MIKROBNA SLEDILA V KRAŠKI HIDROLOGIJI MICROBIAL TRACERS IN KARST HYDROLOGY MIHAEL BRICELJ Acta carsologica, XVIII (1989), 311-322, Ljubljana, 1989 Izvleček UDK 556.34.04( 497.12):578/579 Bricelj, Mihael: Mikrobna sledila v kraški hidrologiji Članek obravnava pregled največkrat uporabljenih mikrobioloških sledi~ ki zaobjemajo bakterije, bakterijske spore, kvasovke, bakteriofage in viruse. Mikrobe kot sledila se uporablja največkrat v svrhe ugotavljanja hitrosti vodnega toka, razredčevanja odpadnih voda v sladkih vodah in morju, zadrževal- nega časa v čistilnih napravah, sledenja in porazdeljevanja podzemnih voda in pronicanja odpadne vode v vodonosne plasti. Ključne besede: mikrobna sledila Abstract UDK 556.34.04( 497.12):578/579 Bricelj, Mihael: Microbial tracers in karst bydrology The article represents a review of usually used microbial tracer agents, that include bacteria, bacterial spors, yeasts, bacteriophages and viruses. Microbial tracers are used in tracing experiments in severa! purposes: determination of water flow velocities, dispersion of sewage water and other pollu- tants in fresh and sea water, determination of detention tirne in wast water treatment plants, tracing of partition of underground waters and contamination and penetration of sewage water to the aquifiers. Key words: microbial tracers Naslov - Address mag. Mihael Bricelj Inštitut za biologijo Univerze v Ljubljani Karlovška 19 YU - 61000 Ljubljana UVOD Mikrobna sledila uporabljamo tako kot druga sledila predvsem iz treh razlogov. Z njimi ugotavljamo hitrost vodnega toka, razredčevanje odpadnih voda in določujemo porazdelitev vode med ponori in izviri. Z mikrobnimi sledili ugotavljamo tudi uspešnost prečiščevalnih procesov v čistilnih napravah. Mikrobna sledila, ki se često uporabljajo v različnih sledilnih poskusih so bakterije, bakterijske spore, kvasovke, bakteriofagi in virusi. ZGODOVINSKI ORIS Uporaba mikrobnih sledil za proučevanje gibanja vode je stara metoda. Prvi raziskova- lci, ki so uporabili mikrobna sledila, so bili italijanski znanstveniki z univerze v Torinu, leta 1899 (F. Abba in drugi, 1899). Da bi ugotovili ali lahko pronicnejo mikroorganizmi preko apnenčastih zemeljskih plasti v zidane vodovodne cevi za oskrbo mesta s pitno vodo, so upo- rabili bakterijsko sledilo. Podoben sledilni poskus je izvedel tudi nemški znanstvenik Pfuhl v okolici Strassbourga (E.Pfuhl, 1897). V začetku našega stoletja so angleški znanstveniki uporabili neznano bakterijsko vrsto, ki je tvorila razpoznavni pigment za ugotavljanje možnosti onesnaženja vodnih virov v bližini Londona (H.M. Richards in drugi,1907/1908). Leta 1915 je Gartner uporabil kvasovko Sa- ccharomyces cerevjsjae v podobne namene (A. Gartner in drugi, 1915). Po tem obdobju je zanimanje za mikrobiološka sledila zamrlo in ponovna uporaba teh sledil se začenja po drugi svetovni vojni s poskusi Robsona, ki je sledil gibanju odpadne vode v morju v priobalnem pasu (J.E. Robson, 1956). Pike in sodelavci so pri sledenju razredčevanja odpadnih voda v morju uporabili poleg bakterije Serratja jndka , tudi bakterijske spore vrste JJacj/Jus subtJ]js var. njger (E.B. Pike in drugi, 1969). Niemela in Kinnunen sta prva uporabila bakteriofage kot sledilo za določevanje vodnega toka in mešanja odpadne vode v rekah in jezerih (S. Niemela in drugi, 1969). Wimpenny in sodelavci so izvedli primerjalni sledilni poskus v katerem so uporabili bakterijo Serratja marce- scens, spore vrste Bacj/Jus subtj/js var. njger, kvasovki Hansenula sp. in Rhodotorula g/u{jnjster kolifag podoben lambda fagu, v sledilnem poskusu določevanja hitrosti rečnega toka (J.W.T. Wimpenny in drugi, 1972). Kinnunen in Jokinen sta leta 1972 prvič uporabila bakteriofag T7 za sledenje onesnaženja vodnjaka. Dokazala sta pronicanje onesnažene vode v vodnjak na razdalji dvanajstih metrov (K. Kinnunen in drugi, 1972). V ZDA in Veliki Britaniji so leta 1974 prvič uporabili bakteriofage pri poskusih sledenja podzemnih voda. Medtem ko sta američana uporabila kolifag T4 , sta angleška raziskovalca 313 Acta carsologica, XVIII (1989) uporabila bakteriofag, ki se razmnožuje na vrsti Aerobacter aerogenes (M.W. Fletcher in drugi, 1974; R. Martin in drugi, 1974). Pri poskusih sledenja možnosti onesnaženja vodnih plasti in podzemnih vodotokov so predvsem v nove~m času uporabljali na antibiotike odporne seve bakterije Escherichia coli (T.M. Rahe in drugi, 1978; W. K~ in drugi, 1983 ; L.W. Sinton, 1980 in 1986). V sledilnih poskusih v kraških terenih švicarske Jure so uporabili poleg kolifaga tudi bakteriofag, ki se razvija v gostiteljski. bakteriji Pseudomonas florescens (M. Aragno in drugi, 1982), ter bakteriofag gostiteljske vrste Enterobacter aerogenes (F. Flury, 1984). V sledilnem poskusu na Peloponezu v Grčiji je bil uporabljen prvič salmonelni fag P22H5 (M. Bricelj in drugi, 1986), ki je bil pozneje uspešno uporabljen tudi v sledilnih posku- sih v Slovenski Istri (M. Bricelj in drugi, 1986; P. Krivic in drugi, 1987) in zaledju Bele krajine (M. Bricelj, nepublicirani rezultati). Med virusi, ki so jih uporabili v raziskavah pronicanja vode in sledenju vodnega toka so bili predvsem poliovirusi in goveji enterovirus (W. Ka~ osebni podatki). UPORABLJENI MIKROORGANIZMI Bakterije Serratia marcescens (=Bacillus prodigiosus) Vibriosp. Serratia indica Escherichia coli Bakterijske spore Bacillus subtilis vau1iger Kvasovke Saccharomyces cerevisiae Hansenula sp. Rhodotorula glutinis Bakteriofagi kolifagi [2 MS2 F46 F52 F137 XJ74 314 Batteriofagi kolifagi T2 T4 T7 KanataG oMWD aerobacter fagi tip2 enterobacter fagi VMJ salmonela fagi P22H5 stafilokokus fagi 080 pseudomonas fagi NeuPJ M. Bricelj, Mikrobna sledila v kraški hidrologiji Virusi apatogeni poliovirusi goveji enterovirus tip 1 poliovirus tip 1 LSc poliovirus tip II REZULTATI Abba in sodelavci so svoje sledilo, bakterijsko vrsto izbrali po naslednjih kriterijih: bak- terija ni smela biti patogena in biti prisotna v vodovodnem sistemu pred poskusom; morala se je razmnoževati z lahkoto in razločevati so jo morali od ostalih bakteri1 ki so lahko prisotne v vodovodnem sistemu. Izbrali so bakterijo Baci/lus prodigiosus, katero danes označujemo kot vrsto Serratia marcescens. Poleg bakterijskega sledila so uporabili tudi fluorescentno barvilo uranin. Raziskovalci so razpršili dvajset litrov bakterijske kulture na petdesetih kvadratnih metrih nad sistemom podzemnih kanalov, ki so bili sestavni del torinskega vodovodnega si- stema. Njihovi rezultati so pokazali, da bakterije zelo hitro pronicnejo do vodovodnega siste- ma, dvakrat hitreje kot barvilo uranin. Vendar moramo vedeti, da so tedaj določali uranin z očesom in ne spektro- ali fluorometrično, tako da je morala pronicniti velika količina barvila, da so jo lahko zaznali s prostim očesom. Podoben rezultat je dobil tudi Pfuhl, ki je poleg bakterije vrste Serratia marcescens uporabil tudi bakterijsko vrsto iz rodu Vibrio, ki jo je poimenoval "svetleči vibrio", ker je fos- forescirala. Pfuhl je v nasprotju od italijanskih znanstvenikov ugotovil, da je najhitre~ sledilo uranin. Bil je tudi prvi, ki je na podlagi rezultatov pojavljanja mikrobiološkega sledila izračunal hitrost potovanja sledene vode. Uranin se je na razdalji dvanajstih metrov pojavil v pol ure, Serratia marcescens v eni uri in "svetlikajoči" vibrio v dveh urah. Richards in Brincker sta uporabila nedoločeno pigmentirano bakterijsko vrsto v sledil- nem poskusu v katerem sta dokazovala onesnaženje vodnjakov skozi razpoke v apnenčastih tleh. Najdaljša razdalja na kateri sta še ugotovila prisotnost bakterij je bila 3200 m, ki so jo bakterije dosegle v 80 urah. Ker sta lahko določila koncentracijo sledila sta dobila skoraj ide- alne krivulje pojavljanja sledila. V svojih sledilnih poskusih je Robson uporabil bakterijo Serratia indica , ki je poleg tvorbe značilnega rdečega pigmenta nosila mutacijo odpornosti za antibiotike. Pri sledenju izliva odpadne vode v morje, je poleg opisane bakterije uporabil tudi 32P in splave. S sledilnim poskusom so ugotovili, da je gibanje onesnažene vode odvisno od bibavice in ne od valovanja, ki ga povzročajo vetrovi. Robson se pri sledenju bolj ogreva za radioaktivni izotop, katerega lahko hitro in učinkovito določamo tudi v terenskih pogojih in tako sprotno sledimo gibanju sledila. Določevanje bakterij je sicer bolj zamudno, vendar je njihov vpliv na okolje manj škodljiv. Pike in sodelavci so ugotovili, da spore bakterije Bacil/us subtilis varJJiger zelo dolgo prežive v slani vodi, vendar pa je obdelava vzorcev zelo zamudna, ker je potrebno vzorce segrevati, da spore vzklijejo v vegetativne celice, katere lahko določimo. 315 Acta carsologica, XVIII (1989) V primerjalnem poskusu so Wimpenny in sodelavci uporabili za sledenje rečnega toka na razdalji slabih treh kilometrov več mikrobioloških sledil. Poleg bakterije Serratia marce- scens , spor Bacillus subtilis var. niger , kvasovk Hansenula sp. in Rhodotorula glutinis , so uporabili lambda fagu podoben kolifag bakterije Escherichia coli. Od vseh uporabljenih sledil so bili najbolj zadovoljni z bakteriofagom zaradi lahkega določevanja in nizkih koncentracij ozadja v vzorcih vode reke Taff, gostiteljske specifičnosti, nizke deaktivacije v laboratorijskih pogojih in njihove inertnosti v okolju, ki zaradi tega ne predstavlja nikakršne nevarnosti za zdravje živali in ljudi. Pri odlaganju poživljenega blata v morju so kot sledilo razprševanja na morskem dnu uporabili tehniko določevanja bakterije Escherichia coli, ki se v poživljenem blatu nahaja v večjih količinah. Rezultati, ki so jih dobili so se dobro skladali z določevanjem radioaktivnih sledil v sedimentu. Vendar pa ima tehnika uporabe bakterije Escherichia coli kot sledila v morju to slabo lastnost, da bakteriji ne moremo slediti dalfli čas, saj je njeno preživetje v slani vodi kratkotrajno(P.A. Ayres, 1977). V raziskavah razprševanja fekalnih bakterij v zemlji tipa Dixonville, Hazelair in Philo- math v Oregonu, so nakratkih razdaljah ugotovili, da so bakterije, ki so odporne na serijo raz- ličnih antibiotikov (novobiocin, nalidiksična kislina in tetraciklin) in natrijev azid, bolfle sledilo kot fluoresceinsko barvilo Pyla-tel yellow (Pylam Dye Co.,N.Y.), ki je v teh poskusih odpo- vedalo. Bakterijski sevi so se gibali s hitrostjo 1500 cm na uro, večinoma skozi makropore v zoni saturacije pod 12 cm pod površino in 150 in 200 cm. Pod to globino je prodiranje sledila onemogočil saprolit (T.M. Rahe in drugi, 1978). V raziskavah pronicanja onesnažene in odpadne vode v aluvialne nanose na Novi Ze- landiji je Sinton uporabil nepatogena seva bakterije Escherichia coli, ki sta nosila mutacijo odpornosti na antibiotika. Sev E coli 16-2 je nosil mutacijo nezmožnosti fermentiranja lakto- ze in odpornosti na nalidiksično kislino, medtem ko je bil sev E coli PB 922 odporen na anti- biotik rimfampicin. Z obema sevoma je dokazal pronicanje onesnažene vode na razdalji 920 metrov. Hitrosti pomikanja najvišje koncentracije sledila so bile 128 in 215 metrov na dan. (L. W. Sinton, 1980 in 1986). Pronicanje uranina in bakterije Escherichia coli so proučevali tudi v silikatnem peščen­ jaku na področju Merdingen v Zvezni republiki Nemčiji v globini dveh metrov na razdalji 37,5 metra. Po začetni hitrosti 0.2 do 0.25 m na dan se je zaradi nihanja vode in osuševanja v plasti vzorčevanja naslednji vrh uranina pojavil šele po mesecu in pol, dokazali pa so tudi bakterije v sledeh. V tem primeru se je izkazal uranin za bolfle sledilo kot bakterije(W. Kass in drugi, 1983). Na območju Chalk river v Kanadi so v monzonitnem gnajsu preiskušali različna sledila: bakterijo Escherichia coli odporno na tetraciklin, bakterijo Escherichia coli markirano z32P,82Br,3 H, natrijev fluorescein, nitrat in mikrokroglice obarvane z natrijevim fluorescei- nom s premerom 0,83 in 2,0 mikrometra. Injiciranje sledil je bilo trenutno (pulzno) ali nepre- kinjeno (kontinuirano) in izvajano na dva načina: pasivno in aktivno. Pri pasivnem načinu so dodali v mesto injiciranja samo toliko vode,da se je sledilo odstranilo z mesta injiciranja, pri 316 M. Bricelj, Mikrobna sledila v kraški hidrologiji aktivnem načinu pa so sledilu neprekinjeno dodajali določeno količino vode. Mikrokroglice in bakterije so kot sledila kazale zelo ozke in nizke sledilne krivulje, medtem ko bromid in natri- jev fluorescein kažeta visoke in razpotegnjene krivulje ne glede na način injiciranja. Povrnjena količina bromida je predstavljala 83% injicirane količine, medtem ko je bila povrnjena količina bakterije le 9% (D.R. Champ in drugi, 1987). Obsežno študijo uporabe bakteriofagov kot sledil predstavlja delo finskega avtorja K. Kinnunena (K. Kinnunen, 1978). V svojih sledilnih poskusih je uporabil kolifage F52, F46 in T7 in F137. Na rekah Kymijoki in Vantaanjoki je s fagnim sledilom sledil gibanju onesna- žene vode. Volumen fagnega sledila v poskusu na reki Kymjoki je bil med 4000 in 5000 mili- litri, titer pa je variiral med 2.5 x 1010 in 1.95 x 1011• Razdalja med točko injiciranja v reko in vzorčenja je v enem primeru bila 17.2 km in v drugem med 8.670 in 8.800 metri. Na osnovi rezultatov so z linearno regresijo izračunali odnos med hitrostjo potovanja vodne mase in hitrostjo izliva odplak. Visok faktor linearne korelacije (r=0.9997) je dokaz, da so bakteriofagi uspešno sledilo za določevanje potovanja onesnažene vode. V poskusu na reki Vantaanjoki je uporabil vse štiri bakteriofage, tako da je istočasno označil omenjeno reko in njene pritoke. Količina fagnega sledila je bila med 1.000 in 3.000 ml s titrom med 5.8 x 109 in 1.2 x 1011 • Hitrosti potovanja posameznih vodnih mas so primerjali z rezultati sledenja z rodamninom B. Ocenjene hitrosti na podlagi sledenja z rodaminom B so bile višje kot hitrosti ocenjene s fagi. Vendar so v primeru merjenja hitrosti s fluorescentnim barvilom ta merjenja izvajali na kraJih razdaljah dveh do treh kilometrov, medtem ko so bile razdalje v primeru uporabe fagov med 24 in 46 kilometri. V tem primeru se je izkazala pred- nost istočasne uporabe več sledil, ki jih enostavno ločimo, kar je pri uporabi fluorescentnih barvil težje zaradi prekrivanja absorbcijskih maksimumov. Pronicanje sledil skozi vodonosne plasti je Kinnunen sledil na modelu umetno polnj- enega vodnjaka na razdalji 10 metrov z vzorčnimi cevmi na približno vsaka dva metra. V sledilnem poskusu je uporabil bakteriofaga T7in F137, ter NaCl, rodamin B in82Br. Vodnjak so umetno polnili z 1 litrom vode v minuti. Rezultati sledil so pokazali, da sta do končne točke odvzema na desetih metrih prispela le82Br in fag F137z isto izračunano hitrostjo 0.125 m/h. Fag T7, NaCl in rodamin B niso pronicnili do končne merilne točke. Vendar pa je bila količi­ na zadržanega faga v plasteh mnogo večja kot količina radioaktivnega izotopa. Kinnunen predlaga uporabo bakteriofagov v te namene le v primeru, ko se radioaktivnih izotopov ne sme uporabiti. Kinnunen je bakteriofage uporabil tudi za določevanje zadrževalnega časa v čistilni napravi za čiščenje gospodinjskih odplak in odplak kemične industrije, kakor tu za določitev zmanjšanja titra bakteriofaga v stabilizacijskih bazenih. V ta namen je uporabil bakteriofaga T7 in F52, poleg tega pa tudi spore praproti vrste Lycopodium obarvane s safraninom in kri- stal violetnim barvilom. Rdečih spor je uporabil 2 g v katerih je bilo približno 105 spor, zele- nih spor pa je uporabil enako količino. Skupna količina fagnih delcev T7 faga je bila 8,2 x 1012 pfe, F52 faga pa 1.2 x 1013 pfe. Spore praproti so zasledili v vzorcih le občasno, bolJi pa so bili rezultati sledenja z bakteriofagi. Vrnjena količina faga T7 je bila 0.023%, bakterio- 317 Acta carsologica, XVIII (1989) faga FS2 pa 25%. Vzroka za zelo maJbno povrnjeno vrednost bakteriofaga T7 je verjetno v tem, da je bil injiciran na drugem mestu kot bakteriofag FS2, ki ni bil voden v apnenčasti reaktor , kjer je pH 11.0 do 11.5, ki ta bakteriofag delno deaktivira. časi izmerjenega zadrže- vanja v čistilni napravi so bili kraji kot teoretično izračunani. Fletcher in Myers sta v južnem Missouriji v kraškem predelu uporabila kolifag T4k ot sledilo za raziskovanje podzemnih vodotokov. Pozitivni rezultat sta dobila na razdalji ene milje. Martin in Thomas sta uporabila bakteriofag tip2 gostiteljske bakterije Aerobacter aero- genes pri proučevanju podzemeljskega toka vode pod odlagališči jalovine iz premogovnikov v Welles-u. V poskusu sta uporabila 3.04 x l011pfe/ml. Bakteriofage sta določila še po 192 urah v vrtini na razdalji 680 metrov. Švicarski raziskovalci Aragno, Mueller in Flury so uporabili bakteriofage v sledilnih poskusih v švicarski Juri. V prvem poskusu so uporabili T7 kolifag in NeuPJ , ki se razmno- žuje na gostiteljski bakteriji Pseudomonas florescens . V drugem sledilnem poskusu pa so uporabili bakteriofag VMJ gostiteljske bakterije Enterobacter aerogenes . Bakteriofage so sledili na razdalji 10 do 16 km. V sledilnem poskusu so dobili bolje rezultate z bakteriofagom NeuPJ , ki je bil uporabljen na kra$i sledilni razdalji. Zaključek raziskovalcev je bil, da so hitrosti potovanja bakteriofagov tudi do desetkrat hitreje, če jih primerjajo s drugimi sledili. V poskusu z bakteriofagom VMJ so bakteriofag določili po 16 dneh na razdalji 8300 m, kar pomeni hitrost potovanja sledila 21,6 m na uro. Nemška raziskovalca Althaus in Jung sta uporabila kolifag f2 za raziskave pronicanja vode skozi peščene vodonosne plasti. Bakteriofag je prepotoval v 124 dneh razdaljo 20 met- rov. Pri tem pa je potrebno omeniti, da so zasledili bakteriofag na posameznih vzorčnih mestih tudi še po enem letu od injiciranja. V sledilnih poskusih mešanja odplak v reki Cam na Novi Zelandiji je Sinton uporabil dva bakteriofaga : n80, ki se razmnožuje na gostiteljski bakteriji Staphylococcus aureus in nMWD, ki se razmnožuje na E coli. Kolifag nMWD s skupnim titrom 4,1 x 1013 pfe je bil injiciran v reko Cam in največjo koncentracijo sledila so zasledili na oddaljenosti 6,6 km po 5 urah in 52 minutah, kar je pomenilo povprečno hitrost 1,13 km na uro. Fag n80 je na približ- no enaki razdalji dosegel hitrost 1,07 m na uro (L.W. Sinton in drugi,1987). V sledilnih poskusih na Peloponezu so poleg kolifagov uporabili prvič tudi salmonelni fag P22HS. V ponor, kamor se stekajo odpadne vode mesta Tripolisa so injicirali 3,9 x 1012 pfe bakteriofaga "Kanata G" in ga zasledili na razdalji 29 do 31 km v izvirih ob Argoškem zalivu. Bakteriofag f2 se je pojavil v istih izvirih, bil pa je injiciran 26 km od obale. V ponor Kapsia je bil injiciran bakteriofag P22.H5 v skupni koncentraciji 5,8 x 1016 pfe. Maksimalno vrednost so zasledili po desetih dneh na 39 km oddaljenem izviru Kiveri ob Argoškem zalivu (M. Bricelj in drugi, 1986). Bakteriofag P22HS je bil uporabljen tudi pri sledenju podzemskih voda v Slovenski Istri. V ponor Smokovska vala na Gračišču so injicirali 10 1 fagne juhe s skupnim litrom 4 x 1014 pfe. Bakteriofagi so se pojavili v izviru Rižane. Izračunana težiščnica vala je bila 348 ur. Izko- ristek sledila je bil 15,6% (M. Bricelj in drugi, 1986). 318 M. Bricelj, Mikrobna sledila v kraški hidrologiji V sledilnem poskusu na Matarskem podolju so injicirali bakteriofag P22H5 v ponor Hotična. Skupni titer bakteriofaga je bil 4,1 x 1014 pfe. Po devetnajstih dneh se je fagno sle- dilo pojavilo v izviru Rižane in naslednji dan doseglo maksimum z 27,6 pfe v mililitru vzorca. Izračunana težiščnica fagnega vala je bila 482 ur. Ob upoštevanju rezultatov laboratorijskega poskusa, v katerem so inkubirali znane koncentracije bakteriofagov v vzorcih ponorne in iz- virne vode, so določili faktor znižanja koncentracije bakteriofagov in ga uporabili pri izračunu povrnjene količine sledila. Izkoristek sledila je bil med 32,6 in 52% (M. Bricelj in drugi, 1986). V sledilnem poskusu na področju Movraške vale je bil injiciran bakteriofag P22H5 s skupnim titrom 8,3 x 10 14 pfe. V vzorcih izvira Mlini so po štirih dneh določili maksimalno količino 654 pfe v mililitru vzorca, pri čemer je bila izračunana težiščnica fagnega vala 94,6 ure, in izkoristek sledila 5,3%. Pozitivni rezultati so bili tudi v vzorcih vode izvirov Sopot in Ara, pri čemer je v prvem primeru maksimalna vrednost 32,4 pfe v ml in težiščnica vala 145,1 ur in zadnjem primeru 416 pfe v ml in 80,8 ur. Sledilni poskus je bil v primeru Movraš- ke vale izpeljan v ponor, ki je bil popolnoma zalit z vodo in je sledilo počasi pronicalo skozi plasti gline. Po dveh letih od injiciranja so zasledili ostanke sledila v vzorcih gline na globini med 7 in 12 cm (P. Krivic in drugi, v tisku). Salmonelni fag P22H5 je bil uporabljen tudi v sledilnem poskusu na področju Senožeč za dokaz povezave med Senožeškim potokom in in izviri v Tržaškem zalivu. Fagno sledilo je bilo injicirano s skupnim titrom 3 x 1015 pfe. Z MPN metodo je bil dokazan bakteriofga v vzorcih izvirov Moščenice in Sardoč, z metodo agarskega preliva pa je bil po 1776 urah doka- zan bakteriofag v vzorcu izvira Nabrežina. Delež povrnjenih bakteriofagov ob upoštevanju faktorja deaktivacije je bil 12,6% (M. Šiško, neobjavljeni rezultati). Salmonelni fag P22H5 je bil uporabljen tudi v dveh sledilnih poskusih na področju za- ledja Bele Krajine. V ponor Kačji potok je bilo injicirano sledilo s skupnim titrom 4,2 x 1015• Fagno sledilo je bilo odkrito v izvirih Obrha in Radeščice. Vzorci izvira Obrh so bili določeni z MPN metodo. Težiščnica vala je bila 704,6 ure. Pojav fagov v izviru Radeščica je bil zasleden po sedemnajstih dneh, z vrhom devetnajsti dan z maksimalno vrednostjo 70,4 pfe v mililitru in izračunano težiščnico vala 511,4 ure. V drugem sledilnem poskusu je bil bakteriofag P22H5 injiciran v potok Vrčice. Skupni titer bakteriofaga je bil 5,1 x 1015 pfe, maksimumalna kon- centracija 2,2 x 102 se je pojavila v izviru Krupe po petih dneh. (M. Bricelj, neobjavljeni re- zultati). ZAKLJUČEK Pri uporabi mikrobioloških sledil v različne namene je potrebno zadostiti predvsem nas- lednjim kriterijem: - sledilo mora biti varno, kar v primeru mikrobnih sledil pomeni, da ne sme biti patogeno. - v vodotokih, podzemni vodi in odpadni vodi ga ne smemo zaslediti, oziroma mora biti pri- sotno v čim manjši količini. - sledilo moramo z lahkoto razpoznati med običajnimi mikroorganizmi v vodi in odpadni vodi, metoda določevanja pa mora biti popolnoma izključujoča. 319 Acta carsologica, XVIII (1989) - sledilo mora imeti dovolj dolgo časovno dobo preživetja tako v vodi kot podzemni vodi in odplakah, ter se v teh okoljih ne sme razmnoževati. - kjerkoli je namen sledilnega poskusa proučevanje preživetja mikroorganizma ali pronicanja skozi zemeljske plasti, mora biti sledilo zelo podobno opazovani vrsti; v primeru bakterij naj bi bil to nepatogeni sev, sicer patogene bakterije. - mikrobno sledilo se mora z lahkoto in čim ceneje namnožiti do zahtevanih koncentraci1 ki so potrebne za izvedbo sledilnega poskusa. Kadarkoli vnašamo v okolje organizme, ki smo jih namnožili v laboratoriju in obstajajo možnosti, da preidejo v vodo za oskrbo prebivalstva so kriteriji varnosti najvažnejši. Pri mi- kroorganizmih sta dva važna kriterija varnosti pri izbiri mikrobnega sledila Prvi je patogenost sledila. V tem primeru odpadejo določene vrste, ki so jih raziskovalci uporabljali za sledenje. To sta predvsem Serratia marcescens, katero so osamili v primerih septikemij (J.T. Davis in drugi, 1970) in Bacil/us subtilis, ki je primarni in sekundarni infektivni agens pri vnetjih oči, urinarnega trakta, pljučnic in septikemij (R. Cox, 1959). Poleg tega pa so nekateri sevi E coli tudi patogeni in jih često najdemo kot povzročitelje infekcij v bolnicah (S. A. Sattar in drugi, 1972). Drugi važni kriterij pa se tiče predvsem uporabe na različne antibiotike odpornih bakte- rijskih sevov. Markerji za odpornost na različne antibiotike se morajo nahajati na kromosomu, ne pa na plazmidu, kajti ta se lahko zelo hitro prenese na druge bakterije, ki zadobijo nove lastnosti (W.H. Smith, 1969). Bakterije torej ne smejo vsebovati R-faktorjev in imeti patogeni serotip in morajo biti genetsko dobro preiskane. Če si ogledamo z zgoraj omenjenih kriterijev posamezna mikrobna sledila, potem lahko zatrdimo, da so najbolj varna sledila bakteriofagi in nepatogepi sevi bakterije Escherichia coli. Predvsem v sledenju porazdelitve in redčenja odpadne vode pa je važno tudi visoko razmerje med sledilom in ozadjem v sledilnem poskusu. Pri tem je predvsem pri izbiri bakte- riofagov potrebno izbrati pravi bakteriofag, ki ima nizko ozadje ali pa ga sploh nima. V pri- meru bakteriofagov angleška avtorja (N.D. Seeley in S. B. Primrose, 1982) odklanjata uporabo bakteriofagov bakterij Escherichia coli in Pseudomonas aeruginosa, kajti njune bakteriofage najdemo v okolju večkrat v večjih količinah in predlagata uporabo redkih bakteriofagov bakterije Salmonella typhimurium , kar se je izkazalo za zelo uspešno (M. Bricelj in drugi, 1986). Poleg tega pa so bakteriofagi pomembni kot sledila predvsem v primerih, ko je potreb- no simulirati propadanje enteričnih virusov v okolju. V vseh dokumentiranih sledenjih z mikroorganizmi je večina rezultatov predvsem poda- na z razdaljo in hitrostjo premikanja ali pronicanja sledila, medtem ko je zelo malo podatkov o izkoristkih sledil, kar je predvsem pomembno pri sledenju podzemnih vodotokov. Prav tako je malo rezultatov o propadanju mikrobioloških sledil med samim sledenjem in vplivom raz- ličnih faktorjev na zmanjševanje količine sledila. Za ovrednotenje uporabnosti mikrobioloških sledil so predvsem pomembne raziskave sočasnih sledenj z drugimi sledili, ki pa so zelo redke in se opravljajo šele v zadnjem času (M. Bricel1 neobjavljeni podatki). 320 M. Briceli Mikrobna sledila v kraški hidrologiji LITERATURA Abba, F, Orlandi, E. & Rondelli, A, 1899: Ueber die Filtrationskraft des Bodens und die Forschwem- mung von Bakterien durch das Grundwasser. Z. Hyg. lnfektKrankh. 31, 66-84. Althaus H. & K.O. Jung, 1985: Feldversuche in Mittelsandingen Grundwasserleiter Haltern zur Feststel- lung der Lebensdauer und des Transportverhaltens von Bakterien und Viren in Grundwasserlei- tern. Im Auftrag des Umweltbundesamtes, Berlin, Bericht 1 und 2. Aragno M. & I. Mueller, 1982: Premiere experiences de tra<;ages des eaux souterraines dans le karst du Jura neuchatelois (Suisse) a l'aide de bacteriophages. Bulletin du Centre d'Hydrogeologie, 4, 59-81. Ayres P.A, 1977: The use of Faecal bacteria asa Tracer for Sewage Sludge Disposal in the Sea. Marine Pollution Bulletin, 8,(12),283-285. Bricelj M. & P. Krivic, 1986: Karstwassermarkierung mit bakteriophagen. IV. Internationales Hydro- mikrobiologisches Symposium, Piest'any, 3.-6. Juni 1986. Ed. I.Daubner, VEDA, Verlage der Slowakische Akademie der Wissenschaften, Bratislava, 285-289. Bricelj M, G. Kosi, P. Krivic, 1986: Tracing of underground karstic waters with phage P22H5. Fourth International Symposium on Microbial Ecology, Ljubljana, August 24 - 28 Bricelj M, G. Kosi & D. Vrhovšek, 1986: Tracing with Salmonella-phage P22H5. In Karst Hydro- geology of the Central and eastern peloponnesus (Greece), ed. A. Morfis & H. Zojer, Sprin- ger-verlag Wien-New York,269-271. Cox, R., G. Sockwell, B. Landers, 1959: Bacillus subtilis septicaemia. New England Journal of Medicine, 261, 894-896. Davis, J.T., Foltz E, Blakemore, W.S, 1970: Serratia marcescens. A pathogen of increasing clinical importance. Journal of American Medica! Assotiation, 214, 2190-2192. Fletcher, M.W. & Myers, R.L, 1974: Groundwater tracing in karst terrain using bacteriophage T4. The Annual meeting of the American Society for Microbiology. Flury F, 1984: Multitra<;age sur le plateau de Bure (Ajoie, Ju) a l'aide de bacteriophages et de tra<;eurs fluorescents. Bulletin du centre d'Hydrogeologie, 5, 91-105. Gartner, A, 1915: Die Hygiene des Wassers, 310 p. Braunschweig.(Ref. Schubert, R.H.W, 1971) Kiiss W, R. Ritter & C. Sacre, 1983: Lebensdauer und Transport von Bakterien in typischen Grund- wasserleitern-Oberrrhenische Schotterebene. DVGW-Scriftenreihe Wasser, 35, 127-137. Kinnunen K., 1978: Tracing water movement by means of Escherichia coli bacteriophages. Pubi. 25 of the Water Research Institute, National Board of Waters, Finland, Helsinki, 50 pp. Kinnunen K. & Jokinen, O, 1972: The use of bacteriophages in marking groundwater. Vesitalous, 1/72, 16-17. Krivic Primož, Mihael Bricelj, Niko Trišič in Martina Zupan, 1987: Sledenje podzemnih vod v zaledju Rižane. Acta carsologica, XVI/4, 83-104. Martin R. & A. Thomas, 1974: An Example of the Use of Bacteriophage asa Groundwater tracer. Journal of Hydrology, 23, 73-78. Niemelii, S. & Kinnunen, K, 1968: An experiment with Escherichia coli T bacteriophage as tracer in river flow studies. Geophysica, 10, 121-124. Pfuhl, E, 1897: Ueber die Verschleppung von Bakterien durch das Grundwasser. Z. Hyg. InfektKrankh. 25, 549-554. Pike, E.B, Bufton, A.WJ. & Gould, D.J., 1969: The use of Serratia indica and Bacillus subtilis var. niger spores for tracing sewage dispersion in the sea. J. Appl. Bact, 32, 206-216. 321 Acta c.arsologica, XVIII (1989) Rahe T.M, C. Hagedorn, E.L. McCoy & G.F. Kling, 1978: Transport of Antibiotic-resistant Escherichia coli Through Western Oregon Hillslope Soils Under Conditions of Saturated Flow. J. Environ. Qual, 7(4), 487-494. Richards, H.M- & Brincker, J.A.H, 1907-1908: The potential danger of water dereived from wells in the chalk. Proc. R. Soc. Med, 1, 191-203. Robson, J.E, 1956: A bacterial method for tracing sewage pollution. J. AppL Bact, 19, 243-246 Sattar S.A, E.J. Synek, J.C.N. Westwood, P. Neals, 1972: Hazards in microbial tracers: Reduction in risk by the use of bacillus stearothermophilus spores in aerobiology. Applied Microbiology, 23(6), 1953-1959. Schubert, R.H.W, 1971: Der Nachweis von Oberfliichenwasser-Orundwasser-Kun.schlussen und unteri- ridischen Zusammenhiingen mit Hilfe genetisch markierten Bakterien. Stiidtehygiene. 22, 197-202 Seely, N.D, S.B. Primrose, 1982: The lsolation of Bacteriophage from the Environment. Journal of Applied Bacteriology, 53, 1-17. Sinton L.W. & S.B. Ching, 1987: An Evaluation of two Bacteriophages as Sewage tracers. Water, Air, and Soil Pollution, 35, 347-356. Sinton L.W, 1980: Two Antibiotic-Resistant Strains of Escherichia coli for Tracing the Movement of Sewage in Groundwater. Journal of hydrology (N.Z), 19(2), 119-130. Sinton L.W, 1986: Microbial Contamination of Alluvial gravel Aquifers by Septic Tank Effluent. Water,Air, and Soil Pollution, 28, 407-425. Smith, W.H, 1969: Transfer of antibiotic resistance from animal and human strains of Escherichia coli to resident E. coli in the alimentary tract of man. The Lancet June, 1969, 1174-1176. Wimpenny, J.W.T, Cotton, N. & Statham, M, 1972: Microbes as tracers of water movement. Wat. res, 6, 731-739. MICROBIAL TRACERS IN KARST HYDROLOGY Summary Microbial tracers were used for the first tirne at the end of 19th century for the determination of the possible contamination of water distribution network with pathogenic microbes of severa! towns. Bacteria and yeasts were the commonly used microbes as tracer agents. There was a new interest in microbial tracers in the 1950's when they were rediscovered. The new tracers were introduced especi- ally bacterial spores and bacteriophages. Microbial tracers were used for severa! purposes: dispersion of wastewaters in freshwaters and sea, determination of water movement velocities, determination of detention tirne in waste water treatment plants, penetration of pollutants into aquifiers and tracing of underground water connections in karstic regions. The main criterion in the use of microbial tracers is safety aspect. For this reason any contamination of water resources with pathogenic microorganisms, especially bacteria must be avoidt:d. As tracer agents only non-pathogenic bacteria strains could be used, carrying no extrachromosomal R-factors and if used antibiotic- resistance markers should be incorporated into bacterial chromosome. From the safety aspect, apart from the non-pathogenic strains of Escherichia coli, bacteriophages represent the most convinient tracer agent. In tracing experiments in highly polluted waters the selection of appropriate phage-host system is cruciaL Coliphages and phages of pseudomonads are suggested to reject, because of likely background interference and phages of mouse salmonella are most promissing. 322 i 1 .i..