@ Zdravniški vestnik
GLASILO SLOVENSKEGA ZDRAVNIŠKEGA DRUŠTVA ZDRAV VESTN, LETNIK 67, MAJ 1998, str. 1-76, Supl. I
40 LET KLINIČNE HEMATOLOGIJE V LJUBLJANI
VSEBINA
UVODNIK
40 let klinične hematologije v Ljubljani, P. Černelč	1-1
PRISPEVKI
Presaditev kostnega mozga - njen razvoj in možnosti, E. D. Thomas	1-3
Zdravljenje kronične limfocitne levkemije in ne-Hodgkinovih limfomov s fludarabinom, C. Rozman	1-5
Avtologna transplantacija krvotvornih matičnih celic pri zdravljenju akutnih levkemij, B. Labar, D. Nemet, M. Mrsić, V. Bogdanih, D. Batinič, B. Golubič-Čepulič,
M. Petrovečki, I. Radman, I. Aurer, D. Sertić	1-9
Naše izkušnje pri zdravljenju bolnikov s kronično mieloično ter akutno levkemijo z alogenično presaditvijo krvotvornih matičnih celic, J. Pretnar, S. Zver, M. Benedik-Dolničar	I—11
Avtologna presaditev krvotvornih matičnih celic pri otrocih s solidnimi tumorji
in naše izkušnje, M. Benedik-Dolničar, J. Anžič	1-15
Zdravljenje solidnih tumorjev odraslih z zelo velikimi odmerki citostatikov in
avtologno presaditvijo krvotvornih matičnih celic, B. Zakotnik, B. Pajk, J. Pretnar	1-19
Zdravljenje napredovane kronične limfocitne levkemije s fludarabinom, P. Černelč	1-23
Zdravljenje bolnikov z dlakasto celično levkemijo s kladribinom, U. Mlakar	1-27
Koncentracija eritropoetina v serumu pri bolnikih z diseminiranim plazmocitomom pred začetkom zdravljenja, U. Mlakar	1-31
Naše izkušnje pri zdravljenju akutne nelimfoblastne levkemije odraslih s
protokolom AML 10, M. Modic	1-35
Naše izkušnje pri zdravljenju akutne mieloblastne levkemije s kladribinom pri
starejših bolnikih, S. Zver, J. Pretnar	1-39
Mieloplastični sindrom s pridobljeno korpuskulamo hemolitično anemijo in
kasnejšim prehodom v AML - prikaz primera, U. Mlakar	1-43
Zdravljenje čiste aplastične anemije pri bolniku s kronično limfocitno levkemijo,
M. Bervar, P. Černelč	1-47
Določanje števila retikulocitov v krvi s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom, I. Preložnik-Zupan	1-51
Določanje antigenov CD62P in CD63 s pretočnim citometrom za oceno aktiviranih trombocitov, J. Kralj	1-57
Določanje protiteles proti trombocitom pri kronični idiopatični trombocitopenični purpuri s pretočnim citometrom, D. Žontar, P. Černelč	I-6l
Odnos med koncentracijo heparina v plazmi in motnjo v koagulaciji: Zdravljenje s heparinom med hemodializo, Z. Čede, A. Andoljšek	1-65
Kronična mieloična levkemija in molekularno genetični načini ugotavljanja
bolezni, T. Pajič, P. Černelč	1-69
Spremembe števila in prostornine trombocitov pri idiopatični trombocitopenični purpuri, M. Tomažič, D. Andoljšek	1-73
Zdravniški vestnik
Glavni urednik/Editor-in-Chief:
J. Drinovec
Odgovorni urednik/Responsible Editor:
M. Janko
Urednika/Editors:
M. Cevc, P. Dolenc
Sourednik/Co-Editor:
P. Černelč
Uredniški svet/Editorial Council:
P. Kapš (predsednik/president),
I. Švab (namestnik predsednika/vice-president),
J. Bedemjak, F. Dolšek, J. Drinovec, M. Janko, M. Jereb I. Kapelj, V. Kostevc-Zorko, F. Košir, M. F. Kenda,
S. Levak-Hozjan, V. Petrič, A. Prijatelj, P. Rode, B. Šalamun, Z. Turk, F. Urlep, T. Vahtar, F. Verovnik, G. Voga, M. Žargi
Uredniški odbor/Editoral Board:
B. R. Binder, Dunaj - Avstrija, B. Brinkmann, Münster - Nemčija, V. Dolenc, D. Ferluga, S. Herman, S. Julius, Ann Arbor - ZDA, M. Jung, Zürich - Švica, P. Kapš, D. Keber, M. Kordaš,
I. Krajnc, G. J. Krejs, Graz - Avstrija, G. Lešničar, M. Likar, J. Milič, Montreal - Kanada,
A. P. Monaco, Harvard - ZDA, D. Pokorn, S. Primožič, M. Rode,
E. Stälberg, Uppsala - Švedska,
J. Šorli, J. Trontelj, B. Vrhovac, Zagreb - Hrvaška, B. Žekš
Poslovna tajnica uredništva/Secretary of the Editorial Office:
K. Jovanovič
Lektorja za slovenščino/Readers for Slovenian:
J. Faganel, T. Korošec
Lektor za angleščino/Reader for English:
A. Snedec
Naslov uredništva in uprave/
Address of the Editorial Office and Administration:
1000 Ljubljana, Komenskega 4, tel. (06l) 317-868
Domača stran na Internetu/Internet Home Page:
http://vestnik.szd.si/
Tekoči račun pri/Current Account with
LB 50101-678-48620
UDK 61+614.258(061.1)=863=20 CODEN: ZDVEEB ISSN 1318-0347
To revijo redno indeksirajo in/ali abstrahirajo:
Biological Abstracts, Biomedicina Slovenica,
BIOSIS, Medlars
Zdravniški vestnik izhaja praviloma vsak mesec.
Letna naročnina za člane SZD je vključena v članarino.
To številko so financirali:
Ministrstvo za znanost in tehnologijo in Ministrstvo za zdravstvo, Zavod za zdravstveno zavarovanje R Slovenije Po mnenju Urada vlade RS za informiranje št. 4/3-12-1388/95-23/294 šteje Zdravniški vestnik med proizvode, za katere se plačuje 5% davek od prometa proizvodov.
- Tisk Tiskarna JOŽE MOŠKRIČ d. d., Ljubljana - Naklada 4100 izvodov
The Journal appears regulary every month.
Yearly subscription for members of the Slovene Medical Society is included in the membership amounting.
The issue is subsidized by Ministry for Research and Technology, Ministry for Health
- Printed by Tiskarna JOŽE MOŠKRIČ d. d., Ljubljana - Printed in 4100 copies
Uvodnik/Leading article
40 LET KLINIČNE HEMATOLOGIJE V LJUBLJANI
Razvoj laboratorijskih preiskav in zahtevnejši načini zdravljenja bolezni krvi in krvotvornih organov v svetu in pri nas so zahtevali specializacijo tako delavcev v laboratoriju kot zdravnikov internistov in tako omogočili nastanek klinične hematologije. Ustanovitev koagulacijskega laboratorija, uvedba citološkega pregleda kostnega mozga in začetek zdravljenja hemoblastoz s citostatiki so bili temelji za začetek klinične hematologije v Ljubljani pred 40 leti.
Ustanovitev Hematološke in transfuziološke sekcije Slovenije leta 1964 je doprinesla k hitrejšemu razvoju in povezanosti klinične hematologije v Sloveniji.
Ustanovitev Hematološke službe na Interni kliniki leta 1966 je ob vse bolj zapletenih načinih ugotavljanja in zdravljenja malignih hemoblastoz omogočila ustreznejšo in učinkovitejšo obravnavo bolnikov.
Po preimenovanju Hematološke službe v Hematološko kliniko leta 1978 zasledimo usmeritve znotraj klinike, ki jo sestavljajo enota za anemije, enota za hemoblastoze, enota za hemostazo, hematološka ordinacija ter aseptična ordinacija in specializirani hematološki laboratoriji. Slednji so imeli sprva laboratorij za hemostazo za osnovne in specialne preiskave s tega področja ter citološki laboratorij. Nekaj let kasneje je nastal imunološki laboratorij, kjer izvajamo imunološke preiskave za opredelitev levke-mičnih in limfomskih celic ter oceno imunskega odziva. Leta 1997 pa je nastal molekularno genetični laboratorij. V specializiranih hematoloških laboratorijih danes izvajamo preiskave za celoten Klinični center, nekatere pa za vso Slovenijo.
Za strokovni razvoj posamezne enote je zadolžen zdravnik, ki se s tem področjem ukvarja ter specialist medicinske biokemije, kemik oziroma biolog, ki zagotavljajo skupaj z laboratorijskimi tehniki uvajanje ter kvalitetno izvajanje preiskav, kar potrjujejo pridobljeni atesti mednarodne kontrole kvalitete za laboratorije (IN-STAND).
Ob koncu 60. let smo uvedli citokemična barvanja predvsem za opredelitev akutnih levkemij. V drugi polovici 70. let smo sledili razvoju imunoloških metod v svetu in uvedli sprva določanje podvrst limfocitov, nato pa levkemičnih in limfomskih celic s pomočjo membranskih označevalcev in pretočnega citometra, ki je postala ena od najpomembnejših preiskav specializiranega imunološkega laboratorija. Ob koncu 70. let smo začeli s kultiviranjem matičnih celic v poltrdem agarju za ugotavljanje prizadetosti usmerjenih krvotvornih matičnih celic. Poleg tega smo neprestano izpopoljnjevali in uvajali nove laboratorijske preiskave s področja hemostaze za potrebe celotnega Kliničnega centra, ki jim že od začetka 70. let dodamo strokovno mnenje hematologa.
Letos smo uspeli uvesti molekularno genetične preiskave, ki jih uporabljamo za ugotavljanje klona pri kronični mieloični levkemiji in preostale levkemije po zdravljenju s citostatiki (minimal residual disease). Predvsem slednje nam omogoča natančno oceniti uspeh zdravljenja in izbrati za presaditev krvotvornih matičnih celic tiste bolnike v klinični remisiji levkemije, ki imajo v kostnem mozgu še levkemični klon celic.
Y aseptični ordinaciji izvajamo posege, kot so punkcije in biopsije organov, uvajanje osrednjih venskih katetrov ter redno nego in nadzor bolnikov z osrednjimi venskimi katetri.
Vse intenzivnejše citostatično zdravljenje, ki še poveča nevtrope-nunsko odzivnost pri bolnikih z akutno limfomi visoke stopnje malignosti, nas je 70. let k preureditvi nekaj navadnih bol-
niških sob v »aseptične«. Z osamitvijo bolnikov in posebnim načinom nege smo izboljšali uspehe zdravljenja.
Dolgoletne izkušnje pri zdravljenju bolnikov s hudo nevtropenijo in pomanjkljivo imunsko odzivnostjo so nam leta 1989 v kratkem času omogočile alogenično in avtologno presajanje krvotvornih matičnih celic, ki je najzahtevnejši način zdravljenja v klinični hematologiji.
Poleg presajanja krvotvornih matičnih celic pri otrocih in odraslih bolnikih s krvnimi boleznimi, smo leta 1997 skupaj s kolegi iz Onkološkega inštituta začeli zdravljenje z zelo velikimi odmerki citostatikov in avtologno presaditvijo perifernih krvotvornih matičnih celic pri bolnicah s karcinomom dojke.
Od leta 1991 smo člani evropske skupine za presaditev kostnega mozga (EBMT).
V zadnjih letih smo sočasno, kot v razvitih državah zahoda uvedli nekaj novih načinov zdravljenja, ki so znatno spremenili napoved poteka bolezni.
Po uvedbi interferona alfa za zdravljenje dlakastocelične levkemije pred štirinajstimi leti, ki je znatno izboljšal potek bolezni, smo to zdravilo leta 1996 začeli redno uporabljati za prvo zdravljenje bolnikov s kroničnimi mieloproliferativnimi boleznimi. Pri kronični mieloični levkemiji je danes interferon alfa prvi način zdravljenja, saj dosežemo najdaljša preživetja bolnikov, ob tem pa je tudi najbolj priporočjiv način zdravljenja pred presaditvijo kostnega mozga.
Novo zdravilo kladribin, ki ga zadnje dve leti uporabljamo kot prvo zdravilo za dlakasto celično levkemijo, je še izboljšalo napoved poteka bolezni. Dolge remisije bolezni po zdravljenju napovedujejo celo možnost popolne ozdravitve.
Fludarabin je danes najučinkovitejše zdravilo za zdravljenje napredovale kronične limfocitne levkemije, predvsem pa za prvo intenzivno zdravljenje bolnikov, ki so kandidati za presaditev krvotvornih matičnih celic.
Vse pogosteje uporabljamo rekombinantna dejavnika za pospešitev delitve in dozorevanja usmerjenih matičnih celic granulocitne (G-CSF) in monocitne-makrofagne (GM-CSF) vrste, ki skrajšata obdobje hude nevtropenije po zdravljenju s citostatiki in po presaditvi kostnega mozga. Njihovo večjo rabo omejuje predvsem velika cena zdravila.
Rekombinantni aktivirani faktor VII se je izkazal kot najbolj učinkovit način zdravljenja krvavitev pri bolnikih s hemofilijo in inhibitorji za faktor VIII.
Zaradi potrebe po redni timski obravnavi bolnika imamo že od začetka 80. let redne sestanke s specialisti-rentgenologi iz skeletne in pljučne diagnostike. Po izpopolnitvi tehnične opreme pa imamo od leta 1991 redne tedenske citološko-histološke seminarje. Redno sodelujemo s kliničnim mikrobiologom, od leta 1993 pa z onkologom-radioterapevtom.
Pri vsakodnevni obravnavi bolnikov sodelujemo s specialisti Zavoda za transfuzijo krvi, Centra za tipizacijo tkiv, Onkološkega inštituta, Inštituta za mikrobiologijo, Kliničnega oddelka za intenzivno interno medicino, Centra za intemistično prvo pomoč Oddelka za citogenetiko Inštituta za varovanje zdravja in Inštituta za patologijo ter drugimi specialisti.
Prostorska stiska na bolniškem oddelku nas je leta 1990 spodbudila, da smo uvedli dnevno bolnišnico.
Zahtevnejša ambulantna obravnava bolnikov po presajanju krvotvornih matičnih celic je po letu 1991 zahtevala začetek dela ambulante za te bolnike. Skupaj s Centrom za hemofilijo smo uvedli dispanzerski način obravnave z ambulantnim zdravlje-
nijo in pomanjkljivo ir levkemijo^rBî^snimi spodbudo v zacá^u
njem bolnikov s hemofilijo ter jih naučili samostojnega zdravljenja na domu.
Potreba po naročanju in spremljanju bolnikov v ordinaciji in bolniškem oddelku je leta 1990 spodbudila uvedbo Registra bolnikov z boleznimi krvi in krvotvornih organov in spremljanje z računalniškim programom Hipokrat.
Kot vse specialistične dejavnosti imamo že vrsto let organizirano konziliarno dejavnost za potrebe Kliničnega centra, v zadnjih letih pa tudi konzultantsko dejavnost, ki je na voljo bolnikom z boleznijo krvi in krvotvornih organov in zdravnikom po Sloveniji.
Vsa leta so specializirani laboratoriji Hematološke klinike omogočali raziskovalno dejavnost, izvajanje magistrskih in doktorskih del tako raziskovalcem Hematološke klinike kot tudi drugim v Kliničnem centru, kar potrjujejo številne publikacije v domači in tuji literaturi.
Dolgoletne klinične in pedagoške izkušnje smo vgradili v učbenike Klinična hematologija, hrvaški učbenik klinične hematologije, učbenik Hematologija za laboratorijske tehnike, skupaj z drugimi avtorji v učbenik Interna medicina ter nazadnje v Pravopis medicinskih izrazov.
Izkušnje pri diagnostiki in zdravljenju smo izmenjevali na strokovnih sestankih v okviru Hematološke sekcije, kongresih in simpozijih ter tesno sodelovali z drugimi centri, ki zdravijo bolezni krvi in krvotvornih organov, predvsem z Royal Free Hospital v Londonu in Centrom za trasplantaciju koštane srži v Zagrebu. Aktivno smo sodelovali pri nastanku prvega skupnega Jugoslovanskega protokola za zdravljenje akutnih levkemij.
Leta 1976 smo organizirali VI. Hematološke dneve v Portorožu, leta 1986 pa V. Kongres hematologov in transfuziologov Jugoslavije z mednarodno udeležbo v Mariboru.
Ne nazadnje že vsa leta predavamo interno medicino in hematologijo na Medicinski fakulteti v Ljubljani, Visoki šoli za zdravstvo v
Ljubljani, na Fakulteti za farmacijo, Tavčarjevih dnevih, podiplomskem izobraževanju iz transfuziologije, hospitalne higiene in splošne medicine ter izvajamo pedagoško delo pri medicinskih sestrah, laboratorijskih tehnikih, študentih stomatologije in medicine, specializantih interne medicine, stomatologije, medicinske biokemije in drugih tako na oddelku, kot v laboratorijih Klinčnega oddelka za hematologijo.
Večletne izkušnje iz zdravstvene nege bolnikov z boleznimi krvi medicinske sestre izmenjujejo v Sekciji hematoloških medicinskih sester in zdravstvenih tehnikov, ki deluje v okviru Zbornice zdravstvene nege Slovenije od ustanovitve leta 1995.
Za izobraževanje laboratorijskih tehnikov in inženirjev smo letos ustanovili Hematološko sekcijo laboratorijskih tehnikov, ki deluje v okviru Slovenskega združenja za klinično kemijo.
Vzporedno z razvojem v Ljubljani se je klinična hematologija razvijala v vseh velikih slovenskih bolnišnicah, kjer so jo razvijali specialisti internisti usmerjeni v hematologijo, ponekod pa specialisti transfuziologi.
40. jubilej bomo proslavili s strokovnim srečanjem, kjer bomo obravnavali najzahtevnejše načine zdravljenja v hematologiji, kot so presajanje krvotvornih matičnh celic in zdravljenje akutnih levkemij. Na strokovno srečanje smo povabili pionirja in Nobelovega nagrajenca s področja presajanja krvotvornih matičnih celic prof.dr.
E.	Donnalla Thomasa iz Seattla in Ambasadorja znanosti Slovenije prof.dr.Cirila Rozmana iz Barcelone, ki je uvedel presajanje krvotvornih matičnih celic v čpaniji. Dolgoletne izkušnje s presajanjem krvotvornih matičnih celic bo predstavil prof.dr.Boris Labar iz Zagreba, ki je ta način zdravljenja prvi uvedel v bivši skupni državi.
Prof. dr. Peter Černelč
predstojnik Kliničnega oddelka za hematologijo
Uvodnik/Leading article	.. n n ,r „ n
y oh 2 8
THE EVOLUTION OF BONE MARROW TRANSPLANTATION IN THE CURE OF HUMAN DISEASE
E. Donnait Thomas, M. D.
The modern era of marrow transplantation began about 1970 with development of the knowledge of the human leukocyte antigen (HLA) system for tissue typing and of supportive care technology for immunosuppressed patients without marrow function. At present more than 20.000 marrow transplant are being done each year.
Initial studies involved high-dose chemo-irradiation therapy and infusion of marrow from an HLA matched sibling for diseases such as aplastic anemia and leukemia after failure of all other therapy. Cure of a small number of these patients made it possible to do grafting earlier in the course of the disease with improvement in cure rate.
Increasing definition of the HLA system made it possible to identify unrelated donors compatible with the patient. More than 3 million volunteer donors are now listed in world-wide donor registries. The results of unrelated donor transplants approach the success with sibling donors.
E. Donnall Thomas, M. D., zaslužni profesor interne medicine, University of Washington School of Medicine, Nobelov nagrajenec za medicino leta 1990, se je rodil 15. marca 1920 v Texasu v Združenih državah Amerike. Leta 1943 se je vpisal na Harvard School of Medicine in zaključil študij medicine leta 1946, Kot mlad
Major complications have been graft-versus host disease (GVHD) and opportunistic infections. Better immunosuppressive regimens after grafting are helping to control GVHD. Better antibiotics for control of bacterial infections and antivirals, especially acyclovir and gancyclovir, have dramatically controlled infectious complications.
Long-term results of marrow transplantation will be presented showing 70 to 90 per cent survival and care for good risk patients (thalassemia, acute leukemia in remission or chronic myeloid leukemia in chronic phase) and 20 to 60 per cent for more advanced disease.
Topics of current research to be mentioned include the use of peripheral blood cells or cord blood cells for hematopoietic cell transplantation, new immunosuppressive agents for control of GVHD, the potential of adoptive immunotherapy, cytogenetic and polymerase chain reaction technology for selection of patients for early treatment of relapse and the use of donor leukocyte infusions.
zdravnik je delal med drugimi tudi z dr. Josephom Murrayem, ki je bil pionir zdravljenja s presaditvijo ledvic. Leta 1955 se je priključil skupini dr. Ferrebeeja v Mary Imogene Basset Hospital v Cooper-stownu, N. Y., kjer je pričel s presaditvami kostnega mozga pri bolnikih z levkemijo. Leta 1963 se je preselil v Seattle in pričel delati na Department of Medicine washingtonske univerze, kjer je skupaj s sodelavci nadaljeval s svojim delom. Leta 1975 se je s svojo skupino preselil v Fred Hutchinson Cancer Research Center v istem mestu. Ustanova je pod vodstvom profesorja Thomasa postala vodilni svetovni center na področju eksperimentalnega in kliničnega presajanja krvotvornih matičnih cele. S svojimi sodelavci, kot Bob Epstein, Rainer Storb, Dean Buckner, Reg Clift, Paul Neiman, Alex Fefer, Joel Meyers, Fred Appelbaum in John Hansen, je opravil v zadnjih dvajsetih letih več kot 4000 presaditev krvotvornih matičnih celic in nadaljeval z intenzivnim kliničnim in laboratorijskim raziskovalnim delom na področju presajanja.
S svojim raziskovalnim, predvsem pa kliničnim delom, je omogočil da je danes presaditev krvotvornih matičnih celic postala varen in uspešen način zdravljenja cele vrste poprej neozdravljivih bolezni predvsem krvotvornih organov (levkemije, aplastične anemije), pa tudi nekaterih podedovanih bolezni in nekaterih rakavih bolezni.
Za svoje pionirsko delo na področju presajanja krvotvornih matičnih celic je leta 1990, skupno s svojim prijateljem in sodelavcem na začetku strokovne poti dr. Josephom Murrayem, prejel najvišje priznanje za svoje delo, Nobelovo nagrado za medicino.
Jože Pretnar
EDICIN
vankomicin
rešuje smrtno nevarne
Med
/	N
najčistejšimi in
naj učinkovitejši mi
substancami
vankomicina
na svetu
/OfN |a|. Lek, tovarna farmacevtskih Verovškova 57 \\fj l“IV in kemičnih izdelkov, d.d. 1526 Ljubljana Telefon: 061/18831 11 Telefaks: 061 / 168 35 17	injekcijske stekleničke 1 x 1 g injekcijske stekleničke 1 x 0,5 g	
Podrobnejša navodila o zdravilu lahko dobite pri proizvajalcu.		
Research article/Raziskovalni prispevek
TREATMENT OF CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKAEMIA AND LOW-GRADE NON HODGKIN’S LYMPHOMAS WITH
FLUDARABINE
ZDRAVLJENJE KRONIČNE LIMFOCITNE LEVKEMIJE IN NE-HODGKINOVIH LIMFOMOV S
FLUDARABINOM
Ciril Rozman
Postgraduate School of Haematology »Farreras Valenti«, Hospital Clinic, Department of Medicine, University of Barcelona
Arrived 1998-04-03, accepted 1998-04-07; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-5-8
Key words:purine analogues; chronic lymphoproliférative disorders; patients; surviving
Abstract — Fludarabine belongs to the new generation of purine analogues, used for the therapy of chronic lymphoproliférative disorders.
In chronic lymphocytic leukaemia (CLL), fludarabine can bring about a remission in more than 70% ofpreviously untreated patients, ivith more than 25% achieving a complete remission. These figures are lower in relapsing or resistant CLL. Fludarabine is more active than either chlorambucil or the combination of cyclophosphamide, doxorubicin andprednisone (CAP). Lt is still unclear whether this higher activity will be translated into longer survival. In non-Hodgkin’s lymphoma (NHL), fludarabine is active chiefly in low-grade types, in which remission rates of about 60% have been achieved in predom inantly pretreated patients.
There is growing experience with the use offludarabine as part of combination therapy both in CLL and low-grade NHL. This drug can be combined with adriamycin, mitoxantrone, cyclophosphamide or glucocorticoids. Generally, higher response rates are achieved with combination therapy than with fludarabine alone.
The most important side-effects are myelosuppression, immunosuppression characterized by a severe and long-lasting depletion of CD4+ T lymphocytes, autoimmune haemolytic anaemia and transfusion-associated graft-versus-host disease.
Fludarabine alone or in combination with other agents should be considered as first line therapy when the aim is to cure the underlying condition, e.g. in young patients with aggressive disease in whom chemotherapy isfollowed by bone marrow transplantation. In other situations, fludarabine is still an experimental drug, whose definitive place will be determined from ongoing randomized trials.
Introduction
Among purine analogues, two generations can be distinguished. The older generation includes well-known drugs such as mercap-topurine, azathioprine, allopurinol, acyclovir and ganciclovir, which are employed in different clinical situations such as immunosuppression and treatment of leukaemia, gout or viral infections. The new generation of purine analogues comprises three cytotoxic agents, viz. pentostatin (2-deoxycoformycin), fludarabine (2-fluoro-ara-AMP) and cladribine (2-chlorodeoxyadenosine), which
Ključne besede: purinski analogi; kronične limfoproliferativne bolezni; bolniki; preživetje
Izvleček — Fludarabin je novejše zdravilo iz skupine purinskih analogov, ki ga uporabljamo za zdravljenje kroničnih limfoproli-ferativnih bolezni.
S fludarabinom dosežemo pri prej nezdravljenih bolnikih s kronično limfocitno levkemijo (KLL) več kot 70% remisij, od tega 25% popolnih remisij bolezni. Odstotek remisij bolezni pa je znatno manjši pri ponovnem poslabšanju bolezni in pri tistih, ki so bili rezistentni na zdravljenje z drugimi citostatiki. Pri zdravljenju KLL jefludarabin bolj učinkovit kot klorambucil ali CAP (ciklofos-famid, doksorubicin in prednizon). Kljub veliki učinkovitosti flu-darabina pri zdravljenju KLL, pa z ftjim zaenkrat še niso uspeli podaljšati preživetja bolnikov. Sfludarabinom dosežemo okoli 60% remisij bolezni pri poprej že zdravljenih bolnikih z ne-Hodgkino-vimi limfomi nizke stopnje malignosti (NHL).
Vse več je izkušenj, ki potrjujejo daje fludarabin še učinkovitejši pri zdravljenju bolnikov s KLL in NHL, čega uporabljamo v kombinaciji z adriamicinom, mitoksantronom, ciklofosfamidom aliglu-kokortikoidi.
Med nežele?iimi pojavi je najpomembnejše zaviralno delovanje na kostni mozeg in imunski odziv, predvsem s hudim in dolgotrajnim zmanjšanjem limfocitov T celic pomagalk. Poleg tega se lahko pojavi avtoimunska hemolitična ane?nija, po transfuziji krvi pa reakcija presadka proti gostitelju.
Fludarabin sam ali v kombinaciji z drugimi zdravili se priporoča kot prvo zdravljenje KLL pri mlajših bolnikih z napredovalo boleznijo, pri katerih želimo zdravljenje nadaljevati s presaditvijo kostnega mozga. Pri drugih bolnikih s kroničnimi limfoproliferativni-mi boleznimi je fludarabin še vedno zdravilo, ki se preizkuša in šele zaključki raziskav bodo določili natančno mesto uporabe.
are chiefly used for the therapy of chronic lymphoproliférative disorders. All three purine analogues of the new generation have been designed to impair purine salvage pathways by the inhibition of adenosine deaminase (ADA) or resistance to its action. All three agents are highly active suppressors of normal and malignant lymphoid cells, producing consequences similar to congenital ADA deficiency, in which elevation of intracellular deoxy-adenosine triphosphate (dATP) causes nicotinamide adenine nucleotide (NAD) depletion, so that this factor is unavailable for the dehydrogenases that generate ATP in lymphocytes; this
results in apoptotic cell death even when the mitotic rate is low
(1, 2).
Pentostatin directly inhibits ADA. In contrast, fludarabine and cla-dribine, which are halogenated analogues, do not inhibit ADA, but rather are resistant to the enzyme. Additionally, fludarabine and cladribine are phosphorylated intracellularly by deoxycytidi-ne kinase to their triphosphates, which act as chain terminators when incorporated into DNA (3). This process also has important consequences in potentiating the formation of ara-CTP after administration of cytosine arabinoside, with implications for clinical use of the drugs as part of combination therapy for acute myeloid leukaemia (4). Finally, fludarabine also has demonstrable action against a number of DNA repair enzymes, which predicts that it may show useful clinical synergy with agents that induce DNA strand breaks (5).
In the present article, the place of fludarabine in the treatment of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) and low-grade non-Hodg-kin’s lymphomas (NHL) will be discussed. The article is divided into the following sections: a) Use of fludarabine for the therapy of CLL; b) Use of fludarabine for the therapy of low-grade NHL; c) Fludarabine as part of combination therapy; d) Side-effects; e) Place of fludarabine in the treatment of CLL and low-grade NHL.
Use of fludarabine for the therapy of CLL
Experience in this field is growing worldwide. For illustrating the use of fludarabine for the therapy of CLL, we shall briefly analyze the results of two retrospective and two prospective trials.
At the MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas, a great deal of research on CLL therapy with fludarabine has been performed under the leadership of MJ Keating. Interesting results were obtained by comparing different dosage schedules in previously treated CLL patients (6). A 3-day fludarabine regimen (30 mg/m2 i.v. over 15-30 min daily given every 28 days) was compared to weekly fludarabine (the same dose given once a week), 5-day fludarabine (standard schedule) and 5-day fludarabine plus prednisone (30 mg/m2 p.o. daily given every 28 days). The overall response to 3-day fludarabine (46%) was significantly higher than that obtained with the weekly schedule (24%), and only slightly lower than that to 5-day fludarabine (58%) or 5-day fludarabine plus prednisone (52%). Conversely, the 3-day schedule was associated with a significantly lower incidence of infection and fever (14%) when compared to 5-day fludarabine (25%) or to 5-day fludarabine plus prednisone (29%). Importantly, different response rates were not translated into different survival rates. These depend on the disease phase in which the therapy is started (7). Previously untreated patients show more favourable survival than previously treated patients. The worst survival is observed in patients refractory to other cytotoxic drugs. The response to fludarabine can be predicted from several variables (8). A less favourable outcome is associated with advanced clinical stage, prior therapy, older age and low albumin levels. The bb2-microglobulin level is also very useful in this context (9). A response rate of 94% has been observed in patients with normal bb2 -microglobulin levels, whereas elevated levels are associated with progressively lower responses.
The Spanish Cooperative Group (10) obtained similar results in 68 patients with resistant or relapsing B-CLL. Complete remission (CR) was achieved in 4% of patients, partial remission in 24% (PR), a minor response in 37%, and the treatment failed in 35%. The most important factor in predicting the response was the disease phase. In relapsing CLL, there was a significantly higher rate of complete and partial remissions (62%) than in the resistant phase (21%) (p = 0.005). Remissions strongly influenced survival. Out of 19 patients achieving a remission, only 3 died, the median survival not being reached, whereas the patients not achieving a remission showed a median survival of only 11 months.
These results are very similar to those of an international retrospective analysis conducted by the National Cancer Institute (11),
which included more than 700 CLL. patients, mostly resistant to other therapies. CR was recorded in 3% of patients and PR in 29%. The median duration of remission was 13-1 months and the median survival only 12.6 months.
Two randomized trials have been reported. An American intergroup trial, a joint effort of several cooperative groups, compared fludarabine (25 mg/m2 i.v. given daily for 5 days) and chlorambucil (40 mg/m2 p.o. on day 1 given weekly for up to 12 months) in previously untreated CLL patients with active disease (12). Nonresponders, or responders whose CLL progressed within 6 months of treatment, were crossed over to the other arm. A significantly higher overall response rate of 70% was obtained among 166 evaluable patients with fludarabine (CR 27% + PR 43%), compared to 43% (CR 3% + PR 40%) among 173 patients on chlorambucil (p = 0.001). Response duration following fludarabine was longer than with chlorambucil (median 33 vs 17 months, p = 0.0002). Similarly, the median progression-free survival was 27 months for patients receiving fludarabine vs 17 months for patients on chlorambucil (p < 0.0001). With a median follow-up of 30 months, there was no difference in overall survival (p = 0.49), although this comparison was complicated by the crossover design of the study. In a European prospective randomized trial (13), fludarabine (25 mg/m2/day on days 1-5) was compared to a CAP combination regimen (cyclophosphamide 750 mg/m2/day on day 1, doxorubicin 50 mg/m2/day on day 1, and prednisone 40 mg/m2/day on days 1-5), both given for six months, in advanced-stage CLL patients. Of 196 evaluable patients, 100 were previously untreated whereas 96 patients had received prior therapy. Remission rates were significantly higher after fludarabine than after CAP, with overall response rates of 60% and 44%, respectively (p = 0.023). A higher response rate to fludarabine was observed in both untreated (71% vs 60%, p = 0.26) and pretreated (48% vs 27%, p = 0.036) cases, although the difference was statistically significant only in pretreated cases. In pretreated patients, the duration of remission and survival did not differ between the treatment groups; the median duration of remission was 324 days after fludarabine and 179 days after CAP (p = 0.22), while the median survival times were 728 days and 731 days, respectively. In untreated cases, on the other hand, fludarabine induced significantly longer remissions than CAP, with the median after fludarabine not reached and a median of 208 days after CAP (p < 0.001). This effect also translated into a tendency towards longer overall survival after fludarabine (p = 0.087).
Use of fludarabine for the therapy of low-grade NHL
Less research has been done in this field. It is clear that the efficacy of fludarabine is higher in low-grade NHL when compared to intermediate and high-grade disease. Hochster and co-workers (14) showed a remission rate of 52% (CR + PR) in low-grade NHL, as opposed to only 14% (p < 0.01) in intermediate- grade disease. Similar results have been achieved by other authors (15-19). In predominantly pretreated patients, a remission rate of nearly 60% was observed (Tab. 1). Definitive conclusions on the value of fludarabine in these disorders will be obtained from ongoing randomized trials (20).
Fludarabine as part of combination therapy
Experience in this field is growing (20-25). Mostly, patients resistant to other drugs have been treated with such schemes. In general, the response rates have been higher than with fludarabine alone. In our institution (25), we are investigating the efficacy of fludarabine combined with mitoxantrone and cyclophosphamide. In relapsing or resistant chronic lymphoproliferative disorders, we have observed a response rate of 70%. Most importantly, 66% of patients have experienced CR and 35% have shown molecular remissions. In low-grade NHL, it is very important to achieve CR since it is
Tab. 1. Activity offludarabine in low-grade NHL.
	N	Previously treated	CR (%)	PR (%)	CR + PR (%)
Whelan (1991) (l5>	34	34	18	21	39
Höchster (1991) (14)	25	25	20	32	52
Redman (1992) 08	40	40	13	45	58
Zinzani (1993) <17>	21	13	14	52	66
Solal-C. (1996) <18)	49	0	37	28	65
Rieux (1996) 091	108	65	28	35	63
AH	277	63.9%	21.7	35.5	57.2
CR - complete remission; PR - partial remission.
Tab. 2. Fludarabine combined with other cytotoxic agents in chronic lymphoproliférative disorders.
Author	Combi nation	Previously Condition treated		N (%)	CR (%)	PR (%)	All
Hohster (1994) <21>	FC	No	NHL	27	89	11	100
Robertson (1995) <22>	FA	Yes	CLL	30	20	35	55
Zinzani (1995) (23>	FMP	Yes	NHL	18	22	50	72
McLaughlin (1996) <24)	FMD	Yes	NHL	51	47	47	94
Barcelona (1997) (25)	FMC	Yes	Both	35	66	12	78
F - fludarabine; A - adriamycin; M - mitoxantrone; C - cyclophosphamide; P -prednisone; D - dexamethasone.
Tab. 3. Side-effects of fludarabine.
Myelosuppression
Immunosuppression
Infections
Autoimmune haemolytic anaemia Transfusion-associated graft-vs-host disease
Other: CNS demyelination, interstitial pneumonitis, tumor lysis syndrome, etc.
translated into longer survival (26). Probably, it is important also to achieve a molecular remission since it is associated with longer failure-free survival (27).
Side-effects
These are classified in Table 3- The three most important side-effects are myelosuppression, immunosuppression and infections. Myelosuppresion is the major dose-limiting adverse effect reported with fludarabine. More than 50% of patients develop a severe neutropenia (<0.5xl09/L), a decrease of Hb concentration by 20 g/ L from baseline and thrombocytopenia (<75X109/L) (28, 29). Severe immunosuppression is highly characteristic of all three purine-analogues of the new generation. There is an about 10-fold reduction in the number of peripheral blood CD4 + T lymphocytes (5, 8, 30) and, what is more important, the median time for normalization is about 40 months. In addition, there is a reduction of CD8 + T lymphocytes, B lymphocytes, monocytes and NK cells. Myelosuppression and immunosuppression are responsible for increased incidence of infections. These can be classified into several categories (6): severe (chiefly pneumonias and septicaemias), less severe, fever of unknown origin and opportunistic infections. The incidence of infections is higher when fludarabine is combined with prednisone. Most authors consider that prednisone should be avoided when administering fludarabine. Byrd and co-workers (31) analyzed 7547 cycles of fludarabine in 2269 patients. They found a 3-2% rate of opportunistic infections. Ninety-seven percent of cases were detected in patients previously treated with prednisone or alkylating agents. The most frequent causative agents were Pneumocystis carinii, Candida and atypical mycobacteria. Some authors advise preventive therapy against Pneumocystis carinii infections. Increased rates of listeriosis have also been observed in patients treated with fludarabine (32, 33).
An important side-effect is autoimmune haemolytic anaemia (AIHA). AIHA or a positive direct antiglobulin test (Coombs test or
DAT) can be observed during the clinical course in about 10-25% of CLL patients (34). From older literature, it is well known that such a side- effect can be associated with several cytotoxic drugs, which probably act as a »trigger-mechanism“, by increasing the already existing immune imbalance. There is no agreement on the incidence of »de novo» AIHA or DAT in fludarabine treated patients. In three retrospective analyses, this was 4.5% (35), 7.5% (10) and 15.4% (36). An important question is whether the incidence is higher with fludarabine than with other cytotoxic agents. This can be answered only with the use of prospective protocols. In the European prospective trial (13), the incidence of AIHA was very low. It appeared in only two out of 100 patients treated with fludarabine and in none of 96 patients who received the CAP combination therapy, the difference being insignificant. When all autoimmune phenomena were considered together, there were five cases in the fludarabine group and none in the CAP group (p = 0.03).
In an American prospective trial, this issue was not analyzed in detail, but apparently, the incidence of AIHA was higher in patients treated with fludarabine than in the chlorambucil group (37). It is noteworthy that fludarabine-associated AIHA is observed only in CLL and not in other diseases. The onset of AIHA can be extremely severe and often fatal, above all when the patient is being re-treated with fludarabine. Probably, fludarabine should best be avoided when there is a positive DAT or a previous episode of AIHA.
Another severe side-effect observed with fludarabine therapy is transfusion-associated graft-versus-host-disease (GVHD). The general incidence of transfusion-related GVDH is about one in a millon transfusions (38). The exact incidence in fludarabine-tre-ated patients is not known, but the published cases (39-41) suggest that it is much higher. The contributing factor is the severe immunosuppression caused by fludarabine. Since GVHD can be associated with a high mortality, it is advisable to irradiate the transfusion components, although this practice has been questioned (42).
Other side-effects have been observed less freqeuntly. A severe, progressive syndrome of CNS demyelination has been reported in patients receiving high-dose fludarabine (>90 mg/m2/day for 5 days) (28, 43), but only exceptionally with the currently employed dosage (28). Toxic interstitial pneumonitis has been observed by some authors,, including ourselves (44). A few cases of fludarabi-ne-induced tumor lysis syndrome have been reported in CLL and NHL (45). Alopecia appears in less than 2% of patients (28).
Place of fludarabine in the treatment of CLL and low-grade NHL
Before answering this question, it is important to define the aim of therapy in these diseases. This may be to cure the patient, to achieve a remission, to prolong the survival, to improve the quality of life or even to improve the cost/benefit ratio. All these objectives are important, but probably the most important ones are to cure the patient and, if this is not possible, to prolong the survival. When the aim of therapy is to cure the disease, fludarabine appears to be more active than the remaining drugs, since it causes a higher rate of CR and molecular remissions. Thus, in younger patients with aggressive disease, fludarabine, possibly combined with other drugs and followed by bone marrow transplantation, should be considered as first line therapy. In all other circumstances, fludarabine should be reserved as an experimental drug for prospective clinical trials, from which the definitive answers about its place in the treatment of CLL and low-grade NHL will be obtained.
References
1.	Seto S, Carrera CJ, Kubota M, Wasson DB, Carson DA. Mechanism of deoxyade-nosine and 2-chlorodeoxyadenosine toxicity to nondividing human lymphocytes. J Clin Invest 1985; 75: 377-83.
2.	Robertson LE, Chubb S, Meyn RE, Story M, Ford R, Hittelman WN et al. Induction of apoptotic cell death in chronic lymphocytic leukemia by 2-chloro-2, -deoxyadenosin and 9-B-D-arabinosyl-2-fluoroadenine. Blood 1993; 81: 143-50.
3.	Huang P, Chubb S, Plunkett W. Termination of DNA synthesis by 9-B-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine: a mechanism for cytotoxicity. J Biol Chem 1990; 265: 16617-25.
4.	Ghandi V, Estey E, Keating MJ, Plunkett W. Fludarabine potentiates metabolism of cytarabine in patients with acute myelogenous leukemia during therapy. J Clin Oncol 1993; 11: 116-24.
5.	Tallman MS, Hakimian D. Purine nucleoside analogs: Emerging roles in indolent lymphoproliférative disorders. Blood 1995; 86: 2463-74.
6.	Robertson LE, O’Brien S, Kantarjian H, Koller C, Beran M, Andreeff M et al. A 3-day schedule of fludarabine in previously treated chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 1995; 9: 1444-9.
7.	Keating MJ, O’Brien S, Kantarjian H, Plunkett W, Estey E, Koller C et al. Long-term follow-up of patients with chronic lymphocytic leukemia treated with fludarabine as a single agent. Blood 1993; 81: 2878-84.
8.	O’Brien S, Kantarjian H, Beran M, Smith T, Koller C, Estey E et al. Results of fludarabine and prednisone therapy in 264 patients with chronic lymphocytic leukemia with multivariate analysis-derived prognostic model for response to treatment. Blood 1993; 82: 1695-700.
9.	Keating MJ, Lemer S, Kantarjian H, Freireich EJ, O’Brien S. The serumB2-microglobulin (B2m) level is more powerful than stage in predicting response and survival in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Blood 1995; 86 Suppl: 606a (abstract no. 2412).
10.	Montserrat E, Lopez-Lorenzo JL, Manso F, Martin A, Prieto E, Arias-Sampedro J et al. Fludarabine in resistant or relapsing B-cell chronic lymphocytic leukemia. The Spanish Group Experience. Leukemia Lymphoma 1996; 21: 467-72.
11.	Sorensen JM, Vena DA, Fallavollita A, Chun HG, Cheson BD. Treatment of refractory chronic lymphocytic leukemia with fludarabine phosphate via the group C protocol mechanism of the National Cancer Institute: Five-year followup report. J Clin Oncol 1997; 15: 4548-465.
12.	Rai KR, Peterson B, Elias L, Shepherd L, Hines J, Nelson D et al. A randomized comparison of fludarabine and chlorambucil for patients with previously untreated chronic lymphocytic leukemia. A CALGB, SWOG, CTG/NCI-C and ECOG inter-group study. Blood 1996; 88: Suppl 1: I4la (abstract no. 552).
13.	The French Cooperative Group on CLL. Multicentre prospective randomised trial of fludarabine versus cyclophosphamide, doxorubicin, and prednisone (CAP) for treatment of advanced-stage chronic lymphocytic leukaemia. Lancet 1996; 347: 1432-8.
14.	Hochster HS, Kim K, Green MD, Mann RB, Neiman RS, Oken MM et al. Activity of fludarabine in previously treated non-Hodgkin’s low-grade lymphoma: Results of an Eastern Cooperative Group Study. J Clin Oncol 1992; 10: 28-32.
15.	Whelan JS, Davis CL, Rule S, Ranson M, Smith OP, Metha AP et al. Fludarabine phosphate for the treatment of low-grade lymphoid malignancy. Br J Cancer 1991; 64: 120-3.
16.	Redman JR, Cabanillas F, Velasquez WAS, McCaughlin P, Hagemeister FB, Swan F et al. Phase II trial of fludarabine phosphate in lymphoma: An effective new agent in low-grade lymphoma. J Clin Oncol 1992; 10: 790-4.
17.	Zinzani DL, Lauria F, Rondelli D, Berferat D, Raspadaor D, Bocchia M et al. Fludarabine: An active agent in the treatment of previously treated and untreated low-grade non-Hodgkin’s lymphoma. Ann Oncol 1993; 4: 575-8.
18.	Solal-Celigny P, Brice P, Brousse N, Caspard H, Bastion Y, Haioun C et al. Phase II trial of fludarabine monophosphate as first-line treatment in patients with advanced follicular lymphoma: a multicenter study by the Group d’Etude des Lymphomes de l’Adulte. J Clin Oncol 1996; 14: 514-9.
19.	19. Rieux C, Dumontet C, Bastion Y, Salles G, Espinouse D, Sonet A et al. Fludarabine treatment in indolent lymphoma patients: Analysis of 108 patients treated in one center. Ann Oncol 1996; 7: Suppl 3: 149 (abstract no. 552).
20.	Salles G, Tilly H, Delfau M-H, Bouabdallah R, MacIntyre E, Bosly A et al. GELF-94: A randomized prospective trial of therapeutic alternatives (intensive therapy with PBSCT or fludarabine) in poor prognosis follicular lymphoma (FL) patients (PTS) with molecular and cytogenetic studies (a GELA study). Ann Oncol 1996; 7: Suppl 3: 148 (abstract no-. 550).
21.	Hochster H, Oken M, Bennett J, Wolf B, Gordon L, Raphael B et al. Efficacy of cyclophosphamide (CYC) and fludarabine (FAMP) as first line therapy of low-
grade non-Hodgkin’s lymphoma (NHL) - ECOG 1491. Blood 1994; 84: Suppl 1: 383a (abstract no. 1517).
22.	Robertson LE, O’Brien S, Kantarjian H, Koller C, Beran M, Andreeff M et al. Fludarabine plus doxorubicin in previously treated chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 1995; 9: 943-5.
23.	23. Zinzani PL, Bendandi M, Tura S. FMP regimen (Fludarabine, mitoxantrone, prednisone) as therapy in recurrent low-grade non-Hodgkin’s lymphoma. Eur J Haematol 1995; 55: 262-6.
24.	McLaughlin P, Hagemeister FB, Romaguera JE, Sarris AH, Pate O, Younes A et al. Fludarabine, mitoxantrone, and dexamethasone: An effective new regimen for indolent lymphoma. J Clin Oncol 1996; 14: 1262-8.
25.	Author’s institution: Unpublished results.
26.	Lopez-Guillermo A, Montserrat E, Bosch F, Escoda L, Terol MJ, Marin P et al. Low-grade lymphoma: clinical and prognostic studies in a series of 143 patients from a single institution. Leuk Lymphoma 1994; 15: 159-65.
27.	Lopez-Guillermo A, Cabanillas F, McLaughlin P, Smith T, Hagemeister F, Rodriguez MA et al. The Clinical significance of molecular response in indolent follicular lymphomas. (Submitted).
28.	Ross SR, McTavish D, Faulds D. Fludarabine. A review' of its pharmacological properties and therapeutic potential in malignancy. Drugs 1993; 45: 737-59.
29- Cheson BD. Infectious and immunosuppressive complications of purine analog therapy. J Clin Oncol 1995; 13: 2431-48.
30.	Fenchel K, Bergmann L, Wijermans P, Engert A, Pralle H, Mitrou PS et al. Clinical experience with fludarabine and its immunosuppressive effects in pretreated chronic lymphocytic leukemias and low-grade lymphomas. Leuk Lymphoma 1995; 18: 485-92.
31.	Byrd JC, Hargis JB, Kester KE, Hospenthal DR, Knutson SW, Diehl LF. Opportunistic pulmonary infections with fludarabine in previously treated patients with low-grade lymphoid malignancies: A role for Pneumocystis carinii pneumonia prophylaxis. Am J Hematol 1995; 49: 135-42.
32.	Anaissie E, Kontoyiannis DP, Kantarjian H, Elting L, Robertson LE, Keating M. Listeriosis in patients with chronic lymphocytic leukemia who were treated with fludarabine and prednisone. Ann Intern Med 1992; 117: 466-9.
33.	Hequet O, de Jaureguibeny JP, Jaubert D, Gisserot O, Muzellec Y, Brisou P. Listerioris after fludarabine treatment for chronic lymphocytic leukemia. Hematol Cell Ther 1997; 39: 89-91.
34.	Foon KA, Rai KR, Gale RP. Chronic lymphocytic leukemia: New insights into biology and therapy. Ann Intern Med 1990; 113: 525-35.
35.	Di Raimondo F, Giustolisi R, Cacciola E, O’Brien S, Kantarjian H, Robertson LB et al. Autoimmune hemolytic anemia in chronic lymphocytic leukemia patients treated with fludarabine. Leuk Lymphoma 1993; 11: 63-8.
36.	Myint H, Copplestone JA, Orchard J, Craig V, Curtis D, Prentice AG et al. Fludarabine-related autoimmune haemolytic anaemia in patients with chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 1995; 91: 341-4.
37.	Rai KR (1997, personal communication).
38.	Linden JV, Pisciotto PT. Transfusion-associated graft-versus-host disease and blood irradiation. Transfus Med Rev 1992; 6: 116-23.
39- Briz M, Cabrera R, Sanjuan I, Fores R, Diez JL, Herrero M et al. Diagnosis of transfusion-associated graft-versus-host disease by polymerase chain reaction in fludarabine-treated B-chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 1995; 91: 409-11-
40.	Maung ZT, Wood AC, Jackson GH, Turner GE, Appleton AL, Hamilton PJ. Transfusion-associated graft-versus-host disease in fludarabine-treated B-chronic lymphocytic leukaemia. Br J Haematol 1994; 88: 649-52.
41.	Williamson LM, Wimperis JZ, Wood ME, Woodcock B. Fludarabine treatment and transfusion-associated graft-versus-host disease. Lancet 1996; 348: 472-3.
42.	Briones J, Pereira A, Alcorta I. Transfusion-associated graft-versus-host disease (TA-GVHD) in fludarabine-treated patients: is it time to irradiate blood component? Br J Haematol 1996; 93: 739-40.
43.	Chun HG, Leyland-Jones B, Cheson BD. Fludarabine phosphate: a synthetic purine antimetabolite with significant activity against lymphoid malignancies. J Clin Oncol 1991; 9: 175-88.
44.	Cervantes F, Salgado C, Montserrat E, Rozman C. Fludarabine for prolymphocytic leukaemia and risk of interstitial pneumonitis. Lancet 1990; 336: 1130.
45.	Killick S, Mercieca J, Nandi A, Behrens J. Fludarabine-induced tumour lysis in low-grade non-Hodgkin’s lymphoma. Clin Lab Haem 1997; 19: 79-80.
Professional article/Strokovni prispevek
AUTOLOGOUS STEM CELL TRANSPLANTATION IN THE TREATMENT OF ACUTE LEUKAEMIAS
AVTOLOGNA TRANSPLANTACIJA KRVOTVORNIH MATIČNIH CELIC PRI ZDRAVLJENJU
AKUTNIH LEVKEMIJ
Boris Labar, Nemet Damir, Mirando Mrsič, Vinko Bogdanič,Drago Batinič,
Branka Golubić-Čepulić, Mladen Petrovečki, Ivo Radman, Igor Aurer, Dubravka Sertič
Klinički bolnički centar Zagreb, Klinike i zavodi Rebro, Klinika za unutranje bolesti, Zavod za hematologiju. Kišpatičeva 12, Zagreb,
Hrvatska.
Arrived 1998-04-08, accepted 1998-04-20; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-9-10
Key words: acute myeloblastic leukaemia; acute lymphoblastic leukaemia; autologous transplantation; haematopoietic stem cell
Abstract—Background. A utologous haematopoietic stem cell transplantation (ASCT) is increasingly performed for the treatment of acute leukaemias. In the period between 1988 and 1998, 57ASCT in patients with acute myeloblastic leukaemia (AML) and 45 ASCT in patients with acute lymphoblastic leukaemia (ALL) have been performed. In 99 procedures the source of stem cells was bone marrow and in 3 procedures peripheral stem cells. Patients were prepared for transplantation with cyclophosphamide and total body hradiation or cyclophosphamide ivith high dose busulfan. Relapse rate in patients ivith AML in first remission was 39% and 72% in patients treated in advanced disease. Relapse rate in patients with ALL in first remission was 45% and 65% in patients treated in advanced disease. Estimated leukaemia free long term survival is 56% for AML patients in first remission and 23% for patients with advanced disease. Estimated leukaemia free long term survival is 54% for ALL patients in first remission and 29% for patients with advanced disease.
Conclusions. Autologous stem cell transplantation is effective and relative safe method of therapy for AML and ALL in first remission and results are approaching allografts. Relapse is still the major problem of autografting. Autologous stem cell transplantation is considered as routine treatment approach for adult patients with acute leukaemias in first remission and without matched family donor.
Introduction
Autologous stem cell transplantation (ASCT) has been increasingly performed for the treatment of acute leukaemias (1, 2). Most patients with acute leukaemia enter complete remission after induction chemotherapy (3, 4). The majority, however, relapses during the first year of remission despite various types of intensive consolidation and maintenance chemotherapy (5, 6). Therefore in the recent years, in adult patients especially patients younger then 60 years of age a postremission therapy has been intensified by performing allogeneic or autologous stem cell transplantation (7, 8).
Ključne besede: akutna mieloblastna levkemija; akutna limfo-blastna levkemija; avtologna presaditev; krvotvorne matične celice
Izvleček - Izhodišča. Avtologna presaditev krvotvornih matičnih celic se uporablja vse pogosteje pri zdravljenju bolnikov z akutnimi levkemijami. Avtorji so v obdobju od leta 1988 do 1998 opravili 57 avtolognih presaditev pri bolnikih z akutno mieloblastno levkemijo (AML) in 45 presaditev pri bolnikih z akutno limfoblastno levkemijo (ALL). Bolnike so pripravili na presaditev s ciklofosfami-dom in obsevanjem celega telesa ali pa s ciklofosfamidom in velikimi odmerki busulfana. Pri 99 presaditvah je bil vir krvotvornih matičnih celic kostni mozeg, pri 3 presaditvah pa matične celice zbrane iz periferne krvi. Delež relapsov po presaditvi pri bolnikih z AML v prvi remisiji je bil 39%, pri tistih v napredovalem obdobju bolezn i pa 72%. Delež relapsov po presaditvi pri bolnikih z ALL v prvi remisiji je bil 45%, pri tistih v napredovalem obdobju bolezni pa 65%. Ocenjeno preživetje brez ponovitve levkemije bolnikov z AML v prvi remisiji je 56%, v napredovalem obdobju bolezni pa 23%. Ocenjeno preživetje brez ponovitve levkemije bolnikov z ALL v prvi remisiji je 54%, v napredovalem obdobju bolezni pa 29%).
Zaključki. Avtologna presaditev kostnega mozga je učinkovit in varen način zdravljenja bolnikivzAML in ALL v prvi remisiji bolezni. Uspehi se približujejo rezultatom zdravljenja z alogenično presaditvijo. Relaps bolezni je še vedno najpomemnejši vzrok neuspeha avtologne presaditve. Avtorji menijo, da je avtologna presaditev krvotvornih matičnih celic ustaljen način zdravljenja odraslih bolnikov z akutno levkemijo, ki nimajo skladnega sorodnega darovalca.
In this study a preliminary report of the treatment results with ASCT for acute leukaemia is presented.
Patients and Methods
Patients: Between March 1988 and March 1998, patients with acute leukaemia (57 patients with acute myeloblastic leukaemia / AML/ and 45 with acute lymphoblastic leukaemia /ALL/ were autografted at the Division of Haematology, Department of Medicine, University Hospital Centre, Zagreb, Croatia. Table 1 indicates patients’ characteristics.
Fig. 1. The probability of leukaemia free survival (LFS) in patients with AML.
Tab. 1. Patients’ characteristics.
		AML	ALL
No of patients		57	45
Age	median	30	22
	(range)	2-54	4-50
Sex	M/F	30/27	26/19
Stage at ASCT	1“ CR/>1SI CR	42/15	29/16
Source of stem cell	BM/PBSC	55/2	44/1
AML - acute myeloblastic leukaemia; ALL - acute lymphoblastic leukaemia; BM -bone marrow; PBSC - peripheral blood stem cell; CR - complete remission
Stem cell: The source of stem cell was bone marrow in 99 patients and peripheral blood in 3. patients.
Conditioning: The conditioning regimen for ALL patients and proportion of AML consisted of cyclophosphamide and total body irradiation (9). Most of AML patients received busulfan and cyclophosphamide (10).
Methods of cryopreservation of stem cells, cell assessment and supportive care measures are described in details elsewhere (11).
Results
The probability of long term leukaemia free survival (LFS) of patients with AML in 1st complete remission (CR) is 56%. For patients with advanced disease the probability of LFS is 23% (Fig. 1). The relapse rate for patients autografted in 1st CR is 39% at 4 years, and for patients treated in advanced disease is 72% at 4 years. The probability of LFS for patients with ALL in 1st CR is 54% at 5 years and for patients in 2nd or 3rd remission 29% at 3 years. All six patients with ALL autografted in relapse died in the 1st posttransplant year (Fig. 2).
The probability of relapse for ALL patients autografted in Is' CR or advanced disease is 45% and 65% respectively.
The relapse is the major problem of autografting. For both AML and ALL patients relapse is the main cause of death in more than 80% of patients.
Discussion
Autologous stem cell transplantation is effective and relatively safe method for therapy of acute leukaemia in remission. The LFS of about 55% for both AML and ALL patients autografted in 1st CR is very encouraging although the number of patients is relatively
Months
Fig. 2. The probability of leukaemia free survival (LFS) in patients with ALL.
small. The LFS of autografted patients approaches our results of allografting (12). These results are superior to chemotherapy. For patients receiving intensive consolidation chemotherapy long term LFS for both AML and ALL patients in 1st CR is between 25 - 30% (13).
Relapse rate is still a major problem of autografting, and 40-45% of patients relapsed at 4 year period. Treatment related mortality of less than 10% is also reported by others (14). The mortality cause by the treatment procedure is not significantly different from those reported for the intensive consolidation chemotherapy (15).
In conclusion, autologous stem cell transplantation is routine treatment approach for adult patients with acute leukaemia in 1st complete remission.
References
1.	Stone RM, Mayer RJ. Treatment of the newly diagnosed adult with de novo acute myeloid leukaemia. Hematol Oncol Clin North Am 1993; 7: 47-64.
2.	Cripe LD. Adult acute leukemia. Current Problems Cancer 1997; 21: 1-64.
3.	Bishop JF. The treatment of adult acute myeloid leukemia. Sem Oncol 1997; 24: 57-69.
4.	Mrsic M, Nemet D, Labar B et al. Chemotherapy versus allogeneic bone marrow transplantations in adults with acute lymphoblastic leukemia. Transplant Proc 1993; 25: 1268-70.
5.	Reiffers J, Lacombe F, Puntous M. Treatment of acute myeloid leukemia in adult. Rev Pratic 1996; 46: 62-8.
6.	Burnett AK. The treatment of acute leukemia. Lancet 1997; 349: 270-5.
7.	Labar B, Maszi T, Morabito F et al. Allogeneic bone marrow transplantation for acute leukemia - IGCI experience. Bone Marrow Transplant 1996; 17: 1009-12.
8.	Labar B, Mrsic M, Nemet D et al. Allogeneic bone marrow transplantation versus chemotherapy for patients with acute myelogenous leukemia in first remission. Transplantationmed 1994; 6: 235-9.
9.	Labar B, Bogdanic V, Nemet D et al. Total body irradiation with or with lung shielding for allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 1992; 9: 343-7.
10.	Tutschka PJ, Copelan EA, Klein JP. Bone Marrow transplantation for leukemia following a new busulfan and cyclophosphamide regimen. Blood 1987; 70:1382-
8.
11.	Nemet D, Labar B, Bogdanic V et al. Autologous bone marrow transplantation for haematological malignancies - Experience of the Centre of Zagreb. Wien Med Wschr 1995; 145: 6l^.
12.	Labar B, Nemet D, Mrsic M et al. Autologous versus allogeneic marrow transplantation for patients with acute myeloid leukemia in lsl remission. Cancer Res Ther Control. Vol 5. In press 1998.
13.	Gorin Nc, Aegerter P, Auvert B for the EBMT. Autologous bone marrow transplantation for acute leukaemia in remission: an analysis on 1322 cases. Bone Marrow Transplant 1989; 4: 3-5.
14.	Labar B, Mrsic M, Nemet D et al. Age as a prognostic factor following stem cell transplantation in acute leukemia. Croatian Med J 1997; 38: 332-7.
15- Zittoun RA, Mandelli F, Willemze R et al. Autologous or allogeneic bone marrow transplantation compared with intensive chemotherapy in acute myelogenous leukemia. N Engl J Med 1995; 332: 217-23.
Strokovni prispevek/Professional article
NAŠE IZKUŠNJE PRI ZDRAVLJENJU BOLNIKOV S KRONIČNO MIELOIČNO TER AKUTNO LEVKEMIJO Z ALOGENIČNO PRESADITVIJO KRVOTVORNIH MATIČNIH
CELIC
ALLOGENEIC HAEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION FOR CHRONIC GRANULOCYTIC AND ACUTE LEUKAEMIAS IN UNIVERSITY MEDICAL CENTRE LJUBLJANA
Jože Pretnar,1 Samo Zver,1 Majda Bene d i k-Do In iča P
1 Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana 2 Hematološko-onkološka služba, Pediatrična klinika, Klinični center, Vrazov trg 1, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-03-13, sprejeto 1998-03-29; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-11-3
Ključne besede: akutne levkemije; kronična mieloična levkemija; alogenična presaditev; krvotvorne matične celice
Izvleček - Izhodišča. Alogenična presaditev krvotvornih matičnih celic je učinkovit način zdravljenja bolnikov z akutno in kronično mieloično levkemijo. Avtorji so v obdobju od leta 1989 do 1997 opravili 36 takih posegov pri bolnikih z različnimi vrstami levkemij. Pri 14 bolnikih s kronično mieloično levkemijo je bilo uspešnih 80% presaditev, pri 22 bolnikih z akutno levkemijo pa 50%. Najpogostejši vzrok smrti pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo je bila intersticijska pljučnica s citomegalovirusom, pri akutni limfoblastni levkemiji relaps bolezni, pri akutni mieloblast-ni levkemiji pa poleg relapsa še neželeni učinki zdravljenja (reakcija presadka proti gostitelju, veno-okluzivna bolezen jeter, trom-botična trombocitopenična purpura). Avtorji v razpravi primerjajo svoje rezultate s podatki iz literature.
Zaključki. Uspešnost zdravljenja akutnih levkemij in kronične mi-eloične levkemije z alogenično presaditvijo krvotvornih matičnih celic v ljubljanskem Kliničnem centru je primerljiva s podatki, ki jih najdemo v literaturi drugih evropskih in ameriških centrov.
Uvod
Prve presaditve krvotvornih matičnih celic (PKMC) so v Sloveniji pričeli izvajati hitro za prvimi poizkusi takega zdravljenja po svetu. Tako je Černelč opravil prvo PKMC pri bolniku z akutno levkemijo že leta 1960 v Mariboru (1). V naslednjih letih so opravljali PKMC pri agranulocitozah in drugih okvarah kostnega mozga tudi v drugih slovenskih bolnišnicah (2, 3). Zaradi številnih zapletov in slabih uspehov zdravljenja so v naslednjih letih PKMC opustili. To zdravljenje se je ponovno uveljavilo šele v sedemdesetih letih po odkritju sistema tkivnih antigenov. V Sloveniji smo pričeli s sodobnim načinom PKMC leta 1989. O podrobnostih zdravljenja s PKMC in o naših izkušnjah smo že poročali tudi v Zdravniškem vestniku (4, 5).
Key words: acute leukaemias; chronic granulocytic leukaemia; haematopoietic stem cells; allogeneic transplantation
Abstract—Background. Allogeneic haematopoietic stem cell transplantation is promising treatmentfor acute leukaemias and chronic granulocytic leukaemia. In the periodfrom 1989 till 1997authors performed 36 related allogeneic transplants for various types of leukaemia. The procedure was succesful in 80% of patients with chronic granulocytic leukaemia and in 50% of patients with acute leukaemias. The most frequent cause of the death in patients with chronic granulocytic leukaemia was cytomegaloviral interstitional pneumonia and relapse in patients with acute lymphoblastic leukemia. In patients with acute myeloblastic leukaemia authors, beside relapse observed also three causes of death related to the transplantation procedure (acute graft versus host disease, liver veno-occlusive disease and thrombotic-thrombocytopenic purpura). Authors discuss and compare their results with the published studies.
Conclusions. Allogeneic haematopoietic stem cell transplantation programme in University Medical Centre Ljubljana is running suc-cesfully and the results are comparable to the data published in the literature.
Bolniki in metode dela
Pregledali smo dokumentacijo bolnikov z akutno mieloblastno levkemijo (AML), akutno limfoblastno levkemijo (ALL) in kronično mieloično levkemijo (KML), ki smo jih zdravili z alogenično PKMC na Kliničnem oddelku za hematologijo in na Pediatrični kliniki od začetka leta 1989 do konca leta 1997. Vse bolnike smo pripravili na presaditev s kombinacijo velikih odmerkov ciklofos-famida in frakcioniranim obsevanjem celega telesa ali pa s kombinacijo velikih odmerkov ciklofosfamida in busulfana, ne glede na vrsto levkemije. Za preprečevanje akutne reakcije presadka proti gostitelju (aGVHD) smo uporabljali kombinacijo ciklosporina in metotreksata . Bolnike smo pred PKMC in po njej osamili v enoposteljnih sobah s sistemom obratne osamitve. Okužbe v obdobju hude nevtropenije smo preprečevali s kombinacijo kinolonov (najpogosteje ciprofloksacin) in protiglivnih zdravil (flukonazol). Leta
1991 smo pričeli bolnike po PKMC zdraviti z dejavniki, ki spodbujajo nastanek kolonij granulocitov ter granulocitov in makrofagov (G-CSF in GM-CSF). Značilnosti bolnikov, uspeh zdravljenja in vzrok smrti so prikazani na tabelah 1 in 2.
Tab. 1. Značilnosti bolnikov z ALL in AML, ki smo jim opravili
PKMC.
Tab. 1. Characteristics of the patients transplanted for ALL and
AML.
Bolnik Patient	Starost Leta Dla«noza Years Dia*n0sis		Datum PKMC Date of Tx	Datum dogodka Date of event	Vzrok smrti Cause of death
HM*	38	AML-S	01. 06.1989	21. 01. 1997	REL
KJ	18	AML - 2R	09. 09. 1989	28. 11. 1989	HEPATITIS
JD	25	ALL - IR	21. 11. 1991	/	/
VM	23	ALL - IR	05. 03. 1992	/	/
IS	35	AML - IR	21. 05. 1992	/	/
PE	35	AML - IR	01. 10. 1992	/	/
LA	32	AML - IR	18. 04. 1993	/	/
Dl	3	AML - IR	26. 05. 1993	/	/
PA	41	ALL - IR	19. 08. 1993	06. 04. 1994	REL
DM	37	AML-2R	07. 10. 1993	12. 04. 1994	REL
PM*	24	ALL - IR	20. 01. 1994	27. 02. 1995	REL
GV	37	AML - IR	31. 03. 1994	/	/
PR	38	AML-S	07. 10. 1994	/	/
HA	36	AML - 2R	08. 12. 1994	31. 12. 1994	VOD
PD	32	ALL - IR	08. 06. 1995	/	/
TM*	27	AM - IR	18. 01. 1996	05. 09. 1996	REL
Čl	47	AML - IR	19. 09. 1996	30. 12. 1996	TTP
KT	5	ALL - 2R	19. 11. 1996	27. 01. 1997	REL
TD	23	ALL - IR	05. 12. 1996	/	/
KM	18	ALE - IR	27. 02. 1997	/	/
EF	37	AML-S	19. 03. 1997	07. 11. 1997	REL
KK	45	AML IR	04. 07. 1997	27. 08. 1997	aGVHD
Bolniki označeni s * so imeli še drugo PKMC. Patients with * had second HSCT.
Legenda: AML - akutna mieloblastna levkemija (acute myeloblastic leukaemia); ALL - akutna limfoblastna levkemija (acute lymphoblastic leukaemia); S - sekundama levkemija (secondary leukaemia); 1R - 1. remisija (first remission); 2R - 2. remisija ali napredovala bolezen (second remission or advanced disease); REL - relaps (relapse); VOD - venookluzivna bolezen jeter (veno-occlusive liver disease); TTP -trombotična trombocitopenična purpura (thrombotic-thrombocytopenic purpura); aGVHD - akutna reakcija presadka proti gostitelju (acute graft versus host disease).
Tab. 2. Značilnosti bolnikov s KML, ki smo jim opravili PKMC. Tab. 2. Characteristics of the patients transplanted for CGL.
Bolnik Patient	Starost/Age Leta/Y ears	Datum PKMC Date of Tx	Datum dogodka Date of event	Vzrok smrti Cause of death
NS	29	21. 04. 1989	/	/
JA	26	30. 10. 1989	27. 12. 198	CMV-IP
OM	37	20. 09. 1990	/	/
ŽA	41	11. 04. 1991	/	/
LI	48	03. 12. 1992	/	/
PF	26	27. 01. 1993	/	/
HC	33	18. 11. 1993	/	/
MM	48	26. 05. 1994 .	14. 07. 1994	CMV-IP
GS	40	26. 01. 1995	/	/
MM	46	13. 04. 1995	/	/
PF	35	26. 10. 1995	/	/
GM	53	25. 04. 1996	/	/
VA	41	24. 10. 1996	12. 09- 1997	
KO	30	23. 01. 1997	/	/
Legenda: CMV-IP - citomegalovirusna intersticijska pljučnica (cytomegaloviral interstitional pneumonia; CŽS - prizadetost osrednjega živčevja (central nervous system involvement).
Rezultati
V devetletnem obdobju smo v Enoti za PKMC na Kliničnem oddelku za hematologijo in na Hematološkem oddelku Pediatrične klinike opravili skupno 60 PKMC. Od tega smo opravili 36 alogenič-nih PKMC pri bolnikih z levkemijami, in sicer 14 pri bolnikih s KML ter 22 pri bolnikih z akutnimi levkemijami. Od tega 14 PKMC pri bolnikih z AML in 8 PKMC pri bolnikih z ALL. Pri dveh bolnikih
z AML in enem bolniku z ALL smo zaradi relapsa bolezni opravili še drugo PKMC. Pri teh treh smo presadili krvotvorne matične celice, ki smo jih po stimulaciji z rastnim dejavnikom granulocitne vrste (G-CSF) zbrali iz periferne krvi. Starost bolnikov s KML je bila od 26 do 53 let, mediana 38,5 let. Starost bolnikov z ALL in AML je bila od 3 do 47 let, mediana 33,5 let. Pri vseh bolnikih je prišlo do delovanja presadka.
Od 14 bolnikov s KML so umrli trije (21%). Dva bolnika sta umrla drugi mesec po PKMC zaradi pljučnice, ki jo je povzročil citome-galovirus, ena bolnica pa je umrla 11 mesecev po presaditvi zaradi nepojasnjene prizadetosti osrednjega živčevja, najverjetneje va-skulitisa zaradi kronične reakcije presadka proti gostitelju (GVHD). Vsi drugi bolniki so živi, brez kliničnih in laboratorijskih znakov ponovitve levkemije.
Od 22 bolnikov z ALL in AML je umrlo 11 bolnikov (50%), in sicer trije z ALL (37%) in osem z AML (57%). Pri vseh treh bolnikih z ALL je bil vzrok smrti ponovitev bolezni po PKMC. Od osmih bolnikov z AML so štirje umrli zaradi ponovitve bolezni, drugi pa zaradi različnih zapletov, vezanih na presaditev (jetrna odpoved zaradi reaktivacije hepatitisa B, venookluzivna bolezen jeter, trombotična trombocitopenična purpura, septična okužba ob hudi akutni reakciji GVHD). Vsi trije bolniki, ki smo jim zaradi ponovitve levkemije opravili drugo PKMC, so umrli v kratkem času po presaditvi zaradi različnih zapletov, povezanih s posegom.
Razpravljanje
KML je s konvencionalnim zdravljenjem še vedno praviloma neozdravljiva bolezen. Alogenična PKMC, tako sorodna kot nesorodna, je znatno izboljšala napoved poteka te bolezni. Tako lahko s presaditvijo ozdravimo do 80% bolnikov (6, 7). Uspešnost presaditev, ki smo jih opravili v Ljubljani, se približuje tem odstotkom. S konvencionalnim zdravljenjem ALL in AML s kemoterapijo je možno trajno ozdraviti le majhno število teh bolnikov. Delež ozdravljenih bolnikov je okoli 10 do 40 odstotkov, odvisno od vrste levkemije (8, 9). Z alogenično PKMC ta odstotek povečamo na 40 do 70%. Uspešnost presaditve je odvisna od vrste prognostičnih dejavnikov, kot so starost bolnika, vrsta levkemije, citogenetične anomalije, stadij bolezni - prva remisija ali napredovala bolezen itd. (10-15). Odstotek uspešnih PKMC pri naših bolnikih z ALL je tak kot drugod. Nekoliko slabši pa so naši uspehi pri zdravljenju bolnikov z AML, saj je bilo zdravljenje neuspešno v več kot 50%. Taki rezultati so lahko le naključni, zaradi majhnega števila opravljenih presaditev, bolj verjetno pa so posledica deleža bolnikov z AML s slabimi kazalniki napovedi poteka (sekundarne AML, AML v napredovalem obdobju bolezni). Takih bolnikov je bilo v naši skupini 6 od 14 (42%). Če upoštevamo samo bolnike s primarnimi AML v prvi remisiji bolezni, naraste uspešnost presaditev na 62 odstotkov, kar je primerljivo z uspehi drugih centrov. V naši državi opravimo večino alogeničnih PKMC pri bolnikih z levkemijami. V zadnjih letih smo opravili od 4 do 7 takih posegov, kar predstavlja približno 2 do 4 alogenične PKMC na leto na en milijon prebivalcev. S tem smo se približali številu alogeničnih PKMC na milijon prebivalcev v razvitih državah srednje Evrope (Madžarska, Češka, Slovaška, Hrvaška). Se vedno pa znatno zaostajamo za skandinavskimi državami, nekaterimi državami zahodne Evrope in Izraelom, kjer opravijo od 10 do več kot 20 sorodnih alogeničnih PKMC na en milijon prebivalcev (16). Menimo, da alogenična PKMC tudi v okviru naših možnostih tako glede opremljenosti enote za PKMC kot števila osebja, bistveno izboljša prognozo in možnosti popolne ozdravitve pri bolnikih z akutnimi levkemijami in KML.
Zaključek
Alogenična PKMC predstavlja učinkovit način zdravljenja bolnikov z akutno levkemijo in kronično mieloično levkemijo, ki ga tudi v naši državi izvajamo že devet let. Uspešnost zdravljenja ALL, AML in KML v naši enoti lahko primerjamo s podatki, ki jih najdemo v
literaturi. Tudi število alogeničnih PKMC na en milijon prebivalcev se v Sloveniji postopno približuje številu presaditev na en milijon prebivalcev v državah srednje Evrope in nekaterih državah bivšega vzhodnega bloka, medtem ko je celotno število alogeničnih presaditev še vedno majhno tako zaradi samega števila prebivalcev Slovenije kakor tudi majhnega števila primernih sorodnih darovalcev.
Literatura
1.	Černelč M, Kušar V, Mihev I. Nenavadna komplikacija po transplantaciji kostnega mozga. Zdrav Vestn 1962; 31: 17-20.
2.	Viđali P. Primer toksične okvare kostnega mozga in terapija s transplantacijo kostnega mozga. Zdrav Vestn 1964; 33: 178.
3.	Pogačnik M. Uspešna terapija agranulocitoze s transplantacijo kostnega mozga. Zdrav Vestn 1964; 33: 179
4.	Pretnar J, Bohinjec M, Černelč P, Lukič L, Zwitter M. Presaditev kostnega mozga pri zdravljenju levkemij - naše prve izkušnje. Zdrav Vestn 1990; 59: 265-7.
5.	Pretnar J. Presajanje krvotvornih matičnih celic. Zdrav Vestn 1996; 65: 267-8.
6.	Gratwohl A. Bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia: longterm results. Bone Marrow Transpl 1993; 12: 509-16.
7.	Clift RA, Buckner CD, Thomas ED et al. Marrow transplantation for chronic myeloid leukemia: a randomized study comparing cyclophosphamide and total body irradiation with busulfan and cyclophosphamide. Blood 1994; 84: 2036-43.
8.	Roberts WM, Rivera GK, Raimondi SC et al. Intensive chemotherapy for Philadelphia-chromosome-positive acute lymphoblastic leukaemia. Lancet 1994; 343: 331-2.
9.	Chiu EKW, Chan LC, Liang R et al. Poor outcome of intensive chemotherapy for adult acute lymhoblastic leukemia - a possible dose effect. Leukemia 1994; 8: 1469-73.
10.	Sebban C. Allogeneic bone marrow transplantation in adult acute lymphoblastic leukemia in first complete reemission: a comparative study. J Clin Oncol 1994; 12: 2580-7.
11.	Reiffers J, Stoppa AM, Rigal-Huguet F et al. Allogeneic versus autologous bone marrow transplantation versus chemotherapy for treatment of acute myeloid leukemia in first complete remission. Bone Marrow Transplant 1991; 7: Suppl 2: 36.
12.	Zittoun RA, Mandelli F, Willemze R et al. Autologous or allogeneic bone marrow transplantation compared with intensive chemotherapy in acute myelogenous leukemia. N Engl J Med 1995; 332: 217-23.
13.	Blaise D, Gaspard AM, Stoppa AM et al. Allogeneic or autologous bone marrow transplantation for acute lymphoblastic leukemia in first complete remission. Bone Marrow Transplant 1990; 5: 7-12.
14.	Chao NJ, Forman SJ, Schmidt GM et al. Allogeneic bone marrow transplantation for high-risk acute lymphoblastic leukemia during first complete remission. Blood 1991; 78: 1923-7.
15.	Buckner CD, Clift RA. Allogeneic transplantation in acute myelogenous leukemia: are we stuck? Leukemia and Lymphoma 1993; 11: Suppl 2: 25-8.
16.	Gratwohl A, Flermans J, Baldomero H. Blood and marrow transplantation activity in Europe 1995. Bone Marrow Transpl 1997; 19: 407-19-
(flukonazol)
Diflucan
?re9 PC? rož
K***'
D¡fUican
100 mg
■¿¿¿■¿sz
Glivične okužbe kože in oni-homikoze
Odmerki:
50 mg/dan ali 150 mg/teden*
*za tineo versicolor je priporočljiv odmerek 50 mg/dan
Trajanje:
2-	4 tedne**
**za tineo pedis je morda potrebno 6 tedensko zdravljenje
3-	6 mesecev***
***onihomikoze
Vaginalna
kandidijaza
Odmerek:
150 mg
Trajanje:
Enkratni odmerek
Hitro zdravljenje glivičnih okužb z dolgotrajnim učinkom
Sistemska
kandidijaza
Orofaringealna	Kriptokoki
in sluznična	meningitis
kandidijaza
■	pri glivičnih okužbah kože
■	pri vaginalni kandidijazi
■	pri oportunističnih glivičnih okužbah
Odmerki:
400 mg (prvi dan) 200-400 mg/dan
Odmerki:
50 mg/dan*
*pri zelo hudih okužbah sluznice je ! morda potrebno 100 mg/dan
Odmerki:
400 mg (prvi dan) 200-400 mg/dan
Povzetek informacij za predpisovanje zdravila
Indikacije in odmerki: glej tabelo. Uporaba pri starejših: kot je
navedeno v tabeli, razen pri ljudeh z ledvičnimi okvarami pri katerih so potrebni manjši odmerki - glej popolne informacije za predpisovanje. Uporaba pri otrocih: pri otrocih ne smemo preseči najvišjega dnevnega odmerka, ki je primeren za odrasle - glej popolne informacije za predpisovanje in priporočljive odmerke za otroke. Dajanje zdraviia: DIFLUCAN lahko dajemo oralno ali v obliki intravenske infuzije. Odmerki so pri obeh načinih enaki. Kontraindikacije: Znana preobčutljivost na flukonazol ali sorodne triazole. Opozorilo: Pri bolnikih, pri katerih pride do pomembnega povečanja jetrnih encimov, moramo pred nadaljevanjem zdravljenja z DIFLUCANOM oceniti razmerje med tveganjem in koristnostjo. Poročajo tudi o anafilaktičnih reakcijah. Varnostni ukrepi: Ker so na voljo le omejeni podatki, odsvetujemo uporabo pri nosečnicah, razen kadar se zdi to lečečemu zdravniku nujno potrebno. Dojenje: ne priporočamo uporabe . Interakcije z drugimi zdravili: Potrebno je skrbno spremljanje bolnikov, ki istočasno jemljejo antikoagu-lanse, oralno sulfonilurejo ali fenltoin, ciklosporin in teofilin. Pri bolnikih, ki istočasno jemljejo rifampicln, so morda potrebni večji odmerki DIFLUCANA. Stranski učinki: Najpogostejši stranski učinki so vezani na gastrointestinalni trakt: slabost, abdominalno nelagodje, diareja in vetrovi. Poročajo tudi o kožnem izpuščaju. Pri bolnikih s hudo osnovno boleznijo so med zdravljenjem z DIFLUCANOM In primernimi učinkovinami opazili spremembe v testnih rezultatih ledvičnih in hematoloških funkcij ter bolezenske spremembe jeter, vendar pa sta klinična pomembnost in povezava z zdravljenjem še nepotrjeni.
Na željo posredujemo dodatne informacije. Pred predpisovanjem DIFLUCANA se je potrebno seznaniti s celotnimi informacijami za predpisovanje zdravila.
Trajanje:
6-8 tednov
Profilaksa:
200 mg/dan
* Blagovna znamka Pfizer Inc.
Pfizer International Corporatinon
Podružnica Ljubljana Dunajska 156,1113 Ljubljana - Slovenija tel.: 061/188 12 76
Trajanje:
Odvisno od kliničnega odziva
Profilaksa:
50 mg/dan
Trajanje:
1-2 tedna**
**pri okužbah sluznice je morda potrebno 30 dnevno zdravljenje
Profilaksa:
50 mg/dan
Strokovni prispevek/Professional article
AVTOLOGNA PRESADITEV KRVOTVORNIH MATIČNIH CELIC PRI OTROCIH S SOLIDNIMI TUMORJI IN NAŠE
IZKUŠNJE
AUTOLOGOUS STEM CELL TRANSPLANTATION FOR SOLID TUMORS IN CHILDREN AND OUR
EXPERIENCES
Majda Benedik-Dolničar, Jožica Anžič
Služba za onkologijo in hematologijo, Pediatrična klinika, Klinični center, Vrazov trg 1, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-04-07, sprejeto 1998-04-16; ZDRAV VESTN 1998; 67; Suppl I: 1-15-8
Ključne besede: otrok; rak; visoko odmerjena kemoterapija; kostni mozeg
Izvleček — Izhodišča. Uspešnost zdravljenja otrok s solidnimi tumorji in zasevki oz. ponovitvijo bolezni je slaba. Zato intenzivno preučujejo načine zdravljenja s povečanimi odmerki kemoterapije s presaditvijo krvotvornih matičnih celic. Predstavljamo ta način zdravljenja pri pogostejših solidnih tumorjih otrok in pri štirih lastnih bolnikih.
Zaključki. Čeprav je minilo že skoraj 20 let od prvih poizkusov, pa do danes še ni uspelo dokazati odločilnega pomena tega zdravljenja pri solidnih tumorjih otrok, razen pri nevroblastomu z zasevki.
Uvod
Letno zboli za rakom 11/100000 otrok do 15 leta starosti, kar pomeni v Sloveniji približno 50 otrok. V Sloveniji, tako kot tudi v razvitih državah, zdravimo mladostnike do dopolnjenega 18 leta praviloma v otroški ustanovi, kjer imajo zagotovljeno nadaljevanje šolanja in možnosti za druge dejavnosti, ki jih potrebujejo za čim manj moten razvoj. Tako obravnamo vsako leto približno 60 otrok, ki na novo zbolijo za rakom.
Najpogostejša maligna bolezen pri otrocih je levkemija (30%), sledijo tumorji osrednjega živčnega sistema (20%), limfomi (13%), nevroblastom (6,8%), skupina tumorjev mehkih tkiv (6,2), kjer je najpogostejši rabdomiosarkom, Wilmsov tumor (5,7%), kostni tumorji (4,7%), očesni tumorji (2,5), germinalni tumorji (2,4), tumorji jeter (1,3%) in različni drugi zelo redki tumorji (7,4%). Danes je dolgotrajno preživetje otrok z vsemi oblikami raka približno 60-odstotno.
Presaditev krvotvornih matičnih celic pri otrocih s solidnimi tumorji
Uspešnost zdravljenja otrok s solidnimi tumorji z zasevki oz. ponovitvijo bolezni je slaba. Zato intenzivno preučujejo zdravljenje z zelo visokimi odmerki citostatikov z obsevanjem celega telesa ali brez t.i. mieloablativno zdravljenje (MAZ), ki povzroči trajno popolno odpoved kostnega mozga, če zdravljenju ne priključimo še
Key words: child; cancer; high-dose chemotherapy; bone mar-roiv
Abstract — Background. Efficiency of treatment for children with solid tumors with métastasés at presen tation or with recurrent disease is rather bad with conventional treatment. More intensive treatment modalities with autologous stem cell rescue is in spotlight of current research. We report our experiences in autologous bone marroiv transplantation in treatment of solid malignancies in four patients.
Conclusions. Although almost 20 years after first attempts, except in treatment of metastatic neuroblastoma, superiority of this treatment in children with solid malignancies with bad prognostic features is still not convincingly proved.
presaditve krvotvornih matičnih celic (KMC). Ker je dokazano, da MAZ s presaditvijo KMC lahko pozdravi bolnike z malignimi krvnimi boleznimi, ki se niso odzvale na običajno zdravljenje, so v poznih 70. letih pričeli s takim zdravljenjem še pri solidnih tumorjih s slabo napovedjo poteka. Izbrali so najprej citostatike, ki imajo dokazano povečan učinek na tumor ob povečanem odmerku. Ti citostatiki morajo biti toksični za kostni mozeg, a povzročati čim manj okvar drugih organov in čim manj poznih posledic. Te zahteve izpolnjuje alkilirajoči citostatik melfalan, ki je predvsem toksičen le za kostni mozeg in sicer premosorazmemo odmerku. Ima kratko razpolovno dobo, kar omogoča uporabo kostnega mozga, ki ni zmrznjen in je dokazano učinkovit v visokih odmerkih pri otroških solidnih tumorjih, ki so neobčutljivi na običajno zdravljenje ali se po običajnem zdravljenju ponovijo. Poleg melfa-lana, ki je najpomembejši, pa nekatere sheme vključujejo tudi visoke odmerke etopozida, thiotepe, ciklofosfamida, busulfana, karboplatina in doksorubicina, vendar še ni dokazano, da je kakršnakoli kombinacija boljša od samega melfalana (1).
Danes celo pri majhnih otrocih s telesno težo 8 do 10 kg vedno več uporabljamo avtologno presaditev perifernih krvotvornih matičnih celic (PKMC). Dokazali so, da število nevtrofilcev in trombocitov pri tem načinu dosti hitreje poraste kot po avtologni oz. alogenični presaditvi kostnega mozga z uporabo rastnih dejavnikov hematopoeze ali brez. Uspešnost PKMC je odvisna od števila matičnih celic (CD 340, ki jih zberemo v periferni krvi (prag za hitro obnovitev hematopoeze je 2-krat 106 CD 34+ celic/ kg TD (1). Zapleti niso pogostejši, pa tudi obdobja brez ponovitve bole-
zni se ne spremenijo. Celoten postopek je cenejši za 17% pri odraslih in celo za 29% pri otrocih. Klinični in ekonomski razlogi torej govorijo v prid avtologni presaditvi PKMC pri solidnih tumorjih (2).
Zaradi nevarnosti, da presadimo tudi tumorske celice, moramo kakovost presadka PKMC tako kot avtologni presadek kostnega mozga, preveriti z ustreznimi laboratorijskimi tehnikami, ki so odvisne tudi od vrste tumorja. V uporabi je metoda polimerazne verižne reakcije (PCR) in dokazovanje tumorskih celic s specifičnimi monoklonskimi protitelesi. V preteklosti so uporabljali za očiščenje kostnega mozga mafosfamid ali imunomagnetno tehniko, kar pa je podaljšalo obdobje aplazije za en teden. Glavno težavo predstavlja zbiranje kostnega mozga oz. PKMC čim bolj zgodaj v procesu zdravljenja, ko matične celice še niso osiromašene ali poškodovane in je zato njihov izkoristek večji, ob tem pa naj ne bi bilo tumorskih celic (1).
Vendar je uspešnost zbiranja matičnih celic pri solidnih tumorjih še vprašljiva, ker je za zdaj še vedno težko povsem odstraniti tumorske celice. Z današnjimi tehnikami lahko zmanjšamo delež tumorskih celic največ za 1 —4 logaritme, pri tem pa izgubimo do 50% CD 34* celic. Alogenična presaditev KMC zaenkrat ni dala boljših uspehov zdravljenja (1).
Postopki presajanja KMC so zvišali preživetje pri bolnikih z nevro-blastomom in Ewingovim sarkomom z metastazami za 30% (1). Kljub temu pa, razen pri nevroblastomu, pomen tega načina zdravljenja pri solidnih tumorjih še ni dokazan, ker so vsi podatki še vedno le rezultat posameznih študij.
Nevroblastom
Nevroblastom, ki je najbolj pogost solidni tumor pri otroku zunaj centralnega živčnega sistema, je sicer redek tumor. Pojavlja se pri 0,7 do 1 otroku / 100000 otrok letno do 15 leta, večinoma že do 5 leta starosti. 70% bolnikov uvrstimo glede na starost (več kot eno leto), stadij (4 po mednarodni klasifikaciji stadijev nevroblastoma) in/ali neugodno histologijo in biologijo (pomnožitev kopij onko-gena N-myc) v skupino z visokim tveganjem. Pri približno 85% teh bolnikov je odgovor na kemoterapijo, ki vključuje tudi cisplatin, dober, vendar se pri večini bolnikov bolezen kasneje ponovi (3). Ko so uvedli še MAZ s presaditvijo kostnega mozga, so ugotovili, da ni izrazito boljših rezultatov, le bolezen se je ponovila kasneje (4). Vloga obsevanja celega telesa še ni povsem razjasnjena. Čeprav je nevroblastom radiosenzitiven tumor, pa je odmerek pri obsevanju celega telesa le 12 GY, kar je manj, kot je dokazani učinkoviti odmerek pri nevroblastomu (od 20-35 GY), ki pa povzroča pomembne pozne posledice. Dokazali so enako učinkovitost le z visoko odmerjeno kemoterapijo s thiotepo in ciklofosfa-midom brez obsevanja celega telesa (3). Pri nekaterih bolnikih so namesto obsevanja uporabili zdravljenje z 131-J-metajodbenzil-gvanidinom (MJBG) v odmerku od 100 do 300 mCi, ki ga kopičijo tkiva in tumorji nevralnega grebena (5,6). Poleg tega, da lahko uniči tumor, je toksičen le za kostni mozeg, vendar v glavnem le, če je infiltriran z malignimi celicami. Uspešnost tega načina je bila 57%, vendar brez dolgotrajnih remisij. Da bi povečali učinkovitost tega načina obsevanja, so uvedli še hiperbarično komoro za povečanje oksigenacije tumorja (7). Poizkušali so tudi z novimi načini zdravljenja, n.pr. z retinoično kislino, da bi sprožili diferenciacijo nevroblastomskih celic v benigne ganglionevromske (4). Vseeno pa MAZ in avtologna presaditev KMC očiščenih tumorskih celic, v prvi popolni ali zelo dobri remisiji omogoča, da preživi 5 let 35-50% bolnikov (8). To pa je v primerjavi z le 5-18% pri konvencionalni kemoterapiji bistven napredek (9). Ni pa še povsem jasno, ali z intenzivno kemoterapijo, operacijo in lokalnim obsevanjem dosežemo bistveno slabše rezultate (8).
Dober odziv na kemoterapijo je pomemben za napoved poteka uspešnosti presaditve KMC.
Avtologna presaditev KMC po MAZ lahko izboljša prognozo nevroblastoma z visokim tveganjem, vendar je uspešnost tega načina odvisna od prisotnosti tumorskih celic. Nedavno so odkrili, da so
preostale nevroblastomske celice zelo klonogene in povzročajo ali pripomorejo k ponovitvi bolezni. Zato skušajo tumorske celice odstraniti iz presadka z različnimi laboratorijskimi tehnikami - z imunoadsorpcijo ali imunomagnetno pozitivno selekcijo osamijo le CD34+ matične celice (10). Anti-GD2 protitelo pa ima neposreden citotoksičen učinek na nevroblastomske celice. Ko bo to protitelo na voljo komercialno, bo lahko učinkovito odstranilo oz. zmanjšalo nevroblastomske celice in vitro (1). Najpogostejši vzrok neuspešne presaditve matičnih celic je prisotnost tumorskih celic v telesu ali v avtolognem presadku KMC (10). Kajti nevroblastomske celice v krvnem obtoku so zelo klonogene in tvorijo tumor. Metode čiščenja pa so omejene, v najboljšem primeru zmanjšajo delež tumorskih celic za 2-4 logaritme. Nevroblastomske celice so označili z genom, ki je rezistenten na neomicin. Nato so pri bolnikih s presaditvijo neočiščenega kostnega mozga te celice dokazali na mestu ponovitve bolezni. Vse to dokazuje, da vrnjene nevroblastomske celice odločilno prispevajo k ponovitvi bolezni (3).
Rabdomiosarkom
Bolniki z mehkotkivnimi sarkomi z zasevki ob odkritju bolezni, rabdomiosarkom je med njimi najpogostejši, imajo zelo slabo napoved poteka. Tisti, ki imajo zasevke v pljučih, imajo le 10-20% možnosti preživetja, z zasevki v kosteh ali kostnem mozgu pa manj kot 10%. Pomembno je odmerjanje in sestava kemoterapije. Kaže, da je intenzivna kemoterapija z odmerki obsevanja, ki so dokazano učinkoviti za to vrsto bolezni, odločilnejše za izboljšanje zdravljenja kot pa presaditev kostnega mozga ali PKMC.
Ewingov sarkom
Ewingov sarkom je maligni nediferencirani tumor, ki izhaja večinoma iz kosti in redkeje iz mehkih tkiv. Danes so dokazali klinično in v poizkusih, da izhaja iz primitivnega nevralnega tkiva (11). S povečanjem odmerkov ifosfamida, vinkristina, doksorubicina z ali brez etopozida, se je povečal delež bolnikov brez ponovitve bolezni po treh letih od odkritja na približno 70%. Kljub intenzivnejšemu prvemu zdravljenju pa še vedno najdemo podskupine bolnikov n.pr. z zasevki ob odkritju bolezni, predvsem v kostnem mozgu in kosteh, z obsežnim primarnim tumorjem (pogosto aksi-alnega izvora kot je medenica). Pri teh bolnikih je dolgotrajno preživetje le 20-30%, tako kot pri bolnikih s ponovitvijo bolezni (1, 11, 12). Študija kaže, da obsevanje celega telesa, melfalan in etopozid v visokih odmerkih s karboplatinom ali brez ter presaditev KMC v obdobju, ko ni več mogoče dokazati bolezni, lahko podaljša preživetje teh bolnikov na 45 +/-12% v 6 letih od začetka zdravljenja. Druga študija pa govori, da je busulfan v zelo visokih odmerkih in melfalan brez obsevanja vsega telesa uspešen v 52% po 3 letih od diagnoze (1). V raziskavi, v katero je bilo vključenih 17 bolnikov s slabo napovedjo, pa se je pokazalo, da v vseh 4 primerih z alogenično presaditvijo kostnega mozga ni prišlo do ponovitve bolezni, v ostalih 13 primerih z avtologno presaditvijo, pa kar v osmih. Zato so v novem poizkusu s 13 bolniki, petim dodali poleg avtologne presaditve kostnega mozga še interlevkin-2, da bi sprožil antitumorske mediatorje (ena ponovitev bolezni), 8 pa ne (5 ponovitev bolezni). Sklepali so, da bi morda še boljše rezultate lahko dosegli z imunološkimi antitumorskimi mehanizmi, ne pa z dodatnim povečevanjem odmerkov kemoterapije in obsevanjem (11).
Možganski tumorji
Tumorji osrednjega živčnega sistema so najbolj pogost soliden tumor v otroški dobi.
Visoko maligni glialni tumorji so z običajnim zdravljenjem praviloma smrtni. Manj kot 10% otrok z nepopolno kirurško odstranjenim gliomom 4. stopnje malignosti živi 1 leto; nobeden pa ne več
po 3 letih. Dodatno obsevanje podaljša preživetje po 3 letih na manj kot 10%. Čeprav so ti tumorji nedvomno občutljivi na kemoterapijo, je malo dokazov, da bi dodatna kemoterapija po operaciji in obsevanju razen pri določenih skupinah meduloblastoma povečala preživetje. Kemoterapija je pri teh bolnikih slabo učinkovita morda zato, ker v standardnih odmerkih zaradi pregrade ne doseže osrednjega živčnega sistema.
Poizkusili so s kombinacijo zelo visokih odmerkov thiotepe in ciklofosfamida ter hiperfrakcioniranim obsevanjem (lahko zmanjša kasne posledice obsevanja na normalnem možganskem tkivu) primarnega tumorja in avtologno presaditvijo kostnega mozga pri bolnikih z difuznim, infiltrativno rastočim gliomom možganskega debla in astrocitomom 3. ali 4. stopnje. Skupina je imela le 9 bolnikov. Pri dveh je bil dokazan delni odgovor na kemoterapijo. Po dodatnem obsevanju sta bila dva otroka (eden z majhnim in eden z delnim odgovorom na kemoterapijo) v popolni remisiji, ki je trajala več kot 22 mesecev. Mogoče bodo dodatne študije odkrile bolnike, ki bodo najverjetneje odgovorili na kombinacijo obsevanja in visoko odmerjeno kemoterapijo (13).
Kaže, da zdravljenje ponovitve meduloblastoma z MAZ in presaditvijo KMC obeta več. Ker povzroča obsevanje kraniospinalne osi otrok pred 3. letom starosti težke pozne posledice, zdaj v mnogih centrih zdravijo meduloblastom po operaciji z običajno kemoterapijo, da lahko obsevanje odložijo na kasneje ali pa sploh ne obsevajo. Če se je bolezen ponovila, so jih po operaciji zdravili z busulfanom in thiotepo v visokih odmerkih ter presaditvijo kostnega mozga, kasneje pa so še lokalno obsevali tumor. Pri polovici od 20 bolnikov, so dosegli približno 31 mesečno obdobje brez bolezni. MAZ naj bi torej bilo učinkovito pri ponovitvi meduloblastoma (1).
Vi ilmsov tumor (nefroblastom)
Večino otrok z Wilmsovim tumorjem lahko pozdravimo s kemoterapijo in operacijo. Nekateri potrebujejo še obsevanje. Pri okoli 20% vseh se bolezen ponovi in polovica teh jih umre (14). Pri neugodnem rabdoidnem histološkem podtipu z nelokalizirano boleznijo, kjer je ozdravljenje še vedno manjše kot 30%, in nekaterih prognostično slabih oblikah ponovitve lahko z MAZ in KMC dosežemo ozdravljenje. Pred presaditvijo so uporabljali visoke odmerke melfalana in vinkristina pa tudi etopozida ter karbopla-tina. Vse kaže, da je tak način zdravljenja pri rezistentnem ali tumorju s slabo napovedjo poteka upravičen. Teoretično lahko Wilmsov tumor, ki je zelo občutljiv na kemoterapijo, tako kot B celični ne-Hodgkinov limfom ozdravimo pri ponovitvi z zvišanimi odmerki enakih citostatikov, kot jih je bolnik dobil prvič (1).
Retinoblastom
Zdravljenje retinoblastoma je uspešno v več kot 90%. Zlasti hema-togeno razširjen retinoblastom zunaj očesa ima še vedno slabo napoved poteka. Ker pa je retinoblastom občutljiv na kemoterapijo, je zdravljenje s kemoterapijo in obsevanjem pri razširjeni bolezni zunaj očesa uspešno v več kot 50%. Opisan je bolnik s ponovitvijo bolezni z odaljenimi zasevki, ki je bil še 17 mesecev po presaditvi kostnega mozga brez znakov bolezni. Remisijo bolezni so dosegli z običajno intravensko in intratekalno kemoterapijo, nato pa so mu po cisplatinu, etopozidu, melfalanu v visokih odmerkih obsevali celo telo (12 GY) in opravili avtologno presaditev kostnega mozga. Z monoklonskimi protitelesi so ob odvzemu kostnega mozga dokazali, da ni bilo več malignih celic (15).
Naše izkušnje
Na hemotoonkološkem oddelku Pediatrične klinike v Ljubljani smo v obdobju od začetka leta 1991 do konca leta 1996 presadili avtologni kostni mozeg pri 4 otrocih s solidnim tumorjem z zasevki. Dva otroka sta imela nevroblastom, dva pa rabdomiosarkom.
Predstavitev bolnikov z nevroblastomom
Bolnik 1
Pri dečku, starem 13 mesecev, smo maja 1991 dokazali nevroblastom v levi nadledvični žlezi, v stadiju II. Zdravljen je bil le z operacijo. Julija 1992 smo ponovno odkrili nevroblastom, tokrat z zasevki v kostnem mozgu in kosteh. Pred avtologno presaditvijo kostnega mozga je prejel intravensko en krog kemoterapije (ciklofosfamid, cisplatin, tenipozid), dvakrat MJBG v odmerku 150 in 100 mCi. Ko ni bilo več znakov aktivne bolezni smo odvzeli kostni mozeg (brez čiščenja). Zatem je prejel še dva kroga kemoterapije (vinkristin, DTIC, ifosfamid, adriamicin oz. vindezin, cisplatin, etopozid). Aprila 1993 je bila po visokih odmerkih karboplatina in melfalana opravljena avtologna presaditev kostnega mozga, kljub znakom začetnega napredovanja bolezni. 17. dan po avtologni presaditvi kostnega mozga je umrl zaradi sepse. Pri obdukciji so ugotovili zasevke tumorja v lobanji in spodnjem delu desne stegnenice.
Bolnik 2
Deklica, stara 7 let in pol je bila sprejeta na kliniko zaradi nevroblastoma z zasevki v kostnem mozgu (stadij IV) avgusta 1992. Po enem krogu ciklofosfamida, cisplatina, tenipozida je prejela MJBG 100 in 142 mCi i.v. ter še dva kroga kemoterapije (vinkristin, DTIC, ifosfamid, adriamicin oz. vindezin, cisplatin, etopozid). Po tem zdravljenju pri citološkem pregledu nismo več našli malignih celic v kostnem mozgu in deklici je kirurg odstranil ostanek še delno vitalnega tumorja leve nadledvične žleze. Nato je prejela še dva kroga enake kemoterapije. Ob tem ji je bil dvakrat odvzet kostni mozeg (brez čiščenja). Junija 1993 je bila po visokih odmerkih karboplatina in melfalana opravljena avtologna presaditev kostnega mozga. Junija 1995 je bila dokazana ponovitev nevroblastoma v trebuhu ob aorti levo, v mediastinumu in v kosteh. Po 6-mesečnem poizkusu zdravljenja z MJBG 200 in 100 mCi v kombinaciji z hiperbarično komoro ter enem ciklusu kemoterapije (karboplatin, etopozid) je deklica umrla zaradi intrakranial-ne krvavitve v času delne remisije bolezni.
Predstavitev bolnikov z rabdomiosarkomom
Bolnik 1
Devet let star deček je bil zaradi rabdomiosarkoma mehkih tkiv leve dlani s številnimi kostnimi zasevki sprejet oktobra 1995- leta. Prejel je 8 krogov izmenjajoče se intenzivne kemoterapije (epirubicin, karboplatin, vinkristin; aktinomycin D, ifosfamid, vinkristin oz. etopozid, ifosfamid, vinkristin) po shemi SIOP-a za mehkotkivne tumorje z zasevki. Po 6 krogih, ko je bil brez kliničnih znakov bolezni, smo mu odvzeli kostni mozeg. Med nadaljevanjem kemoterapije je bil še obsevan na vseh znanih mestih tumorja z 47 do 50 GY. Junija 1996 je sledila zelo visoko odmerjena kemoterapija z melfalanom in avtologna presaditev kostnega mozga. Posledice zdravljenja so alopecija v področju obsevanja glave, težave pri odvajanju vode ter pareza spodnjih okončin. Marca 1998 se je bolezen ponovila v trebuhu ob hrbtenici, deloma še v področju, kjer je bil obsevan.
Bolnik 2
Deklica, stara 10 let, je bila sprejeta junija 1996 zaradi rabdomiosarkoma desne goleni v stadiju IV (zasevki v oddaljenih bezgavkah in hilusu pljuč). Po 8 krogih izmenjajoče se intenzivne kemoterapije po shemi SIOP-a za mehkotkivne tumorje z zasevki smo ji, ko je bila bolezen v delni dobri remisiji, odvzeli kostni mozeg. Obsevanje primarnega mesta tumorja je prejela pri 7. in 8. ciklu kemoterapije v odmerku 41 GY, v področju zasevkov v bezgavkah pa od 16 do 36 GY. Pred presaditvijo kostnega mozga aprila 1997 je prejela še en ciklus enake kemoterapije in zelo visoko odmerjeni melfalan. Pet mesecev kasneje smo dokazali ponovitev bolezni v desnih dimeljskih bezgavkah, ki so bile obsevane z 36 GY. Bolezni je bilo največ v bezgavkah ob aorti, kjer je prej ni bilo. Aktivna bolezen pa je bila dokazana tudi v bezgavki desno nad ključnico. Decembra 1997 je umrla.
Sklep
Pri solidnih tumorjih otrok s slabo napovedjo poteka intenzivno preučujejo načine zdravljenja s povečanimi odmerki s presaditvijo krvotvornih matičnih celic ali brez. Mogoče bo boljše razumevanje in izraba učinka medsebojnega delovanja zdravil in farmako-
kinetike premagalo mehanizme celične rezistence. Čeprav je minilo že skoraj 20 let od prvih poizkusov pa do danes še ni uspelo dokazati odločilnega pomena tega zdravljenja pri solidnih tumorjih otrok, razen pri nevroblastomu z zasevki. Potrebno je počakati na rezultate mednarodnih randomiziranih študij, če bodo dokazale učinkovitost tega zelo toksičnega in dragega načina zdravljenja (1).
Naše izkušnje s prvimi avtolognimi presaditvami kostnega mozga pri solidnih tumorjih dokazujejo, da je takšno zdravljenje tudi pri nas izvedljivo. Zaenkrat v Sloveniji zaradi pomanjkanja ustreznih naprav še ni možno čiščenje kostnega mozga oz. selekcija krvotvornih matičnih celic. Širitev indikacij bomo sprejeli, ko bodo znani rezultati ustreznih večjih študij in ko bodo sprejeta ustrezna priporočila SIOP-a.
Literatura
1.	Ladenstein R, Philip T, Gardner H. Autologous stem cell transplantation for solid tumors in children. Curr Op Ped 1997; 9: 55-69.
2.	Hartman O, Le Corroller AG, Blaise D et al. Peripheral blood stem cell and bone marrow transplantation for solid tumors and lymphomas: Hematologic recovery and costs. A randomized, controlled trial. Ann Inter Med 1997; 126: 600-7.
3.	Kletzel M, Abella EM, Sandler ES et al. Thiotepa and cyclophosphamid with stem cell rescue for consolidation therapy for children with high-risk neuroblastoma: A phase I/II study of the pediatric blood and marrow transplant consortium. J Pediatr Hematol Oncol 1998; 20: 49-54.
4.	Robertson KA. Pediatric bone marrow transplantation. Curr Op Ped 1993; 5: 103-9-
5.	Mastrangelo R, Lasorella A, Iavarone A et al. Critical observations on neuroblastoma treatment with 131-I-Metaiodobenzylguanidine at diagnosis. Med Pediatr Oncol 1993, 21: 411-5.
6.	De Kraker J, Hoefnagel CA, Caron H, Voute PA, Tiel van Buul MMC, Valdes Olmos R. Targeted radiotherapy with iodine-131-meta-iodobenzylguanidine (MJBG) as first line treatment of neuroblastoma advanced disease patients. Med Pediatr Oncol 1994, 23: 179-9.
7.	Voute PA, Van der Kleij AJ, De Kraker J, Hoefnagel CA. M-131-IBG treatment of patients with relapsed neuroblastoma combined with oxygen treatment under hyperbaric conditions. Med Pediatr Oncol 1994, 23: 179-9.
8.	Sanders JE. Bone marrow transplantation for pediatric malignancies. In: Link MP ed. Pediatric Oncology. Pediatr Clin North. 1997; 44: 1005-20.
9.	Kremens B, Klingebiel T, Herrmann F et al. High-dose consolidation with local radiation and bone marrow rescue in patients with advanced neuroblastoma. Med Pediatr Oncol 1994, 23: 470-5.
10.	Tchirkov A, Kanold J, Giollant M et al. Molecular monitoring of tumor cell contamination in leukapheresis products from stage IV neuroblastoma patients before and after positive CD34 selection. Med Pediatr Oncol 1998; 30: 228-32.
11.	Sandoval C, Meyer WH, Parham DM et al. Outcome in 43 children presentation with metastatic Ewing sarcoma: The St. Jude children’s research hospital experience, 1962 to 1992. Med Pediatr Oncol 1996; 26: 180-5.
12.	Hartman O, Valteau-Couanet, Benhamou E. Chimiothérapie â hautes doses suivie d’autogreffe de moelle dans les tumeurs solides de l’enfant: les arguments pour. Bull Cancer 1995; 82: 36-41.
13- Kedar A, Maria BL, Graham-Pole J et al. High-dose chemotherapy with marrow reinfusion and hyperfractionated irradiation for children with high-risk brain tumors. Med Pediatr Oncol 1994; 23: 428-36.
14.	Garaventa A, Hartmann O, Bernard JL et al. Autologous bone marrow transplantation for pediatric Wilms tumor: The experience of the European bone marrow transplantation solid tumor registry. Med Pediatr Oncol 1994; 22: 11—4.
15.	Saarinen UM, Sariola H, Hovi L. Recrrurent disseminated retinoblastoma treated by high-dose chemotherapy, total body irradiation, and autologous bone marrow rescue. Am J Pediatr Hematol Oncol 1991; 13: 315-9.
Pregledni prispevek/Review article
ZDRAVLJENJE SOLIDNIH TUMORJEV ODRASLIH Z ZELO VELIKIMI ODMERKI CITOSTATIKOV IN AVTOLOGNO PRESADITVIJO KRVOTVORNIH MATIČNIH CELIC
HIGH DOSE CHEMOTHERAPY WITH AUTOLOGOUS PERIPHERAL BLOOD STEM CELL
SUPPORT IN SOLID TUMOURS IN ADULTS
Branko Zakotnik,7 Bojana Pajk,1 Jože Pretnar2
1 Onkološki inštitut, Zaloška 2, 1105 Ljubljana, Slovenija 2 Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana, Slovenija
Prispelo 1998-04-10, sprejeto 1998-04-17; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-19-22
Ključne besede: zdravljenje s citostatiki; maligne bolezni; matične celice
Izvleček - Izhodišča. Zdravljenje s citostatiki je poleg kirurške odstranitve tumorja in obsevanja z ionizirajočimi žarki pomemben način zdravljenja pri bolnikih s solidnimi tumorji (karcinomi, germinalni tumorji, sarkomi, melanom). Z običajnimi odmerki citostatikov se uspeh zdravljenja pri večini razsejanih solidnih tumorjev (razen germinalnih) v zadnjih letih ni izboljšal. Za vrsto citostatikov so dokazali, daje učinek na tumor sorazmeren z odmerkom zdravila. Večanje odmerkov nekaterih citostatikov je omogočila uporaba citokinov, predvsem pa avtologna presaditev krvotvornih matičnih celic, ki znatno skrajšajo obnovitev kostnega mozga po zdravljenju. Z velikimi odmerki citostatikov in avtologno presaditvijo krvotvornih matičnih celic zdravimo nekatere bolnice s karcinomom dojke in bolnike z germinalnimi tumorji, v manjši meri pa bolnice s karcinomom jajčnikov, mikrocelulamim karcinomom pljuč, gliomom in Eivingovim sarkomom. Pri drugih solidnih tumorjih ta način zdravljenja zaenkrat ni uspešen.
Zaključki. Končno oceno tega načina zdravljenja pričakujemo kmalu po letu 2000, ko bo zaključenih velikoprospektivnih rando-miziranih raziskav.
Uvod
Zdravljenje s citostatiki je poleg kirurške odstranitve tumorja in obsevanja z ionizirajočimi žarki pomemben način zdravljenja pri bolnikih s solidnimi tumorji, kot so karcinomi, germinalni tumorji, sarkomi in melanom. Te neoplazme zavzemajo okrog 95% vseh malignih bolezni (1). Z uvajanjem novih načinov zdravljenja, predvsem novih citostatikov in hormonske terapije, se je preživetje teh bolnikov pomembno podaljšalo (2). Najpomembnejši napovedni dejavnik preživetja je stadij bolezni. Uspeh kombiniranega zdravljenja je tem boljši, čim bolj zgodaj bolezen odkrijemo. Pri razsejanih solidnih tumorjih, razen pri germinalnih, dosežemo z zdravljenjem s citostatiki velikokrat le kratkotrajno izboljšanje bolezni.
Za vrsto citostatikov so dokazali, da je učinek na tumor sorazmeren z odmerkom zdravila (3, 4) kar predstavlja teoretično osnovo za zdravljenje z zelo velikimi odmerki. Večanje odmerka omejuje
Key words: high dose chemotherapy; solid tumours
Abstract — Background. Chemotherapy is besides surgery and radiotherapy an important mode of treatment in patients with solid tumours (carcinoma, germinal tumours, sarcoma, melanoma). There has been little improvement in the effectiveness of conventional dose chemotherapy in most common solid tumors in recent years. It has been demonstrated that the dose response curve is very steep for most cytostatic agents, and therefore it seemed rational that with higher doses of these drugs a higher cure rate could be achieved. Very high doses of some cytostatic drugs could be applied with many new approaches of supportive care, mainly autologous peripheral stem cells that substantially shorten the period of aplasia. Such treatment is currently used in many prospective clinical trials in breast cancer, germinal tumours, ovarian cancer, micro-cellular lung cancer, gliomas and Ewing sarcoma. In other solid tumours it seems that high dose chemotherapy as it is used today is not appropriate.
Conclusions. The place of high dose chemotherapy as standard treatment in solid tumours has still to be defined. We expect that this will be known soon after year 2000 when most of prospective randomised clinical trials that are ongoing will reach a conclusion.
toksičnost zdravila, ki je pri različnih citostatikih različna (hemato-toksičnost, kardiotoksičnost, nefrotoksičnost, hepatotoksičnost,...). Pri citostatikih, ki se največ uporabljajo v zelo velikih odmerkih je zaviralno delovanje na kostni mozeg tisto, ki omejuje nadaljnje večanje odmerka. Temu so se v preteklosti izognili na ta način, da so bolniku pred zdravljenjem s citostatiki odvzeli zadostno količino kostnega mozga in ga nato neposredno po zdravljenju vrnili. S takim načinom so lahko zvečali odmerke nekaterih citostatikov pet do desetkrat. Ta način zdravljenja je bil drag in zamuden, saj je bil potreben poseg v splošni anesteziji, izvajanje take terapije večkrat zapored pa je bilo zelo zahtevno. Z napredkom zbiranja krvotvornih matičnih celic v periferni krvi, ki poteka ambulantno, pa je postalo tako zdravljenje dostopno. Običajno zdravljenje z zelo visokimi odmerki citostatikov (ZVOC) poteka tako, da bolniku najprej z levkoferezo odvzamemo iz venske krvi krvotvorne matične celice (KMC). Izplavljanje KMC iz kostnega mozga običaj-
no povečamo s citokini ali s kombinacijo citostatikov in citokinov. Temu sledi ZVOC in nato transfuzija KMC. S tem skrajšamo obdobje aplazije na 7 dolO dni.
Zdravljenje z ZVOC in KMC trenutno v svetu, predvsem pa v Evropi še ni povsod običajen način zdravljenja pri bolnikih s solidnimi tumorjih (5). Leta 1996 so v Evropi zdravili z ZVOC 2382 bolnikov s solidnimi tumorji. Od tega 1347 bolnic z rakom dojke, 283 bolnikov z germinalni tumorji, 196 z neuroblastom, 117 z Ewingov sarkomom, 85 s sarkomi mehkih tkiv, 55 z gliomi, in 299 drugih. Le pri zdravljenju 3% bolnikov so uporabili krvotvorne matične celice iz kostnega mozga, pri zdravljenju 3% bolnikov krvotvorne matične celice periferne krvi in kostnega mozga pri vseh drugih pa krvotvorne matične celice periferne krvi (6). Trenutno poteka v svetu več prospektivnih kliničnih raziskav na tem področju z namenom, da se ugotovi prava vrednost takega zdravljenja. Namen tega prispevka je kratek pregled teh raziskav pri posameznih boleznih in poročilo o takem zdravljenju pri naših bolnikih.
Epitelijske neoplazme
Epitelijske neoplazme (karcinomi) predstavljajo večino neopla-zem tako v svetu kot pri nas. Leta 1995 je v Sloveniji zbolelo za rakom 6508 bolnikov pri katerih je bila diagnoza potrjena s histološko ali citološko preiskavo, od tega 5584 zaradi karcinomov (1). ZVOC se uporablja največ pri zdravljenju karcinoma dojke, redkeje pri zdravljenju karcinoma jajčnikov in mikrocelularnga karcinoma pljuč (5), v še manjšem obsegu pa pri zdravljenju drugih epitelijskih neoplazem.
Karcinom dojke
V Sloveniji zboli letno okrog 700 bolnic zaradi karcinoma dojke. Pri približno 45% teh bolnic je bolezen omejena na dojko, pri približno 45% je razširjena v pazdušne bezgavke, v 10% pa je bolezen razsejana (1).
Običajno zdravljenje s citostatiki je pri razsejani bolezni učinkovito v 40-75% (navadno gre za delno remisijo bolezni). Čas do ponovitve bolezni pa je kratek (9-18 mesecev). Mediana preživetja teh bolnic je približno 2 leti.
Prognoza bolnic z vnetnim rakom dojk in bolnic z rakom dojk z 10 ali več pozitivnimi pazdušnimi bezgavkami je slaba čeprav nimajo ugotovljenih zasevkov v druge organe. Kljub zdravljenju s citostatiki pride pri 55-87% teh bolnic v 5 letih do ponovitve bolezni in kar pri 70-90% bolnic v 10 letih po zaključenem prvem zdravljenju (7, 8).
Rezultati zdravljenja bolnic z razsejanim rakom dojk z ZVOC in KMC v nekaterih randomiziranih kliničnih raziskavah, ki pa vključujejo le manjše število bolnic so enaki ali boljši kot pri običajnem načinu zdravljenja. Približno četrtina teh bolnic preživi več kot 3 leta po ZVOC brez znakov bolezni (9, 10). Indikacije za zdravljenje teh bolnic izven kliničnih raziskav niso povsem enotne. Bolnice, ki so primerne za vključitev v take raziskave so tiste pri katerih z običajnim zdravljenjem s citostatiki dosežemo popolno remisijo bolezni.
Peters s sodelavci ugotavlja, da je pri bolnicah z nerazsejano boleznijo, vendar z > 10 pozitivnimi pazdušnimi bezgavkami, zdravljenih z ZVOC 5 letno preživetje brez znakov bolezni 71% (11). Tudi v drugih kliničnih raziskavah (faza II) nekateri opisujejo pri bolnicah z >10 pozitivnimi bezgavkami, ki so jih zdravili z ZVOC, 5 lemo preživetje brez znakov bolezni v 56% (12) in drugi 4 letno preživetje brez znakov bolezni v 70% (13).
Po mnenju nekaterih raziskovalcev je za uspešno zdravljenje potrebnih več zaporednih krogov ZVOC, le to pa omejuje velika toksičnost zdravljenja. Z novimi kombinacijami citostatikov in prilagoditvami že obstoječih načinov so uspeli toksičnost toliko zmanjšati,da je mogoče varno dajanje tudi treh zaporednih krogov ZVOC (14, 15). Prvi izsledki večjih randomiziranih kliničnih raziskav, ki trenutno potekajo so obetajoči, končna ocena zdravljenja pa bo na voljo po letu 2000.
Karcinom jajčnikov
Letno zboli za rakom jajčnikov v Sloveniji približno 160 žensk. Pri približno 60% bolnic je bolezen ob odkritju že napredovala do stadija III ali IV (1).
Z običajnim zdravljenjem s citostatiki bolnic v stadiju III in IV po operaciji dosežemo popolno remisijo bolezni v 60-80%, toda 5 lemo preživetje teh bolnic je le 10-20% (16).
V različnih kliničnih raziskavah (faza I in II) so ugotovili, da z zdravljenjem teh bolnic z ZVOC in KMC sicer dosežejo popolno remisijo bolezni v 70-90%, vendar se bolezen hitro ponovi, preživetje pa je enako kot pri običajnem načinu zdravljenja (17). Nekateri raziskovalci opisujejo 20-50% 5 letno preživetje, če so bolnice zdravili z ZVOC neposredno po zaključenem običajnem načinu zdravljenja (18). Izsledki raziskav, ki vključujejo v ZVOC tudi citostatik paclitaxel, obetajo izboljšanje prognoze bolnic z rakom jajčnikov. (19)
Mikrocelularni karcinom pljuč
Vsako leto v Sloveniji zboli zaradi karcinoma pljuč okoli 1000 novih bolnikov. Od tega približno 20% zaradi mikrocelularnega raka pljuč (1). Le okrog 5% bolnikov, ki so zboleli za rakom na pljučih v Sloveniji v obdobju 1988-1990 je preživelo 5 let od ugotovitve bolezni (2). Zaradi hitre rasti tumorja in zelo dobrega odziva na običajno zdravljenje s citostatiki je izgledalo, da je mikrocelularni rak pljuč najprimernejša bolezen za zdravljenje z ZVOC. Raziskave niso pokazale pomembnega podaljšanja preživetja, saj se je bolezen zelo hitro ponovila (20). Tako kot običajno zdravljenje tudi ZVOC pri mikrocelularnemu raku pljuč ni na mestu. Preskušajo zelo intenzivno zdravljenje z več zaporednimi krogi ZVOC (21, 22).
Germinalni tumorji
Rak na modih je najpogostejši tumor pri moških v starosti 15 do 35 let. Leta 1995 je v Sloveniji zbolelo 56 bolnikov (1). Delež ozdravitev je pri bolnikih z rakom na modih velik tudi pri napredovali bolezni. Uspehi zdravljenja so se zlasti izboljšali po vključitvi cis-platina v zdravljenje (23, 24). Uspeh ozdravitve je pri bolnikih z nizkim stadijem bolezni 95-100%, pri bolnikih z razširjeno boleznijo pa na uspeh zdravljenja vplivajo stadij bolezni, tumorska masa in izsledki tumorskih markerjev.
Običajno razsejano bolezen zdravimo s citostatiki in operativno odstranitvijo ostanka tumorja. Ozdravitev dosežemo pri 65-95% bolnikov, pri približno 15% bolnikov zdravljenje ni učinkovito. Pri približno 10% bolnikov se bolezen ponovi po doseženi popolni remisiji. Pri ponovitvi bolezni dosežemo z zdravljenjem s citostatiki ponovno popolno remisijo pri približno 60% bolnikov. Pri polovici od njih pride do ponovne ponovitve bolezni (25). Namen uporabe vedno bolj intenzivnih načinov zdravljenja kot so ZVOC in presaditev KMC kostnega mozga oziroma presaditev KMC periferne krvi je doseči večji odstotek popolnih remisij, kasnejšo ponovitev bolezni, daljše preživetje bolnikov pri ponovitvi bolezni kakor tudi pri tistih z neugodnimi prognostičnimi dejavniki ob ugotovitvi bolezni (26-30).
Po podatkih v literaturi je približno 22% bolnikov, ki so jih zdravili z ZVOC in podporo KMC periferne krvi in/ali KMC kostnega mozga brez znakov bolezni več kot leto dni po zaključenem zdravljenju (31).
Avtorji so poskušali oceniti napovedne dejavnike, ki vplivajo na uspeh zdravljenja z ZVOC. Z multivariatno analizo so ugotovili, da so statistično najpomembnejši naslednji prognostični dejavniki: obseg bolezni pred zdravljenjem z ZVOC, primarno mesto tumorja in koncentracija tumorskega markerja v krvi (horionski gonado-tropin) pred ZVOC. Ugotovili so, da imajo bolniki s primarnim tumorjem na modih, pri katerih je bilo zdravljenje s cisplatinom učinkovito in so imeli pred zdravljenjem z ZVOC nizke vrednosti tumorskega markerja, več kot 50% verjetnosti, da bodo preživeli
dve leti ali več. Pri bolnikih z drugimi manj ugodnimi prognostičnimi dejavniki je verjetnost ozdravitve le 10% do 30%. Med različnimi načini ZVOC niso ugotovili pomembnih razlik pri preživetju bolnikov (32).
Klinične raziskave še niso potrdile pravega pomena ZVOC kot konsolidacijskega načina zdravljenja po zdravljenju s citostatiki pri ponovitvi bolezni (31).
Iz rezultatov različnih kliničnih raziskav lahko povzamemo, da ZVOC niso primerni kot zdravljenje za bolnike neodzivne na zdravljenje s cisplatinom (31, 33).
Po mnenju nekaterih raziskovalcev je zdravljenje z ZVOC in KMC obetajoče kot prvo zdravljenje za bolnike z neugodnimi prognostičnimi dejavniki (31, 32). V literaturi še ni dovolj podatkov o morebitno večjem uspehu zdravljenja z več kot enim krogom ZVOC (33).
Drugi solidni tumorji
Potekajo tudi klinične raziskave (faza I in II) pri bolnikih z Ewin-govim sarkomom in gliomi (34). O večjih uspehih ne poročajo, saj se bolezen hitro ponovi.
Izsledki zdravljenja solidnih tumorjev z zelo visokimi odmerki citostatikov pri naših bolnikih
Zdravljenje solidnih tumorjev z ZVOC in KMC periferne krvi smo pričeli leta 1997 in sicer kot dopolnilno zdravljenje pri bolnicah s karcinomom dojke z več kot 10 prizadetih pazdušnih bezgavk. Ker tak način zdravljenja še ni priznan kot običajen, nameravamo vključevati te bolnice v mednarodni protokol za zadravljenje raka dojke (IBCSG - International Breast Cancer Study Group) v katerem na Onkološkem inštitutu sodelujemo že vrsto let.
V sodelovanju s Kliničnim oddelkom za hematologijo smo do sedaj zdravili na ta način dve bolnici, obe mlajši od 40 let z velikim številom prizadetih pazdušnih bezgavk. Bolnici sta prejeli tri kroge ZVOC (epidoksorubicin, ciklofosfamid) v razmaku treh tednov in ob vsakem krogu zdravljenja sta prejeli transfuzijo KMC. Te smo pred začetkom zdravljenja zbrali iz venske krvi z levkoferezami na Zavodu RS za transfuzijo krvi v Ljubljani . Za povečanje števila KMC v krvi smo uporabili rastni dejavnik G-CSF (Neupogen).
Med akutnimi neželenimi pojavi smo ugotavljali navzeo, bruhanje in zaviralno delovanje na kostni mozeg. Obdobje pancitopenije je bilo le 7 dolO dni, pri nobeni od bolnic ni prišlo do okužbe.V tem času sta prejemali profilaktično ciprofloksacin, flukonazol in acyclovir.
Bolnici nista potrebovali transfuzije koncentriranih trombocitov, prejeli sta le enkrat transfuzijo koncentriranih filtriranih in obsevanih eritrocitov. Tudi v obdobju po presaditvi bolnici nista imeli okužbe. Redno ju kontroliramo vsake tri mesece. Do sedaj nismo ugotovili kasnih neželenih sopojavov niti ponovitve bolezni.
Zaključek
Zdravljenje z ZVOC in KMC pri solidnih tumorjih še ni običajen način zdravljenja in tudi v svetu trenutno poteka v glavnem kot klinične raziskave, vsekakor pa je eden izmed obetajočih načinov zdravljenja pri nekaterih solidnih tumorjih. Pravo vrednost tega zdravljenja pa bomo lahko ocenili po zaključku randomiziranih kliničnih raziskav v začetku prihodnjega tisočletja.
Literatura
1.	Incidenca raka v Sloveniji1995. Ljubljana: Onkološki inštitut, Register raka za Slovenijo, 1998.
2.	Pompe-Kirn V, Zakotnik B, Volk N, Benulič T, Škrk J. Preživetje bolnikov z rakom v Sloveniji. Ljubljana: Onkološki inštitut, 1995.
3.	Frei E III, Canellos GP. Dose: a critical factor in cancer chemotherapy. Am J Med 1980; 69: 585-94.
4.	Skipper HE. Criteria associated with destruction of leukemia and solid tumor cells in animals. Cancer Res 1987; 27: 2636-45.
5.	Goldman JM, Schmitz N, Niethammer D, Gratwohl A. Allogenic and autologous transplantation for haematological diseases, solid tumours and immune disorders: current practice in Europe in 1998. Bone Marrow Transplantation 1998; 21: 1-7.
6.	Gratwohl A, Hermans J, Baldomero H. Blood and marrow transplantation activity in Europe 1995. European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT). Bone Marrow Transplant, 1997; 19: 5, 407-19.
7.	Bearman SI, Shpall EJ, Jones RB, Cagnoni PJ, Ross M: High-dose chemotherapy with progenitor cell support for metastatic and high risk primary breast cancer. Semin Oncol 1996; 23: 60-7.
8.	Goldhirsch A: Breast cancer. In: Cavalli F, Hansen H, Kaye SB. Eds. Textbook of Medical Oncology. Martin Dunitz, 1997: 53-82.
9.	Peters WP, Jones RB, Vredenburgh J, Shpall EJ. A large prospective randomized trial of high dose combination alkylating agents (CPB) with autologous cellular support (ABMS) as consolidation for patients with metastatic breast cancer achieving complete remission after intensive doxorubicin based induction therapy (AFM). Proc Am Soc Clin Oncol 15, 1996: 149-9.
10.	Bezwoda WR, Seymour L, Dansey RD. High dose chemotherapy with hematopoietic rescue as primary treatment for metastatic breast cancer: A randomized trial. J Clin Oncol 1995; 13: 2483-9.
11.	Peters WP, Beny D, Vredenburgh J, Hussein A. Five year follow up high dose combination alkylating agents with ABMT as consolidation after standard dose CAF for primary breast cancer involving >10 axillary lymph nodes (DUKE/ CALGB 8782). Proc Am Soc Clin Oncol 14, 1995: 933-3-
12.	Gianni AM, Siena S, Bregni M, Di Nicola M. Five year results of high dose sequential adjuvant chemotherapy in breast cancer with 610 positive nodes. Proc Am Soc Clin Oncol 14, 1995: 61—1.
13.	Garcia-Conde J, Sola C, Solano C, Azagra P. High-dose chemotherapy (HDCT) and autologous peripheral stem-cell transplantation (APSCT) after standard chemotherapy in high risk breast cancer patients (> 10 axillary node involvement after surgery). Proc Am Soc Clin Oncol 15, 1996: 994-4.
14.	Rodenhuis S, Westermann A, Holtkamp MJ, Nooijen WJ, Baars JW. Feasibility of multiple courses of high dose Cyclophosphamide, Thiotepa, and Carboplatin for breast cancer or germ cell cancer. J Clin Oncol 1996; 14, 1473-83-
15.	Basser RL, To LB, Begley CG, Juttner A. Adjuvant treatment of high risk breast cancer using multicycle high dose chemotherapy and filgrastim mobilized peripheral blood progenitor cells. Clin Cancer Res 1995; 1, 715-21.
16.	NIH Consensus Conference: Ovarian Cancer-Screening, Treatment, Follow up. JAMA 1995; 273: 491-7.
17.	Shpall EJ, Jones RB, Bearman SI Purdy MP: Future strategies for the treatment of advanced ovarien cancer using high dose chemotherapy and autologous bone marrow support. Gynecol Oncol 1994: 54: 357-61.
18.	Veins P, Gravis G, Blaise D. High dose chemotherapy (HDC) with bone marrow rescue for patients with FIGO stage III or IV common epithelial ovarian carcinoma responding to first treatment. Proc AM Soc Clin Oncol 1995: 14: 285-
5.
19.	Fennelly D, Schneider J, Spriggs D. Dose escalation of paclitaxel with analysis of progenitor-cell mobilization and hematologic support of advanced ovarien cancer patients receiving rapidly sequennced high-dose carboplatin/cyclop-hosphamide courses. J Clin Oncol 1995; 13: 1160-0.
20.	Humblet Y, Symann M, Bosly A. Late intensification chemotherapy with autologous bone marrow transplantation in selected small-cell carcinoma of the lung: a randomized study. Journal of Clinical Oncology 1987; 5 (12): 1864-73.
21.	Leyvraz S, Perey L, Lange A, Ketterer N, Bosquee L, Rosti G, Pasini F, Hamdan O, Humblet Y, Cetto GL, Marangolo M . Sequential high-dose ICE chemotherapy with circulating progenitor cells (CPC) in patients with small cell lung carcinoma (SCLC): an EBMT study. Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol 1996: 15: A1133-3.
22.	Jennis A, Levitan N, Pecora AL, Isaacs R, Lazarus H . Sequential high dose chemotherapy (HDC) with filgrastim/peripheral stem cell support (PSCS) in extensive stage small cell lung cancer (SCLC). Proc Annu Meet Am Soc Clin Oncol. 1996: 15: A1021-1.
23.	Sternberg C. Cancers of the genitourinary tract. In: Cavalli F, Hansen H, Kaye SB eds. Textbook of Medical Oncology. Martin Dunitz, 1997: 202-8.
24.	Einhom LH. Testicular cancer: A new and improved model. J Clin Oncol 1990; 8: 1777-81.
25.	Loehrer PJ, Laver R, Roth BJ, Williams SD, Kalasinki LA. Salvage therapy in recurrent germ cell cancer: ifosfamide and cisplatin plus either vinblastine or etoposide. Ann Int Med 1988; 109: 540-6.
26.	Droz JP, Pico JL, Ghosu M. Long-term survivors after salvage high-dose chemotherapy with bone marrow rescue in refractory germ cell cancer. Eur J Cancer 1991; 27: 831-5.
27.	Ibrahim A, Zambon E, Bourhis JH. High dose chemotherapy with etoposide, cyclophosphamide and escalating dose of carboplatin followed by autologous bone marrow transplantation in cancer patients. A pilot study. Eur J Cancer 1993; 29 A: 1398-403-
28.	Motzer RJ. Guleti SC, Tang WP. Phase I trial with pharmacokinetic analyses of high-dose carboplatin, etoposide and cyclophosphamide with autologous bone marrow transplantation in patients with refractory' germ cell tumours. Cancer Res 1993; 53-3.
29.	Lotz JP, Mochover D, Malassagne B. Phase I—II study of two consecutive courses of high-dose epipodophyllotoxin, ifosfamide and carboplatin with autologous bone marrow transplantation for treatment of adult patients with solid tumours. J Clin Oncol 1991; 9: 1860-70.
30.	Motzer RJ, Mazumdar M, Basl GJ. High-dose carboplatin, etoposide and cyclophosphamide for patients with refractory germ cell tumours: Treatment results and prognostic factors for survival and toxicity. J Clin Oncol 1996; 14: 1098-105.
31.	Droz JP, Culine S, Biron P, Kramar A. High-dose chemotherapy in germ-cell tumours. Ann Oncol 1996; 7: 997-1003-
32.	Beyer J, Kramar A, Mandanas R. High-dose chemotherapy as salvage treatment in germ cell tumours: A multivariate analysis of prognostic variables. J Clin Oncol 1996; 14-4.
33.	Tjan-Heijnen VCG, Oosterhov GON, Wit R, De Mulder P. Treatment in germ cell tumours: state of the art. Eur J Surg Oncol 1997; 23: 110-22.
34.	Antman KH, Souhami RL. High-dose chemotherapy in solid tumours. Annals of Oncology 1993; 4 Suppl 1: S29-S44.
Strokovni prispevek/Professional article
ZDRAVLJENJE NAPREDOVALE KRONIČNE LIMFOCITNE
LEVKEMIJE S FLUDARABINOM
TREATMENT OF ADVANCED-STAGE CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKAEMIA WITH
FLUDARABINE
Peter Černelč
Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Klinični center Ljubljana, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-04-04, sprejeto 1998-04-07; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-23-5
Ključne besede: predhodno zdravljeni bolniki; fludarabin; trajanje učinka zdravljenja
Izvleček-Izhodišča. Fludarabin pomeni novo možnost zdravljenja za bolnike z napredovalo kronično limfocitno levkemijo (KLL), ko zdravljenje s k.lorambiicilom ni več učinkovito.
Bolniki in zdravljenje. S'fludarabinom smo zdravili 15 bolnikov z napredovalo B-KLL, pri kateri drugi načini zdravljenja niso bili več učinkoviti. Starost štirih bolnic in enajstih bolnikov je bila od 40 do 73 let (mediana 59 let). Fludarabin smo dajali 25 mg/m-2 telesne površine/dan 5 dni. Zdravljenje smo ponavljali na 28 dni.
Rezultati. Po zdravljenju s jludarabinom smo dosegli popolno remisijo bolezni pri dveh odpetnajstih bolnikov (13%), delno remisijo pri petih bolnikih (33%), medtem koje bilo pri osmih bolnikih (54%) zdravljenje neuspešno. Bolniki, pri katerih je bilo zdravljenje uspešno, so prejeli povprečno 4 kroge zdravljenja. Cas od zaključka zdravljenja s fludarabinom do poslabšanja bolezni je bil pri tistih, kjer smo dosegli popolno remisijo bolezni, povprečno 22 mesecev, pri bolnikih z delno remisijo povprečno 13 mesecev, skupno pa povprečno 16 mesecev.
Zaključki. Zdravljenje s fludarabinom je bilo uspešno, s tem pa tudi boljša kakovost življenja pri skoraj polovici prej zdravljenih bolnikov z napredovalo KLL. Učinek zdravljenja je bil daljši pri tistih bolnikih, kjer smo dosegli popolno remisijo bolezni.
Uvod
Kronična limfocitna levkemija (KLL) je najpogostejša oblika levkemije v zahodnih državah, saj doseže po 60. letu starosti pogostnost več kot 20 novih primerov bolezni na leto na 100.000 prebivalcev (1). Moški zbolevajo enkrat pogosteje kot ženske.
Za bolezen je značilna klonska proliferacija in kopičenje neopla-stičnih limfocitov B. Kadar bolezen slučajno ugotovimo pri pregledu krvi (limfocitoza več kot 5,0xl0-9/L) in je omejena na kostni mozeg (infiltracija z več kot 30% limfocitov), govorimo o klinično razvojni stopnji A. Pri razdelitvi KLL po razvojnih stopnjah ločimo pet enakovrednih področij povečanih bezgavk in organov: povečane bezgavke v vratu, pazduhah in dimljah ter povečana vranica in jetra. Pri klinično razvojni stopnji A so lahko povečane bezgavke in/ali organi v manj kot treh območjih, pri stopnji B pa v treh ali več področjih. Pri stopnji C imajo bolniki anemijo (koncentracija hemoglobina manj kot 100 g/L) in/ali trombocito-
Key words: previously treated patients; fludarabine; duration of response
Abstract — Background. Fludarabine is a new option in the treatment of patients with advanced-stage chronic lymphocytic leukaemia (CLL) failing on therapy with chlorambucil.
Patients and treatment. Fludarabine was given to 15patients with advanced B-CLL who no longer to other treatment modalities. There were 4 women and 11 men, aged 40 to 73 years (median 59 yrs). The patients received fludarabine 25 mg/m2 per day over 5 consecutive daxs. The regimen was repeated every 28 days.
Results. Two of the 15 patients (13%) shoived a complete remission and 5 (33%) a partial remission. Eight patients (54%) showed no therapeutic response. Fludarabine proved effective in patients who completed an average of 4 treatment cycles. Tire average progression-free interval after fludarabine was 22 months in patients with a complete remission and 13 months in patients with a partial remission, the average overall interval being 16 months.
Conclusions. Fludarabine has provided an effective therapy and has improved the quality of life in nearly one half of the pretreated patients with advanced B-LLC. The benficial effect of therapy lasted longer in patients showing a higher therapeutic response.
penijo (število trombocitov manj kot 100xl0-9/L) (2). Pri okoli 60% bolnikov s KLL (stopnja A) poteka bolezen počasi in ne potrebujejo zdravljenja, medtem ko pri 40% bolnikov s povečanimi bezgavkami, jetri, vranico in znaki odpovedi kostnega mozga, poteka bolezen hitreje. Povprečno preživetje je pri slednjih le nekaj let.
Za oceno napovedi poteka KLL je najpomembnejša razširjenost bolezni ob ugotovitvi, poleg tega pa še čas podvojitve števila limfocitov v krvi, način limfocitne infiltracije kostnega mozga in citogenetične nepravilnosti (2-4).
Klorambucil je alkilirajoči citostatik, s katerim običajno začnemo zdravljenje KLL. Pri bolnikih s klinično razvojno stopnjo C kloram-bucilu dodamo glukokortikoide. Izboljšanje bolezni dosežemo pri 40-77% bolnikov, ki pred tem še niso bili zdravljeni (5, 6). Čeprav so s kombinacijo ciklofosfamida, doksorubicina, vinkristi-na in prednisona (CHOP) dosegli izboljšanje napredovale bolezni v večjem odstotku, pa se preživetje bolnikov ni podaljšalo (7-9).
Tab. 1. Odzivnost na zdravljenje s fludarabinom.
Tab. 1. Response to treatment with fludarabine.
	PR	DR	PR+DR	NZ
Vsi bolniki All patients	2/15 (13%)	5/15 (33%)	7/15 (46%)	8/15 (54%)
Razširjenost bolezni Clinical stage B	2	2	4	5
C	1	2	3	3
Obdobje do poslabšanja bolezni (meseci) Progression-free intervals (months)	20	13	16	
PR - popolna remisija / complete remission
DR - delna remisija / partial remission
NZ - neuspešno zdravljenje / unsuccesfull treatment
Uporaba purinskih analogov, kot sta fludarabin in kladribin, je v drugi polovici osemdesetih let pomenila novo možnost zdravljenja za bolnike z napredovalo KLL, ko drugi načini zdravljenja niso bili več učinkoviti (10, 11). Fludarabin (9-beta-D-arabinofurano-zil-2-fluoro-adenin monofosfat) je fluorirani analog ara-adenina, ki je relativno odporen proti delovanju encima adenozin deami-naze (12). Pri bolnikih s KIL in ne-Hodgkinovimi limfomi so v kliničnih raziskavah I. in II. Grever in sod. (13) ter Leiby in sod. (14) ugotovili, da fludarabin povzroča levkopenijo. Odzivnost na zdravljenje s fludarabinom je bila pri poprej zdravljenih bolnikih s KLL 45%, od tega so dosegli popolno remisijo bolezni pri 13% bolnikov, delno izboljšanje pa pri 32% bolnikov. Pri 55% bolnikov s KLL je bilo zdravljenje neučinkovito (15, 16).
Čeprav smo fludarabin registrirali v Sloveniji ob koncu leta 1997, v večini evropskih držav pa leto prej, smo ga začeli uporabljati pri nas že decembra leta 1993. Kljub temu, da je fludarabin učinkovitejši od klorambucila pri prvem zdravljenju KLL in se nakazuje možnost daljšega preživetja bolnikov po zdravljenju z njim, pa ga zaradi velike cene zdravljenja uporabijo v večini držav šele takrat, ko zdravljenje s klorambucilom ni več učinkovito (17).
Namen našega dela je prikazati izsledke zdravljenja s fludarabinom pri bolnikih z napredovalo KLL in jih primerjati z izsledki v literaturi.
Bolniki in zdravljenje
Od decembra 1993 do decembra 1997 smo na Kliničnem oddelku za hematologijo v Ljubljani zdravili s fludarabinom 15 bolnikov z napredovalo B-KLL. KLL smo opredelili na osnovi kliničnega pregleda, celotne krvne slike, citološke ocene kostnega mozga in potrditve celičnih označevalcev B na limfocitih. Starost štirih bolnic in enajstih bolnikov je bila od 40 do 73 let (mediana 59 let). Devet bolnikov je imelo pred začetkom zdravljenja s fludarabinom klinično razvojno stopnjo B, šest bolnikov pa klinično razvojno stopnjo C. Čas od ugotovitve KLL pa do začetka zdravljenja s fludarabinom je bil od 6 do 44 mesecev (mediana 31 mesecev). Pred začetkom zdravljenja s fludarabinom so se trije bolniki zdravili s klorambucilom, devet bolnikov s klorambucilom in metil-prednizolonom, dva s kombinacijo citostatikov CHOP (ciklofosfa-mid, doksorubicin, vinkristin, prednizon) in COP (ciklofosfamid, doksorubicin, prednizon), dvema pa smo obsevali vranico z ionizirajočimi žarki.
Fludarabin (Fludara, Schering AG) smo dajali 25 mg/m-2 telesne površine/dan, 5 dni v 30 minutni venski infuziji (17). Zdravljenje smo ponavljali na 28 dni, dokler so se kazalniki bolezni izboljševali. Uspešnost zdravljenja smo ocenjevali pred naslednjim ktogom zdravljenja.
Popolno remisijo bolezni smo ocenili: 1. če po zdravljenju nismo več ugotovili povečanih bezgavk ali organov, 2. če je bilo v krvni sliki več kot l,5xl0-9/L nevtrofilcev, manj kot 4xlO-9/L limfocitov, več kot 100xl0-9/L trombocitov, koncentracija hemoglobina
pa večja od 110 g/L, 3. če je bilo v kostnem mozgu manj kot 30% limfocitov.
Za delno remisijo smo ocenili, če so se povečane bezgavke ali organi zmanjšali za 50% in izboljšale zgoraj naštete vrednosti krvne slike za več kot 50%. V primerih, ko nismo dosegli opisnega izboljšanja bolezni, smo ocenili zdravljenje kot neuspešno (18). Zdravljenje smo zaključili, če smo dosegli popolno remisijo bolezni ali če se znaki bolezni niso več zmanjševali oziroma če je bilo zdravljenje neuspešno.
Rezultati
V	skupini 15 bolnikov z napredovalo KLL smo po zdravljenju s fludarabinom dosegli popolno remisijo pri dveh bolnikih (13%), delno remisijo pa pri petih (33%). Pri osmih bolnikih (54%) je bilo zdravljenje neuspešno.
V	skupini sedmih bolnikov (46%), pri katerih je bilo zdravljenje s fludarabinom uspešno, so bili štirje bolniki klinično razvojne stopnje B, trije pa C. V skupini osmih bolnikov (54%), pri katerih zdravljenje ni bilo uspešno, je bilo pet bolnikov klinično razvojne stopnje B, trije pa C. Bolniki, pri katerih je bilo zdravljenje uspešno, so prejeli povprečno 4 kroge zdravljenja. Pri enem smo dosegli popolno remisijo že po prvem krogu zdravljenja, pri drugem pa šele po sedmih krogih.
Čas od zaključka zdravljenja s fludarabinom pa do poslabšanja bolezni je bil pri bolnikih 16 mesecev (mediana). Pri tistih, kjer smo dosegli popolno remisijo bolezni, je bil 22 mesecev (mediana), pri bolnikih z delno remisijo bolezni pa 13 mesecev (mediana).
Pri enem bolniku se je med zdravljenjem s fludarabinom prehodno zmanjšalo število nevtrofilcev v krvi pod lxl0-9/L, pri dveh pa število trombocitov pod 100x10-9/L. Pri enem bolniku se je po zaključenem zdravljenju s fludarabinom pojavila avtoimunska he-molitična anemija.
Razpravljanje
Učinkovitost fludarabina pri prej zdravljenih in nezdravljenih bolnikih s KLL so potrdile že prve klinične raziskave ob koncu 80 let (13, 15, 16).
Naši izsledki zdravljenja s fludarabinom so primerljivi z izsledki v literaturi. Medtem ko so Grever in sod. (15) ugotovili, da je bilo zdravljenje s fludarabinom uspešno pri 35% bolnikov, so Keating in sod. (16) to ugotovili pri 51% bolnikov s KLL, ki so jih pred tem že zdravili na druge načine. V obeh raziskavah je bil delež popolnih remisij 13%. Catovsky in Murphy (19) sta po zdravljenju s fludarabinom 34 prej že zdravljenih bolnikov s KLL ugotovila 18% popolnih in 41% delnih remisij. Naša skupina bolnikov je glede napredovanja bolezni in načinov poprejšnjega zdravljenja KLL primerljiva s tistimi v literaturi (15, 16). Večina naših bolnikov 12/ 15 (80%) je bila pred zdravljenjem s fludarabinom rezistentna le na eno vrsto zdravljenja KLL. Poleg tega je pomemben tudi delež bolnikov z najbolj napredovalo boleznijo (stopnja C), saj je pri njih odzivnost na zdravljenje manjša (16) kot pri manj napredovali bolezni (stopnja B). V naši skupini bolnikov je bilo šest bolnikov (40%) klinično razvojne stopnje C in devet bolnikov (60%) klinično razvojne stopnje B.
Po zdravljenju s fludarabinom prej zdravljenih bolnikov s KLL niso ugotovili (15, 16) pomembno podaljšanega preživetja bolnikov, temveč le kasnejšo ponovitev bolezni, kot če so se zdravili (17) s kombinacijo CAP (ciklofosfamid, doksorubicin, prednizon).
Čas od zaključka zdravljenja s fludarabinom pa do poslabšanja bolezni je bil pri naših bolnikih v povprečju 16 mesecev, kar je manj, kot so ugotovili (27 mesecev) Johnson in sod. (17) vendar še znatno več, kot so ugotovili po zdravljenju s CAP (9 mesecev). Hitrejša ponovitev KLL je lahko pri naših bolnikih posledica tega, ker so prejeli v povprečju en krog zdravljenja s fludarabinom manj kot skupina bolnikov Johnsona in sod. (17).
Zaviralno delovanje fludarabina na kostni mozeg se pojavi pri 19% bolnikov kot nevtropenija in pri 14% bolnikov kot tromboci-topenija (17), medtem ko se anemija pojavi le pri 7% bolnikov. Tudi pri naših bolnikih se je pri enem pojavila prehodna nevtropenija, pri dveh trombocitopenija, pri enem pa po zaključenem zdravljenju avtoimunska hemolitična anemija, kar je nekoliko manj kot v literaturi (17). Okužb in drugih zapletov s prebavili in osrednjim živčevjem pri naših bolnikih nismo zasledili. Medtem ko so nekateri ugotovili, da so avtoimunski zapleti z anemijo in trombo-citopenijo pogostejši med zdravljenjem s fludarabinom (20, 21), pa so drugi opisali izboljšanje avtoimunske hemolitične anemije (22).
Zaključki
Zdravljenje s fludarabinom je bilo uspešno, s tem pa tudi boljša kakovost življenja pri skoraj polovici prej zdravljenih bolnikov z napredovalo KLL. Trajanje učinka zdravljenja je bilo daljše pri tistih bolnikih, kjer smo dosegli popolno remisijo bolezni. Pri petini bolnikov smo zasledili zaviralno delovanje fludarabina na mielopoezo.
Literatura
1.	Li FP. Epidemiology of chronic leukemias. In: Wiemik PH, Canellos GP, Kyle RA, Schiffer CA, eds. Neoplastic Disease of the blood. New York: Churchill Livingstone, 1991: 7-14.
2.	Binet JL, Auquier A, Dighiero G et al. A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from multivariate survival analysis. Cancer 1981; 48: 198-206.
3.	Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP et al. Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975; 46: 219-34.
4.	Rozman C, Montserrat E. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 1995; 333: 1052-7.
5.	Knospe WH, Loeb V, Hugulex CM. Biweekly chlorambucil treatment of chronic lymphocytic leukemia. Cancer 1974; 33: 555-62.
6.	Montserrat E, Alcala A, Parody R et al. Treatment of chronic lymphocytic leukemia in advanced stages: a randomized trial comparing chlorambucil plus prednisone versus cyclophosphamide, vincristineand prednisone. Cancer 1985; 56: 2369-75.
7.	Hansen MM, Andersen E, Birgens H et al. CHOP versus chlorambucil plus prednisolone in chronic lymphocytic leukemia. Leuk Lymph 1991; 5 Suppl: 97-100.
8.	Kimby E, Mellstedt H. Chlorambucil/prednisone versus Chop in symptomatic chronic lymphocytic leukemias of B-cell type. A randomized trial. Leuk Lymph 1991; 5 Suppl: 93-6.
9.	Spanish Cooperative Group PETHEMA. Treatment of chronic lymphocytic leukemia: a preliminary report of Spanish (PANTHEMA) trials. Leuk Lymph 1991; 5 Suppl: 89-91-
10.	O’Bien S, Kantarjiian H, Beran M et al. Results of fludarabine and prednisone therapy in 264 patients with chronic lymphocytic leukemia with multivariate analysis-derived prognostic model for response to treatment. Blood 1993; 82: 1695-700.
11.	Juliusson G, Liliemark J. High complete remission rate from 2-chloro-2,-deoxadenosine (CdA) in previously treated patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. Response predicted by rapid decrease of blood lymphocyte counts. J Clin Oncol 1993; 11: 679-89-
12.	Lee WW, Benitz A, Goodman A, Baker BR. Potential anticancer agents LX: Synthesis of the beta-anomer of 9- (d-arabinofuranosyl) adenine. J Am Chem Soc I960; 82: 2648-52.
13- Grever MR, Leiby JM, Kraut EH et al. A comprehensive phase I and II clinical investigation of fludarabine phosphate. Sem Oncol 1990; 17 Suppl: 39-48.
14.	Leiby JM, Snider KM, Kraut EH et al. Phase II trial of 9-beta-D-arabinofuranosyl-2-fluoroadenine-5,-monophosphate in non-Hodgkin,s lymphoma: Prospective comparision of response with deoxycytydine kinase activity. Cancer Res 1987; 47: 2719-22.
15.	Grever MR, Kopecky KJ, Coltman CA et al. Fludarabine monophosphate: A potentially useful agent in chronic lymphocytic leukemia. Nouv Rev Fr Hematol 1988; 30: 457-9-
16.	Keating MJ, Kantarjian H, Talpaz M et al. Fludarabine: A new agent with major activity against chronic lymphocytic leukemia. Blood 1989; 74:19-25-
17.	Johnson S, Smith AG, Loeffler H, Oesby E et al. Multicentre prospective randomised trial of fludarabine versus cyclophosphamide, doxorubicin, and prednisone (CAP) for treatment of advanced-stage chronic lymphocytic leukaemia. Lancet 1996, 347: 1432-8.
18.	Cheson BD, Bennett JM, Rai KR et al. uidelines for clinical protocols for chronic lymphocytic leukemia. Recommendations of the National Cancer Institute sponsored working group for CLL. Am J Hematol 1989; 29: 152-63.
19- Catovsky D, Murphy RLW. Key issues in the treatment of chronic lymphocytic leukaemia. Eur J Cancer 1995; 31A: 2146-54.
20.	Bastion Y, Coiffier B, Dumontet C, Espinouse D, Byron PA. Severe autoimmune hemolytic anemia in two patients treated with fludarabine for chronic lymphocytic leukemia. Ann Ocol 1992; 3: 171-2.
21.	DiRaimondo F, Giustolisi R, Cacciola E et al. Autoimmune hemolytic anemia in chronic lymphocytic leukemia patients treated with fludarabine. Leuk Lymph 1993; 11: 63-8.
22.	Dighiero G. Potential immunological action of purine nucleoside analogues. Drugs 1994; 47 Suppl 6: 57-62.
Pred predpisovanjem, prosimo, preberite navodilo za uporabo. Dobite ga pri naših strokovnih sodelavcih.
^MSD
MERCK SHARP & DOHME IDEA INC* Podružnica Ljubljana Dunajska cesta 58, 1000 Ljubljana Tel.: 061 175 52 01, Fax: 061 175 52 49/50
'’'Zaščitena blagovna znamka MERCK & CO., INC., Whitehouse Station, N.J., U.S.A. *Družba povezana z MERCK & CO., INC., Whitehouse Station, N.J., U.S.A. Avtorska pravica MERCK & CO., INC., 1996. Vse pravice pridržane.
1098-TEN-97-SLO-18&J
Strokovni prispevek/Professional article
ZDRAVLJENJE BOLNIKOV Z DLAKASTO CELIČNO LEVKEMIJO S KLADRIBINOM
TREATMENT OF HAIRY CELL LEUKEMIA WITH CLADRIBINE
Uroš Mlakar
Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-03-30, sprejetol998-04-04; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-27-9
Ključne besede: dlakasto celična levkemija; 2-klorodeoksiade-nozin; zdravljenje
Izvleček—Izhodišča. Z uporabo interferona alfa in novejših analogov purina (pentostatin, kladribin) za zdravljenje dlakasto celične levkemije se je prognoza bolezni znatno izboljšala. Kladribin se je najbolj uveljavil zaradi majhne toksičnosti, kratkotrajnega zdravljenja in visokega deleža dolgotrajnih remisij.
Metode in rezultati. Petnajst bolnikov z dlakasto celično levkemijo smo zdravili s kladribinom (0,1 mg/kg/dan sedem dni). Zdravljenje je trajalo sedem dni. Sedem bolnikov smo poprej zdravili z interferonom alfa. Popolno remisijo bolezni smo dosegli pri 9/15 (60%) bolnikov in delni odgovor pri 6/15 (40%). Bolnike smo po zdravljenju spremljali 6 do 31 mesecev. En bolnik je umrl šest mesecev po zdravljenju zaradi karcinoma pljuč. Remisija bolezni pri drugih bolnikih še vedno traja. Hujših neželenih učinkov zdravljenja nismo opazili. Osem bolnikov je zbolelo med zdravljenjem ali kmalu po njem z zvečano telesno temperaturo. Pri vseh, razen pri enem, je zvečana telesna temperatura nastopila v obdobju nev-tropenije. En bolnikje zaradi poslabšanja anemije potreboval transfuzijo eritrocitov kmalu po zaključku zdravljenja.
Zaključki. Zdravljenje dlakastocelične levkemije s kladribinom je zelo učinkovito. Hujši neželeni učinki zdravljenja so redki. Pri bolnikih spovečanim tveganjem za resno okužbo lahko zmanjšamo to tveganje s spremembo načina zdravljenja.
Uvod
Dlakasto celična levkemija (DCL) je redka kronična limfoprolife-rativna bolezen, pri kateri so se načini zdravljenja v zadnjih 14 letih znatno izboljšali. Pred odkritjem učinkovitega sistemskega zdravljenja je bila mediana preživetja bolnikov le 53 mesecev (1). Z uvedbo interferona alfa (IFN) leta 1984 in kasneje novih analogov purina, kot sta pentostatin in kladribin, je postalo zdravljenje DCL uspešno. Vsi trije načini zdravljenja podaljšajo preživetje za več kot 10 let. Razlike so le glede trajanja indukcijskega zdravljenja, deleža doseženih popolnih remisij in trajanja remisije. Glede teh lastnosti se je zdravljenje s kladribinom izkazalo za najprimernejše.
Kladribin (2-klorodeoksiadenozin, 2-CdA) je analog deoksiade-nozina, na katerega encim adenozin deaminaza ne učinkuje. Zdravilo deluje predvsem na limfocite in monocite. Deluje na celice v obdobju delitve, kot tudi na mirujoče celice s tem, da sproži apop-tozo. Selektivnost je posledica velike aktivnosti encima deoksiciti-din kinaze v celicah limfocitne vrste. To omogoča kopičenje fos-
Key words: hairy cell leukemia; cladribine; treatment
Abstract — Background. Since the introduction of interferon and newer purine analogues (pentostatin and cladribine) in the treatment of hairy cell leukaemia outcome of disease changed dramatically. Cladribine is emerging as the treatment of choice because of its favourable toxicity profile, brief duration of treatment and high percentage of long-lasting complete remissions.
Methods and results. Fifteen patients with hairy cell leukaemia were treated with cladribine (0.1 mg/kg/day) for seven days. Seven patients had received prior interferon therapy. Complete haemato-logical remission was achieved in nine (60%) patients and partial remission in six (40%). The follow up period varied between 6 and 31 months. One patient died six months after cladribine treatment because of pulmonary carcinoma. Otherfourteen patients are still in remission. There were no serious side effects of treatment. Eight patients had shortfever during or shortly after the treatment. Seven of these had fever in the setting of neutropenia. One patient required blood product support after treatment.
Conclusions. Treatment of hairy cell leukaemia with cladribine is highly effective with minor side effects. The selected group of patients with higher risk of serious infection or myelosupression may benefit of a different schedule of treatment.
foriliranega 2-CdA v toksičnih koncentracijah. Prvo poročilo o učinkovitem zdravljenju DCL s kladribinom so objavili Piro in sodelavci leta 1987 (2). Pri dveh bolnikih so s sedemdnevnim zdravljenjem v obliki neprekinjene infuzije kladribina (0,lmg/kg) 7 dni dosegli popolno dolgotrajno remisijo. Kasneje so številne klinične raziskave potrdile učinkovitost takšnega zdravljenja. Zaradi prednosti, kot sta kratko zdravljenje in velik delež dolgotrajnih popolnih remisij, se kladribin bolj priporoča za zdravljenje DCL kot IFN ali pentostatin.
Namen prispevka je opisati naše izkušnje pri zdravljenju DCL z kladribinom.
Bolniki in načini zdravljenja
Od julija 1995 do julija 1997 smo na Kliničnem oddelku za hematologijo v Ljubljani zdravili s kladribinom 15 bolnikov z DCL. Pri vseh bolnikih so izsledki kliničnega pregleda in laboratorijskih preiskav ustrezali DCL. Za zdravljenje smo se odločili v primeru
znakov aktivne bolezni: hemoglobin (Hb) <110 g/L, število nevtrofilcev (Ng) <lxl06/L, število trombocitov (Tr) <100xl07L, ponavljajoče se okužbe in prisotnost splošnih simptomov bolezni. Podatke o bolnikih pred začetkom zdravljenja s kladibinom smo prikazali v tabeli 1. Le pri bolnikoma BA in RD smo navedli izsledeke biopsije kostnega mozga izpred dveh let. Sedem bolnikov smo poprej zdravili z IFN. Pri petih bolnikih, ki so zaključili indukcijsko zdravljenje z IFN, smo ugotovili relaps bolezni leto dni (mediana 16 mesecev) po zaključku zadnjega zdravljenja. Pri bolniku LA smo ugotovili relaps med vzdrževalnim zdravljenjem z IFN. Vzdrževalno zdravljenje je trajalo šest let. Pri bolniku ŠF smo indukcijsko zdravljenje z IFN po dveh mesecih prekinili zaradi neželenih učinkov. Drugi bolniki se poprej niso zdravili zaradi DCL.
Tab. 1. Značilnosti bolnikov pred začetkom zdravljenja s CdA.
Tab. 1. Characteristics of patients before therapy with CdA.
Bolnik Patient	Spol Sex	Starost (leta) Age (years)	Predhodno zdravljenje z IFN Previous treatment wtih IFN
BA	m	59	
ČR	m	49	IZ (4x)*
HZ	m	57	
JM	m	40	
KD	m	73	IZ
KJ	m	67	IZ (2x)
LŠ	m	63	
LA	m	69	IZ + VZ
PG	m	51	
RD	ž (0	47	IZ (2x)
SD	ž (0	63	
SI	m	55	
SL	ž (0	74	
ŠF	m	63	IZ
ŠLF	m	46	IZ
IFN - interferon; IZ - indukcijsko zdravljenje; * število IZ, VZ - vzdrževalno zdravljenje.
IZ - induction treatment; * number of inductions; VZ - maintenance treatment.
Bolnike smo zdravili s kladribinom (Leustatin, Ortho Biotech) v odmerku 0,1 mg/kg/dan sedem dni zapored. Zdravilo so bolniki prejeli v neprekinjeni infuziji (dva bolnika) ali kot podkožne injekcije (13 bolnikov). Zdravljenje smo izvajali v bolnišnici in ambulantno. Pred začetkom zdravljenja smo bolnikom napravili celotno krvno sliko in citološki ter histološki pregled kostnega mozga. Pri histološkem pregledu kostnega mozga je patolog ocenil delež infiltracije z dlakastimi celicami (DC). Uspeh zdravljenja smo ocenili tri do šest mesecev po začetku zdravljenja. Za oceno uspešnosti zdravljenja smo uporabili priporočila »2nd International Workshop on Hairy Cell Leukemia« (3):
-	Popolna remisija bolezni je zmanjšanje povečanih organov (jetra, vranica bezgavke) na normalno velikost, Hb > 120 g/L, Tr > 100x107 L, Ng > l,5xl0VL in odsotnost DC v krvi in kostnem mozgu.
-	Delna remisija bolezni je zmanjšanje povečanih organov in števila DC v kostnem mozgu za najmanj 50% ter manj kot 5% DC v diferencialni beli krvni sliki.
Rezultati
Izsledke zdravljenja petnajstih bolnikih smo prikazali v tabeli 2. Popolno remisijo smo ugotovili pri devetih bolnikih (60%), delno remisijo pa pri petih bolnikih (40%). Neuspešnega zdravljenja ni bilo. Bolnika JM smo zdravili dvakrat. Po prvem zdravljenju smo dosegli delno remisijo z 20% preostalih DC v kostnem mozgu. Sedem mesecev po prvem zdravljenju smo bolnika ponovno zdravili na enak način kot prvič. Po drugem zdravljenju v kostnem mozgu ni bilo več DC, vendar smo zaradi zmanjšanega števila trombocitov v kivi uspeh zdravljenja ocenili le kot delno remisijo.
Pri štirinajstih bolnikih zaenkrat nismo zasledili poslabšanja bolezni. Čas opazovanja je 8-31 mesecev. Le bolnik PG, pri katerem smo dosegli popolno remisij bolezni, je šest mesecev po zaključku zdravljenja s kladribinom umrl zaradi adenokarcinoma pljuč.
Tab. 2. Hematološki izsledki pred in 3 do 6 mesecev po zdravljenju z kladribinom (2-CdA).
Tab. 2. Haematologic values before and after 3 to 6 months of treatment with cladribine (2-CdA).
Pred 2-CdA Before 2-CdA Bolnik Hb Tr Ng DC Patient (g/L) 107L lOVL %					KM %	3-6 mes. po 2-CdA 3-6 mo. after 2-CdA Hb Tr Ng DC KM ° zdravi), remisije Respon- (g/L) 109/L 106/L % % se to Remission treatment duration						
BA	106	22	0,7	4	>30	164	105	4,2	0	0	R	22 m*
ČR	139	212	0,8	11	90	159	285	5,9	0 •	' 30	DR	17 m*
HZ	102	137	2,2	7	90	150	176	2	0	25	DR	27 m*
JM	81	45	0,7	8	90	151	79	3,6	0	20	DR	
2:	151	79	3,6	0	20	142	78	3	0	0	DR	13m*
KD	123	53	1,4	16	80	146	130	2,7	0	0	R	11m*
KJ	113	54	1,1	23	80	158	112	4	0	0	R	11m*
LŠ	79	143	0,8	0	>90	144	176	3	0	5	DR	14m*
LA	95	89	0,8	0	>90	107	137	2,3	0	30	DR	9m*
PG	99	139	1,3	3	70	123	286	4,6	0	0	R	6m
RD	114	85	1	1	>90	134	164	2,5	0	<5	DR	14m*
SD	55	9	0,1	49	>90	135	111	1,6	0	0	R	8m*
SI	128	104	0,3	0	60	150	166	3,9	0	0	R	18m*
SL	95	41	0,6	67	90	136	157	4,7	0	0	R	13m*
ŠF	82	37	0,2	0	>90	158	206	5	0	0	R	31m*
ŠLF	105	38	0,8	45	80	140	152	5,5	0	0	R	11m*
Hb - hemoglobin; Tr - trombociti; Ng - nevtrofilci; DC - dlakaste celice v krvi; KM - dlakaste celice v kostnem mozgu; R - popolna remisja; DR - delna remisija; m -mesec; * remisija še traja; + drugo zdravljenje.
Hb - haemoglobin; Tr - platelets; Ng - neutrophils; DC - blood hairy cells; KM - bone marrow hairy cells; R - complete remission; DR - partial remission; m - month; * remission permanent; + second treatment.
Pri petih bolnikih med zdravljenjem in po njem ni bilo zapletov. Osem bolnikov je imelo po zdravljenju krajše obdobje zvečane telesne temperature. Pri sedmih se je vročina pojavila v obdobju poslabšanja nevtropenije. Bolnik ČR je po zdravljenju s kladribinom zbolel za akutnim bronhitisom. Bolnik RD pa je zaradi prehodnega poslabšanja anemije potreboval transfuzijo eritrocitov.
Razpravljanje
Če ocenjujemo uspešnost zdravljenja DCL s preživetjem bolnikov, ni bistvenih razlik med zdravljenjem z IFN, pentastatinom ali kladribinom. Razlike so pri trajanju indukcijskega zdravljenja, deležu popolnih remisij in trajanju remisij. Indukcijsko zdravljenje z IFN traja eno leto, popolno in delno remisijo dosežemo v 10% oziroma 55%, bolezen se ponovi v povprečju po 1-2 letih po zdravljenju (4, 5). Glede deleža popolnih remisij in njihovega trajanja je zdravljenje s pentostatinom in kladribinom uspešnejše. Popolno remisijo bolezni so dosegli v 60-80%, pri ostalih bolnikih pa delno remisijo. Neuspešno zdravljenje je bilo redko (4). Trajanje remisij je bilo dolgo. Štiri leta po zdravljenju je bilo 72% bolnikov še vedno v remisiji (6). Glavna prednost kladribina pred pentostatinom je krajši čas zdravljenja (7 dni nasproti 3-6 mesecem) in uspešno zdravljenje ponovitve bolezni po zdravljenju z IFN ali pentostatinom (7). Zdravljenje s kladribinom v obliki podkožnih injekcij je enako uspešno kot intravenska infuzija (8). Zdravljenje se zato lahko izvaja tudi ambulantno. Naši izsledki glede zdravljenja s kladribinom so podobni tistim v literaturi (9). Manj uspešen je kladribin pri zdravljenju bolnikov z različico DCL s CD25 negativnim imunološkim fenotipom (10). Pri teh sta tudi IFN in pento-statin neuspešna. Tri mesece po koncu zdravljenja so Wheaton in sod. pri bolnikih s popolno remisijo ocenjevali bioptične pripravke kostnega mozga z natančnejšimi imunokemičnimi načini. Pri 13% bolnikov so še ugotovili manjše število DC v kostnem mozgu (minimalno rezidualno levkemijo) (11). Menijo, da je to edini kazalnik, ki napoveduje kasnejšo ponovitev bolezni. Glede na dolgo remisijo bolezni še ni znano, ali je kateri od bolnikov v popolni remisiji dejansko ozdravel. Prav tako se ne ve, ali je pri bolnikih z delno remisijo bolezni koristno poskusiti doseči popol-
no remisijo s ponovitvijo zdravljenja. Pri našem bolniku smo po drugem zdravljenju s kladribinom sicer dosegli remisijo bolezni v kostnem mozgu, število trombocitov v krvi pa je ostalo znižano. Pri ponovitvi DCL po zdravljenju s kladribinom lahko ponovno zdravimo na enak način. Vendar so sledeče remisije praviloma krajše (10). Poročajo, da je pri teh bolnikih uspešno tudi zdravljenje z IFN (12).
Bolniki običajno nimajo večjih težav pri zdravljenju z kladribinom. Pogosti neželeni učinek zdravljenja je zvečana telesna temperatura ob nevtropeniji, ki se pojavi pri 1/3-1/2 bolnikov. Navadno se pojavi med zdravljenjem ali kmalu po njem in je kratkotrajna. Iz hemokultur običajno ne uspejo osamiti povzročitelja. Le pri manjšem številu bolnikov so okužbe hude in se v 3% končajo s smrtjo. Večja verjetnost okužb ali potreb po transfuzijah je pri bolnikih z večjo tumorsko maso in hujšo prizadetostjo kostnega mozga. Pomembnejša kazalnika nevarnosti okužbe po zdravljenju s kladribinom sta koncentracija hemoglobina in holesterola pred pričetkom zdravljenja. Tveganje je večje pri manjših koncentracijah (13). Da bi zmanjšali nevarnost okužb pri bolnikih s povečanim tveganjem, predlagajo:
1.	poprejšnje zdravljenje z IFN (9),
2.	spremembo načina zdravljenja s kladribinom (1-krat tedensko 6-krat zapored) (14) in
3.	uporabo filgrastima (G-CSF) (4).
Čeprav po zdravljenju s kladribinom nastopi dolgotrajno zmanjšanje števila limfocitov CD4, novejše raziskave ne opisujejo poznih zapletov z oportunističnimi okužbami ali pojavom sekundarnih novotvorb (6, 10). Zato menimo, da je ugotovitev karcinoma pljuč pri enem od naših bolnikov le slučajen pojav dveh bolezni.
Zaključki
Na osnovi naših ugotovitev in izsledkov iz literature menimo, da je zdravljenje DCL s kladribinom zelo uspešno. Resni zapleti zdravljenja so redki. Nenazadnje je to zdravljenje za bolnika sprejemljivejše, pa tudi cena zdravljenja je v primerjavi z enoletnim zdravljenjem z IFN manjša.
Literatura
1.	Golomb HM, Catovsky D, Golde DW. Hairy cell leukemia; a clinical review of 71 cases. Ann Intern Med 1978; 89: 677-83-
2.	Piro LD, Miller WE, Carrera CJ et al. Hairy-cell leukemia. N Engl J Med (Letter) 1987; 317: 901.
3.	2nd International workshop on hairy cell leukemia. Consensus resolution: Proposed criteria for evaluation of response to treatment in hairy cell leukemia. Leukemia 1987; 4: 405-
4.	Gollard R, Lee TC, Piro LD, Saven A. The optimal management of hairy cell leukemia. Drugs 1995: 49: 921-31-
5.	Bouroncle BA. Thirty-five years in the progress of hairy cell leukemia. Leukemia and Lymphoma 1994; 14: Suppl 1: 1-12.
6.	Tallman MS, Hakimian D, Rademaker AW, Zanzig C, Wollins E, Rose E. Relapse of hairy cell leukemia after 2-chlorodeoxyadenosine: long-term folllow-up of Northen University experience. Blood 1996; 88: 1954-9.
7.	Saven A, Piro LD. Complete remissions in hairy cell leukemia with 2-chlorodeoxyadenosine after failure with 2-deoxycoformycin. Ann Intern Med 1993; 119: 278-83-
8.	Juliusson G, Heldal D, Hippe E. Subcutaneous injection of 2-chlorodeoxyadenosine for symptomatic hairy cell leukemia. J Clin Oncol 1995; 13: 989-95.
9- Legrand O, Vekfoff A, Marie JP, Zittoun R, Delmer A. Treatment of hairy cell leukemia (HCL) with 2-chlorodeoxyadenosine (2-CdA): identification of parameters predictive of adverse effects. Br J Haematol 1997; 99: 165-7.
10.	Hoffman MA, Janson D, Rose E, Rai KR. Treatment of hairy-cell leukemia with cladribine: response, toxicity, and long-term follow-up. J Clin Oncol 1997; 15: 1138-42.
11.	Wheaton S, Tallman MS, Hakimian D, Peterson L. Minimal residual disease may predict bone marrow relapse in patients with hairy cell leukemia treated with 2-chlorodeoxyadenosine. Blood 1996; 87: 1556-60.
12.	Seymour B, Estey EH, Keating MJ et al. Response to interferon in patients with hairy cell leukemia relapsing after treatment with 2-chlorodeoxyadenosine. Leukemia 1995; 9: 929-32.
13- Juliusson G, Lenkei R, Tjonnfjord G, Heldal D, Liliemark J. Neutropenic fever following cladribine therapy for symptomatic hairy-cell leukemia: predictive factors and effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Ann Oncol 1995; 6: 371-5.
14. Lauria F, Bocchia M, Marotta G et al. Weekly administration of 2-chlorodeoxy-adenosine in patients with hairy-cell leukemia: a new treatment schedule effective and safer in preventing infectious complications. Blood 1997; 89:1838-9-
o
Interferon alfa-2a
Raztopina za injiciranje brez humanega serumskega albumina
v predhodno napolnjeni Injekcijski brizgi
Vse dodatne informacije so vam na voljo pri zastopniku
Proizvaja:
F. Hoffmann-La Roche Ltd Basel, Švica
Zastopa:
Hoffmann-La Roche Ltd Podružnica Ljubija na Dalmatinova 10, 1000 Ljubljana
Strokovni prispevek/Professional article
KONCENTRACIJA ERITROPOETINA V SERUMU PRI BOLNIKIH 2 DISEMINIRANIM PLAZMOCITOMOM PRED
ZAČETKOM ZDRAVLJENJA *
PRE-TREATMENT SERUM ERYTHROPOIETIN IN PATIENTS WITH MULTIPLE MYELOMA
Uroš Mlakar
Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-03-30, sprejetol998-04-04; ZDRAV VESTN 1998; 67; Suppl I: 1-31—4
Ključne besede: diseminiraniplazmocitom; eritropoetin;prognoza; anemija
Izvleček — Izhodišča. Anemija je pri diseminiranem plazmocito-mu pogosta. Vzrokov za njen nastanek je več. Med njimi je pomembno predvsem neustrezno izločanje eritropoetina. V raziskavi smo proučevali pomanjkanje eritropoetina pri bolnikih z anemijo in diseminiranim plazmocitomom.
Metode. Pri 80 bolnikih z diseminiranim plazmocitomom smo izmerili koncentracijo eritropoetina v serumu (Epo) pred začetkom zdravljenja. Za oceno ustreznosti nivoja Epo glede na stopnjo anemije smo za vsako vrednost izračunali količnik med logaritmoma opazovane in pričakovane koncentracije Epo (O/P Epo). Pričakovano vrednost smo izračunali iz regresijske enačbe, ki prikazuje odnos med koncentracijo Epo in hemoglobina (Hb) pri referenčni skupini oseb z anemijo.
Rezultati. Pomanjkanje Epo (O/P <0,8) smo ugotovili pri 83% pri bolnikov z ledvično odpovedjo in pri 39% bolnikov brez ledvične odpovedi. Pii bolnikih brez ledvične odpovedi smo ugotovili tudi negativno korelacijo med koncentracijo Hb in log Epo (rp = -0,68 p < 0,001). Pri bolnikih z ledvično odpovedjo ni bilo tovrstne povezave. S pomočjo količnika O/P Epo lahko ocenimo tudi prognozo diseminiranega plazmocitoma. Tega nismo ugotovili za serumsko koncentracijo Epo.
Zaključki. Koncentracija Epoje glede na stopnjo anemije neustrezna ne le pri bolnikih z ledvično odpovedjo, temveč tudi pri številnih bolnikih brez ledvične odpovedi. Količnik O/P Epo je koristen za patofiziološko oceno anemije. Ta količnik ima tudi prognostični pomen.
Uvod
Patogeneza anemije pri diseminiranem plazmocitomu (DP) je kompleksna. Odločilno vlogo pri njenem nastanku ima zmanjšanje eritropoeze. Eritropoetin (Epo) je hormon, ki deluje predvsem na v rdečo vrsto usmerjene matične celice in jih spodbuja k deljenju in dozorevanju v proeritroblaste. Na ta način poveča proizvodnjo eritrocitov (eritropoezo). Epo je glikoprotein z molekulsko maso 34 KDa. Proizvajajo ga predvsem peritubulame intersticijske celice v ledvicah kot odgovor na ledvično hipoksijo. Zato je bistven člen regulacijske zanke, ki uravnava proizvodnjo eritrocitov in s tem koncentracijo hemoglobina (Hb) v krvi (1, 2). Glede na nastanek
Keywords: multiple myeloma, erythropoietin; anaemia; prognosis
Abstract - Background. Anaemia is a common complication of multiple myeloma. Several causes have been implicated but inappropriate erythropoietin (Epo) secretion appears to be important. We evaluated the erythropoietin deficiency in anaemic patients with multiple myeloma and prognostic value of this parameter.
Methods. Pre-treatment serum levels were measured in 80patients with multiple myeloma. To define Epo levels as appropriate or inappropriatefor a given degree of anaemia the obsewed/predicted log (Epo) ratio (O/P Epo) was derivedfor each sample. The predicted values were calculated by use of regression formula of serum Epo versus haemoglobin (Hb) determined in reference subjects.
Results. The Epo deficiency (O/P ratio <0,8) was present in 83% of patients with renal failure and in 39% without renal failure. Significant inverse relationship between serum Epo level and Hb concentration was shown for the patients without renalfailure (rp =-0,68p<0,001).This correlation was absent in group of patients with renal failure. Pre-treatment O/P Epo ratio was prognostic factor while serum Epo level had no prognostic significance.
Conclusions. Serum Epo levels are inadequate not only for patients with renal failure but also in a number ofpatients without renal failure. The O/P Epo ratio is usefid in evaluation of pathophysiology of anaemia. The ratio has prognostic significance too.
lahko pri DP razlikujemo tri glavne vrste anemije: 1. anemijo, ki je posledica infiltracije kostnega mozga s plazmocitomskimi celicami
(3); 2. anemijo, ki jo srečamo pri kroničnih vnetjih (4); 3. anemijo, ki je posledica kronične ledvične odpovedi (5). V zadnjih dveh primerih je pri nastanku anemije soudeleženo relativno ali absolutno pomanjkanje eritropoetina.
Anemija je pri DP pogosta. Že zgodaj so ugotovili, da je preživetje bolnikov z DP tem krajše, čim hujša je anemija. Zaradi velike prognostične vrednosti je stopnja anemije (koncentracija Hb) vključena v mnoge prognostične razvrstitve DP (6). Z našo raziskavo smo želeli ugotoviti, kakšna je prognoza bolnikov, pri katerih izločanje Epo ne ustreza stopnji anemije. Zanimala nas je tudi
1200 100 800 I 600
400
200
0 -
1 1 1 1 1 1 ■ 1 !	1 1 ■ - |
i h ' ,■ 	S	
0,2
0,4
0,6 0,8 1,0
O/P Epo
1,2
1,4
Sl. 1. Odnos med koncentracijo eritropoetina in hemoglobina pri bolnikih z DP. Področje med vrisanima krivuljama ustreza območju pričakovanih vrednosti.
Fig. 1. Relationship between erythropoietin and haemoglobin levels in patients with multiple myeloma. The area between two lines representspredicted range of epo valuesfor any given haemoglobin.
SI. 2. Odnos med količnikom O/P Epo in koncentracijo kreatinina v serumu pri bolnikih z DP. Navpična in vodoravna črta sta vrisani pri vrednosti O/P Epo 0,8 in koncentraciji kreatinina 177 jtmol/L.
Fig. 2. Relationship between O/P Epo ratio and creatinine level. Vertical and horizontal lines are at O/P Epo 0,8 and creatinine 177 ptmol/L.
vloga neustreznega izločanja Epo pri nastanku anemije zaradi diseminiranega plazmocitoma.
Material in metode
V raziskavi smo obravnavali 80 bolnikov z diseminiranim plazmo-citomom, ki so se zdravili na Kliničnem oddeleku za hematologijo v Ljubljani. Bolniki so izpolnjevali diagnostične kriterije za pla-zmocitom, kot jih priporoča Durie, in pred tem niso bili zdravljeni (7). Bolnikov z benigno monoklonsko imunoglobulinemijo in pla-zmacelično levkemijo nismo obravnavali (8). Vse laboratorijske in klinične kazalnike smo ocenili pred pričetkom zdravljenja na dan vključitve v raziskavo. Poleg preiskav, potrebnih za opredelitev diagnoze in razvojne stopnje DP (9, 7), smo bolnikom določili tudi koncentracijo Epo v serumu. Kri za laboratorijske preiskave smo odvzeli dopoldne (7.30-12.00). S tem smo se izognili fiziološkim spremembam koncentracije Epo med dnevom (cirkadi-ani ritem) (10). Bolnike smo kasneje zdravili z melfalanom in prednisonom (11).
Koncentracijo Epo v serumu (E/L) smo izmerili z radioimunskim testom (EPO-Trac 1251 RIA kit, Incstar, USA). Koncentracijo hemoglobina (Hb) (g/L), število levkocitov, nevtrofilcev ter trombocitov (109/L) v krvi smo določili s pomočjo elektronskega števca Coulter STKS. Koncentracijo sečnine (urea) (mmol/L), kreatinina (pmol/L) in celotnega kalcija v serumu smo izmerili na šestnajst kanalnem analizatorju SMAC.
S pomočjo količnika med logaritmoma opazovane in pričakovane koncentracije Epo (O/P Epo) lahko ocenimo, ali je izločanje Epo ustrezno stopnji anemije. S pričakovano koncentracijo razumemo koncentracijo Epo, ki bi jo ugotovili pri kontrolnih osebah z isto stopnjo anemije. Pri slednjih je anemija take vrste, da ni prizadeto izločanje Epo, kot npr. anemija zaradi pomanjkanja železa ali hemolitična anemija. Pričakovano koncentracijo smo izračunali iz regresijske enačbe, ki jo navaja Beguin s sod. in velja za vrednosti hematokrita pod 0,38 oziroma Hb pod 130 g/L (12). Prvotno enačbo smo priredili tako, da smo lahko namesto hematokrita za oceno stopnje anemije uporabili koncentracijo Hb.
log Epo = 4,746 - (0,0273xHb)
Podatke smo vrednotili s statističnim programskim paketom BMDP (13). Medsebojno povezanost spremenljivk smo ugotavljali s testom hi2 in Spearmanovim koeficientom korelacije 0/). Statistično
značilnost testov smo ocenjevali pri p <0,05. Odnos med koncentracijo Epo in preživetjem smo ocenili s primerjavo krivulj preživetja (14) s pomočjo logrank testa (15).
Rezultati
Pri obravnavanih bolnikih je bila mediana koncentracije Epo v serumu 32,6 E/L, koncentracije Hb 96 g/L in koncentracije kreatinina 117 pmol/L. Med koncentracijo Hb in kreatinina smo ugotovili negativno korelacijo (r. = -0,37). Opazovano koncentracijo Epo v serumu smo primerjali s pričakovano koncentracijo na grafični način (sl. 1) in s pomočjo količnika O/P Epo.
Pri zmanjšanem izločanju eritropoetina je O/P Epo <0,8 (12). Zmanjšano izločanje Epo smo ugotovili pri 83% bolnikov z ledvično odpovedjo (kreatinin >177 mmmol/L), pri bolnikih brez odpovedi ledvic pa v 39% (sl. 2).
V tabeli 1 prikazujemo koncentracije Hb, kreatinina in Epo pri bolnikih z normalnim in Zmanjšanim O/P Epo. Koncentraciji Hb in eritropoetina sta manjši, koncentracija kreatinina pa je večja pri bolnikih z neustreznim izločanjem eritropoetina. Opisane razlike so statistično pomembne (Mann-Whitney-ev test, p < 0,01).
Tab. 1. Mediana koncentracij Hb, eritropoetina in kreatinina v serumu pri bolnikih z anemijo (Hb<130 g/L) glede na ustreznost izločanja eritropoetina (O/P Epo).
Tab. 1. The mediane of serum haemoglobin, erythropoietin and creatinine in anaemic patients (Hb<130 g/L) with inappropriate (O/P Epo <0.8) and appropriate erythropoietin secretion.
O/P Epo	Št. bolnikov	Hemoglobin	Eritropoetin	Kreatinin
	No. patients	Haemoglobin	Erythropoietin	Creatinine
<0,8	41	92 g/L	26 E/L	164 pmol/L
>0,8	39	105 g/L	73 E/L	94 pmol/L
Analizirali smo tudi koncentracijo Hb in Epo glede na stopnjo razširjenosti DP. Pri bolnikih v III. stopnji DP je bila koncentracija Hb manjša in koncentracija Epo večja kot pri bolnikih z II. stopnjo. Izločanje eritropoetina pri III. stopnji je bilo kljub večji koncentraciji manj ustrezno (mediana O/P Epo = 0,74) kot v II. stopnji (mediana O/P Epo = 0,81).
Korelacijo med Hb in Epo smo ocenili ločeno v skupini bolnikov brez ledvične odpovedi in skupini bolnikov z njo. Pri bolnikih
SI. i.Krivuljipreživetjabolnikovzdiseminiranimplazmocitomom. Vpliv izsledka O/P Epo na preživetje.
Fig. 3- Life-table analysis of myeloma patients grouped according to O/P Epo results.
brez ledvične odpovedi (kreatinin <110 pmol/L) smo ugotovili negativno korelacijo med Hb in log Epo (r = -0,68 p < 0,001). Pri bolnikih z ledvično odpovedjo ni bilo tovrstne povezave. Povezave med koncentracijo eritropoetina v serumu in preživetjem nismo ugotovili. Ko smo primerjali vpliv količnika O/P Epo na preživetje, smo ugotovili, da so bolniki s količnikom O/P Epo manjšim od 0,65, živeli krajše (sl. 3).
Razpravljanje
Čeprav neposredne povezave med koncentracijo eritropoetina v serumu in preživetjem bolnikov ni bilo, smo ugotovili krajše preživetje pri bolnikih z neustreznim izločanjem eritropoetina (O/ P Epo < 0,65). Menimo, da je krajše preživetje posledica večjega deleža bolnikov z ledvično odpovedjo (86%) v tej skupini, v primerjavi s skupino bolnikov (34%), kjer je bil količnik O/P Epo večji od 0,65. Ledvična odpoved je namreč neodvisni prognostični dejavnik in je znanilec krajšega preživetja bolnikov z DP.
Za oceno anemije koncentracija eritropoetina v serumu nima večjega pomena, če je ne ocenjujemo v povezavi s stopnjo anemije. Pri opredelitvi anemije lahko ocenjujemo ustreznost izločanja eritropoetina grafično (sl. 1) ali s pomočjo količnika med opazovanim in pričakovanim logaritmom koncentracije Epo (O/P Epo). Pri nastanku anemije zaradi kronične ledvične odpovedi ima osrednjo vlogo neustrezno izločanje eritropoetina (2). S tem tudi pojasnjujemo anemijo pri večini naših bolnikov z ledvično odpovedjo in tudi negativno povezavo med koncentracijo Hb ter koncentracijo kreatinina.
Mnenja o pomenu neustreznega izločanja Epo za nastanek anemije pri bolnikih z DP brez ledvične odpovedi so deljena. Nekateri navajajo, da je pri tovrstnih bolnikih izločanje eritropoetina ustrezno stopnji anemije (16-18). V naši raziskavi smo podobno kot Beguin s sod. ugotovili znaten delež bolnikov brez ledvične odpovedi z neustreznim izločanjem eritropoetina (12). Pri teh gre verjetno za vrsto anemije, ki jo ugotovimo pri bolnikih z rakom in pri nekaterih kroničnih vnetjih (5, 19). Neustrezno izločanje eritropoetina je tu verjetno posledica zaviralnega učinka nekaterih citokinov na izločanje eritropoetina (5).
Pri bolnikih brez ledvične odpovedi smo podobno kot drugi avtorji ugotovili korelacijo med logaritmom koncentracije Epo in koncentracijo Hb (12,16). Te povezave pri bolnikih z ledvično odpovedjo ni bilo, kar si razlagamo s prizadetostjo peritubolamih celic pri odpovedi ledvic. Na osnovi naših opazovanj in podatkov iz literature lahko zaključimo, da je pri bolnikih z DP glavni vzrok za nastanek
anemije zmanjšanje eritropoeze (12). Ta je lahko posledica infiltracije kostnega mozga z plazmocitomskimi celicami ali neustreznega izločanja eritropoetina. Eritropoeza je pri infiltraciji kostnega mozga z plazmocitomskimi celicami verjetno okrnjena zaradi zmanjšanja števila krvotvornih celic in njene zavore s celicami NK (naravne ubijalke) ter nekaterimi citokini, npr. interferonom gama (20, 21). Neustrezno izločanje eritropoetina pa je lahko posledica ledvične odpovedi in zavore izločanja eritropoetina na način, značilen za anemijo pri kroničnem vnetju. Zdravljenje anemije z rekombi-nantnim eritropoetinom je pri večini bolnikov z DP uspešno (21, 22). Ugotovili so, da s pomočjo O/P Epo lahko napovemo, ali bo zdravljenje z rekombinantnim Epo uspešno (23). Pri vrednosti O/ P Epo <0,6 je verjetnost uspešnega zdravljenja 89%. Pri bolnikih z O/P Epo >1,2 pa bo zdravljenje z Epo v 80% neuspešno (23).
Zaključki
Na osnovi naših izsledkov ocenjujemo: 1. Koncentracija Epo je neustrezna glede na stopnjo anemije ne le pri bolnikih z ledvično odpovedjo, temveč tudi pri številnih bolnikih brez ledvične odpovedi. 2. Količnik O/P Epo je koristen za patofiziološko oceno anemije. 3- Količnik O/P Epo ima tudi prognostični pomen.
Literatura
1.	Fisher JW, Nakashima J. The role of hypoxia in renal production of erythropoietin. Cancer 1992; 70: 928-39-
2.	Erslev AJ. Erythropoietin. Leukemia Research 1990; 14: 683-8.
3.	Oster W, Herrmann F, Gamm H et al. Erythropoietin for treatment of anemia of malignancy associated with bone marrow infiltration. J Clin Oncol 1990; 8: 956-62.
4.	Radtke HW, Claussner A, Erbes PM et al. Serum erythropoietin concentration in chronic renal failure: relationship to degree of anemia and excretory renal function. Blood 1979, 54: 877-84.
5.	Means RT, Kranz SB. Progress in understanding the pathogenesis of the anemia of chronic disease. Blood 1992; 80: 1639-^7.
6.	Gassmann W, Pralle H, Haferlach T et al. Staging systems for multiple myeloma: a comparison. Br J Haematol 1985; 59: 703-11-
7.	Durie BMG. Staging and kinetics of multiple myeloma. Semin Oncol 1986; 13: 300-9-
8.	Kyle RA, Maldonado JE, Bayrd ED. Plasma cell leukemia. Report on 17 cases. Arch Intern Med 1974; 133: 813-8.
9.	Durie BGM, Salmon SE. A clinical staging system for multiple myeloma. Correlation of measured myeloma cell mass with presenting clinical features, response to treatment and survival. Cancer 1975; 36: 842-54.
10.	Wide L, Bengtsson C, Birgegard G. Circadian rhythm of erythropoietin in human serum. Br J Haematol 1989; 72: 85-90.
11.	Alexanian R, Haut A, Khan AU et al. Treatment of multiple myeloma. JAMA 1969; 208: 1680-5-
12.	Beguin Y, Yema M, Loo M, Weber M, Fillet G. Erythropoiesis in multiple myeloma: defective red cell production due to inappropriate erithropoietin production. Br J Haematol 1992; 82: 648-53-
13.	Dixon WJ, Brown MB, Jennrich RI ed. BMDP Statistical Software Manual. Berkley: University of California Press, 1990.
14.	Kaplan EL, Meier P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc 1958; 53: 457-81.
15- Benedetti J, Yuen K, Young L. Life tables and survivor functions. In: Dixon WJ, Brown MB, Jennrich RI ed. BMDP Statistical Software Manual. Vol 2. Berkley: University of California Press, 1990: 739-68.
16.	Nielsen OJ, Brandt M, Drivsholm A. The secretory erythropoietin response in patients with multiple myeloma and Waldenstrom’s macroglobulinemia. Scand J Clin Lab Invest 1990; 50: 697-703-
17.	Majumdar G, Westwood NB, Bell-Witter C, Muggleston D, Phillips J, Pearson TC. Serum erythropoietin and circulating BFU-E in patients with multiple myeloma and anaemia but without renal failure. Leuk Lymphoma 1993; 9; 173-6.
18.	Ariad S, Clifford D, Penfold G, MacPhail AP, Bezwoda WR. Erythropoietin response in anaemic patients with multiple myeloma and other lymphoid malignancies infiltrating the bone marrow. Eur J Haematol 1992; 49: 59-62.
19- Miller CB, Jones RJ, Piantadosi S, Abeloff MD, Spivak JL. Decreased erythropoietin response in patients with the anemia of cancer. N Engl J Med 1990; 322: 1689-92.
20.	Uchida A, Yagita M, Sugiyama H, Hoshino T, Moore M. Strong natural killer (NK) cell activity in bone marrow of myeloma patients: accelerated maturation of bone marrow NK cells and interaction with other bone marrow cells. Int J Cancer 1984; 34: 375-81.
21.	Ludwig H, Fritz E, Leitgeb C et al. Erythropoietin tratment of chronic anemia of selected hematological malignancies and solid tumors. Ann Oncol 1993: 4: 161-7.
22.	Ludwig H, Fritz E, Kotzmann H, Hooker P, Gisslinger H, Bamas U. Erythropoietin 23. Osterborg A, Boogaerts MA, Cimnio R et ai. Recombinant human erythropoietin tratment of anemia associated with multiple myeloma. N Engl J Med 1990; 322:	in transfusion-dependent anemic patients with multiple myeloma and non
1693-9-	Hodgkin’s lymphoma - a randomized study. Blood 1996; 87; 2675-82.
V suplementu I so sodelovali:
doc. dr. Dušan Andoljšek, dr. med., specialist internist, Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
prim. Jožica Anžič, dr. med., specialistka pediatrinja, Pediatrična klinika, KC Ljubljana
asist. Igor Aurer, dr. med., specialist internist, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
doc. dr. Drago Batinič, dr. med., specialist imunolog, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
prim. Majda Benedik-Dolničar, dr. med., specialistka pediatrinja, Pediatrična klinika, KC Ljubljana
Mojca Bervar, dr. med., specialistka internistka, Oddelek za bolezni srca, pljuč in ožilja, SB Celje
prim. mag. Vinko Bogdanič, dr. med., specialist internist, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
mag. Zora Čede, dipl. biol., Laboratorij za klinično biokemijo, SB Trbovlje
prof. dr. Peter Černelč, dr. med., specialist internist, Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
Branka Golubič-Čepulič, dr. med., specialistka transfuziologinja, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
mag. Jana Kralj, mr. ph., specialistka medicinske biokemije, Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
prof. dr. Boris Labar, dr. med., specialist internist, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
doc. dr. Uroš Mlakar, dr. med., specialist internist, Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
mag. Mojca Modic, dr. med., specialistka internistka, Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
mag. Mirando Mrsič, dr. med., specialist internist, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
prof. dr. Damir Nemet, dr. med., specialist internist, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
Tadej Pajič, dipl. ing. kem., Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
Bojana Pajk, dr. med, specialistka internistka, Onkološki inštitut Ljubljana
doc. dr. Mladen Petrovečki, dr. med., specialist imunolog, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
mag. Irena Preložnik-Zupan, dr. med., specialistka internistka, Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
prim. Jože Pretnar, dr. med., specialist internist, Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
Ivo Radman, dr. med., specialist internist, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
prof. dr. Ciril Rozman, dr. med., specialist internist, Postgraduate School of Hematology »Farreras Valenti-, University of Barcelona, Španija
Dubravka Sertič, dr. med., specialistka internistka, Klinika za interne bolesti, KBC Zagreb
prof. dr. Donnall E. Thomas, dr. med., specialist internist, Fred Hutchinson Cancer Research Center Seattle, University of Washington, ZDA
Mojca Tomažič, dr. med., specializantka radiologije, Radiološki oddelek, SB Novo mesto
Samo Zver, dr. med., specializant interne medicine, Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
mag. Branko Zakotnik, dr. med., specialist internist, Onkološki inštitut Ljubljana
Darja Žontar, dipl. biol., Klinični oddelek za hematologijo, KC Ljubljana
Strokovni prispevek/Professional article
NAŠE IZKUŠNJE PRI ZDRAVLJENJU AKUTNE NELIMFOBLASTNE LEVKEMIJE ODRASLIH S PROTOKOLOM AML 10
O UR RESULTS IN ADULT PATIENTS WITH ACUTE MYELOID LEUKEMIA TREATED ACCORDING
TO AML 10 PROTOCOL
Mojca Modic
Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1996-09-23, sprejeto 1998-03-05; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl 1:1-35-8
Ključne besede: akutna nelimfoblastna levkemija; zdravljenje
Izvleček—Izhodišča. Za uspešno zdravljenje akutne nelimfoblastne levkemije (ANLL) pri odraslih je potrebna intenzivna kombinacija več citostatikov. Z njimi dosežemo danes popolno remisijo bolezni v 80% bolnikov mlajših od 50 let in 3 do 5 letno preživetje v 20 do 50%. Hoteli smo oceniti zdravljenje ANLL pri odraslih po AML 10 protokolu, ki ga od leta 1994 uporabljamo na Kliničnem oddelku za hematologijo v Ljubljani.
Material in metode. Od januarja 1994 do junija 1996smo zdravili 20 odraslih bolnikov z ANLL po protokolu AML 10, povprečna starost bolnikov je bila 45 let, razpon27-55 let. Za indukcijo remisije smo uporabili citostatike citozin arabinozid, daunorubicin in tioguanin, za konsolidacijo remisije pa amsakrin, etopozid, mito-ksantron in citozin arabinozid. Pri 20 bolnikih smo hlastnim celicam v kostnem mozgu določali celična imunološka znamenja. Pri 18 bolnikih smo določili kariogram iz kostnega mozga.
Rezultati in zaključki. Pri 13 bolnikih (65%) smo dosegli remisijo bolezni, kije v povprečju trajala 11 mesecev (razpon 2 do 28 mesecev). Pri eni bolnici smo naredili alogeničnopresaditev kostnega mozga 7 mesecev od diagnoze bolezni v prvi remisiji. Štirje bolniki (20%) so umrli v prvih 6 tednih od začetka citostatskega zdravljenja. Najpogostejši vzroki smrti so bile okužbe in krvavitve.Protokol AML 10 zajema 4 intenzivne cikluse citostatikov, pri katerih vedno dosežemo aplazijo kostnega mozga. Vendar se zaradi intenzivnega konsolidacijskega zdravljenja izognemo dolgotrajnemu vzdrževalnemu citostatskemu zdravljenju. Menim, da se s tem kvaliteta življenja bolnikov izboljša, ne glede na to, da bolniki prve mesece preživijo daljčasa v bolnišnici.
Uvod
Akutna levkemija je neoplazma krvotvornega sistema, ko se prič-no razraščati levkemične celice v kostnem mozgu, od koder prehajajo v periferno kri, vranico, bezgavke in tudi v druga tkiva (koža, dlesni, centralno živčevje, prebavila, testise). Levkemične celice se kopičijo v kostnem mozgu in izpodrivajo druge normalne krvotvorne celice. Posledica tega so anemija, trombocitopenija in nevtropenija. Glede na morfološke značilnosti poznamo akutno nelimfoblastno levkemijo (ANLL) in akutno limfoblastno levkemijo (ALL) (1). Bolezni se razlikujeta glede na prognozo in
Key words: acute myeloid leukemia; treatment
Abstract—Background. Succesful treatment of acute myeloblastic leukemia (AML) in adults requires intensive combination chemotherapy for induction of complete remission. The results of several collaborative trialsfor the treatment of AML indicate that complete remission can now be achived in over 80% of patients under the age of50. 20-50% of patients were still alive at 3-5 years. The AML 10 regiment was studied in our institute between 1994 and 1996.
Methods. Between january 1994 and June 199620 adult patients with newly diagnosed acute myeloid leukemia were eligible for induction chemotherapy (AML 10 regiment). Mean age was 45 year, range 27-55years. Induction chemotherapy uniformly consisted of citosin arabinoside, daunorubicin and thioguanin. Remission consolidation therapy consisted of amsacrine, etoposide, mitozantrone, cytosin arabinoside. The expression of myeloid surface markers at first diagnosis were studied. Cytogenetics investigation were performed on bone marrow in 18 ofpatients.
Results and conclusion. 65% (13) of patients achived complete remission. The remission duration was 11 months (range 2-28). One patient underwent allogenic bone marrow transplantation (BMT). BMT was performed at a median of 7 months from diagnosis in first remission. 4 patients (20%) died within 6 weeks after start of chemotherapy. Predominantly couses of mortality proved to be infection and haemorhage. Studies of the value of remission maintance chemotherapy in prolonging survival have given conflicting results with some studies showing benefit and others showing no benefit. The qualiti of life for patients receiving no further chemotherapy may be superior.
način zdravljenja. Za opredelitev tipa ANLL so potrebne določene morfološke, imunološke in citokemične značilnosti (2), prav tako pa tudi prisotnost specifičnih genetskih translokacij.
Skupina francoskih, ameriških in britanskih hematologov (3) je razdelila ANLL glede na morfološke značilnosti celic v 8 podtipov, Mo-M7. Razlikujejo se tudi po kliničnih slikah. Akutna promielo-citna levkemija (M3) je pogosto povezana z motnjami v hemosta-zi, diseminirano intravensko koagulacijo, kot posledica sproščanja tkivnega tromboplastina iz levkeminčnih celic. Pri akutni mi-elomonocitni levkemiji (M4) in akutni monoblastni levkemiji (M5) dobimo ekstramedularno infiltracijo z levkemičnimi celicami (ko-
Tab. 1. ProtokolAML 10 za odrasle: Indukcija remisije.
Tab. 1. AML 10 protocol for adults: remission induction therapy.
Ciklus 1	DAT 3+10 PROTOKOL
Course 1	DAT 3+10 REGIMENT
Daunorubicin 50 mg/m2 i. v. 1., 3. in 5. dan (day)
Daunorubicin
Citozinarabinozid 100mg/m2/12 ur (hours)i.v. 1. do 10. dan (day) Cytarabine
Tioguanin 100 mg/m2/12 ur (hours) per os 1. do 10. dan (day) Thioguanine
Ciklus 2	DAT 3+8 PROTOKOL
Course 2	DAT 3+8 REGIMENT
Daunorubicin 50 mg/m2 i.v. 1., 3. in 5. dan (day)
Daunorubicin
Citozinarabinozid 100mg/m2/12 ur (hours) i.v. 1. do 8. dan (day) Cytarabine
Tioguanin 100 mg/m2/12 ur (hours) per os 1. do 8. dan (day) Thioguanine
ža, gingive, centralno živčevje). Nekateri bolniki imajo bifenotip-sko levkemijo, pri kateri ima levkemična celica istočasno mieloič-ne in iimfoidne markerje (4).
Od prognostičnih faktorjev za izid bolezni je eden najpomembnejših starost (5). Starejši od 60 let imajo slabšo prognozo (6). Pri njih ne dosežemo tako pogoste remisije, bolniki težje prenašajo hudo aplazijo kostnega mozga in tudi komplikacije v tem obdobju so pogostejše. Kromosomske anomalije ob ugotovitvi so drugi pomembni neodvisni prognostični faktor. Bolniki, pri katerih najdemo t (8;21), t(15;17) in inv (16) imajo boljšo prognozo od bolnikov s t(9;22). Translokacijo t(4;21) najdemo pri bifenotipski levkemiji s splenomegalijo in slabo prognozo. Translokacija t(8;21) je pri mlajših bolnikih z akutno mieloblastno levkemijo z dozorevanjem (M2), splenomegalijo in kloromom (6). Pri M4 z eozinofilijo najdemo inv(l6) in pogosto prizadetost centralnega živčevja, medtem ko pri običajni M4 dobimo translokacijo t(9;ll). Morfološki tip bolezni po FAB klasifikaciji prav tako vpliva na prognozo bolezni. Bolniki z M3, pri katerih dosežejo remisijo, imajo večje možnosti za dolgoletno preživetje kot drugi. Slabšo prognozo imajo bolniki z eritrolevkemijo (M6) in M4 od bolnikov z Ml (5). Prognostični kazalci so tudi trajanje znakov bolezni pred ugotovitvijo, število levkocitov in odstotek hlastnih celic v periferni krvi ob ugotovitvi bolezni.
Zdravljenje ANLL razdelimo v dve obdobji: indukcija remisije in konsolidacija remisije. O remisiji govorimo takrat, ko je manj kot 5% hlastnih celic v kostnem mozgu, odsotnost hlastnih celic v periferni krvi z normalno krvno sliko in odsotnost kliničnih znakov bolezni. Remisijo bolezni dosežemo samo prek hude aplazije kostnega mozga. Bolniki, pri katerih smo dosegli remisijo, imajo še vedno rezidualne levkemične celice, zato je potrebno zdravljenje nadaljevati. Za uspešno zdravljenje ANLL pri odraslih je potrebna intenzivna kombinacija več citostatikov. Z njimi dosežemo danes popolno remisijo bolezni pri 80% bolnikov, mlajših od 50 let (7). Odstotek popolnih remisij pri bolnikih, starejših od 55 let, se hitro zmanjšuje. V skupini bolnikov s povprečno starostjo 82 let so dosegli remisijo le v 31%, povprečno preživetje je bilo 3 do 4 tedne (8). Zato pri bolnikih, starejših od 80 let, odsvetujejo intenzivno citostatsko zdravljenje.
Že pred več kot 20 leti so za indukcijo remisije ANLL pričeli uporabljati kombinacijo citostatikov citozinarabinozida in antraci-klinskih antibiotikov, kar se je ohranilo še danes. Nastale so majhne modifikacije v shemah z zamenjavo doksorubicina z daunoru-bicinom in idambicinom. Dodajanje tioguanina oziroma etopozi-da ni bistveno vplivalo na odstotek remisij, prav tako tudi čas, kdaj se odločamo za dajanje antraciklinskega citostatika v shemi (9). Mediano trajanje remisije je pri večini bolnikov od 9 mesecev do 2 leti (6).
Presaditev kostnega mozga HLA identičnega dajalca ali identičnega dvojčka je učinkovito zdravljenje akutne levkemije. Za presaditev se odločimo, ko z intenzivnim citostatičnim zdravljenjem dosežemo remisijo krvne bolezni. Večina centrov za presaditev kost-
Tab. 2. ProtokolAML 10za odrasle: konsolidacija remisije. Tab.2. AML 10protocolfor adults: remission consolidation therapy. Ciklus 3	MACE
Course 3 Amsakrin 100 mg/m2 i.v. 1 do 5 dan (day)
Amsacrine
Citozinarabinozid 200 mg/m2 v kontinuirani infuziji 1. do 5. dan (day) Cytarabine
Etopozid 100 mg/m2 i.v. 1. do 5. dan (day)
Etoposide
Ciklus 4	MidAc
Course 4 Mitoksantron 10 mg/m2 i.v. 1. do 5. dan (day)
Mitoxantrone
Citozinarabinozid l,0g/m2/12 ur v 2-umi infuziji 1. do 3. dan (day) Cytarabine
nega mozga je povečala starostno mejo bolnikov do 55 let. Pri starejših bolnikih se pogosteje pojavljajo komplikacije kot so okužbe in reakcija presadka proti gostitelju (GVHD). GVHD je komplikacija alogenične presaditve kostnega mozga. Pri mladih bolnikih z ANLL je alogenična presaditev kostnega mozga zdravljenje izbora že v prvi remisiji bolezni. 3 do 5 letno preživetje dosežemo pri teh bolnikih v 30 do 70%, medtem ko z intenzivnim citostatskim zdravljenjem samo v 20 do 50% (6). Ena največjih omejitev za alogenič-no presaditev kostnega mozga je, da ima samo 1/3 bolnikov ustreznega dajalca. V poštev pride tudi avtologna presaditev kostnega mozga, v večjih centrih pa se odločajo za presaditev kostnega mozga nesorodnega dajalca.
Bolniki in zdravljenje
Od januarja 1994 do junija 1996 smo na Kliničnem oddelku za hematologijo v Ljubljani zdravili 20 bolnikov z novo odkrito ANLL po protokolu AML 10 za bolnike mlajše od 55 let. V skupini je bilo 5 žensk in 15 moških. Povprečna starost bolnikov je bila 45 let, razpon starosti od 27 do 55 let.
Diagnozo ANLL smo opredelili na osnovi pregleda krvnega razmaza in punktata kostnega mozga, barvanega po metodi May-Grunwald-Giemsa. Upoštevali smo tudi izsledke citokemičnih reakcij s PAS (Pefiodic Acid Shiff) in peroksidazo ter alfa naftil butirat esterazo. Po priporočilu skupine francoskih, ameriških in britanskih hematologov (FAB) smo razlikovali naslednje podvrste ANLL: 4 bolniki so imeli AML-M1, 7 bolnikov AML-M2, 7 bolnikov AML-M4, 1 bolnik AL bifenotipsko, 1 bolnik AL nediferencirano. Pri 20 bolnikih smo hlastnim celicam v kostnem mozgu določili celična imunološka znamenja: CD 13, CD 14, CD 15, CD 33, CD 34. Pri 18 bolnikih smo določili kariogram kostnega mozga v citogenetskem laboratoriju Inštituta za varovanje zdravja.
Pri zdravljenju po shemi AML 10 (7, 10) smo za indukcijo remisije uporabili daunorubicin v dozi 50 mg/m2 i.v. 1., 3. in 5. dan, citozinarabinozid 100 mg/m2/12 ur i.v. 1. do 10. dan, tioguanin 100 mg/ m2/12 ur per os 1. do 10. dan, shema DAT 3 + 10 (tab. 1). Nadaljevali smo zdravljenje po shemi DAT 3 + 8. Sledilo je obdobje konsolidacije remisije, v katerem so bolniki prejeli 2 kroga citostatikov (tab. 2): 1. MACE (amsakrin 100 mg/m2 v 2-umi infuziji 1. do
5.	dan, citozinarabinozid 200 mg/m2 dnevno kontinuirana infuzija 1. do 5. dan, Etopozid 100 mg/m2 v 2-urni infuziji 1. do 5. dan); 2. MidAc (mitoksantron 10 mg/m21. do 5. dan i.v., citozinarabinozid
1,0	g/m2/12 ur v 2-umi infuziji 1. do 3. dan).
Celotno zdravljenje ANLL po protokolu AML 10 traja približno 6 mesecev z obdobji aplazije kostnega mozga, ki jih opažamo po vseh štirih krogih citostatikov. Zdravljenje je z manjšimi presledki bolnišnično. V tem obdobju so bolniki prejemali transfuzije koncentriranih eritrocitov in trombocitov. Okužbe smo zdravili z antibiotiki in antimikotiki. Za preprečevanje gljivičnih okužb smo uporabljali ketokonazol ali flukonazol peroralno, za selektivno dekontaminacijo črevesja pa ciprofloksacin peroralno.
Popolno remisijo smo opredelili kot odsotnost kliničnih znakov bolezni pri normalni krvni sliki in normocelulami kostni mozeg z
Tab. 3. Vzroki smrti v prvih šestih tednih od pričetka kemoterapije.
Tab. 3. Deaths within 6 weeks after start of chemotherapy.
Bolnik Patient	Starost (leta) Age (years)	FAB FAB	Dan smrti po začetku zdravljenja Time of death	Vzrok smrti Reason of death
LM	50	MA	smrt 3. dan dead by day 3	Akutna respiratorna odpoved Acute respiratory failure Sepsa Sepsis
GM	35	M2	smrt 25. dan dead by day 25	Akutna respiratorna odpoved Acute respiratory failure Pljučnica z neznanim povzročiteljem Pneumonia with unknown pathogen Diseminirana intravask. koagulacija Disseminated intravascular coagulation
KI	55	M4	smrt 9. dan dead by day 9	Akutna respiratorna odpoved Acute respiratory failure Akutna ledvična odpoved Acute renal failure Možganska krvavitev Intracranial haemorrhage Sepsa Sepsis
SI	51	Ml	smrt 35. dan dead by day 35	Akutna respiratorna odpoved Acute respiratory failure Pljučnica z neznanim povzročiteljem Pneumonia with unknown pathogen Sepsa Sepsis
		Tab. 4. Vzroki smrti v prvi remisiji. Tab. 4. Deathsinfirstcompleteremission.	
Bolnik	Starost (leta)	FAB Trajanje remisije (meseci)	Vzroki smrti
Patient	Age (years)	FAB Duration of remission (months)	Reason of death
BJ	44	Ml 3,5	Pljučnica z neznanim povzročiteljem Pneumonia with unknown pathogen
BS	28	AL - ne- 4,5 diferenc. AL - undiff.	Akutna respiratorna odpoved Acute respiratory failure Diseminirana intravask. koagulacija Disseminated intravascular coagulation Sepsa Sepsis
manj kot 5% hlastnih celic. O delni ali nepopolni remisiji pa govorimo, če je 5 do 15% hlastnih celic v kostnem mozgu.
Rezultati
Remisijo ANLL smo dosegli pri 13 bolnikih (65%). Povprečno trajanje remisije je trajalo 11 mesecev (razpon od 2 do 28 mesecev). Dva bolnika smo kasneje morali izključiti iz protokola. Enega zaradi popuščanja srca z znaki oslabelosti srčne mišice na ehokardiogramu, drugega pa zaradi tumorja v pljučih.
Do relapsa bolezni (več kot 5% hlastnih celic v kostnem mozgu) je prišlo v prvi remisiji pri 4 bolnikih (20%). Pri eni bolnici z bifeno-tipsko AL je prišlo do relapsa po 7 mesecih od ugotovitve remisije, pri enem bolniku z AML-M2 po 6 mesecih od ugotovitve remisije, pri drugem bolniku z AML-M2 po 1 mesecu in pol od ugotovitve remisije, pri bolnici z AML-M4 po 7 mesecih od ugotovitve remisije.
Trije bolniki (15%) so bili rezistentni na citostatsko zdravljenje (nismo dosegli remisije po dveh indukcijskih krogih citostatikov). V prvih šestih tednih citostatskega zdravljenja so umrli štirje bolniki (20%). Vzroki njihove smrti so navedeni v tabeli 3. Nato sta v obdobju prve remisije umrla še dva bolnika (10%). Vzroki njihovih smrti so navedeni v tabeli 4.
Tab. 5. Celični imunološki označevalci ob ugotovitvi bolezni.
Tab. 5. Expression of myeloid surface markers at diagnosis.
Označevalec Marker	Št. primerov No. of cases	Odstotek pozitivnih celic Mean of percentage of leukaemic cells stained	Razpon (%) Range (%)
CD 13	19	40	20-76
CD 14	18	28	21-37
CD 15	15	49	19-78
CD 33	16	61	22-99
CD 34	18	56	19-78
	Tab. 6. Kariogrami kostnega mozga pri bolnikih z ANLL. Tab. 6. Cytogenetics characteristics of patients with ANLL.		
Št.	Bolnik	FAB	Kariogrami kostnega mozga
No.	Patient	FAB	Cytogenetics
1	RS	AML-M2	46, XY
2	BJ	AML-M1	ni mitoz no mitosis
3	ŠA	AML-M4	46, XY
4	OL	AML-M2	ni mitoz no mitosis
5	KJ	AML-M2	45, X, -Y, t(8:21) (q 22: q 22)
6	ZM	AML-M1	46, XY
7	KJ	AML-M4	ni mitoz no mitosis
8	AŠ	AML-M4	48, XX, t(21) t(22)
9	SH	AML-M2	46, XX, del (3) (q 13 - q ter) t(5: 19) (q 14: p 13)
10	BS	AL-undiff.	ni mitoz no mitosis
11	LM	AML-M4	46, XY
12	PS	AL-bifenotipska	46, XX
13	GM	AML-M2	ni mitoz no mitosis
14	KI	AML-M4	46, XY, del (7) (q 21-q ter)
15	SI	AML-M1	ni motoz no mitosis
16	DD	AML-M4	47, XY, +22
17	ČI	AML-M2	46, XY, t(8:21) (q 22:q22)
18	TM	AML-M1	ni mitoz no mitosis
Opredelili smo tudi mieloične imunološke označevalce na blast-nih celicah kostnega mozga (CD13, CD14, CD15, CD33, CD34). Izsledki so navedeni v tabeli 5.
Pri 18 bolnikih smo odvzeli kostni mozeg za določitev kariogra-ma. Preiskava je bila uspešna pri 11 bolnikih (61%), pri 7 bolnikih (39%) kariograma nismo mogli narediti, ker je bilo premalo mitoz. Pri 5 bolnikih (45%) je bil kariogram normalen, pri 6 bolnikih smo ugotovili kromosomske anomalije (55%). Izsledki so navedeni v tabeli 6.
Pri eni bolnici stari 27 let z AML-M1 smo naredili alogenično presaditev kostnega mozga 7 mesecev po ugotovitvi prve remisije bolezni. 7 mesecev po presaditvi kostnega mozga je prišlo do relapsa bolezni.
Razpravljanje
Pred več kot 20 leti so ugotovili, da pri zdravljenju s citozinarabi-nozidom in antraciklinskimi antibiotiki dosežemo remisijo ANLL v 50 do 60% odraslih bolnikov z novo odkrito boleznijo (11). Z izboljšanjem pogojev zdravljenja v obdobju aplazije kostnega mozga (transfuzije trombocitne plazme, širokospektralni bakte-ricidni antibiotiki, amfotericin) se je danes odstotek doseženih remisij z istimi citostatiki povečal na 75 do 80%, nekateri centri navajajo pri bolnikih, mlajših od 55 let, 84% oziroma pri mlajših od 40 let 90% (1) remisij. V naši raziskavi smo dosegli remisijo ANLL pri 65% bolnikov, mlajših od 55 let. Ugotovili pa smo večji odstotek smrtnosti (20%) v prvih 6 tednih zdravljenja, kot ga navajajo v literaturi, 10% (12). Vzrok so verjetno slabši pogoji zdravljenja, saj ne moremo zdraviti vseh bolnikov v enopostelj-
nih sobah in je zato večja možnost prenosa okužbe iz bolnika na bolnika. Da se temu čim bolj izognemo delamo sedaj vsem bolnikom pred pričetkom zdravljenja in v obdobju aplazije kostnega mozga enkrat tedensko nadzorne kužnine: bris kože, nosu, žrela, črevesa, koprokultura. S tem dobimo pregled vsaj nad bolniki, ki so nosilci nevarnih virulentnih patogenih klic, prev-sem na meticilin rezistentnega stafilokoka. Povečana pogostnost gram pozitivne septikemije je verjetno posledica uporabe centralnih venskih katetrov.
Pomemben prognostični pomen imajo pri bolnikih z ANLL kari-ogrami kostnega mozga. V preiskovani skupini bolnikov smo dobili kromosomske anomalije v 55% uspešno opravljenih kari-ogramov. Pri 39% bolnikov zaradi premajhnega števila mitoz kariograma nismo mogli narediti. Kromosomske anomalije, ki smo jih dobili pri različnih tipih ANLL se skladajo s tistimi, ki jih navajajo v literaturi. Pomen mieloičnih celičnih imunoloških znamenj na prognozo bolnikov z ANLL danes ni velik. Pomagajo nam pa pri lažjemu razlikovanju mieloblastov od monoblastov skupaj z morfologijo celic in citokemičnimi reakcijami.
Protokol AML 10 zajema 4 intenzivne cikluse citostatikov, pri katerih vedno dosežemo aplazijo kostnega mozga. Vendar se zaradi intenzivnega konsolidacijskega zdravljenja izognemo dolgotrajnemu vzdrževalnemu citostatskemu zdravljenju. Menimo, da se s tem kakovost življenja bolnikov izboljša, ne glede na to, da bolniki prve mesece preživijo daljčasa v bolnišnici. Zaradi majhnega števila bolnikov sedaj nismo naredili večjih statističnih analiz. Z daljšim opazovanjem in zbiranjem bolnikov pa bomo lažje ocenili uspešnost zdravljenja po protokolu AML 10.
Literatura
1.	Bohinjec J. Temelji klinične hematologije. Ljubljana: Dopisna delavska univerza Univerzum, 1983: 259-77.
2.	Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT et al. Proposal for the classification of the acute leukaemias. Br J Haematol 1976; 33: 451-8.
3.	Second MIC Cooperative Study Group. Morphologic, imunologic and cytogenetic (MIC) working classification of the acute myeloid leukaemias. Br J Haematol 1988; 68: 487-94.
4.	Hansen CA, Abaza M, Sheldon S, Ross CW, Schnitzer B, Stoolman LM. Acute byphenotypic leukaemias. Br J Haematol 1993; 84: 49-60.
5.	Billstrom R, Wilsson PG, Mitelman F. Chromosomes, Auer rods and prognosis in acute myeloid leukaemia. Eur J Haematol 1988; 40: 273-8.
6.	Scheinberg DA, Golde DW. The Leukemias. In: Isselbacher KJ, Braunwald E, Wilson JD, Martin JB, Fauci AS eds. Harrison s principles of internal medicine. 12th ed. New York: Me GrawHill, 1994: 1764-71.
7.	Rees JKH, Gray RG, Hayhoe FGJ. Treatment of acute myeloid leukaemia with 1+5 DAT or 3+10 DAT induction and intensive consolidation: Early results in 9th MRC AML trial. Abstract 104 Proceedings of the 4lh International Symposium of the Therapy of Acute Leukaemias. Rome, 1987.
8.	Marcos DeLima, Ghadder H, Pierce S, Estey E. Treatment of newly diagnosed acute myelogenous leukaemia in patients aged 80 years and above. Br J Haematol 1996; 93: 451-8.
9.	Archimband E, Fiere D, Treille-Ritonet D et al. Influence of daunorubicin and cytarabine sequencing on the outcome of therapy in acute myelogenous leukemia: a randomized trial. Cancer Treatment Reports 1987; 71: 571-4.
10.	Buchner T, Urbanitz D, Hiddemann W et al. Intensified induction and consolidation with or without maintenance chemotherapy for acute myeloid leukaemia (AML): two multicentre studies of the German AML Cooperative Groups. J Clin Oncol 1985; 3: 1583-9.
11.	Rai KR, Holland JR, Glidewell OJ et al. Treatment of AML: a study by Cancer and Leukemia Group B. Blood 1981; 58: 1203-12.
12.	Schiffer CA, Wade JC. Supportive care: issues in the use of blood products and treatment of injection. Semi in Oncol 1987; 14: 545-67.
Strokovni prispevek/Professional article
NAŠE IZKUŠNJE PRI ZDRAVLJENJU AKUTNE MIELOBLASTNE LEVKEMIJE S KLADRIBINOM
PRI STAREJŠIH BOLNIKIH
TREATMENT OF ACUTE MYELOBLASTIC LEUKEMIA WITH CLADRIBINE IN ELDERLY PATIENTS
- OUR EXPERIENCIES
Samo Zver, Jože Pretnar
Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center Ljubljana, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-03-24, sprejeto 1998-04-02; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-39-42
Ključne besede: kladribin; akutna mieloblastna levkemija; starejši bolniki, zapleti
Izvleček—Izhodišča. Nukleozidni analog kladribin je novejše zdravilo za zdravljenje akutnih levkemij. Po navadi se uporablja v kombinaciji s citozin-arabinozidom pri zdravljenju starejših bolnikov. Prikazujemo retrogradni pregled zdravljenja starejših bolnikov z akutno mieloblastno levkemijo (AML), ki smo jih zdravili z kladribinom in nizkimi odmerki citozin-arabinozida na Kliničnem oddelku za hematologijo od 1. 1. 1996 do 1. 3- 1998.
Metode. Z kladribinom in nizkimi odmerki citozin-arabinozida smo zdravili 14 bolnikov, 9 moških in 5 žensk. Bolniki so prejemali kladribin v odmerku 0,1 mg/kg/telesne teže sedem dni in citozin-arabinozid 13 mg/m2/telesnepovršine štirinajst dni zapored. Mediana starost bolnikov je bila 72 let. Deset od štirinajstih bolnikov (71%) poprej ni bilo zdravljenih s citostatiki, štirfe od štirinajstih bolnikov (29%) pa so bili poprej že zdravljeni. Med zdravljenjem smo beležili število nevtrofilnih granulocitov, hlastnih celic v periferni krvi, število doseženih remisij bolezni in zaplete zdravljenja z kladribinom.
Rezultati. Pri štirih od štirinajst bolnikov (29%) smo dosegli popolno remisijo bolezni, pri enem bolniku (79'o)pa delno remisijo AML. Skupno je bilo zdravljenje uspešno pri petih od štirinajstih bolnikov (36%). Remisijo AML smo dosegli le pri poprej nezdravljenih bolnikih. Najmanjše število nevtrofilnih granulocitov smo v povprečju zasledili dvanajsti dan zdravljenja. Prve znake regeneracije kostnega mozga v krvni sliki smo vpovprečju beležili 14 dan po končani kemoterapiji. Trije od štirinajstih bolnikov (21%) so med zdravljenjem umrli. Resnejših zapletov in trajnih neželenih učinkov zdravljenja z kladribinom in citozin-arabinozidom nismo opazovali.
Zaključki. Kladribin je v kombinaciji z nizkimi odmerki citozin-arabinozida dobro in uspešno zdravilo za zdravljenje AML pri starejših bolnikih, ki poprej še niso bili zdravljeni s citostatiki. Neuspešen pa je pri bolnikih z relapsom ali rezistentno obliko AML.
Uvod
Kladribin (2- kloro-2-deoksiadenozin) je novejše zdravilo v hematologiji. Prva poročila v literaturi o zdravljenju s kladribinom segajo v začetek osemdesetih let (1). Sodi med novejša kemoterapevt-
Key words: cladribine; acute myeloid leukemia; elderly patients; complications
Abstract—Background. Nucleosid analogue cladribine is a newer drug for treatment ofacute leukemias. Usually is used in combination with cytosine-arabinoside in elderly patients. We present retrograde overview of elderly patients with acute myeloid leukemia (AML), who were treated with cladribine and low doses cytosine arabinoside in Ljubljana haematologic department between 1.1. 1996 and 1.3-1998.
Methods. During mentioned period we have treated 14 patients with cladribine and low doses cytosine-arabinoside, with median age of 72 years. 9 patients were males and 5 females. Patients recieved cladribine in dosage 0,1 mg/kg/body weight seven days and cytosine arabinoside 13 mg/m2/body surface area forfourteen days. 10/14patients (71%) did not recive chemotherapy before treatment and 4/14 patients (29%) recieved at least one cycle of chemotherapy. During the treatment we documented neutrophyl granulocyte cell count, disapperance of blast cells from peripheral blood, number of achieved remissions of AML and complications considering chemotherapy with cladribine.
Results. 4/14 patients (29%) achieved complete remission and 1/ 14 (7%) patients achieved partial remission of AML. Only patients who did not recieved chemotherapy before cladribine achieved remission of AML. On average the lowest neutrophyl granulocyte cell count was on day 12 after beginning of chemotherapy and the first signs of bone marrow regeneration were noticed on day 14 after completion of chemotherapy. 3/14 patients (21%) died during the treatment. We did not documented serious and long lasting side effects of cladribine and low doses cytosine-arabinoside treatment.
Conclusions. Cladribine is in combination with cytosine-arabinoside good and sucessfull drug for treatment of AML in elderly patients, who were not recieve chemotherapy before. But it has no effect in patients with relapsed or refractory AML.
ska zdravila iz vrst nukleozidnih analogov kot naprimer tudi flu-darabin in deoksikoformicin. Kladribin je citotoksični purinski analog, ki je odporen proti razgradnji z encimom adenozin deami-naza. V celice vstopi s pasivnim transportom. Po znotrajceličnem privzemu encim deoksicitidin kinaza fosforilira kladribin v kladri-
bin trifosfat. Slednji je aktivna oblika zdravila, ki ga adenozin deaminaza ne more razgraditi, zato se kopiči v celicah do toksičnih koncentracij. Citotoksičnost se izraža na dveh ravneh. Inhibira sintezo DNK v celicah, ki so v obdobju delitve tako, da zavira delovanje encima ribonukleotidna reduktaza, ki reducira ribonu-kleotide v deoksiribonukleotide (2). V limfoblastih se med deoksi-ribonukleotidi najbolj zmanjša koncentracija deoksicitozin-trifos-fata (dCTP), v mieloblastih pa raven deoksiadenozin-trifosfata (dATP) (2). Tudi vključitev trifosfatne oblike kladribina v podvajajočo DNK pomeni prekinitev podvajanja DNK med celično delitvijo. Na celice v obdobju delitve delujejo tudi antraciklinski citostatiki in citozin-arabinozid (Ara-C). Bolj zanimivo in za zdravljenje pomembnejše pa je delovanje kladribina na celice, ki niso v obdobju delitve in na katere antraciklini in Ara-C ne učinkujejo (3).Velik delež relapsov potrjuje, da je velik del levkemičnih celic izven obdobja delitve (izven S obdobja mitoze) in zato odporen proti indukcijskim in konsolidacijskim protokolom kemoterapije, ki vključujejo antracikline in Ara-C. Kladribin deluje na celice, ki so izven obdobja delitve tako, da se vgradi v poškodovane dele DNK in onemogoči popravo spremenjene DNK z popravljalnimi encimi, kot sta na primer polimeraza alfa in beta (4). Nepopravljena DNK sproži začetek apoptoze v levkemični celici.
Sprva so kladribin uporabljali kot protilimfocitno zdravilo. Njegova učinkovitost je dobro znana pri bolnikih z dlakasto celično levkemijo, kronično limfatično levkemijo, Waldenstroemovo ma-kroglobulinemijo (5, 6). Limfatične celice vsebujejo večje koncentracije encima deoksicitidin kinaza kot neutrofilni granulociti, zato je raven citotoksične oblike fosforiliranega kladribina v limfocitih večja (7). Nepričakovano pa so in vitro raziskave z kladribinom potrdile, da se kladribin hitro fosforilira tudi v hlastnih celicah mieloične vrste (8). Zato so kmalu sledile prve klinične raziskave z kladribinom pri bolnikih z AML (8, 9). Santana in sod. so pri otrocih z prvim oziroma kasnejšim relapsom AML, ki so bili zdravljeni samo s kladribinom, ugotavljali popolno remisijo pri 59% bolnikov (9). Pri odraslih bolnikih z AML, predvsem pri tistih z relapsom bolezni in za zdravljenje odporno obliko AML, pa kladribin do sedaj ni bil tako učinkovit kot pri otrocih (10, 11).
Leta 1996 smo začeli zdraviti z kladribinom starejše bolnike s primarno oz. sekundarno AML ali mielodisplastičnim sindromom (MDS) tudi na Kliničnem oddelku za hematologijo (KOH) Kliničnega centra v Ljubljani. Protokol zdravljenja je poleg kladribina vključeval tudi nizke odmerke Ara-C. Predstavljamo pregled zdravljenja starejših bolnikov z AML v obdobju od 1. 1. 1996 do 1.3. 1998.
Bolniki in načini zdravljenja
V obdobju od 1.1. 1996 do 1. 3- 1998 smo s kladribinom in nizkimi odmerki Ara-C zdravili 14 bolnikov z AML in MDS (tab. 1). Devet bolnikov je bilo moških in pet žensk. Mediana starost bolnikov je bila 73 let, v razponu od 61 do 83 let. Mediana starost bolnikov moškega spola 67 let je bila nižja kot srednja starost bolnic 74 let. Sedem od štirinajstih bolnikov (50%) je imelo sekundarno AML. Ta se je v štirih primerih razvila iz MDS tip 5 po FAB (francosko-ameriško-angleška razvrstitev akutnih levkemij in mielodisplastič-nih sindromov), pri dveh iz MDS tip 3, enega bolnika pa smo štiri leta pred nastankom sekundarne AML zdravili zaradi nizkomali-gnega ne-Hodgkinovega limfoma (tab. 1). 6/14 bolnikov je imelo primarno AML, eden od štirinajstih bolnikov pa je imel primarni MDS tip 3 po FAB. Pri zdravljenju bolnikov z AML in MDS je važen tudi podatek, o poprejšnjem zdravljenju s citostatiki. Kladribin in nizki odmerki Ara-C so predstavljali indukcijsko zdravljenje s kemoterapijo pri desetih od štirinajstih bolnikov (71,4%), štirje od štirinajstih bolnikov (28,6%) pa so poprej že prejeli vsaj en krog zdravljenja s citostatiki. Pri slednjih je šlo za enega bolnika iz skupine s sekundarno AML, ter za tri bolnike iz skupine s primarno AML. Nihče med štirinajstimi bolniki ni bil ob začetku zdravljenja s kladribinom v remisiji bolezni.
Tab. 1. Bolniki, ki smo jih zdravili z kladribinom in nizkimi odmerki Ara-C na KOH v obdobju od 1. 1. 1996 do 1. 3■ 1998.
Tab. 1. Patients treated with cladribine and low doses Ara-C at haematologic department between 1.1. 1996 and 1. 3■ 1998.
Bolniki, starost, spol Patients, age, sex					Diagnoza Diagnose	Poprejšnja kemotherapija Previous chemotherapy	Remisija bolezni in trajanje Remission of the disease and duration
1.	PM	61	let	M	AML 1.relaps	da/yes	ne/no
2.	KS	77	let	M	s AML (NHL)	ne/no	ne/no
3.	AJ	76	let	M	s AML (MDS 5)	ne/no	umrl/died
4.	TA	74	let	F	MDS 3	ne/no	PR 3m+/CR 3m+
5.	RV	68	let	M	s AML (MDS 5)	ne/no	PR 7 m/CR 7m
6.	GL	81	let	M	AML	ne/no	umrl/died
7.	FJ	67	let	M	s AML (MDS 3)	da/yes	ne/no
8.	KJ	65	let	M	AML 1 relaps	da/yes	umrl/died
9.	MHO 61		let	M	s AML (MDS 5)	ne/no	ne/no
10.	OA	64	let	M	AML.	ne/no	DR lm/PR lm
11.	PP	83	let	F	h AL 2 relaps	da/yes	ne/no
12.	ML	75	let	F	s AML (MDS 1)	ne/no	ne/no
13.	KZ	78	let	F	s AML (MDS 3)	ne/no	PR 17m+/CR 17m+
14.	ŠN	73	let	F	AML	ne/no	PR 5m+/CR 17m+
AML - akutna mieloična levkemija; s AML - sekundama akutna mieloična levkemija; NHL - nehodgkinov limfom; MDS - mielodisplastičnin sindrom; h AL - hibridna akutna levkemija; PR - popolna remisija bolezni; DR; delna remisija bolezni; m -mesec dni; m+ - dlje kot mesec dni ; M - moški; F - ženska.
AML - acute myeloid leukemia; s AML - secondary AML; NHL - nonhodgkin lymphoma; MDS - mielodysplastic syndrom; h AL - hybrid acute leukemia; CR -complete remission; PR - partial remission; m — month; m+ - longer than month ; M - male; F - female
Bolniki so prejemali kladribin v odmerku 0,1 mg/kg telesne teže/ dan v podkožje ali kot 24-urno neprekinjeno infuzijo v 500 ml fiziološke raztopine 1., 3., 5., 7., 9-, 11. in 13. dan od začetka zdravljenja in Ara-C v odmerku 13 mg/m2 tel. površine/12 ur v podkožje 1.-14. dan od začetka zdravljenja. V obdobju aplazije kostnega mozga so vsi prejemali peroralno protibakterijsko in protiglivično profilakso s ciprofloksacinom in ketokonazolom ali flukonazolom. Okužbe in sepse smo glede na povzročitelje zdravili s cefalosporini tretje generacije, vankomicinom in amfoterici-nom ob sumu na glivično sepso.
Za najmanjše število nevtrofilnih granulocitov (NG) smo ocenjevali dan po začetku zdravljenja s kladribinom, ko je bilo število NG v diferencialni beli krvni sliki najmanjše, ali pa prvi dan, ko so NG izginili iz periferne krvi. Za prvi znak regeneracije kostnega mozga po aplaziji smo ocenili prvi dan po končani kemoterapiji, ko so se NG ponovno pojavili v diferencialni beli krvni sliki, oziroma dan, ko je najnižje zabeležena vrednost NG v periferni krvi pričela naraščati. Pred zdravljenjem so imeli vsi bolniki različen odstotek levkemičnih hlastnih celic v periferni krvi. Zato smo bili pri bolnikih pozorni tudi na izginotje hlastnih celic iz periferne krvi med zdravljenjem z kladribinom.
V obdobju regeneracije kostnega mozga smo za oceno uspešnosti zdravljenja s kladribinom opravili tudi punkcijo kostnega mozga. Popolno remisijo bolezni (PR) smo dosegli, če je bilo v kostnem mozgu manj kot 5% hlastnih celic, hkrati pa v diferencialni beli krvni sliki več kot 1,5x10/9 NG in bolnik ni potreboval transfuzij trombocitne plazme. Če je bilo v kostnem mozgu 5-25% hlastnih celic z vsaj 15% celic rdeče vrste in 25% normalnih celic bele vrste, smo zdravljenje ocenili kot delno remisijo bolezni (DR). Več kot 25% hlastnih celic v kostnem mozgu smo šteli za obliko bolezni, odporno za zdravljenje s kladribinom (12,13). Če so se v obdobju regeneracije kostnega mozga v diferencialni krvni sliki pojavile hlastne celice v večjem odstotku (na primer več kot 10%) ali če je njihov odstotek naraščal, punkcije kostnega mozga nismo naredili. Takšne bolnike smo uvrstili v skupino, ki je odporna proti zdravljenju s kladribinom.
Rezultati
Pri štirih od štirinajstih bolnikov (29%) smo dosegli popolno remisijo bolezni, pri enem bolniku (7%) pa delno remisijo bolezni.
Slednji je imel v obdobju regeneracije kostnega mozga po obdobju aplazije v kostnem mozgu 11% hlastnih celic. Skupno smo bili uspešni pri petih od štirinajstih bolnikov (36%). S kladribinom in nizkimi odmerki Ara-C pa nismo uspeli doseč remisije pri devetih od štirinajstih bolnikov (64%). Vsi bolniki, ki so dosegli popolno remisijo bolezni, pred tem niso bili zdravljeni s citostatiki. Zdravljenje s kladribinom je bilo prvo indukcijsko zdravljenje njihove bolezni. Tudi bolnik, pri katerem smo dosegli delno remisijo bolezni, pred kladribinom ni prejel citostatikov. Tako smo v skupini bolnikov, ki so prejeli kladribin kot indukcijsko zdravljenje, kar pri štirih od desetih (40%) dosegli popolno remisijo bolezni, pri enem od desetih (10%) pa delno remisijo. Skupno, je bil kladribin uspešen pri petih od desetih bolnikov (50%). Zdravljenje z kladribinom pa ni bilo uspešno pri nobenem od štirih bolnikov (0%), ki so pred kladribinom prejeli vsaj en krog zdravljenja s citostatiki. Najmanjše vrednosti NG smo beležili v povprečju dvanajsti dan po začetku zdravljenja s kladribinom. Pred začetkom zdravljenja so imeli le trije bolniki normalno vrednost NG v krvi. Pri kar desetih od štirinajstih bolnikov je bila začetna vrednost NG pod 1,0x10 9/ L, med temi pri petih celo pod 0,5x10 9/L. V obdobju aplazije so pri trinajstih bolnikih (92,9%) levkemične blastne celice izginile iz periferne krvi. Prve znake regeneracije kostnega mozga po aplazi-ji smo beležili v povprečju 14 dan (6 do 25 dni) po končanem zdravljenju s citostatiki. Le trije bolniki so v obdobju aplazije prejemali rastni faktor za granulocitno celično vrsto (G-CSF). Pri teh so se znaki regeneracije kostnega mozga pojavili 11, 12 in 22 dan po končanem zdravljenju s citostatiki. Bolniki, ki niso prejemali G-CSF, so regenerirali v povprečju 13 dni po končanem zdravljenju s citostatiki.
Med stranskimi učinki zdravljenja smo pri vseh bolnikih, 14/14 (100%), opazovali zaviralno delovanje kladribina na kostni mozeg. Vsi bolniki so v obdobju aplazije kostnega mozga vsaj dvakrat prejeli transfuzijo koncentriranih trombocitov. Le dva od štirinajstih bolnikov (14%) sta bila ves čas zdravljenja s kladribinom brez povišane telesne temperature. Pri drugih smo ugotovili vsaj enkraten porast telesne temperature. Iz kužnin (bris kože, nosne in žrelne sluznice, hemokultur...) smo izolirali po Grammu negativne bakterije, več sevov proti meticilinu odpornega stafilokoka in več sevov gliv iz rodu kandida. Pri štirih od štirinajstih bolnikov (29%) smo opazovali porast vrednosti kreatinina v serumu do 303 umol/L. Dva bolnika (14%) sta imela diarejo in močno bruhanje. Nevrotoksičnih stranskih učinkov zdravljenja, ki bi jih lahko pripisali kladribinu, nismo ugotovili.
Trije bolniki (21%) so v času zdravljenja s kladribinom umrli. Dva sta umrla v obdobju aplazije, eden pa v obdobju regeneracije kostnega mozga. Vzroki smrti so bili obojestranska pljučnica, krvavitev v osrednje živčevje ob hkratni glivični sepsi in sepsi z meticilin odpornim Staphylococcus aureusom. Pri avtopsiji sta imela dva bolnika v kostnem mozgu rezidualne levkemične blastne celice, pri enem pa je bil kostni mozeg aplastičen, brez rezidualnih levkemičnih blastov. Vendar so pri slednjem bolniku pri avtopsiji našli nodularno razrast levkemičnih hlastnih celic v vranici.
Razpravljanje
Več kot polovica vseh bolnikov z AML je starejših od 60 let, približno tretjina pa celo starejša od 70 let (14). Glede na dejstvo, da se življenjska doba ljudi daljša, lahko v prihodnje pričakujemo še večji delež AML med starejšimi bolniki. Povprečno preživetje zdravljenih in nezdravljenih starejših bolnikov z AML je približno 20 tednov po postavitvi diagnoze (14). Pogosto gre za sekundarno AML, ki se razvije iz MDS, ali pa je posledica obsevanja in zdravljenja s citostatiki poprejšnje rakave bolezni. Zdravljenje sekundarnih oblik AML je manj uspešno kot zdravljenje primarnih oblik bolezni. Ker zdravljenje starejših bolnikov spremljajo pogostejši zapleti in ker številni med njimi niso sposobni za intenzivno zdravljenje s citostatiki, je iskanje uspešnega in primernega zdravila eden pomembnejših ciljev v hematologiji. Predvsem zaradi delo-
vanja na levkemične blastne celice, ki niso v obdobju delitve, je kladribin morda eno takšnih zdravil.
Indukcijski protokoli zdravljenja AML, ki vključujejo Ara-C v kombinaciji z antraciklinom ali epipodofilotoksinom, so, ne-upoštevajoč starost, učinkoviti pri 70-75% bolnikov s primarno AML in pri 30-50% bolnikov z relapsom ali resistentno obliko AML (10, 14). Podatki v literaturi o učinkovitosti kladribina pri zdravljanju AML so različni. Kladribin kot monoterapija je bil pri bolnikih z relapsom oz. na zdravljenje odporno obliko AML v dveh raziskavah učinkovit pri 8,3% oz. 0% bolnikov (10, 11). Če so kladribinu dodali še Ara-C v odmerku 1 g/m2 so bili uspešni pri 17,6% bolnikov. Giralt in sod. (12) so pri zdravljenju z kladribinom ugotavljali pri 5/7 bolnikov (71,4%), starih 55-70 let remisijo AML. V skupini so bili bolniki z relapsom ali proti zdravljenju odporno obliko bolezni. Kladribin so dobivali v odmerku 12mg/m2/dan, skupaj z Ara-C lg/m2/dan, oboje pet dni zapored. V literaturi nismo našli člankov o uporabi kladribina in Ara-C samo pri starejših bolnikih.
Pri nas smo bili pri zdravljenju s kladribinom in nizkimi odmerki Ara-C uspešni pri petih od štirinajstih bolnikov (36%). Pri štirih bolnikih smo dosegli PR bolezni (29%), pri enem pa DR bolezni (7%). Dva bolnika sta imela primarno AML, eden primarni MDS 3, dva po sekundarno AML, ki se je razvila iz MDS (tab. 1). Pri enem bolniku je remisija trajala 7 mesecev, ostali trije pa so še vedno v remisiji bolezni, ki traja 5, 7 in 17 mesecev. Bolnica, pri kateri remisija AML traja 17 mesecev je deset mesecev prejemala vzdrževalno zdravljenje z nizkimi odmerki Ara-C. Bolnik z DR je po mesecu dni dobil polno razvit relaps AML in kmalu zatem umrl. Nihče izmed peterice bolnikov, pri katerih je bilo zdravljenje uspešno, poprej ni prejemal citostatikov. Tako smo v skupini bolnikov, kjer je bil kladribin prvo indukcijsko zdravljenje, dosegli remisijo bolezni pri petih od desetih bolnikov (50%), med njimi pri štirih (40%) PR bolezni. Tudi v literaturi so pri starejših, poprej nezdravljenih bolnikih z AML z intenzivno kemoterapijo, podobno ali celo slabše uspešni. Remisijo AML navajajo pri 30-35% bolnikov (14). Zato smo mnenja, da je kladribin v kombinaciji z nizkimi odmerki Ara-C lahko primemo in učinkovito indukcijsko zdravljenje za starejše, poprej nezdravljene bolnike z AML. Nasprotno pa ni bil kladribin neuspešen pri nobenem od štirih, poprej že zdravljenih bolnikih z AML (100%), kar je skladno s podatki v literaturi (10, 11).
Bolniki so sedem dni prejemali klabribin v odmerku 0,lmg/kg tel teže/dan. Ker je znano, da je razpolovna doba zdravila 70-150 minut, so bolniki prejemali zdravilo v neprekinjeni 24-urni infuziji ali pa kot enakovreden enkraten dnevni podkožni odmerek (9). Vahdat in sod. (11) so uporabljali znatno večje odmerke kladribina, od 5-21 mg/m2 telesne površine/dan (približno 0,1-0,4 mg/kg telesne teže) pet dni zapored. Zaradi hude nevrotoksičnosti, ki so jo opazovali kot neželen stranski učinek zdravljenja, priporočajo najvišji dovoljen odmerek 17 mg/m2 telesne površine/dan (približno 0,3 mg/kg tel. teže/dan) pet dni zapored. Pri največjih odmerkih so opazovali tudi zelo dolge aplazije kostnega mozga in več okužb.
Več raziskav je dokazalo, da nukleozidni analog fludarabin poveča koncentracijo aktivne oblike Ara-C, to je arabinozid-citozin-tri-fosfata (Ara-CTP) v levkemičnih blastnih celicah (15). To je posledica zavore encima ribonukleotidna reduktaza in posledičnega znižanja koncentracije deoksiribonukleotidov v celicah. Ker pa je kladribin močnejši inhibitor ribonukleotidne reduktaze kot fludarabin, je tudi močnejši modulator metabolizma Ara-C. Z raziskavami in vitro so dokazali 65% povečanje koncentracije Ara-CTP po inkubaciji blastnih celic z kladribinom (10). Podobno so tudi s študijami ex vivo pokazali 1,2-1,4-kratni porast Ara-CTP po dodatku kladribina (10). Klinične in farmakološke raziskave z Ara-C so pokazale, da je pri odmerku zdravila lg/m2 tel. površine/dan danega v dveumi infuziji dosežena najvišja koncentracija Ara-CTP v blastnih celicah. Pri tem odmerku je dosežen največji privzem zdravila v celice, zato večji odmerki Ara-C nimajo pravega učinka (16). Ker so naši bolniki prejemali znamo manjše odmerke zdravi-
la, bi lahko z večjim odmerkom Ara-C morebiti lahko dosegli boljše rezultate zdravljenja, seveda z več neželenimi učinki.
Po kladribinu in nizkih odmerkih Ara-C je pri vseh bolnikih prišlo do aplazije kostnega mozga. Pri trinajstih bolnikih (93%) so hlastne celice izginile iz periferne krvi. Slednje potrjuje dobro protilev-kemično delovanje zdravila. Po končani kemoterapiji smo prve znake regeneracije kostnega mozga opažali v povprečju po 14 dneh. To je približno enako dolgo, kot tudi pri drugih starejših bolnikih z AML, ki prejmejo druga, podobno intenzivna zdravljenja s citostatiki. Trije bolniki so prejemali G-CSF po tem, ko smo več dni po končani kemoterapiji preverili kostni mozeg in v njem ni bilo blastnih celic. Dva bolnika sta dosegla PR, eden pa DR bolezni. Menimo, da je G-CSF varno zdravilo, če se zanj odločimo v obdobju aplazije po tem, ko izključimo prisotnost levkemičnih celic v kostnem mozgu.
Med neželenimi stranskimi učinki zdravljenja je prevladovalo zaviralno delovanje kladribina na kostni mozeg. V tem obdobju so prejemali transfuzije koncentriranih eritrocitov in trombocitov. Med nehematološkimi stranskimi učinki zdravljenja smo pri štirih od štirinajstih bolnikov (29%) ugotovili zmeren, povraten porast vrednosti kreatinina v serumu, pri dveh pa diarejo in bruhanje. Porast serumskega kreatinina težko pripišemo izključno kladribinu. Bolniki so hkrati bili tudi septični in prejemali antibiotike s škodljivim delovanjem na ledvice. Tudi v literaturi ni opisanih pogostih in resnih nehematoloških stranskih učinkov zdravljenja z kladridi-nom pri nižjih in srednje visokih odmerkih. Navajajo blag porast aktivnosti jetrnih transaminaz, zmeren povratni porast kreatinina v serumu, simptome s strani prebavil, redko sindrom tumorske liže (11). Škodljiv učinek kladribina na ledvice postane bolj izrazit pri kumulativnem odmerku 91mg/m2 tel površine. Vahdat in sod. (11) so raziskovali nevrotoksične stranske učinke zdravila. Kladri-bin namreč prehaja membrano med krvjo in osrednjim živčevjem. Njegova koncentracija v likvorju se giblje med 12,4—38,0% serumske koncentracije dosežene v ravnotežnostnem stanju (13). Pri odmerkih kladribina 19-21mg/m2 tel. površine/dan (približno 4mg/ kg tel. teže/dan) pet dni zapored je pri šestih od devetih bolnikov (66%) prišlo do razvoja hude senzori-motorne nevropatije, ki se je le delno popravila. Patomorfološko je šlo za aksonsko degeneracijo in sekundarno demielinizacijo. Zato je, kot že omenjeno, najvišji dovoljeni odmerek kladribina 17mg/m2 tel. površine/dan (približno 3mg/kg tel. teže/dan) pet dni zapored. Sicer so pri visokih odmerkih kladribina beležili le blage akutne stranske učinke zdravljenja, najpogosteje s strani prebavil. Zato pa so kasneje bolniki razvili dolge aplazije kostnega mozga, ki so trajale 40 do 60 dni.
Trije od štirinajstih bolnikov (21,3%) so med zdravljenjem s kladri-binom in nizkimi odmerki Ara-C umrli (tab. 1). Zanimiv je primer bolnika, ki je umrl deseti dan po končani kemoterapiji zaradi stafilokokne sepse. Pri avtopsiji je bil kostni mozeg aplastičen, brez blastnih celic. Hkrati pa so našli nodularno razrast levkemičnih blastnih celic v vranici. To je nazoren primer, kako prihaja do relapsov AML kljub začetnemu uspešnemu zdravljenju s kemoterapijo.
Zaključki
Nukleozidni analog kladribin je novejše zdravilo pri zdravljenju AML. Je prvo zdravilo za zdravljenje akutnih levkemij, ki deluje na celice v obdobju delitve (v S obdobju mitoze) in tudi na celice, ki
se ne delijo. Glede na naše dosedaj zbrane in predstavljene izkušnje pri zdravljenju bolnikov z AML in MDS, starejših od 65 let, smo mnenja, da je kladribin primemo zdravilo za bolnike, ki poprej niso bili zdravljeni s citostatiki. Spodbudno je, da smo remisijo dosegli tudi pri bolnikih s sekundarno AML. Ker smo bolnike zdravili z nižjim odmerkom Ara-C, kot je priporočeno v literaturi, bi mogoče lahko z višjim odmerkom zdravila v prihodnosti dosegali še boljše rezultate zdravljenja. Skladno s podatki iz literature pa s kladribinom nismo dosegli remisije AML pri bolnikih, ki so bili poprej že zdravljeni s citostatiki (10). Gre za bolnike z relapsom bolezni ali proti zdravljenju primarno odporno obliko bolezni, pri katerih nikoli nismo dosegli remisije. Ta skupina bolnikov ima najslabšo napoved poteka bolezni in zanjo še naprej ne poznamo učinkovitega zdravljenja. Mogoče bo pri teh bolnikih učinkovito sinergistično delovanje kladribina in interferona alfa na levkemične blastne celice, ki pa je zaenkrat še v laboratorijskem obdobju preiskovanja (17).
Literatura
1.	Carson DA, Wasson DB, Beutler E. Antileukemic and immunosupressive activity of cladribine. Proč Natl Acad Sci USA 1984; 81: 2232-6.
2.	Griffig J, Koob R, Blakley RL Mechanism of inhibition of DNA syntesis by cladribin in human lymphoblastic colls. Cancer Res 1989; 49: 6923-8.
3.	Beutler E, Piro LD, Saven A, Kay AC. Cladribine: a potent chemotherapeutic and immunosupressive nucleoside. Leuk Lymphoma 1991; 5: 1-8.
4.	Chunduru SK, Blakeley RL. Effect of cladribinetriphosphate on nucleotide incorporation rate of human DNA polymerase alfa and beta. Proc Am Assoc Cancer Res 1991; 32: 17-23-
5.	Estey EH, Kurzrock R, Kantarijan HM et al. Treatment of hairy cell leukemia with cladribine (2 CdA). Blood 1992; 79: 882-7.
6.	Saven A, Piro LD. Cladribine: a newer purine analogue active in the treatment of lymphoid malignancies. Ann Intern Med 1994; 120: 784-91.
7.	Amer ESJ, Erikssan S. Selective assays for thymidine kinase 1 and 2 and deoxycytidine kinase and their activities in extracts from human cells and tissues. Biochem Biophy Res Commun 1992; 188: 712.
8.	Santana VM, Mirro J, Harwood FC, Cherrie J, Schell M, Blakeley RM. A phase 1 clinical trial of 2 CdA in pediatric patients with acute leukemias. J Clin Oncol 1991; 9: 416-22.
9.	Santana VM, Mirro J, Keams C, Schell MJ, Crom W, Blackley RL. Cladribine produces a high rate complete remission in relapsed acute myeloid leukemia. J Clin Oncol 1992; 10: 364-70.
10.	Komblau SM, Gandhi V, Andreeff HM, Beran M, Kantarijan HM, Estey E. Clinical and laboratory studies of cladribine and cytosine arabinoside for relapsed or refractory acute myeloid leukemia in adults. Leukemia 1996; 10: 1563-9-
11.	Vahdat L, Wong ET, Wile MJ, Rosenblum M, Foley KM. Therapeutic and neurotoxic effects of cladribine in adults with acute myeloid leokemia. Blood 1994; 10: 3429-34.
12.	Giralt S, Estey E, Albitar M, Besien K, Rondon G, Anderlini P. Engraftment of allogenic hematopoietic progenitor cells with purine analog containing chemotherapy: harnessing graft versus leukemia without myeloablative therapy. Blood 1997; 12: 4531-6.
13.	Santana VM, Hurwitz CA, Blakley RL, Crom WR, Luo X, Roberts WM. Complete hematologic remissions induced by cladribine in children with newly diagnosed acute myeloid leukemia. Blood 1994; 4: 1237-42.
14.	Ferrara F, Annunziata M, Copia C, Magrin S, Mele G, Mirto S. Therapeutic options and treatment results for patients over 75 years of age with acute myeloid leukemia. Haematologica 1998; 83: 126-31-
15.	Gandhi V, Estey E, Keating MJ, Plunkett W. Fludarabine potentiates metabolism of cytarabine in patients with acute myelogenuus leukemia during therapy. J Clin Oncol 1993; 11: 116-24.
16.	Plunkett W, Liliemark JO, Estey E, Keating MJ. Saturation of Ara CTP accumulation durin high dose Ara-C therapy. Pharmacologic rational for intermediate dose Ara-C. Semin Oncol 1987; 14: Suppl 1: 159-
17.	Robak T, Korycka A. The comparison of 2.CdA in combinatin with interferon alfa or gama on granulocyte-macrophage progenitor cells and clonogenic blasts in in vitro cultures. Leuk Lymphoma 1996; 21: 161-8.
Strokovni prispevek/Professional article
MIELODISPLASTIČNI SINDROM S PRIDOBLJENO KORPUSKULARNO HEMOLITIČNO ANEMIJO IN S KASNEJŠIM PREHODOM V AML - PRIKAZ PRIMERA
MYELODYSPLASTIC SYNDROME WITH ACQUIRED CORPUSCULAR HAEMOLYTIC ANAEMIA
AND LATER TRANSITION IN AML - CASE REPORT
Uroš Mlakar
Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-04-06, sprejeto 1998-04-09; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-43-5
Ključne besede: hemolitična anemija; mielodisplastičnisindrom; akutna mieloblastna levkemija
Izvleček—Izhodišča. Pridobljena korpuskulama hemolitična anemija je pri mielodisplastičnem sindromu neobičajen pojav. Vzrok za hemolizo je lahko pridobljeno pomanjkanje encima piruvat kinaze ali pridobljena bolezen hemoglobina H. Poročila, ki opisujejo korpuskulamo hemolitično anemijo kot predhodnico akutne mieloblastne levkemije, so zelo redka.
Prikaz bolnika. Pri 59-letnem bolniku so odkrili hemolitično anemijo. Pred tem je bil bolnik ves čas zdrav. S kasnejšimi preiskavami smo ugotovili, da gre sočasno za pridobljeno korpuskulamo hemolitično anemijo in mielodisplastični sindrom. Pri iskanju vzroka za hemolizo smo izključili večino možnih vzrokov, razen pomanjkanja piruvat kinaze. Deset mesecev kasneje seje v krvi pojavilo 1-2% blastov. Njihovo število je postopoma naraščalo. S preiskavo kostnega mozga smo ugotovili akutno mieloblastno levkemijo vrste AML-M2po FAB razvrstitvi. Kljub intenzivnemu zdravljenju s citostatiki remisije nismo dosegli in bolnik je 6 mesecev po začetku zdravljenja umrl.
Zaključki. Avtor razpravlja o možnih vzrokih za hemolitično anemijo pri mielodisplastičnem sindromu. Pri pregledu literature je našel le nekaj poročil s podobno hematološko sliko. Hemolitična anemija je v poteku mielodisplastičnega sindroma zelo redek zaplet.
Uvod
Če se akutna mieloblastna levkemija (AML) razvije iz mielodisplastičnega sindroma ali kot posledica obsevanja ali zdravljenja s citostatiki, govorimo o sekundarni AML. Mielodisplastični sindromi (MDS) so bolezni, pri katerih so v ospredju znaki odpovedi kostnega mozga. Na osnovi razvrstitve, ki jo je predlagala skupina francoskih ameriških in britanskih hematologov (FAB klasifikacija), razlikujemo pet vrst MDS (1). Pogosti prehodi v AML so predvsem pri vrsti III, IV in V. Bolniki z MDS, kjer so v ospredju znaki hemolitične anemije, so zelo redki. Opisujemo bolnika s pridobljeno korpuskulamo hemolitično anemijo in znaki MDS, pri katerem se je leto kasneje razvila AML. Zdravljenje s citostatiki ni bilo učinkovito.
Key words: haemolytic anaemia; myelodysplastic syndrome; acute myeloblastic leukaemia
Abstract — Background. Acquired corpuscular haemolytic anaemia may appear as an unusual manifestation of myelodysplastic syndrome. The underlying cause for red cell destruction are acquired severe pyruvate kinase deficiency or acquired haemoglobin H disease. Only very few papers describe acquired corpuscular haemolytic anaemia as an early symptom of acute leucoblastic leukaemia.
Methods, results. A 59-year-old previously healthy man wasfound to have haemolytic anaemia. Further studies revealed a myelodysplastic syndrome and acquired corpuscular haemolytic anaemia. The underlying cause for the red cell destruction was not found, but pyruvate kinase was not evaluated. Ten months later 1-2% of blast cells in the peripheral blood were noted which increased progressively. Subsequently a diagnosis of acute myeloblastic leukaemia M2 was made according to the FAB co-operative group criteria. Although intensive chemotherapy was performed, the patient did not achieve remission and died 6 months later.
Conclusions. The author discusses possible causes for underlying red cell defect. A review of literature reveals very few previous reports with this haematologicalpicture. Haemolytic anaemia is an unusual manifestation of myelodysplastic syndrome.
Prikaz bolnika
59-letni bolnik je decembra 1994 poiskal pomoč pri splošnem zdravniku, ker je postal rumen. Do tedaj je bil ves čas zdrav. V sorodstvu ni bilo oseb, ki bi se zdravile zaradi krvne bolezni. Bolniku so ugotovili makrocitno anemijo in zvečano koncentracijo bilirubina v serumu ter se odločili za zdravljenje z vitaminom B]2.
Maja 1995 so bolnika sprejeli v področno bolnišnico zaradi poslabšanja anemije. Imel je splošne simptome in znake anemije. Barva kože je bila bledo rumena. Nad srcem so slišali sistolični šum. Ugotovili so makrocitno anemijo z retikulocitozo (hemoglobin (Hb) 60 g/L, povprečni volumen eritrocitov (PVE) 118 fL, število retikulocitov (Rt) 438xl09/L). Posamezni eritrociti so bili bazofilno punktirani. V serumu so bili prisotni kazalci povečane razgradnje eritrocitov: zvečana koncentracija nekonjugiranega bilirubina (celokupni bilirubin 125 umol/L, direktni 10 umol/L) in laktat dehidrogenaze (LDH 6,9 ukat/L) ter znižana koncentracija haptoglobina (0,1 g/L). Reakcija na hemosiderin v urinskem sedimentu je bila pozitivna.
V kostnem mozgu so ugotovili razrast celic rdeče vrste. Coombsov test je bil negativen, hladnih aglutininov pa ni bilo. Koncentracija železa v serumu je bila zvečana (Fe 54 umol/L, TIBC 67 umol/L). Koncentraciji folatov in vitamina B12 v serumu sta bili normalni. Na osnovi zgornjih izsledkov so zaključili, da ima bolnik Coombs negativno hemolitično anemijo. Začeli so zdravljenje z glukokortikoidi (metilprednizolon 64 mg/dan). Bolnik je prejemal tudi folno kislino. Ker zdravljenje ni bilo uspešno, so bolnika zaradi nadaljnih preiskav premestili na Klinični oddelek za hematologijo v Ljubljani.
Klinični izsledki so bili v času premestitve enaki kot v področni bolnišnici. Prav tako ni bilo bistvenih sprememb v rdeči krvni sliki (Hb 57 g/L, PVE 120 fL, Rt 474xl09/L, bazofilno punktirani eritrociti 1%). V krvni sliki je bila prisotna še trombocitopenija ter nevtrofilija z blagim pomikom v levo (trombociti (Tr) 78xl09/L, levkociti (L) 23><106/L, diferencialna krvna slika (DKS): metamielociti 3%, paličasti nevtrofilci 8%, segmentirani nevtrofilci 50%, eozinofilci 1%, bazofilci 5%, limfociti 21%, monociti 11%, normoblasti 1%). S citološko preiskavo kostnega mozga smo ugotovili razrast celic rdeče vrste z znaki diseritropoeze. Količnik med celicami granulocitne vrste in eritroblasti (G/E) je bil 1/1. Število megakariocitov ni bilo povečano. Delež blastov je bil ocenjen na 14% ne-eritroidnih celic (vse jedrne celice brez eritroblastov). Z reakcijo na železo smo ugotovili 8% prstanastih sideroblastov in siderocite. Količina železa je bila v makrofagih nekoliko povečana. Življenjska doba bolnikovih eritrocitov, ki so jih označili z Cr51, je bila skrajšana (t]/214 dni, normalno 24-32 dni). Tako označeni eritrociti so se v večji meri kopičili v vranici. Kasneje smo določili še življenjsko dobo svežih heterolognih eritrocitov. Razpolovna doba teh je bila normalna, brez znakov povečane razgradnje v vranici. Vrednosti kazalcev pospešene razgradnje eritrocitov ter izsledki Coombsovega testa in določitve hemo-siderina v urinskem sedimentu so bili podobni tistim iz področne bolnišnice. Aktivnost glukoza-6-fosfat dehidrogenaze (2,99 ukat/1012 eritrocitov) in delež Hb F (8,4%) v eritrocitih sta bila povečana. Elektroforeza Hb in delež Hb Aj sta bila normalna. Normalni so bili tudi izsledki testa ozmotske rezistence pred 24-urno inkubacijo in po njej, testa hemolize v izotonični raztopini glukoze in Hamovega testa ter testov za dokaz nestabilnih Hb (test provokacije Heinzovih telesc, propranololski test in test s segrevanjem). Proti-trombocitnih protiteles ni bilo. Ocenili smo, da gre pri bolniku za korpuskulamo hemolitično anemijo s sočasnimi spremembami v kostnem mozgu (povečan delež blastov, diseritropoeza), ki so značilne za mielo-displastični sindrom vrste III po FAB klasifikaciji (1). Bolnika smo zdravili s transfuzijami eritrocitov. Število levkocitov se je po opustitvi zdravljenja z glukokortikoidi normaliziralo.
Po odpustitvi iz bolnišnice je bolnik občasno prejemal transfuzije eritrocitov. Naslednjih deset mesecev v krvni sliki nismo opazili novih sprememb. Poleg anemije z retikulocitozo je bila ves čas prisotna blaga trombocitopenija. DKS je ostala nespremenjena. Od aprila 1996 dalje se je postopoma začelo zmanjševati število trombocitov. Hkrati so se v DKS pojavili tudi levkemični blasti (1-2%). Julija 1996 smo bolezen ocenili ponovno. Krvna slika je bila naslednja: Hb 86 g/L, PVE 104 fL, Rt 995*109/L, Tr 46xl09/L, L 6xl06/L, blasti 2%, mielociti 1%, paličasti nevtrofilci 9%, segmentirani nevtrofilci 49%, limfociti 30%, monociti 3%, eritroblasti 5%. Izsledek citološke preiskave kostnega mozga je ustrezal akutni mieloblastni levkemiji - AML-M6 po FAB. V ospredju je bila razrast rdeče vrste (G/E 1/16) in kopičenje hlastnih celic (48% ne-eritroidnih celic). S citogenetično preiskavo kostnega mozga smo ugotovili normalni kariotip brez vidnih kromosomskih sprememb. Ker bolnik ni imel večjih težav, se za zdravljenje s citostatiki ni odločil. Naslednjih enajst mesecev smo nadaljevali zdravljenje s transfuzijami eritrocitov. V krvi je postopoma naraščal delež blastov. Hkrati z zmanjševanjem učinkovite eritropoeza (padec števila retikulocitov) so znaki hemolize postajali manj izraziti. Povečevala se je trombocitopenija.
Zaradi začetka zdravljenja s citostatiki smo bolnika junija 1997 sprejeli v bolnišnico. V krvni sliki je bila anemija brez retikulocitoze, trombocitopenija in kopičenje blastov (Hb 86 g/L, Rt 77xl09/L, Tr 10xl09/L, L 52xl0s/L, blasti 54%). V kostnem mozgu so prevladovali blasti (80% vseh jedrnih celic). Glede na morfološke in imunološke značilnosti smo blaste opredelili za mieloblaste. Imunološki fenotip blastov je bil CD33*, cCD13*, mielo-peroksidaza*, HLA DR*, CD14-, glikoforin A-. Tudi tokrat s citogenetično preiskavo kostnega mozga nismo ugotovili kromosomskih sprememb. Zgornji izsledki so bili skladni s polno razvito AML-M2 po FAB. Odločili smo se za indukcijsko zdravljenje po shemi, ki jo priporočajo za starejše bolnike, tj. idarubicin 8 mg/m2 iv 3 dni, etopozid 60 mg/m2 iv 5 dni in ARA-C 200 mg/m2 iv 7 dni (2). Zdravljenje ni bilo uspešno. Tri tedne po zakjučku kemoterapije je bilo v kostnem mozgu še vedno 80% blastov.
Zaradi napredovanja bolezni smo oktobra 1997 poskusili še zdravljenje z velikimi odmerki citotostatikov (ARA-C 3 g/m2/12h iv 1-4 dan in mitoksantron 12 mg/m2 3-5 dan). Po obdobju aplazije smo tudi tokrat ugotovili kopičenje blastov v kostnem mozgu. Ocenili smo, da je levkemija odporna proti zdravljenju s citostatiki in da prihaja v poštev le simptomatično zdravljenje.
Teden dni po odpustu smo bolnika ponovno sprejeli v bolnišnico zaradi septičnega stanja. Zdravljenje z antibiotiki ni bilo uspešno in bolnik je teden dni po sprejemu umrl.
Razpravljanje
Pri MDS so praviloma v ospredju znaki odpovedi kostnega mozga (anemija, trombocitopenija, nevtropenija). Če so prisotni znaki hemolize, je treba upoštevati možnost sovpadanja dveh bolezni. Sočasnost podedovane hemolitične anemije z MDS pri našem bolniku ni verjetna, saj se je hemolitična anemija pri bolniku pojavila šele v 59. letu starosti, hkrati pa tovrstne anemije pri njegovih sorodnikih ni bilo. Tudi z laboratorijskimi preiskavami smo pogostejše podedovane hemolitične anemije izključili.
V	literaturi so opisani bolniki z MDS in AML s sočasno avtoimun-sko hemolitično anemijo (3, 4). Coombsov test je bil v nekaterih primerih negativen. Zdravljenje z glukokortikoidi je bilo uspešno
(4). Proti taki možnosti v našem primeru govori neuspešno zdravljenje z glukokortikoidi, predvsem pa normalna razpolovna doba transfundiranih heterolognih eritrocitov.
Paroksizmalna nočna hemoglobinurija (PNH) je pridobljena hemolitična anemija, ki v redkih primerih preide v AML. To je klon-ska bolezen z značilno napako v membrani. Posledica napake je povečana dovzetnost za litični učinek komplementa in intrava-skularna hemoliza. Če se razvije AML, izvirajo levkemični blasti iz PNH klona (5). Čeprav smo tudi pri našem bolniku ugotovili znake kronične intravaskulame hemolize (hemosiderin v urinu), ni imel drugih značilnositi za PNH (Hamov test).
Anemija je pri MDS pogosta, saj se jo ugotovi v več kot 85% (6). Praviloma je anemija posledica neučinkovite eritropoeze. V krvnem razmazu lahko ugotovimo nenormalno oblikovane eritrocite, npr. eliptocite, dakriocite, sferocite in shizocite. Pojavijo se lahko bazofilno punktirani eritrociti in normoblasti. Druge nepravilnosti eritrocitov, ki jih lahko ugotovimo pri MDS, so še povečana koncentracija Hb F, zmanjšana aktivnost nekaterih encimov, povečana občutljivost na komplement in sprememba antigenov krvnih skupin (6). Le v zelo redkih primerih je napaka v eritrocitih taka, da pripelje do hemolitične anemije. Kot vzrok hemolitične anemije pri MDS ali AML zaradi pridobljene napake so do sedaj opisali
1.	pridobljeno bolezen s Hb H in
2.	pridobljeno hudo pomanjkanje encima piruvat kinaze.
V	prvem primeru gre za pridobljen sindrom talasemije alfa (7). Zaradi zavore sinteze verig alfa se verige beta, ki so v prebitku, združijo v tetramer, imenovan Hb H. Ta je nestabilen in se obori. Nastali precipitati se pri supravitalnem barvanju prikažejo kot He~ inzova telesca. Ker pri našem bolniku ni bilo mikrocitoze niti Heinzovih telesc, menimo, da ni šlo za tovrstno napako. Pomanjkanje piruvat kinaze sodi med pogoste pridobljene napake eritrocitov pri MDS in AML. Ta napaka je prisotna v 1/3—1/2 primerov (8). Druge manj pogoste napake so pomanjkanje fosfo-fruktokinaze, bifosfoglicerat mutaze, adenilat kinaze in glukoza fosfat izomeraze (8). Pogosto je hkrati prisotnih več encimskih napak. Pridobljeno pomanjkanje encimov je zmerno. Aktivnost encima praviloma ni manjša od 50% normalne vrednosti, zato ne povzroča kliničnih ali hematoloških simptomov. Le v zelo redkih primerih je lahko pomanjkanje encimov take stopnje, da privede do nastanka hemolitične anemije. Naš primer je še najbolj podoben trem do sedaj objavljenim primerom s hemolitično anemijo zaradi pridobljenega hudega pomanjkanja encima piruvat kinaze in kasnejšim prehodom v AML (9-11). V opisanih primerih je bila hemolitična anemija ugotovljena približno leto dni pred preobrazbo v AML. Kromosomskih sprememb v celicah kostnega mozga niso ugotovili. V enem primeru so bili v kostnem mozgu prisotni tudi znaki diseritropoeze. Remisijo AML so dosegli le v enem primeru. Aktivnost piruvat kinaze pri našem bolniku žal nismo določili. Glede na podobnost z zgoraj omenjenimi primeri zato lahko le domnevamo, da je tudi v našem primeru morda šlo za pridobljeno pomanjkanje piiuvat kinaze.
Med spremljanjem bolezni smo opazovali postopen prehod od MDS v AML-M2. V začetnem obdobju AML, ko je bila eritropoeza še kompenzatorno povečana, je citološki izsledek kostnega mozga ustrezal FAB kriterijem za AML M6 (akutna eritrolevkemija). Zanjo ni značilno zelo povečano število retikulocitov v krvi, ki je znak povečanja učinkovite eritropoeze. Pri razlikovanju AML-M6 od drugih vrst AML, če je slednjim pridružena hemolitična anemija, so v pomoč tudi kazalci hemolize in odsotnost nekaterih za rdečo vrsto značilnih molekul (glikoforin A) na površini blastov.
Zaključek
Pridobljena korpuskularna hemolitična anemija je pri MDS in AML redek pojav. Vzrok za njen nastanek je pridobljeno hudo pomanjkanje encima piruvat kinaze ali pridobljena bolezen s Hb H. Pri razlikovanju od eritrolevkemije (AML M6) so v pomoč povečano število retikulocitov, znaki hemolize in odsotnost za rdečo vrsto značilnih molekul na površini levkemičnih blastov.
Literatura
1.	Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT et al. Proposed revised criteria of the classification of acute myeloid leukemia. A report of the French-American-British cooperative group. Ann Intern Med 1985; 103; 626-9.
2.	Leoni F, Ciolli S, Ginliani G et al. Attenuated-dose idarubicin in acute myeloid leukemia of elderly. Br J Haem 1995; 90: 164—74
3.	Tamura H, Ogata K, Yokose N et al. Autoimune hemolytic anemia in patients with de novo acute myelocytic leukemia. Ann Hematol 1996; 72: 45-7.
4.	Tamura S, Konya H, Miyazaki E et al. Coombs negative autoimune hemolytic anemia in patient with myelodysplastic syndrome. Rinsho Ketsueki 1991; 32: 132-6.
5.	Shichishima T, Terasawa T, Hashimoto C et al. Discordant and heterogeneous expression of GPI-anchored membrane proteins on leukemic cells in a patient with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Blood 1993; 81: 1855-62.
6.	Lichtman MA, Brennan JK. Myelodysplastic disorders. In: Beutler E, Lichtman MA. Coller BS, Kipps TJ eds. Williams Hematology. 5th ed. New York: McGraw-Hill, 1995: 257-72.
7.	Abbondanzo SL, Anagnou NP, Sacher RA. Myelodysplastic syndrome with acquired hemoglobin H disease. Evolution through megakarioblastic transformation into myelofibrosis. Am J Clin Pathol 1988; 89: 401-6.
8.	Kahn A. Abnormalities of erythrocyte enzyme in dyserythropoiesis and malignancies. Clinics in Haematology 1981; 10: 123-38.
9.	Ieki R, Miwa S, Fujii H, Kudoh S, Kimura H, Takaku F. Patient with pyruvate kinase deficiency developed acute myelogenous leukemia. Am J Hematol 1990, 34: 64-
8.
10.	Korenberg A, Goldfarb A. Preleukemia manifested by hemolytic anemia with pyruvate-kinase deficiency. Arch Intern Med 1986; 146: 786-6.
11.	Helmstadter V, Arnold H, Blume HG, Uhl N, Hunstein W. Acquired pyruvate kinase deficiency with hemolysis in preleukemia. Acta Haemat 1977; 57: 339-43-
Neupogen
filgrastim	H	G-CSF
PREDHODNO NAPOLNJENE INJEKCIJSKE BRIZGE
enkratno in preprosto
Neupogen veliko prispeva k zdravljenju raka. Pospešuje dvig števila nevtro-filcev po citotoksični kemoterapiji (1, 2) in izboljša možnosti za izvajanje celotne kemoterapije po predvidenem urniku (2-4). Zmanjša število infekcijskih zapletov in občutno izboljša kvaliteto življenja.
Pri posameznikih lahko prepreči nevtropenijo in infekcije, zaradi česar se ne razvijejo niti stres niti anksiozna stanja (5).
• Enkratna oblika zdravila z vsebnostjo G-CSF
• Pripravljen v korist bolnikov in zdravstvenih delavcev
Olajša uvajanje samozdravljenja
Literatura
ijša uporaba od dajanja zdravila z običajnimi injekcijami in ampulami
•	Prilagodljivost zaradi 30- in 48- milijoni I.E. odmerkov v predhodno napolnjenih injekcijskih brizgah
•	Preprosta uporaba in dajanje
1.	Crawford J, Ozer H, Stoller R in sod. New England Journal of Medicine 1991; 325: 164-170.
2.	Trillet-Lenoir V, Green J, Manegold C in sod. Europian Journal of Cancer 1993; 29A(3): 319-324.
3.	Pettengell R, Gurney H, Radford J in sod. Proceedings of the American Society of Clinical Oncology 1992; 11:319 (Abstract 1083).
4.	Gabrilove JL, Jakubowski A, Scher H in sod. New England Journal of Medicine 1988; 318: 1414-1422.
5.	Traynor B. Quality of life with filgastrim (r-metHuG-CSF). V. Filgastrim (r-metHuG-CSF) in Clinical Practice. Morstyn G, Dexter TM (eds). New York: Marcel Dekker 1994, pp 319-337-
¿MGEN <Whe)>
Strokovni prispevek/Professional article
ZDRAVLJENJE ČISTE APLASTIČNE ANEMIJE PRI BOLNIKU S KRONIČNO LIMFOCITNO LEVKEMIJO
TREATMENT OF PURE RED CELL APLASTIC ANEMIA IN PATIENT WITH CHRONIC
LYMPHOCYTIC LEUKEMIA
Mojca Bervar1, Peter Černelč2
1 Oddelek za bolezni srca, pljuč in ožilja, Splošna bolnišnica Celje, Oblakova 5, 3000 Celje 2 Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-03-24, sprejeto 1998-04-02; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl 1:1-47-9
Ključne besede: zdravljenje; ciklosporin,■ oksimetolon; metilpre-dnizolon; fludarabin
Izvleček — Izhodišča. Čista aplastična anemija (ČAA) je redek zaplet kronične limfocitne levkemije (KLL) inje posledica protitele-snega in celičnega zaviralnega delovanja na dozorevanje usmerjene matične celice rdeče vrste. Za zdravljenje CAA pri bolnikih s KLL najpogosteje uporabljamo učinkovine z zaviralnim delovanjem na imunski odziv, kot so glukokortikoidi, ciklosporin in pro-tilimfocitni globulin, redkeje pa androgene steroide.
Naš primer. 68-letnemu bolniku, ki se je tri leta zdravil zaradi KLL, smo marca 1996ugotovili ČAA. Zaradi razširjene KLL in neuspešnega zdravljenja s klorambucilom in metilprednizolonom smo ga začeli zdraviti s Jludarabinom. Po zdravljenju so se zmanjšale bezgavke in število limfocitov v krvi, medtem ko se anemija ni popravila. Na osnovi hude anemije, zelo zmanjšanega števila reti-kulocitov v krvi, odsotnosti celic rdeče vrste v kostnem mozgu in kopičenja limfocitov ob še ohranjeni granulopoezi in megakari-opoezi smo menili, da gre za ČAA. Ker se po zdravljenju s glukokortikoidi anemija ni popravila, smo začeli zdravljenje s ciklospo-rinom (Sandimmun Neoral) 200 mg/dan. Po mesecu dni se je povečalo število retikulocitov in koncentracija Hb do 100 g/L vendar, ker nadaljnega porasta nismo zasledili, smo ciklosporin ukinili in se odločili za zdravljenje z oksimetolonom (Anapolon) 100 mg/dan. Po enomesečnem zdravljenju seje povečalo število retikulocitov in koncentracija hemoglobina na 126 g/L, zato smo oksimetolon ukinili.
Zaključki. Ker se ČAA najpogosteje pojavi pri razširjeni KLL, je priporočljivo sočasno zdraviti KLL in ČAA. Slednje je pri našem bolniku potrdila dolga remisija ČAA po zdravljenju s ciklospori-nom in androgenimi steroidi ter KLL s jludarabinom.
Uvod
Čisto aplastično anemijo (ČAA) je prvi opisal ločeno od aplastične anemije Kaznelson leta 1922 (1). Za ČAA je značilna normokro-mna normocitna ali makrocitna anemija z zelo zmanjšanjim številom retikulocitov v krvni sliki in odsotnost samo celic rdeče vrste v kostnem mozgu. Granulopoeza in megakariopoeza sta v kostnem mozgu ohranjeni. Pri hudi aplastični anemiji je za razliko od ČAA v krvni sliki prisotna pancitopenija zaradi prizadetosti vseh treh vrst krvnih celic.
Keywords: therapy; cyclosporine; oxymetholone; méthylprednisolone; fludarabine
Abstract — Background. Pure red cell aplastic anaemia is a very rare complication of chronic lymphocytic leukaemia (CLL). It is probably caused by humoral and/or T lymphocytic interferance with the growth and differentiation of red cell precursors. Most patients with CLL-associated pure red cell aplastic anaemia are treated with immunosuppressive drugs, such as glucocorticoids, cyclosporine or antilymphocyte globulin, and less frequently with androgen steroids.
Case report. A 68-year-oldpatient with CLL developedpure red cell aplastic anaemia after 3 years of treatment with chlorambucil and méthylprednisolone. Because of advanced CLL, fludarabine was instituted. Two months later, the lymph nodes became smaller and the lymphocyte count decreased, but the anaemia and reticu-lopoenia persisted. The patient was given cyclosporine (Sandim-mun-Neoral) in a dose of200mg/day. After a month of this treatment, the reticulocyte count increased and the haemoglobin rise to 100g/L. As no further improvement was noted over the next month, cyclosporine was substituted with oxymetholone (Anapolon) 100 mg/day. After a month, the reticulocyte count increased, the haemoglobin reached 126g/L, and oxymetholone was withdrawn.
Conclusion. Since pure red cell aplastic anaemia mostly occus in association with advanced CLL, simultaneous treatment of both disorders is advisable. Our patient experienced a prolonged remission of the anaemia after treatment with a combination of cyclosporine, androgen steroids and fludarabine.
V klinični sliki prevladujejo težave zaradi anemije ter bledica kože in sluznic. Glede na začetek in potek ločimo akutno in kronično obliko ter prirojeno in pridobljeno ČAA. Akutna oblika se lahko pojavi pri sferocitozi, pridobljeni hemolitični anemiji, paroksizmalni nočni hemoglobinuriji, po nekaterih virusnih okužbah, kroničnih limfoproliferativnih boleznih in ob uživanju difenilhidantoina ali rifampicina (2). Značilno zanjo je, da mine po uspešnem zdravljenju osnovne bolezni ali ukinitvi zdravila. Usmerjeno zdravljenje anemije ni potrebno.
Čista aplastična anemija pri bolnikih s kronično limfocitno levkemijo (KLL) sodi med kronične pridobljene oblike te bolezni. Poleg KLL se lahko kronična oblika pojavi tudi pri sistemskem lupusu eritematozusu, revmatoidnem artritisu, kroničnem aktivnem he-patiitsu, hemolitični anemiji in timomu (3).
Nekateri avtorji menijo (4-6), da je čista aplastična anemija pri KLL povezana z nastankom protiteles proti usmerjeni matični celici rdeče vrste in eritropoetinu (4), lahko pa je tudi posledica pomno-žitve limfocitov T celic zaviralk v kostnem mozgu, ki naj bi zavirale razvoj celic rdeče vrste (4).
Ker so pri napredovali KLL prizadete vse tri celične vrste, slednje pa poslabša še zdravljenje s citostatiki, čisto aplastično anemijo pogosto težje prepoznamo. Pogostnost pojavljanja ČAA pri bolnikih s KLL ni natančno znana. Po nekaterih avtorjih (7) naj bi ČAA nastala pri 6% bolnikov z razširjeno KLL.
Prikazujemo bolnika z razširjeno KLL, pri katerem smo ugotovili ČAA in smo jo najprej neuspešno zdravili z metilprednizolonom, nato pa uspešno s ciklosporinom in oksimetolonom.
Prikaz primera
Potek bolezni
68-letnega bolnika, ki so mu v krvni sliki slučajno odkrili absolutno limfo-citozo, smo decembra 1993 pregledali v hematološki ordinaciji. Bolnik je bil brez težav, pri pregledu nismo ugotovili povečanih bezgavk v vratu, pazduhah in dimljah ter povečanih organov v trebuhu. V krvni sliki je bilo število limfocitov 26,8xl09/L, koncentracija hemoglobina 146 g/L, število retikulocitov 68xl09/L, število trombocitov 235xl09/L. Po izsledkih citološkega in histološkega pregleda kostnega mozga je bil ta izrazito hiperce-lularni kostni mozeg, odsotnost maščobe, odnos celic granulocitne vrste proti celicam rdeče vrste so bili 3:1, s kopičenjem malih limfocitov (več kot 80%) in še prisotnimi celicami rdeče vrste, granulociti in megakariociti. Menili smo, da gre za KLL.
Sprva bolnik ni potreboval zdravljenja. Avgusta 1994 smo ugotovili povečanje števila limfocitov v krvi do 118xl09/L. Zdraviti smo ga začeli s klo-rambucilom (Leukeran) 20 mg (10 mg/m2 telesne površine) na dan 5 dni. Zdravljenje smo ponovili dvakrat v presledku štirih tednov. Po zdravljenju se je število limfocitov zmanjšalo na 6l,lxl09/L. Po devetih mesecih smo ugotovili poslabšanje bolezni s potenjem, utrujenostjo in povečanjem bezgavk v vratu do velikosti lešnika ter vranice, ki je segala 2 cm pod levi rebrni lok. Ponovili smo dva kroga zdravljenja s klorambucilom. Zdravljenje je bilo neučinkovito. Pojavila se je anemija s koncentracijo hemoglobina 77 g/L in zmanjšanje števila retikulocitov na 5X109/L. Pričeli smo zdravljenje z metilprednizolonom (Medrol) 16 mg vsak drugi dan. Ker se po enomesečnem zdravljenju anemija ni popravila, število limfocitov pa se je povečalo na I68xl09/L, smo ponovili 5-dnevno zdravljenje s klorambucilom 20 mg dnevno in metilprednizolonom 32 mg dnevno. Ker je bilo tudi to zdravljenje neučinkovito, smo bolnika marca 1996 sprejeli na Hematološko kliniko.
Preiskave
Ob sprejemu smo ugotovili: število levkocitov 71,7xl09/L, število limfocitov 58,6xl09/L, število nevtrofilnih granulocitov 4,4xl09/L, število eritrocitov 2,38xl012/L, število retikulocitov 5xl09/L, koncentracija hemoglobina 74 g/L, PVE 93 fl, PHE 31,2 pg, število trombocitov 170xl09/L. Pri pregledu smo ugotovili hipercelularen kostni mozeg zaradi kopičenja pretežno malih limfocitov (98%), nekaj celic granulocitne vrste in megakariocitov. Celic rdeče vrste ni bilo. Izsledek je ustrezal razširejeni KLL. S histološkim pregledom kostnega mozga smo ugotovili difuzno infiltracijo z malimi limfociti. Coombsov test je bil negativen. Izsledki biokemičnih preiskav in proteinograma so bili v normalnem območju. Z UZ trebuha smo ugotovili žolčne kamne ter zmerno zvečano vranico in bezgavke ob trebušni aorti.
Zdravljenje
Zaradi razširjene KLL s hudo anemijo in neučinkovitega zdravljenja s klorambucilom in glukokortikoidi smo bolnika začeli zdraviti s fludarabinom (Fludara) 50 mg dnevno i.v. 5 dni in transfuzijami koncentriranih eritrocitov. Povečanih bezgavk in vranice štiri tedne po končanem zdravljenju nismo več otipali. Zaradi še prisotne hude normocitne normokromne anemije in zelo zmanjšanega števila retikulocitov v krvni sliki ter odsotnosti
celic rdeče vrste v kostnem mozgu smo menili, da ima bolnik poleg KLL še ČAA.
Zdraviti smo ga začeli s ciklosporinom (Sandimmun Neoral) 200 mg dnevno (3 mg/kg telesne teže). Povprečna koncentracija ciklosporina v krvi je bila 78 ug/L. Po enomesečnem zdravljenju se je koncentracija hemoglobina povečala za 20 g/L, število retikulocitov pa je bilo 50xl09/L. Ker smo po mesecu dni ugotovili ponovno poslabšanje anemije in zmanjšanje števila retikulocitov, smo poskusili zdravljenje z oksimetolonom (Anapolon) 100 mg dnevno. Po enomesečnem zdravljenju je porastlo število retikulocitov do 83xl09/L in koncentracija hemoglobina do 112 g/L. Dnevni odmerek oksimetolona smo nato razpolovili, po enem mesecu pa smo ga ukinili. Koncentracija hemoglobina se je povečala na 120 g/L, število retikulocitov pa je bilo 6lxl09/L. Remisija ČAA traja že 15 mesecev.
Razprava
Čeprav so že v 60 letih opisali ČAA pri bolnikih s KLL in menili, da je vzrok za njihov nastanek imunski, so šele v 90. letih s poizkusi in vitro to tudi potrdili (5). V serumu bolnikov s ČAA pri KLL so ugotovili specifična protitelesa proti matični celici rdeče vrste, pri nekaterih pa tudi protitelesa proti eritropoetinu (4-6). Poleg tega so dokazali povečano število limfocitov T celic zaviralk, za katere so menili, da imajo vlogo pri nastanku ČAA (2, 3, 5, 7).
Na osnovi teh ugotovitev se je zdravljenje čiste aplastične anemije pomembno spremenilo. Sprva so uporabljali klorambucil (2, 3) in ciklofosfamid (2, 3), zaradi neučinkovitosti in onkogenih neželenih učinkov pa so ju zamenjali za ciklosporin (2), glukokortikoide (2, 3, 5-7) in protilimfocitni globulin (2, 3, 6). Zdravljenje ČAA s slednjimi učinkovinami je uspešno v 60% (8). Opisani pa so tudi primeri učinkovitega zdravljenja s plazmaferezo (2).
Način delovanja ciklosporina pri ČAA ni povsem znan. Ciklosporin zmanjša proizvodnjo citokinov, kot sta interlevkin-2 in interfe-ron gama, za katera je znano, da zavirata eritropoezo (9). Poleg tega pa ciklosporin najverjetneje zmanjša tudi spremenjen klon limfocitov T, ki sodelujejo pri nastanku ČAA (10).
Androgeni steroidi, ki smo jih uporabljali pred tem, so izgubili svoj pomen. Danes jih uporabljamo pri vzdrževanju remisije po izboljšanju ČAA ali pa če niso učinkoviti drugi načini zdravljenja. Ugoden učinek androgenih steroidov so opisali tudi v kombinaciji s protilimfocitnim globulinom in metilprednisolonom pri zdravljenju aplastične anemije (6). Pri poizkusih in vitro so ugotovili, da pospešijo rast celičnih kolonij krvotvornih celic in zmanjšajo občutljivost na komplement (6).
Pri polovici bolnikov s ČAA se bolezen po nekaj mesecih poslabša, če zdravljenje prekinemo. Zato potrebujejo vzdrževalno zdravljenje z zdravilom, ki je bilo učinkovito. V primerih, ko zdravljenje z zdravili ni bilo uspešno ali pa je bilo le delno uspešno, pa zdravimo nadomestno s transfuzijami koncentriranih eritrocitov (2, 3).
Pri razširjeni KLL s hudo anemijo ali trombocitopenijo se običajno odločimo za zdravljenje s kombinacijo glukokortikoidov in klo-rambucila (2). Ker so bile pri našem bolniku v ospredju težave zaradi anemije, smo najprej poizkusili zdravljenje z metilprednisolonom, nato pa s kombinacijo slednjega s klorambucila, ki je bilo prav tako neuspešno. Zaradi tega smo bolnika s KLL začeli zdraviti s fludarabinom. Štiri tedne po zdravljenju nismo več otipali povečanih bezgavk in vranice, prisotna pa je še bila huda anemija. Začeli smo zdravljenje s ciklosporinom, ki ga danes običajno uporabljamo pri zdravljenju ČAA pri bolnikih s KLL (3-7). Zdravljenje s ciklosporinom je bilo uspešno le mesec dni, nato pa se koncentracija hemoglobina ni več povečevala. Zato smo ga zamenjali z oksimetolonom. Po enomesečnem zdravljenju se je rdeča krvna slika izboljšala, težave v zvezi z anemijo pa so prenehale.
Odmerek ciklosporina (3 mg/kg telesne teže na dan) bi sicer lahko po dvpmesečnem zdravljenju povečali, saj so v literaturi podatki o učinkovitih dnevnih odmerkih od 1-12 mg/kg (11, 12) oziroma koncentracijah ciklosporina v krvi, ki so večje od 100 ug/ L (13), ali pa poskusili zdravljenje s kombinacijo ciklosporina in eritropoetina (14). Daljše dajanje večjih odmerkov ciklosporina je
povezano z neželenimi pojavi, kot so zmanjšano delovanje ledvic, povečana verjetnost oportunističnih okužb in nevarnost nastanka drugih neoplazem (10).
Menimo, da je bilo zdravljenje s fludarabinom pomembno za zmanjšanje znakov razširjene KLL, nadaljnje zdravljenje s ciklo-sporinom in oksimetolonom pa za razrast celic rdeče vrste.
Zaključki
Čisto aplastično anemijo, ki se pojavi kot zaplet v poteku KLL, najpogosteje zdravimo z učinkovinami, ki delujejo zaviralno na imunski odziv, kot so glukokortikoidi, ciklosporin in protilimfo-citni globulin. Za zdravljenje z androgenimi steroidi se danes običajno odločimo v primerih, ko z drugimi zdravili ne dosežemo želenega učinka.
Ker se ČAA najpogosteje pojavi pri razširjeni KLL, je priporočljivo sočasno zdraviti KLL in ČAA. Slednje je potrdila dolga remisija ČAA pri našem bolniku po zdravljenju s ciklosporinom in androgenimi steroidi ter KLL s fludarabinom.
Literatura
1.	Kaznelson P. Zur Enstehung der Blut Plattchen. Verh Dtsch Ges Inn Med 1922; 34: 557.
2.	Erslev AJ. Pure red cell aplasia. In: Williams W, Bentler E, Erslev A J, Lichtman MA. Hematology. Fifth ed. New York: McGraw Hill, 1995: 448-53-
3.	Ammus SS, Yunis AA. Aquired pure red cell aplasia. Am J Hematol 1987; 24: 311-
26.
4.	Hocking W, Champlin R, Mitsuyasu R. Transient response of pure red cell aplasia to anti-thymocyte globulin in a patient with T-Cell chronic lymphocytic leukemia. Am J Hematol 1987; 24: 285-91.
5.	Kouides PA, Rowe JM. Large granular lymphocyte leukemia presenting with both amegakaryocytic thrombocytopenic purpura and pure red cell aplasia. Am J Hematol 1995; 49: 232-6.
6.	Bacigalupo A, Chaple M, Hows J, Van Lint MT, Mccanns AC. Treatment of aplastic anemia with antilymphocyte globulin and methylprednisolone with or without androgens; a randomised trial from EBMT SAA working party. Brith J Haematol 1993; 83: 145-51.
7.	Chikkappa G, Pasquale D, Zarrabi MH, Weiler RJ, Divakara M, Tsan MF. Cyclosporine and prednisone therapy for pure red cell aplasia in patients with chronic lymphocytic leukemia. Am J Hematol 1992; 41: 5-12.
8.	Lacy MQ, Kurtin PJ, Tafferi A. Pure red cell aplasia: asociation with large granular lymphocyte leukemia and the prognostic value of cytogenetic abnormalities. Blood 1996; 87: 3000-6.
9.	Kahan BD. Drug therapy-Cyclosporin. N Engl J Med 1991 ;79: 137-9-
10.	Sivakumaran M, Bhavnani M. Cyclosporin therapy for pure red cell aplasia in patients with chronic lymphocytic leukemia. AmJ Haematol 1994; 45: 192.
11.	Fujii T, Yajima T, Kameda H, Mimori T, Akizuki M, Ikeda Y. Successful treatment with cyclosporin A of pure red cell aplasia associated with rheumatoid arthritis. J Rheumat 1996; 23: 1803-5.
12.	Inokuchi K, Nakamura H, Tajika K, Hasegawa S. Pure red cell aplasia occurring 12 years after thymectomy: Successful treatment with cyclosporine. AmJ Hematol 1996; 53: 141.
13- Canavan B, Kim HC, Kosmin M, Maffei B, Saidi P. Pure red cell aplasia (PRCA): correlation of cyclosporin A concentrations and clinical response in refractory PRCA. Blood 1993; 82 (10, Suppl 1): 463a.
14. Cesana C, Carlo-Stella C, Mangoni L et al. Response to cyclosporin A and recombinant human erythropoietin in a case of B cell chronic lymphocytic leukemia and pure red cell aplasia. Leukemia 1996; 10: 1400-1.
Za mirno potovanje
skozi kemoterapijo
Navoban
tropisteron
•	preprečevanje slabosti in bruhanja pri emetogeni kemoterapiji
•	učinkovito zdravilo, ki ga odrasli in otroci dobro prenašajo
•	vedno 1-krat na dan
•	vedno 5 mg
Skrajšano navodilo za uporabo: Navoban® kapsule, Navoban® raztopina za injiciranje 2 mg in 5 mg. Serotoninski antagonist. Oblika in sestava: 1 trda kapsula vsebuje 5 mg tropisetronovega hidroklorida. 1 ampula po 2 ml vsebuje 2 mg tropisetronovega hidroklorida. 1 ampula po 5 ml vsebuje 5 mg tropisetronovega hidroklorida. Indikacije: Preprečevanje slabosti in bruhanja, ki sta posledici zdravljenja s citostatiki. Zdravljenje pooperativne slabosti in bruhanja. Preprečevanje pooperativne slabosti in bruhanja pri bolnicah, pri katerih je načrtovana ginekološka operacija v trebušni votlini. Odmerjanje in uporaba: Preprečevanje slabosti in bruhanja, ki sta posledici zdravljenja s citostatiki. Odmerjanje pri otrocih: Otroci starejši od 2 let 0,2 mg/kg telesne mase na dan. Največji dnevni odmerek ne sme preseči 5 mg. Prvi dan kot intravenska infuzija ali kot počasna intravenska injekcija. Od 2. do 6. dne naj otrok jemlje zdravilo oralno (raztopino v ampuli razredčimo s pomarančnim sokom ali koka kolo). Odmerjanje pri odraslih: 6-dnevna kura po 5 mg na dan. Prvi dan kot intravenska infuzija ali počasna intravenska injekcija. Od 2. do 6. dne 1 kapsula na dan. Zdravljenje in preprečevanje pooperativne slabosti in bruhanja: Odmerjanje pri odraslih: 2 mg Navobana z intravensko infuzijo ali kot počasno injekcijo. Glej celotno navodilo! Kontraindikacije: Preobčutljivost za tropisetron, druge antagoniste receptorjev 5-HT3 ali katerokoli sestavino zdravila. Navobana ne smemo dajati nosečnicam; izjema je preprečevanje pooperativne slabosti in bruhanja pri kirurških posegih, katerih del je tudi terapevtska prekinitev nosečnosti. Previdnostni ukrepi: Bolniki z nenadzorovano hipertenzijo; bolniki s prevodnimi ali drugimi motnjami srčnega ritma; ženske, ki dojijo; bolniki, ki upravljajo s stroji ali vozili. Medsebojno delovanje zdravil: Rifampicin ali druga zdravila, ki inducirajo jetrne encime. Glej celotno navodilo! Stranski učinki: Glavobol, zaprtje, redkeje omotica, utrujenost in prebavne motnje (bolečine v trebuhu in driska), preobčutljivostne reakcije. Zelo redko kolaps, sinkopa ali zastoj srca, vendar vzročna zveza z Navobanom ni bila dokazana. Način izdajanja: Kapsule: uporaba samo v bolnišnicah, izjemoma se izdaja na zdravniški recept pri nadaljevanju zdravljenja na domu ob odpustu iz bolnišnice in nadaljnjem zdravljenju. Ampule: uporaba samo v bolnišnicah. Oprema in odločba: Zloženka s 5 kapsulami po 5 mg; številka odločbe 512/B-773/97 z dne 10. 11. 1997. Zloženka z 1 ampulo po 2 ml (2 mg/2 ml); številka odločbe 512/B-772/97 z dne 10. 11. 1997. Zloženka z 10 ampulami po 5 ml (5 mg/5 ml); številka odločbe 512/B-771 /97 z dne 10. 11. 1997. Izdelovalec: NOVARTIS PHARMA AG, Basel, Švica. Imetnik dovoljenja za promet z zdravilom: NOVARTIS PHARMA SERVICES INC., Podružnica v Sloveniji, Dunajska 22, 1511 Ljubljana, kjer so na voljo informacije in literatura.
Preden predpišete Navoban, prosimo preberite celotno navodilo.
NOVARTIS
Strokovni prispevek/Professional article
DOLOČANJE ŠTEVILA RETIKULOCITOV V KRVI S SVETLOBNIM MIKROSKOPOM IN PRETOČNIM
CITOMETROM
NAJPRIMERNEJŠA KONCENTRACIJA TIAZOL ORANŽNEGA ZA PRETOČNI CITOMETER EPICS
PROFILE
RETICULOCYTE COUNTING BY MICROSCOPY AND FLOW CYTOMETRY
THE MOST ACCURATE CONCENTRATION OF THIAZOLE ORANGE FOR THE EPICS PROFILE FLOW CYTOMETRY
Irena Preložnik-Zupan
Klinični oddelek za hematologijo, SPS Interne klinike Zaloška, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-03-31, sprejeto 1998-04-07; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl 1:1-51-5
Ključne besede: število retikulocitov; svetlobni mikroskop;pretočni citometer; tiazol oranžno
Izvleček — Izhodišča. Število retikulocitov v krvi je klinično pomembno kot posredni kazalnik obsega nastajanja eritrocitov v kostnem mozgu. Določanje števila retikulocitov s svetlobnim mikroskopom je slabo ponovljivo in nenatančno. V zadnjem času so razvili avtomatične retikulocitne števce, ki omogočajo hitrejše in natančnejše štetje retikulocitov.
Metode. V nalogi smo primerjali določanje števila retikulocitov s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom EPICS Profile (Coidter). Za štetje retikulocitov s svetlobnim mikroskopom smo vzorce krvi obarvali z briljantnim krezilnim modrilom, za določanje s pretočnim citometrom pa s tiazol oranžnim barvilom (TO). Želeli smo ugotoviti, katera koncentracija TO je najprimernejša za pretočni citometer EPICS Profile. Izbirali smo med naslednjimi koncentracijami TO: 0,2 mg/L; 0,1 mg/L; 0,07 mg/L in 0,05mg/L.
Rezultati in zaključki. Najprimernejša koncentracija tiazol oranžnega barvila za štetje retikulocitov s pretočnim citometrom EPICS Profile je 0,1 mg/L. Izbrali smo jo na osnovi najboljše skladnosti rezultatov med svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom EPICS Profile, najmanjših razlik med rezultati, ki smo jih analizirali s parnim t-testom in ujemanja normalnih vrednosti zdravih odraslih krvodajalcev. Stopnja povezanosti med dvema načinoma določanja retikulocitov je bila dobra. Korelacijski koeficient (r) je bil med 0,82 in 0,87. Povprečna koeficienta variacije štetja retikulocitov s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom EPICS Profile sta bila 27,5% in 8,4%.
Uvod
Retikulociti so prehodna stopnja v razvoju celic rdeče vrste med normoblasti z jedri in zrelimi eritrociti. Pri panoptičnem barvanju so nekoliko modro rožnati (polikromazija). Pri supravitalnem barvanju se ostanki ribosomov prikažejo kot mrežica ali posamezna zrnca. Zaradi natančnosti pri ločevanju retikulocitov od zrelih eritrocitov so v zgodnjih 80-ih letih objavili definicijo retikulocitov (1, 2). Retikulociti so celice rdeče vrste brez jedra, ki imajo po
Key words: reticulocyte count; microscopy; flow cytometry; thi-azole orange
Abstract — Background. The reticulocyte count is a clinically important indirect indicator of erythropoietic activity in patients. However, determination of the reticulocyte count using a light microscope has low accurracy and reproducibility rates. Recently, automated reticulocyte counters have been developed, which allow fora more rapid and accurate counting of reticulocytes.
Methods. In our study, we compared the following methods for reticulocyte count determination: the microscopic brilliant cresyl blue method and flow cytometric EPICS Profile (Coulter) method using thiazole orange (TO). The purpose of the study was following: to select the most suitable TO concentration to be used with the EPICS Profile cytometer. The following TO concentrations were used: 0.2 mg/L, 0.1 mg/L, 0.07 mg/L and 0.05 mg/L.
Results and conclusions. The most appropriate TO concentration for counting reticulocyte by the EPICS Profile is 0.1 mg/L. The concentration was selected according to the following criteria: good agreement of the results obtained by microscopy with the results yielded by the EPICS Profile cytometer, absence of statistically significant differences between the results, and agreement in the normal ranges. There was a good correlation between the methods studied. The correlation coefficient (r) ranged from 0,82 and 0,87. The mean intra-assay coefficients of variation for determination by light microscopy and EPICS Profile cytometer was 27.5% and 8.4% respectively.
barvanju z novim metilenskim modrilom ali briljantnim krezilnim modrilom dva ali več modrih zrnc.
Število retikulocitov v krvi je posredni kazalnik obsega nastajanja eritrocitov (učinkovita eritropoeza) v kostnem mozgu (1, 3-7). Omogoča nam razlikovanje anemij zaradi zmanjšane proizvodnje eritrocitov od anemij zaradi zvečane razgradnje ali izgube eritrocitov, oceno uspešnosti zdravljenja anemij, oceno obnovitvene sposobnosti kostnega mozga po zaviralnem delovanju zdravil in presaditvi kostnega mozga, oceno učinkovitosti spodbujanja eritro-
poeze z eritropoetinom v primeru anemije pri kronični ledvični odpovedi, revmatoidnem artritisu, raku in po presaditvi kostnega mozga (8).
V	večini laboratorijev še danes uporabljajo običajni način prikaza in štetja retikulocitov s svetlobnim mikroskopom (1, 7, 9, 10-11). Metoda je slabo zanesljiva. Koeficient variacije znaša po podatkih v literaturi med 25 in 48% (1). Glavni viri napak izhajajo iz majhnega vzorca preštetih celic, različne porazdelitve retikulocitov v razmazu, razlik med laboratorijskimi tehniki pri štetju in morfološki identifikaciji celic.
Sodobnejša metoda za proučevanje fizikalnih in kemičnih lastnosti celic je pretočna citometrija (12, 13). V laboratoriju Hematološke klinike smo do nedavnega uporabljali za štetje retikulocitov v krvi pretočni citometer EPICS Profile (Coulter). Oceno retikulocitov s pretočnim citometrom nam omogočajo fluorescenčna barvila. Danes največ uporabljajo tiazol oranžno in auramin oranžno. Prisotnost RNK v retikulocitih omogoča njihovo ločevanje od zrelih eritrocitov. Načinov barvanja vzorcev krvi s tiazol oranžnim barvilom je več. Laboratoriji, ki imajo pretočne citometre tovarne Bec-ton Dickinson, običajno uporabljajo tovarniško pripravljen reagent Retic-COUNT. Drugi priredijo način barvanja svojemu pretočnemu citometru (14). Pretočni citometer šteje s hitrostjo več sto celic na sekundo. Z njim preštejemo v povprečju od 30.000 do 50.000 celic v vzorcu. Zaradi tega so natančnejši in ponovljivejši rezultati zlasti pri vzorcih z majhnim številom retikulocitov (15-17).
V	nalogi smo primerjali štetje retikulocitov s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom EPICS Profile (Coulter Corporation) ter uporabo različnih koncentracij tiazol oranžnega. Želeli smo ugotoviti:
-	katera koncentracija tiazol oranžnega je najprimernejša za pretočni citometer EPICS Profile,
-	kakšna je korelacija med vrednostmi retikulocitov istega vzorca s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom.
Preiskovanci in načini dela
V	raziskavo smo vključili 103 vzorce krvi bolnikov in zdravih krvodajalcev. Od tega je bilo 33 zdravih krvodajalcev in 70 bolnikov (36 z zvečanim in 34 z zmanjšanim številom retikulocitov v krvi).
Med preiskovanci z zvečanim številom retikulocitov v krvi so bili bolniki s hemolitično anemijo, anemijo po akutni krvavitvi, mega-loblastno anemijo med zdravljenjem z B12 in pravo policitemijo po venepunkcijah.
Med preiskovanci z zmanjšanim številom retikulocitov so bili bolniki z akutno levkemijo neposredno po zdravljenju s citostatiki. Uporabili smo ostanke vzorcev venske krvi, ki so jo odvzeli zaradi rutinskega pregleda krvne slike. Če smo opravili analizo retikulocitov v šestih urah po odvzemu, smo shranjevali vzorce na sobni temperaturi, sicer smo jih shranili do 24 ur v hladilniku pri temperaturi +4°C (18, 19).
Priprava vzorcev krvi za štetje s svetlobnim mikroskopom
V	laboratoriju Hematološke klinike štejemo retikulocite s svetlobnim mikroskopom 01ympus BH2. Za prikaz retikulocitov uporabljamo bazično supravitalno barvilo briljantno krezilno modrilo. Raztopino barvila pripravimo iz 1 g barvila in 100 ml citratne fiziološke raztopine. V epruveto nato odpipetiramo 100 pL reagenta in 100 pL venske krvi z EDTA. Vzorce inkubiramo 15-20 minut pri 37°C. Nato napravimo razmaze in jih pregledamo s svetlobnim mikroskopom, z imerzijsko (pri nas 1000-kratno) povečavo. Poiščemo predele, kjer se eritrociti ne prekrivajo in ne dotikajo ter preštejemo število retikulocitov na 1000 eritrocitov. Izsledke izrazimo z absolutnim številom retikulocitov, ki ga dobimo tako, da relativno število retikulocitov pomnožimo s številom eritrocitov v istem vzorcu.
Retikulocite v razmazih je štel izkušeni laboratorijski tehnik, ki to delo redno opravlja.
Določanje števila retikulocitov s pretočnim citometrom
Pretočni citometer smo uravnali na naslednje vrednosti: 488 nm zračno hlajeni argonski laser z močjo 15 mW, filter z delovnim območjem valovne dolžine 525 nm pred detektorjem fluorescence in hitrostjo pretoka skozi pretočno celico 32 mml/min. Isoton II smo uporabljali kot hladilno raztopino. Celice rdeče vrste smo osamili s pomočjo ocene celic na prednjem osvetljevalcu (FS -forward scatter) proti stranskemu osvetljevalcu (LSS - side scatter [log]). Za štetje odvzame aparat 100 pl vzorca in prešteje 30.000 celic na vzorec.
Osnovno raztopino tiazol oranžnega smo pripravili iz 1 mg tiazol oranžnega barvila, ki smo ga raztopili v 1 ml absolutnega metanola. To raztopino smo hranili v temi v zamrzovalniku pri -20°C. Iz nje smo vsak dan pripravili sveže delovne raztopine barvila. Vsak vzorec smo obarvali s štirimi raztopinami z različno razredčitvijo tiazol oranžnega barvila: 1:5.000, 1:10.000, 1:15.000, 1:20.000, ki smo jih pripravili iz osnovne raztopine tiazol oranžnega (1: 5.000 = 0,2 mg/L = 4,19xlCr7 mol/L, 1:10.000 = 0,1 mg/L = 2,10xl0"7 mol/L, 1:15.000 = 0,07mg/L = l,40xl0"7 mol/L, 1:20.000 = 0,05mg/L = l,05xl0-7 mol/L).
Za vsak vzorec krvi smo vzeli dve plastični epruveti 12x75 mm. Eno smo uporabili za vzorec z barvilom, drugo za neobarvano kontrolo. Z neobarvano kontrolo smo določili spodnji in zgornji prag fluorescence. S spodnjo nastavitvijo praga izločimo 99,9% avtofluorescence eritrocitov. Nastavitev zgornjega fluorescenčnega praga je potrebna zaradi izključitve levkocitov ali normobla-stov iz območja fluorescence retikulocitov. Pri analizi obarvanega vzorca krvi je ostala lega pragov nespremenjena. Med retikulocite smo uvrstili vse celice z večjo intenzivnostjo fluorescence, kot je bila autofluorescenca eritrocitov oz. vse celice, ki so se pojavile na desni strani spodnjega praga fluorescence in levo od zgornjega praga fluorescence.
Določitev najprimernejšega časa inkubacije s tiazol oranžnim
Uporabili smo 9 naključno izbranih vzorcev z različnim številom retikulocitov. Pripravili smo jih po zgoraj opisanem navodilu. Vzorce smo inkubirali v temi, na sobni temperaturi, v časovnem intervalu od 30 do 240 min. Določili smo najprimernejši čas inkubacije.
Določitev ponovljivosti oz. natančnosti načinov določanja števila retikulocitov
Določili smo ponovljivost oz. natančnost štetja retikulocitov s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom na treh različnih vzorcih (z normalnim, zvečanim in zmanjšanim številom retikulocitov). Vsakemu od treh vzorcev smo 10 krat zaporedoma določili število retikulocitov. Nato smo izračunali koeficient variacije (KV), ki je izražen v odstotkih: KV% = (standardna deviacija/aritmetična sredina)xl00.
Statistično vrednotenje podatkov
Uporabili smo statistični program Statistics for Windows (StatSoft™). Pred pričetkom analize smo spremenljivke z asimetrično porazdelitvijo pretvorili in s tem zmanjšali asimetrijo na sprejemljivo raven (»skewness« < 2 in > -2). Prevedli smo naslednje spremenljivke: vrednosti retikulocitov v% obarvanih z briljantnim kre-zilnim modrilom = log (x - 0,2), vrednosti retikulocitov v % obarvanih z Retic-COUNT = log x, vrednosti retikulocitov obarvanih s tiazol oranžnim v vseh različnih koncentracijah = log x. Normalnost porazdelitve smo nato preverili še z Kolmogorov-Smimovim testom. Korelacijo med rezultati smo izrazili s koeficientom korelacije po Pearsonu. Pri ugotavljanju statistično pomembnih razlik med dvema sküpinama smo uporabili t-test za odvisne vzorce. Razlike med rezultati smo ocenjevali kot statistično značilne pri vrednosti p < 0,05.
INKUBACIJSKI ČAS OD 0 DO 240 MINUT
RETIKULOCITI V % OBARVANI Z RETIC COUNT
MIN_0 MIN_30 MIN_60 MIN_90 MIN_120 MIN_240
LOG_0_2 vs. LOG_10%
11 i i i i i i i i i i i i i_iiii'__i ii i -j_i-j
-2-101234
LOG_0_2
Regression 95% confld. ■d.
Sl. 1. Določitev najprimernejšega časa inkubacije. Prikaz štirih vzorcev z različnim številom retikulocitov. Na vodoravni osi je prikazan čas inkubacije v minutah, na navpični osi so prikazani retikulociti v odstotkih.
Fig. 1. Determination of the optimal incubation time. There are four samples with different reticulocite count. Vertical scale represents incubation time in minutes, horizontal scale representes reticulocyte count in percentiles.
Rezultati
Določitev najprimernejšega časa inkubacije vzorcev s tiazol oranžnim za določanje števila retikulocitov s pretočnim citometrom
Opazili smo, da se število retikulocitov v času od 30 do 60 min po obarvanju s tiazol oranžnim barvilom še zmerno zveča, po 60 minutah se ustali, po 120 minutah pa se prične počasi zmanjševati (sl. 1.). Izbrali smo inkubacijski čas 60 min.
Sl. 2. Primerjava rezultatov, ki smo jih dobili s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom EPICS Profile pri koncentraciji tiazol oranžnega 0,1 mg/L. Koeficient korelacije (r) je bil 0,87. LOG 10%- logaritmirane vrednosti, ki smo jih dobili s pretočnim citometrom pri razredčitvi tiazol oranžnega 1:10000 oz. koncentraciji 0,1 mg/L; LOG 0-2- log (relativnih vrednosti retikulocitov s svetlobnim mikroskopom -0,2).
Fig. 2. Comparison of the results from microscopy and flow cytometry at thiazole orange concentration 0,1 mg/L. The coefficient of correllation (r) was 0,8 7. LOG 10%- log value got byflow cytometry in dilution of thiazole orange 1:1000 (cone. 0,1 mg/L); LOG 0-2-log (relative value of reticulocytes got by microscopy- 0,2).
prikazane v tabeli 2. Vidimo, da se rezultati statistično pomembno ne razlikujejo pri primerjavi svetlobnega mikroskopa in pretočnega citometra EPICS Profile s koncentracijami TO 0,1 mg/L in 0,07 mg/ L. Lahko rečemo, da so skoraj skladni. V drugih dveh primerih so razlike statistično pomembne pri p < 0,05.
Določitev najprimernejše koncentracije tiazol oranžnega za pretočni citometer EPICS Profile
Pri primerjavi rezultatov pretočnega citometra EPICS Profile in svetlobnega mikroskopa smo dobili koeficiente korelacije (r), ki so prikazani v tabeli 1.
Tab. 1. Koeficienti korelacije (r) med rezultati štetja retikulocitov s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom. EPICS Profile -pretočni citometer EPICS Profile; TO- tiazol oranžno; r-Pearsonov korelacijski koeficient.
Tab. 1. Correlation coefficients between the results of microscopy and flow cytometry reticulocyte counting. EPICS Profile - EPICS Profile flow cytometry.
X	y	r
Mikroskop	EPICS Profile; 0,2mg/L TO	0,82
Mikroskop	EPICS Profile; 0,lmg/L TO	0,87
Mikroskop	EPICS Profile; 0,07mg/L TO	0,85
Mikroskop	EPICS Profile; 0,05mg/L TO	0,83
Ocena ponovljivosti štetja retikulocitov s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom
Povprečni koeficient variacije za štetje s svetlobnim mikroskopom znaša 27,5% (10% pri zvečanem, 23,6% pri normalnem in 49% pri zmanjšanem številu retikulocitov) in za pretočni citometer EPICS Profile 8,4% (3,3% pri zvečanem, 7,4% pri normalnem in 14,6% pri zmanjšanem številu retikulocitov v krvi).
Določitev statistične pomembnosti razlik med rezultati posameznih skupin
S t-testom za odvisne vzorce smo določili statistično pomembnost razlik med rezultati po posameznih skupinah. Vse vrednosti t so
Tab. 2. Prikaz rezultatov t-testa za odvisne vzorce med skupinami rezultatov. Log (ret BKM% -0,2) - rezultati štetja s svetlobnim mikroskopom; Log TO - rezultati štetja s pretočnim citometrom EPICS Profile pri različnih koncentracijah TO.
Tab. 2. Results of paired t-test. Log (ret BKM% - 0,2) - results of reticulocyte counting by microscopy; Log TO- results of reticulocyte counting by EPICS Profileflow cytometry at different concentration
of TO.
T-test za odvisne vzorce Razlike so statistično pomembne pri p < 0,05	
spremenljivki	vrednost t
Log (ret BKM% -0,2) - Log TO5%	-3,3
Log (ret BKM% -0,2) - Log TO10%	-0,4
Log (ret BKM% -0,2) - Log T015%	1,3
Log (ret BKM% -0,2) - Log TO20%	3,1
Normalne vrednosti pri zdravih odraslih krvodajalcih
Iz 33 vzorcev krvi zdravih odraslih krvodajalcev smo izračunali normalne vrednosti ter območje normalnih vrednosti. Rezultate smo prikazali v tabeli 3-
Razpravljanje
Klinični pomen določanja števila retikulocitov je velik. Omogoča oceno učinkovite eritropoeze in nam je v pomoč pri opredelitvi anemij (20, 21). Spremljanje zdravljenja anemij ter obnove kostnega mozga po zaviralnem delovanju zdravil in presaditvi kostnega mozga pa zahtevajo vedno večjo stopnjo natančnosti pri oceni števila retikulocitov zlasti v območju zmanjšanega števila le teh.
Tab. 3. Normalne vrednosti števila retikulocitov v relativnih in absolutnh številh. SD - standardna deviacija; EP1CS Profile -pretočni citometer EP1CS Profile.
Tab. 3. Normal ranges of the reticulocyte counts in relative and absolute values. SD - standard deviation; EPICS Profile - EPICS Profile flow cytometry
Število retikulocitov Način štetja	%	abs. vrednosti (x 109/L)
Mikroskop - srednja vrednost	1,4	64
- SD	0,45	21
— območje	0,5-2,3	22-106
EPICS Profile - srednja vrednost	1,5	68
- SD	0,5	27
- območje	0,5-2,5	14-122
V	večini laboratorijev še vedno uporabljajo tradicionalno metodo štetja retikulocitov s svetlobnim mikroskopom. Leta 1985 je izšel predlog za standardizacijo supravitalnega barvanja retikulocitov z novim metilenskim modrilom, ki je po mnenju več avtorjev (11, 22) primernejše za prikaz retikulocitov kot briljantno krezilno modrilo. Slabosti svetlobne mikroskopije, kot so majhno število preštetih celic, velike razlike med laboratorijskimi tehniki pri štetju retikulocitov, različna definicija retikulocitov razvojne stopnje IV po Heilmeyerju in vključki v eritrocitih, ki prispevajo k zmanjšanju natančnosti metode, pa so nas prisilile, da smo do izsledkov kritični (7, 10). Koeficient variacije, s katerim ocenjujemo ponovljivost in natančnost metode, znaša 25-30% za normalno število retikulocitov (23), pri zmanjšanju števila retikulocitov pa je ustrezno večji. To je slabost vseh t.i. »ročnih« tehnik štetja.
V	80. letih se je pričel razvoj pretočne citometrije in fluorescenčnih barvil, ki je omogočil mnogim kliničnim laboratorijem poleg drugih novosti tudi določanje števila retikulocitov z večjo natančnostjo in ponovljivostjo (12). Med fluorokromi se je za štetje retikulocitov uveljavil zlasti tiazol oranžno barvilo, ki dobro prehaja skozi celične membrane in se močno veže z nukleinskimi kislinami (21, 24). Rezultati določanja števila retikulocitov s pretočnim citometrom so bili primerljivi s svetlobnim mikroskopom (14). Najnatančnejše rezultate so v zadnjem času dobili s pretočnimi citometri R 1000 in R 3000 (TOA Medical Electronics) (25, 26).
Zaenkrat razen prikaza RNK v retikulocitih ne poznamo drugega objektivnega kriterija za ločevanje retikulocitov. Pomanjkljivosti določanja števila retikulocitov s pretočnim citometrom in uporabo fluorokromov je v tem, da nobeno barvilo ni specifično za RNK, enako dobro se veže tudi na DNK. Največji razlog za razlike med rezultati različnih metod je zato najverjetneje interferenca z drugimi celicami (27). Posebej moteči so zvečano število levkocitov (npr. mali limfociti v primeru kronične Emfatične levkemije), gigantski trombociti, normociti in Howell-Jollyjeva telesca v eritrocitih (28). Zato je priporočljivo v teh primerih preveriti število retikulocitov s svetlobnim mikroskopom (29).
V	zadnjem času so pri firmi Coulter razvili polavtomatsko metodo določanja števila retikulocitov. V rutinske hematološke analizatorje so vgradili pretočno celico in uporabili tehniko pretočne citometrije, ki omogoča poleg drugih vrednosti krvne slike tudi določanje števila retikulocitov. Za barvanje RNK v retikulocitih so uporabili supravitalno barvilo novo metilensko modrilo. Aparat prešteje največ 32000 celic in jih analizira v približno 30 sekundah. Morda bo ta metoda dostopnejša večjemu številu kliničnih laboratorijev. Z namenom določiti najprimernejšo koncentracijo barvila tiazol oranžno za določanje števila retikulocitov s pretočnim citometrom EPICS Profile smo v laboratoriju Hematološke klinike vzorce krvi najprej obarvali s tovarniško pripravljeno raztopino barvila tiazol oranžno Retic-COUNT in določili število retikulocitov s pretočnim citometrom EPICS Profile. Rezultate smo primerjali z rezultati štetja s svetlobnim mikroskopom. Vrednosti, ki smo jih dobili s pretočnim citometrom, so bile v povprečju polovico manjše od vrednosti, ki smo jih dobili s svetlobnim mikroskopom (mediana pri
100 vzorcih, pregledanih s svetlobnim mikroskopom, je bila 1,4%, pri istih vzorcih s pretočnim citometrom pa 0,8%). To ni bilo v skladu s podatki v literaturi, ki navaja, da so vrednosti retikulocitov s pretočnim citometrom v povprečju večje kot s svetlobnim mikroskopom (18), ker s pretočnim citometrom zajamemo tudi najbolj zrele retikulocite (razvojna stopnja IV po Heilmeyerju), ki jih laboratorijski tehnik pri štetju s svetlobnim mikroskopom lahko izpusti. Sklepali smo, da barvilo Retic-COUNT™ (Becton Dic-kinson) ni primerno za določanje števila retikulocitov s pretočnim citometrom EPICS Profile (Coulter). Nato smo preizkusili različne koncentracije barvila tiazol oranžno, ki smo jih pripravili iz suhe snovi tiazol oranžnega barvila in določili najprimernejšo koncentracijo za pretočni citometer EPICS Profile. Največjo skladnost rezultatov smo dosegli med svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom EPICS Profile pri koncentraciji tiazol oranžnega barvila 0,1 mg/L (razredčitev matične raztopine tiazol oranžnega 1:10000). Koeficient korelacije, ki je merilo za stopnjo povezanosti, je bil pri tej koncentraciji največji in je znašal 0,87 (tab. 1). Rezultate smo ocenili tudi s parnim t-testom, kjer ocenjujemo razlike med obema podatkoma v posameznem paru. Ugotovili smo, da so razlike najmanjše med rezultati svetlobnega mikroskopa in pretočnega citometra EPICS Profile pri koncentraciji tiazol oranžnega 0,1 mg/L (tab. 2). Nekoliko večje, vendar še vedno statistično nepomembne so bile razlike pri primerjavi rezultatov med svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom EPICS Profile pri koncentraciji tiazol oranžnega barvila 0,07 mg/L (tab.
2). V drugih primerih so bile razlike med rezultati večje. Skladnost rezultatov smo potrdili tudi z določitvijo normalnih vrednosti pri 33 zdravih odraslih krvodajalcih. Normalne vrednosti so si bile najbližje pri primerjavi rezultatov štetja s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom EPICS Profile pri koncentraciji tiazol oranžnega barvila 0,1 mg/L.
Za vsako metodo smo določili ponovljivost oziroma natančnost štetja retikulocitov, ki smo jo izrazili s koeficientom variacije. Vzeli smo tri naključne vzorce krvi, enega v normalnem, drugega v zmanjšanem in tretjega v zvečanem območju števila retikulocitov. Vsakemu smo desetkrat zapored določili število retikulocitov na vsakem aparatu. Pri štetju s svetlobnim mikroskopom smo dobili koeficient variacije 10% pri zvečanem, 23,6% pri normalnem in 49% pri zmanjšanem število retikulocitov. Povprečen koeficient variacije je bil 27,5%. Naši podatki so bili podobni tistim v literaturi (14, 23). Štetje retikulocitov s svetlobnim mikroskopom je torej še posebej neprimerno ravno v območju zmanjšanega števila retikulocitov zaradi slabe ponovljivosti rezultatov.
Manjši koeficient variacije smo dobili pri določanju števila retikulocitov s pretočnim citometrom. Pri štetju s pretočnim citometrom EPICS Profile je bil povprečen koeficient variacije 8,4% (med 3,3% in 14,6%, glede na število retikulocitov). Rezultati so primerljivi s tistimi v literaturi (30), kjer navajajo koeficient variacije, manjši od 12% za različne pretočne citometre.
Normalne vrednosti retikulocitov v krvi in območje normalnih vrednosti smo določili iz 33 vzorcev krvi zdravih odraslih krvodajalcev (tab. 3). Vrednosti niso referenčne zaradi premajhnega števila vzorcev krvi zdravih odraslih prostovoljcev. Za način določanja s svetlobnim mikroskopom je bilo območje normalnih vrednosti 22-106x109/L, za pretočni citometer EPICS Profile pri koncentraciji tiazol oranžnega barvila 0,1 mg/L je bilo območje 14-122xl09/L. Tudi v literaturi (27) navajajo večje vrednosti retikulocitov v krvi zdravih odraslih oseb pri določanju s pretočnim citometrom FACScan in barvilom Retic-COUNT. Možni vzroki so opisani zgoraj.
Na devetih naključno izbranih vzorcih krvi z različnim številom retikulocitov smo določili najprimernejši inkubacijski čas tiazol oranžnega barvila za določanje števila retikulocitov s pretočnim citometrom (sl. 1). Po obarvanju so se vrednosti retikulocitov od 30 do 60 minut še zmerno zvečevale, medtem ko so se po 120 minutah pričele zmanjševati. Ustalitev števila retikulocitov, ki ga dobimo med 60 ih 120 minutami po obarvanju, nam omogoča, da z analizo vzorcev ne hitimo in kljub temu dobimo dovolj natančne
rezultate. To je dobra lastnost tiazol oranžnega barvila za razliko od nekaterih drugih fluorokromov, npr. tioflavina T, ki zahteva takojšnje odčitanje rezultatov po končani inkubaciji, ker je po razredčitvi nestabilen (31). Za določanje retikulocitov s pretočnim citometrom smo izbrali čas 60 minut oz. začetek ustalitve števila retikulocitov. Ta inkubacijski čas največkrat uporabljajo tudi drugi
(32).
Poleg inkubacijskega časa je zelo pomemben tudi čas shranjevanja neobarvanih vzorcev krvi, ki ga v naši nalogi nismo ocenjevali, temveč smo podatke povzeli iz literature (18, 19, 21). Običajno dopuščajo shranjevanje vzorcev krvi do 48 ur. Razlike v rezultatih niso statistično pomembne, če so vzorci shranjeni v hladilniku pri 4°C. Kadar pa so vzorci shranjeni pri sobni temperaturi nastanejo spremembe števila retikulocitov. Nekateri avtorji opisujejo zmerno zmanjšanje števila retikulocitov po 24 urah in ga razložijo s postopnim dozorevanjem retikulocitov in izgubo RNK. Drugi opisujejo zmeren porast števila retikulocitov po 24 urah, ki ga razložijo z večjo stabilnostjo membrane retikulocitov kot eritrocitov, ki hitreje hemolizirajo ali pa se poveča prepustnost membrane eritrocitov, ki povzroči nespecifično obarvanje eritrocitov (33).
Klinična uporabnost raziskave
Določili smo najprimernejšo koncentracijo tiazol oranžnega barvila in optimalni inkubacijski čas za štetje retikulocitov s pretočnim citometrom EPICS Profile. Pri štetju retikulocitov s svetlobnim mikroskopom priporočamo uporabo supravitalnega barvila novega metilenskega modrila. Določanje števila retikulocitov s pretočnim citometrom se najverjetneje ne bo uveljavilo v rutinskem kliničnem delu, temveč ga bo nadomestila metoda določanja števila retikulocitov s hematološkim analizatorjem.
Zaključki
Pri primerjavi določanja števila retikulocitov v krvi s svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom smo prišli do naslednjih pomembnih ugotovitev:
1.	najprimemeša koncentracija tiazol oranžnega za štetje retikulocitov s pretočnim citometrom EPICS Profile je 0,1 mg/L. Izbrali smo jo na osnovi najboljše skladnosti rezultatov, ki smo jih dobili med svetlobnim mikroskopom in pretočnim citometrom EPICS Profile, najmanjših razlik med rezultati, ki smo jih ocenili s parnim t-testom in ujemanja normalnih vrednosti zdravih odraslih krvodajalcev;
2.	stopnja povezanosti med vrednostmi retikulocitov istega vzorca dobljenimi s svetlobnim mikroskopom in dvema pretočnima citometroma je dobra v vseh primerih. Najboljša korelacija je med rezultati štetja s svetlobnem mikroskopom in pretočnem citometrom EPICS Profile pri koncentraciji tiazol oranžnega 0,1 mg/L.
Literatura
1.	Gilmer PR, Koepke JA. The reticulocytes. An approach to definition. Am J Ciin Pathol 1976; 66: 262-7.
2.	National committee for clinical laboratory standards. Method for reticulocyte counting; Proposed Standard. NCCLS Document H16-P. Villanova: NCCLS, 1985: 225-31.
3.	Andoljšek A. Bolezni krvi in krvotvornih organov. In: Kocijančič A, Mrevlje F. Interna medicina. Ljubljana: EWO, 1993: 974-1030.
4.	BohinjecJ. Temelji klinicne hematologije. Ljubljana: DDU Univerzum, 1983: 11-56.
5.	Bunn HF. Anemia. In: Isselbacher KJ, Braunwald E, Wilson JD, Martin JB. Fauci AS, Kasper DL eds. Harrison s principles of internal medicine. 13th ed. Vol 2. New York: McGraw Hill, 1994: 313-7.
6.	Brian SB. Janine BG, Ernest B. Morphology of erythron. In: Williams WJ, Beutler E, Erslev AJ, Lichtman MA eds. Hematology. New York: McGraw Hill, 1990: 297-309.
7.	Koepke JF, Koepke JA. Reticulocytes. Clin lab haemat 1986; 8:169-79.
8.	Kanold J, Bezou MJ,Coulet M.Quainon F, Malpuech G, Travade Ph, Demeocq F. Evaluation of erythropoetic/hematopoetic reconstitution after BMT by highly fluorescent reticulocyte counts compares favorably with traditional peripheral blood counting. Bone Marrow' Transpl 1993; 11: 313-8.
9.	Erslev AJ. Reticulocyte enumeration. In: Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps TJ.Williams Hematology'. New York: McGraw Hill. 1995: L28.
10.	Peebles DA, Hochberg A, Clarke TD. Analysis of manual reticulocyte counting. Am J Clin Pathol 1981; 76: 713-7.
11.	DacieJV, Lewis SM. Practical Haematology'. London: Churchill Livingstone, 1984: 58-61.
12.	Carter NP, Meyer EW. Introduction to the principles of flow cytometry. In: Ormerod MG. Flow cytometry. New York: Oxford University Press, 1990: 1-28.
13.	Wood JCS. Clinical flow cytometry instrumentation. In: Bauer KD, Duque RE, Shankey TV. Clinical flow cytometry. Principles and application. Baltimor: Williams && Wilkins, 1993: 71-92.
14.	Nobes PR, Carter AB. Reticulocyte counting using flow cytometry. J Clin Pathol 1990; 43: 675-8.
15- Davis BH, Bigelow NC. Flow cytometric reticulocyte quntification using thiazole orange provides clinically useful reticulocite maturity index. Arch Pathol Lab Med 1989; 113: 684-9.
16.	Tarallo P, Humbert JC, Mahassen P, Fournier B. Henny J. Reticulocytes: biological variations and reference limits. Eur J Haemat 1994; 53: 11-5.
17.	Davis BH. Bigelow NC, Koepke JA et al. Flow' cytometric reticulocyte analysis. Multiinstitutional interlaboratory correlation study. Am J Clin Pathol 1994; 102: 468-77.
18.	Hansson GK, Andersson M, Jarl H, Stemme S. Flow cytometric analysis of reticulocytes using an RNA-binding fluorochrome. Scand J Clin Lab Invest 1992; 52: 35-41.
19.	Chin-Yee I, Keeney M, Lohmann RC. Flow' cytometric reticulocyte analysis using thiazole orange; clinical experience and technical limitations. Clin Lab Haemat 1991; 13: 177-88.
20.	Cavill I. The rejected reticulocyte . Brit J Haemat 1993; 84: 563-5.
21.	Ferguson DJ, Lee SF, Gordon PA. Evaluation of reticulocyte counts by flow cytometry in a routine laboratory. Am J Haemat 1990; 33: 13-20.
22.	Brecher G. New methylene blue as a reticulocyte stain. Am J Clin Pathol. 1949; 19: 895-6.
23- Lohmann RC, Crawford LN, Wood DE. Proficiency testing in reticulocyte counting. Clin Lab Haematol 1994; 16: 57-64.
24.	Lee LG, Chen CH, Chin LA. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry 1986; 7: 508-17.
25.	Davis BH, Bigelow NC. Automated reticulocyte analisys. Haematol/Oncol Clinics of North Amerika 1994; 8 (4): 617-30.
26.	Hamilton JL, Pollard Y, Grant D, Patterson K, Machin SJ. Evaluation of semi-automated reticulocyte counting method using the Coulter STKS-2A blood cell counter. Clin Lab Haem 1995; 17: 145-9.
27.	Van Houte AJ, Bartels PCM, Schoorl M, Mulder C. Methodology dependent variations in reticulocyte counts using a manual and two different flow cytometric procedures. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1994; 32: 859-63.
28.	Van Hove L, Goossens W, van Dupppen V, Verwilghen RL. Reticulocyte count using thiazole orange. A flow cytometry method. Clin Lab Haemat 1990; 12: 287-99.
29.	National committee for clinical laboratory standards. Reticulocyte counting by flow cvtometry; Proposed guideline. NCCLS document H44-P. Villanova: NCCLS, 1993: 1-25.
30.	Van Petegem M, Cartuyvels R, Schouwer P, van Duppen V, Goossens W, van Hove L. Comparative evaluation of three flow cytometers for reticulocyte enumeration. Clin Lab Haemat 1993: 15: 103-11.
31.	Metzger DK. Charache S. Flow cytometric reticulocyte counting with thioflavin T in a clinical hematology laboratory. Arch Pathol Lab Med 1987; 111: 540-4.
32.	Technical note. Retic-COUNT™ (Becton Dickinson) kit for reticulocyte enumeration in human periferal blood, 1993-
33- Bow'en D, Bentley N, May T, Cavill I. Comparison of a modified thiazole orange technique with a fully automated analyser for reticulocyte counting. J Clin Pathol 1991; 44: 130-3.
PREDHODNO NAPOLNJENE INJEKCIJSKE BRIZGE
. . . enkratno in preprosto
Kratka navodila za predpisovanje NEUPOGENA (filgastrima)
Preden boste predpisali NEUPOGEN, prosimo, preberite informacijski list.
Indikacije: Skrajšanje trajanja nevtropenije in zmanjšanje pogostnosti febrilne nevtropeni-je po običajni kemoterapiji zaradi nemieloidne maligne bolezni; skrajšanje trajanja nevtropenije in kliničnih posledic po mieloablativni terapiji, kateri sledi presaditev kostnega mozga; dolgotrajno zdravljenje z namenom zvečanja števila nevtrofilcev in zmanjšanja incidence oz. skrajšanje trajanja infekcijsko povezanih dogodkov pri bolnikih s hudo vrojeno, ciklično ali idiopatično nevtropenijo s številom nevtrofilcev ( 0,5 x 109/L, in s hudimi ter pogostnimi okužbami; pospešeno izplavljanje matičnih krvotvornih celic (PBPC) (kot samostojni postopek ali v poteku mielosupresivne kemoterapije). Infuzija s filgastrimom pospešeno izplavljenih matičnih krvotvornih celic (PBPC) (s kostnim mozgom ali brez) pospešuje okrevanje hematopoetičnega sistema, vključno z zmanjševanjem potrebe po transfuziji trombocitov po mielosupresivni kemoterapiji. Odmerjanje in uporaba: Odrasli: Pri citotoksični kemoterapiji: 5 jxg/kg/dan s subkutano injekcijo, ali razredčeno v 5-% glukozi z iv. infuzijo v 30 minutah. Prvi odmerek smemo dati čez 24 ur po kemoterapiji. Zdravljenje nadaljujemo do pričakovanega povečanja in povratka primernega števila nevtrofilcev. Mieloablativna terapija, ki ji sledi presaditev kostnega mozga: 10 pg/kg/dan dano kot 30- minutna ali 24- urna iv. infuzija, razredčena s 5-% glukozo, ali kot 24- urna subkutana infuzija. Začnemo čez vsaj 24 ur po infuziji kostnega mozga. Ko število nevtrofilcev preseže 1,0 x 109/L pri treh kontrolah v treh zaporednih dnevih, odmerek zmanjšamo na 5 pg/kg/dan. Če število nevtrofilcev vztraja naslednje tri dni pri enakem oz. večjem številu od 1,0 x 109/L, zdravljenje prekinemo. Če se število nevtrofilcev zmanjša pod 1,0 x 109/L med zdravljenjem, moramo odmerek povečati, kot je navedeno zgoraj. Pospešeno izplavljanje matičnih krvotvornih celic: Samostojno zdravljenje: 10 pg/kg/dan subkutano kot 24- urna infuzija, razredčena s 5- % glukozo ali kot enkratna dnevna injekcija šest dni zapored. Planiranje levkoforeze: priporočene so skupno 3 zaporedne kolekcije 5., 6. in 7. dne. V nadaljevanju pri mieloablativni terapiji: 5 pg/kg/dan subkutano vsak dan od prvega dne po zaključeni kemoterapiji, dokler se ne povrne število nevtrofilcev v meje normale. Levkoforeza poteka v obdobju, ko se nevtrofilci z ravni, manjše od 0,5 x 107L povečajo do števila, večjega od 0,5 x 107L. Pri bolnikih, ki niso prejemali ekstenzivne kemoterapije, običajno zadostuje enkratna afereza. V drugih primerih so priporočljive dodatne levkofereze. Huda kronična nevtropenija (otroci ali odrasli): Vrojena nevtropenija: 12 pg/kg/dan subkutano v enkratnem odmerku ali več odmerkih. Idiopatična ali ciklična nevtropenija: 5 pg/kg/dan subkutano v enkratnem odmerku ali več odmerkih. Prilagajanje odmerka: Z zdravljenjem je potrebno nadaljevati, dokler se število nevtrofilcev ne ustali nad 1,5 x 109/L, potem moramo ugotoviti najmanjši možni odmerek za ohranjanje te ravni. Po enem do dveh tednih zdravljenja lahko začetni odmerek glede na odgovor podvojimo ali prepolovimo; zatem odmerek prilagajamo individualno za vsakega bolnika na 1 do 2 tedna tako, da ostane povprečno število nevtrofilcev med 1,5 x 107L in 10 x 109/L. Pri hudih infekcijah lahko presojate tudi o hitrejšem povečevanju odmerka, vendar dolgoročna varnost NEUPOGENA pri odmerkih nad 24 pg/kg/dan pri bolnikih s kronično nevtropenijo še ni bila potrjena. Zdravljenje je možno izvajati samo v sodelovanju s specializiranimi centri, izkušenimi v uporabi G-CSF in v hematologiji, z vsemi potrebnimi zmogljivostmi. Pospešeno izplavljanje in aferezo je treba izvajati v sodelovanju s centri, ki imajo izkušnje na tem področju in kjer lahko pravilno opravijo celotno nadziranje matičnih krvotvornih celic. Starejši: Ni posebnih priporočil o odmerjanju. Kontraindikacije: Znana preobčutljivost za zdravilo ali njegove sestavine. Huda vrojena nevtropenija (Kostmanov sindrom) z nenormalno citogenetiko. NEUPOGENA ne smemo namensko uporabljati zato, da bi tako povečali možnosti uvedbe citotoksične kemoterapije nad ustaljenimi režimi odmerjanja. Nosečnost: Tveganje za človeški zarodek je neznano. Ugotovljena je povečana možnost splava pri zajcih. Uporaba pri doječih materah ni priporočljiva. Previdnostni ukrepi: Pri mielodisplaziji in akutni mieloblastni ali kronični mielocitni levkemiji nista dognani varnost in učinkovitost. Previdnost je potrebna pri uporabi NEUPOGENA v zdravljenju vseh premalignih mieloidnih stanj, zaradi možnosti tumorske rasti. Zdravljenje prekinemo, če se pojavijo mielodisplastični sindromi ali levkemija. Med zdravljenjam z NEUPOGENOM v rednih presledkih preverjamo število levkocitov. Število levkocitov, večje od 100 x 109/L, so ugotovili pri manj kot 5 % bolnikov, zdravljenih z večjimi ali enakimi odmerki kot 3 pg/kg/dan. Zdravljenje prekinemo, če število celic preseže 50 x 109/L po pričakovanem nadiru. Z pospešenim izplavljanem
matičnih krvotvornih celic (PBPC) prekinemo, ko število levkocitov zraste nad 100 x 109/L. Priporočljivo je preverjanje kostne mase pri bolnikih z osteoporozo, ki se zdravijo več kot 6 mesecev. Uporaba NEUPOGENA ni priporočljiva pri bolnikih s hudo ledvično ali jetrno okvaro. Vpliv na presadke in zavrnitvene reakcije še ni raziskan. Prekurzorji nevtrofilcev so lahko zmanjšani pri bolnikih po ekstenzivni kemoterapiji ali radioterapiji, zato je lahko pri teh bolnikih odgovor nevtrofilcev na NEUPOGEN zmanjšan. Posebni previdnostni ukrepi pri hudi kronični nevtropeniji: Diagnostični testi morajo razlikovati med npr. aplastično anemijo, mielodisplazijo, mieloidno levkemijo. Natančno moramo nadzorovati trombocite v prvih nekaj tednih in presoditi o zmanjšanju odmerka ali prekinitvi zdravljenja, če je njihovo število stalno manjše od 100000/mm'. Zasledovati moramo pojav anemij in prehodne poraste mieloidnih progenitorskih celic. Vsakih 12 mesecev opravimo morfološke in citogenetične preiskave kostnega mozga pri bolnikih s Kostmanovim sindromom. Nadziramo volumen vranice: povečanje, ki je odzivno na zmanjšanje odmerka, opažamo v 31 % bolnikov; splenektomija je potrebna pri 3 % bolnikov. Izključiti moramo druge možnosti (npr. virusno infekcijo) prehodne nevtropenije. Priporočamo redne analize urina zaradi odkrivanja hematurije/proteinurije. Varnost in učinkovitost pri novorojenčkih in bolnikih z avtoimunsko nevtropenijo še nista ugotovljeni. Posebni previdnostni ukrepi pri pospešenem izplavljanju matičnih krvotvornih celic (PBPC): Pred izpostavitvijo citotoksičnim pripravkom: Pri bolnikih, ki so prestali zelo ekstenzivno mielosupresivno terapijo, včasih ni razvidna zadostno izplavljanje matičnih krvotvornih celic (PBPC) za dosego priporočene minimalne tvorbe (več ali enako številu 2,0 x 107CD34+/kg celic), ali v enaki meri pospeševanja povratka trombocitov. Nekateri citotoksični pripravki izkazujejo posebno citotoksičnost do fonda krvotvornih matičnih celic in lahko škodljivo vplivajo na pospešeno izplavljanje. Ko se odločamo za transplantacijo matičnih krvotvornih celic (PBPC), je priporočljivo načrtovati postopek zgodaj v poteku zdravljenja. Število izplavljenih matičnih celic pri takih bolnikih moramo oceniti pred dajanjem visokoodmerne kemoterapije. Če je po zgornjih kriterijih tvorba celic nezadostna, moramo razmišljati o drugih oblikah zdravljenja, ki ne zahtevajo podpore matičnih celic. Ocenjevanje rezultata tvorbe matičnih krvotvornih celic (PBPC): Ko določamo število matičnih celic, pridobljenih pri bolnikih, ki so bili zdravljeni z NEUPOGENOM, moramo pozornost posvetiti metodi kvantifikacije. Trenutno pridobljeno minimalno število celic CD34+ ni natanko določeno. Priporočeno minimalno pridobljeno število celic CD34+, večje oz. enako 2,0 x IO6 CD34+ celic/kg, temelji na kustvenih rezultatih, ki zadoščajo za hematološko obnavljanje. Število celic, ki je večje od zgoraj navedenega, je povezano s hitrejšim okrevanjem; tisti, ki so manjši od zgoraj navedenega, pa govorijo za počasnejše okrevanje. Interakcije med zdravili: Uporaba ni priporočljiva 24 ur pred kemoterapijo niti 24 ur po njej. Stranski učinki in neželene reakcije: Bolečine v mišicah in kosteh, težave v sečilih (v glavnem dizurija, redko hematurija/proteinurija); reverzibilna, od odmerka odvisna, povečanja vrednosti jetrnih encimov in serumske sečne kisline; prehodni padci krvnega tlaka; občasna poročila o žilnih nepravilnostih po visokoodmerni kemoterapiji. Redka poročila o reakcijah alergične narave. Neželeni učinki pri bolnikih s hudo kronično nevtropenijo niso pogosti in se sčasoma zmanjšajo. Zasledili so: kostne/generalizirane bolečine; splenomegalijo; trombocitopenijo; glavobol; drisko; anemijo; krvavitev iz nosu (pri podaljšanem dajanju); nesimptomatični dvig koncentracije serumske sečne kisline in jetrnih encimiov; prehodno, zmerno hipoglikemijo; reakcije na mestu vbrizgavanja; hepatomegalijo; artralgijo; alopecijo; osteoporozo. Kožni vaskulitis po dolgotrajni uporabi.
Popolna navodila so na voljo pri zastopniku.	g;
o
Proizvaja:
F. Hoffmann-La Roche Ltd Basel, Švica
Zastopa:
Hoffmann-La Roche Ltd Podružnica Ljubljana

Strokovni prispevek/Professional article
DOLOČANJE ANTIGENOV CD62P IN CD63 S PRETOČNIM CITOMETROM ZA OCENO AKTIVIRANIH TROMBOCITOV
DETECTION OF ACTIVATED PLATELETS BY FLOW CYTOMETRIC ANALYSIS OF ANTIGENS
CD62P AND CD63
Jana Kralj
Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-04-09, sprejeto 1998-04-15; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-57-9
Ključne besede: P-selektin; receptorji GPIIb in GP lila; mono-klonska protitelesa; adenozindifosfat; tromboza
Izvleček—Izhodišča. Aktivirane trombocite so ugotovili pri bolnikih z aterosklerozo, vensko trombozo in malignimi boleznimi. Določanje aktiviranih trombocitov je pomembno za odkrivanje tveganja za nastanek tromboze. Večina načinov za oceno trombocit-ne funkcije je posrednih. Nanje vplivajo številni dejavniki, ki omejujejo klinično uporabnost. Pretočni citometer nam ponuja določanje aktiviranih trombocitov z uporabo monoklonskih protiteles. Kljub številnim prednostim, pa se pretočna citometrija za določanje aktiviravih trombocitov v klinični praksi še ni uveljavila.
Preiskovanci in metode. Aktivirane trombocite smo določili pri 30 zdravih preiskovancih s protitelesi za antigena CD62P in CD63 pred in po spodbuditvi z ADP, ADP in ADR, trombinom in kolagenom . Preverili smo pogoje, ki preprečijo aktivacijo trombocitov med delom in zagotovijo ponovljivost izsledkov.
Rezultati. V vzorcih krvi sparaformaldeh idom smo ugotovili znatno manjši delež trombocitov z antigeni CD62P in CD 63 (< 596) kot, v vzorcih krvi s teofilinom (< 27%). Ugotovili smo, da so koncentracije ADP 10 pmol/L, ADP in ADR 20 pmol/L, 0,17 E/mL trombina in 88 pg/mL kolagena zadostne da spodbudijo trombocite k premestitvi antigenov CD62P in CD63 na membrano, ne povzročijo pa medsebojnega zlepljanja. Določili smo referenčne vrednosti pred spodbuditvijo z izbranimi spodbujevalci in po njej.
Zaključki. Menimo, da je za preprečevanje aktivacije trombocitov med določanjem antigenov CD62P in CD63 najbolj primerna uporaba 1% raztopine paraformaldehida. Deleži trombocitov z antigeni CD62P in CD63 se razlikujejo glede na izbrane spodbujevalce. Menimo, daje za celovito oceno aktiviranih trombocitov smisleno uporabiti več monoklonskih protiteles.
Uvod
Trombociti se v krvnem obtoku aktivirajo pri različnih boleznih. Najpogostejše so bolezni ožilja, akutni srčni infarkt, dihalna stiska pri srčnih operacijah, sladkorna bolezen, mieloproliferativne bolezni, preeklampsija in sepsa (1-7). Pri slednjih bi morda z določanjem aktiviranih trombocitov ocenili tveganje za nastanek tromboze in začeli zdravljenje za preprečitev. Kljub naglemu razvoju tehnologije, ki nam omogoča hitro in natančno oceno števila in velikost trombocitov, pa nimamo na voljo enostavnega preskusa za oceno trombocitne funkcije. Laboratorijske preiskave
Key words: P-selectin; GPIIb and GPIIIa receptors; monoclonal antibodies; adenosine diphosphate; thrombosis
Abstract — Background. Platelets may become activated in a number of disorders such as atherosclerosis, venous thrombosis and cancer. Therefore, the detection of activated platelets might facilitate the identification of certain thrombotic disorders. Previous methodsforassaing platelet activity have been indirect, and quantitation has been difficult, precluding their use in the clinical area. Flow cytometry is a promising new method, using monoclonal antibodies specific for a glycoprotein markers of platelet activation expressed on the membrane surface following activation.
Methods. Cell surface expression of granule membrane antigens P-selectin (CD62P') and lysosome antigen CD63 were examined by flow cytometry in 30 healthy donors. We studied the conditions to prevent artifactual induction of platelet activation.
Results. The proportion of platelets expressing antigens CD62P and CD63 in blood samples with paraformaldehyde was lower (< 5%) than in samples with theophyillin (< 27%). Tloe concentration-effect relationship were determined for the ADP, adrenaline, thrombin and collagen induced expression of CD62P and CD63-
Conclusions. The results suggest that 1% solution of paraformaldehyde should be used for preventing of artifactual induction of platelet activation in blood samples. Platelets are likely to become activated by different agonist in different clinical situations. Therefore, it seems necessary to detect of activated platelets by a panel of monoclonal antibodies.
za oceno trombocitne funkcije obsegajo merjenje adhezije in agregacije trombocitov ter določanje deleža aktiviranih trombocitov. Preskus agregacije trombocitov in čas krvavitve se pogosto uporabljata v klinični praksi za oceno funkcije trombocitov. Ker sta preiskavi odvisni od številnih dejavnikov, je njun diagnostični pomen omejen (8, 9). Na izid določanja beljakovin, ki se sprostijo iz aktiviranih trombocitov, kot so beta-tromboglobulin, trombocitni faktor 4 in tromboksan A2 v krvni plazmi ter metabolitov tromboksana A2 v seču, vplivajo tudi dejavniki, ki niso v zvezi z načinom določanja. Zato se ti načini niso uveljavili v diagnostiki. V zadnjih letih se je uveljavilo
določanje antigenov na celični membrani s pretočnim citometrom in monoklonskimi protitelesi. Metoda se v klinični hematologiji uporablja predvsem za določanje podvrst limfocitov in za opredelitev levkemij in malignih limfomov (10). Vse bolj pogosto jo rabijo tudi za določanje aktiviranih trombocitov.
Trombociti imajo na membrani številne glikoproteinske molekule, ki so biokemično in genetično dobro poznane. Mnogi trombocitni glikoproteini so heterodimeri z lastnostmi receptorjev, ki so pomembni pri aktivaciji, adheziji in agregaciji trombocitov. Z uporabo monoklonskih protiteles, ki so označena s fluorescenčnimi barvili, jih prikažemo. Danes je uspelo izdelati monoklonska protitelesa tudi za antigene na membrani aktiviranih trombocitov. To so protitelesa, ki se vežejo na preoblikovana aktivirana gliko-proteina GPIIb inGPIIIa in na beljakovine granul in lizosomov v trombocitih. Čeprav so številni avtorji ocenjevali aktivirane trombocite s pretočnim citometrom pri različnih boleznih, še vedno ni dovolj znan klinični pomen teh preiskav (2-7, 11).
Ker na določanje aktiviranih trombocitov vplivajo številni dejavniki, je v vsakem laboratoriju potrebno določiti osnovne pogoje dela in meritve ter določiti referenčne vrednosti (19). Želeli smo preveriti pogoje, ki preprečijo aktivacijo trombocitov med delom in zagotovijo ponovljivost izsledkov in določiti referenčne vrednosti, za trombocite z antigeni CD62P in CD63 pred spodbuditvjo z ADP, ADP in adrenalinom, trombinom in kolagenom in po njej.
Preiskovanci in načini dela
Aktivirane trombocite smo ocenjevali z določanjem antigenov CD62P in CD63 'pri zdravih osebah pred spodbuditvijo z ADP, ADP in ADR, trombinom in kolagenom in po njej. Uporabili smo vzorce krvi 30 zdravih oseb v starosti od 18 do 50 let. Preiskovane osebe so bili nekadilci in niso prejemali zdravil.
Uporabili smo monoklonska protitelesa CD62P, CD63, CD41 in CD42b proizvajalca Immunotech (Marseille, Francija), snovi za spodbujevanje ADP, ADR in kolagen proizvajalca DiaMed (Cressier sur Morat, Švica), trombin Dade AG (Dudingen, Švica), paraformal-dehid in teofilin proizvajalca Sigma-Aldrich Chemie (Deisenhofen, Nemčija).
Kri smo odvzeli v polistirensko epruveto z raztopino natrjevega citrata (0,129 M) proizvajalca Becton Dickinsori (Meylan-Cedex, Francija).
Delež aktiviranih trombocitov smo določali v krvi do 10 minut po odvzemu in po spodbuditvi z ADP, ADP in ADR, trombinom in kolagenom (22). Z določanjem antigenov CD41 in CD42b smo potrdili, da je bilo v suspenziji celic, ki smo jo preiskovali 99% trombocitov. Vse meritve smo napravili s citometriom XL-MCL tovarne Coulter Electronics GMBH. V vzorcih krvi smo s citometrom ocenili 5 000 trombocitov in ugotovili delež celic z antigeni. Preizkusili smo učinek 1% raztopine paraformaldehida in 1% raztopine teofilina na preprečevanje aktivacije trombocitov pri delu. S primerjanjem izsledkov aktiviranih trombocitov po spodbuditvi z ADP (koncentracije 7,3,14,6,16,6, 33 pmol/L), trombinom (koncentracije 0,5, 1, 1,7 in 2 E/mL) in kolagenom (koncentracije 44, 88, 100 pg/mL) smo določili ustrezne koncentracije za spodbuditev trombocitov k premestitvi antigenov CD62P in CD63 na membrano. Te koncentracije smo izbrali tako, da ne povzročajo medsebojnega zlepljanja trombocitov. Statistično analizo smo napravili na računalniku IBM PC/AT. Uporabili smo program Statistica for Windows Release 4.1 Upoštevali smo vzorčne cenilke parametrov porazdelitve merjenih količin (aritmetična sredina, standardni odklon). Sklepe smo sprejemali pri manj kot 5% tveganju (p < 0,05).
Izsledek
Pri preskušanju učinka paraformaldehida in teofilina na preprečevanje aktivacije trombocitov med delom smo v vzorcih krvi s paraformaldehidom ugotovili znatno manjši delež trombocitov z
antigeni CD62P in CD 63 (<5%) kot v vzorcih krvi s teofilinom (<27%).
Pri določanju ustreznih koncentracij spodbujevalcev smo ugotovili, da 10 pmol/L ADP, 20 pmol/L ADP in ADR, 0,17 E/mL trombina in 88 ug /mL kolagena zadostujejo za spodbuditev trombocitov k premestitvi antigenov CD62P in CD63 na membrano, ne povzročijo pa medsebojnega zlepljanja trombocitov.
V tabeli 1 smo navedli srednje vrednosti deleža trombocitov z antigeni CD62P in CD63 pri 30 zdravih preiskovancih pred in po spodbuditvi z ADP, ADP in ADR, kolagenom in trombinom (tab. 1).
Tab. 1. Delež trombocitov z antigeni CD62P in CD63 pred in po spodbuditvi s ADP, ADP in adrenalinom, trombinom in kolagenom.
Tab. 1. Cell surface expression of CD62P and CD63 in unstimulated platelets and in stimulated platelets with ADP, ADP and adrenaline, thrombin,and collagen.
Brez spodbuditve	Po spodbuditvi
Unstimulated platelets	Stimulated platelets
ADP ADP in ADR Trombin Kolagen ___________________________ADP	ADP and ADR	Thrombin	Collagen
CD62P (%, x±s)	5,2±1,2	4l,0±8,2	46,1±9,2	4l,5±5,2	40,5±4,8
CD63 (%, x±s)	8,1±1,4	l6,2±2,3	16,5±5,6	26,0±9,6	19,2±6,2
x - povprečna vrednost / mean value s - standardni odklon / standard deviation ADP - adenozindifosfat / adenosine diphosphate ADR - adrenalin / adrenaline
%	- delež trombocitov z antigeni CD62P ali CD63 / indicates the percentage of
human blood platelets expressing cell surface CD62P or CD63
Pri zdravih preiskovancih smo po spodbuditvi ugotovili statistično značilno večji delež trombocitov z antigenom CD62P kot antigenom CD63 (p < 0,05).
Razpravljanje
Aktivacijo trombocitov sproži trombin, kolagen v subendoteliju ali spodbujevalci kot sta adenozindifosfat (ADP) in adrenalin (ADR). Aktivirani trombociti se spremene iz diskoidne v sferično obliko z izrastki. Sledijo preureditve in premestitve receptorjev iz citoplazme na membrano. Na receptorje se lahko vežejo fibrinogen, von Willebrandov faktor, kolagen in trombospodin, ki sprožijo adhezijo in agregacijo trombocitov ter nastanek strdka (11-13). Močni spodbujevalci lahko povzročijo aktivacijo trombocitov v krvnem obtoku in nalaganje trombocitov na žilno steno ter nastanek tromboze.
Ugotovili so, da je v citoplazmi trombocitov več vrst zrnc, ki se glede na vsebino med seboj razlikujejo. Po spodbuditvi celice se zrnca prenesejo na celično površino, preko kontraktilnega dela celičnega skeleta, kjer se vključijo v zgradbo celične membrane ali pa izločijo iz celice. Ugotovili so, da se iz membrane zmc alfa vključi v membrano trombocita glikoprotein P-selektin (GMP-140, PADGEM, CD 62P), ki ima vlogo mediatorja med aktiviranimi trombociti in celicami endotelija ter granulociti in monociti. Izdelali so več monoklonskih protitels za odkrivanje P selektina (16, 17). Ugotovili so tudi, da se po spodbuditvi iz membrane lizosomov prenese na membrano trombocitov protein 53-kDA (CD63). Avtorji so menili, da bi z določanjem antigenov CD62P in CD63 na membrani trombocitov lahko ocenili delež aktiviranih trombocitov
(18).
S pretočnim citometrom ugotovimo lahko že majhne spremembe aktivacije trombocitov. Mnenja, ali je določanje aktiviranih trombocitov s pretočnim citometrom ustrezno za oceno trombocitne funkcije, so še vedno deljena. Predvsem je pomembno določiti pogoje, ki preprečujejo aktivacijo trombocitov med določanjem. Sprva so ocenjevali delež aktiviranih trombocitov po osamitvi trombocitov, danes ocenjujejo v krvi, ker že postopki osamitve
celic lahko spodbudijo aktivacijo trombocitov. Nekateri avtorji zato priporočajo fiksirat celice s paraformaldehidom ali pa uporabo snovi, s katerimi zavremo presnovne procese v celici (4, 19). V naši raziskavi smo preizkusili učinek paraformaldehida in teofilina na preprečevanje aktivacije trombocitov med delom. Ugotovili smo značilno manjši delež trombocitov z antigeni CD62P in CD63 (< 5%) v vzorcih krvi s paraformaldehidom kot v vzorcih krvi s teofilinom (< 27%). Menimo, da je za preprečevanje aktivacije trombocitov med določanjem antigenov CD62P in CD63 primerna uporaba 1% raztopine paraformaldehida.
Za določanje aktiviranih trombocitov po spodbuditvi so trombocite po odvzemu krvi spodbudili s spodbujevalci, kot so ADP, ADR, trombin in kolagen. Po spodbuditvi so aktivacijske antigene določili na membrani trombocitov. Na ta način so ugotavljali zvečan delež aktiviranih trombocitov pri bolnikih z rakavimi boleznimi in pri zdravih osebah. Enake spremembe so opisali tudi pri mieloprolifera-tivnih boleznih (18, 20). Za razliko od drugih smo ugotovili, da so ustrezne večje koncentracije ADP in trombina za spodbuditev trombocitov k premestitvi antigenov CD62P in CD63 na membrano (21).
Da imajo trombociti po spodbuditvi na membrani antigene CD62P in CD63, smo potrdili tudi z našo raziskavo (18-20). Antigen CD62P smo ugotovili po spodbuditvi z ADP pri 41,0%, z ADP in ADR pri 46,1% s trombinom pri 41,5% in s kolagenom pri 40,5% trombocitov. Antigen CD63 smo ugotovili po spodbuditvi z ADP pri 16,2%, z ADP in ADR pri 16,5%, s trombinom pri 26,0%, in s kolagenom pri 19,2% trombocitov.
V	literaturi nismo zasledili dela, ki bi obravnavalo razmerje med antigeni CD62P in CD63 na membrani trombocita po spodbuditvi.
V	naši raziskavi smo z različnimi načini spodbujevanja ugotovili, značilno večji delež trombocitov z antigenom CD62P kot z antigen CD63.
Potrdili smo tudi ugotovitve drugih, da se trombociti zdravih oseb različno odzivajo na izbrane spodbujevalce (20, 21). Delež trombocitov z antigeni CD62P je bil po spodbuditvi z ADP in ADR statistično značilno večji kot po spodbuditvi z drugimi uporabljenimi spodbujevalci. Statistično značilno večji delež trombocitov z antigeni CD63 pa smo ugotovili po spodbuditvi s trombinom. Menimo, da je za določanje aktiviranih trombocitov nujno uporabiti več monoklonskih protiteles, ki odkrivajo različne antigene. Predpostavljamo, da na ta način lahko ocenimo aktivirane trombocite pri različnih boleznih, kjer so vzroki in poti spodbujevanja zelo različni.
Zaključki
Za preprečevanje aktivacije trombocitov med določanjem antigenov CD62P in CD63 je najbolj primerna uporaba 1% raztopine paraformaldehida. Ugotovili smo, da je za uporabljena monoklonska protitelesa potrebno vedno določiti najprimernejše koncentracije spodbujevalcev za premestitev antigenov CD62P in CD63 na membrano.
Pri zdravih preiskovancih smo po spodbuditvi trombocitov z ADP, ADP in ADR, trombinom in kolagenom ugotovili značilno večji delež trombocitov z antigenom CD62P kot antigenom CD63-
Literatura
1.	Flores NA, Sheridan DJ. The pathophysiological role of platelets during myocardial ischaemia. Cardiovasc Res 1994; 28: 295-5.
2.	Ejim OS, Powling MJ, Dandona P, Kemoff PB, Goodall AH. A flow cytometric analysis of fibronectin binding to platelets from patients with peripheral vascular disease. Thromb Res 1990; 58: 519-602.
3.	Gawaz M, Neumann FJ, Ott I, Schiessler A, Schoming A. Platelet function in acute myocardial infraction treated with direct angioplasty. Circulation 1996; 93: 229-37.
4.	Tschope D, Schultheiss HP, Kolarov P, Schwippert B, Dannehl K, Nieuwenhaus HK, Kehrel B, Strauer B, Gries FA. Platelet membrane markers are predictive for increased risk of acute ischaemic events after PTCA. Circulation 1993; 88: 37-42.
5.	Tschope D, Driesch E, Schwippert B, Nieuwenhaus HK, Gries FA. Exposure of adhesion molecules on activated platelets in patients with newly diagnosed IDDM is not normalized by neamormoglycemia. Diabetes 1995; 44: 890-4.
6.	Wehmeier A, Toschope D, Esser J Menzel C, Nieuwenhaus HK, Schneider W. Circulating activated platelets in myeloproliferative disorders. Thrombosis Res 1991; 61: 271-8.
7.	Janes SL, Kyle PM, Redman C, Goodall AH. Flow cytometric detection of activated platelets in pregnant women prior to the development of pre-ecclampsia. Thromb Haemost 1994; 74: 1059-63-
8.	Rodgers RPC, Levin J. A critical reappraisal of the bleeding time. Semin Thromb Hemost 1991; 6l: 1-7.
9.	George JN, Shattil Sj. The clinical importance of acquired abnormalities of platelet function. N Engl J Med 1991; 324: 27-31.
10.	Žontar D, Černelč P. Uporaba pretočne citometrije v klinični hematologiji. 1993; 9: 361-424.
11.	Gawaz M, Fateh-Moghadam S, Pilz G, Gurland HJ, Werdan K. Platelet activation and interaction with leukocytes in patients with sepsis or multipe organ failure. Eur J Clin Invest 1995; 25: 843-51.
11.	Janes SI, Wilson DJ, Chronos N, Goolall Ah. Evaluation of whole blood flow cytometric detection of platelet bound fibrinogen on normal subjects and patients with activated platelets. Thromb Haemostasis 1993; 70: 659-66.
12.	Hourdille P, Gralnick HR, Heilmann E, Derion A, Ferrer AM, Vezon G, Nurden AT. Von Willebrand factor bound to glycoprotein lb is cleared from the platelet surface after platelet activation by thrombin. Blood 1992; 79: 2011-21.
13- Kehrel B. Platelet receptors for collagens. Platelets 1995; 6: 11-6.
14.	Ruf A, Patscheke H. Flow cytometric detection of activated platelets: comparison of determining sharpe change, fibrinogen binding, and P-selectin expression. Sem Thromb Hemosta 1995; 21: 146-51.
15.	George NJ, Pickett EB, Saucerman S, McEver RP, Kunicki TJ, Kieffer N, Newman PJ. Platelet surface glycoproteins. Studies on resting and activated platelets and platelet membrane microparticles in normal subjects, and observations in patients during adult respiratory distress syndrome and cardiac surgery. J Clin Invest; 1986; 40: 348-8.
16.	Sedlmayer P, Grobhaupt B, Muntean W. Flow cytometric detection of intracellular platelet antigens. Cytometry 1996; 23: 284—9.
17.	Golanski J, Pietrucha T, Baj Z, Greger J, Watala C. A novel approach to inhibit anticoagulant induced spontaneous activation of blood platelets. Thromb Research 1997; 85: 127-32.
18.	Kannan k, Divers SG, Lurie AA, Chervenvk R, Fukuda M, Holcombe RF. Cell surface expression of lysosome-associated membrane protein-2 and CD63 as markers of in vivo platelet activation in malignancy. Eur J Haematol 1995; 55:145— 51-
19- Michelson D. Flow Cytometry: A clinical test of platelet function. Blood 1996; 87: 4925-36.
20.	Wehmeier A, Tschope D, Esser J, Menzel C, Nieuwenhuis J. Circulating activated platelets in myeloproliferative disorders. Thromb Res 1991; 6l: 271-8.
21.	Rinder CS, Student LA, Banon JL, Rinder HM, Smith BR. Aspirin does not inhibit adenosin diphosphate-induced platelet alfa granule release. Blood 1993; 82: 505-12.
22.	Shattil SJ, Cunningham M, Hoxie JA. Detection of activated platelets in whole blood using activation dependent monoclonal antibodies and flow cytometry. Blood 1987; 70: 307-12.
Fludara
(fludarabinfosfat)
Najaktivnejše zdravilo druge izbire za monoterapijo bolnikov s kronično limfocitno levkemijo (KLL) celic B
Učinkovita kot monoterapija predhodno zdravljenih bolnikov
Učinkovita v napredovalih stopnjah bolezni pri bolnikih, ki se ne odzovejo na kombinirano zdravljenje
Učinkovitejša kot kombinirano zdravljenje s CAP pri predhodno zdravljenih bolnikih
Bolniki jo dobro prenašajo
Uporabljati jo je mogoče ambulantno
Strokovni prispevek/Professional article
DOLOČANJE PROTITELES PROTI TROMBOCITOM PRI KRONIČNI IDIOPATIČNI TROMBOCITOPENIČNI PURPURI S PRETOČNIM CITOMETROM
FLOW CYTOMETRY ANALYSIS OF PLATELET ANTIBODIES IN CHRONIC IDIOPATHIC
THROMBOCYTOPENIC PURPURA
Darja Žontar, Peter Černelč
Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika. Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-04-06, sprejeto 1998-04-08; ZDRAV VESTN 1998; 67; Suppl I; 1-61-3
Ključne besede: trombocitnaprotitelesa; razred IgG; razred IgM; pretočna citometrija; kronična idiopatična trombocitopenična purpura
Izvleček — Izhodišča. Za potrditev avtoimunskih trombocitopenij določamo protitelesa proti trombocitom, ki so lahko vezana na trombocite ali pa prosta v plazmi. Določamo protitelesa razredov IgG in IgM.
Preiskovanci in načini. S pretočnim citometrom smo določali protitelesa IgG in IgM proti trombocitom na površini trombocitov in prosta v plazmi pri 56 bolnikih z idiopatično trombocitopenično purpuro (ITP).
Rezultati. Pri 56 bolnikih z značilnostmi ITP smo s pretočnim citometrom ugotovili protitelesa na trombocitih ali v plazmi pri 42/56 (75%) bolnikih. Protitelesa, vezana na membrano trombocitov, smo ugotovili pri 30/56(54%) bolnikih, od tega protitelesa razreda IgG pri 19/56(34%) bolnikih, protitelesa razreda IgMpa pri 25/56 (45%) bolnikih. Protitelesa proti trombocitom v plazmi smo ugotovili pri 35/56 (62%) bolnikih, od tega protitelesa razreda IgG pri 27/56 (48%) bolnikih, protitelesa razreda IgM pa pri 26/56 (46%) bolnikih. Pri 15/56 (27%) bolnikih z značilnostmi ITP smo s pretočnim citometrom ugotovili istočasno protitelesa razredov IgG in IgM, vezana na membrano, medtem ko smo pri 18/56 (32%) bolnikih ugotovili istočasno protitelesa razredov IgG in IgM v plazmi. Pri 24/56 (43%) bolnikih smo ugotovili istočasno protitelesa proti trombocitom na membrani in v plazmi. Punkcijo kostnega mozga smo napravili pri 3 7/56 (66%) bolnikih. Pri 31/37(88%) bolnikih je bilo število megakariocitov v kostnem mozgu zvečano, kar je značilnost imunskih trombocitopenij. Pri drugih bolnikih sta bila izsledek citološkega pregleda kostnega mozga in število megakariocitov normalna.
Zaključki. Določanje protiteles proti trombocitom je preiskava za potrditev ITP. Kjub temu, da pri večini bolnikov z ITP ugotavljamo prisotnost protiteles proti trombocitom, pa ostaja citološki pregled kostnega mozga in potrditev zvečanega števila megakariocitov zanesljivejši in cenejši način potrditve TIP.
Keywords: platelet antibodies; class IgG; class IgM; flow cytometry; chronic idiopathic thrombocytopenic purpura
Abstract - Background. To confirm the diagnosis of autoimune thrombocytopenia we test antibodies against platelets, which are bind on platelets (direct assay) or are free in plasma (indirect assay). Class IgG and IgM platelet antibodies can be determined.
Results. Flow cytometry was used to detect platelet antibodies in 56 patients with idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP).Platelet associated antibodies (direct assay) were positive in 30/56 (54%) patients with 19/56 (34%) positive for IgG and 25/56 (45%) for IgM. Circulating antibodies (indirect assay) were positive in 35/56 (62%) patients with 27/56(48%) for IgG and26/56(46%) for IgM. 15/56(27%) patients were positiveforplatelet associated antibodies IgG and IgM. 18/56 (32%) patients were positive for circulating antibodies IgG and IgM. 24/56 (43%) patients were positive for both, circulating and platelet associated antibodies. Bone marrow examination was made in 37/56patients. An increased numbers of megakaryocytes were found in 31/37 (88%) patients.
Conclusions. In patients with idiopathic thrombocytopenic purpura increased values of antibodies were found by both methods.
Uvod
Na membranah trombocitov je pri človeku več skupin antigenov, proti katerim lahko nastanejo specifična protitelesa. Najpogostejše skupine antigenov so: ABO, HLA razred I, glikoprotein Ilb/IIIa (receptor za fibrinogen), glikoprotein Ib (receptor za FVIII-von Willebrandov faktor) in številni drugi za trombocite specifični antigeni, ki so pri več kot 90% ljudi (1-3).
Do povečanega razpada trombocitov lahko pride zaradi nastanka aloprotiteles (po več transfuzijah trombocitov) ali avtoprotiteles (idiopatična trombocitopenična purpura, bakterijske in virusne okužbe, sistemski lupus eritematozus, limfoproliferativne bolezni in po nekaterih zdravilih). Protitelesa se lahko vežejo z Fc delom na Fc receptorje trombocitov (imunski kompleksi). Z Fab delom se lahko vežejo na adsorbirani antigen trombocita ali na specifične antigene trombocitov (avtoimunski kompleksi) pri čemer ostane Fc del prost za vezavo komplementa ali vezavo na makrofage. Okvarjene trombocite z vezanimi protitelesi fagocitirajo makrofa-gi v vranici in jetrih (4).
Najpogosteje se pojavljajo protitelesa proti trombocitom razredov IgG in/ali IgM.
Kronična idiopatična trombocitopenična purpura (ITP) je avto-imunska bolezen, ki je posledica nastanka protiteles proti lastnim trombocitnim glikoproteinom Ib in Ilb/IIIa. Bolezen se pogosto začne nenadoma s krvavitvami v kožo in sluznice zaradi trombo-citopenije in ima kronični potek.
Za ugotavljanje protiteles proti trombocitom zadnja leta večinoma uporabljajo pretočni citometer (3-5). Podatkov o tovrstnih raziskavah v literaturi ni veliko, izsledki pa se med seboj razlikujejo. Ker preiskava ni standardizirana so izsledki preiskav slabo primerljivi med različnimi laboratoriji. Medtem ko s fluorescenčnim mikroskopom določamo trombocitna protitelesa kvalitativno, lahko s pretočnim citometrom določamo protitelesa tudi semikvanti-tativno, predvsem pa natančneje in hitreje.
Določanje trombocitnih protiteles je preiskava za potrditev ITP. Poleg uveljavljenega načina določanja protiteles na površini trombocitov s pretočnim citometrom smo želeli ugotoviti še delež prostih protiteles proti trombocitom v plazmi, predvsem pri bolnikih s kronično idiopatično trombocitopenijo, pa tudi pri odraslih zdravih osebah.
Bolniki in načini dela
Preiskovane osebe
Protitelesa proti trombocitom smo določali v Enoti za diagnostiko Kliničnega oddelka za hematologijo v Ljubljani od januarja 1995 do marca 1998 pri 34 bolnicah in 22 bolnikih z idiopatično trombocitopenijo v starosti od 20 do 80 let. Diagnostični kriteriji za ITP so bili : 1) trombocitopenija, 2) povečano ali normalno število megakariocitov v kostnem mozgu, 3) odsotnost povečane vranice in znakov drugih bolezni. Število trombocitov v krvi je bilo od 1 do 136xl09/L.
Priprava suspenzije trombocitov
10 ml venske krvi z EDTA (etilendiamino-tetraacetat) centrifugira-mo tri minute pri 1700 g in 22° C. Plazmo s trombociti odstranimo in prenesemo v 10 ml plastično epruveto. Ponovno centrifugira-mo deset minut pri 800 g in 22° C. Po centrifugiranju plazmo odstranimo, trombociti pa ostanejo na dnu epruvete. Trombocite trikrat izperemo in razredčimo s PBS-EDTA (puferirana fiziološka raztopina z etildiamino-tetraacetatom), nato pa uravnamo na 50.000/ul.
Neposredni način določanja protiteles proti trombocitom
200 pl suspenzije trombocitov preiskovanca dodamo 20 pl proti-humanih protiteles IgG (IgG-Fab) konjugiranih s fluoresceinom in
v drugo epruveto 20 pl protihumanih protiteles IgM (IgM-Fab) konjugiranih s fluoresceinom. Rahlo premešamo in inkubiramo v temi 30 minut.. Po inkubaciji trombocite trikrat izperemo s PBS-EDTA. Vsak vzorec razredčimo s 200 pl PBS-EDTA, rahlo premešamo in vrednotimo s pretočnim citometrom (EPICS XL2-MCL).
Posredni način določanja protiteles proti trombocitom
200 pl suspenzije trombocitov iz poola zdravih darovalcev krvne skupine 0 pipetiramo v označene epruvete. Dodamo 100 pl bolnikovega seruma in inkubiramo 30 minut pri 37°C. Trikrat izperemo s PBS-EDTA in dodamo po 20 pl protihumanih protiteles IgG (Fab)-FITC in IgM (Fab)-FITC. Inkubiramo 30 minut v temi pri sobni temperaturi. Nato trombocite trikrat izperemo s PBS-EDTA. Vsak vzorec razredčimo s 200 ul PBS-EDTA in vrednotimo s pretočnim citometrom.
Priprava negativne kontrole
200 pl suspenzije trombocitov iz poola zdravih darovalcev dodamo 100 pl seruma, ki ne vsebuje protiteles proti trombocitom. Inkubiramo 30 minut pri 37°C. Trikrat izperemo trombocite s PBS-EDTA, dodamo protihumana protitelesa IgG (Fab)-FITC ali IgM (Fab)-FITC in ponovno inkubiramo 30 minut v temi pri sobni temperaturi. Po inkubaciji ponovno trikrat izperemo s PBS-EDTA, vzorec razredčimo s 200 pl PBS-EDTA in vrednotimo fluorescenco s pretočnim citometrom.
Priprava pozitivne kontrole
200 pl suspenzije trombocitov iz poola zdravih darovalcev dodamo 100 pl seruma bolnika, pri katerem smo poprej dokazali prisotnost protiteles proti trombocitom. Inkubiramo 30 minut pri 37°C. Trikrat izperemo s PBS-EDTA in dodamo protihumana protitelesa IgG (Fab)-FITC ali IgM (Fab)-FITC in ponovno inkubiramo 30 minut v temi pri sobni temperaturi. Po inkubaciji ponovno trikrat izperemo s PBS-EDTA, vzorec razredčimo s 200 pl PBS-EDTA in vrednotimo fluorescenco s pretočnim citometrom. Referenčne vrednosti Kliničnega oddelka za hematologijo so za protitelesa, vezana na membrano trombocitov razreda IgG, do največ 12,2% pozitivnih trombocitov (8,6 ± 3,6%), protitelesa razreda IgM do največ 7,2% pozitivnih trombocitov (3,8 ± 3,4%).
Za protitelesa proti trombocitom v plazmi zdravih oseb so ugotovljene vrednosti za IgG do največ 12,9% pozitivnih trombocitov (9,2 ± 3,7%), za IgM pa do največ 8,9% pozitivnih trombocitov (5,4 ± 3,5%).
Rezultati
Med 56 bolniki z značilnostmi ITP smo s pretočnim citometrom ugotovili protitelesa na trombocitih ali v plazmi pri 42/56 (75%).Protitelesa, vezana na membrano tombocitov, smo ugotovili pri 30/56 (54%) bolnikih, od tega protitelesa razreda IgG pri 19/56 (34%) bolnikih,protitelesa razreda IgM pa pri 25/56 (45%) bolnikih. Protitelesa proti trombocitom v plazmi smo ugotovili pri 35/56 (62%) bolnikih, od tega protitelesa razreda IgG pri 27/56 (48%) bolnikih, protitelesa razreda IgM pa pri 26/56 (46%) bolnikih.
Pri 15/56 (27%) bolnikih z značilnostmi ITP smo s pretočnim citometrom ugotovili istočasno protitelesa razredov IgG in IgM, vezana na membrano, medtem ko smo pri 18/56 (32%) bolnikih ugotovili istočasno protitelesa razredov IgG in IgM v plazmi. Pri 24/56 (43%) bolnikih smo ugotovili istočasno protitelesa proti trombocitom na membrani in v plazmi.
Punkcijo kostnega mozga smo napravili pri 37/56 (66%) bolnikih. Pri 31/37 (88%) je bilo število megakariocitov v kostnem mozgu zvečano. Pri drugih bolnikih sta bila izsledek citološkega pregleda kostnega mozga in število megakariocitov normalna.
Tab. 1. Protitelesa proti trombocitom pri bolnikih z idiopatično trombocitopenično purpuro.
Tab. 1. Platelet antibodies in patients with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura.
Protitelesa na površini	Protitelesa
trombocitov	v plazmi
Platelet asociated	Circulating
antibodies	antibodies
Bolniki Patients	KM BM	Tr.xlOYL PltxlOVL	IgG %	IgM %	IgG %	IgM %
1. ZZ		102	11,1	8,8*	11,1	4,2
2. KD	zv	125	25,0*	22,0*	8,7	2,1
3. ŠM	zv	55	4,7	39,0*	14,6*	68,3*
4. BA		12	12,0*	18,0*	19,5*	11,5*
5. KE		104	13,8*	7,2*	16,3*	6,2
6. VA		18	18,9*	10,4*	44,9*	1,6
7. SA		11	42,9*	3,1	30,1*	3,4
8. VA		116	18,2*	11,0*	14,0*	3,2
9. KS	zv	16	29,0*	9,6*	19,0*	14,0*
10. ŠP		105	1,0	0	4,0	0
11. LJ	zv	97	3,0	2,0	10,3	2,4
12. KŠ		134	2,8	2,0	15,2*	1,6
13. RJ		44	2,8	2,1	21,6*	4,0
14. ČJ	zv	115	17,3*	2,0	6,6	0,7
15. BM	zv	107	14,2*	9,8*	12,2	7,1
16. SS	zv	130	6,3	11,2*	11,9	2,5
17. SF	zv	107	37,4*	0,4	19,1*	8,2
18. BP	n	57	2,2	0,3	3,4	1,8
19. BA		136	1,2	0,2	6,3	0,4
20. OD		114	1,9	2,0	10,3	8,4
21. AP	n	70	8,9	5,2	10,9	6,0
22. VJ		124	32,0*	45,8*	13,7*	23,8*
23. MA		6	4,0	2,8	2,9	1,7
24. SD	n	76	3,6	7,1	9,4	4,4
25. DF		78	14,9*	47,6*	19,8*	38,6*
26. EO		2	32,1*	0,8	15,7*	4,7
27. SM		76	9,4	4,2	16,2*	15,6*
28. FT		30	5,4	75,3*	10,2	37,8*
29. ŽL	zv	101	0,8	0,4	6,4	1,9
30. MŽ	n	98	23,2*	27,0*	19,0*	24,9*
31. TT	zv	74	0	49,0*	14,8*	16,7*
32. DK	zv	64	0	8,4	2,4	23,9*
33. JM	zv	124	1,1	2,5	4,2	7,3
34. JL	zv	67	0,6	2,0	0	0
35. MŽ	zv	64	0	0,8	4,7	58,0*
36. ČM	zv	102	5,8	0,4	5,2	2,2
37. MP		33	11,4	15,1*	22,1*	24,8*
38. TB	n	53	1,9	2,2	2,4	4,5
39. VP	zv	11	3,4	6,4	2,0	4,0
40. PV	zv	6	0	3,0	78,0*	9,4*
41. ŠF	zv	14	0,7	3,3	6,0	4,7
42. MN	n	85	2,0	4,0	10,6	16,4*
43. HM	zv	1	8,2	7,6*	32,0*	25,0*
44. SS	zv	36	65,0*	72,0*	59,2*	55,8*
45. FD	zv	1	0,5	14,0*	84,0*	15,0*
46. FZ	zv	12	28,1*	16,2*	36,9*	24,0*
47. IC	zv	35	4,6	8,6*	16,4*	12,0*
48. SR	zv	3	14,7*	9,6*	30,0*	18,9*
49. AP	zv	61	8,4	12,0*	11,6	16,3*
50. ML	zv	88	1,4	18,2*	11,8	45,3*
51. VT	zv	25	0	0	14,3*	29,5
52. IK	zv	1	1,0	9,6*	1,0	10,2*
53. RL	zv	1	0,6	3,4	2,0	12,6*
54. JS	zv	10	34,0*	23,0*	18,4*	14,9*
55. LS	zv	68	8,9	20,9*	10,4	17,0*
56. RM	zv	90	12,4*	35,1*	8,9	6,3
Razpravljanje
Pri določanju protiteles proti trombocitom je v literaturi opisanih več načinov, ki so zelo različno občutljivi in specifični. V primerjavi s članki avtorjev, ki so za določanje protiteles proti trombocitom uporabljali pretočni citometer, so rezultati naših raziskav različno primerljivi. Finley (4) je pri skupini 20 bolnikov z ITP ugotovil protitelesa na membrani trombocitov pri 90% bolnikov, prosta protitelesa proti trombocitom pa le pri 20% bolnikov. Pri naših bolnikih smo ugotovili pogosteje prosta protitelesa kot vezana na trombocite. V skupini 56 bolnikov z ITP smo dokazali protitelesa proti trombocitom na posredni ali neposredni način pri 75% bolnikov, kar je podobno, kot so ugotovili Bellucci in sodelavci (8). Prisotnost protiteles proti trombocitom pri bolnikih z ITP so ugotovili pri 70-80% bolnikov. Vzrok za razlike med rezultati je tudi uporaba različnih načinov določanja. Z razliko od drugih avtorjev (3, 4, 8) smo pri določanju protiteles proti trombocitom uporabili le Fab del molekule imunoglobulina, kar zagotavlja le specifično vezavo. Zato so še vedno v glavnem primerljivi med seboj le izsledki, ugotovljeni v istem laboratoriju.
Način določanja s pretočnim citometrom, ki se vse pogosteje uporablja, je predvsem natančnejši in hitrejši od drugih načinov, predvsem pa nam omogoča določiti protitelesa na trombocitih tudi pri bolnikih s hudo trombocitopenijo in zelo zmanjšanim številom trombocitov v krvi. Pri določanju protiteles proti trombocitom moramo upoštevati, da se protitelesa proti trombocitom pri nekaterih boleznih pojavljajo ciklično (6) in da lahko izginejo že nekaj ur po zdravljenju z glukokortikoidi (7).
Določanje protiteles proti trombocitom je v pomoč pri razločevanju imunskih trombocitopenij od neimunskih, ki so posledica zmanjšanega nastajanja ali zvečanega porabljanja trombocitov. Kljub temu, da so pri večini bolnikov z ITP prisotna protitelesa proti trombocitom, pa ostajata citološki pregled kostnega mozga in ocena števila megakariocitov osnovna preiskava za potrditev ITP.
Literatura
1.	Finley PR, Fletcher C. Laboratory tests in immune thrombocytopenia. J Med Technol 1984; 1: 709-15.
2.	He R, Reid D, Jones CE, Shulman NR. Spectrum of Ig classes, specificities, and titers of serum antiglycoproteins in chronic idiopathic thrombocytopenic purpura. Blood 1994; 83: 1024-32.
3.	Marti GE, Magruder L, Schuette WE, Gralnick HR. Flow cytomertic analysis of platelet surface antigens. Cytometry 1988; 9: 448-55.
4.	Finley PR, Fletcher C, Williams JR. Flow cytometry analysis of platelet antibodies. Journal of Clinical laboratory Analysis 1988; 2: 249-55.
5.	Kokava T, Nomura S, Yanabu M, Yasunaga K. Detection of platelet antigen for antiplatelet antibodies in idiopatic thrombocytopenic purpura by flow cytometry, antigen-capture ELISA, and immunoblotting: a comparative study. Eur J Haematol 1993; 50: 74-80.
6.	Yanabu M, Nomura S, Fukuroi T et al. Periodic production of antiplatelet autoantibody direct against GPIIIa in Cyclic Thrombocytopenia. Acta Haematol 1993; 89: 155-59.
7.	Bauer KD, Duque RE, Shankey TV. Clinical flow cytometry. In: Ault KA. Flow cytometric analysis of platelets. Baltimore: Williams and Wilkins, 1993; 387—403-
8.	Bellucci S, Han ZC, Caen JP. Studies in vitro megakaryocytopoiesis in adult immune thrombocytopenic purpura (ITP). Eur J Haematol 1991; 47: 86-90.
KM- kostni mozeg BM- bone marrow
zv - zvečano število megakariocitov v kostnem mozgu
-	increased numbers of megakariocytes in bone marrow n - normalno število megakariocitov v kostnem mozgu
-	normal megakariocyte count
*	- zvečan odstotek protiteles proti trombocitom
-	increased values of platelet antibodies Tr - število trombocitov v krvi
Pit - platelet count
lb NOVARTIS
Fluvastatin je registriran v Sloveniji pod imenom LESCOL® in je razvrščen na pozitivno listo.
Na voljo je 28 kapsul po 20 mg in 40 mg.
LESCOL
FLUVASTATIN
nadzorovano uravnavanje holesterola
1. Herd JA et al. Effects of Fluvastatin on Coronary Atherosclerosis in Patients With Mild to Moderate Cholesterol Elevations (Lipoprotein and Coronary Atherosclerosis Study /LCAS/). American Journal of Cardiology 1997; Vol. 80. No. 3: 278 - 286
Kaj je LCAS?
LCAS - The Lipoprotein and Coronary Atherosclerosis Study je prva
s fluvastatinom, ki je pokazala, da je za z blago do zmerno povečano koncentracijo holesterola in koronarno srčno boleznijo koristno, če se zdravijo s hipolipemikom.
Ugotovili so, da zdravljenje s fluvastatinom pomembno upočasni napredovanje aterosklerotičnih sprememb na koronarnih arterijah.1
“Do sedaj so bila mnenja strokovnjakov o agresivnem zdravljenju bolnikov z blago do zmerno povečano koncentracijo holesterola deljena. Vendar je tudi blago ali zmerno povečana koncentracija holesterola previsoka za bolnika, pri katerem se razvije koronarna srčna bolezen."
Prof. dr. Antonio M. Gotto, Cornell University, New York
Informacije in literatura so na voljo pri Novartis Pharma Services Inc., Podružnica v Slovenili. Dunaiska 22. 1511 I iuhliana_________________
Strokovni prispevek/Professional article
ODNOS MED KONCENTRACIJO HEPARINA V PLAZMI IN MOTNJO V KOAGULACIJI: ZDRAVLJENJE S HEPARINOM MED HEMODIALIZO
RELATION BETWEEN PLASMA HEPARIN CONCENTRATION AND CLOTTING DISTURBANCE
DURING HEPARIN HEMODIALYSIS
Zora Čede', Dušan A ndoljšefZ
1 Laboratorij za klinično biokemijo, Splošna bolnišnica Trbovlje, Rudarska 7, 1420 Trbovlje 2 Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-04-03, sprejeto 1998-04-06; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-65-8
Ključne besede: aktivirani parcialni tromboplastinski čas; anti-trombinski učinek beparina; hemodializa s heparinom
Izvleček - Izhodišča. Ni znano, kateri od testov daje najboljšo informacijo o antikoagulacijskem učinku beparina. Zelo uporabljan je aktivirani parcialni tromboplastinski čas (aPTC). Hoteli smo ugotoviti, kakšen je odnos med koncentracijo beparina v plazmi in motnjo v koagulaciji, ocenjeno prek aPTC. Za model smo imeli stacionarno stanje kronične ledvične odpovedi in heparin-sko hemodializo (HD).
Bolniki in metode. HD so začeli s heparinom v bolusu (povprečno 30 i.e./kg telesne teže) in nadaljevali z infuzijo (povprečno 16,1 i.e./kg telesne teže/uro). Določili smo aPTČ, koncentracijo hepari-na in aktivnost antitrombina III (A TIII) v poteku 22 epizod HD pri enajstih bolnikih s kronično ledvično odpovedjo. Za aPTČ smo rabili Pathromtin (Behringwerke AG, Marburg, Nemčija). Koncentracijo beparina smo določili fotometrično s kromogenim substratom Berichrom Heparin (Behringiverke AG) in s pomočjo ume-ritvene krivulje z različnimi koncentracijami beparina, aktivnost antitrombina III (ATIII) s pomočjo Antitrombin III Reagent (Be-bringwerkeAG). Statistično pomembne so bile razlike, kjerjep<0,05.
Rezultati. Koncentracija beparina v plazmi se ustali po 120. minuti po začetku zdravljenja, koje doseženo stacionarno stanje. Zatem se koncentracija beparina ne spreminja pomembno. V začetku je učinek beparina, merjen prek aPTČ, nepredvidljiv. Po 120. minuti po začetku pa je bolj predvidljiv: za dodanih 0,10 i.e./ml beparina se aPTČ podaljša v povprečju za 21,5 s.
Zaključek. APTČ ni posebno primeren test za oceno antikoagulacij-skega (antitrombinskega) učinka beparina v začetku zdravljenja, dokler ni doseženo stacionarno stanje. Šele potem aPTČ lahko rabimo za prilagajanje odmerka beparina za zdravljenje.
Uvod
Znano je, da lahko uporabljamo heparin za preprečevanje tromboze. Pri hemodializi z njim preprečimo strjevanje krvi v sistemu (1). Zaplet zdravljenja s heparinom so lahko krvavitve (2). Farmakološki učinek heparina spremljamo z enim od testov ex vivo, ki odrazijo antitrombinski učinek heparina. Še največ podat-
Key words: activated partial thromboplastin time; heparin antithrombin activity; heparin hemodialysis
Abstract — Background. There are several assays of heparin pharmacological effect but it is unknown which assay yields the best information with regard to anticoagulant effect. The commonly used is activated partial thromboplastin time (APTT). We used it to study patients with chronic renal insufficiency on hemodialysis with heparin and the relation between heparin concentration and its antithrombin effect.
Patients and methods. Hemodialysis (HD) was started with un-fractioned heparin in bolus (mean 30 i.u./kg b.w.) and than followed by infusion (mean 16,1 i.u./kg b.w./hour). APTT, plasma heparin concentration and antithrombin acitivity (AT III) was measured in 22 episodes of heparin HD in 11 patients with chronic renal insufficiency. Pathromtin (BehringwerkeAG, Germany) was usedfor measurement of APTT, Antithrombin III Reagent (Behringwerke AG, Germany) for antithrombin III activity, and Berichrom Heparin (Behringwerke AG, Germany)for plasma heparin concentration. The latter was assesedphotometrically, using chromogenic substrate and heparin dilution curve.
Results. Plasma heparin concentration becomes stable at 120. minutes of HD when steady state seems to be reached. After that there were no significant changes in plasma heparin concentration. Heparin antithrombin activity measured by APTT was unpredictable up to 120.minutes of HD. After that the heparin effect was more predictable: 0.10 i.uVml prolongs APTTfor aprox. 21.5 s.
Conclusions. APTT does not seem to be a very suitable test for measuring the anticoagulant (antithrombin) effect of heparin until steady state is achieved. It is only from that time on that the APTT results can be used for adjusting heparin dosage.
kov in kliničnih izkušenj je za aktivirani parcialni trombiplastinski čas (aPTČ) (3).
Želeli smo ugotoviti odnos med koncentracijo heparina v plazmi in njegovim antitrombinskim učinkom, merjenim prek aPTČ.
Za raziskavo smo izbrali bolnike s kronično ledvično odpovedjo, ki so jih zdravili s kronično periodično hemodializo. Domnevali smo, da je farmakokinetika heparina v teh pogojih bolj enostavna kot pri zdravih.
Bolniki in metode
Preiskovance so zdravili s kronično periodično hemodializo v oddelku za dializo Splošne bolnišnice Trbovlje. Med enajstimi bolniki je bilo 5 moških in 6 žensk, starih 41-76 let (povprečna starost 57,3 let, mediana 58 let). V času raziskave je zdravljenje z dializo trajalo 24-172 mesecev. Niso dobivali zdravil in tudi niso imeli bolezni, ki bi vplivala na hemostazo.
V kontrolni skupini je bilo 32 oseb, 17 moških in 15 žensk, starih 31—6l let (povprečno 40,6 let, mediana 40 let), ki so bili povsem zdravi in seveda niso dobili heparina in nobenih zdravil.
Vse preiskovance smo seznanili z namenom raziskave in so nanjo pristali.
Hemodializni postopek je bil izpeljan vselej na enak način. Uporabili so kapilarni dializator s hemofansko membrano (0,9m2, 6,5 pm), s polnilno prostornino 47 ml (Cobe Centrysystem Dialyzer 400 HG, Lakewood, Colorado, ZDA), PVC cevje in bikarbonatno raztopino (Lekodel K-l-G, Lekodel A-l, Lek, Ljubljana, Slovenija). Pred začetkom so dializator izprali z dvema litroma fiziološke raztopine brez heparina. Pretok dializne raztopine je bil 500 ml/ min. Uporabili so monitor Gambro AK-100 (Gambro, Lund, Švedska) in vzdrževali stalen pretok krvi 300 ml/min. Bolniki so imeli arteriovenske fistule.
Začetni odmerek heparina v obliki natrijeve soli (Heparin Krka, Novo mesto, Slovenija), povprečno 30 i.e. (13,4—46,3) i.e./kg telesne teže, so dobili v bolusu, zatem pa v kontinuirani infuziji povprečno 16,1 (6,7-23,2) i.e./kg telesne teže/uro. Z infuzijo heparina so prenehali eno uro pred koncem dialize.
Pri vseh enajstih bolnikih smo napravili meritve med redno 4 urno dializo, dvakrat v razmaku 4 tednov. 4,5 ml krvi smo ujeli v epruveto (Becton Dickinson Vacutainer System Eur, Francija) z natrijevim citratom na odvzemnem mestu pred dializno črpalko v 60., 120., 180., 240. minuti.
Plazmo smo ločili od ostale krvi s centrifugiranjem (1500g, 10 minut). Aktivirani parcialni tromboplastinski čas (aPTČ) in aktivnost antitrombina III (AT III) smo določili takoj, koncentracijo heparina v plazmi pa naenkrat, ko smo zbrali polovico vseh vzorcev plazme, tj. v četrtem in osmem tednu raziskave. Vzorce plazme za določanje koncentracije heparina smo hranili pri -20°C. Za določanje aPTČ smo rabili reagent Pathromtin (Behringwerke AG, Marburg, Nemčija) in koagulometer Fibrintimer (isti proizvajalec). Upoštevali smo navodila proizvajalca. Območje normalnih vrednosti za aPTČ je 34,9 ± 5,7 (x ± 2SD).
Koncentracijo heparina v plazmi smo določili fotometrično s kro-mogenim substratom, z metodo dveh točk. Uporabili smo reagent Berichrom Heparin (Behringwerke AG, Marburg, Nemčija) in upoštevali navodila proizvajalca.
Koncentracijo heparina smo odčitali z umeritvene krivulje: heparin (Krka, Novo mesto, Slovenija) smo dodali plazmi tako, da je bila končna koncentracija 0,00-1,00 i.e./ml.
Koncentracija heparina v vzorcu je bila obratno sorazmerna povečanju absorbance (1).
Območje normalnih vrednosti za koncentracijo heparina v plazmi je 0,00 ± 0,02 i.e/ml (x ± 2SD).
Aktivnost AT III v plazmi smo določili z Antithrombin Reagent (Behringwerke AG, Marburg, Nemčija) in z uporabo koagulome-tra Fibrintimer (isti proizvajalec), upoštevali smo navodila proizvajalca.
Območje normalnih vrednosti za AT III v plazmi je 96 ± 6% (x ± 2SD).
Pri analiznih postopkih za aPTČ, AT III in koncentracijo heparina smo uporabili testno kontrolno plazmo za normalno in patološko območje (Behringwerke AG, Marburg, Nemčija).
Statistično oceno podatkov smo napravili s pomočjo statističnega programa Statistica (StatSoft). Uporabili smo parametrične teste. Test razlik aritmetičnih sredin smo napravili z analizo variance, koeficient linearne korelacije smo izračunali po Pearsonu. Izračunali smo tudi regresijsko premico. Za statistično pomembne smo šteli razlike, kjer je p<0,05.
Rezultati
Aktivirani parcialni tromboplastinski čas (aPTČ) med hemodializo (tab. 1)
Tab. 1. Aktivirani parcialni tromboplastinski čas (aPTC) (s) med hemodializo.
Tab. 1. Activated partial thromboplastin time (aPTT) (s) during hemodialysis.
aPTfi PTTK (s)	N	X	SD	SE
pred before HD	22	34,6	3,0	0,6
60 min.	22	230,5	254,7	54,3
120 min.	22	111,6	46,6	9,9
180 min.	22	109,9	42,3	9,05
po after HD	22	101,7	63,4	13,5
N - število meritev / number of tests HD - hemodializa / hemodialysis
Pred hemodializo se vrednosti aPTČ bolnikov kot pri zdravih osebah (kontrolne skupine), pomembno pa so se razlikovale vrednosti pred potekom hemodialize in po njem.
V	60. minuti hemodialize je bil aPTČ najbolj podaljšan, podaljšanje je bilo glede na predializno vrednost 6,6-krat (x = 6,6, SD 7,2). Prav tako je bila tudi največji variacijski razmak (999 s - 41,5 s = 957,5 s).
V	120. in 180. minuti dialize je bil aPTČ manj podaljšan, zvečanje je bilo glede na predializne vrednosti za 3,3-krat (x = 3,2, SD 1,2 oz.1,1).
Po hemodializi je bil aPTČ še vedno podaljšan, zvečanje je bilo glede na predializne vrednosti za 2,9-krat (x = 2,9, SD 1,6).
Koncentracija heparina med hemodializo (tab. 2)
Tab. 2. Koncentracija heparina v plazmi (i.e Arni) med hemodializo.
Tab. 2. Plasma heparin concentration (i.u./ml) during hemodialysis.
Heparin	N	X	SD	SE
pred before HD	22	0,01	0,02	0,00
60 min.	22	0,50	0,23	0,05
120 min.	22	0,44	0,17	0,04
180 min.	22	0,45	0,18	0,04
po after HD	22	0,45	0,19	0,04
N - število meritev / number of tests HD - hemodializa / hemodialysis
Pred hemodializo so bile vrednosti heparina v plazmi kot pri zdravih osebah (kontrolne skupine), med zdravljenjem s heparinom pa so se vrednosti seveda pomembno razlikovale.
V	60. minuti hemodialize je bila koncentracija heparina v plazmi največja, prav tako pa tudi razlike med najmanjšo (0,06 i.e./ml) in največjo (0,95 i.e./ml) izmerjeno koncentracijo.
V	120. in 180. minuti je bila koncentracija heparina v plazmi' pomembno manjša kot v 60. minuti. Tudi razpršenost vrednosti je bila manjša in vse izmerjene koncentracije heparina so bile manjše kot 0,8 i.e/ml.
Po hemodializi je bila koncentracija heparina v plazmi še vedno enako zvečana kot v 180.minuti.
Aktivnost antitrombina HI (AT HI) med hemodializo (tab. 3)
Predializne vrednosti aktivnosti AT III (x = 84,3%, SD 6,4%) bolnikov so bile v primerjavi z zdravimi (x = 95,6%, SD = 3,1%) pomembno manjše (p<0,05) .
Aktivnost antitrombina III se sicer med dializo ni pomembno spreminjala.
Tab. 3- Aktivnost antitrombina III (AT III) v plazmi (%) med hemodializo.
Tab. 3. Plasma antithrombinIII(ATIH) (%) during hemodialiysis.
AT III	N	X	SD	SE
pred before HD	22	84,3	6,4	1,9
60.min.	22	83,9	15,5	4,7
120 min.	22	85,8	10,1	3,1
180 min.	22	88,5	7,5	2,3
po after HD	22	88,4	8,2	2,5
N	- število meritev / number of tests
HD - hemodializa / hemodialysis
Odnos med aktiviranim parcialnim tromboplastinskim časom (aPTČ) in koncentracijo heparina v plazmi (tab. 4)
Tab. 4. Odnos med aktiviranim parcialnim tromboplastinskim časom (aPTČ) in koncentracijo heparina med hemodializo.
Tab. 4. Correlation between activated partial thromboplastin time (aPTT) and plasma heparin concentration during hemodialysis.
	r	SE	y “ ß„ + ß,x
pred before HD	-0,02	3,05	
60 min.	0,47	230,05	y - 522,34x - 30,903
120 min.	0,77	30,64	y - 214,45x + 16,701
180 min.	0,79	26,49	y - 184,24x + 25,869
po after HD	0,78	40,26	y = 265,28x - 17,219
r - koeficient korelacije (Pearson) / correlation coefficient (Pearson)
SE - standardna napaka / standard error regresijska premica y = aPTČ (s), x = heparin (i.e./ml) regression line y = aPPT (s), x = heparin (i.u./ml)
V 60. minuti hemodialize je povezanost med vrednostmi aPTČ in koncentracijami heparina v plazmi majhna, zatem pa se zvečuje. V 120. minuti hemodialize je povezanost razmeroma velika. V tem časovnem prerezu s povečanjem koncentracije heparina za 0,10 i.e/ml povzročimo v povprečju za 21,5 s daljši aPTČ. V180. in 240. minuti (ob koncu) hemodialize je povezanost med obema spremenljivkama podobna.
Razpravljanje
V	raziskavi smo zajeli 11 bolnikov oziroma 22 epizod 4-urne kronične hemodialize. Pri vseh bolnikih je zdravljenje trajalo že nekaj časa (24-172 mesecev), da lahko stanje bolnikov štejemo za stacionarno.
Kontrolna skupina zdravih oseb je nekaj mlajša od bolnikov. Zdrave starostnike je za raziskavo težko najti. Znano je, da se aktivnost AT III z leti ne spreminja, na izid aPTČ pa vplivajo predvsem pogoji izvedbe testa.
V	začetku so bolniki dobili heparin v bolusu in zatem v trajni infuziji. Odmerek zdravila so določili že ob poprejšnjih hemo-dializah, da ni prišlo do koagulacije krvi v sistemu. Heparin je bilo edino zdravilo, ki je vplivalo na hemostazo.
Aktivirani parcialni tromboplastinski čas (aPTČ) je najbolj pogosto uporabljana metoda za merjenje učinka heparina na koagulacijo krvi. Čas testa je tem daljši, čim večji je antitrombinski učinek heparina oziroma motnja v koagulaciji. Na izid testa lahko vplivajo številni dejavniki, npr. pomanjkanje enega ali več koagulacijskih faktorjev, prisotnost njihovih inhibitorjev, manjša koncentracija fibrinogena, trombocitni faktor 4 (5-7). Znano je, da vpliva na aPTČ uporabljeni laboratorijski reagent in drugi pogoji izvedbe testa, npr. različen koagulometer (8). Zaradi tega so podatki enega laboratorija z drugim težko primerljivi. Zaenkrat ni mednarodnega standarda za aPTČ kot je npr. za protrombinski čas. Zelo malo je bilo poskusov standardizacije testa (9, 10).
Proizvajalec reagenta, ki smo ga uporabili, priporoča, da napravimo test v dveh urah po odvzemu krvi. Ugotovili smo, da so se izidi
aPTČ heparinizirane plazme pomembno razlikovali, če smo napravili test takoj ali eno uro po odvzemu krvi. Pri aPTČ neheparinizirane plazme ni bilo takih razlik.To opazovanje nismo našli opisano. aPTČ smo določili takoj po odvzemu krvi.
Farmakološki učinek heparina lahko merimo na različne načine, npr. prek aPTČ, aktiviranega časa koagulacije, merjenja učinka na aktivirani faktor X in na trombin. Ni znano, kateri od laboratorijskih preskusov daje boljšo informacijo o ravni in antikoagulacijskem učinku heparina (3). Razen tega je heparin mešanica različnih molekul z različnimi farmakokinetičnimi lastnostmi (3).
Za merjenje koncentracije heparina smo uporabili metodo po Tienu in sod. z uporabo kromogenega substrata (4). Z njo določimo koncentracijo heparina posredno prek inaktivacije aktiviranega faktorja X in s pomočjo umeritvene krivulje.
Antitrombin III smo določili prek aktivnosti encima in ne prek koncentracije beljakovine.
Raziskali smo odnos med učinkom heparina na koagulacijo in njegovo koncentracijo pri bolnikih med kronično periodično hemodializo, kjer so uporabili heparin. Bolnike smo preiskovali v stacionarnem stanju bolezni.
Domnevamo lahko, da pri teh bolnikih ni odstranjevanja heparina prek ledvic (16, 17).
Ugotovili smo, da se raven heparina v plazmi ustali 120 minut po odmerku heparina v bolusu in sočasnem začetku infuzije. 60 minut po začetku zdravljenja je koncentracija heparina pri posameznem bolniku zelo različna. Nismo je korigirali glede na začetni odmerek heparina (i.e./kg telesne teže). Vsekakor pa v tem časovnem preseku ni povezanosti med ravnijo heparina in njegovim učinkom, če ga merimo prek aPTČ. Domnevamo lahko, da je to posledica velike koncentracije heparina in razpodelitve v obtoku in obenem vzpostavljanja ravnovesja v mehanizmu odstranjevanja heparina. Zmanjšanje učinka heparina na koagulacijo je prek dveh mehanizmov. Heparin se veže na proteine v plazmi, na endotelijske celice in monocite, izloča pa se prek ledvic (11-13). Hitro se zmanjšuje antitrombinski učinek heparina (inhibicija trombina), verjetno zaradi vezave večjih verig heparina na endotelijske celice in monocite. Z endocitozo in depolimerizacijo heparina nastajajo manjše verige z ohranjeno sposobnostjo za inhibicijo aktiviranega F X. Zato se po enkratnem dajanju nefrakcioniranega heparina sčasoma zvečuje odnos inhibicija F X : inhibicija trombina (14). Čas aPTČ se skrajšuje.
Po terapevtskih odmerkih heparina je antikoagulacijski (antitrombinski) učinek heparina nelinearen zaradi kombinacije mehanizmov odstranjevanja: saturacija, t.j. vezava na proteine in celice, je hitra, izločanje skozi ledvici je počasno. Zato z naraščanjem odmerka heparina ugotovimo neproporcionalnost antikoagulacij-skega učinka in tudi njegovega trajanja (3, 15).
Po 120. minuti zdravljenja s heparinom se njegova raven ni pomembno spreminjala in v tem času je odnos med koncentracijo in učinkom heparina predvidljiv. Domnevamo lahko, da je v času stacionarnega stanja učinek heparina, merjen prek aPTČ, predvidljiv.
Aktivnost AT III se med hemodializo ni pomembno spreminjala, da bi s tem vplivala na izid aPTČ.
aPTČ je razmeroma neprimeren test za oceno antikoagulacijskega (antitrombinskega) učinka v začetnem obdobju zdravljenja s heparinom, dokler ni doseženo stacionarno stanje. Sele takrat vrednosti aPTČ lahko rabimo za prilagajanje terapetskega odmerka heparina.
Literatura
1.	Keeler F, Seemann J, Preuschoff L, Offermann G. Risk factors for system clotting in heparin free hemodialysis. Nephrol Dial Transpl 1991; 5: 802-7.
2.	Schwartz RD. Haemorrhage during high-risk hemodialysis using controlled heparinisation. Nephron 1981; 28: 65-9.
3.	Fiore L, Deykin D. Anticoagulant therapy. In: Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps Th J eds. Williams Hematology. 5lh ed. New York: McGraw Hill, 1995: 1562-7.
4.	Teien AN, Lie M, Abildgaard U. Assay of heparin in plasma using a chromogenic substrate for activated factor X. Thromb Res 1976; 8: 413-6.
5.	Hougie C. Partial thromboplastin time and activated thromboplastin time tests. In: Williams WJ, Beutler E, Ersler A, Lichtman M eds. Hematology 4,h ed. New York: McGraw Hill, 1990: 1290-4.
6.	Glynn MFX. Heparin monitoring and thrombosis. Am J clin Path 1979; 71: 377-400.
7.	Levine SP, Sorenesen RR, Harris MA, Kniefiem LK. The effect of platelet factor 4 on assay of plasma heparin. Br J Haemat 1984; 57: 585-96.
8.	Barrowcliffe TW, Gray E. Studies of phospholipid reagents in coagulation. II. Factors influencing their sensitivity to heparin. Thromb Haemostas 1981; 46 (2): 634.
9.	Koepke JA. Partial thromboplastin time test - proposed performance guidlines. ICSH panel on the PTT. Thromb Haemostas 1986; 55: 143—4.
10.	Ray M, Carroll P, Smith I, Hawson G. An attempt to standardise APTT reagents used to monitor heparin therapy. Blood Coag Fibr 1992; 3: 743-8.
11.	Hiebert LM, Jacques CB. The observation of the heparin on endothelium after injection. Thromb Res 1976; 8: 195-204.
12.	Friedman Y, Arsenis C. Studies on the heparin sulphamidase activity from rat spleen: intracellular distribution and characterization of the enzyme. Biochem J 1974; 139, 699-708.
13.	Follea G, Laville M. Pozet N, Dechavanne M. Pharmacokinetic studies of standard heparin and low molecular heparin in patients with chronic renal failure. Haemostas 1986; 16: 147-51.
14.	Barzu T, van Rijn JLML, Petitou M et al. Heparin degradation in the endothelial cells. Thromb Res 1987; 47: 601-9.
15.	Ambrosioni E, Strocchi E. Pharmacokinetics of heparin and low molecular weight heparins. Haemostas 1990; 20 (1): 94-7.
16.	Horry B, Cludet MH, Magnette J et al. Pharmacokinetics of very low molecular weight heparin in chronic renal failure. Thromb Res 1991; 63: 311-7.
17.	Cadroy Y, Pourrat J, Baladre MF et al. Delayed elimination of enoxaparin in patients with chronic renal insufficiency. Thromb Res 1991; 63: 385-90.
Pregledni prispevek/Review article
KRONIČNA MIELOIČNA LEVKEMIJA IN MOLEKULARNO GENETIČNI NAČINI UGOTAVLJANJA BOLEZNI
CHRONIC MYELOID LEUKAEMIA AND RESPONDENT MOLECULAR DIAGNOSTIC METHODS
Tadej Pajič' 2, Peter Černelč1
1 Hematološka klinika, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana 2 Medicinski center za molekularno biologijo, Inštitut za biokemijo, Medicinska fakulteta, Vrazov trg 2, 1000 Ljubljana
Prispelo 1998-04-07, sprejeto 1998-04-16; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-69-72
Ključne besede: kronična mieloična levkemija; kromosom Philadelphia; molekularno genetične metode; hibridizacija po Sout-hemu; reverzno transkripcijska - verižna reakcija polimerizacije
Izvleček— Kronična mieloična levkemija (KML)je klonska mielo-proliferativna bolezen, ki nastane z neoplastičnopreobrazbo matičnih krvotvornih celic. Kromosom Philadelphia je prva opisana kromosomska nepravilnost, ki sojo leta 1960 ugotovili pri KML. Ta skrajšani kromosom 22 nastane z recipročno translokacijo med končnim segmentom 34 dolgega kraka (q) kromosoma 9 in segmentom qll, kromosoma 22 (t(9;22) (q34;qll)). Prelomno mesto je na kromosomu 9 znotrajproto-onkogena ABL, na kromosomu 22 pa znotraj gena BCR. Posledica translokacije t(9;22) (q34;ql l)je tvorba hibridnega gena BCR-ABL na Ph kromosomu in gena ABL-BCR na9q+ kromosomu. Hibridni gen BCR-ABL označuje himerični protein z molekularno maso 210 kd (p210BCR/ ABL), ki ga povezujejo z nekontrolirano proliferacijo levkemičnih celic pri KML. Vloga gena ABL-BCR pri KML ostaja nejasna. Za veliko večino bolnikov s KML je kromosom Philadelphia specifični označevalec neoplastičnega klona, ki ga ugotavljamo z različnimi metodami. Ob standardnih citogenetičnih metodah se pri ugotavljanju bolezni in spremljanju minimalnega preostalega klona levkemičnih celic po zdravljenju uporabljajo tudi zelo občutljive in specifične molekularno genetične metode kot sta hibridizacija po Southemu in reverzno transkripcijska verižna reakcija polimerizacije. Z metodo hibridizacije po Southemu je mogoče ugotoviti več kot 95% kromosom Ph pozitivnih in tudi velik del kromosom Ph negativnih bolnikov s KML. Reverzno transkripcijska verižna reakcija polimerizacije je izmed vseh najobčutljivejša metoda in je najprimernejša za spremljanje bolnikov s KML v popolni citogene-tični remisiji po zdravljenju.
Uvod
Kronična mieloična levkemija (KML) je klonska mieloproliferativ-na bolezen, ki nastane s trajno preobrazbo matičnih krvotvornih celic. Ta prizadene mieloične, monocitne, eritroidne, megakari-ocitne, celično vrsto B in včasih tudi celično vrsto T. Zanjo je značilna strukturna kromosomska nepravilnost, recipročna trans-lokacija (1, 2), ki vodi do nastanka t.i. kromosoma Philadelphia (t(9;22)(q34;ql 1)). Kromosom Philadelphia (kromosom Ph) je značilen za 90% do 95% bolnikov s KML, 2-5% otrok z akutno limfo-blastno levkemijo (ALL), 10-20% odraslih bolnikov z ALL, medtem ko se pri bolnikih z akutno mieloblastno levkemijo (AML) in malignimi limfomi redko pojavi (3). Etiologija KML ni znana. Lah-
Key words: chronic myeloid leukaemia; Philadelphia chromosome; molecular diagnostic methods; Southern blotting; reverse transcriptase- polymerase chain reaction (RT-PCR)
Abstract - Chronic myeloid leukaemia (CML) is a clonal myeloproliferative disorder resulting from the neoplastic transformation of the primitive hemopoietic stem cell. The Philadelphia chromosome (Ph chromosome) was the first described consistent chromosome aberration identified in CML in 1960. This shortness chromosome 22 is a product of a reciprocal translocation involving the long arm (q) of chromosome 9, band 34, and band qll ofchromosome 22, (t(9;22) (q34;qll)). Molecular analysis has localized the breakpoint on chromosome 9 to proto-oncogene ABL, and the breakpoint on chromosome 22 to BCR gene. The t(9;22) (q34;ql 1) results in the formation of two hybrid genes, BCR-ABL on the Ph chromosome and ABL-BCR on 9q+. The hybrid BCR-ABL gene encodes a chimeric protein with a molecular weight of 210 kd (p210BCR/ABL) which is associated with the uncontrolled proliferation of the leukaemic cells in the CML. The role of the ABL-BCR fusion gene remains unknown. For the great majority of patients with CML, the Ph chromosome is a specific marker of the malignant clone that can be detected by different methods. The standard cytogenetic and also sensitive and specific molecular methods like Southern blotting and reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) can be used in the diagnosis andfollowup of the minimal residual disease in the CML patients. Using Southern blotting, a rearrangement is detectable in more than 95% of Ph-positive cases and also in a significant proportion of Pb-nega-tive cases. RT-PCR is by far the most sensitive assay and is most appropiate for monitoring patients who are in complete cytogenetic remission.
ko nastane po obsevanju z ionizirajočimi žarki. Preživeli v atomski nesreči v Hirošimi in Nagasakiju so imeli znatno večjo pogostnost za KML (2). Bolezen poteka v dveh ali treh obdobjih. Začetno kronično obdobje navadno vodi preko vmesnega oziroma pospešenega poteka bolezni do blastne preobrazbe. Bolezen se lahko izjemoma pojavi z blastno preobrazbo že ob ugotovitvi bolezni (1).
Molekularne spremembe pri KML
Kromosom Philadelphia je prva opisana kromosomska nepravilnost, ki so jo leta I960 ugotovili pri KML (4). Sprva so mislili, da
ABL
lb

a2 a3
a11
področje prekinitev v genu ABL; > 300 kb
e1
BCR
e1’	e2’
\ /
e2
I
m-bcr
e6
b2 b3
\ /
<>
M-bcr
e19
I
O-
p-bcr
Kromosom
Philadelphia
Hibridni gen BCR-ABL pri KML
1 1	Ib la . 1 1	a2 II
1 1 b1 b2	b3	
M-bcr zaporedje . nukleotidov
ABL zaporedje nukleotidov
Sl. 1. Prikaz prekinitvenih mest v genu ABL in BCR pri recipročni translokaciji t(9;22) (q34;qll) in kromosoma Philadelphia pri KML. Okvirji prikazujejo eksone, povezovalne črte pa introne. Z vodoravnimi dvoglavimi puščicami so prikazana večja (major-bcr; M-hcr), manjša (minor-bcr; m-bcr) in mikro (micro-bcr;■ m-bcr)prekinitvenapodročja (breakpoint cluster region) v genu BCR.
Fig 1. Schematic representation of the ABL and the BCR genes with breakpoint locations in reciprocal translocation t(9;22)(q34;qll) and the Philadelphia chromosome associated with CML. Exons are represented by boxes and introns by connecting horizontal lines. Major (M-bcr), minor (m-bcr) and mikro (m-bcr) breakponit cluster regions in BCR gen are illustrated by double-headed horizontal arrows.
gre za delecijo kromosomov, vendar so leta 1973 z izboljšanimi načini proganja ugotovili (5), da skrajšani kromosom 22 nastane kot posledica recipročne translokacije med dolgim krakom (q) kromosoma 9, v predelu končnega segmenta 34, in segmentom qll, kromosoma 22 (t(9;22) (q34;qll)). Prelomno mesto se na kromosomu 9 nahaja znotraj proto-onkogena ABL, na kromosomu 22 pa znotraj BCR gena. Nukleotidno zaporedje obeh genov je znano (7). Posledica translokacije ni samo tvorba hibridnega gena BCR-ABL na kromosomu Ph ampak tudi hibridni gen ABL-BCR na kromosomu 9q+, ki so ga ugotovili pri pribiližno dveh tretjinah bolnikov s KML. Vloga tega transkripcijsko aktivnega gena pri KML ostaja nejasna (3). Velikost proteina, ki ga označuje hibridni gen BCR-ABL preko himerične prenašalne RNA (messenger RNA; mRNA), se spreminja zaradi različnih prelomnih mest znotraj gena BCR na kromosomu 22, ki vsebuje 23 eksonov. Do danes so ugotovili tri področja prelomnih mest (breakpoint cluster region; bcr) na genu BCR: večje (major-bcr; M-bcr), manjše (minor-bcr; m-bcr) in mikro (micro-bcr; m-bcr), ki se zelo redko pojavi (Jo). Pri KML se velika večina prelomov pojavi znotraj večjega področja (M-bcr). To področje je dolgo 5,8-kilobaznih parov (kb) in vsebuje pet eksonov, označenih z 12 do 16. Vendar jih danes največkrat označujemo na star način z bi do b5. Cepitev nastane (8) znotraj intronskega zaporedja med eksoni b3 in b4 ali med b2 in b3 BCR gena (sl. 1).
Gen ABL vsebuje dva alternativna prva eksona lb in la ter 10 dodatnih eksonov (sl. 1). Prelom lahko nastane znotraj več kot 300 kb dolgega področja od 5' konca do eksona 2 v genu (9). Nastaneta lahko različna hibridna gena (sl. 1), ki združujeta ekson a2 gena ABL z eksonom b2 (b2a2) ali eksonom b3 (b3a2) gena BCR (10). Čeprav nastala hibridna gena lahko vključujeta eksona
ABL la in lb, pa iz njih prepisana mRNA vsebuje le stičišče eksonov b2a2 ali b3a2. Hibridni molekuli BCR-ABL mRNA označujeta himerični protein, molekularne mase 210 kD (p210BCR/ABL). Ta protein ima večjo tirozin kinazno aktivnost kot protein, ki ga označuje normalni gen ABL. Molekularna masa slednjega je 145 kD (2). Za himerični protein p210BCS/ABl se predvideva, da ima onkogensko aktivnost. Menijo, da je odgovoren za nekontrolirano proli-feracijo levkemičnih celic, kar so potrdili s preizkusi in vitro in in vivo pri miših (11-13).
Manjše prelomno področje (m-bcr) je soudeleženo pri nastanku kromosoma Ph pri dveh tretjinah bolnikov s kromosom Ph pozitivno ALL in le redko pri KML. Ce-pitveno mesto se nahaja znotraj intronskega zaporedja med dvema alternativnima eksonoma e2’ in e2 (sl. 1). Nastane hibridni gen BCR-ABL, brez dveh eksonov el' in e2', ki se prepiše v 7,5-kb velik transkript BCR-ABL, ki vsebuje stičišče eksona ela2. Pri translaciji nastane 190 ali 185 kD velik protein BCR-ABL (pl90BCR/ ABL), ki se redko pojavlja primarno pri KML (3, 14). Ta protein ima približno petkrat večjo tirozin kinazno aktivnost kot p210BCE/ ABL in ga zato pogosteje povezujejo z akutno kot s kronično mieloično levkemijo (15). Protein p230BCR/ABI- se zelo redko pojavlja pri Ph pozitivnih levkemijah in je posledica prekinitve v mikro področju gena BCR. Tako kot prejšnja proteina ima tudi ta tirozin kinazno aktivnost (16).
Opisani so bili še redki primeri KML, pri katerih je bilo prekinitveno mesto v genu BCR zunaj običajnih treh področij ali pa je šlo za nenavadne prekinitve znotraj gena ABL. Slednje je privedlo do transkriptov BCR-ABL s stičiščem med eksoni b2a3 ali b3a3. Opaženi so bili tudi nepravilno združeni transkripti, ki so vsebovali spremenljivo dolžino vgrajenega intronskega zaporedja (3). Ph-negativna KML obsega primere, pri katerih se lahko z molekularnimi metodami ugotovi značilen gen BCR-ABL. Drugi bolniki so BCR-ABL negativni in imajo običajno drugačno obliko bolezni (3).
Dodatne kromosomske nepravilnosti so značilne za pospešeni potek bolezni. Najpogostejši so pojavi dodatnega kromosoma Ph, trisomija 8 in izokromosom 17q. Te spremembe pa niso tako stalne kot je primarna translokacija t(9;22) (2). Kjub novim znanjem pa vzroki za napredovanje bolezni ostajajo neznani (6).
Molekularno genetične metode za ugotavljanje in spremljanje KML
Za velik del bolnikov s KML je kromosom Ph specifični označevalec malignega klona. Običajna metoda za ugotavljanje bolezni in za ugotavljanje kakovosti remisije bolnikov po zdravljenju je cito-genetična analiza metafaz v celicah kostnega mozga (17). Hibridizacija po Southemu analizira genomsko DNA in določi, če je gen BCR preurejen. Reakcijo, pri kateri iz specifične mRNA z nasprotnim prepisovanjem dobimo komplementarno DNA (complementary DNA; cDNA) in naprej DNA z verižno reakcijo polimerizacije, imenujemo angleško reverse transcriptase - polymerase chain reaction (RT-PCR). S to reakcijo lahko določimo prisotnost ali odsotnost transkripta BCR-ABL. S hibridizacijo Western analiziramo lizirane celice in določamo prisotnost ali odsotnost proteina
BCR-ABL. Pri fluorescenčno in situ hibridizaciji (FISH) pa z uporabo barvno označenih delcev DNA za BCR in ABL nukle-otidna zaporedja gena ugotavljamo hibridni gen BCR-ABL na interfaznih in/ali me-tafaznih kromosomih v celicah (18).
Ugotavljanje minimalnega preostalega klona levkemičnih celic
Hlmerični gen BCR-ABL
I
b2
b3±
\—H
lb±
la± a2
odstranjeno zaporedje nukleotidov

prepisovanje in dozorevanje mRNA

V zadnjem času potekajo številne raziska- mRLLA^113	5 'BCR eksoni	b1	b2	b3+	a2	a3 In ostali ABL eksoni
ve za ugotavljanje minimalnega preosta-						
lega klona levkemičnih celic (»minimal residual disease») pri bolnikih s KML po zdravljenju (19, 20). Ob ugotovitvi bolezni ali pri ponovitvi imajo bolniki s KML navadno več kot 1012 malignih celic. V remisiji pa je od 0 pa do največ 1010 levkemičnih celic (citogenetika, hibridizacija po Southernu, hibridizacija Western). RT-PCR je do zdaj najbolj občutljiva metoda, ker lahko zazna eno samo maligno, pozitivno celico BCR-ABL med 10’ do 106 normalnimi celicami. Vendar lahko tudi pri BCR-ABL RT-PCR negativnih bolnikih preostanek malignih celic, ki jih metoda ni zaznala, povzroči povrnitev bolezni. Pomen ugotavljanja minimalnega preostalega klona levkemičnih celic je omogočiti ustreznejšo oceno uspeha zdravljenja, oceniti verjetnost ponovitve bolezni in izbrati najprimernejši način zdravljenja. Pri KML to lahko pomeni odločitev o presaditvi kostnega mozga (18).
cDNA sinteza
Komplementarna
cDNA
5 'BCR eksoni	b1	b2	b3±	a2
H ABL oligonukleotidni začetnik
Y -<------1---1 ABL oligonukleotidni
PCR začetnik
M-bcr PCR oligonukleotidni
Sl. 2. Določanje himerične BCR-ABL mRNA s pomočjo reverzno transkripcijske - verižne reakcije polimerizacije. Okvirji na himeričnem genu BCR-ABL prikazujejo eksone. Ekson b3± označuje njegovo spremenljivo prisotnost v himeričnem genu in transkriptu mRNA.
Fig 2. Detection of the BCR-ABL chimeric mRNA by the RT-PCR. Boxes on the chimeric BCR-ABL gene denote exons. Exon b3± denotes the variable presence of this exon in the chimeric gene and mRNA transcript.
Hibridizacija po Southernu
Ta analiza temelji na ugotovitvi, da se cepitveno mesto znotraj gena BCR navadno pojavi v zelo omejenem predelu, tj. 5,8 kb velikem glavnem področju (M-bcr) gena BCR (sl. 1). Genomsko DNA cepimo z do tremi restrikcijskimi encimi. Nato jo ločimo na agaroznem gelu in prenesemo na trdno podlago. Sledi hibridizacija z enim ali dvema kratkima označenima delcema DNA (DNA sondama) iz M-bcr področja (18, 21). Z avtoradiografijo prikažemo madež, ki ustreza nespremenjenemu alelu BCR. Pri bolnikih s KML sta lahko prisotna eden ali dva dodatna madeža. Ta ustrezata preureditvi BCR-ABL na kromosomu Ph in/ali recipročni preureditvi na 9q+ kromosomu. Na ta način je mogoče zajeti več kot 95% Ph pozitivnih bolnikov in tudi znatni del Ph-negativnih bolnikov s KML (18, 22). V redkih primerih je ta analiza negativna zaradi cepitvenega mesta zunaj omenjenega področja ali mutacije prizadetega alela BCR (18). Z denzitometričnim merjenjem avtoradi-ografskega signala lahko ocenimo delež celic s preureditvijo BCR. To naredimo tako, da izračunamo količnik, ki je opredeljen kot 2-krat preurejen signal deljen s seštevkom preurejenega in normalnega signala. Molekularne spremembe po zdravljenju na osnovi razmerja BCR se znatno razlikujejo od opredeljenih citogenetičnih (19, 23). Na osnovi izkustvenih povezav med citogenetičnimi spremembami in zdravljenjem lahko predvidijo uspeh zdravljenja (19). Za analize se uporablja periferna venska kri, saj je spremenjen klon celic v periferni krvi in kostnem mozgu (18).
Verižna reakcija pomnoževanja DNA
Verižna reakcija polimerizacije omogoča hitro in specifično po-množevanje določenega segmenta genomske DNA in vitro s po-
močjo termostabilne polimeraze DNA in ustreznih oligonukleoti-dnih začetnikov. Nukleotidno zaporedje le-teh se prilega na 5’ konec vsake od verig tarčne DNA, med katerima je del DNA, ki se pomnožuje.
Pri KML so cepitvena mesta za t(9,22), še posebej znotraj gena ABL, široko razpršena, zato ne omogočajo uporabiti preposto analizo PCR na osnovi genomske DNA. Za ugotavljanje se uporablja himerična specifična mRNA, značilna za KML. Ta se najprej prepiše v komplementarno DNA z uporabo naključnih ali specifičnih oligonukleotidov ABL in encimov, ki omogočajo tak prepis. Komplementarna DNA je osnova za verižno reakcijo polimerizacije s pomočjo oligonukleotidnih začetnikov (sl. 2), ki se prilegajo v M-bcr (ekson 1 ali 2) in področju ABL (ekson 2 ali 3) (21).
Z agarozno ali poliakrilamidmo gelsko elektroforezo določimo velikost pomnožene DNA iz himeričnega gena. Pri veliki večini bolnikov s KML sta možna dva različno velika pridelka verižne reakcije polimerizacije (b3a2, b2a2), ki se razlikujeta za 75 bp. Ta dolžina predstavlja M-bcr ekson 3 (sl. 2). Redko sta pri istem bolniku prisotna oba (21). S ponovnim pomnoževanjem v prvi reakciji dobljene DNA s pomočjo oligonukleotidnih začetnikov, ki se prilegajo znotraj prej pomnoženega dela DNA, se poveča občutljivost reakcije. Ta metoda se imenuje ‘nested PCR’ in je posebej primerna za spremljanje bolezni bolnikov v remisiji bolezni (19). Občutljivost in specifičnost te reakcije se lahko še naprej poveča z različnimi hibridizacijskimi metodami kot je npr. metoda po Sout-hemu ali kolorimetrična metoda (DNA Enzyme Immunoassay, DEIA), ki temelji na uporabi monoklonskih protiteles, ki specifično reagirajo z dvojno vijačno DNA, tj. hibridizirano DNA (24). Za diagnostične vzorce je bila predlagana tudi t.i. večkratna verižna reakcija polimerizacije (multiplex PCR). Pri tej se sočasno določa več vrst transkriptov BCR-ABL in transkript BCR kot interna kon-
trola v eni sami reakciji (25). Ta metoda omogoča detekcijo tipičnih transkriptov BCR-ABL kot so b2a2 in b3a2, neznačilnih združitev kot npr. transkriptov brez eksona ABL 2 (b2a3 in b3a3) ali transkriptov, ki jih dobimo izven področja M-bcr, tj. ela2 ali e6a2 (25, 26).
Izsledki preiskav v krvi in kostnem mozgu bolnika so podobni, tako da se za diagnostiko običajno uporablja periferna kri bolnikov (18). Metoda je hitra in daje rezultate že v 24 do 48 urah. Ima pa tudi nekatere pomankljivosti. Zaradi velike občutljivosti metode je večja nevarnost napačnih pozitivnih rezultatov. Zaradi tega je potrebno preprečiti kontaminacijo novih vzorcev z DNA iz prejšnjih reakcij in izvesti negativne in pozitivne kontrole istočasno z vzorcem. Napačno negativni rezultati se lahko pojavijo tudi zaradi razpada RNA v vzorcu. Ta možnost se izključi s pomnože-vanjem kontrolnega zaporedja mRNA, ki nastane iz ABL ali nespremenjenega gena BCR. Neznačilna prelomna mesta tudi lahko vodijo do pojava napačno negativnih rezultatov (21).
Verižna reakcija polimerizacije je visoko občutljiva preiskava za ugotavljanje preostalega malignega klona levkemičnih celic po presaditvi kostnega mozga in po terapiji z interferonom-a. Izsledki raziskav potrjujejo, da je bila večina bolnikov s KML prvih šest mesecev po presaditvi kostnega mozga PCR pozitivna, kar zmanjšuje prognostični pomen preiskave. Pozitivni izsledek PCR po več kot 6 mesecih po transplataciji je lahko povezan z zvečano nevarnostjo ponovitve bolezni. Bolniki, z negativnim PCR rezultatom več kot eno leto po presaditvi kostnega mozga, imajo manjše tveganje za povrnitev bolezni. S to kvalitativno preiskavo pa ne moremo predvideti ponovitve bolezni pri posameznem bolniku. Znani so primeri,'ki so ostali v klinični in citogenetični remisiji eno do dve leti po presaditvi kostnega mozga kljub pozitivnim rezultatom PCR (18, 19). Zato je bila razvita zahtevna kvantitativna metoda verižne reakcije polimerizacije za določanje ostanka transkriptov BCR-ABL, t.i. kompetitivna metoda PCR (competitive PCR). Standardiziran rezultat se izrazi kot razmerje BCR-ABL proti normalnemu transkriptu ABL (notranji standard) v odstotkih (19). Raziskave so potrdile, da se rezultati kvantitativnega PCR dobro ujemajo s citogenetičnim ugotavljanjem Ph kromosoma (27). Pri bolnikih po presaditvi kostnega mozga je naraščanje BCR-ABL mRNA najavilo ponovitev bolezni (28, 29). Po zdravljenju z IFN-a lahko dosežemo morfološko in citogenetično remisijo, vendar s PCR metodo prikažemo ostanek ali samo trenutno izgubo hime-rične mRNA (18, 19, 30). Bolnikom, katerim se znatno spreminja razmerje BCR-ABL/ABL ali BCR, je potrebno narediti citogenetič-ne preiskave. S citogenetičnimi preiskavami lahko ugotovijo dodatne kromosomske nepravilnosti, ki so znak razraščanja malignega klona celic že pred pojavom kliničnih znakov (19).
Zaključek
Odzivnost na zdravljenje KML je pomemben prognostični kazalec pri oceni napovedi poteka bolezni ter izbiri najustreznejšega načina zdravljenja. Še vedno ostaja vprašanje, kako najbolje spremljati odgovor bolnikov na zdravljenje. Molekulama določitev translo-kacije t(9,22) in poznavanje strukture hibridnih genov BCR-ABL sta omogočili ugotavljanje in spremljanje bolezni z molekularno genetičnimi metodami, kot je hibridizacija po Southernu, rever-zno transkripcijska - verižna reakcija polimerizacije (RT-PCR), fluorescenčna hibridizacija in situ (FISH) in hibridizacija Western. Vse so pomembne dopolnilne preiskave, s katerimi lahko znatno izboljšamo oceno uspeha zdravljenja pri bolnikih s KML.
Literatura
1.	Rowley JD, Aster JC, Sklar J. The clinical applications of new DNA diagnostic technology on the management of cancer patients. JAMA 1993; 270: 2331-7.
2.	Cortes JE, Talpaz M, Kantarjian H. Chronic myelogenous leukemia: a review. The Am J Med 1996; 100: 555-70.
3.	Melo JV. BCR-ABL gene variants. Bailliere’s Clinical Haematology 1997; 10: 203-22.
4.	Nowell P, Hungerford D. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia. Science I960; 132: 1497-7.
5.	Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature 1973; 243: 290-3.
6.	Groffen J, Heisterkamp N. The chimeric BCR-ABL gen. Bailliere’s Clinical Haematology 1997; 10: 187-201.
7.	Chissoe SJ, Bodenteich A, WangY-F et al. Sequence and analysis of the human ABL gene, the BCR gene, and regions involved in the Philadelphia chromosomal translocation. Genomics 1995; 27: 67-82.
8.	Groffen J, Hermans A, Grosveld G et al. Molecular analysis of chromosome breakpoints. Prog Nucl Acid Res Mol Biol 1989; 36: 281-300.
9.	Melo JV, Gordon DE, Cross NC and Goldman JM. The ABL-BCR fusion gen is expressed in chronic myeloid leukemia. Blood 1993; 88: 158-65.
10.	Kurzrock R, Gutterman JU, Talpaz M. The molecular genetics Philadelphia chromosome-positive leukemias. N Engl J Med 1988; 319: 990-8.
11.	Daley GQ, Van Etten RA, Baltimore D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210BCR/ABL gene of the Philadelphia chromosome. Science 1990; 247: 824-30.
12.	Heisterkamp N, Jenster G, ten Hoeve J, Zovich D, Pattengale PK, Groffen J. Acute leukaemia in bcr/abl transgenic mice. Nature 1990; 344: 251-3.
13.	Gordon MY, Goldman JM. Cellular and molecular mechanisms in chronic myeloid leukaemia: biology and treatment. Br J Haematol 1996; 95: 10-20.
14.	Muller AJ, Young JC, Pendergast A-M et al. BCR first exon sequences specifically activate the BCR/ABL tyrosine kinase oncogene of Philadelphia chromosomepositive human leukemias. Mol Cell Biol 1991; 11: 1785-92.
15.	Clarkson B, and Strife A. Linkage of proliferative and maturational abnormalities in chronic myelogenous leukemia and relevance to treatment. Leukemia 1993; 7: 1683-721.
16.	Wada H, Mizutani S, Nishimura J et al. Establishment and molecular characterization of a novel leukemic cell line with Philadelphia chromosome expressing p230 BCR/ABL fusion protein. Cancer Research 1995; 55: 3192-6.
17.	Lion T, Bartram CR, Talpaz M et al. Debate round table. Monitoring of residual disease in chronic myelogenous leukemia: methodological approaches and clinical aspects. Leukemia 1996; 10: 896-906.
18.	Cross NCP. Assessing residual leukaemia. Bailliere’s Clinical Haematology 1997; 10: 389-403.
19.	Hochhaus A, Reiter A, Skladny H, Reichert A, SauBele S, Hehlmann R. Molecular monitoring of residual disease in chronic myelogenous leukemia patients after therapy. Recent Results in Cancer Research 1998; 144: 36-45.
20.	The Italian Cooperative Study Group on Chronic Myeloid Leukemia. Interferon alfa-2a as compared with conventional chemoteraphy for the treatment of chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 1994; 330: 820-5.
21.	McClure JS, Litz CE. Chronic myelogenous 'lukemia: molecular diagnostic considerations. Human Pathology 1994; 25: 594-7.
22.	Reiter A, Skladny H, Hochhaus A et al. Quantitative Southern blot for monitoring CML patients on theraphy. Br J Haematol 1997; 97: 86-93.
23.	Kantarjian HM, Smith TL, O’Brien S, Beran M, Pierce S, Talpaz M, and the Leukemia Service. Prolonged survival in chronic myelogenous leukemia after cytogenetic response to interferon - a theraphy. Ann Intern Med 1995; 122: 254-61.
24.	Magalini AR, Primi D, Albertini A, Capucci A, Rossi G, Mantero G. Detection of BCR/ABL transcripts in chronoc myeloid leukaemia by polymerase chain reaction and DNA enzyme immunoassay: a DNA probe assay without DNA labelling. Br J of Haematol 1993; 83: 334-9.
25.	Cross NCP, Melo JV, Goldman JM. An optimized multiplex polymerase chain reaction (PCR) for detection of BCR.ABL fusion mRNAs in haematological disorders. Leukemia 1994; 8: 186-9.
26.	Hochhaus A, Reiter A, Skladny H et al. A novel BCR-ABL fusion gene (e6a2) in a patient with Philadelphia chromosome negative chronic myelogenous leukemia. Blood 1996; 88: 2236-40.
27.	Hochhaus A, Lin F, Reiter A et al. Quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia patients on interferon - a therapy by competitive polymerase chain reaction. Blood 1996; 87: 1549-55.
28.	Lin F, Kirkland MA, van Rhee F et al. Molecular analysis of transient cytogenetic relapse after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia. Bone Marrow Transplatation 1996; 18: 1147-52.
29.	Lin F, van Rhee F, Goldman JM and Cross NCP. Kinetics of increasing BCR-ABL transcript numbers in chronic myeloid leukemia patients who relapse after bone marrow transplantation. Blood 1996; 87: 4473-8.
30.	Dhingra K, Kurzrock R, Kantarjian H et al. Minimal residual disease in interferon-treated chronic myelogenous leukemia: Results and pitfalls of analysis based on polymerase chain reaction. Leukemia 1992; 6: 754-60.
Strokovni prispevek/Professional article
SPREMEMBE ŠTEVILA IN PROSTORNINE TROMBOCITOV PRI IDIOPATIČNI TROMBOCITOPENIČNI PURPURI
PLATELET NUMBER AND VOLUME CHANGES IN IDIOPATHIC THROMBOCYTOPENIC PURPURA
Mojca Tomažič1, Dušan A ndoljšek2
1 Splošna bolnišnica Novo mesto, radiološki oddelek, Šmihelska 1, 8000 Novo mesto 2 Klinični oddelek za hematologijo, Interna klinika, Klinični center, Zaloška7, 1525 Ljubljana
Prispelo 1998-04-10, sprejeto 1998-04-14; ZDRAV VESTN 1998; 67: Suppl I: 1-73-6
Ključne besede: povprečni volumen trombocitov; regulacija trom-bocitopoeze; ITP
Izvleček — Izhodišča. Povprečna prostornina trombocitov (MPV) se v pogojih stresne trombocitopoeze lahko zveča. Pri idiopatični trombocitopenični purpuri (ITP) gre za spremenjene pogoje nastajanja trombocitov in bi motnja lahko tplivala na MPV. Če upoštevamo hipotezo o regulaciji trombocitopoeze prek vzdrževanja stalne količine (število xprostornina) trombocitov, potem je lahko odnos med številom trombocitov in MPV ohranjen tudi pri ITP.
Metode. Preiskali smo 29 zdravih krvodajalcev in 73 bolnikov z ITP (32 nezdravljenih, 25 zdravljenih z glukokortikosteroidi /GK, 16po splenektomiji /SPL/). Število trombocitov in MPV smo določili s pomočjo števca Coulter STKS Systems. Vzorce krvi smo vzeli v epruveto s K-EDTA. Število trombocitov in MPV smo določili eno uro po odvzemu krvi.
Rezultati. Ugotoinli smo statistično pomembne razlike med MPV kontrolne skupine in MPV bolnikov z ITP. Razlike so največje pri bolnikih po splenektomiji, manjše pri nezdravljenih in zdravljenih z GK. Obstaja pomembna negativna povezanost med številom trombocitov in MPV pri zdravih in pri bolnikih po splenektomiji. Povezanosti ni pri zdravljenih z GK in nezdravljenih z ITP.
Zaključki. MPV je pri ITP zvečan, ni pa razlik med zdravljenjem na različen način. Ni mogoče oceniti, če stopnja motnje vpliva na MPV. Obstaja negativna povezanost med številom in MPVpri zdravih in bolnikih po splenektomiji. Povezanosti ni pri tistih, ki niso zdravljeni ali pa so zdravljeni z GK. Lahko, da je to posledica vpliva trombocitov, zadržanih v vranici. Če upoštevamo hipotezo o regulaciji trombopocitoezeprek količine trombocitov, je ta mehanizem ohranjen pri ITP po splenektomiji.
Uvod
Število trombocitov v krvi se spreminja in je pri zdravih osebah različno. Če sodimo samo po številu trombocitov, je kontrola nastajanja trombocitov zelo nenatančna. Ugotovili so, da je število v obratnem sorazmerju s povprečno prostornino trombocitov (MPV, mean platelet volume): osebe z majhnim številom imajo velike trombocite in obratno. Znano je tudi, da je količina trombocitov (število x prostornina, MPV) konstantna, da pa zakonitost ne velja v vsem območju razmeroma širokih meja normalnega (1-T). Vzrok je lahko nenatančna ocena količine trombocitov zaradi trombocitov v krvnem obtoku vranice (2).
Key words: mean platelet volume; regulation of thrombopoesis; ITP
Abstract—Background. Mean platelet volume (MPV) is increased in stress thrombopoesis. Conditions for platelet production in idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) are changed and the same is true after treatement. These possibly could have influence on MPV. If we belive the hypothesis that platelet production is regulated to maintain a constant circulating platelet mass, there could be the correlation between platelet number and MPV in ITP.
Methods. 29 healty blood donors and 73 patients with ITP were examined. Blood samples with K-EDTA were analysed by cell counter Coulter STKS System for platelet number and MPV. Analyses were done one hour after venepuncture.
Results. There are statistically significant differences for MPV in ITP patients and controls. Differences are more pronounced after splenectomy and less in patient groups with no treatement or with corticosteroids. There is a negative correlation between platelet number and MPV in controls and splenectomy group of patients. No correlation was found in patient group with no treatement or with corticosteroids.
Conclusions. MPV is increased in ITP. There is a significant negative correlation between platelet number and MPV in controls and splenectomy group ofpatients. No correlation was foundfor platelet number and MPV in corticosteroids and no treatement group of patients. Platelet pool in the spleen, which can not be assesed, probably influence the data for these patient groups. If we consider the hypothesis that platelet production is regulated to maintain a constant circulating platelet' mass, than such a mechanism is operating in ITP after splenectomy.
Pri bolnikih s kronično idiopatično trombocitopenično purpuro in pri nekaterih podedovanih boleznih z majhnim številom trombocitov, npr. sindromu Bernard-Souliers so ugotovili zvečan MPV (5, 6). Če je pri zvečanem številu trombocitov tudi MPV zelo velik, gre verjetno za avtonomno produkcijo trombocitov, npr. pri mielo-proliferativni bolezni (7).
Namen raziskave
Pri nastajanju trombocitov pod spremenjenimi pogoji (stresna trom-bocitopoeza) je povprečna prostornina trombocitov (MPV) lahko zvečana (5, 8).
Pri kronični idiopatični trombocitopenični purpuri (ITP) gre za nastajanje trombocitov pod spremenjenimi pogoji. Domnevamo, da bi motnja, grobo ocenjena prek števila trombocitov (večja stopnja motnje - manjše število), lahko vplivala na MPV.
Če upoštevamo hipotezo o regulaciji trombocitopoeze prek vzdrževanja stalne količine trombocitov, potem je odnos med številom trombocitov in MPV ohranjen lahko tudi pri ITP.
Bolniki in način dela
Ponovno smo pregledali 73 od 262 bolnikov z kronično idiopatič-no trombocitopenično purpuro (ITP), ki smo jih zdravili v Hematološki kliniki v Ljubljani v letih 1984 do 1994. Ostali, ki jih nismo mogli pregledati, so spremenili bivališče, umrli ali pa so javili, da se počutijo zdravi in se niso odzvali za pregled.
V	kontrolni skupini je bilo 29 zdravih krvodajalcev (11 moških in 18 žensk), starih 36,8±8,2 (22-49) let. Starosti obeh podskupin se nista pomembno razlikovali (p = 0,03).
Za vse pregledane bolnike smo imeli medicinsko dokumentacijo. Ugotovili smo način zdravljenja. Ponovno smo preverili, če gre za ITP.
Za ITP smo šteli bolnike 1. brez simptomov in znakov bolezni ali le s krvavitvami zaradi trombocitopenije, 2. brez zvečane vranice in jeter, 3. z izolirano trombocitopenijo ali trombocitopenijo in anemijo po krvavitvi, 4. s citološko normalnim kostnim mozgom in zvečanim številom megakariocitov, 5. bolniki niso jemali zdravil, niso imeli predhodne okužbe, sistemske in kivne bolezni (9). Po načinu zdravljenja smo bolnike z ITP razvrstili v tri skupine: brez zdravljenja (ITP-0) 32 bolnikov, zdravljeni z glukokortikosteroidi (ITP-GK) 25 bolnikov, zdravljeni z GK in zatem s splenektomijo (ITP-SPL) 16 bolnikov.
V	vseh treh skupinah je bilo več žensk kot moških, odnos je 1,2— 4 : 1.
Starost skupin je bila tale:
ITP-O 53,5±21,3 (17-86) let,
ITP-GK 50,8±19,4 (21-86) let,
ITP-SPL je bila 40,1±9,8 (20-53) let.
Bolniki skupin ITP-O in ITP-GK so bili starejši od kontrolne skupine (p = 0,000). Ti dve skupini bolnikov se med seboj sicer nista pomembno razlikovali po starosti (p = 0,6). Skupina ITP-SPL in kontrolna skupina se po starosti nista razlikovali (p = 0,02).
Po kliničnem pregledu smo vzeli 3 ml krvi v epruveto Vacutainer Hemogard s K-EDTA. Napravili smo krvno sliko, določili število trombocitov in povprečno prostornino trombocitov (MPV).
Krvno sliko, število trombocitov in MPV so določili s pomočjo števca Coulter STKS Systems, skladno z navodili proizvajalca aparata.
Referenčne vrednosti za število trombocitov in MPV najdemo v tabeli 1 in 2.
Pred začetkom statistične analize smo preskusili in ugotovili, da podatki kontrolne skupine za število trombocitov in MPV ustrezajo normalni porazdelitvi.
Statistično analizo smo napravili s programom Statistica. Uporabili smo parametrične in neparametrične teste. Koeficient korelacije smo izračunali po Pearsonu in Kendall Tau.
Sklepe smo sprejeli z manj kot 5% tveganjem (p < 0,05).
Rezultati
Tab. 1. Število trombocitov kontrolne skupine in skupine bolnikov
z ITP.
Tab. 1. Platelet number in control group and in ITP patients.
Skupina Group	Število trombocitov Platelet number (X±s.d.) x 109/L
Kontrolna skupina Control group	227,0±43,50
ITP-0	91,0±37,8
ITP-GK	112,2±79,70
ITP-SPL	205,5+144,4
ITP
ITP-0 -ITP-GK -
ITP-SPL -
Idiopatična trombocitopenična purpura / Idiopathic thrombocytopenic purpura
Bolniki z ITP brez zdravljenja / ITP patients without treatment Bolniki z ITP zdravljeni z glukokortikosteroidi / ITP patients treated with glucocrticosteroids
Bolniki z ITP po splenektomiji / ITP patients after splenectomy
Tab. 2. Povprečna prostornina trombocitov (MPV) kontrolne skupine in bolnikov z ITP.
Tab. 2. Mean platelet volume (MPV) in control group and in ITP patients.
Skupina	MPV (X±s.d.) x 10VL
Group	
Kontrolna skupina Control group	8,8±1,1
ITP-0	9,9+1,2
ITP-GK	9,9±1,9
ITP-SPL	10,46+1,3
ITP - Idiopatična trombocitopenična purpura / Idiopathic thrombocytopenic purpura
ITP-O - Bolniki z ITP brez zdravljenja / ITP patients without treatment ITP-GK - Bolniki z ITP zdravljeni z glukokortikosteroidi / ITP patients treated with glucocrticosteroids
ITP-SPL - Bolniki z ITP po splenektomiji / ITP patients after splenectomy
Tab. 3. Odnos med številom in povprečno prostornino trombocitov
(MPV).
Tab. 3- Platelet number in correlation ivith meanplatelet volume
(MPV).
Skupina Group	Korelacijski koeficient (r) Correlation coefficient (r)
Število trombocitov pri kontrolni skupini Platelet number in control group	-4,41
Število trombocitov pri ITP vsi bolniki Platelet number in ITP patients	-0,14
Število trombocitov pri ITP-0 Platelet number in ITP-0	-0,25
Število trombocitov pri ITP-GK Platelet number in ITP-GK	-0,29
Število trombocitov pri ITP-SPL Platelet number in ITP-SPL	-0,66
ITP
ITP-0 -ITP-GK -
ITP-SPL -
Idiopatična trombocitopenična purpura / Idiopathic thrombocytopenic purpura
Bolniki z ITP brez zdravljenja / ITP patients without treatment Bolniki z ITP zdravljeni z glukokortikosteroidi / ITP patients treated with glucocrticosteroids
Bolniki z ITP po splenektomiji / ITP patients after splenectomy
Število trombocitov kontrolne skupine in skupine bolnikov navajamo v tabeli 1.
Obstajajo statistično pomembne razlike števila trombocitov med kontrolno skupino in skupino ITP-0 ter ITP-GK (p = 0,000), med obema skupinama (ITP-0 in ITP-GK) pa so razlike majhne (p = 0,19).
Ni razlike med kontrolno skupino in ITP-SPL (p = 0,44). Povprečno prostornino trombocitov (MPV) smo prikazali v tabeli 2.
MPV kontrolne skupine in skupine ITP-0 (p = 0,001) ter kontrolne skupine in ITP-GK (p = 0,022) je statistično pomembno različen. Enako velja za MPV kontrolne skupine in skupine ITP-SPL (p = 0,0003). Ni razlik MPV, če primerjamo skupini ITP-0 in ITP-GK (p = 0,95), ITP-0 in ITP-SPL (p = 0,19).
Obstajajo torej statistično pomembne razlike med MPV kontrolne skupine in MPV bolnikov z ITP. Zdi se, da so razlike največje pri bolnikih z ITP po splenektomiji, manjše pa pri nezdravljenih in zdravljenih z glukokortikosteroidi.
MPV Korelacijski koeficient / Correlation coefficient: r = 0.4091
-50
Regresija Regression 95% confid.
50	100	150	200	250	300	350	400
Število trombocitov / Platelet number
Sl. 1. Odnos med številom (X x 1CP/L) in povprečno prostornino trombocitov (MPV: fl) pri kontrolni skupini.
Fig. 1. Correlation between platelet number (X x 1CP/L) and mean platelet volume (MPV: fl) in control group.
MPV Korelacijski koeficient / Correlation coefficient: r = 0.2517
12.5
11.5
10.5
9.5
8.5
7.5
-20	20	60	100	140	180	220
Število trombocitov / Platelet number
Sl. 1. Odnos med številom (X x 1CP/L) in povprečno prostornino trombocitov (MPV: fl) pri OTP-O (TIP brez zdravljenja).
Fig. 1. Correlation between platelet number (X x 1CP/L) and mean platelet volume (MPV: fl) in ITP-0 (UP without treatment).
Povezanost med številom trombocitov in MPV je prikazana v tabeli 3, grafični prikaz za posamezne skupine bolnikov je na slikah 1, 2 in 3.
Obstaja pomembna negativna povezanost med številom trombocitov in MPV pri zdravih in bolnikih z ITP po splenektomiji. Te povezanosti ni pri bolnikih, ki jih nismo zdravili in pa pri tistih, ki smo jih zdravili z glukokortikosteroidi.
Razpravljanje
V raziskavi je bila pripravljena sodelovati le tretjina, ki smo jih pregledali ali zdravili zaradi kronične idiopatične trombocitopenične purpure (ITP) v obdobju desetih let. Večinoma se niso odzvali tisti, ki so imeli zmerno trombocitopenijo in je bila to naključna najdba, ko so napravili krvno sliko.
Skupini bolnikov ITP-0 (nezdravljeni) in ITP-GK (zdravljeni z glukokortikosteroidi), sta po starosti različni od kontrolne skupine, med seboj pa se ne razlikujeta. Skupina splenektomiranih (ITP-SPL) bolnikov se po starosti ne razlikuje od kontrolne skupine. Razlog za neuravnoteženost kontrolne in preiskovane skupine po starosti je dejstvo, da zdravih starostnikov za preiskavo praktično ni mogoče najti. To ne predstavlja vira napak, saj niso ugotovili pomembnih razlik v številu trombocitov pri odraslih osebah različnih starosti (10). Obstaja zelo široko območje normalnih
Sl. 3. Odnos med številom (X x 1CP/L) in povprečno prostornino trombocitov (MPV: fl) pri ITP-GK (ITP zdravljena z glukokortikosteroidi).
Fig. 3. Correlation between platelet number (X x UP/L) and mean platelet volume (MPV:fl) in ITP-GK (UP treated with glococortico-steroids)
vrednosti za število trombocitov. Vzrok za to so tudi izrazita sezonska nihanja števila trombocitov, z vrhom v obdobju decem-ber-februar (10). Preiskovanje bolnikov smo opravili v petih tednih, poleti.
Vzorec krvi smo vzeli v epruveti s K-EDTA. Znano je, da se MPV pod temi pogoji spreminja po odvzemu krvi. Ugotovili so, da so spremembe števila trombocitov in MPV nepomembne, če opravimo preiskavo eno uro po odvzemu krvi (11). Da bi se izognili temu viru napak, smo vzorce krvi pregledali eno uro po odvzemu. Regulacija trombocitopoeze je malo poznana (1). Obstajajo razlike glede števila, velikosti, starosti in funkcije trombocitov v krvnem obtoku zdrave osebe (2). 1974 je O’Brien ugotovil, da je število trombocitov v obratnem sorazmerju z njihovo povprečno prostornino (3). Kasneje se je pokazalo, da je količina (število x prostornina) trombocitov konstantna, da pa zakonitost ne velja v vsem območju širokih meja normalnega. Vzrok za to je lahko nenatančna ocena deleža trombocitov, ki so v krvnem obtoku vranice. Ti trombociti so tudi v povprečju večji (2, 4). Domnevamo lahko, da obstaja neka najmanjša prostornina trombocita, ki nastane pod fiziološki pogoji. Ko število trombocitov preseže 450xl09/L, vzdrževanje konstantne količine ni več mogoče, pač pa le-ta narašča skupaj s številom trombocitov.
Verjetno sta število trombocitov in njihova povprečna prostornina določena pod fiziološkimi pogoji med njihovim nastajanjem (12). Ugotovili smo statistično pomembne razlike v številu trombocitov med zdravimi osebami in tistimi z ITP, ki jih nismo zdravili ali pa so bili dobili glukokortikosteroide. Ni pa bilo razlik v številu trombocitov pri zdravih osebah in splenektomiranih bolnikih. Delež trajnih izboljšanj ITP po splenektomiji je preko 90% (9, 15). Povprečna prostornina trombocitov (MPV) je pri bolnikih z ITP pomembno večja od zdravih. Zdi se, da so razlike največje pri zdravljenih z ITP po splenektomiji, manjše pri nezdravljenih in zdravljenih z glukokortikosteroidi.
Trombociti, ki nastajajo v pogojih spremenjene produkcije, imajo večji MPV (2). Ker so zvečanje MPV ugotovili tudi, če so poskusni živali odstranili vranico, domnevajo, da zvečanje ni posledica izplavljanja trombocitov iz vranice, v kateri so pretežno večji trombociti (2, 13).
Ker je skupina pregledanih po splenektomiji majhna, ni mogoče oceniti pomena ugotovitve, da je bil MPV največji ravno pri tej skupini. Po drugi strani pa seveda ugotovitve iz poskusov na živalih ni mogoče brez zadržkov prenesti na človeka.
Ugotovili smo negativno povezanost med številom trombocitov in MPV pri zdravih in bolnikih po splenektomiji. Če upoštevamo hipotezo o regulaciji nastajanja prek vzdrževanja stalne količine
trombocitov v krvnem obtoku, se zdi, da je ta ohranjena le pri ITP po splenektomiji.
Trombociti, ki nastanejo pod stresnimi pogoji, so večji od normalnih. Če v poskusu sprožimo imunsko trombocitopenijo, se MPV zveča že 8 ur po začetku poskusa, tj. 40 ur preden so opazne spremembe v dozorevanju megakariocitov. Verjetno nastanejo večji trombociti z demarkacijo robnega dela citoplazme megakariocitov in šele kasneje se zveča število na račun večjega nastajanja trombocitov iz posameznega megakariocita. Končno pa se po treh do šestih dneh zveča tudi število megakariocitov v kostnem mozgu (13,14). ITP je kronična in ponavadi doživljenjska bolezen (2, 9, 15). Po mesecih ali letih trajanja se ne zdi verjetno, da bi nastajanje trombocitov teklo enako kot pri akutni trombocitopeniji, tj. pretežno z demarkacijo robnega dela citoplazme megakariocitov (2,13). Po mnenju Najeana, Raina in Dufoura je veljavni koncept trombo-pocitoeze zmoten. Ni je mogoče primerjati z eritropoezo, kjer je po kronični izgubi vedno zvečano nastajanje celic. Domnevno je nastajanje trombocitov pri ITP lahko normalno ali le malo zvečano. Avtorji so mnenja, da podrobnosti regulacije trombocitopoeze ne poznamo in da so dosedanji podatki nezadostni ali pa dvomljive vrednosti (16).
Zaključki
Nastajanje trombocitov pod spremenjenimi pogoji pri idiopatični trombocitopenični purpuri (ITP) vpliva na povprečno prostornino trombocitov (MPV).
MPV je zvečan pri vseh bolnikih z ITP, ne glede na zdravljenje. Ni mogoče oceniti, če stopnja motnje vpliva na MPV.
Obstaja negativna povezanost med številom trombocitov in MPV pri zdravih in tudi pri bolnikih z ITP po splenektomiji. Te povezanosti nismo dokazali pri ostalih bolnikih z ITP. Lahko, da je to zaradi vpliva v vranici zadržanih trombocitov.
Če upoštevamo hipotezo o regulaciji trombocitopoeze prek količine (številko x prostornina) trombocitov, domnevamo, da je mehanizem regulacije ohranjen pri ITP po splenektomiji.
Literatura
1.	Burnstein SA, Breton-Gorius J. Megakaryopoiesis and platelet formation. In: Beutler E, Lichtman MA, Coller BS, Kipps Tli J. Williams Hematology. 5th ed. New York: McGraw Hill, 1995: 1149-16.
2.	Thompson CB, Jakubowski JA. The pathophysiology and clinical relevance of platelet heterogenity. Blood 1988; 72: 1-8.
3.	O’Brien JR, Jamieson S. A relationship between platelet volume and platelet number. Thromb Diath Haemorrh 1974; 31: 363-5.
4.	Levine J, Bessman JD. The inverse relationship between platelet volume and platelet number: abnormalities in hematologic disease and evidence that platelet size does not correlate with platelet age. J Lab Clin Med 1983; 101: 295-307.
5.	Kokawa T, Nomura S, Yasunaga K. Relationship between platelet volume and antiplatelet antibodies in idiopathic thrombocytopenic purpura. Eur J Haemat 1991; 47: 104-8.
6.	Gardner FH, Bessman JD. Thrombocytopenia due to defective platelet production. Clin Haematol 1983; 12: 23-38.
7.	Small BM, Bettigole RE. Diagnosis of myeloproliferative disease by analysis of the platelet volume distribution. Am J Clin Path 1981; 76: 685-91.
8.	Bessman JD, Gardner FH. Platelet size in thrombocytopenia due to sepsis. Surg Gynec Obstet 1983; 156: 177-80.
9.	Berchtold P, McMillan R. Therapy of chronic idiopathic thrombocytopenic purpura in adults. Blood 1989; 74: 2309-17.
10.	Maes M, Scharpe S, Cooreman et al. Components of biological, including seasonal, variation in hematological measurements and plasma fibrinogen concentrations in normal humans. Experimentia 1995; 51: 141—9-
11.	Kralj J. Pomen zunanjih dejavnikov pri oceni povprečnega volumna trombocitov. Magisterska naloga. Ljubljana: Medicinska fakulteta, 1993.
12.	Thompson CV, Love DG, Quinn PG, Valeri CR. Platelet size does not correlate with platelet age. Blood 1983; 62: 487-94.
13- Corash L, Chen HY, Levinj, Baker G, Lu H, Mok Y. Regulation of thrombopoesis: Effects of the degree of thrombocytopenia on megakaryocyte ploidy and platelet volume. Blood 1987; 70: 177-85.
14.	Martin JF, Trowbridge EA, Salmon GL, Slater DN. The relationship between platelet and megakaryocyte volume. Thromb Res 1982; 28: 447-59.
15.	Andoljšek D, Repše S. Splenektomija pri kronični idiopatski trombocitopenični purpuri. Zdrav vestn 1991; 60: 287-9-
16.	Najean Y, Rain JD, Dufour V. Platelet production in idiopathic thrombocytopenic purpura. Nouv Rev Fr Hematol 1993; 35: 431-6.
Naučiti se morate samo treh lahkih
korakov in že lahko plešete valček.
S Sumamedom postane antibiotično zdravljenje tako privlačno preprosto kot valček. Enkrat na dan, samo tri dni.
Sumamed, en in enkraten.


7-2-5.
Trije lahki koraki
Širokospektralni antibiotik za zdravljenje okužb dihal.
Sumamed®
azitromicin
® PLIVA
Proizvajalec: PLIVA d.d, Zagreb, Hrvaška, Zastopnik: PLIVA LJUBLJANA d.o.o., Dunajska 51,1000 Ljubljana, Telefon: 061/302150; telefaks 061/302 850
SKRAJŠANO NAVODILO: Sumamed je prvi predstavnik makrolldnlh antibiotikov nove generacije, Imenovanih azalldi. indikacije: Okužbe zgornjega dela dihal: bakterijsko vnetje žrela in tonzll, akutno vnetje srednjega uSesa in sinusov. Okužbe spodnjega dela dihal: akutne eksacerbacije kroničnega bronhitisa, intersticijske in bakterijske pljučnice. Okužbe kože in mehkih tkiv:erizipel (šen), impetigo in sekundarne piodermlje. Kontraindikacije: Preobčutljivost za makrolidne antibiotike. Interakcije: Hrana zmanjšuje absorpcijo azitromicina, zato moramo zdravilo jemati uro pred jedjo ali dve uri po njej. Antacidi upočasnijo absorpcijo azitromicina, zato priporočamo vsaj 2-urni presledek med jemanjem obeh zdravil, v nasprotju z večino makrolidov azitromicin ne inaktivira citokroma P-450, zato doslej niso opazili interakcij z drugimi zdravili. Posebna opozorila: Previdnost pri jemanju zdravila je potrebna pri bolnikih z okvarami jetrnih funkcij. Prilagajanje odmerkov pri starejših bolnikih ni potrebno. Nosečnost in dojenje: Poskusi na brejih živalih niso pokazali škodljivih učinkov zdravila na plod, vendar so klinični podatki le maloštevilni, zato uporabljamo azitromicin med nosečnostjo in dojenjem le, Ce je res potreben. Odmerki in uporaba: Okužbe dihal, kože In mehkih tkiv: odrasli vzamejo tri dni zapored po 500 mg enkrat na dan. Stranski učinki: Azitromicin redko povzroča stranske učinke. Lahko se pojavijo prebavne motnje (napenjanje, slabost, bruhanje, driska, bolečine v trebuhu) in izpuščaji. Opazili so prehodno rahlo povečanje vrednosti jetrnih encimov, nevtropenijo ter le redko nevtrofilljo In eozinofilijo. zvečane vrednosti se povrnejo na normalno raven v dveh do treh tednih po koncu zdravljenja. Oprema: kapsule po 250 mg, tablete po 500 mg.
Podrobnejše informacije o zdravilu so vam na voljo pri zastopniku.
NITRO-DUR
transdermalni nitroglicerol 0,2 mg/h 0,4 mg/h
• tanek, prosojen
enostavno odpiranje, nameščanje in odstranjevanje
• manj iritacij
k kapsule
\ v svetu največpredpisovani sistemski antimikotik
S edini peroralni sistemski antimikotik za zdravljenje vaginalne kandidoze, ki ga je odobril FDA
Skrajšano navodilo
Flukonazol je sistemski antimikotik iz skupine triazolov.
Odmerjanje pri različnih indikacijah:
vaginalna kandidoza	150 mg v enkratnem odmerku
mukozna kandidoza	50 do 100 mg na dan
dermatomikoze	50 mg na dan ali 150 mg na teden
sistemska kandidoza	prvi dan 400 mg, nato od 200 do 400 mg na dan Največji dnevni odmerek je 800 mg.
preprečevanje kandidoze	50 do 400 mg na dan
kriptokokni meningitis	prvi dan 400 mg, nato od 200 do 400 mg na dan
vzdrževalno zdravljenje	200 mg na dan
Kontraindikacije: Preobčutljivost za zdravilo ali sestavine zdravila. Interakcije: Pri enkratnem odmerku flukonazola za zdravljenje vaginalne kandidoze klinično pomembnih interakcij ni.
Pri večkratnih in večjih odmerkih so možne interakcije s terfenadinom, cisapridom, astemizolom, varfarinom, derivati sulfonilureje, hidroklorotiazidom, fenitoinom, rifampicinom, ciklosporinom, teofilinom, indinavlrom in midazolamom. Nosečnost in dojenje: Nosečnica lahko jemlje zdravilo le, če je korist zdravljenja za mater večja od tveganja za plod. Doječe matere naj med zdravljenjem s flukonazolom ne dojijo. Stranski učinki: Povezani so predvsem s prebavnim traktom: slabost, napenjanje, bolečine v trebuhu, driska, zelo redko se pojavijo preobčutljivostne kožne reakcije, anafilaksija in angioedem - v tem primeru takoj prenehamo jemati zdravilo. Pri bolnikih s hudimi glivičnimi obolenji lahko pride do levkopenije in trombocitopenije in do povečane aktivnosti jetrnih encimov. Oprema in način izdajanja: 7 kapsul po 50 mg, 28 kapsul po 100 mg, 1 kapsula po 150 mg. Na zdravniški recept. 5/98.
Podrobnejše informacije so na voljo pri proizvajalcu.
.
,	■■■• aeS SMf fcj ( ¿s®
I KRKSV
Krka, d. d.. Novo mesto Šmarješka cesta 6 8501 Novo mesto

Kdo uporablja najnaprednejše
metode
znanja
za razvoj *
novih zdravi
21. stoletja?
lb NOVARTIS
Vodilni farmacevtski koncern v svetu. Nastal z združitvijo Sandoza in Cibe.
novo znanje
za razumevanje življenja
Informacije in literatura so na voljo pri
Novartis Pharma Services Inc., Podružnica v Sloveniji
Dunajska 22, 1511 Ljubljana
H Zdravniški vestnik
JOURNAL OF SLOVENE MEDICAL SOCIETY, ZDRAV VESTN, YEAR 67, MAY 1998, Pages 1-1-76, Suppl. I
40 YEARS OF CLINICAL HEMATOLOGY IN LJUBLJANA
CONTENTS LEADING ARTICLE
40 years of clinical haematology in Ljubljana, P. Černelč	1-1
ARTICLES
The evolution of bone marrow transplantation in the cure of human disease,
E. D. Thomas	1-3
Treatment of chronic lymphocytic leukemia and low-grade non Hodgkin’s
lymphomas with fludarabine, C. Rozman	1-5
Autologous stem cell transplantation in the treatment of acute leukemias, B. Labar, D. Nemet,
M. Mrsic, V. Bogdanič, D. Batinič, B. Golubič-Čepulič, M. Petrovečki, L Radman, I. Aurer, D. Sertie 1-9
Allogeneic haemopoietic stem cell transplantation fo„ ironic granulocytic and acute leukaemias in University Medical Centre Ljubljana, J. Pretnar, S. Zver,
M. Benedik-Dolničar	I-11
Autologous stem cell transplantation for solid tumors in children and our
experiences, M. Benedik-Dolničar, J. Anžič	1-15
High dose chemotherapy with autologous peripheral blood stem cell support in
solid tumors in adults, B. Zakotnik, B. Pajk, J. Pretnar	1-19
Treatment of advanced-stage chronic lymphocytic leukemia with fludarabine,
P. Černelč	-	1-23
Treatment of hairy cell leukemia with cladribine, U. Mlakar	1-27
Pre-treatment serum erythropoietin in patients with multiple myeloma, U. Mlakar	1-31
Our results in adult patients with acute myeloid leukemia treated according
to AML 10 protocol, M. Modic	1-35
Treatment of acute myelblastic leukemia with cladribine in elderly
patients - Our experiences, S. Zver, J. Pretnar	1-39
Myelodysplastic syndrome with acquired corpuscular haemolytic anaemia and
later transition in AML - Case report, U. Mlakar	1-43
Treatment of pure red cell aplastic anemia in patient with chronic lymhocytic
leukemia, M. Bervar, P. Černelč	1-47
Reticulocyte counting by microscopy and flow cytometry, I. Preložnik-Zupan	1-51
Detection of activated platelets by flow cytometric analysis of antigens CD62P
andCD63, J. Kralj	1-57
Flow cytometry analysis of platelet antibodies in chronic idiopatic
thrombocytopenic purpura, D. Žontar, P. Černelč	I—61
Relation between plasma heparin concentration and clothing disturbance during heparin hemodialysis, Z. Cede, A. Andoljšek	1-65
Chronic myeloid leukemia and respondent molecular diagnostic methods,
T.	Pajič, P. Černelč	1-69
Platelet number and volume changes in idiopathic thrombocytopenic purpura,
M. Tomažič, D. Andoljšek
1-73