Izpostavitev ravninskih lipidnih dvoslojev električnemu polju
nanosekundnih pulzev
Peter Kramar1'2, Matej Reberšek1, Damijan Miklavčič1, P. Thomas Vernier2
1 University of Ljubljana, Faculty of Electrical Engineering, Ljubljana, Slovenia 2Frank Reidy Research Center for Bioelectrics, Old Dominion University, Norfolk (VA), USA
E-pošta: peter.kramar@fe. uni-lj.si
Planar lipid bilayers exposed to nanosecond pulsed electric field
Abstract. Planar lipid bilayers are often used to study electroporation phenomena. In this study, preliminary experiments were carried out to measure changes in planar lipid bilayer resistance and capacitance resulting from exposure to nanosecond pulsed electric fields. We also looked at the effects of calcium ions on bilayer electrical properties. The results of the measured planar lipid bilayer resistance and capacitance obtained after exposure to nanosecond pulse rises several new questions about basic understanding of membrane electroporation mechanism under nanosecond electric field, which requires additional work to be performed.
1 Uvod
Izpostavitev bioloških celic električnemu polju se je izkazala kot uporabna tehnologija za manipulacijo s prepustnostjo celične membrane ter s tem potencialno široko uporabo v številnih biomedicinskih in biotehnoloških aplikacijah ter tudi v predelavi hrane [1,2]. Že kratkotrajna izpostavitev električnemu polju povzroči strukturne spremembe na nivoju lipidnih molekul v celični membrani. V odvisnosti od parametrov električnega polja (amplituda, trajanje, frekvenca) postane membrana začasno prepustna, tudi po zaključeni izpostavitvi električnemu polju, za molekule, ki običajno ne morejo prehajati celične membrane. Pojav imenujemo elektroporacija ali elektropermeabilizacija [3-5].
Kljub temu, da je dandanes elektroporacija široko uporabljena metoda v različnih biomedicinskih in biotehnoloških aplikacijah [1,2], vključno s predelavo hrane [6,7], so nekateri osnovni fizikalni in biološki ter molekularni mehanizmi prenosa snovi pri elektroporaciji še vedno niso v celoti razjasnjeni.
Elektroporacijo delimo na dve osnovni veji: mikrosekundno elektroporacijo ter nanosekundno elektroporacijo, pri čemer predpostavljamo, da so osnovni mehanizmi enaki. Pri mikrosekundni elektroporaciji uporabljamo električne pulze z električnim poljem manjšim od 1 MV/m ter mikrosekundnim	trajanjem.	Nanosekunda
elektroporacija uporablja električno polje večje od 1 MV/m ter trajanjem manjše od 1 ^s [8]. Večina poizkusov v in vitro ter in vivo pogojih in aplikacij elektroporacije je bila narejena v mikrosekundnem
področju. V nanosekundnem področju pa so bili narejeni osnovni modeli elektroporacije z molekularno dinamiko poleg tega pa tudi poizkusi in vitro ter in vivo pogojih. Za premostitev razlik med nano in mikrosekundnim območjem in razlago dinamike dogodkov na celični membrani ob elektroporaciji, smo zasnovali poizkuse na ravninskih lipidnih dvoslojih tako, da smo jih izpostavili nanosekundnim pulzom.
Ravninski lipidni dvosloj je umetna struktura lipidnih membran, ki po svoji zgradbi ponazarja infinitezimalno majhen košček celične membrane. Pogosto ga uporabljamo za preučevanje pojava elektroporacije tako na eksperimentalnem nivoju z merjenjem kapacitivnosti ter porušitvene napetosti membrane kot tudi na nivoju molekularne dinamike. Odlika ravninskega lipidnega dvosloja je njegova električna dostopnost z obeh strani in preprosta predstavitev z električnim vezjem vzporedno vezanega upora in kondenzatorja [9]. Na ravninskih lipidnih dvoslojih so v preteklosti že bili narejeni poizkusi za različne lipidne molekule, pri različnih temperaturah v odvisnosti od faznega prehoda lipidnih molekul in z uporabo različnih stimulacijskih signalov. Z meritvami kapacitivnosti posameznega ravninskega lipidnega dvosloja preverimo kvaliteto zgrajega ravninskega lipidnega dvosloja. Za preučevanje pojava elektroporacije je pomemben parameter porušitvena napetost, ki nam podaja stabilnost ravninskega lipidnega dvosloja v električnem polju.
Namen študije je bil izpostavitev ravninskega lipidnega dvosloja nanosekundim pulzem in pri tem preučevaje strukturnih spememb, kot so reorentacija lipidnih molekul, pore ter porušitvene napetosti. Ker poizkusov z nanosekundnimi pulzi v preteklosti na ravninskih lipidnih dvoslojih še ni bilo, je bil del študije razvoj unikatnega eksperimentalnega sistema za elektroporacijo ravninskih lipidnih dvoslojev z električnimi pulzi v območju nekaj deset voltov ter trajanjem pulzov nekaj nanosekund. Optično opazovanje ravninskega lipidnega dvosloja je zaradi narave komore, kjer zgradimo ravninski lipidni dvosloj nemogoče. Zato smo morali spremembe na ravninskem lipidnem dvosloju meriti električno s primernim napetostnim vzbujanjem ter merjenjem odziva toka. Merjenj e toka v času nanosekundnega napetostnega vzbujanja je izredno zahtevno. Zato smo pred in po izpostavitvijo ravninskega lipidnega dvosloja nanosekundim pulzem merili kapacitivnost in upornost ravninskega lipidnega dvosloja z LCR metrom.
ERK'2018, Portorož, 427-158
155
2 Materiali in metode
2.1 Nanosekundni pulzni generator
Tehnike generiranja nanosekundih pulzev se zelo razlikujejo od tistih za generiranje mikro- ali milisekundnih pulzov [10-14]. Vzrok so predvsem stikala, ki ne omogočajo izključitve v nanosekundnem časovnem območju. Za generiranje nanosekundih pulzev uporabljamo mrežo za oblikovanje pulza (ang. pulse-forming networks - PFN). Mreža za oblikovanje pulza je zgrajena iz večih podsekcij, kjer so posamezne sekcije sestavljene iz tuljav (L) in kondenzatorjev (C). Generator Blumlein (slika 1) tvori nanosekundni pulz s pomočjo dveh mrež za oblikovanje pulza. Blumlein generator deluje v dveh fazah, naelektritvi linij in razelektritvi. V času faze naelektritve mrež za oblikovanje pulza je stikalo (S) izključeno. Napetostni vir z nastavljivo amplitudo enosmerno napetostjo (V) nabije mrežo za oblikovanje pulza preko upora (R). V fazi razelektritve vključimo stikalo (S), tako razelektrimo naboj, shranjen v mreži za oblikovanje pulza preko impedance bremena (Zl) oziroma ravninskega lipidnega dvosloja. Ker želimo generirati napetostni pulz brez odbojev, se mora impedanca Zl čim bolj ujemati z impedanco mreže za oblikovanje pulza, Impedanco mreže za oblikovanje pulza določimo z enačbo (L/C)05, kjer L in C predatavljata induktivnost tuljave in kapacitivnost kondenzatorja v posamezni podsekciji. Trajanje nanosekundnega pulza je 2N(LC)05, kjer je N število podsekcij mreže za oblikovanje pulza. Izhodna napetost nanosekundnega pulza je približno enaka izbrani nap_ajalni napetosti V.
Slika 1. Shema generatorja Blumlein z dvema mrežama za oblkovanje pulza (PFNa and PFNb), nastavljivim napetosnim napajalnikom V, visoko impedančnim uporom R za nabijanje mreže za oblikovanje pulza, stikalom S in impedanco bremena - ravninskega lipidnega dvosloja Zl.
Pri nanosekundni elektroporaciji je Blumline generator uporabljen praktično v vseh poizkusih za generiranje nanosekundnih pulzih. Njegova prednost je nizka cena, enostavnost izdelave, dobro kontrolo nad ponovljivostjo električnih parametrov. Kljub temu pa je pomembno, da je impedanca mreže za oblikovanje pulza prilagojena ravninskemu lipidnemu dvosloju, da preprečimo atenuacije amplitude pulza ter odboje nanosekundnega pulza. Pulzni generator Blumline, ki smo ga razvili za elektroporacijo ravninskih lipidnih dvoslojev, tvori nanosekundne pulze amplitud od 0 do 60 V in trajanja 7 ns.
2.2	Merjenje električnih lastnosti ravninskega lipidnega dvosloja
Merjenje strukturnih sprememb ravninskih lipidnih dvoslojev ob izpostavitvi nanosekundnim pulzem smo izvedli z LCR metrom Agilent E4980A, 20 Hz - 300 kHz, (ZDA). LCR meter deluje na principu mostične metode. Izbrana parametra merjenja sta bila paralelna upornost in kapacitivnos Rp-Cp. Amplituda merilne sinusne napetosti je bila izbrana 20 mV, frekvenca pa 2 kHz.
Merjenje impedance z LCR metrom in generiranje nanosekundnega pulza sočasno ni bilo mogoče. Zato smo razvili posebno analogno stikalo, ki je preklapljalo elektrode med nanosekundnim Blumeline generatorjem in LCR metrom. Prožilnik preklaplanja smo izvedli z digitalnim zakasnitvenim generatorjem DG645 (Stanford Research Systems, ZDA)
Na analogno stikalo smo priključili štiri Ag-AgCl elektrode, ki smo jih potopili v prevodno raztopino; dve na vsako stran ravninskega lipidnega dvosloja. Teflonska komora je sestavljena iz dveh kockastih rezervoarjev volumnov 5,3 cm3. V povezovalno luknjico med rezervoarjema smo vstavili 25 ^m tanko teflonsko folijo na sredi katere je bila luknjica s premerom 106 ^m. Lipidne dvosloje smo tvorili z metodo dvigovanja gladine [15].
Celoten sistem smo nadzirali z uporabo programskega orodja Matlab 2017a ter dodatnim modulom Instrumentation Control Toolbox za nadzor merilnih instumentov preko protokola VISA.
2.3	Priprava ravninskih lipidnih dvoslojev
Prevodno raztopino smo pripravili iz 0,1 molarne KCl (Merck, Nemčija) in 0,01 molarne raztopine Hepes (Merck, Nemčija). Zmešali smo ju v enakem razmerju in dodali toliko kapljic 1 M NaOH (Merck, Nemčija), da smo dosegli pH raztopine 7,4.
Lipidne dvosloje smo pripravljali iz 1-palmitil 2-oleil 3-fosfatidilholin-a (POPC), ki smo jih kupili v prahu (Avanti Polar-Lipids, inc., ZDA). Lipid v prahu smo raztopili v mešanici heksana (Riedel-de Haen, Nemčija) in etanola (Riedel-de Haen, Nemčija) v razmerju 9:1. Za podporni torus smo uporabili mešanico heksadekana (MERCK, Nemčija) in etanola v razmerju 3:7.
Za preizkus zmožnosti detekcije strukturnih sprememb ravninskega lipidnega dvosloja smo pripravili dodatne poizkuse z dodajanjem dvovalentnih ionskih raztopin Ca2+ v okoliško prevodno raztopino. V komoro smo na eno stran ravninskega lipidnega dvosloja postopoma dodajali po 0.5 ^L 1M CaCl2 raztopine, kar je pomenilo, da smo molarnost CaCl2 z vsakim vnosom povečali za 0,5 mM.
2.4	Merilni protokol
Potek poizkusov je temljil na cikličnem merilnem protokolu. Najprej smo v komori tvorili ravninski lipidni dvosloj, nato smo z LCR metrom merili kapacitivnost in upornost ravninskega lipidnega
428
dvosloja. V primeru, da vrednosti le teh nista ustrezali ravninskemu lipidnemu dvosloju, smo postopek ponovili. Ob primernih vrednostih kapacitivnosti in upornosti ravninskega lipidnega dvosloja smo pričeli s postopkom merjenja in generiranja nanosekundnega pulza. Posamezna meritev na LCR metru je trajala vsaj 400 sekund. Med tem smo enkrat vbrizgali dvovalentno raztopino CaCl2 in opazovali spremebo upornosti in kapacitivnosti ravninskega lipidnega dvosloja. Med posameznimi meritvami smo tudi večkrat prožili nanosekundni pulz različnih amplitud.
3 Rezultati
Študija je obsegala razvoj nanosekundnega pulznega generatorja ter izpostavitev ravninskih lipidnega dvosloja nanosekundim pulzom in pri tem preučevaje strukturnih spememb ter porušitvene napetosti z merjenjem upornosti in kapacitivnosti. 3.1 Generator nanosekundnih pulzov Blumeline
Komora za ravninski lipidni dvosloj z nizko prevodnostjo in visoko kapacitivnostjo predstavlja električno breme z visoko časovno konstanto. Za generiranje nanosekundnega pulza na bremenu z visoko časovno konstanto mora zato imeti pulzni generator nizko impedanco in mora biti električno blizu bremena. Blumlein generator z mrežo za oblikovanje pulza je eden izmed najprimernejših konceptov za generiranje pulzov na nizki impedanci, saj je njegovo vezje in električne komponente najlažje optimizirati, da dosežemo zahteve za izhodni pulz. Generator smo najprej optimizirali s programom PSPICE (Cadence, ZDA) [16] in ga nato še izdelali (slika 2). Obe mreži za oblikovanje pulza v Blumlein generatorju sta sestavljeni iz treh pod sklopov z induktivnostjo 6 nH in kapacitivnostjo 240 pF. Izhodni pulzi iz nanosekundnega Blumlein generatorja se dobro ujemajo s PSPICE simulacijo. Polna dolžina pulza pri polovični amplitudi (FWHM) je 7 ns, maksimalna amplituda pulzov pa je enaka napajalni napetosti (slika 3). Nepravokotnost pulzov in 20% negativni odboji so bili predvideni že pri PSPICE simulaciji in so posledica majhnega število pod sklopov mreže za oblikovanje pulza. To pa zato, da smo lahko realizirali kompaktno vezje na majhni komori za ravninski lipidni dvosloj.
40 50 t (ns)
Slika 3. Časovni potek izhodnega nanosekundnega pulza iz Blumlein generatorja pri različnih napajalnih napetostih (10 -40 V).
3.2 Ravninski lipidni dvosloji izpostavljeni nanosekundnim pulzem
Rezultati merjenja kapacitivnosti in upornosti ravninskega lipidnega dvosloja z uporabo LCR meta so pokazali, da nanosekundni pulzi na ravninski lipidni dvosloj nimajo vpliva. Pri dodajanju dvovalentne raztopine CaCl2, opazimo povečanje kapacitivnosti in zmanjšanje upornosti ravninskega lipidnega dvosloja. V kombinaciji vzbujanja ravninskega lipidnega dvosloja in dodajanja CaCl2 opazimo, da se upornost in kapacitivnost ravninskega lipidnega dvosloja spremeni le ob dodajanju CaCl2 (slika 4). Ravninski lipidni dvosloj se zaradi vzbujanja z nanosekundnimi pulzi ni porušil, kot smo pričakovali. Ko je prevodna raztopina vsebovala 4 mM CaCl2, se je ravninski lipidni dvosloj običajno porušil, zaradi dodajanja CaCl2 v prevodno raztopino. Pri ponovnem tvorjenju ravninskega lipidnega dvosloja se lipidni dvosloj ni več vzpostavil. Poizkuse smo ponovili večkrat, na sliki 4 je prikazan eden od rezultatov.
Slika 2. Vezje nanosekundnega Blumlein generatorja na komori za ravninski lipini dvosloj.
Slika 4. Kapacitivnost in upornost ravninskega lipidnega dvosloja v odvisnosti od časa. Črtkane črte na obeh grafih predstavljajo dodajanje 0,5 mM CaCl2 v solno raztopino na eno stran ravninskega lipidnega dvosloja. Sivo polje predstavlja vzujanje ravninskega lipidnega dvosloja z nanosekundnim pulzom amplitude 50 V in trajanja 7 ns. Nanosekundni pulzi so bili proženi na vsakih 50 s.
429
4 Diskusija
Ravninski lipidni dvosloj, kot preprost model celične membrane, do sedaj ni bil izpostavljen nanosekundnim elektroporacijskim pulzom. Cilj študije je bil razvoj nanosekundnega generatorja za izpostavitev ravninskih lipidnih dvoslojev nanosekundnim pulzom, da bi razložili razliko eksperimentov in vitro ter in vivo z uporabo nanosekundnih in mikrosekundnih puziov. V skladu z študijami v in vitro in in vivo pogojih ter simulacijami molekularne dinamike smo ob izpostavitvi nanosekundnim pulzom pričakovali strukturne spremembe oziroma porušitev ravninskega lipidnega dvosloja.
Opazovanje v času trajanja naosekundnega pulza je težko izvedljiva. Optično opazovanje z mikroskopom ni mogoče zaradi komore, kjer so pripravljeni ravninski lipidni dvosloji. Zato moramo spremembe ravninskega lipidnega dvosloja opazovati električno z merjenjem spremembe kapacitivnosti in upornosti. Pred in po vzpostavitvi ravninskega lipidnega dvosloja nanosekundim pulzom smo merili kapacitivnost in upornost ravninskega lipidnega dvosloja z LCR metrom.
Rezultati merjenja kapacitivnosti in upornosti so pokazali, da izpostavitev ravninskega lipidnega dvosloja nanosekundnim pulzom ne vpliva, opazne pa so spremembe ob dodajanju dvo-valentnih ionov v okoliško raztopino. To odpira nekatera nova vprašanja na nivoju osnovnega razumevanja mehanizmov elektroporacije na nivoju nanosekundih pulzev, ki zahtevajo dodatne raziskave.
Z dinamičnim merjenjem toka v času trajanja pulza bi lahko izmerili perturbacije lipidnih molekul v membrani. Vendar so lastnosti merilnega sistema, kot je pasovna širina v gigaherčnem frekvenčnem območju, hitra dinamika merilnika, merjenje toka v pikoamperih, prezahtevne. Izdelati ali kupiti bi bilo potrebno tudi novo mikro komoro za izgradnjo ravninskih lipidnih dvoslojev ter prilagoditi merilno vezje za visoko frekvenčno merjenje. Za primerjavo poizkusov med nanosekundnim območjem ter mikrosekundnim območjem bo v prihodnosti potrebno načrtovati poizkuse tako z napetostnim kot tudi tokovnim vzbujanjem s pulzi.
Zahvala
Raziskava je podprta s strani Javne agencije za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije. Raziskave so bile opravljene v sklopu laboratorijev EBAM skupine evropskih laboratorijev (LEA). Del poizkusov je bil opravljen v sklopu programa Mreže infrastrukturnih centrov Univerze v Ljubljani (MRIC UL IP-0510). Del poizkusov je bil opravljen v sklopu štirimesečnega obiska v Frank Reidy Research Center for Bioelectrics, Old Dominion University, Norfolk, Virginia, ZDA, za katerega je doc. dr. Peter Kramar prejel Fulbrightovo štipendijo.
Literatura
[1]	M.L. Yarmush et al. : Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Annu. Rev. Biomed. Eng. 16: 295-320, 2014.
[2]	T. Kotnik et al.: Electroporation-based applications in biotechnology. Trends Biotechnol. 33: 480-488, 2015.
[3]	E. Neumann et al.: Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10: 279-290, 1972.
[4]	D. Miklavčič: Handbook of Electroporation. Springer 2017.
[5]	T. Kotnik et al. : Cell membrane electroporation - Part 1 : The phenomenon. IEEE Electr. Insul. M. 28(5): 14-23, 2012.
[6]	S. Mahnič-Kalamiza et al.: Electroporation in food processing and biorefinery. J. Membrane Biol. 247: 12791304, 2014.
[7]	E. Puértolas et al.: Improving mass transfer to soften tissues by pulsed electric fields: fundamentals and applications. Annu Rev Food Sci Technol 3: 263-82, 2012.
[8]	T. Batista Napotnik et al.: Effects of high voltage nanosecond electric pulses on eukaryotic cells (in vitro): A systematic review. Bioelectrochemistry 110: 1-12, 2016.
[9]	P. Kramar et al.: Merjenje lastnosti ravninskih lipidnih dvoslojev. Elektrotehniški vestnik 76: 293-298, 2009.
[10]	M. Reberšek et al. : Cell membrane electroporation - Part 3: The equipment. IEEE Electr. Insul. M. 30(3): 8-18, 2014.
[11]	J. F. Kolb et al.: Nanosecond pulsed electric field generators for the study of subcellular effects. Bioelectromagnetics, 27: 172-187, 2006.
[12]	M. Reberšek et al.: Blumlein configuration for high-repetitionrate pulse generation of variable duration and polarity using synchronized switch control. IEEE Trans. Biomed. Eng., 56(11): 2642-2648, 2009.
[13]	C. Merla et al.: A 10-fl high-voltage nanosecond pulse generator. IEEE Trans. Microw. Theory Tech., 58(12): 4079-4085, 2010.
[14]	J. F. Kolb: Generation of ultrashort pulse. In Advanced Electroporation Techniques in Biology in Medicine, A. G. Pakhomov, D. Miklavčič, and M. S. Markov, Ed. Boca Raton, FL: CRC Press, 2010, pp. 341-352.
[15]	M. Montal et al. : Formation of Bimolecular Membranes from Lipid Monolayers and a Study of Their Electrical Properties. Proceedings of the National Academy of Sciences 69: 3561-3566, 1972.
[16]	E. Puértolas et al.: Improving mass transfer to soften tissues by pulsed electric fields: fundamentals and applications. Annu Rev Food Sci Technol 3: 263-82, 2012.
430