FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 259
Pregledni članki - Review Articles
17ft-hidroksisteroid-
dehidrogenaze -
obetajoče farmakološke tarče
17R-hydroxysteroid dehydrogenases -potential pharmacological targets
Katja Kristan, Tea Lanišnik Rižner
POVZETEK: 17B-hidroksisteroid-dehidrogenaze (17B-HSD) katalizirajo oksidacijo ali redukcijo estrogenov in androgenov na mestu 17 steroid-nega skeleta in s tem uravnavajo aktivnost steroidnih hormonov. Do danes je bilo pri človeku odkritih že 11 različnih tipov 17B-HSD. Nepravilno delovanje teh encimov vodi do motenj v razvoju, do bolezni centralnega živčnega sistema, ali v razvoj številnih rakavih obolenj. Ta članek opisuje vse znane človeške 17B-HSD, njihov pomen in vpletenost v razvoj bolezni ter predstavlja nekatere inhibitorje posameznih izooblik.
Ključne besede: 17p-hidroksisteroid-dehidrogenaze, androgen:, estrogeni, inhibitorji
ABSTRACT: The 17B-hydroxysteroid dehydrogenases (17B-HSDs) have important roles in the regulation of steroid hormone actions through their catalysis of the oxidation or reduction of estrogens and androgens at position 17. To date, 11 different human 17B-HSDs have been described. Dysfunction of the human 17B-HSDs results in reproduction disorders and neuronal diseases, and in the development of hormone-dependent cancers. This review summarizes current knowledge on the medical implications of the 17B-HSDs and presents some representative inhibitors of the different 17B-HSD isozymes.
Keywords: 17p-hydroxysteroid dehydrogenases, androgens, estrogens, inhibitors
I Uvod
Moški ter ženski spolni hormoni (androgeni oz. estrogeni) so odgovorni za spolno diferenciacijo ter razvoj spolnih organov že pri zarodku, njihova koncentracija pa močno naraste v času pubertete. Androgeni so takrat odgovorni za spermatogenezo, rast in razvoj poraščenost, spremembo glasu ter za libido moških, estrogeni pa za telesne spremembe pri ženskah, povečanje prsi, pojav menstruacije. S spolnimi hormoni je povezanih tudi 40 % vseh rakavih obolenj, gre namreč za od hormonov odvisne tipe rakov, kot so rak dojke, prostate, jajčnikov, maternice (1, 2) ter ostale od androgenov in estrogenov odvisne bolezni, kot so npr. benigna hiperplazija prostate, akne in plešavost.
1.1   Biosinleza androgenov in estrogenov v klasičnih sleroidogenih tkivih
Pri moških biosinteza androgenov poteka v testisih, v Leydigovih celicah, v manjši količini pa se sintetizirajo tudi v zoni reticularis nadled-vične žleze. Pri ženskah se androgeni sintetizirajo v veliko manjši količini, in sicer v nadledvični žlezi, v jajčnikih (Vesicular follicles. Corpus luteum) ter v placenti v času nosečnosti. Encime biosinteze aktivira luteinizirajoči hormon, koncentracija le-tega močno naraste med   puberteto.   Androgeni,   vključno   s   testosteronom   in   5a-
dihidrotestosteronom (DHT), ki imata največjo afiniteto do androgenih receptorjev, se sintetizirajo preko pregnenolona (slika 1) (1).
Sintezo estrogenov aktivirata luteinizirajoči ter folikel stimulirajoči hormon. Estron in aktivni ženski spolni hormon estradiol nastaneta iz androgenov po oksidativni odstranitvi C19-metilne skupine ter po sledeči aromatizaciji obroča A. Aromatizacija poteka v celicah granu-loze jajčnikov, nekaj tudi v skorji nadledvične žleze (za ženske pred menopavzo manjšega pomena) ter v Sertolijevih celicah mod (slika 2) (1).
Steroidni hormoni so močno lipofilni, zato se po krvi prenašajo v obliki sulfata (dehidroepiandrosteron (DHEA), estron), ali pa se vežejo na globu-line za vezavo spolnih hormonov (testosteron, estradiol) ali na albumin. V ciljnih organih se sulfatni del odstrani s steroid-sulfatazo (1, 3).
1.2  Biosinteza androgenov in estrogenov v perifernih tkivih
Leta 1988 so odkrili, da sinteza spolnih hormonov ne poteka samo v klasičnih steroidogenih tkivih, pač pa tudi lokalno v perifernih tarčnih tkivih, kjer hormoni tudi delujejo (intrakrina sinteza) (4, 5). Tam se spolni hormoni sintetizirajo iz neaktivnih prekurzorjev, DHEA, DHEA-sulfata, androstendiona in estron-sulfata (2, 3). Koncentraciji DHEA in DHEA-sulfata v plazmi sta pri odraslih moških in ženskah 100-500-krat višji
dr. Katja Kristan, mag. farm., doc. dr. Tea Lanišnik Rižner, univ. dipl. ing. kem., Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za biokemijo, Vrazov trg 2,1000 Ljubljana
farm vestn 2005; 56 2\
FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 260
Pregledni članki - Review Articles
DEHIDROEPIANDRO-CZ      STERON SULFAT
DEHIDROEPIANDRO-            p
STERON (DHEA)
PREGNENOLON
ANDROSTEN DION
PROGESTERON
5-ANDROSTEN-3p,17p-DIOL
5a-ANDROSTAN 3,17-DION
ANDROSTERON
CH
TESTOSTERON
5a-DIHIDRO-TESTOSTERON
OH     <DHT>
5a-ANDROSTAN-3p, 17P-DIOL  CH  OH
3P-HIDROKSISTEROID DEHIDROGENAZA
ISULFATl            I 3-GLUKURQNIDl
5a ANDROSTAN-3a,17p-DIOL
3-GLUKURONIDl         ISULFATl
| 3-glukur6njd|        I sulfat I
Slika 1: Biosinteza androgenov. Številke predstavljajo različne tipe Ujj-hidroksisteroid-dehidrogenaz (1, 2). Figure 1: Androgen biosynthesis. Numbers indicate different types of 17ji-hydroxysteroid dehydrogenases (1, 2).
od koncentracije testosterona ter 1000-10000-krat višji od koncentracije estradiola. Po menopavzi, ko aktivnost jajčnikov oslabi, se skoraj 100 % estrogenov sintetizira v perifernih tkivih po t. i. intrakrini poti (5). Tako so pri ženskah z rakom dojke ugotovili 10-20-krat večjo koncentracijo aktivnega estrogena estradiola v rakavem tkivu kot v plazmi (3, 6). Drugi primer so moški z rakom na prostati. Po kirurški odstranitvi testisev so sicer res opazili 90-95 % znižanje koncentracije testosterona v krvi, vendar je koncentracija aktivnega znotrajcelične-ga androgena DHT v celicah prostate padla samo za 50 %, kar dokazuje, da obstaja še druga, lokalna pot biosinteze (2, 4). Biosinteza aktivnih spolnih hormonov v tumorju torej igra pomembno vlogo pri proliferaciji rakavih celic.
1.3  Selektivni intrakrini modulator ji
Inhibitorji encimov, ki so vključeni v biosintezo oziroma aktivacijo steroidnih hormonov, so pomembna skupina zdravilnih učinkovin za zdravljenje vseh od androgenov in estrogenov odvisnih bolezni. Med najpomembnejše encime uvrščamo aromatazo, steroid-sulfatazo ter
različne hidroksisteroid-dehidrogenaze (6). Ti encimi se izražajo tkivno specifično, tako da inhibitorji uravnavajo aktivnost številnih encimov selektivno le v določenem tkivu oz. celicah. Takšne inhibitorje imenujemo selektivni intrakrini modulatorji (SIM), govorimo o pre-dreceptorskem uravnavanju aktivnosti (7, 8).
SIM se že uporabljajo za zdravljenje raka na dojki. To so inhibitorji aromataze formestan, vorozol, letrozol, anastrozol in eksamestan (6). Znano je, da steroid-sulfatazo inhibirajo tibolon ter njena 3a- in 3p-hidroksi derivata. Tibolon predpisujejo za zdravljenje pomenopavzal-nih težav ter za zdravljenje in preprečitev pomenopavzalne osteo-poroze. V visoki koncentraciji steroid-sulfatazo inhibira tudi medroge-ston, sintetični pregnanski derivat, ki se uporablja pri pomanjkanju progesterona (9). Za zdravljenje moške plešavosti (androgena alopecija), benigne hiperplazije ter raka prostate pa se uporablja finasterid, ki je inhibitor 5a-reduktaze tipa 2. Zanimiva skupina potencialnih zdravilnih učinkovin so tudi inhibitorji 17p-hidroksisteroid-dehidrogenaz, ki se v terapiji še ne uporabljajo.
0 farm vestn 2005; 56
FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 261
17fi-hidroksisteroid-dehidrogenaze - obetajoče farmakološke tarče
GLUKURONOZIL-        ^.       116-GLUKURONiDl TRANSFERAZA^ "
ESTRIOL
>-      ISULFATl
SULFO-TRANSFERAZA
16a-HIDROKSILAZA OH
TESTOSTERON
CH
(encimi kot zgoraj)
ANDROSTEN DION
CH
I3-GLUKURONID I ^     ISULFATl
«-     I 3-GLUKURONIDl
IsulfatI
2-HIDROKSILAZA,      I p*- 4-HIDROKSILAZA,-»-| |    160L-HIDROKSILAZA,    | 1     KATEHOL-O-METIL-x        TRANSFERAZA       1
RAZLIČNI METABOLITI
Slika 2: Biosinteza estrogenov. Številke predstavljajo različne tipe 17fi-hidroksisteroid-dehidrogenaz (1, 2). Figure 2: Estrogen biosynthesis. Numbers indicate different types of 17ji-hydroxysteroid dehydrogenases (1, 2).
2 17B-hidroksisteroid-
dehidrogenaze in inhibitorji
17p-hidroksisteroid-dehidrogenaze (17p-HSD) stereospecifično in reverzibilno pretvarjajo neaktivne 17-ketosteroide v aktivne 17(3-hidroksisteroide v prisotnosti koencima. Uvrščamo jih med NAD /NADPH odvisne oksidoreduktaze (10). V steroidogenih tkivih katalizirajo zadnjo stopnjo sinteze androgenov in estrogenov, v perifernih tkivih, vključno s tarčnimi tkivi steroidnih hormonov, pa delujejo kot molekularna stikala, saj pretvarjajo učinkovite steroidne hormone (testosteron, DHT, estradiol) v neaktivne metabolite (androsten-dion, 5a-androstan-3,17-dion, estron), s tem pa uravnavajo količino hormonov, ki se vežejo na jedrne receptorje (predreceptorska, intrak-rina regulacija) (8, 11). Do danes je bilo pri človeku odkritih že 11 različnih tipov 17p-HSD, ki so oštevilčeni kronološko po času odkritja. Tipa 6 in 9 pri človeku še niso našli, znana je podganja 17p-HSD tip 6 ter mišja 17p-HSD tip 9 (12).
2.1   17R-HSD tip 1
17p-HSD tip 1 je citosolni encim, ki je bil prvič opisan in delno izoliran že leta 1958 (13). Encim je odgovoren za biosintezo estradiola v jajčnikih ter v placenti, od koder se nato izloči v kri. Tip 1 pretvarja estron v estradiol tudi v dojkah (lokalno v tarčnem tkivu), kjer estradiol deluje (11, 14, 15). Znane so tudi kristalne strukture encima s številnimi inhibitorji (16).
Ugotovili so, da se izražanje gena za tip 1 zelo poveča v rakavih celicah dojke, kar vodi k povečani od estrogenov odvisni proliferacij celic (15). Zaradi navedenega je 17p-HSD tip 1 zelo zanimiva farmakološka tarča.
Inhibitorji
Prvi znani inhibitorji so bili derivati estrona in estradiola, kasneje pa tudi spojine z nesteroidnim skeletom. Najboljši inhibitorji iz prvega obdobja so 17-dezoksi-estradiol (7), spojini 2 in 3 ter ekvilin (4) s Ki vrednostmi pod 1uM (slika 3). Kot dober inhibitor tipa 1 se je izkazal tudi nesteroidni sintezni dietilstilbestrol (5) (14). Kasneje so sintetiziral veliko število spojin z namenom, da bi lažje ugotovili zgradbo aktivnega mesta 17p-HSD tipa 1. Gre za analoge naravnega substrata estrona z zelo reaktivno (npr. bromoacetoksi) skupino, ki se je kova-lentno povezala z aminokislinami, odgovornimi za vezavo substrata. Kot inhibitorji so se izkazali tudi nekateri diketoni, derivati 2,3-butan-diona in 2,4-pentandiona, ter različni estronski derivati s pirazolom in izoksazolom, pripetim na D-obroč steroidnega skeleta. Vse te sinte-tizirane spojine so se izkazale kot nizko selektivne, kar preprečuje njihovo uporabo v bolj kompleksnih bioloških sistemih (14).
Encim šibko inhibirajo tamoksifen (6) in njegova metabolita 4-hidroksi-in desmetiltamoksifen. Dobri inhibitorji 17p-HSD tipa 1 so tudi nekateri progestini (nomegestolacetat, medrogeston, tibolon in njegovi metaboliti), ki inhibirajo še steroid sulfatazo (IC50 0,5-35 uM ob 5 nM koncentraciji substrata) (14). Zelo dobri inhibitorji tipa 1 so derivati estradiola s stransko verigo na mestih 17a ali 16a z IC50 vrednostmi pod 1 uM (2-6 nM substrat). Ugotovili so, daje najprimernejša dolži-
farm vestn 2005; 56 2
prelom   1/5/06    11:29 AM   Page 262
Pregledni članki - Review Articles
HO    v   v          16(n=7,8ali9)                                                                           17
Slika 3: Inhibitorji 17/3-HSD tipa 1 Figure 3: Inhibitors of 17/3-HSD type 1
na stranske verige 3 oz. 4 ogljikove atome, za inhibicijo pa je ključen substituent na 16<x položaju (7). Ker so spojine agonisti estrogenskih receptorjev, so uvedli dodatno verigo na mestu 7a (8). Te spojine estrogene aktivnosti niso imele, je pa hkrati močno padla njihova inhibitorna učinkovitost (IC50 16 uM; 3,6 nM substrat) (14).
Epidemiološke študije so pokazale, da lahko fitoestrogeni vplivajo na razvoj raka na dojki, zato so nadaljevali s študijami na predreceptors-ki ravni. Fitoestrogeni, ki jih razdelimo v flavonoide (flavoni, flavanon in izoflavoni), kumestane in lignane, so rastlinske nesteroidne spojine
2 farm vestn 2005; 56
z estrogeno aktivnostjo. Kot najboljši inhibitor 17p-HSD tipa 1 se je izkazal kumestan kumestrol (9), dobri inhibitorji pa so tudi flavoni in izoflavoni, hidroksilirani na mestih 4', 5 in 7 obročev A in B, npr. api-genin (10) in genistein (11) (17). Študija inhibicije encima s fitoestrogeni je prispevala tudi k iskanju novih spojin vodnic pri nadaljnjem razvoju inhibitorjev tipa 1 (18).
Po odkriju, da naravna spojina gosipol (12), polifenolni binaftil iz bombaževih semen, inhibira vse izoencime sorodne človeške laktat-dehidrogenaze, so sintetizirali več njenih analogov in jih testirali kot
FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 263
17fi-hidroksisteroid-dehidrogenaze - obetajoče farmakološke tarče
18
'SCH2Ph
22
Slika 4: Inhibitorji 17fi-HSD tipa 2 Figure 4: Inhibitors of 17/3-HSD type 2
potencialne inhibitorje 17(3-HSD tipa 1. Za najboljša inhibitorja sta se izkazala gosilolakton (13) ter gosiloiminolakton (14) (Ki 2,2 in 4,3 uM) ki se glede na rezultate sidranja vezeta v mesto za vezavo koencima (19). Sintetizirane so bile tudi spojine, ki bi se hkrati vezale v mesto za vezavo substrata in koencima, t. i. panaktivni inhibitor. Prvi takšen primer je hemigosilolakton, ki predstavlja polovico molekule gosipola, ki je preko butilnega distančnika povezana z mimetikom obročev D in C estradiola (15) (19). Drugi takšen primer pa so spojine 16 z različno dolgo vmesno verigo. Za optimalno se je izkazala dolžina osmih CH2 skupin (K,-3,0 mM) (14).
Kar ponuja se vprašanje, ali je sinteza spojin, ki se vežejo v mesto za vezavo koencima, ki je podobno pri vseh encimih iste proteinske družine, smiselna oz. ali sploh lahko pričakujemo selektivne inhibitorje. Kot argument za sintezo tovrstnih spojin avtorji navajajo inhibitorje kinaz, ki se vežejo v mesto za vezavo ATP, a so selektivni za posamezne tipe in so že na tržišču. Prav tako so tudi različni analog gosipola z različnimi substituenti na mestih 4 in 7 pokazali več kot 200-kratno selektivnost za različne tipe visoko homolognih (84-89 %) človeških laktat-dehidrogenaz (19). Zadnja skupina testiranih inhibitorjev tipa 1 so različni pirimidinonski derivati (17) (20)
2.2   17R-HSD lip 2
Nasprotno od 17(3-HSD tipa 1 mikrosomalni 17(3-HSD tip 2 oksidira androgene in estrogene v njihovo neaktivno obliko. Na ta način omejuje količino aktivnih spolnih hormonov v obtoku ter ščiti tarčna tkiva. Zaradi varovalne vloge se encim nahaja v številnih tkivih; v dojkah placenti, maternici, jetrih ter tankem črevesju, v manjši meri pa tudi v prostati, ledvicah, trebušni slinavki in debelem črevesju (21). Tipično ga najdemo v epitelijskih celicah, kot so epitelijske celice gastroin-testinalnega in urinarnega trakta. Znano je, da zmanjšano izražanje gena za 17(3-HSD tip 2 vodi do raka na črevesju, prostati in dojkah (15, 22). V placenti tip 2 verjetno omejuje dostop plodovih androgen-
ov do materinih tkiv in dostop materinih estrogenov v plod ter deluje kot pregrada med plodom in materjo (15)
Zaradi varovalne lastnosti inhibitorji tega encima niso zanimivi z vidika zdravljenja rakavih obolenj. Prevelika aktivnost encima pa lahko preveč zniža koncentracijo aktivnih estrogenov, ki so naravni zaviralci resorpcije kosti, zato bi se inhibitorji tipa 2 lahko uporabljali za zdravljenje osteoporoze pri ženskah v času po menopavzi (23).
Inhibitorji
Prvi inhibitorji 17(3-HSD tipa 2 so bili objavljeni leta 1984. Najnižji Ki vrednosti sta imeli spojini 17a-etinil-estradiol (18) in danazol (19) (Ki 0,3 in 0,6 uM); prva spojina je hkrati agonist estrogenskega receptor-ja, druga pa ima androgeno aktivnost ter je šibek inhibitor steroid-sul-fataze (14) (slika 4).
Testirali so tudi učinek 16oe- in 17a-derivatov estradiola, ki so jih sin-tetizirali kot inhibitorje tipa 1. Ugotovili so, da le spiro-y-lakton-estradi-ola (20) inhibira delovanje 17(3-HSD tipa 2. Ta spojina je služila kot spojina vodnica. Narejenih je bilo nekaj modifikacij, med katerimi je tudi substitucija OH-skupine, sprememba stereokemije laktona, sprememba položaja laktona, različne velikosti laktonskega obroča. Kot najboljši inhibitor se je izkazala spojina 21 (Ki 2 uM), ki selektivno nhibira tipa 2 in 5, ne pa tipov 1, 3 in 7. Spojina ima tudi zmerno estrogeno aktivnost (14, 21).
Ker tip 2 katalizira oksidacijo estrogenov in androgenov, je bila smiselna sinteza tudi takšnih laktonov, ki imajo C19-metilno skupino Hkrati so bile narejene tudi modifikacije A in B obroča steroidnega skeleta. Med vsemi C19 steroidnimi derivati je najboljši inhibitor spojina 22 (IC50 0,42 mM; 3-5 nM substrat), spojina 23 (IC50 0,7 mM; 3-5 nM substrat) pa se kot edina ni vezala na vse testirane receptorje (androgenske, estrogenske, progesteronske, glukokortikoidne) Spojina 23 tudi ni inhibitor 17(3-HSD tipov 1, 3 in 5 niti aromataze (14)
farm vestn 2005; 56 2
FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 264
Pregledni članki - Review Articles
25
28 (R=H)
29 (R=fenil)
OMe
R3      O
30 (R^OH, R2=R3=H)
31 (Ri=R2=R3=OH)
R4          R3
HO
HO
H        O
^A
RK    ^N
'rTN H O          R2             HO
39
X^ „N
R1-R7: različni alkilni substituenti X: O, H2
Slika 5: Inhibitorji 17P-HSD tipa 3 Figure 5: Inhibitors of 17P-HSD type 3
Nedavno so bili kot potencialni inhibitorji tipa 2 sintetizirani 4,5-disub-stituirani cis-pirolidinoni (24), analogi naravne spojine klavsenamid iz drevesa Clausena lansium (23). Spojine so trenutno v fazi testiranja
2.3   17B-HSD tip 3
Tip 3 je mikrosomalni encim, ki ga najdemo izključno v Leydigovih celicah testisov in je odgovoren za biosintezo testosterona. Encim zago-
tavlja 50 % aktivnih androgenov, ki delujejo v prostati in drugje po telesu (2). Ravno zaradi tega je izredno zanimiva tarča za zdravljenje vseh od androgenov odvisnih bolezni (24). Ker ga najdemo izključno v testisih, je zanimiv tudi z vidika blokade spermatogeneze, saj bi se inhibitorji lahko uporabljali kot moški kontraceptivi (14). Mutacije na genu za 17(3-HSD tip 3, ki onemogočijo pravilno delovanje encima, so odgovorne za nastanek psevdohermafroditizma (25-27).
4 farm vestn 2005; 56
FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 265
17fi-hidroksisteroid-dehidrogenaze - obetajoče farmakološke tarče
OH     O        CH

^tz-\J
/1      J			43			COOH
42		0			0,N	44
	O	II /=\	HOOC-	O	"H^O"	-N02
HOOC		w				
		46			45	
Slika 6: Inhibitorji 17J3-HSD tipa 5 Figure 6: Inhibitors of 17P-HSD type 5
Inhibitorji
Prve študije inhibicije so pokazale, daje za inhibicijo ključni steroidn skelet s karbonilno skupino na mestu 17 ter nearomatskim A-obročem. Izmed takrat 20 sintetiziranih spojin sta se kot najbolj aktivna izkazala 4-estren-3,17-dion (25) (Ki 2,4 uM) in 5-androsten-3,17-dion (26) (Ki 6,8 uM) (14) (slika 5).
Leta 1993 so Lombardo in sodelavci ugotovili, da je zelo dober inhibitor tipa 3 tudi atamestan (27), že prej znani ireverzibilni inhibitor aromataze (14). Kot potencialne inhibitorje so kasneje testirali nekatere zdravilne učinkovine. Pokazal se je inhibitorni učinek gentamicina ter S-petazina. Na padec serumske koncentracije testosterona vplivajo tudi spojine iz sladkega korena (14). Leta 2001 so Le Lain in sodelavci testirali 18 nesteroidnih spojin (p-benzokinoni, flavoni, izoflavoni, derivati trifeniletena). Najboljši inhibitorji človeškega 17P-HSD tipa 3 so bili 2,5-difenil-p-benzokinon (29), fenil-p-kinon (28), 7-hidroksiflavon (30), derivat trifeniletena (33), baikalein (31) ter biokanin A (33). Te spojine niso učinkoviti inhibitorji (IC50 območje od 3 do 10 uM, 2 uM substrat), vendar so rezultati, še posebej pomen OH skupin različnih flavonov, pripomogli k načrtovanju novih inhibitorjev (14).
Istega leta so Smith in ostali patentirali vrsto spojin (34, 35), ki so strukturno podobne biokaninu A. Najboljši inhibitorji so spojine s F, Cl ali Br na mestu R1 (IC50 od 1,8 do 8,3 uM; 2 uM substrat). Kasneje so patentirali še več spojin s splošnima formulama 36 in 37, ki inhibirajo 17P-HSD in naj bi se uporabljale za preventivo in/ali zdravljenje različnih bolezni, povezanih z androgeni in estrogeni (14).
Študija različnih steroidov je vodila k temu, da so Poirier in ostali leta 1995 izbrali androsteron kot osnovni skelet za razvoj inhibitorjev tipa 3. Za dobre inhibitorje 17P-HSD tipa 3 so se izkazali sintetiziran derivati s substituenti na mestu 3(5 (37), najboljše skupine na tem mestu pa fenilmetil, cikloheksil, propil in sec-butil (IC50 57-73 nM 0,05-0,1 uM substrat). Te spojine niso inhibirale tipov 1 in 5, imajo pa androgeno aktivnost.
Leta 2001 so Maltais in sodelavci skušali poiskati spojine, ki ne bi imele androgene aktivnosti. Naredili so serijo spojin z osnovnim skeletom 38, najboljši inhibitor (n=2, Rx=fenilmetil, Ry=heksil) z IC50 227 nM pri koncentraciji 0,1 uM nima androgene aktivnosti.
sta skupina je kasneje sintetizirala tudi različne derivate 3(5-amidometil-androsterona (39), ki so še boljši inhibitorji (IC50 35-85 nM; 0,05 uM substrat). Najboljši inhibitor (X=0, R1=oktil, R2=ciklo-propil) ne kaže nobene androgene aktivnosti pri koncentracijah 0,1 MM in 1 mM (14).
Da bi pripravili bolj rigidne molekule, so naredili še vrsto derivatov spojine 41. Najboljši inhibitor (X=0, R^morfolino, R2=ciklopentiletil; IC50 74 nM; 0,05 mM substrat) ima zelo šibko androgeno aktivnost (14).
2.4   17R-HSD lip 4
17(5-HSD tip 4 je multifunkcionalni peroksisomalni encim. N-terminalni del ima 17P-HSD ter 3-hidroksiacil-CoA dehidrogenazno aktivnost in katalizira oksidacije estradiola, 5-androsten-3p,17p-diola ter 3-hidroksiacil-CoA. Centralni del encima ima enoil-CoA hidratazno aktivnost, C-terminalni del proteina pa sodeluje pri prenosu 7-dehidroholesterola in fosfatidilholina med membranami. Encim najdemo v vseh sesalskih tkivih, a je v nekaterih tkivih, kot so možgani, maternica ter pljuča, izražen samo v specifičnih celicah, kot so Purkynjeve celice ali luminalni epitelij (28). Njegova naloga je podobna nalogi 17P-HSD tipa 2 - ščiti tkiva pred preveliko količino aktivnih spolnih hormonov (2). Znano je, da so mutacije na genu za 17P-HSD tip 4 odgovorne za nastanek Zellwegerjevega sindroma (29). Nedavno so ugotovili, da se na 17P-HSD tip 4 veže vitamin K in zniža koncentracijo intracelularnega estradiola. Natančni mehanizem tega delovanja še ni znan (30). Študije inhibicije na tem encimu še niso bile narejene, znana pa je kristalna struktura (16).
2.5   17R-HSD lip 5
17P-HSD tip 5 ali aldo-keto reduktaza 1C3 (AKR1C3) je citosolni encim in pretvarja androstendion v testosteron, DHT v 5a-androstan-3a,17p-diol ter tudi estron v estradiol (31). Človeški encim deluje tudi kot 3a-HSD, 20a-HSD in dihidrodiol-dehidrogenaza, njegov substrat pa naj bi bil tudi prostaglandin D2 (32). Z uporabo protiteles so ga lokalizirali v prostati, jetrih, nadledvični žlezi, testisih, endometriju, jajčnikih, mlečnih žlezah ter v ženskem maščobnem tkivu (32). Izražanje gena za ta encim je povečano pri raku prostate (15, 32) ter
farm vestn 2005; 56 2
FV st 4 prelom 1/5/06 11:29 AM Page 266
Pregledni članki - Review Articles
Slika 7: Inhibitorji 17fi-HSD tipa 7 Figure 7: Inhibitors of 17J3-HSD type 7
v podkožnem (subkutanem) maščobnem tkivu pri ženskah s povečanim indeksom telesne mase (33). Takšne ženske imajo posledično povečano koncentracijo androgenov v krvi, hiperandro-genemija pa je tipični znak sindroma policističnih jajčnikov (33). Znana je kristalna struktura encima (16).
Inhibitorji
Kot prvi inhibitorji tipa 5 so bili patentirani spirolaktoni s splošno formulo 42 (slika 6). Te spojine tudi ne inhibirajo tipov 1, 2 in 3 ter 3oc-HSD tipa 1 in 3 (IC50 od 2 do 54 nM, 100 nM substrat) (14). Encim nhibirajo tudi nekateri fitoestrogeni in ostale naravne substance. Najboljši inhibitorji 17(3-HSD tipa 5 so zearalenon (43), kumestrol (9). kvercetinter biokanin A (33) (IC50 območje od 4 do 14 uM; 30 nM substrat) (34).
Kasneje so odkrili, da encim dobro inhibira nesteroidna protivnetna učinkovina mefenaminska kislina, zato so sintetizirali vrsto spojin na osnovi N-fenilantranilne kisline (44). Dva dobra inhibitorja, ki ne inhibi-rataAKFMCI, AKR1C2 ter ciklooksigenazi (COX) 1 in 2, sta spojini 45 in 46 s Ki vrednostmi 0,38 oziroma 1,9 uM (31).
2.6   17B-HSD tip 7
Tip 7 je membranski encim in reducira estron v estradiol, v manjši količini tudi inaktivira DHT v 5oc-androstan-3(3,17(3-diol. Našli so ga v maternici, testisih, placenti, mlečnih žlezah, ledvicah, priželjcu in prostati (15, 35). Natančnejši pomen tega encima še ni znan, glede na njegovo razširjenost v različnih tkivih pa verjetno deluje kot intrakrini regulator steroidnega metabolizma in povečuje koncentracijo estrogenov v okolici. Pomen estradiola za razvoj od estrogenov odvisnega raka dojke, jajčnikov ter maternice je dobro znan, zato je smiselna tudi sinteza inhibitorjev encima 17(3-HSD tip 7, ki bi v teh tkivih znižali koncentracijo estradiola.
Inhibitorji
Pri prvem rešetanju spojin sta se kot najboljša inhibitorja tipa 7 izkazala estra-1,3,5-trien-3-ol-17-spiro-5-lakton (47), inhibitor 17|3-HSD tipa 5, ter 17(3-(N-pentilformamido)-4-metil-4-aza-5a-androstan-3-on (48). dober inhibitor 5oc-reduktaze (slika 7). Da bi izboljšali njune inhibitorne lastnosti, so naredili različne derivate spojin (35). Spojina (49), ki strukturno vsebuje dela obeh prejšnjih inhibitorjev, 4-aza jedro ter 17-spiro-5-lakton, je pokazala zelo dobre inhibitorne lastnosti, prav tako
tudi nekateri analogi spojine 48, kot je spojina 50 z IC50 vrednostim okoli 0,05 mM (0,15 mM substrat) (35).
2.7   17B-HSD tip 8
Tip 8 je mitohondrijski in prednostno oksidativni encim. Inaktivira predvsem estradiol, pa tudi testosteron in dihidrotestosteron. Ima še manjšo reduktivno sposobnost in reducira estron v estradiol, našli pa so ga v jetrih, spolnih žlezah, ledvicah in vranici. V ledvicah je veliko število različnih hidroksisteroid-dehidrogenaz, ki inaktivirajo glukokor-tikoide ter spolne hormone, z nizkim izražanjem gena za 17(3-HSD tip 8 pa povezujejo nastanek policističnih ledvic (36, 37).
2.8   17B-HSD tip 10
Tudi tip 10 je mitohondrijski encim. Odgovoren je za oksidacijo estradiola, DHT ter L-3-hidroksiacil-koencima A. Encim najdemo v številnih tkivih, vključno z možgani (38). V možganih pacientov z Alzheimerjevo boleznijo so ugotovili visoko koncentracijo 17(3-HSD tipov 10 (38). Tam encim interagira z amiloid (3-peptidom, kar vodi do motenj v delovanju mitohondrijev in smrti živčnih celic (39). Encim dodatno kata-lizira nastanek toksičnih aldehidov v nevronih, z oksidacijo estradiola pa zmanjšuje koncentracijo zaščitnih estrogenov. Klinične študije so namreč pokazale, da nadomestna terapija z estrogeni zadrži ali prepreči nastanek Alzheimerjeve bolezni (38). Zaradi teh lastnost je encim izredno zanimiv z vidika zdravljenja Alzheimerjeve bolezni
Nedavno so ugotovili, da encim v možganih katalizira tudi oksidacijo naravnih pozitivnih alosteričnih modulatorjev GABAA receptorja, kot sta alopregnanolon ter alotetrahidrodeoksikortikosteron (40). Takšn modulatorji pospešijo vezavo GABA na GABAA receptor in imajo zaradi tega antikonvulzivni ter anksiolitični učinek.
Inhibitorji
Študije različnih inhibitorjev na tem encimu še niso bile narejene znana pa je kristalna struktura encima z vezanim inhibitorjem AG18051 (57) (slika 8). Ta inhibitor se veže v aktivno mesto encima ter se kovalentno poveže s koencimom NAD+ (39). IC50 vrednost za racemno zmes tega inhibitorja je 92 nM (40 mM substrat)
2.8   17B-HSDtip 11, 12 in 13
Zadnji trije tipi so bili odkriti po letu 2000. Tip 11 je oksidativni encim ki prednostno pretvarja 5oc-androstan-3oc,17(3-diol v androsteron, v
6 farm vestn 2005; 56
relom 1/5/06 11:29 AM Page 267
17fi-hidroksisteroid-dehidrogenaze - obetajoče farmakološke tarče
OQuO
Slika 8: Inhibitor 17p-HSD tipa 10 Figure 8: Inhibitor of 17/3-HSD type 10
manjši meri tudi estradiol v estron (41). Verjetno je odgovoren za intrakrino kontrolo sinteze androgenov, saj so ga našli v različnih tkivih: pljučih, trebušni slinavki, ledvicah, jetrih, srcu, nadledvični žlezi jajčnikih, testisih, endometriju, možganih ... (12, 42). Pravilno delovanje encima naj bi bilo ključno za normalen razvoj ploda (43). Znana je kristalna struktura človeškega 17P-HSD tipa 11 (16).
Tip 12 je bil odkrit na osnovi podobnosti aminokislinskega zaporedja z zaporedji znanih 17P-HSD. Najdemo ga v številnih tkivih, največ pa v jetrih, mišicah in ledvicah (12). Sodeluje pri sintezi maščobnih kislin ter redukciji ketoacil-CoA (12, 44), njegove vloge pri metabolizmu steroidov pa še niso proučevali.
V  tem letu so identificirali še 17P-HSD tip 13, ki ga najdemo predvsem v ledvicah ter v očesni mrežnici. Encim oksidira estradiol, z 10-krat nižjo aktivnostjo pa tudi testosteron. Glede na to, da je mesto za vezavo substrata v encimu zelo veliko, verjetno oksidira tudi druge, večje nesteroidne substrate. Znana je kristalna struktura encima (45).
3  SKLEP
V zadnjih nekaj letih so bile odkrite številne izooblike 17P-HSD ter njihov pomen za razvoj različnih od androgenov in estrogenov odvisnih bolezni. Inhibitorji posameznih izooblik 17P-HSD bi se tako lahko uporabljali kot moški kontraceptivi, anksiolitiki ali antikonvulzivi, z njimi bi lahko zdravili plešavost, prekomerno poraščenost, aknavost, osteoporozo, raka na prostati, raka dojke, sindrom policističnih jajčnikov ali preprečili nastanek Alzheimerjeve bolezni. Zaradi navedenega so 17P-HSD zelo zanimive farmakološke tarče.
4    LITERATURA
1.     Norman AW, LitwackG. In: Hormones. 2 ed. New York: Academic Press 1997; 49-86.
2.     Labrie F, Luu-The V, Lin SX et al. Intracrinology: role of the family of 17f3-hydroxysteroid dehydrogeneses in human physiology and disease. J Mol Endocrinol 2000; 25: 1-16.
3.     Suzuki T, Moriya T, Ishida T et al. Intracrine mechanism of estrogen synthesis in breast cancer. Biomed Pharmacother 2003; 57: 460-462.
4.     Biswas MG, Russell DW. Expression, cloning and characterization of oxidative 17f3- and 3a-hydroxysteroid dehydrogenases from rat and human prostate. J Biol Chem 1997; 272: 15959-15966.
5.     Labrie F. Intracrinology. Mol Cell Endocrinol 1991; 78: C113-C118.
6.     Geisler J. Breast cancer tissue estrogens and their manipulation with aro-matase inhibitors and inactivators. J Steroid Biochem Mol Biol. 2003; 3-5: 245-253.
7.     Penning TM. Beyond steroid hormone receptors - aldo-keto reductases as targets for selective intracrine modulators. Pharmacology News (University of Pennsylvania school of medicine) 2001; 9: 1-6.
8.     Nobel S, Abrahmsen L, Oppermann U. Metabolic conversion as a pre-receptor control mechanism for lipophilic hormones. Eur J Biochem 2001 268: 4113-4125.
9.     Pasqualini JR. The selective estrogen enzyme modulators in breast cancer: a review. Biochim Biophys Acta 2004; 1654: 123-143.
10.   Anzyme nomenclature: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb
11.   Penning TM: Molecular endocrynology of hydroxysteroid dehydrogenases Endocrine Reviews 1997; 18: 281-305.
12.   Mindnich R, Moller G, Adamski J. The role of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenases. Mol Cell Endocrinol 2004; 218: 7-20.
13.   Talalay P, Williams-Ashman HG. Activation of hydrogen transfer between pyridine nucleotides by steroid hormones. Proc Natl Acad Sci US 1958; 44 15-26.
14.   Poirier D. Inhibitors of 17f3-hydroxysteroid dehydrogenases. Curr Med Chem 2003; 10: 453-477.
15.   Vihko P, Harkonen P, Soronen P et al. 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenases - their role in pathophysiology. Mol Cell Endocrinol. 2004; 215: 83-88.
16.   Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, Protein data bank (http://www.rcsb.org/pdb)
17.   Makela S, Poutanen M, Lehtimaki J et al. Estrogen-specific 17 beta-hydroxysteroid oxidoreductase type 1 (E.C. 1.1.1.62) as a possible target for the action of phytoestrogens. Proc Soc Exp Biol Med 1995; 208 :51-59.
18.   Hoffren AM, Murray CM, Hoffmann RD. Structure-based focusing using pharmacophores derived from the active site of 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase. Curr Pharm Des 2001; 7: 547-566.
19.   Brown WM, Metzger LE, Barlow JP et al. 17-beta-Hydroxysteroid dehydrogenase type 1: computational design of active site inhibitors targeted to the Rossmann fold. Chem Biol Interact 2003; 143-144: 481-491.
20.   Messinger J, Hirvela L, Husen B et al. New 17beta-HSD1 inhibitors - setting up a new program line. Workshop on 11beta- and ^beta-hydroxysteroid dehydrogenases: role in human disease, Abstract book, Elmau Castle, Germany, May 8-11, 2005; 37.
21.   Bydal P, Auger S, Poirier D. Inhibition of type 2 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase by estradiol derivatives bearing a lactone on the D-ring structure-activity relationships. Steroids 2004; 69: 325-342.
22.   Oduwole OO, Makinen MJ, Isomaa VV et al. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2: independent prognostic significance and evidence of estrogen protection in female patients with colon cancer. J Steroid Biochem Mol Biol 2003; 87: 133-140.
23.   Cook JH, Barzya J, Brennan C et al. 4,5-Disubstituted cis-pyrrolidinones as nhibitors of 17f3-hydroxysteroid dehydrogenase II. Part 1: Synthetic approach. Tetrahedron Letters 2005; 46: 1525-1528.
24.   Edwards P. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase inhibitors; thrombin receptor (PAR-1) antagonists. Drug Discovery Today 2002, 7: 785-835.
25.   Andersson S. 17f3-hydroxysterpid dehydrogenase: isozymes and mutations. J Endocrinol 1995; 146: 197-200.
26.   Goebelsmann U, Horton R, Mestman JH et al. Male pseudohermaphroditism due to testicular 17f3-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency. J Clin Endocrinol Metab 1972; 36: 865-878.
27.   Geissler WM, Davis DL, Wu L et al. Male pseudohermaphroditism caused by mutations of testicular 17f3-hydroxysteroid dehydrogenase 3. Nature Genetics 1994; 7: 34-39.
28.   Moller G, Leenders F, van Grunsven EG et al. Characterization of the HSD17B4 gene: D-specific multifunctional protein 2/17beta-hydroxysteroid dehydrogenase IV. J Steroid Biochem Mol Biol 1999; 69: 441-446.
farm vestn 2005; 56 2
relom 1/5/06 11:29 AM Page 268
Pregledni članki - Review Articles
29.   de Launoit Y, Adamski J. Unique multifunctional HSD17B4 gene product: 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase 4 and D-3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase/hydratase involved in Zellweger syndrome. J Mol Endocrinol 1999; 22: 227-240.
30.   OtsukaM, Kato N, IchimuraTetal. Vitamin K2 binds 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase 4 and modulates estrogen metabolism. Life Sci 2005; 76: 2473-2482.
31.   Bauman DR, Rudnick SI, Szewczuk LM et al. Development of nonsteroidal anti-inflaumatory drug analogs and steroid carboxylates selective for human aldo-keto reductase isoforms: potential antineoplastic agents that work independently of cyclooxygenase isozymes. Mol Pharmacol 2005; 67: 60-68.
32.   Soronen P, Laiti M, Torn S et al. Sex steroid hormone metabolism and prostate cancer. J Steroid Biochem Mol Biol. 2004; 92: 281-286.
33.   Quinkler M, Sinha B, Tomlinson JW et al. Androgen generation in adipose tissue in women with simple obesity—a site-specific role for 17beta-hydrox-ysteroid dehydrogenase type 5. J Endocrinol 2004; 183: 331-342.
34.   Krazeisen A, Breitling R, Moller G et al. Phytoestrogens inhibit human 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 5. Mol Cell Endocrinol 2001 171: 151-162.
35.   Bellavance E, Luu-The V, Poirier D. First inhibitors of the steroidogenic enzyme type 7 17P-hydroxysteroid dehydrogenase. Letters in Drug Design & Discovery 2004; 1: 194-197.
36.   Fomitcheva J, Baker ME, Anderson E et al. Characterization of Ke6, a new 17P-hydroxysteroid dehydrogenase, and its expression in gonadal tissues J Biol Chem 1998; 273: 22664-22671.
37.   Peltoketo H, Luu-The V, Simard J et al. 17P-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD)/17-ketosteroid reductase (KSR) family; nomenclature and main characteristics of the 17HSD/KSR enzymes. J Mol Endocrinol 1999; 23: 1-11
38.   He XZ, Merz G, Mehta P et al. Human brain short-chain L-3-hydroxyacyl coenzyme A dehydrogenase is a single domain multifunctional enzyme. J Biol Chem 1999; 274: 15014-15019.
39.   Kissinger CR, Rejto PA, Pelletier LA et al. Crystal structure of human ABAD/HSD10 with a bound inhibitor: implications for design of Alzheimer's disease therapeutics. J Mol Biol 2004; 342: 943-952.
40.   He XY, Wegiel J, Yang YZ et al. Type 10 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase catalyzing the oxidation of steroid modulators of gamma-aminobutyric acid type A receptors. Mol Cell Endocrinol 2005; 229: 111-117
41.   Adamski J, Jakob FJ. A guide to 17P-hydroxysteroid dehydrogenases. Mol Cell Endocrinol 2001; 171: 1-4.
42.   Chai Z, Brereton P, Suzuki T et al. 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type XI localizes to human steroidogenic cells. Endocrinology 2003; 144: 2084-2091.
43.   Brereton P, Suzuki T, Sasano H et al. Panlb (17betaHSD11)-enzymatic activity and distribution in the lung. Mol Cell Endocrinol 2001; 171: 111-117.
44.   Moon Y-A, Horton JD. Identification of two mamalian reductases involved in the two-carbon fatty acyl elongation cascade. J Biol Chem 2003; 278: 7335-7343.
45.   Lukacik P. Structural genomics of SDR-type human 17beta-hydroxysteroid deydrogenase. Workshop on 11beta- and 17beta-hydroxysteroid dehydrogenases: role in human disease, Abstract book, Elmau Castle, Germany. May 8-11, 2005; 13.
8 farm vestn 2005; 56