa se poveča sposobnost sproščanja vezanih TPC iz pirinih semen. Poleg tega so Everette in sod. (2010) pokazali, da številne nefenolne spojine kažejo precejšnjo reaktivnost s Folin-Ciocalteu reagentom, vključno s proteini, ki pa se lahko po svoji reaktivnosti do Folin-Ciocalteu reagenta precej razlikujejo. V nasprotju z našimi pričakovanji smo ugotovili, da so bile obdelave s ksilanazami, esterazami in celulazami, posamezno ali v kombinaciji, manj učinkovite pri sproščanju vezanih TPC. Encimska obdelava ne more v celoti pretvoriti vezanih fenolnih spojin v ekstraktibilno obliko, saj lahko matrica celične stene pirinih semen vsebuje strukturne elemente, ki jih encimi ne morejo hidrolizirati (Moore in sod., 2006). Kaljenje pirinih semen pod abiotskim stresom in fermentacija semen s kvasovko S. cerevisiae sta znatno povečala vsebnosti TPC in njihovo antioksidativno aktivnost glede na neobdelana pirina semena. Rezultati raziskave, kjer smo ugotavljali vpliv encimske obdelave pirinih semen, pa so pokazali, da je encimska obdelava kaljenih in fermentiranih semen dodatno povečala vsebnost ekstraktibilnih TPC v primerjavi s samo kaljenimi oz. fermentiranimi semeni. Omeniti velja še, da je encimska obdelava kaljenih in fermentiranih semen rezultirala v povečanju deleža ekstraktibilnih TPC glede na skupne TPC (ekstraktibilne + vezane) s 34 % na 44 % in z 12 % na 50 %. Rezultati nadalje kažejo, da zaporedna uporaba kaljenja/fermentacije in encimske obdelave (C+X+E+A+P) poleg 98 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 transformacije netopnih fenolnih spojin v topne ekstraktibilne, omogoča oslabitev estrske in etrske vezi med netopnimi fenolnimi spojinami in komponentami celične stene, zaradi česar fenolne spojine, ki so še v netopni obliki, lažje ekstrahiramo in tako določimo njihovo večjo vsebnost. Slednje sovpada z ugotovitvami Bei in sod. (2018). Vse encimske obdelave so povečale vsebnost ekstraktibilne p-kumarne, trans-ferulne, kavne in p-hidroksibenzojske kisline, v primerjavi z neobdelanim vzorcem. Vzorci, ki so pokazali znatno povečanje vsebnosti ekstraktibilne p-kumarne, ferulne in p-hidroksibenzojske kisline (zlasti C+X+E+A+P in C+X+E+P), so bili posebno učinoviti pri lovljenju ABTS•+ radikalov in so vsebovali večjo vsebnost ekstraktibilnih TPC. Smatramo, da so te fenolne kisline znatno prispevale k antioksidativni aktivnosti pirinih semen in da izkazujejo večjo reaktivnost v Folin-Ciocalteu testu. Kombinacija ksilanaz in esteraz je povzročila največje povečanje vsebnosti ekstraktibilne trans-ferulne kisline, saj ksilanaze naključno cepijo β-1,4 ksilansko strukturo, medtem ko so esteraze sposobne sproščati ferulno kislino (Sancho in sod., 2001). Pirini otrobi so bogat vir prehranskih vlaknin, vsebujejo pa tudi okoli 41 % škroba (Escarnot in sod., 2012). Obdelava z α-amilazami je sprostila zelo malo vezanih fenolnih kislin, posledično je vsebnost vezanih fenolnih spojin, še posebej p-kumarne in ferulne kisline, ostala visoka. Predvidevamo, da je možen razlog lokacija škrobnih zrnc v rastlinski celici, saj se nahajajo predvsem v endospermu, večina fenolnih kislin v piri pa je vezanih na neškrobne polisaharide v otrobih. Zanimivo pa je, da je bila vsebnost ekstraktibilnih TPC pri obdelavi z α-amilazami precej visoka, kar je lahko posledica dejstva, da je Folin-Ciocalteu reagent nespecifičen, saj se odziva tudi na reducirajoče sladkorje, ki so produkt aktivnosti α-amilaz. Sočasna uporaba vseh petih encimov je povzročila razgradnjo celuloze, arabinoksilanov, ostalih polisaharidov in proteinov ter posledično zmanjšala molekulsko maso in velikost komponent celične stene, prekinila vezi med komponentami celične stene in fenolnih spojin in tako povečala sproščanje fenolnih spojin iz pirinih semen. Naše ugotovitve se ujemajo z rezultati drugih raziskav, tako so Rakariyatham in sod. (2020) poročali, da je obdelava s celulazami povečala sproščanje o-kumarne kisline. Peixoto Araujo in sod. (2019) so ugotovili, da je obdelava s proteazami in celulazami povečala vsebnost ekstraktibilnih fenolnih kislin, kot sta p-hidroksibenzojska in ferulna kislina. V naši raziskavi je kombinacija kaljenja in encimske obdelave ter fermentacije in encimske obdelave pirinih semen privedla do izjemnega povečanja vsebnosti ekstraktibilne trans-ferulne kisline, za kar 5899 % in 8263 %. Encimsko obdelana kaljena semena so imela največjo absolutno vsebnost ekstraktibilnih fenolnih kislin. Različni encimi so lahko med kaljenjem pirinih semen neposredno ali posredno vključeni v tvorbo ekstraktibilnih fenolnih spojin. Blagi pogoji encimske obdelave (pH 6, 40 °C) v naši raziskavi so bili hkrati idealni za boljšo aktivnost endogenih encimov (esteraze, proteaze, amilaze, itd. ) (Rakariyatham in sod., 2020). Kaljena in fermentirana semena so se, v primerjavi z neobdelanimi pirinimi semeni, izkazala za znatno boljši substrat za obdelavo z eksternimi encimi. Predvidevamo lahko, da so predhodno obdelana pirina semena omogočila dodanim encimom lažji dostop do njihovih substratov kot neobdelana. 99 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Antioksidativne aktivnosti encimsko obdelanih pirinih semen, ki so bile ugotovljene z uporabo ABTS•+ radikalov, so močno pozitivno korelirale z vsebnostjo ekstraktibilnih (r = 0,905) in vezanih (r = 0,778) TPC, medtem ko so bile korelacije med DPPH testom in vsebnostjo ekstraktibilnih (r = -0,155) in vezanih (r = 0,097) TPC zanemarljive. Ti podatki kažejo, da so verjetno polarne fenolne spojine v encimsko obdelanih pirinih semenih glavni lovilci ABTS•+ radikalov. Encimska obdelava je povečala antioksidativno aktivnost semen verjetno s sproščanjem polarnih antioksidantov, vezanih na celično steno, in/ali s hidrolizo biopolimerov, kot so polipeptidi in polisaharidi (Azmir in sod., 2013). Hkrati pa na reaktivnost fenolnih spojin vpliva tudi izbor metode, tako Folin-Ciocalteu test najbolje korelira z ABTS testom, ker sta oba izvedena v rahlo alkalnem vodnem mediju (pH 7,4), medtem ko je DPPH test izveden v metanolu (Abramovič in sod., 2017). Po drugi strani pa nizka korelacija med antioksidativno aktivnostjo, določeno z DPPH testom, in vsebnostjo ekstraktibilnih in vezanih TPC kaže, da fenolne spojine v encimsko obdelanih semenih slabše reagirajo z DPPH reagentom. V naših raziskavah so bile vrednosti antioksidativne aktivnosti, določene z ABTS testom, znatno višje od tistih določenih z DPPH testom. Zaradi visoke vsebnosti p-kumarne in ferulne kisline v biološko obdelanih pirinih semenih so bili dobljeni rezultati pričakovani, saj ABTS•+ radikal bistveno bolje reagira z monofenolnimi spojinami kot DPPH• radikal. Naši razultati so potrdili, da je kombinacija kaljenja oziroma fermentacije z encimsko obdelavo dobra strategija za izboljšanje antioksidativne aktivnosti ekstraktibilnih fenolnih spojin. Glede na raziskavo Wang in sod. (2018) obstajata dve možni razlagi za to: prva je, da smo z encimsko obdelavo (biološko obdelavo) povečali topnost fenolnih spojin iz pirinih semen, druga pa je, da smo pridobili fenolne spojine z večjo antioksidativno aktivnostjo. Pri določanju antioksidativne aktivnosti v celici modelnega organizma S. cerevisiae smo ugotovili, da so samo ekstraktibilne frakcije semen, ki so bila podvržena kombinacijam biotehnoloških procesov, znižale znotrajcelično oksidacijo, medtem ko vezane frakcije encimsko obdelanih kaljenih in fermentiranih semen niso pokazale nobenih statistično značilnih razlik v znotrajcelični oksidaciji v primerjavi s kontrolo. Zanimivo je, da je med vezanimi frakcijami samo encimska obdelava neobdelanih semen pokazala znižanje znotrajcelične oksidacije v kvasovki. Nasprotno, vezane frakcije neobdelanih semen in samo kaljenih semen so celo zvišale znotrajcelično oksidacijo, zato sklepamo, da omenjeni frakciji vsebujeta prooksidativne snovi, ki povečujejo znotrajcelično oksidacijo. Znano je, da z in vitro testi določanja antioksidativne aktivnosti ne moremo predvideti, kakšna bo antioksidativna aktivnost in vivo, to ponazarjajo tudi negativne korelacije med antioksidativno aktivnostjo, določeno z DPPH testom oz. ABTS testom, ter antioksidativno aktivnostjo, določeno v celici kvasovke. Zanimivo je, da večji celični privzem fenolnih spojin ne pomeni nujno tudi večje antioksidativne aktivnosti v celici. Vezana frakcija encimsko obdelanih neobdelanih semen je pokazala nižjo antioksidativno aktivnost v celici modelnega organizma kot pripadajoča ekstraktibilna frakcija, medtem ko je bil celični privzem vezanih hidroksicimetnih kislin, določen s HPLC-MS/MS metodo kot razlika v 100 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 koncentraciji fenolnih kislin pred in po tretiranju kvasnih celic, kar 24-krat višji od ekstraktibilnih. Rezultati kažejo, da ni pomembna samo količina fenolnih spojin, ki vstopajo v celico, ampak tudi oblika (ekstraktibilna/vezana), v kateri vstopijo v celico. Zato je ekstraktibilna oblika fenolnih spojin ključna za vstop v celico. Ugotovili smo, da encimska obdelava fermentiranih semen najbolj zniža znotrajcelično oksidacijo. Očitno fermentacija pirinih semen s kvasovko S. cerevisiae lahko pretvori fenolne kisline v metabolite in nove spojine, ki lažje vstopajo v celico. Poleg tega je dodajanje eksternih encimov po fermentaciji omogočilo še dodatno sproščanje netopnih vezanih fenolnih spojin iz pirinih semen. Naši rezultati so prvič pokazali, da je mogoče encimsko obdelavo uporabiti v kombinaciji z drugimi biotehnološkimi procesi (kaljenje, fermentacija) za povečanje vsebnosti ekstraktibilih fenolnih spojin in njihove antioksidativne aktivnosti in tako izboljšati potencialno biološko dostopnost antioksidantov pirinih semen. Vzorci, ki so bili obdelani z vsemi petimi hidrolitičnimi encimi skupaj, so pokazali znatno izboljšanje vsebnosti ekstraktibilne p-kumarne, ferulne in p- hidroksibenzojske kisline, skupnih fenolnih spojin in učinkovitejšo in vitro antioksidativno aktivnost. Potrebne pa so nadaljnje študije za raziskovanje možne transformacije fenolnih spojin v njihove metabolite, ki imajo večjo antioksidativno aktivnost in lažje vstopajo v celico. Iz tega razloga bi lahko bilo encimsko sproščanje fenolnih spojin uporabno tako v prehrambeni kot tudi nutracevtski industriji. 3.1.4 Vpliv biološke obdelave pirinih semen na biološko dostopnost fenolnih spojin Da bi fenolne spojine pirinih semen imele zdravju koristne učinke, se morajo uspešno sprostiti iz matrice zaužite hrane, hkrati morajo prestati pogoje GI trakta in v tarčnem tkivu nato izkazati bioaktivne lastnosti (Shahidi in Pan, 2021). Biotehnološki procesi (kaljenje, fermentacija, encimska obdelava) dokazano izboljšajo biološko dostopnost fenolov iz žitnih semen. Tako so Koistinen in sod. (2017) ugotovili, da se biološka dostopnost ferulne kisline znatno poveča v kruhu iz biološko obdelanih (fermentacija + encimska obdelava) rženih otrobov v primerjavi s kruhom iz navadnih rženih otrobov (88 % proti 51 %). Prav tako so Anson in sod. (2009) poročali, da je bila kombinacija uporabe eksternih encimov in fermentacije učinkovit pristop, saj je povečala biološko dostopnost ferulne kisline z 1 % na skoraj 6 %. Namen naše raziskave je bil oceniti vpliv različnih tehnik biološke obdelave na izboljšanje biološke dostopnosti fenolnih spojin iz pirinih semen. Uporabili smo in vitro prebavni model, s katerim smo posnemali prebavo v ustih, želodcu in tankem črevesu. Med prebavljenimi vzorci smo največjo vsebnost ekstraktibilnih in vezanih TPC našli pri kaljenih semenih, fermentiranih s S. cerevisiae. Glede na neobdelana prebavljena semena je bila vsebnost ekstraktibilnih TPC za kar 7-krat večja, najverjetneje kot posledica delovanja žitnih in mikrobnih encimov, ki so povzročili strukturno degradacijo celične stene otrobov. Zanimivo, da so samo kaljena semena po prebavi pokazala statistično značilno povečanje vsebnosti ekstraktibilnih TPC (16 %) glede na pripadajoči neprebavljen vzorec. Povečanje vsebnosti ekstraktibilnih fenolnih spojin po prebavi je lahko rezultat prebavnih encimov in 101 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 žolčnih soli, ki delujejo na matrico pirinih semen in tako olajšajo sproščanje vezanih fenolnih spojin v prebavni sok (Zhang in sod., 2017). Poleg tega, prehod iz kislega v alkalno okolje vodi do deprotonacije hidroksilnih skupin aromatskih obročev, kar bi lahko prispevalo k povečanju vsebnosti ekstraktibilnih TPC prebavljenih kaljenih semen (Tomé-Sánchez in sod., 2021). Možen razlog je lahko tudi struktura kaljenih semen, saj je škrob v kaljenih semenih praviloma bolj prebavljiv zaradi encimsko modificirane strukture škrobnih zrn, tankih celičnih sten ter lažje dostopnih mono- in disaharidov. Polisaharidi v celičnih stenah so med kaljenjem hidrolizirani z de novo sintetiziranimi encimi, kar povzroči spremembe v sestavi netopnih in topnih prehranskih vlaknin žitnih semen (Xu in sod., 2021). Vsebnost vezanih TPC se je znatno zmanjšala v skoraj vseh prebavljenih vzorcih v primerjavi z neprebavljenimi. Delež vezanih TPC glede na skupne TPC (ekstraktibilni + vezani) je bil najvišji (80 %) pri prebavljenih neobdelanih semenih in najnižji (51 %) pri prebavljenih encimsko obdelanih semenih, fermentiranih z L. plantarum. Zmanjšanje vsebnosti vezanih TPC v prebavljenih vzorcih kaže na njihovo delno pretvorbo v ekstraktibilno obliko med prebavo, čeprav se kvantitativne spremembe na splošno ne odražajo v povečanju ekstraktibilne frakcije. Do podobnih rezultatov so prišli tudi Ortega in sod. (2011) in Ydjedd in sod. (2017), saj so poročali o znatnem upadu količine prostih fenolnih spojin rožičeve moke po GI prebavi. Poleg tega so Chait in sod. (2020) poročali, da so se po fazi prebave v tankem črevesu vrednosti TPC v topni prosti (-28 %), topni konjugirani (-66 %) in vezani (- 68 %) frakciji rožičeve moke drastično zmanjšale v primerjavi z neprebavljenim vzorcem. Rezultati naše raziskave kažejo, da je vsebnost biološko dostopnih fenolnih spojin v biološko obdelanih semenih znatno večja (do 589 % v “kaljenih + fermentiranih” semenih) kot v neobdelanih semenih. Kombinacija encimske obdelave in fermentacije ima večji vpliv na povečanje vsebnosti ekstraktibilne ferulne kisline v pirinih semenih kot sam proces fermentacije. Na podlagi naših rezultatov predvidevamo, da obdelava pirinih semen z eksternimi hidrolitičnimi encimi poveča dostopnost vezane trans- ferulne kisline za delovanje hidrolitičnih encimov fermentacijskih mikroorganizmov. Med prebavljenimi vzorci so “kaljena + fermentirana” semena pokazala največjo vsebnost vseh identificiranih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih kislin. Zdi se, kot da med kaljenjem pire nastaja oz. se aktivira optimalna količina encimov za de novo sintezo fenolnih spojin in za razgradnjo komponent celične stene, kar poveča tudi vsebnost fermentabilnih virov za mikroorganizme, posledično kaljena semena predstavljalo dober substrat za delovanje mikroorganizmov. Po GI prebavi se je vsebnost vezanih fenolnih kislin zmanjšala v primerjavi z neprebavljenimi vzorci. Prav tako se je vsebnost večine ekstraktibilnih fenolnih kislin zmanjšala v prebavljenih vzorcih. Po drugi strani pa se je vsebnost ekstraktibilne trans-ferulne kisline povečala po prebavi v “kaljenih + fermentiranih” semenih za 25 %, prav tako sta se po prebavi povečali vsebnosti ekstraktibilne kavne (33 %) in p-hidroksibenzojske (73 %) kisline v “kaljenih + encimsko obdelanih” semenih. Po GI prebavi se je vsebnost trans- in cis-ferulne kisline drastično zmanjšala v nekaterih biološko obdelanih semenih. Izguba trans-ferulne kisline po prebavi 102 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 je bila od 69 % (“kaljena + encimsko obdelana” semena) do 91 % (encimsko obdelana semena) v primerjavi s pripadajočimi neprebavljenimi vzorci. Drastične izgube fenolnih kislin po GI prebavi so verjetno posledica spremembe v molekulski strukturi fenolnih kislin zaradi različnih kemijskih reakcij, predvsem oksidacije in polimerizacije, in zaradi encimskega delovanja, posledično lahko pride do spremembe v njihovi topnosti (Ortega in sod., 2011). Pomembno je, da so semena biološko obdelana, saj pri prebavi prihaja do velikih izgub. Če imajo naši biološko obdelani vzorci znatno večjo izhodiščno vsebnost fenolnih kislin kot neobdelani vzorec, bo posledično več fenolnih spojin prestalo proces prebave. Tako so imela po prebavi biološko obdelana semena znatno večjo vsebnost ekstraktibilne trans- ferulne kisline in sicer od 7-krat (fermentirana semena) do 140-krat (“kaljena + fermentirana” semena) v primerjavi z neobdelanimi semeni. Med prebavljenimi vzorci so dale kombinacije tehnik več ekstraktibilnih fenolnih kislin kot neobdelana semena ali tista, obdelana zgolj s posamezno tehniko biološke obdelave. Antioksidativne lastnosti fenolnih spojin se lahko spremenijo zaradi kemijskih transformacij, ki so posledica različnih mehanizmov med GI prebavo. V primerjavi z neobdelanimi semeni so biotehnološki procesi znatno povečali sposobnost lovljenja DPPH• in ABTS•+ radikalov ekstraktibilnih frakcij prebavljenih vzorcev. Po prebavi so bile DPPH vrednosti ekstraktibilnih fenolnih spojin v “kaljenih + fermentiranih” semenih 21-krat večje, medtem ko so bile DPPH vrednosti vezanih fenolnih spojin 2-krat večje kot v prebavljenih neobdelanih semenih. Ista kombinacija tehnik biološke obdelave semen je bila optimalna tudi pri ABTS testu, vendar pa je potrebno poudariti, da relativno povečanje ni bilo primerljivo z DPPH metodo. Ekstraktibilna frakcija “kaljenih + fermentiranih” semen je pokazala 4,6-krat večjo reaktivnosti proti ABTS•+ radikalu, medtem ko je vezana frakcija pokazala 1,4-krat večjo reaktivnost kot prebavljena neobdelana semena. Dobljeni rezultati kažejo na spremembe v sestavi ekstraktov med simulirano in vitro prebavo, saj so antioksidanti istega ekstrakta pokazali drugačen odziv proti različnim prostim radikalom v primerjavi z neobdelanimi semeni. Podobne razlike smo opazili tudi, ko smo prebavljene vzorce primerjali z neprebavljenimi. Na primer, DPPH vrednosti ekstraktibilnih fenolnih spojin kaljenih semen so pokazale veliko povečanje (63 %) po GI prebavi glede na neprebavljen vzorec, medtem ko je bilo povečanje ABTS vrednosti po prebavi zanemarljivo (2 %). Večjo antioksidativno aktivnost po prebavi bi lahko pripisali spremembam pH in deprotonaciji hidroksilnih skupin, prisotnih na aromatskih obročih fenolnih spojin (Chait in sod., 2020). To bi lahko bilo povezano tudi s strukturnimi spremembami molekul fenolnih spojin ali s sproščanjem novih spojin z večjo antioksidativno aktivnostjo (Chait in sod., 2020). Drugi biološko obdelani vzorci so pokazali zmanjšanje sposobnosti lovljenja DPPH• in ABTS•+ radikalov ekstraktibilnih fenolnih spojin, z največjim zmanjšanjem 70 % pri “fermentiranih + encimsko obdelanih” semenih v primerjavi z neprebavljenimi vzorci. Upad antioksidativne aktivnosti med prebavo je lahko posledica nižje vsebnosti skupnih fenolnih spojin oz. dejstva, da je mogoče nekatere fenolne spojine pretvoriti v različne derivate z različnimi kemijskimi lastnostmi, zaradi njihove občutljivosti na nevtralni pH v fazi prebave 103 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 v tankem črevesu (Ydjedd in sod., 2017). Poleg možnih medmolekulskih interakcij (vodikove vezi) fenolnih kislin s topilom v reakcijski mešanici, ki lahko zmanjšajo njihovo reaktivnost v antioksidativnih testih, lahko fenolne kisline tvorijo tudi intramolekularne vodikove interakcije, kar lahko vpliva na prenos vodikovega atoma do prostega radikala (Terpinc in Abramovič, 2010). Antioksidativna aktivnost fenolnih spojin je odvisna od njihove molekulske strukture. Dokazano je, da CH=CH-COOH skupina hidroksicimetnih kislin zagotavlja večjo sposobnost prenosa vodikovega atoma in posledično stabilizacijo radikalov kot karboksilna (COOH) skupina hidroksibenzojskih kislin (Rice-Evans in sod., 1996). Ekstrakti žitaric so zelo kompleksne mešanice številnih različnih spojin z različnimi aktivnostmi. Po in vitro prebavi se je del fenolnih spojin iz pirinih semen sprostil v supernatant in te molekule so predstavljale biološko dostopne fenolne spojine, ki jih naše telo lahko absorbira. “Kaljena + fermentirana” semena so pokazala najvišjo biološko dostopnost TPC (37,4 %), poleg tega so ta semena pokazala tudi najvišjo vsebnost biološko dostopnih (ekstraktibilnih) fenolnih kislin in flavonoidov, kvantificiranih s HPLC-MS/MS. Najnižjo biološko dostopnost TPC so pokazala neobdelana semena (18,4 %). Manjšo biološko dostopnost fenolnih spojin v neobdelanih semenih pripisujemo dejstvu, da je večina fenolih spojin v rastlinah konjugiranih z drugimi molekulami, kot so ogljikovi hidrati, celuloza in lignin, ki so odporni na prebavo. Pokazali smo, da biološka obdelava pirinih semen poveča biološko dostopnost fenolnih spojin za najmanj 47 % (“fermentirana + encimsko obdelana” semena) pa vse do 103 % (“kaljena + fermentirana” semena) v primerjavi z neobdelanimi semeni. Del fenolnih spojin je po prebavi ostal v prebavljenem ostanku pirinih semen, kar kaže, da niso biološko dostopni, vendar pa so biološko stabilni (vezani fenoli), saj preživijo proces prebave. Pri neobdelanih semenih smo opazili znatno višjo biološko stabilnost fenolnih spojin v primerjavi z biološko obdelanimi semeni. Biološka stabilnost TPC v neobdelanih semenih je bila od 31 % do 141 % večja kot v biološko obdelanih semenih. Čeprav so imela neobdelana semena najvišji odstotek biološko stabilnih fenolnih spojin, je bila vsebnost biološko stabilnih fenolnih spojin v "kaljenih + fermentiranih" semenih znatno večja (2-krat) kot v neobdelanih semenih. Bolj kot so fenolne spojine stabilne med GI prebavo, več jih vstopa naprej v debelo črevo, kjer jih prisotna mikrobiota presnavlja v produkte, ki jih naše telo lažje absorbira. Vendar pa so Ren in sod. (2022) poročali, da je večina fenolnih spojin z več hidroksilnimi skupinami nestabilnih. Eden od načinov za izboljšanje biološke dostopnosti oz. stabilnosti fenolnih spojin je s pomočjo njihove inkapsulacije (Peanparkdee in Iwamoto, 2022). Biološka dostopnost posameznih fenolnih kislin se med različno biološko obdelanimi pirinimi semeni zelo razlikuje. Biološka obdelava semen s fermentacijo in encimsko obdelavo, posamezno ali v kombinaciji, je pokazala največjo biološko dostopnost p-kumarne kisline, vendar pa je bila količina biološko dostopne p-kumarne kisline po prebavi največja pri “kaljenih + fermentiranih” semenih. V primeru trans- ferulne kisline so se še posebej izkazale kombinacije dveh različnih tehnik biološke obdelave, ki so njeno biološko dostopnost povečale za od 24-krat (“kaljena + encimsko obdelana” semena) 104 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 do 63-krat (“encimsko obdelana + fermentirana” semena) v primerjavi z neobdelanimi semeni. Podobne rezultate so opazili tudi Anson in sod. (2009), ki so poročali, da je bila najučinkovitejša tehnika biološke obdelave kombinacija fermentacije in encimske obdelave pšeničnih otrobov, saj je povečala biološko dostopnost ferulne kisline za 5-krat v primerjavi z nativnimi otrobi. Med fenolnimi kislinami je p-hidroksibenzojska kislina pokazala največjo biološko dostopnost, do 57 %. Več avtorjev je izpostavilo, da na stabilnost fenolnih spojin med procesom GI prebave močno vpliva njihova kemijska struktura, saj imajo fenolne spojine različno občutljivost na variacije pH in aktivnost prebavnih encimov (Goulas in Hadjisolomou, 2019; Lima in sod., 2019). Po prebavi je največji odstotek fenolnih kislin ostal biološko stabilen v neobdelanih semenih, kar je skladno s stabilnostjo TPC. Ker neobdelana semena niso predhodno obdelana z biotehnološkimi procesi, ostaja substrat težje dostopen za prebavne encime. Posledično imajo neobdelana semena največji delež fenolnih spojin, vezanih na različne komponente celične stene. Sęczyk in sod. (2021) so poročali, da so matrice z visoko vsebnostjo netopnih prehranskih vlaknin in proteinov pokazale močnejše interakcije s fenolnimi spojinami in manjšo prebavljivost. Nadalje so Xu in sod. (2020) poročali, da neškrobni polisaharidi ščitijo nanje vezane fenolne spojine pred encimi v ustih, želodcu in tankem črevesu. Na splošno sta p-kumarna in trans-ferulna kislina pokazali največjo biološko stabilnost, medtem ko je p-hidroksibenzojska kislina pokazala najmanjšo stabilnost. Tomé-Sánchez in sod. (2021) so poročali, da imajo derivati ferulne kisline ječmenovih in pšeničnih kalčkov visoko stabilnost na prebavne pogoje. Kljub bistvenemu povečanju biološke dostopnosti fenolnih kislin, doseženim z uporabo različnih biotehnoloških procesov, je večji del fenolnih kislin ostal v biološko nedostopni (stabilni) obliki, ki nadalje vstopa v debelo črevo. V debelem črevesu naj bi fermentacija komponent celične stene z delovanjem bakterijskih encimov olajšala sproščanje fenolnih kislin, ki v tankem črevesu niso bile dostopne. Zato je pomembno razumeti, kako proces prebave vpliva na strukturo in stabilnost fenolnih spojin, saj to posledično vpliva na njihovo biološko dostopnost in možne koristne učinke v celicah črevesnega epitelija (Correa-Betanzo in sod., 2014). Zeng in sod. (2016) so poročali, da je bila vsebnost biološko dostopnih fenolnih spojin v pšenici manjša kot pri rjavem rižu in ovsu kljub večji vsebnosti TPC in močneje izraženi antioksidativni aktivnosti. To nakazuje, da žita z največjo vsebnostjo fenolnih spojin niso nujno tista z najvišjo biološko dostopnostjo. Zdi se, da je žitna matrica ključni dejavnik pri prebavljivosti in stabilnosti fenolnih spojin med prebavo. Čeprav je ferulna kislina najpogostejša fenolna spojina v piri, je bila v naši raziskavi njena biološka dostopnost (maks. 6,3 %) znatno nižja od biološke dostopnosti TPC (maks. 37,4 %). Možen razlog za tako veliko razliko v dostopnosti je, da je bila identiteta številnih spojin, prisotnih v supernatantu prebavljenih vzorcev, neznanih. Biotehnološki procesi (kaljenje/fermentacija/encimska obdelava), katerih cilj je izboljšati biološko dostopnost fenolnih spojin iz žitnih izdelkov, so lahko obetaven pristop k izboljšanju zdravja ljudi na sistemski ravni. Naša raziskava je pokazala statistično značilen učinek biotehnoloških procesov na povečanje vsebnosti biološko dostopnih skupnih, 105 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 posameznih fenolnih spojin in njihove antioksidativne aktivnosti v primerjavi z neobdelanimi semeni. Kombinacija biotehnoloških procesov, zlasti kaljenja in fermentacije, je bila najučinkovitejša metoda za drastično povečanje vsebnosti skupnih in posameznih biološko dostopnih fenolnih spojin in njihove antioksidativne aktivnosti. Biološka dostopnost p-kumarne in trans-ferulne kisline pa je bila največja pri »encimsko obdelanih + fermentiranih« semenih. Uporaba modela in vitro prebave je omogočila podrobnejši vpogled v posamezne fenolne spojine pirinih semen, ki so človeku dejansko dostopne. Vendar pa se je v naši študiji potrdilo, da se v žitih večina fenolnih spojin nahaja v vezani obliki in se ne sprostijo med GI prebavo, temveč šele v debelem črevesu. Poudariti je potrebno, da naša simulacija prebave ni zajela pomembne stopnje - fermentacije v debelem črevesu, kjer so fenolne spojine podvržene metabolizmu s strani naravno prisotne črevesne mikrobiote. 3.2 PRISPEVEK K RAZVOJU ZNANOSTI Pridobljene informacije se lahko uporabljajo za izboljšanje prehranske vrednosti kruha in drugih izdelkov iz žit. Kolikor nam je znano, nobena raziskava o vplivu biotehnoloških procesov na izboljšanje dostopnosti fenolnih spojin iz rastlinskega materiala ni zajemala tako širokega spektra biotehnoloških procesov, optimizacije posameznih tehnik in njihovih kombinacij. Prav tako smo pridobljenim ekstraktom poleg in vitro antioksidativne aktivnosti določali še antioksidativno aktivnost v celičnem organizmu S. cerevisiae, ki nam daje vpogled v živo celico. Z namenom omejevanja številnih kroničnih bolezni različne zdravstvene organizacije doma (Nacionalni program o prehrani in telesni dejavnosti za zdravje 2015-2025) in po svetu (poročilo Svetovne zdravstvene organizacije za obdobje 2012-2016) spodbujajo večje uživanje polnozrnatih izdelkov. Ravno v vključevanju biotehnološko obdelanih semen v živila, ki jih uživamo na dnevni ravni, vidimo velik potencial za vnos bioaktivnih komponent, ki so tekom procesiranja žit sicer praviloma odstranjena. Menimo, da bodo rezultati doktorske disertacije pomembno dopolnili področje izboljšanja biološke dostopnosti fenolnih spojin iz semen žit. Izsledki raziskave odpirajo možnosti za razvoj funkcionalnih živil, saj ravno s hranili osiromašena hrana znatno pripomore k večji pojavnosti kroničnih bolezni. S tem bi prispevali k večjemu vnosu antioksidantov v telo, posledično pa bi pozitivno vplivali na svoje zdravje. Kaljenje, fermentacija in encimska obdelava pirinih semen znatno povečajo dostopnost fenolnih spojin na varen, poceni in tehnološko enostaven način, zaradi naravnega pristopa pa nenazadnje verjamemo tudi, da bi bili potencialni izdelki z izboljšano prehransko vrednostjo dobro sprejeti med potrošniki. 3.3 SKLEPI Hipotezo, da kaljenje pirinih semen pod abiotskim stresom pripomore k izboljšanju antioksidativne aktivnosti, smo delno potrdili. Potrebno je poudariti, da vsi pogoji abiotskega stresa niso rezultirali v izboljšanju antioksidativne aktivnosti v primerjavi s kontrolo in da so bili praviloma učinkovitejši, če smo se odločili za souporabo različnih vrst abiotskega 106 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 stresa. Kaljenje pirinih semen ob dodatku 25 mM NaCl po 48 h in 50 mM sorbitola po 96 h, brez aplicirane mehanske poškodbe je znatno pripomoglo tako k povečanju vsebnosti ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin, kot tudi k učinkovitejšemu lovljenju prostih radikalov DPPH•, ABTS•+, O •- 2 v primerjavi s kontrolo. Medtem, ko je kaljenje pri povišani slanosti in osmolarnosti z apliciranim mehanskim stresom rezultiralo v najboljši antioksidativni učinkovitosti vezane frakcije pri lovljenju ROO• radikalov v emulziji. Hipotezo, da je učinkovitost fermentacije z namenom povečanja vsebnosti fenolnih antioksidantov večja z uporabo izbranih mikroorganizmov (kvasovk, MKB) kot v primeru spontane fermentacije, nismo potrdili. Učinkovito fermentacijo smo dosegli tudi brez inokuliranih mikroorganizmov, saj smo pri vseh vrstah fermentacij opazili sproščanje CO2 in vzorcem po zaključku poskusa določili znatno višjo kislost v primerjavi z nefermentiranimi semeni. Čeprav je bila koncentracija MKB in kvasovk pri spontani fermentaciji manjša kot pri fermentaciji z inokuliranimi MKB L. plantarum in kvasovkami S. cerevisiae, se to neposredno ni izrazilo v vsebnosti fenolnih spojin. Pri kaljenih semenih je spontana fermentacija pokazala najmanjšo vsebnost ekstraktibilnih in vezanih TPC, v encimsko obdelanih semenih je pokazala najmanjšo vsebnost vezanih posameznih fenolnih kislin, a največjo vsebnost ekstraktibilnih TPC, hkrati pa je rezultirala v največjem povečanju vsebnosti vezane p-hidroksibenzojske kisline v neobdelanih semenih. Pestrost avtohtone mikrobiote pirinih semen povzroča nastanek raznolikih metabolitov, ki lažje vstopajo v celico, saj je spontana fermentacija kaljenih in encimsko obdelanih semen najučinkoviteje znižala znotrajcelično oksidacijo. Hipotezo, da kaljenje in fermentacija učinkujeta sinergistično na povečanje dostopnosti fenolnih spojin, smo potrdili. Kombinacija kaljenja in fermentacije je imela vzajemen učinek, saj kaljenje prispeva k večji količini fermentabilnih snovi (sladkor, dušik), hkrati pa oba procesa pripomoreta k večji koncentraciji in aktivnosti hidrolitičnih encimov. Največjo vsebnost posameznih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin ter biološko dostopnih TPC smo med vsemi poskusi določili pri kaljenih semenih, fermentiranih s kvasovko S. cerevisiae. Hipotezo, da so vsebnosti posameznih fenolnih spojin odvisne od pogojev fermentacije in kaljenja, smo potrdili. Različni stresni pogoji med kaljenjem značilno vplivajo na vsebnost posameznih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin ter na njihove medsebojne transformacije. Nadalje smo ugotovili, da na vsebnost posameznih fenolnih spojin vpliva tako tip fermentacije, kot tudi vrsta substrata (neobdelano, kaljeno, encimsko obdelano seme). Pri kaljenih semenih je uporaba S. cerevisiae najučinkoviteje povečala vsebnost ekstraktibilne p-kumarne in trans-ferulne kisline. Največje povečanje vsebnosti ekstraktibilne p-hidroksibenzojske kisline smo našli v kaljenih semenih, sočasno fermentiranih z L. plantarum in S. cerevisiae. Fermentacija kaljenih semen je praviloma rezultirala v zmanjšanju vsebnosti vezane p- kumarne in trans-ferulne kisline, največje povečanje količine vezane cis-ferulne in kavne kisline smo našli pri kaljenih semenih, fermentiranih s S. cerevisiae, medtem ko je fermentacija z L. plantarum rezultirala v 107 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 največjem povečanju vsebnosti p-hidroksibenzojske kisline. Uporaba različnih mikroorganizmov specifično vpliva tudi na pH, ki lahko posledično predstavlja optimalno okolje za delovanje različnih encimov, ki razgrajujejo celično steno in izvirajo iz kaljenih pirinih semen. Hipotezo, da antioksidativna aktivnost, določena v celicah kvasovke S. cerevisiae, ni v korelaciji z antioksidativno aktivnostjo, določeno z različnimi in vitro testi, smo potrdili. Korelacije med i n vitro antioksidativno aktivnostjo pirinih semen, kaljenih pod različnimi stresnimi pogoji, in zmanjšanjem znotrajcelične oksidacije (ICO) v kvasovki nismo ugotovili. Tudi pri fermentiranih vzorcih korelacije med in vitro in in vivo antioksidativno aktivnostjo nismo našli. Močne pozitivne korelacije smo določili zgolj med vrednostmi DPPH in zmanjšanjem ICO ekstraktibilne frakcije neobdelanih semen; med vrednostmi ABTS in zmanjšanjem ICO ekstraktibilne frakcije encimsko obdelanih semen in med vrednostmi DPPH oz. ABTS ter zmanjšanjem ICO vezane frakcije kaljenih semen. Prav tako pri encimsko obdelanih vzorcih nismo ugotovili korelacije med in vitro in in vivo antioksidativno aktivnostjo. Glavni namen doktorske disertacije je bil z različnimi biotehnološkimi procesi izboljšati dostopnost vezanih fenolnih spojin, ki prevladujejo v pirinih semenih. Z uspešno uporabo biotehnoloških procesov smo v sklopu štirih zastavljenih poskusov ugotovili:  Biosinteza in transformacija fenolnih spojin je odvisna od specifičnih stresnih razmer med kaljenjem. V kombinaciji z ustreznimi pogoji abiotskega stresa je kaljenje pirinih semen pri 25 °C ob dodatku 25 mM NaCl in 50 mM sorbitola brez aplicirane mehanske poškodbe znatno pripomoglo k povečanju vsebnosti ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin in k učinkovitejšem lovljenju prostih radikalov (DPPH•, ABTS•+, O •- 2 , ROO•), kot če so semena kalila brez stresa.  Glavne identificirane fenolne spojine kaljenih pirinih semen ne morejo direktno vstopiti v celico modelnega organizma S. cerevisiae in jo zaščititi pred oksidacijo.  Kombiniranje fermentacije s kaljenjem ali encimsko obdelavo je sinergistično povečalo vsebnost ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin ter njihove antioksidativne aktivnosti.  Največjo absolutno vsebnost ekstraktibilnih in vezanih posameznih fenolnih kislin smo določili pri kaljenih pirinih semenih, fermentiranih s S. cerevisiae. Poleg tega je uporaba kvasovke omogočila tudi največji relativni prirast identificiranih spojin in sicer ekstraktibilne trans-ferulne kisline (2922 %) v primeru kaljenih pirinih semen in vezane cis-ferulne kisline (466 %) v primeru neobdelanih semen.  Antioksidativna aktivnost fermentiranih semen, določena v celicah kvasovke S. cerevisiae, praviloma ni bila v korelaciji z in vitro a ntioksidativno aktivnostjo. Vzorci, ki so pokazali antioksidativno aktivnost in vivo, so bile predvsem ekstraktibilne frakcije fermentiranih neobdelanih, kaljenih in encimsko obdelanih semen. 108 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022  Obdelava pirinih semen z vsemi petimi hidrolitičnimi encimi hkrati je najbolj povečala vsebnost ekstraktibilnih TPC. Encimska obdelava kaljenih in fermentiranih pirinih semen je izrazito povečala ekstraktibilne TPC v primerjavi s samo kaljenimi oz. fermentiranimi semeni. Dodatek encimov k delno modificiranim vzorcem je rezultiral v povečanem deležu ekstraktibilnih TPC glede na skupne (ekstraktibilne + vezane) TPC in sicer s 34 % na 44% pri kaljenih in z 12 % na 50 % pri fermentiranih semenih.  Kombinacija kaljenja in encimske obdelave ter fermentacije in encimske obdelave semen je privedla do velikega povečanja vsebnosti ekstraktibilne trans- ferulne kisline, za kar 5899 % in 8263 %. Samo ekstraktibilne frakcije encimsko obdelanih neobdelanih, kaljenih in fermentiranih semen ter vezana frakcija encimsko obdelanih neobdelanih semen so znižale znotrajcelično oksidacijo.  Vsebnost biološko dostopnih TPC v kaljenih semenih, fermentiranih s S. cerevisiae, je bila kar 7-krat višja kot pri prebavljenih neobdelanih semenih. Prav tako je isti vzorec pokazal največjo vsebnost vseh identificiranih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih kislin med prebavljenimi vzorci. Pri neobdelanih semenih smo resda opazili znatno večjo biološko stabilnost fenolnih spojin, a hkrati je bilo slednjih koncentracijsko 2-krat manj kot v »kaljenih + fermentiranih« semenih. Med GI prebavo prihaja do velikih izgub tako ekstraktibilnih kot tudi vezanih fenolnih spojin, zato je pomembno, da so semena biološko obdelana. Znatno večja izhodiščna vsebnost fenolnih spojin v tako pripravljenih vzorcih sovpada z večjo količino fenolnih spojin, ki bo uspešno prešla proces prebave. 109 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 4 POVZETEK (SUMMARY) 4.1 POVZETEK Pira predstavlja pomemben vir vlaknin in nanje vezanih antioksidantov. Glavni predstavniki fenolnih spojin v pirinih semenih so ferulna, p-kumarna, kavna in p-hidroksibenzojska kislina. Te fenolne kisline imajo nizko biološko dostopnost, saj so v večini vezane na strukturne elemente celične stene. Da bi izkazale svoje blagodejne učinke na zdravje, se morajo fenolne spojine sprostiti iz matrice hrane in biti dostopne v prebavilih. Biološka obdelava živil lahko učinkovito izboljša dostopnost zaužitih bioaktivnih spojin. Čeprav je bil vpliv nekaterih biotehnoloških procesov na sproščanje vezanih fenolnih spojin in na njihovo dostopnost predhodno že raziskan, smo v naši raziskavi uporabo biotehnoloških procesov in njihovih kombinacij močno razširili, prav tako smo poleg določanja antioksidativne aktivnosti in vitro, ugotavljali antioksidativno aktivnost v celicah kvasovke S. cerevisiae, s čimer smo dobili vpogled v živo celico. Uporaba biotehnoloških procesov (kaljenja, fermentacije, encimske obdelave) predstavlja nove načine za izboljšanje dostopnosti bioaktivnih spojin ter ponuja določene prednosti, saj so stroškovno in energetsko učinkoviti ter okolju prijazni. Kaljenje je proces, ki zmehča strukturo zrna, zmanjša vsebnost antinutrientov in izboljša biološko dostopnost prehransko pomembnih komponent. Zato je bil cilj prvega sklopa raziskav s kaljenjem pirinih semen pod različnimi stresnimi pogoji povečati vsebnost ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin. Ugotovili smo, da kaljenje semen pri 25 °C ob dodatku 25 mM NaCl in 50 mM sorbitola brez aplicirane mehanske poškodbe znatno pripomore k povečanju vsebnosti ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin in njihove antioksidativne aktivnosti in vitro. Fenolne spojine kaljenih semen niso pokazale antioksidativne aktivnosti v celici modelnega organizma S. cerevisiae, ker identificirane spojine v intaktni obliki niso mogle vstopiti v celico in jo zaščititi pred oksidacijo. Ugotovili smo, da različni stresni pogoji med kaljenjem značilno vplivajo na vsebnost posameznih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin. V drugem sklopu raziskav smo ugotavljali vpliv različnih tipov fermentacije (mlečnokislinske, alkoholne, kombinirane, spontane) na vsebnost ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin in na njihovo in vitro in in vivo antioksidativno aktivnost. Nadalje smo želeli ugotoviti, ali lahko kombiniranje biotehnoloških procesov še dodatno poveča izplen fenolnih spojin in učinkovitost pridobljenih antioksidantov. Vsebnost ekstraktibilnih fenolnih spojin se je v primerjavi z nefermentiranimi vzorci bistveno povečala neodvisno od izbranih pogojev fermentacije. Kombiniranje biotehnoloških procesov je sinergistično povečalo vsebnost ekstraktibilnih in vezanih antioksidantov. Največjo absolutno vsebnost posameznih ekstraktibilnih in vezanih fenolnih spojin in in vitro antioksidativno aktivnost smo v primeru kaljenih semen določili z uporabo S. cerevisiae, medtem ko je bila za encimsko obdelana semena najučinkovitejša fermentacija z L. plantarum (samostojno ali v kombinaciji s S. 110 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 cerevisiae). Med ekstraktibilnimi spojinami se je relativno najbolj povečala vsebnost trans- ferulne kisline, in to za kar 2922 % v kaljenih semenih, fermentiranih s S. cerevisiae. Pri vezanih fenolnih spojinah pa se je najbolj povečala količina cis- ferulne kisline, za 466 % v neobdelanih semenih, prav tako fermentiranih zgolj s S. cerevisiae. Antioksidativna aktivnost in vitro praviloma ni bila v korelaciji z antioksidativno aktivnostjo, določeno v celicah kvasovke. Vzorci, ki so pokazali antioksidativno aktivnost in vivo, so bile predvsem ekstraktibilne frakcije fermentiranih neobdelanih, kaljenih in encimsko obdelanih semen. Spontana fermentacija kaljenih in encimsko obdelanih vzorcev je najbolj učinkovito znižala znotrajcelično oksidacijo. Celični privzem vezanih hidroksicimetnih kislin je bil znatno večji kot privzem ekstraktibilnih kislin; vendar so bile slednje učinkovitejši antioksidanti v in vivo sistemu. Glede na našo študijo predvidevamo, da bi se fermentacija pirinih semen lahko uporabila za izboljšanje vsebnosti, antioksidativne aktivnosti in celičnega privzema fenolnih spojin. Tretji sklop raziskav prikazuje pristop, pri katerem obdelava s specifičnimi encimi (celulaze, ksilanaze, feruloil esteraze, proteaze, α-amilaze) posamezno ali v kombinaciji znatno izboljša vsebnost ekstraktibilnih TPC in njihovo in vitro antioksidativno aktivnost. Semena, obdelana z vsemi petimi encimi naenkrat, so imela znantno povečano vsebnost ekstraktibilne p-kumarne, trans-ferulne in p-hidroksibenzojske kisline, ekstraktibilnih TPC, prav tako so bila še posebno učinkovita pri lovljenju ABTS•+ radikalov. Najučinkovitejši način za sproščanje večjih količin vezanih fenolnih spojin v ekstraktibilno obliko je bilo kombiniranje biotehnoloških procesov. Pri kaljenih in fermentiranih semenih je encimska obdelava povzročila znatno povečanje vsebnosti ekstraktibilnih TPC in njihove in vitro antioksidativne aktivnosti, prav tako se je povečala vsebnost posameznih fenolnih kislin. Zaradi kombiniranja kaljenja in encimske obdelave se je vsebnost ekstraktibilne trans- ferulne kisline povečala za kar 5899 % v primerjavi s kaljenimi semeni, pri kombiniranju fermentacije in encimske obdelave pa za kar 8263 % v primerjavi s fermentiranimi semeni. Hkati pa je encimska obdelava kaljenih in fermentiranih pirinih semen negativno vplivala na vsebnost vezanih fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost, kljub temu je ta oblika še vedno predstavljala prevladujoč delež skupnih fenolnih spojin. Med ekstraktibilnimi frakcijami so encimsko obdelana neobdelana, kaljena in fermentirana semena izkazala antioksidativno aktivnost v celici, medtem ko so med vezanimi frakcijami to lastnost izkazala le encimsko obdelana neobdelana semena. Vpliv posameznih biotehnoloških procesov in njihovih kombinacij na izboljšanje biološke dostopnosti fenolnih spojin iz pirinih semen smo ugotavljali z uporabo statičnega in vitro prebavnega modela, s katerim smo posnemali prebavo v ustih, želodcu in tankem črevesu. Raziskava je pokazala statistično značilen vpliv biotehnoloških procesov na vsebnost biološko dostopnih TPC, posameznih fenolnih spojin in njihovo antioksidativno aktivnost, kljub temu, da je med procesom prebave prišlo do velikih izgub fenolnih spojin. Neobdelana semena so imela najmanjšo vsebnost biološko dostopnih TPC in posameznih fenolnih spojin. 111 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Kombinacija biotehnoloških procesov, zlasti kaljenja in alkoholne fermentacije, se je izkazala za najučinkovitejši pristop. Biološka dostopnost p- kumarne in trans- ferulne kisline je bila največja pri encimsko obdelanih semenih, fermentiranih z L. plantarum, medtem ko je bila njuna absolutna vsebnost največja v kaljenih semenih, fermentiranih s S. cerevisiae. Največjo biološko stabilnost fenolnih spojin smo po pričakovanju določili v neobdelanih semenih, kjer so bili substrati slabše dostopni za prebavne encime. Izkazalo se je, da imajo biološko obdelana semena bistveno večjo začetno vsebnost fenolnih kislin kot neobdelana, posledično jih tudi več vstopa v debelo črevo. 4.2 SUMMARY Spelt is an important source of dietary fiber and antioxidants bound to it. The main representatives of phenolic compounds in spelt seeds are ferulic, p-coumaric, caffeic and p- hydroxybenzoic acids. These phenolic acids have low bioaccessibility, since they are mostly bound to the structural elements of the cell wall. To exert their health-promoting effects, phenolic compounds must be released from the food matrix and be accessible in the digestive system. Bioprocessing of foods can effectively improve the accessibility of ingested bioactive compounds. Although the influence of some biotechnological processes on the release of bound phenolic compounds and their accessibility has been studied previously, our research has greatly expanded the use of biotechnological processes and their combinations, and in addition to determining antioxidant activity in vitro, we have determined cellular antioxidant activity in yeast S. cerevisiae, which provides insight into the living cell. The use of biotechnological processes (germination, fermentation, enzymatic treatment) represents a new way to improve the accessibility of bioactive compounds and offers certain advantages, as they are cost and energy efficient and environmentally friendly. Germination is a process that softens seed structure, reduces the content of antinutrients, and improves bioaccessibility of nutritionally important components. Therefore, the aim of the first series of research was to increase the content of extractable and bound phenolic compounds by germination of spelt seeds under different stress conditions. We found that germination of seeds at 25 °C with the addition of 25 mM NaCl and 50 mM sorbitol solutions without applied mechanical damage significantly increased the content of extractable and bound phenolic compounds and their antioxidant activity in vitro. The phenolic compounds of the germinated seeds did not show antioxidant activity in the cell of the model organism S. cerevisiae, because the identified compounds in their intact form could not enter the cell and protect it from oxidation. We found that different stress conditions during germination typically affect the content of individual extractable and bound phenolic compounds. In the second set of research experiments, we determined the influence of different types of fermentation (lactic acid, alcoholic, combined, spontaneous) on the content of extractable and bound phenolic compounds and on their in vitro and in vivo antioxidant activity. 112 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Furthermore, we also determined whether the combination of biotechnological processes can further increase the yield of phenolic compounds and their antioxidant activity. The content of extractable phenolic compounds increased significantly compared to non-fermented samples, regardless of the selected fermentation conditions. The combination of biotechnological processes had synergistic effects on increasing the content of extractable and bound antioxidants. The highest absolute content of individual extractable and bound phenolic compounds and in vitro antioxidant activity were obtained after fermentation of germinated seeds with S. cerevisiae, while for enzymatic treated seeds, fermentation with L. plantarum (alone or in with S. cerevisiae) was the most effective. Among extractable phenolic compounds, the content of trans-ferulic acid increased relatively the most in the germinated seeds fermented with S. cerevisiae, by 2922%. Among bound phenolic compounds, content of cis-ferulic acid increased the most in the raw seeds fermented with S. cerevisiae, by 466%. Antioxidant activity in vitro generally did not correlate with antioxidant activity determined in yeast cells. The samples that showed antioxidant activity in vivo were mainly the extractable fractions of fermented raw, germinated and enzymatic treated seeds. Spontaneous fermentation of germinated and enzymatic treated samples most effectively decreased intracellular oxidation. Cellular uptake of bound hydroxycinnamic acids was significantly higher than that of extractable acids; however, the latter were more efficient antioxidants in the in vivo system. According to our study, we suggest that fermentation of spelt seeds can be used to improve the content, antioxidant activity and cellular uptake of phenolic compounds. The third set of research experiments demonstrates an approach in which treatment with specific enzymes (cellulases, xylanases, feruloyl esterases, proteases, α-amylases) individually or in combination significantly improves the content of extractable TPCs and their in vitro antioxidant activity. Seeds treated with all five enzymes simultaneously had significantly higher content of extractable p-coumaric, trans- ferulic and p-hydroxybenzoic acids, as well as extractable TPCs, and were also particularly effective in scavenging activity against ABTS•+ radicals. The most effective way to release larger amounts of bound phenolic compounds into an extractable form was to combine biotechnological processes. In germinated and fermented seeds, enzymatic treatment resulted in a significant increase in the content of extractable TPCs and their in vitro antioxidant activity, as well as in the content of individual phenolic acids. The combination of germination and enzymatic treatment enormously increased the content of extractable trans-ferulic acid by 5899% compared to germinated seeds, and the combination of fermentation and enzymatic treatement increased its content by 8263% compared to fermented seeds. However, enzymatic treatment of germinated and fermented spelt seeds had a negative effect on the content of bound phenolic compounds and their antioxidant activity, although they still represented a predominant proportion of total phenolic compounds. Among the extractable fractions, the enzymatic treated raw, germinated, and fermented seeds showed cellular 113 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 antioxidant activity, while among the bound fractions, only the enzymatic treated raw seeds showed cellular antioxidant activity. The influence of individual biotechnological processes and their combinations on improving the bioaccessibility of phenolic compounds from spelt seeds was determined using a static in vitro digestion model simulating oral, gastro and intestinal digestion. The study showed a statistically significant effect of the biotechnological processes on the content of bioaccessible TPCs, individual phenolic compounds and their antioxidant activity, despite that large losses of phenolic compounds occured during the digestion process. Raw seeds showed the lowest content of bioaccessible TPCs and individual phenolic compounds. The combination of biotechnological processes, especially germination and alcoholic fermentation, has proven to be the most effective approach. The bioaccessibility of p- coumaric and trans-ferulic acids was the highest in enzymatic treated seeds fermented with L. plantarum, while their absolute content was the highest in germinated seeds fermented with S. cerevisiae. As expected, the greatest biostability of phenolic compounds was determined in raw seeds, where the substrates were less accessible to digestive enzymes. It turned out that bioprocessed seeds have a significantly higher initial content of phenolic acids than raw seeds, and as a result, more phenolic compounds enter the colon. 114 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 5 VIRI Abramovič H., Grobin B., Ulrih N. P., Cigić B. 2017. The methodology applied in DPPH, ABTS and Folin-Ciocalteau assays has a large influence on the determined antioxidant potential. Acta Chimica Slovenica, 64, 2: 491–499 Acosta-Estrada B. A., Gutiérrez-Uribe J. A., Serna-Saldívar S. O. 2014. Bound phenolics in foods, a review. Food Chemistry, 152: 46–55 Adebo O. A., Gabriela Medina-Meza I. 2020. Impact of fermentation on the phenolic compounds and antioxidant activity of whole cereal grains: a mini review. Molecules, 25, 4: 927, doi:10.3390/molecules25040927: 19 str. Adom K. K., Liu R. H. 2002. Antioxidant activity of grains. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 21: 6182–6187 Alam M. N., Bristi N. J., Rafiquzzaman M. 2013. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal, 21, 2: 143–152 AL-Quraan N. A., Sartawe F. A., Qaryouti M. M. 2013. Characterization of γ-aminobutyric acid metabolism and oxidative damage in wheat ( Triticum aestivum L.) seedlings under salt and osmotic stress. Journal of Plant Physiology, 170, 11: 1003–1009 Alves G. H., Ferreira C. D., Vivian P. G., Monks J. L. F., Elias M. C., Vanier N. L., de Oliveira M. 2016. The revisited levels of free and bound phenolics in rice: effects of the extraction procedure. Food Chemistry, 208: 116–123 Angelino D., Cossu M., Marti A., Zanoletti M., Chiavaroli L., Brighenti F., Rio D. D., Martini D. 2017. Bioaccessibility and bioavailability of phenolic compounds in bread: a review. Food & Function, 8, 7: 2368–2393 Anson N. M., Aura A.-M., Selinheimo E., Mattila I., Poutanen K., Van Den Berg R., Havenaar R., Bast A., Haenen G. R. M. M. 2011. Bioprocessing of wheat bran in whole wheat bread increases the bioavailability of phenolic acids in men and exerts antiinflammatory effects ex vivo. Journal of Nutrition, 141, 1: 137–143 Anson N. M., Selinheimo E., Havenaar R., Aura A.-M., Mattila I., Lehtinen P., Bast A., Poutanen K., Haenen G. R. M. M. 2009. Bioprocessing of wheat bran improves in vitro bioaccessibility and colonic metabolism of phenolic compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 14: 6148–6155 Antognoni F., Mandrioli R., Potente G., Taneyo Saa D. L., Gianotti A. 2019. Changes in carotenoids, phenolic acids and antioxidant capacity in bread wheat doughs fermented with different lactic acid bacteria strains. Food Chemistry, 292: 211–216 Azmir J., Zaidul I. S. M., Rahman M. M., Sharif K. M., Mohamed A., Sahena F., Jahurul M. H. A., Ghafoor K., Norulaini N. A. N., Omar A. K. M. 2013. Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: a review. Journal of Food Engineering, 117, 4: 426–436 115 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Babbar N., Oberoi H. S., Sandhu S. K., Bhargav V. K. 2014. Influence of different solvents in extraction of phenolic compounds from vegetable residues and their evaluation as natural sources of antioxidants. Journal of Food Science and Technology, 51, 10: 2568–2575 Bei Q., Chen G., Lu F., Wu S., Wu Z. 2018. Enzymatic action mechanism of phenolic mobilization in oats ( Avena sativa L.) during solid-state fermentation with Monascus anka. Food Chemistry, 245: 297–304 Bento-Silva A., Koistinen V. M., Mena P., Bronze M. R., Hanhineva K., Sahlstrøm S., Kitrytė V., Moco S., Aura A.-M. 2020. Factors affecting intake, metabolism and health benefits of phenolic acids: do we understand individual variability? European Journal of Nutrition, 59, 4: 1275–1293 Bojňanská T., Frančáková H. 2011. The use of spelt wheat ( Triticum spelta L.) for baking applications. Plant, Soil and Environment, 48, 4: 141–147 Bonafaccia G., Galli V., Francisci R., Mair V., Skrabanja V., Kreft I. 2000. Characteristics of spelt wheat products and nutritional value of spelt wheat-based bread. Food Chemistry, 68, 4: 437–441 Boskov Hansen H., Andreasen M., Nielsen M., Larsen L., Knudsen B. K., Meyer A., Christensen L., Hansen Å. 2002. Changes in dietary fibre, phenolic acids and activity of endogenous enzymes during rye bread-making. European Food Research and Technology, 214, 1: 33–42 Boudaoud S., Aouf C., Devillers H., Sicard D., Segond D. 2021. Sourdough yeast-bacteria interactions can change ferulic acid metabolism during fermentation. Food Microbiology, 98: 103790, doi:10.1016/j.fm.2021.103790: 9 str. Boz H. 2016. Ferulic acid in cereals: a review. Czech Journal of Food Sciences, 33, 1: 1–7 Brodkorb A., Egger L., Alminger M., Alvito P., Assunção R., Ballance S., Bohn T., Bourlieu-Lacanal C., Boutrou R., Carrière F., Clemente A., Corredig M., Dupont D., Dufour C., Edwards C., Golding M., Karakaya S., Kirkhus B., Le Feunteun S., Lesmes U., Macierzanka A., Mackie R. A., Martins C., Marze S., McClements J. D., Ménard O., Minekus M., Portmann R., Santos C. N., Souchon I., Singh R. P., Vegarud G. E., Wickham M. S. J., Weitschies W., Recio I. 2019. INFOGEST static in vitro simulation of gastrointestinal food digestion. Nature Protocols, 14, 4: 991–1014 Călinoiu L. F., Vodnar D. C. 2018. Whole grains and phenolic acids: a review on bioactivity, functionality, health benefits and bioavailability. Nutrients, 10, 11: 1615, doi:10.3390/nu10111615: 31 str. Carboni Martins C., Rodrigues R. C., Domeneghini Mercali G., Rodrigues E. 2022. New insights into non-extractable phenolic compounds analysis. Food Research International, 157: 111487, doi:10.1016/j.foodres.2022.111487: 11 str. 116 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Carciochi R. A., Galvan-D’Alessandro L., Vandendriessche P., Chollet S. 2016. Effect of germination and fermentation process on the antioxidant compounds of quinoa seeds. Plant Foods for Human Nutrition, 71, 4: 361–367 Caverzan A., Casassola A., Brammer S. P. 2016. Antioxidant responses of wheat plants under stress. Genetics and Molecular Biology, 39, 1: 1–6 Chait Y. A., Gunenc A., Bendali F., Hosseinian F. 2020. Simulated gastrointestinal digestion and in vitro colonic fermentation of carob polyphenols: bioaccessibility and bioactivity. LWT, 117: 108623, doi:10.1016/j.lwt.2019.108623: 10 str. Chavarín-Martínez C. D., Gutiérrez-Dorado R., Perales-Sánchez J. X. K., Cuevas-Rodríguez E. O., Milán-Carrillo J., Reyes-Moreno C. 2019. Germination in optimal conditions as effective strategy to improve nutritional and nutraceutical value of underutilized Mexican blue maize seeds. Plant Foods for Human Nutrition, 74, 2: 192–199 Chen Z. Ma Y., Yang R., Gu Z., Wang P. 2019. Effects of exogenous Ca2+ on phenolic accumulation and physiological changes in germinated wheat ( Triticum aestivum L.) under UV-B radiation. Food Chemistry, 288: 368–376 Chen Z., Wang P., Weng Y., Ma Y., Gu Z., Yang R. 2017. Comparison of phenolic profiles, antioxidant capacity and relevant enzyme activity of different Chinese wheat varieties during germination. Food Bioscience, 20: 159–167 Chrzanowski G. 2020. Saccharomyces cerevisiae—an interesting producer of bioactive plant polyphenolic metabolites. International Journal of Molecular Sciences, 21, 19: 7343, doi:10.3390/ijms21197343 Chu C., Du Y., Yu X., Shi J., Yuan X., Liu X., Liu Y., Zhang H., Zhang Z., Yan N. 2020. Dynamics of antioxidant activities, metabolites, phenolic acids, flavonoids, and phenolic biosynthetic genes in germinating Chinese wild rice ( Zizania latifolia). Food Chemistry, 318: 126483, doi:10.1016/j.foodchem.2020.126483: 10 str. Cigut T., Polak T., Gašperlin L., Raspor P., Jamnik P. 2011. Antioxidative activity of propolis extract in yeast cells. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59, 21: 11449–11455 Cilla A., Bosch L., Barberá R., Alegría A. 2018. Effect of processing on the bioaccessibility of bioactive compounds – a review focusing on carotenoids, minerals, ascorbic acid, tocopherols and polyphenols. Journal of Food Composition and Analysis, 68: 3–15 Coghe S., Benoot K., Delvaux F., Vanderhaegen B., Delvaux F. R. 2004. Ferulic acid release and 4-vinylguaiacol formation during brewing and fermentation: indications for feruloyl esterase activity in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 3: 602–608 Correa-Betanzo J., Allen-Vercoe E., McDonald J., Schroeter K., Corredig M., Paliyath G. 2014. Stability and biological activity of wild blueberry ( Vaccinium angustifolium) 117 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 polyphenols during simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry, 165: 522–531 Costabile A., Klinder A., Fava F., Napolitano A., Fogliano V., Leonard C., Gibson G. R., Tuohy K. M. 2008. Whole-grain wheat breakfast cereal has a prebiotic effect on the human gut microbiota: a double-blind, placebo-controlled, crossover study. British Journal of Nutrition, 99, 1: 110–120 Dawidowicz A. L., Olszowy M. 2013. The importance of solvent type in estimating antioxidant properties of phenolic compounds by ABTS assay. European Food Research and Technology, 236, 6: 1099–1105 de Oliveira Silva D. M., Finger-Teixeira A., Rodrigues Mota T., Salvador V. H., Moreira-Vilar F. C., Correa Molinari H. B., Craig Mitchell R. A., Marchiosi R., Ferrarese-Filho O., Dantas dos Santos W. 2015. Ferulic acid: a key component in grass lignocellulose recalcitrance to hydrolysis. Plant Biotechnology Journal, 13, 9: 1224–1232 de Oliveira Silva E., Batista R. 2017. Ferulic Acid and naturally occurring compounds bearing a feruloyl moiety: a review on their structures, occurrence, and potential health benefits. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 16, 4: 580–616 Domínguez-Rodríguez G., Marina M. L., Plaza M. 2017. Strategies for the extraction and analysis of non-extractable polyphenols from plants. Journal of Chromatography A, 1514: 1–15 Đorđević T. M., Šiler-Marinković S. S., Dimitrijević-Branković S. I. 2010. Effect of fermentation on antioxidant properties of some cereals and pseudo cereals. Food Chemistry, 119, 3: 957–963 Escarnot E., Aguedo M., Paquot M. 2012. Enzymatic hydrolysis of arabinoxylans from spelt bran and hull. Journal of Cereal Science, 55, 2: 243–253 Espín J. C., González-Sarrías A., Tomás-Barberán F. A. 2017. The gut microbiota: a key factor in the therapeutic effects of (poly)phenols. Biochemical Pharmacology, 139: 82–93 Everette J. D., Bryant Q. M., Green A. M., Abbey Y. A., Wangila G. W., Walker R. B. 2010. Thorough study of reactivity of various compound classes toward the Folin−Ciocalteu reagent. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 14: 8139–8144 Falcinelli B., Sileoni V., Marconi O., Perretti G., Quinet M., Lutts S., Benincasa P. 2017. Germination under moderate salinity increases phenolic content and antioxidant activity in rapeseed ( Brassica napus var oleifera Del.) sprouts. Molecules, 22, 8: 1377, doi:10.3390/molecules22081377: 13 str. Faulds C. B., Mandalari G., LoCurto R., Bisignano G., Waldron K. W. 2004. Arabinoxylan and mono- and dimeric ferulic acid release from brewers grain and wheat bran by feruloyl esterases and glycosyl hydrolases from Humicola insolens. Applied Microbiology and Biotechnology, 64, 5: 644–650 118 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Fazary A. E., Ju Y.-H. 2007. Feruloyl esterases as biotechnological tools: current and future perspectives. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 39, 11: 811–828 Ferri M., Happel A., Zanaroli G., Bertolini M., Chiesa S., Commisso M., Guzzo F., Tassoni A. 2020. Advances in combined enzymatic extraction of ferulic acid from wheat bran. New Biotechnology, 56: 38–45 Filannino P., Bai Y., Di Cagno R., Gobbetti M., Gänzle M. G. 2015. Metabolism of phenolic compounds by Lactobacillus spp. during fermentation of cherry juice and broccoli puree. Food Microbiology, 46: 272–279 Filannino P., Di Cagno R., Gobbetti M. 2018. Metabolic and functional paths of lactic acid bacteria in plant foods: get out of the labyrinth. Current Opinion in Biotechnology, 49: 64–72 Gan R.-Y., Lui W.-Y., Wu K., Chan C.-L., Dai S.-H., Sui Z.-Q., Corke H. 2017. Bioactive compounds and bioactivities of germinated edible seeds and sprouts: an updated review. Trends in Food Science & Technology, 59: 1–14 Gani A., Sm W., Fa M. 2012. Whole-grain cereal bioactive compounds and their health benefits: a review. Journal of Food Processing & Technology, 3, 3: 146, doi:10.4172/2157-7110.1000146: 10 str. Gänzle M. G. 2014. Enzymatic and bacterial conversions during sourdough fermentation. Food Microbiology, 37: 2–10 Gawlik-Dziki U., Dziki D., Baraniak B., Lin R. 2009. The effect of simulated digestion in vitro on bioactivity of wheat bread with Tartary buckwheat flavones addition. LWT - Food Science and Technology, 42, 1: 137–143 Gawlik-Dziki U., Świeca M., Dziki D. 2012. Comparison of phenolic acids profile and antioxidant potential of six varieties of spelt ( Triticum spelta L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60, 18: 4603–4612 Gong L., Cao W., Chi H., Wang J., Zhang H., Liu J., Sun B. 2018. Whole cereal grains and potential health effects: involvement of the gut microbiota. Food Research International, 103: 84–102 Goulas V., Hadjisolomou A. 2019. Dynamic changes in targeted phenolic compounds and antioxidant potency of carob fruit ( Ceratonia siliqua L.) products during in vitro digestion. LWT - Food Science and Technology, 101: 269–275 Halbwirth H. 2010. The creation and physiological relevance of divergent hydroxylation patterns in the flavonoid pathway. International Journal of Molecular Sciences, 11, 2: 595–621 Heleno S. A., Martins A., Queiroz M. J. R. P., Ferreira I. C. F. R. 2015. Bioactivity of phenolic acids: metabolites versus parent compounds: a review. Food Chemistry, 173: 501–513 119 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Hole A. S., Rud I., Grimmer S., Sigl S., Narvhus J., Sahlstrøm S. 2012. Improved bioavailability of dietary phenolic acids in whole grain barley and oat groat following fermentation with probiotic Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus johnsonii, and Lactobacillus reuteri. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60, 25: 6369–6375 Huang D., Ou B., Prior R. L. 2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 6: 1841–1856 Hübner F., Arendt E. K. 2013. Germination of cereal grains as a way to improve the nutritional value: a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 53, 8: 853–861 Hung P. V., Hatcher D. W., Barker W. 2011. Phenolic acid composition of sprouted wheats by ultra-performance liquid chromatography (UPLC) and their antioxidant activities. Food Chemistry, 126, 4: 1896–1901 Katina K., Laitila A., Juvonen R., Liukkonen K.-H., Kariluoto S., Piironen V., Landberg R., Åman P., Poutanen K. 2007a. Bran fermentation as a means to enhance technological properties and bioactivity of rye. Food Microbiology, 24, 2: 175–186 Katina K., Liukkonen K.-H., Kaukovirta-Norja A., Adlercreutz H., Heinonen S.-M., Lampi A.-M., Pihlava J.-M., Poutanen K. 2007b. Fermentation-induced changes in the nutritional value of native or germinated rye. Journal of Cereal Science, 46, 3: 348– 355 Kim M. J., Kwak H. S., Kim S. S. 2018. Effects of germination on protein, γ-aminobutyric acid, phenolic acids, and antioxidant capacity in wheat. Molecules, 23, 9: 2244, doi:10.3390/molecules23092244: 13 str. Koistinen V. M., Nordlund E., Katina K., Mattila I., Poutanen K., Hanhineva K., Aura A.- M. 2017. Effect of bioprocessing on the in vitro colonic microbial metabolism of phenolic acids from rye bran fortified breads. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65, 9: 1854–1864 Konopka I., Tańska M., Faron A., Czaplicki S. 2014. Release of free ferulic acid and changes in antioxidant properties during the wheat and rye bread making process. Food Science and Biotechnology, 23, 3: 831–840 Lima K., Silva O., Figueira M. E., Pires C., Cruz D., Gomes S., Maurício E. M., Duarte M. P. 2019. Influence of the in vitro gastrointestinal digestion on the antioxidant activity of Artemisia gorgonum Webb and Hyptis pectinata (L.) Poit. infusions from Cape Verde. Food Research International, 115: 150–159 Liu L., Zhang R., Deng Y., Zhang Y., Xiao J., Huang F., Wen W., Zhang M. 2017. Fermentation and complex enzyme hydrolysis enhance total phenolics and antioxidant activity of aqueous solution from rice bran pretreated by steaming with α-amylase. Food Chemistry, 221: 636–643 120 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Liu R. H. 2007. Whole grain phytochemicals and health. Journal of Cereal Science, 46, 3: 207–219 López Perea P., Guzmán Ortiz F. A., Román Gutiérrez A. D., Castro Rosas J., Gómez Aldapa C. A., Rodríguez Marín M. L., Falfán Cortés R. N., González Olivares L. G., Torruco Uco J. G. 2019. Bioactive compounds and antioxidant activity of wheat bran and barley husk in the extracts with different polarity. International Journal of Food Properties, 22, 1: 646–658 Ma Y., Wang P., Wang M., Sun M., Gu Z., Yang R. 2019. GABA mediates phenolic compounds accumulation and the antioxidant system enhancement in germinated hulless barley under NaCl stress. Food Chemistry, 270: 593–601 Madhujith T., Shahidi F. 2009. Antioxidant potential of barley as affected by alkaline hydrolysis and release of insoluble-bound phenolics. Food Chemistry, 117, 4: 615– 620 Marienhagen J., Bott M. 2013. Metabolic engineering of microorganisms for the synthesis of plant natural products. Journal of Biotechnology, 163, 2: 166–178 Masisi K., Beta T., Moghadasian M. H. 2016. Antioxidant properties of diverse cereal grains: a review on in vitro and in vivo studies. Food Chemistry, 196: 90–97 Mathew S., Abraham T. E. 2004. Ferulic acid: an antioxidant found naturally in plant cell walls and feruloyl esterases involved in its release and their applications. Critical Reviews in Biotechnology, 24, 2–3: 59–83 Maurya D. K., Devasagayam T. P. A. 2010. Antioxidant and prooxidant nature of hydroxycinnamic acid derivatives ferulic and caffeic acids. Food and Chemical Toxicology, 48, 12: 3369–3373 Mencin M., Abramovič H., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2021a. Abiotic stress combinations improve the phenolics profiles and activities of extractable and bound antioxidants from germinated spelt ( Triticum spelta L.) seeds. Food Chemistry, 344: 128704, doi:10.1016/j.foodchem.2020.128704: 12 str. Mencin M., Mikulic-Petkovsek M., Veberič R., Terpinc P. 2021b. Development and optimisation of solid-phase extraction of extractable and bound phenolic acids in spelt ( Triticum spelta L.) seeds. Antioxidants, 10, 7: 1085, doi:10.3390/antiox10071085: 20 str. Mencin M., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2022a. Improving accessibility and bioactivity of raw, germinated and enzymatic-treated spelt ( Triticum spelta L.) seed antioxidants by fermentation. Food Chemistry, 394: 133483, doi:10.1016/j.foodchem.2022.133483: 12 str. Mencin M., Jamnik P., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2022b. Enzymatic treatments of raw, germinated and fermented spelt ( Triticum spelta L.) seeds improve 121 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 accessibility and antioxidant activity of their phenolics. LWT, 169: 114046, doi:10.1016/j.lwt.2022.114046: 13 str. Mencin M., Mikulič Petkovšek M., Veberič R., Terpinc P. 2022c. Simulated gastrointestinal digestion of bioprocessed spelt seeds: bioaccessibility and bioactivity of phenolics. Antioxidants, 11, 9: 1703, doi: 10.3390/antiox11091703: 20 str. Minekus M., Alminger M., Alvito P., Ballance S., Bohn T., Bourlieu C., Carrière F., Boutrou R., Corredig M., Dupont D., Dufour C., Egger L., Golding M., Karakaya S., Kirkhus B., Feunteun S. L., Lesmes U., Macierzanka A., Mackie A., Marze S., McClements D. J., Ménard O., Recio I., Santos C. N., Singh R. P., Vegarud G. E., Wickham M. S. J., Weitschies W., Brodkorb A. 2014. A standardised static in vitro digestion method suitable for food – an international consensus. Food & Function, 5, 6: 1113–1124 Montemurro M., Pontonio E., Gobbetti M., Rizzello C. G. 2019. Investigation of the nutritional, functional and technological effects of the sourdough fermentation of sprouted flours. International Journal of Food Microbiology, 302: 47–58 Moore J., Cheng Z., Su L., Yu L. 2006. Effects of solid-state enzymatic treatments on the antioxidant properties of wheat bran. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 24: 9032–9045 Ndolo V. U., Beta T., Fulcher R. G. 2013. Ferulic acid fluorescence intensity profiles and concentration measured by HPLC in pigmented and non-pigmented cereals. Food Research International, 52, 1: 109–118 Nenadis N., Tsimidou M. 2002. Observations on the estimation of scavenging activity of phenolic compounds using rapid 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH•) tests. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 79, 12: 1191–1195 Oghbaei M., Prakash J. 2016. Effect of primary processing of cereals and legumes on its nutritional quality: a comprehensive review. Cogent Food & Agriculture, 2, 1: 1136015, doi:10.1080/23311932.2015.1136015: 14 str. Ortega N., Macià A., Romero M.-P., Reguant J., Motilva M.-J. 2011. Matrix composition effect on the digestibility of carob flour phenols by an in-vitro digestion model. Food Chemistry, 124, 1: 65–71 Pang Y., Ahmed S., Xu Y., Beta T., Zhu Z., Shao Y., Bao J. 2018. Bound phenolic compounds and antioxidant properties of whole grain and bran of white, red and black rice. Food Chemistry, 240: 212–221 Paucar-Menacho L. M., Martínez-Villaluenga C., Dueñas M., Frias J., Peñas E. 2017. Optimization of germination time and temperature to maximize the content of bioactive compounds and the antioxidant activity of purple corn ( Zea mays L.) by response surface methodology. LWT - Food Science and Technology, 76: 236–244 122 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Peanparkdee M., Iwamoto S. 2022. Encapsulation for improving in vitro gastrointestinal digestion of plant polyphenols and their applications in food products. Food Reviews International, 38, 4: 335–353 Peixoto Araujo N. M., Pereira G. A., Arruda H. S., Prado L. G., Ruiz A. L. T. G., Eberlin M. N., Castro R. J. S., Pastore G. M. 2019. Enzymatic treatment improves the antioxidant and antiproliferative activities of Adenanthera pavonina L. seeds. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 18: 101002, doi:10.1016/j.bcab.2019.01.040: 7 str. Petersen M., Hans J., Matern U. 2010. Biosynthesis of phenylpropanoids and related compounds. V: Biochemistry of plant secondary metabolism. Wink M. (ur.). Ames, John Wiley & Sons, Ltd: 182–257 Prior R. L., Wu X., Schaich K. 2005. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 10: 4290–4302 Pruska-Kedzior A., Kedzior Z., Klockiewicz-Kaminska E. 2008. Comparison of viscoelastic properties of gluten from spelt and common wheat. European Food Research and Technology, 227, 1: 199–207 Rakariyatham K., Liu X., Liu Z., Wu S., Shahidi F., Zhou D., Zhu B. 2020. Improvement of phenolic contents and antioxidant activities of longan ( Dimocarpus longan) peel extracts by enzymatic treatment. Waste and Biomass Valorization, 11, 8: 3987–4002 Randhir R., Lin Y.-T., Shetty K. 2004. Phenolics, their antioxidant and antimicrobial activity in dark germinated fenugreek sprouts in response to peptide and phytochemical elicitors. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 13, 3: 295–307 Ren Y., Liu H., Wang D., Liu T., Zhang R., Wu Y., Zhang Y., Han J., Liu M. 2022. Antioxidant activity, stability, in vitro digestion and cytotoxicity of two dietary polyphenols co-loaded by β-lactoglobulin. Food Chemistry, 371: 131385, doi:10.1016/j.foodchem.2021.131385: 10 str. Rice-Evans C. A., Miller N. J., Paganga G. 1996. Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radical Biology and Medicine, 20, 7: 933–956 Richard-Forget F. C., Gauillard F. A. 1997. Oxidation of chlorogenic acid, catechins, and 4-methylcatechol in model solutions by combinations of pear ( Pyrus communis Cv. Williams) polyphenol oxidase and peroxidase: a possible involvement of peroxidase in enzymatic browning. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 45, 7: 2472–2476 Rocchetti G., Giuberti G., Lucini L. 2018. Gluten-free cereal-based food products: the potential of metabolomics to investigate changes in phenolics profile and their in vitro bioaccessibility. Current Opinion in Food Science, 22: 1–8 Ruibal-Mendieta N. L., Delacroix D. L., Mignolet E., Pycke J.-M., Marques C., Rozenberg R., Petitjean G., Habib-Jiwan J.-L., Meurens M., Quetin-Leclercq J., Delzenne N. M., 123 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Larondelle Y. 2005. Spelt ( Triticum aestivum ssp. Spelta) as a source of breadmaking flours and bran naturally enriched in oleic acid and minerals but not phytic acid. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 7: 2751–2759 Sancho A. I., Bartolomé B., Gómez-Cordovés C., Williamson G., Faulds C. B. 2001. Release of ferulic acid from cereal residues by barley enzymatic extracts. Journal of Cereal Science, 34, 2: 173–179 Santos-Sánchez N., Salas-Coronado R., Hernández-Carlos B., Villanueva-Cañongo C. 2019. Shikimic acid pathway in biosynthesis of phenolic compounds. V: Plant physiological aspects of phenolic compounds. Soto-Hernández M., García-Mateos R., PalmaTenango M. (ur.). London, IntechOpen, doi:10.5772/intechopen.83815: 15 str. Saura-Calixto F., Serrano J., Goñi I. 2007. Intake and bioaccessibility of total polyphenols in a whole diet. Food Chemistry, 101, 2: 492–501 Sęczyk Ł., Sugier D., Świeca M., Gawlik-Dziki U. 2021. The effect of in vitro digestion, food matrix, and hydrothermal treatment on the potential bioaccessibility of selected phenolic compounds. Food Chemistry, 344: 128581, doi:10.1016/j.foodchem.2020.128581: 7 str. Shahidi F., Chandrasekara A. 2010. Hydroxycinnamates and their in vitro and in vivo antioxidant activities. Phytochemistry Reviews, 9, 1: 147–170 Shahidi F., Pan Y. 2021. Influence of food matrix and food processing on the chemical interaction and bioaccessibility of dietary phytochemicals: a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 62, 23: 6421–6445 Shahidi F., Yeo J. 2016. Insoluble-bound phenolics in food. Molecules, 21, 9: 1216, doi:10.3390/molecules21091216: 22 str. Singh A., Sharma S. 2017. Bioactive components and functional properties of biologically activated cereal grains: a bibliographic review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 57, 14: 3051–3071 Singh A., Sharma V., Banerjee R., Sharma S., Kuila A. 2016. Perspectives of cell-wall degrading enzymes in cereal polishing. Food Bioscience, 15: 81–86 Sørensen H. R., Meyer A. S., Pedersen S. 2003. Enzymatic hydrolysis of water-soluble wheat arabinoxylan. 1. Synergy between α-L-arabinofuranosidases, endo-1,4-β- xylanases, and β-xylosidase activities. Biotechnology and Bioengineering, 81, 6: 726– 731 Spaggiari M., Ricci A., Calani L., Bresciani L., Neviani E., Dall’Asta C., Lazzi C., Galaverna G. 2020. Solid state lactic acid fermentation: a strategy to improve wheat bran functionality. LWT, 118: 108668, doi:10.1016/j.lwt.2019.108668: 9 str. 124 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Starzyńska-Janiszewska A., Stodolak B., Socha R., Mickowska B., Wywrocka-Gurgul A. 2019. Spelt wheat tempe as a value-added whole-grain food product. LWT, 113: 108250, doi:10.1016/j.lwt.2019.108250: 7 str. Terpinc P. 2019. Vezane fenolne spojine polnozrnatih žitnih pripravkov kot sestavina funkcionalnih živil: drugi del. Acta agriculturae Slovenica, 114, 2: 279–291 Terpinc P., Abramovič H. 2010. A kinetic approach for evaluation of the antioxidant activity of selected phenolic acids. Food Chemistry, 121, 2: 366–371 Terpinc P., Cigić B., Polak T., Hribar J., Požrl T. 2016. LC–MS analysis of phenolic compounds and antioxidant activity of buckwheat at different stages of malting. Food Chemistry, 210: 9–17 Terpinc P., Polak T., Poklar Ulrih N., Abramovič H. 2011. Effect of heat treatment of camelina ( Camelina sativa) seeds on the antioxidant potential of their extracts. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59, 16: 8639–8645 Ti H., Zhang R., Zhang M., Li Q., Wei Z., Zhang Y., Tang X., Deng Y., Liu L., Ma Y. 2014. Dynamic changes in the free and bound phenolic compounds and antioxidant activity of brown rice at different germination stages. Food Chemistry, 161: 337–344 Tomé-Sánchez I., Martín-Diana A. B., Peñas E., Frias J., Rico D., Jiménez-Pulido I., Martínez-Villaluenga C. 2021. Bioprocessed wheat ingredients: characterization, bioaccessibility of phenolic compounds, and bioactivity during in vitro digestion. Frontiers in Plant Science, 12: 790898, doi:10.3389/fpls.2021.790898: 20 str. Van Hung P. 2016. Phenolic compounds of cereals and their antioxidant capacity. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 56, 1: 25–35 Vitaglione P., Napolitano A., Fogliano V. 2008. Cereal dietary fibre: a natural functional ingredient to deliver phenolic compounds into the gut. Trends in Food Science & Technology, 19, 9: 451–463 Wang J., Chatzidimitriou E., Wood L., Hasanalieva G., Markellou E., Iversen P. O., Seal C., Baranski M., Vigar V., Ernst L., Willson A., Thapa M., Barkla B. J., Leifert C., Rempelos L. 2020. Effect of wheat species ( Triticum aestivum vs T. spelta), farming system (organic vs conventional) and flour type (wholegrain vs white) on composition of wheat flour – Results of a retail survey in the UK and Germany – 2. Antioxidant activity, and phenolic and mineral content. Food Chemistry: X, 6: 100091, doi:10.1016/j.fochx.2020.100091: 10 str. Wang L., Luo Y., Wu Y., Liu Y., Wu Z. 2018. Fermentation and complex enzyme hydrolysis for improving the total soluble phenolic contents, flavonoid aglycones contents and bio-activities of guava leaves tea. Food Chemistry, 264: 189–198 Wang T., He F., Chen G. 2014. Improving bioaccessibility and bioavailability of phenolic compounds in cereal grains through processing technologies: a concise review. Journal of Functional Foods, 7: 101–111 125 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Xiang N., Guo X., Liu F., Li Q., Hu J., Brennan C. S. 2017. Effect of light- and dark-germination on the phenolic biosynthesis, phytochemical profiles, and antioxidant activities in sweet corn ( Zea mays L.) sprouts. International Journal of Molecular Sciences, 18, 6: 1246, doi:10.3390/ijms18061246: 13 str. Xu J. G., Tian C. R., Hu Q. P., Luo J. Y., Wang X. D., Tian X. D. 2009. Dynamic changes in phenolic compounds and antioxidant activity in oats ( Avena nuda L.) during steeping and germination. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 57, 21: 10392– 10398 Xu K., She Z., Wang H., Liu X., Zhang Y., Chi C., Zhang H. 2021. Textural quality of sweet dumpling: effect of germination of waxy rice. International Journal of Food Science & Technology, 56, 8: 4081–4090 Xu M., Rao J., Chen B. 2020. Phenolic compounds in germinated cereal and pulse seeds: classification, transformation, and metabolic process. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 60, 5: 740–759 Yang T. K. B., Ooraikul F. 2001. Studies on germination conditions and antioxidant contents of wheat grain. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 52, 4: 319–330 Ydjedd S., Bouriche S., López-Nicolás R., Sánchez-Moya T., Frontela-Saseta C., Ros-Berruezo G., Rezgui F., Louaileche H., Kati, D.-E. 2017. Effect of in vitro gastrointestinal digestion on encapsulated and nonencapsulated phenolic compounds of carob ( Ceratonia siliqua L.) pulp extracts and their antioxidant capacity. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65, 4: 827–835 Yu J., Vasanthan, T., Temelli F. 2001. Analysis of phenolic acids in barley by high-performance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49, 9: 4352–4358 Zeng Z., Liu C., Luo S., Chen J., Gong E. 2016. The profile and bioaccessibility of phenolic compounds in cereals influenced by improved extrusion cooking treatment. PLOS ONE, 11, 8: e0161086, doi:10.1371/journal.pone.0161086: 11 str. Zhang Z., Li D., Refaey M. M., Xu W. 2017. High spatial and temporal variations of microbial community along the southern catfish gastrointestinal tract: insights into dynamic food digestion. Frontiers in Microbiology, 8: 1531, doi:10.3389/fmicb.2017.01531: 13 str. Žilić S., Delić N., Basić Z., Ignjatović-Micić D., Janković M., Vančetović J. 2015. Effects of alkaline cooking and sprouting on bioactive compounds, their bioavailability and relation to antioxidant capacity of maize flour. Journal of Food & Nutrition Research, 54, 2; 155–164 Zörb C., Betsche T., Langenkämper G., Zapp J., Seifert M. 2007. Free sugars in spelt wholemeal and flour. Journal of Applied Botany and Food Quality, 81, 2: 172–174 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ZAHVALA Tekom doktorskega študija sem imela ta privilegij, da sem se lahko večkrat zahvaljevala, saj je zahvala vedno odziv na neko dobro, plemenito dejanje, ki si ga kot posameznik deležen. Zahvale začenjam z največjo zahvalo in ta gre moji mentorici doc. dr. Petri Terpinc. V teh štirih letih si mi bila, draga Petra, več ko le mentorica, bila si tudi zaupnica, ki sem ji lahko povedala svoje skrbi, dvome in čisto življenjske probleme. Si mentorica, ki mi je dajala svobodo za razvoj idej, podpirala si me pri delu in me s svojimi nasveti usmerjala v pravo smer. V posebno zadovoljstvo so mi bili najini pogovori. Zaradi tebe so bila ta štiri leta res lepa. Hvala tudi za vse vikende in prosti čas, ki si ga namenila za popravljanje najinih člankov. Hvala vsem članom komisije, prof. dr. Blažu Cigiću, prof. dr. Heleni Prosen, doc. dr. Borisu Kovaču, za vaš trud, za vse vaše predloge in popravke, s katerimi smo izboljšali našo doktorsko nalogo. Velika zahvala velja prof. dr. Rajku Vidrihu, ki mi je pred štirimi leti predlagal naj se prijavim za mlado raziskovalko. Hvala vam, da vas je vedno zanimalo kako sem, kako mi gre delo, koliko člankov sem že napisala in hvala, da se v zadnjih mesecih tako trudite glede moje nadaljnje zaposlitve. Posebna zahvala gre trem profesoricam, s katerimi sem imela čast sodelovati, prof. dr. Heleni Abramovič, prof. dr. Poloni Jamnik in prof. dr. Maji Mikulič Petkovšek. Hvala vsaki posebej za možnost sodelovanja, za to, da ste bile vedno pripravljene pomagati ter za vedno lepe in spodbujajoče besede. Hvala vam. Zahvala velja vsem zaposlenim na Katedri za tehnologije rastlinskih živil in vino, za to da sem se dobro počutila ob vas, za dobro voljo in seveda hrano. Hvala Doris, Saši in Niku za vse trenutke v laboratoriju, za vse fore, smeh, pogovore, za vso pomoč in nasvete. Hvala tudi Hani, ki me je ob popoldnevih vedno nasmejala. Ena največjih zahval gre sigurno mojemu službenemu cimru s katerim sem preživela največ časa. Andrej, hvala ti za tvojo “laganost” s katero si me znal pomiriti, ko sem paničarila, za vse fore, prigode in različna mnenja, zaradi tebe je bil marsikateri dan lažji in lepši. Hvala za tvoje nasvete pri “optimizaciji” mojega dela v laboratoriju, za vse epruvete, ki si jih pomil namesto mene. Hvala, ker nisi bil samo sodelavec, ampak si bil prijatelj. Hvala lepa 😊. Velika hvala gre mojim staršem, ki sta me celo življenje spodbujala pri izobraževanju in sta mi velik zgled delavnosti, pridnosti in poštenosti. Hvala, da me še vedno marsikdaj razvajata z vnaprej pripravljenim kosilom … Posebna zahvala gre moji sestri Katji in mojim prijateljem, še posebej Janu in Kaji, za vse pogovore, za vse hece, za vse spodbude. Kakšen privilegij je, da vas imam. Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Začela sem s prvo zahvalo, ki je bila na službenem področju najpomembnejša, zaključujem pa z zahvalo osebi, ki je v mojem življenju najpomembnejša, mojemu možu. Timi hvala ti, da me imaš rad tako kot sem, hvala ker ne kompliciraš, hvala za vse spodbudne in lepe besede, ki mi jih nameniš, hvala ker si me v zadnjem mesecu dobro prenašal in ker si me znal pomiriti. Hvala, ker se tako trudiš za najin odnos. Rada sem tvoja žena. 😍 Na koncu še hvala Njemu, ki je na mojo pot pripeljal vse te ljudi. Srečnica sem! 😊 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 PRILOGE PRILOGA A: Dovoljenje za uporabo članka Mencin in sod. (2021a) iz revije Food Chemistry. Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 PRILOGA B: Dovoljenje za uporabo članka Mencin in sod. (2022a) iz revije Food Chemistry. Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 PRILOGA C: Objavljen članek Mencin in sod. (2021b). Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mencin M. Izboljšanje dostopnosti in antioksidativne aktivnosti … z izbranimi biotehnološkimi procesi. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 To delo je ponujeno pod Creative Commons Priznanje avtorstva-deljenje pod enakimi pogoji 4.0 International licenca