UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA ODDELEK ZA BIOLOGIJO Aleš KLADNIK CITOLOŠKA ANALIZA RAZVOJA ENDOSPERMA IN KORENINSKE ČEPICE KORUZE (Zea mays L.) DOKTORSKA DISERTACIJA CYTOLOGICAL ANALYSIS OF MAIZE (Zea mays L.) ENDOSPERM AND ROOT CAP DEVELOPMENT DOCTORAL DISSERTATION Ljubljana, 2003 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). II Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Doktorska disertacija je zaključek podiplomskega študija biologije. Delo je bilo opravljeno na organizacijah: - Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani - Department of Plant Pathology, University of Florida, Gainesville, USA Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in sklepu Komisije za podiplomski študij Univerze z dne 21. 5. 2002 (po pooblastilu Senata Univerze v Ljubljani) je bila sprejeta tema doktorske disertacije in za mentorico imenovana prof. dr. Marina Dermastia. Komisija za oceno in zagovor: Predsednica: prof. dr. Maja KOVAČ Nacionalni inštitut za biologijo, Oddelek za rastlinsko fiziologijo in biotehnologijo Članica: prof. dr. sc. Marijana KRSNIK-RASOL Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet, Biološki odsjek, Zavod za molekularnu biologiju Članica: prof. dr. Marina DERMASTIA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo Datum zagovora: 17. december 2003 Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela. Aleš Kladnik Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). III Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ŠD Dd DK 577.2:581.19:582.542(043.3)=863 KG slikovna citometrija/endoreduplikacija/endopoliploidnost/miniature-1/invertaza/ saharoza sintaza/prostornina celic/3-D model AV KLADNIK, Aleš, univ. dipl. biolog SA DERMASTIA, Marina (mentor) KZ SI-1000 Ljubljana, Večna pot 111 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo LI 2003 IN CITOLOŠKA ANALIZA RAZVOJA ENDOSPERMA IN KORENINSKE ČEPICE KORUZE (Zea mays L.) TD Doktorska disertacija OP XVIII, 196 s., 3 pregl., 79 sl., 1 pril., 148 vir. IJ sl JI sl/en AI V endospermu koruze smo s slikovno citometrijo ocenili prostorsko razporeditev velikosti celic in njihove stopnje endopoliploidnosti. Razvili smo 3-D model, ki nam je omogočil oceno celotne strukture endosperma na podlagi mediane vzdolžne rezine. S pomočjo modela smo primerjali razvoj endosperma divjega tipa in mutante mn1, ki je brez invertaze iz celične stene v prenosnih celicah na bazi endosperma. Ugotovili smo, da je majhnost endosperma mn1 posledica zmanjšane rasti/ekspanzije celic v osrednjem delu in posledično verjetno manjše mitotske aktivnosti v obrobnem delu endosperma. Proces endoreduplikacije v endospermu mn1 ni bil prizadet, v obeh genotipih smo opazili jedra z vsebnostjo DNA od 3 C do 192 C, vendar sta bili velikost in število celic z največjimi vrednostmi C v mn1 manjša kot v Mn1. Razpoka, ki se pojavi med endospermom mn1 in materinskim tkivom placento-halazne plasti (PHP), je bila posledica odmika premajhnega endosperma mn1 od normalno razvitega materinskega tkiva. V PHP se je od 4. do 20. dneva po oprašitvi razvilo 20 do 25 plasti celic, ki so programirano odmirale v obeh genotipih. V PHP smo opazili tudi nalaganje fenolnih spojin. V plasteh celic bližje endospermu smo opazili hidroksicimetne kisline, v nižjih plasteh, bližje žilam v pedicelu, pa so bili flavonoidi. Predpostavljamo, da so fenolne spojine vključene v razvoj abscizijske plasti. V koreninski čepici smo z imunolokalizacijo pregledali nalaganje izocima saharoza sintaze SUS1. Večjo količino SUS1 smo opazili v zunanjih, endopoliploidnih celicah čepice, katerih jedra so vsebovala 16 C in več DNA. Prostornina celic se je večala s stopnjo endopoliploidnosti. Predvidevamo, da endoreduplikacija omogoča večje nalaganje SUS1 v celicah čepice, SUS1 pa bi bila lahko vključena v sintezo polisaharidov sluzi. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). IV Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 KEY WORDS DOCUMENTATION DN Dd DC 577.2:581.19:582.542(043.3)=863 CX image cytometry/endoreduplication/endopolyploidy/miniature-1/invertase/sucrose synthase/cell volume/3-D model AU KLADNIK, Aleš AA DERMASTIA, Marina (supervisor) PP SI-1000 Ljubljana, Večna pot 111 PB University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology PY 2003 TI CYTOLOGICAL ANALYSIS OF MAIZE (Zea mays L.) ENDOSPERM AND ROOT CAP DEVELOPMENT DT Doctoral dissertation NO XVIII, 196 p., 3 tab., 79 fig., 1 ann., 148 ref. LA sl AL sl/en AB Spatial distribution of cell size and level of endopolyploidy of cells were analysed in maize endosperm using image cytometry. We developed a 3-D model that allowed us to estimate the composition of the whole endosperm on the basis of a median longitudinal section. Using the model, we compared the endosperm development in wild-type and mn1 mutant, lacking cell-wall invertase in basal endosperm transfer cells. Smallness of the mn1 endosperm was a consequence of reduced cell growth/expansion in the central part and impaired cell division in the peripheral part of the endosperm. The endoreduplication process was not affected in mn1, both genotypes contained 3 C to 192 C nuclei. However, both volume and number of cells with highest C values were lower in mn1 as compared to Mn1. The gap, forming between mn1 endosperm and maternal tissue of placento-chalazal layer (PC layer), was a result of the detachment of the small mn1 endosperm from the normally developed maternal tissue. 20 to 25 layers of dead cells developed in the PC layer in both genotypes during 4 to 20 days after polinnation in the process of programmed cell death. In addition, we observed accumulation of phenolic compounds in the PC layer. Hydroxycinnamic acids were located in the layers of maternal cells near the endosperm, whereas in the lower layers in the pedicel we found massive deposition of flavonoids. We suggest that phenolic substances might be involved in the development of the abscission layer. In addition, we found increased amounts of sucrose synthase isozyme SUS1 in the outer cells of the maize root cap. The SUS1 positive cells overlapped significantly with cells of increased endopolyploidy levels. We suggest that SUS1 accumulation is enhanced by endreduplication and that SUS1 may have a role in mucilage synthesis. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). V Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 KAZALO VSEBINE Ključna dokumentacijska informacija .............................................................................. III Key words documentation ............................................................................................... IV Kazalo vsebine ................................................................................................................. V Kazalo preglednic ............................................................................................................. X Kazalo slik ....................................................................................................................... XI Kazalo prilog ................................................................................................................ XVI Okrajšave .................................................................................................................... XVII Slovarček ................................................................................................................... XVIII 1 UVOD ...................................................................................................................... 1 2 PREGLED OBJAV ................................................................................................ 2 2.1 KORUZA (Zea mays L.) ........................................................................................ 2 2.2 KARIOPSA KORUZE ........................................................................................... 3 2.2.1 Semenska zasnova .............................................................................................. 4 2.2.2 Dvojna oploditev ................................................................................................ 5 2.2.3 Razvoj endosperma ............................................................................................ 5 2.2.4 Prenosne celice ................................................................................................... 7 2.2.5 Placento-halazna plast ....................................................................................... 7 2.2.6 Mutanta mn1 ...................................................................................................... 8 2.3 KALITEV KARIOPSE .......................................................................................... 9 2.3.1 Koreninska čepica .............................................................................................. 9 2.4 RAST IN RAZVOJ ORGANOV .......................................................................... 11 2.4.1 Celični cikel in vrednost C ............................................................................... 12 2.4.2 Endoreduplikacija ............................................................................................ 12 2.4.3 Programirana celična smrt v razvoju rastlin .................................................. 13 2.5 VLOGA SLADKORJEV V RAZVOJU RASTLIN .............................................. 15 2.5.1 Invertaza ........................................................................................................... 15 2.5.2 Saharoza sintaza ............................................................................................... 16 2.6 NAMEN DELA ................................................................................................... 18 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). VI Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3 MATERIAL IN METODE ................................................................................... 19 3.1 RASTLINSKI MATERIAL ................................................................................. 19 3.1.1 Opis rastlin ....................................................................................................... 19 3.1.2 Vzgoja rastlin do zrelosti ................................................................................. 19 3.1.3 Vzgoja kalic ...................................................................................................... 21 3.2 PRIPRAVA PREPARATOV ............................................................................... 22 3.2.1 Fiksacija rastlinskega materiala ...................................................................... 22 3.2.1.1 Formalin – ocetna kislina – etanol (FAA) ......................................................... 22 3.2.1.2 Fiksiranje kariops ............................................................................................ 22 3.2.1.3 Fiksiranje kalic ................................................................................................ 23 3.2.2 Priprava rezin .................................................................................................. 23 3.2.2.1 Dehidracija vzorcev ......................................................................................... 23 3.2.2.2 Vklapljanje v parafin ....................................................................................... 24 3.2.2.3 Rezanje na mikrotomu ..................................................................................... 24 3.3 HISTOKEMIČNE REAKCIJE ............................................................................. 25 3.3.1 Kvantitativno barvanje DNA po Feulgenu ..................................................... 25 3.3.2 Barvanje DNA z DAPI ..................................................................................... 26 3.3.3 Barvanje fragmentirane DNA z reakcijo TUNEL .......................................... 27 3.3.4 Barvanje kondenziranega kromatina s kristal vijoličnim .............................. 28 3.3.5 Barvanje kutina in suberina s Sudan IV ......................................................... 29 3.3.6 Barvanje lignina s floroglucinolom .................................................................. 29 3.3.7 Barvanje kaloze z anilin modro – fluorescenčno metodo ............................... 29 3.3.8 Barvanje flavonoidov z Naturstoffreagenz A .................................................. 30 3.4 IMUNOHISTOKEMIČNE REAKCIJE ................................................................ 31 3.4.1 Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 ......................................... 31 3.5 MIKROSKOPIJA ................................................................................................ 33 3.6 KVANTITATIVNA ANALIZA SLIKE ............................................................... 34 3.6.1 Denzitometrična meritev količine DNA .......................................................... 34 3.6.1.1 Umeritev sistema in odprava napak na zajeti sliki ............................................ 36 3.6.1.2 Merjenje stabilnosti osvetlitve .......................................................................... 38 3.6.1.3 Merjenje relativne količine DNA v tkivnih rezinah .......................................... 40 3.6.2 Kvantitativno ovrednotenje imunolokalizacijskega barvanja ........................ 42 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). VII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.6.2.1 Prikaz imunolokalizacijskega barvanja s psevdo barvami ................................. 42 3.6.2.2 Kvantitativno ovrednotenje imunolokalizacijskega barvanja v posameznih celicah v čepici ................................................................................................ 42 3.6.2.3 Povezava imunolokalizacijskega signala s ploidnostjo celic ............................. 44 3.6.3 Meritev velikosti ............................................................................................... 44 3.6.3.1 Meritev velikosti celic ...................................................................................... 44 3.6.3.2 Meritev velikosti koreninskih vršičkov ............................................................ 45 3.6.4 Obdelava podatkov .......................................................................................... 46 3.6.4.1 Odstranjevanje dvojnikov ................................................................................ 46 3.6.4.2 Povezava podatkov za ploidnost in velikost celic ............................................. 47 3.6.4.3 Ocena tridimenzionalne porazdelitve celic v koreninski čepici ......................... 47 3.6.4.4 Ocena tridimenzionalne porazdelitve celic v endospermu ................................ 50 3.6.4.4.1 3-D model endosperma .................................................................................. 52 3.6.4.4.2 3-D model endosperma mlajših razvojnih stopenj (4–8 DPO) ........................ 53 3.6.4.4.3 3-D model endosperma starejših razvojnih stopenj (10–16 DPO) .................. 54 3.6.4.5 Statistična obdelava podatkov .......................................................................... 56 4 REZULTATI ........................................................................................................ 57 4.1 VIZUALIZACIJA CELIČNIH PROCESOV V KARIOPSI .................................. 57 4.1.1 Razporeditev jeder v kariopsi .......................................................................... 57 4.1.2 Citološka analiza materinskega tkiva .............................................................. 66 4.1.2.1 Nucel ............................................................................................................... 66 4.1.2.1.1 Število jeder posameznih razredov ploidnosti v vzdolžnih rezinah kariopse ......................................................................................................... 66 4.1.2.1.2 Fragmentacija DNA v jedrih nucela .............................................................. 72 4.1.2.2 Perikarp ........................................................................................................... 74 4.1.2.2.1 Število jeder posameznih razredov ploidnosti v vzdolžnih rezinah kariopse ......................................................................................................... 74 4.1.2.3 Placento-halazna plast ...................................................................................... 80 4.1.2.3.1 Stopnja endopoliploidnosti jeder .................................................................... 80 4.1.2.3.2 Izguba jeder in morfologija celic v placento-halazni plasti ............................ 80 4.1.2.3.3 Fragmentacija DNA v jedrih placento-halazne plasti ..................................... 87 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). VIII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.2.3.4 Nalaganje sekundarnih spojin v celične stene ................................................ 89 4.1.3 Citološka analiza filialnega tkiva ..................................................................... 94 4.1.3.1 Embrio ............................................................................................................. 94 4.1.3.1.1 Število jeder posameznih razredov ploidnosti v vzdolžnih rezinah kariopse ......................................................................................................... 94 4.1.3.2 Endosperm ..................................................................................................... 100 4.1.3.2.1 Število jeder posameznih razredov ploidnosti v vzdolžnih rezinah kariopse ....................................................................................................... 100 4.1.3.2.2 Število in prostornina celic v celotnem endospermu (ocena s 3-D modelom) ..................................................................................................... 108 4.1.3.2.3 Število in prostornina celic v celotnem endospermu (ocena s 3-D modelom) glede na stopnjo endopoliploidnosti ............................................ 114 4.1.3.2.4 Fragmentacija DNA v jedrih endosperma ob embriu ................................... 127 4.2 VIZUALIZACIJA CELIČNIH PROCESOV V KORENINSKI ČEPICI ............. 128 4.2.1 Kalitev in rast kalic ........................................................................................ 128 4.2.1.1 Morfološki parametri koreninskih vršičkov .................................................... 130 4.2.2 Število celic v koreninski čepici in prostornina čepice .................................. 132 4.2.3 Endopoliploidnost celic v koreninski čepici .................................................. 133 4.2.4 Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 ....................................... 140 4.2.5 Kvantifikacija imunolokalizacijskega barvanja ........................................... 145 4.2.6 Povezava imunolokalizacijskega signala za SUS1 s stopnjo endopoliploidnosti celic .................................................................................. 148 5 RAZPRAVA IN SKLEPI ................................................................................... 149 5.1 RAZPRAVA ...................................................................................................... 149 5.1.1 Metode ............................................................................................................ 149 5.1.2 Zakaj je endosperm mn1 majhen? ................................................................ 152 5.1.2.1 Razvoj materinskega tkiva ............................................................................. 152 5.1.2.2 Razvoj embria ................................................................................................ 154 5.1.2.3 Razvoj endosperma ........................................................................................ 155 5.1.3 Nastanek razpoke med endospermom in materinskim tkivom v kariopsi mn1 ................................................................................................................. 164 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). IX Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5.1.4 Poseben transportni sistem v placento-halazni plasti in nastanek abscizijske plasti ............................................................................................. 166 5.1.5 Razvoj koreninske čepice ............................................................................... 172 5.1.5.1 Vpliv substrata na rast korenin ....................................................................... 172 5.1.5.2 Stopnja endopoliploidnosti celic v koreninski čepici ...................................... 174 5.1.5.3 Lokalizacija saharoza sintaze v koreninski čepici ........................................... 175 5.1.5.4 Povezava med endopoliploidnostjo in količino SUS1 proteina ter morebitna vloga saharoza sintaze v koreninski čepici ..................................... 176 5.2 SKLEPI .............................................................................................................. 178 6 POVZETEK ........................................................................................................ 180 7 SUMMARY ........................................................................................................ 183 8 VIRI .................................................................................................................... 186 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). X Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 KAZALO PREGLEDNIC Pregl. 4.1. Število celic, prostornina in površina endosperma Mn1 in mn1; podatki ocenjeni s 3-D modelom ................................................................................... 108 Pregl. 4.2. Dolžina in prirastek primarnih korenin po gojenju v različnih substratih. . ..... 129 Pregl. 5.1. Povprečna dolžina koreninske čepice in hitrost rasti primarne korenine.. ....... 173 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). XI Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 KAZALO SLIK Sl. 2.1. Struktura razvijajoče se kariopse koruze, vzdolžni prerez (Kiesselbach, 1949) ....................... ............................................................................................... 4 Sl. 2.2. Skica placento-halazne plasti v bazalnem delu kariopse, okrog 10 DPO.. ............... 8 Sl. 3.1. Vzgoja rastlin koruze v rastlinjaku in storž koruze z 1 : 1 deljenim potomstvom, 12 DPO.. ......................................................................................... 20 Sl. 3.2. Vlažna komora ..................................................................................................... 28 Sl. 3.3. Razmerje med izmerjeno sivo vrednostjo in resnično vrednostjo transmisije, ki jo predstavlja siva vrednost, ter optična gostota (OG), izračunana iz transmisije.. .......................................................................................................... 38 Sl. 3.4. Nihanje jakosti osvetlitve in neenakomerna osvetlitev vidnega polja (brez korekcije senčenja).. ............................................................................................. 39 Sl. 3.5. Siva vrednost in koeficient variacije pikslov v centru zaporedoma zajetih slik. ....39 Sl. 3.6. Vpliv logaritemske transformacije na frekvenčno porazdelitev IOG vrednosti ...... 40 Sl. 3.7. Premikanje po preparatu z izbiranjem jeder .......................................................... 41 Sl. 3.8. Pretvorba sivih vrednosti na sliki v psevdobarve. . ................................................ 42 Sl. 3.9. Kvantitativno ovrednotenje imunolokalizacijskega barvanja za saharoza sintazo SUS1.. ...................................................................................................... 43 Sl. 3.10. Merjeni parametri v koreninskem vršičku. . ........................................................ 46 Sl. 3.11. Prepoznavanje dvojnikov pri merjenju IOG in velikosti celic. . ........................... 47 Sl. 3.12. Celice koreninske čepice v vzdolžnem prerezu in ocena števila celic v prečnem prerezu.. ................................................................................................. 48 Sl. 3.13. Obrisi celic v koreninski čepici. . ........................................................................ 49 Sl. 3.14. Merjenje velikosti celic v endospermu in priprava slike za izračun 3-D modela endosperma.. ............................................................................................ 51 Sl. 3.15. Izdelava 3-D modela endosperma za razvojne stopnje od 4. do 8. DPO.. ............ 53 Sl. 3.16. Izdelava 3-D modela endosperma za razvojne stopnje od 10. do 16. DPO.. ........ 55 Sl. 4.1. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 4 DPO .......................................................................................................... 60 Sl. 4.2. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 6 DPO .......................................................................................................... 61 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). XII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Sl. 4.3. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 8 DPO .......................................................................................................... 62 Sl. 4.4. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 10 DPO ........................................................................................................ 63 Sl. 4.5. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 12 DPO ........................................................................................................ 64 Sl. 4.6. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 16 DPO ........................................................................................................ 65 Sl. 4.7. Število izmerjenih jeder v nucelu v vzdolžnih rezinah kariops koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1.. .................................................................................... 67 Sl. 4.8. Frekvenčna porazdelitev jeder v nucelu glede na relativno vsebnost DNA. . ......... 68 Sl. 4.9. Površina preseka jeder in stopnja endopoliploidnosti jeder v nucelu.. ................... 70 Sl. 4.10. Fragmentacija DNA v jedrih nucela. . ................................................................. 73 Sl. 4.11. Število izmerjenih jeder v perikarpu v vzdolžnih rezinah kariops koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1 .......................................................................... 75 Sl. 4.12. Frekvenčna porazdelitev jeder v perikarpu glede na relativno vsebnost DNA. . .................................................................................................................. 76 Sl. 4.13. Površina preseka jeder in stopnja endopoliploidnosti jeder v perikarpu. . ............ 78 Sl. 4.14. Večanje števila plasti celic v placento-halazni plasti, ki izgubijo jedra; 0–28 DPO.. ................................................................................................................... 81 Sl. 4.15. Štetje plasti celic v placento-halazni plasti, ki so izgubile jedra. . ........................ 85 Sl. 4.16. Število plasti celic brez jeder v placento-halazni plasti. . ..................................... 85 Sl. 4.17. Neoplojena semenska zasnova in razvijajoča se kariopsa (oplojena) iz istega storža, 12 DPO. . ................................................................................................... 86 Sl. 4.18. Kondenzirana jedra v placento-halazni plasti v kariopsi Mn1 (A) in mn1 (B), 10 DPO. . .............................................................................................................. 87 Sl. 4.19. Fragmentacija DNA v jedrih celic v placento-halazni plasti. . ............................. 88 Sl. 4.20. Vzdolžni rezini kariops divjega tipa (A) in mutante mn1 (B), 16 DPO, barvani s Sudan IV. . ............................................................................................. 89 Sl. 4.21. Vzdolžna rezina kariopse divjega tipa, 16 DPO, barvana s floroglucinolom v HCl. . .................................................................................................................... 89 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). XIII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Sl. 4.22. Vzdolžne rezine kariops divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 2–16 DPO, barvane z DAPI in anilin modrim v 0,15 M K2HPO4 (pH 8,2). . ............................ 91 Sl. 4.23. Fenolne snovi v placento-halazni plasti v kariopsah divjega tipa in mutante mn1, 6 DPO .......................................................................................................... 92 Sl. 4.24. Fenolne snovi v placento-halazni plasti v kariopsah divjega tipa in mutante mn1, 16 DPO ........................................................................................................ 93 Sl. 4.25. Število izmerjenih jeder v embriu v vzdolžnih rezinah kariops koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1 .......................................................................... 95 Sl. 4.26. Frekvenčna porazdelitev jeder v embriu glede na relativno vsebnost DNA.. ....... 96 Sl. 4.27. Površina preseka jeder in stopnja endopoliploidnosti jeder v embriu. . ................ 98 Sl. 4.28. Število izmerjenih jeder v endospermu v vzdolžnih rezinah kariops koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1 ...................... .................................................. 101 Sl. 4.29. Frekvenčna porazdelitev jeder v endospermu glede na relativno vsebnost DNA. . ............................................................................................................... 102 Sl. 4.30. Površina preseka jeder in relativna količina DNA v jedrih v endospermu. . ....... 104 Sl. 4.31. Premer jeder v endospermu glede na stopnjo endopoliploidnosti.. .................... 106 Sl. 4.32. Velikost celic v medianih vzdolžnih rezinah kariopse koruze. . ......................... 109 Sl. 4.33. Število celic in prostornina endosperma. . ......................................................... 110 Sl. 4.34. Število celic in prostornina, ki jo zavzemajo celice v endospermu divjega tipa Mn1 in mutante mn1 4 do 16 DPO.. ............................................................. 112 Sl. 4.35. Razmerje med številom celic v endospermu mutante mn1 in divjega tipa Mn1 v posameznih razredih velikosti celic. . ....................................................... 113 Sl. 4.36. Stopnja endopoliploidnosti celic v medianih vzdolžnih rezinah kariopse koruze. . ............................................................................................................. 115 Sl. 4.37. Sestava endosperma po vrednostih C 4 do 16 DPO. . ........................................ 116 Sl. 4.38. Število celic posameznih stopenj endopoliploidnosti v endospermu in prostornina, ki jo zavzemajo v endospermu 4 do 16 DPO. . ................................. 117 Sl. 4.39. Prostornina celic v endospermu glede na stopnjo endopoliploidnosti.. .............. 119 Sl. 4.40. Mediana prostornina celic v endospermu divjega tipa (črni simboli) in mutante mn1 (rdeči simboli) glede na stopnjo endopoliploidnosti 4 do 16 DPO.. ................................................................................................................. 121 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). XIV Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Sl. 4.41. Razmerje števila celic (A), prostornine endosperma (B) in medianih prostornin celic (C) v mn1 proti Mn1 endospermu, 4–16 DPO.. .......................... 121 Sl. 4.42. Število celic v endospermu glede na prostornino celic in stopnjo endopoliploidnosti.. ............................................................................................ 123 Sl. 4.43. Prostornina endosperma, ki jo zavzemajo celice v razredih glede na prostornino celic in stopnjo endopoliploidnosti.. ................................................. 125 Sl. 4.44. Fragmentacija DNA v jedrih celic endosperma ob embriu.. .............................. 127 Sl. 4.45. Dolžina primarne korenine kalic koruze.. ......................................................... 129 Sl. 4.46. Morfološki parametri, izmerjeni v medianih longitudinalnih rezinah vršičkov korenin, gojenih v različnih substratih. . ................................................ 131 Sl. 4.47. Razmerje med ocenjenim številom celic in prostornino koreninskih čepic.. ...... 132 Sl. 4.48. Stopnja endopoliploidnosti jeder v koreninski čepici.. ...................................... 134 Sl. 4.49. Relativna količina jedrne DNA v celicah čepic korenin, gojenih v različnih substratih.. .......................................................................................................... 135 Sl. 4.50. Mediani longitudinalni rezini čepic korenin, gojenih v vodi (A) in v prsti (B) ...................................................................................................................... 136 Sl. 4.51. Prostornina celic različnih stopenj endopoliplodnosti v koreninskih čepicah. ... 137 Sl. 4.52. Povprečna prostornina celic glede na stopnjo endopoliploidnosti. . ................... 138 Sl. 4.53. Frekvenčna porazdelitev celic v koreninski čepici glede na prostornino celic in stopnjo endopoliploidnosti ................... ........................................................... 139 Sl. 4.54. Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 v vršičkih primarnih korenin, gojenih v nesterilizirani prsti.. ............................................................... 141 Sl. 4.55. Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 v vršičkih primarnih korenin, gojenih v sterilizirani prsti. . .................................................................. 142 Sl. 4.56. Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 v vršičkih primarnih korenin, gojenih v nesterilizirani vodi.. ............................................................... 143 Sl. 4.57. Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 v vršičkih primarnih korenin, gojenih v sterilizirani vodi. . .................................................................. 144 Sl. 4.58. Razporeditev celic, ki vsebujejo malo ali veliko SUS1 antigena, v koreninski čepici. . .............................................................................................. 146 Sl. 4.59. Frekvenčna porazdelitev celic v koreninski čepici glede na prostornino celic in jakost imunolokalizacijskega signala za SUS1.. .............................................. 147 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). XV Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Sl. 4.60. Razmerje med stopnjo endopoliploidnosti in jakostjo imunolokalizacijskega signala za SUS1 v celicah koreninske čepice. . .................................................... 148 Sl. 5.1. Propadanje vsebine celic v placento-halazni plasti Mn1, 9 DPO (A–D) in zmanjšanje števila plazmodezem v celicah tik pod endospermom, 5 DPO (E) in 9 DPO (G).. .................................................................................................... 168 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). XVI Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 KAZALO PRILOG Priloga A: Vilhar B, Kladnik A, Blejec A, Chourey PS, Dermastia M. 2002. Cytometrical evidence that the loss of seed weight in the miniature1 seed mutant of maize is associated with reduced mitotic activity in the developing endosperm. Plant Physiology 129: 23-30. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). XVII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 OKRAJŠAVE DAPI ................. 4’,6’ diamino-2-phenylindole·2HCl DNA .................. deoksiribonukleinska kislina DPO .................. dnevi/dni/dan po oprašitvi IOG ................... integrirana optična gostota INCW2 .............. izocim invertaze iz celične stene, kodiran z genom Mn1 Mn1 ................... genotip rastline je divjega tipa mn1 ................... genotip rastline je miniature-1, semenska mutanta koruze brez izocima invertaze iz celične stene INCW2, ki se specifično izraža v bazalnem delu endosperma NST ................... Naturstoffreagenz A; difenilborova kislina-2-aminoetilester PCS ................... programirana celična smrt PHP ................... placento-halazna plast; plast materinskega tkiva med žilami v pedicelu in endospermom SUS1 ................. izocim saharoza sintaze, kodiran z genom Sus1 TBA .................. terciarni butilni alkohol TUNEL ............. terminal deoxynucleotidyl transferase mediated X-dUTP nick end labeling UV ..................... ultravijolična Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). XVIII Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 SLOVARČEK apikalno ............. v kariopsi označuje del, kjer je viden ostanek vratu plodnice; v koreninski čepici označuje skrajni vršiček čepice bazalno .............. v kariopsi označuje del, kjer je pedicel; v koreninski čepici označuje del, kjer je meristem (na meji med čepico in telesom korenine) bitna slika .......... računalniška slika, sestavljena iz točk denzitometrija.... kvantitativno merjenje koncentracije snovi na podlagi absorpcije svetlobe dorzalno ............. uporabljeno pri orientaciji v kariopsi – na nasprotni strani kot ventralno (v smeri pravokotno na os bazalno-apikalno) endosperm ......... triploidno tkivo v semenu, ki služi za prehrano embria embrio ............... zarodek nove rastline v semenu Feulgen .............. barvanje po; kvantitativno barvanje DNA s Schiffovim reagentom kariopsa ............. majhen suh enosemenski plod, v katerem seme ostane obdano s perikarpom pedicel ............... pecelj klaska, cveta, plodu ali lista perikarp ............. stena plodnice v razvitem plodu piksel ................. najmanjša enota računalniške bitne slike ventralno ............ uporabljeno pri orientaciji v kariopsi – na strani kariopse, kjer je embrio voksel ................ najmanjša enota tridimenzionalne računalniške bitne slike (volumski piksel) vrednost C ......... 1 C je količina DNA v nepodvojenem haploidnem genomu Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 1 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 1 UVOD Dandanes je koruza ena najpomembnejših prehranskih rastlin, za stare indijanske kulture pa je bila pomembna že pred tisočletji. Posvetili so ji celo nekaj božanstev, kar ni presenetljivo, saj so njena zrna dobesedno akumulatorji energije Sonca. Že takrat so želeli vzgojiti sorte, ki bi dajale velik pridelek. Iskanje novih načinov za povečanje pridelka prehranskih rastlin daje velik zagon raziskavam rasti in razvoja rastlin ter je veliko prispevalo k poznavanju procesov, ki oblikujejo končno obliko rastline. V koruzi se založne snovi shranjujejo v endospermu, po mnenju nekaterih raziskovalcev nenavadnem dvojčku embria. Kolikšen bo endosperm, je odvisno od natančno uravnanih procesov delitve celic in njihovega povečevanja. V rastlinah so celične delitve omejene na meristemska območja, nastale celice pa nato prispevajo k rasti organa s povečevanjem. V nekaterih skupinah rastlin, tudi pri koruzi, ima v procesu rasti in diferenciacije celic pomembno vlogo endoreduplikacija, večkratno podvajanje celotnega genoma znotraj istega jedra. Endopoliploidne celice imajo večjo prostornino kot celice z običajno, diploidno količino DNA v jedrih, imele pa naj bi tudi večjo metabolno aktivnost. O pravi vlogi endoreduplikacije je še vedno veliko vprašanj, saj se navidez naključno pojavlja v različnih taksonomskih skupinah rastlin. V razvoju organov pa ni pomembna le natančna regulacija delitve in rasti celic, temveč tudi nadzorovano, programirano odmiranje celic. Vsi našteti procesi imajo v razvoju organov pomembno vlogo, saj le kooordinirano nastajanje celic, njihova rast in odmiranje na točno določenih mestih vodi do delujočih tkiv. V regulaciji rasti in razvoja rastlin je še veliko neznank. Kljub temu pa nove mikroskopske tehnike v povezavi z analizo slike omogočajo kvantitativen opis razvoja organov in s tem globlji vpogled v delovanje celičnih in organizemskih sistemov. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 2 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2 PREGLED OBJAV 2.1 Koruza (Zea mays L.) Koruza je že dolgo povezana s človekom. Že stara indijanska ljudstva, Maji, Azteki in Inki, so jo čislali zaradi obilnega pridelka in lahke vzgoje. Zaradi velikega vpliva na njihovo življenje so ji posvetili kar nekaj božanstev (Weatherwax, 1954). Na območju zdajšnje Mehike so jo gojili že 5000 let pred našim štetjem (Heiser, 1990). V šestnajstem stoletju so jo v Evropo prinesli španski zavojevalci Amerike. Hitro se je razširila po južnih deželah Evrope, vendar dolgo ni bila priznana kot zdrava hrana, bila pa je botanična zanimivost. Večji pomen je imela za evropske priseljence v Ameriko in še vedno je pridelovanje koruze najbolj razširjeno prav v Ameriki (Weatherwax, 1954). Koruza se uporablja kot živinska krma, v človekovi prehrani pa je pomemben vir ogljikovih hidratov. Koruza je pomembna tudi kot objekt za raziskovalno delo, saj je poleg navadnega repnjakovca (Arabidopsis thaliana) modelna rastlina za molekularno biološke raziskave. Za razvoj sodobne genetike je koruza za botanike to, kar je za zoologe Drosophila (Heiser, 1990). Koruza spada v družino trav (Poaceae). Njen najbližji divji sorodnik je trava teozint (Zea diploperennis, Z. perennis ali starejše ime Euchlaena mexicana Schrad.), ki še vedno raste v območjih Mehike in Gvatemale (Weatherwax, 1954). Koruzno steblo je razdeljeno na nodije, z enim listom na vsakem nodiju. Listi rastejo dvoredno, vsak je sestavljen iz nožnice, ki objema steblo, in listne ploskve. Iz zalistja izraščajo stranski poganjki, pri dnu stebla na bazi internodijev pa adventivne korenine. Koruza je enodomna rastlina, cvetni klaski pa so karpelni ali prašnični. Karpelni cvetni klaski so združeni v bate (storže), ki so v zalistjih stebelnih listov in so tesno oviti s številnimi listnimi nožnicami (ličje). Os socvetja je odebeljena, internodiji so zelo skrajšani, klaski imajo večinoma zelo zakrnele pleve. Vratovi plodnic so dolgi nekaj 10 centimetrov in na vrhu molijo iz ovoja storža. Prašnični cvetovi so na vrhu stebla v prstastem socvetju, ki je sestavljeno iz več klasastih socvetij (Kiesselbach, 1949; Martinčič s sod., 1999). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 3 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2.2 Kariopsa koruze Razmnoževalna struktura koruze je kariopsa (zrno), ki je tudi najpomembnejši del rastline za človeka. Kariopsa koruze (Slika 2.1) je orešek, nastal iz nadrasle plodnice. Seme (embrio, endosperm in ostanki semenske ovojnice ter nucela) je zraslo z osemenjem (perikarp). Endosperm zavzema največji del prostornine zrele kariopse, relativno manjši embrio je na strani, blizu baze endosperma. Naloga endosperma je shraniti dovolj hrane za začetno rast embria ob kalitvi. Celice endosperma so napolnjene s številnimi amiloplasti s škrobnimi zrni. Na bazi endosperma (najbližje pedicelu) so celice specializirane v prenosne celice in služijo prevajanju hrane od materinske rastline v razvijajoči se endosperm in posredno v embrio. Celice na površini endosperma nimajo škrobnih zrn, temveč sestavljajo alevronsko plast in vsebujejo alevronska zrna in olja. Alevronska plast se ne porablja za prehrano embria, ampak naj bi le prispevala encime za razgradnjo škroba. Perikarp je stena plodnice in tvori trden zunanji ovoj, ki ščiti notranje dele. Na apikalnem delu je viden ostanek vratu plodnice, na bazalnem delu pa prehaja v pedicel brez jasnega prehoda. Med semensko zasnovo in pedicelom je placento-halazna plast, kjer se v zreli kariopsi razvije abscizijska plast. Ravnina abscizijske plasti ustreza hilumu pecljatih vrst, pri katerih se zrela kariopsa v tej ravnini odlomi (Kiesselbach, 1949). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 4 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 2.1. Struktura razvijajoče se kariopse koruze, vzdolžni prerez (Kiesselbach, 1949). Pomen oznak: a – ostanek vratu plodnice, b – perikarp, c – notranji del karpelov, ki razpada, d – endosperm, e – mesto mitoz v endospermu, f – alevronska plast, g – embrio, h – območje hiluma (placento-halazna plast), i – pedicel. 2.2.1 Semenska zasnova V semenski zasnovi, ki je del sporofitne generacije karpelnega cveta, se razvije ženski gametofit – megagametofit ali embrionalna vrečka. Iz megasporocite nastanejo z mejozo štiri spore (vsaka ima 10 kromosomov); tri od njih propadejo. V preostali spori se jedro trikrat deli (brez nastanka vmesnih celičnih sten), nastane embrionalna vrečka z osmimi jedri. Dve od njih se premakneta na sredino embrionalne vrečke – to sta polni jedri, ki bosta postali del prvega jedra endosperma. Na mikropilnem koncu embrionalne vrečke so tri jedra, okoli katerih se oblikujejo celice. Ena od njih se poveča, ta postane jajčna celica, drugi dve pa sta sinergidi. Tudi na nasprotnem delu embrionalne vrečke se oblikujejo tri celice – antipode, ki pa se kmalu začnejo deliti, tako da nastane okrog 30 celic. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 5 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Embrionalno vrečko obdaja diploidno tkivo nucela (20 kromosomov), nucel pa je obdan z dvema integumentoma. Semensko zasnovo obdajajo karpeli, ki so združeni v steno plodnice. Nucel je hranilno tkivo za začetni razvoj filialne generacije. Kmalu se v celicah nucela začnejo avtolitični procesi. Ko endosperm raste, pri tem zapolnjuje prostor, kjer so bile prej celice nucela (Kiesselbach, 1949). 2.2.2 Dvojna oploditev Filialna generacija (embrio in endosperm) nastane z dvojno oploditvijo, ki je značilna za kritosemenke. Skoraj hkrati sta jo konec devetnajstega leta odkrila Nawaschin in Guignard (Raghavan, 2003). Oploditev se zgodi približno 24 ur po oprašitvi (Kiesselbach, 1949). Po cevi pelodnega mešička dospeta v embrionalno vrečko dve spermalni jedri (haploidni moški gameti, vsaka ima 10 kromosomov). Eno od njiju se združi z jedrom jajčne celice. Iz te zigote z 20 kromosomi nastane embrio, ki se razvije v hčerinsko rastlino. Drugo spermalno jedro se združi z dvema polnima jedroma. V tej združitvi nastane triploidno jedro s 30 kromosomi (dve kromosomski garnituri prispeva materinska rastlina, eno pa očetovska). Po dvojni oploditvi so v embrionalni vrečki trije tipi celic glede na število kromosomov: triploidne celice endosperma, diploidne celice embria in haploidne antipode (Kiesselbach, 1949; Berger, 1999). 2.2.3 Razvoj endosperma Triploidno jedro, ki je nastalo po dvojni oploditvi, se začne po 2 do 4 urah sinhrono deliti. Na tak način nastane sincicij z nekaj sto jedri. Tretji dan po oploditvi se začnejo okoli jeder oblikovati celične stene in četrti do peti dan je endosperm popolnoma celulariziran, celice so enojedrne. V endospermu je mitotska aktivnost največja med 8. in 10. dnevom po oploditvi. Okrog 12. dneva celične delitve v osrednjem delu endosperma prenehajo, na obrobju endosperma na nasprotni strani od embria pa se delijo še naprej. Delujejo kot meristemsko tkivo, ki celice oddeljuje v notranjost endosperma, celice v osrednjem delu pa se povečujejo in nalagajo škrob. Celične delitve prenehajo v valu, ki se začne v zgornjem delu endosperma, napreduje proti bazi in nato proti perifernim plastem endosperma. Okoli Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 6 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 20. do 25. dneva se ustavi vsa mitotska aktivnost v celotnem endospermu, razen v alevronski plasti (Lowe in Nelson, 1946; Kiesselbach, 1949; Kowles in Phillips, 1985; Kowles in Phillips, 1988; Berger, 1999, Young in Gallie, 2000). V času od 12. do 15. DPO razvoj endosperma preide v fazo zorenja, ko se začne nalaganje suhe snovi. V endospermu se zelo povečata izražanje in aktivnost encimov, povezanih s sintezo škroba in založnih proteinov. To obdobje traja do smrti celic v endospermu. Nalaganje škroba se začne v osrednjem delu endosperma, se razširi proti periferiji in nato proti bazi endosperma. Sinteza založnih proteinov sledi vzorcu nalaganja škroba, največ založnih proteinov pa se naloži v perifernih plasteh endosperma (Tsai in sod., 1970; Kowles in Phillips, 1988; Doehlert in sod., 1994). Celice endosperma odmrejo v poznem razvoju. Programirana celična smrt se začne okrog 16. DPO v osrednjem delu endosperma, do 24. DPO zajame apikalni del, nato pa se razširi še proti bazi endosperma. Po 20. DPO se začne v endospermu zmanjševati količina DNA, RNA in topnih proteinov (Kowles in Phillips, 1988; Young in sod., 1997, Young in Gallie, 2000). Celice v endospermu odmrejo, vendar njihova vsebina ne propade, ampak se ohrani v mumificiranem stanju. Razgradi se šele ob kalitvi s hidrolitskimi encimi iz alevronske plasti (Dangl in sod., 2000). Celice v alevronski plasti (najbolj zunanja plast celic v endospermu) ostanejo žive in propadejo šele po kalitvi (Haberlandt, 1884, cit. po Fath in sod., 200c0). Programirano odmiranje celic so opazili že zgodaj v razvoju kariopse pšenice tudi v materinskem tkivu perikarpa in nucela, ki odmirata, da naredita prostor za hitro rastoči endosperm (Young in Gallie, 2000). V procesu diferenciacije se celice v endospermu endopoliploidizirajo. Endoreduplikacija se začne okrog 10. DPO (razvoj kariopse koruze so navadno merili v dnevih po oprašitvi -DPO, oploditev sledi v enem dnevu) in doseže vrh 16-18 DPO (Kowles in Phillips, 1985). Vsebnost DNA v normalnih delečih se triploidnih celicah v fazi celičnega cikla G1 je 3 C, v fazi G2 pa 6 C. Vrednost 1 C je količina DNA v nepodvojenem haploidnem genomu (Swift, 1950). Vsebnost DNA v jedrih celic, ki so že končale en cikel endoreduplikacije, je 6 C. Stopnja endopoliploidnosti največjih centralnih celic je 96 C do 192 C, redko več, kar so ocenili z meritvami prostornine jeder (Tschermak-Woess in Enzenberg-Kunz, 1965), citometrijo jeder, barvanih po Feulgenu (Kowles in Phillips, 1985) in pretočno citometrijo z uporabo fluorescentnih barvil za DNA (Kowles in sod., 1992; Schweizer in sod., 1995; Larkins in sod., 2001; Setter in Flannigan, 2001). Število celic v endospermu je rezultat Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 7 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 mitotske aktivnosti in je pomemben podatek za razumevanje razvoja endosperma. Pri 16. DPO naj bi doseglo najvišjo vrednost (Kowles in Phillips, 1988). Število celic v endospermu so ocenili s štetjem jeder 16 DPO s pretočno citometrijo ali s štetjem jeder s hemocitometrom po razgradnji tkiva s celulazami. V endospermu so ocenili od 54.000 do 880.000 celic (Jones in sod., 1985; Kowles in sod., 1992; Schweizer in sod., 1995; Setter in Flannigan, 2001). 2.2.4 Prenosne celice Na bazi endosperma so celice specializirane v prenosne celice. Njihove celične stene so zelo nagubane. Stenam sledijo celične membrane, katerih površina je tako zelo povečana. V prenosnih celicah so našli za te celice specifičen izocim invertaze iz celične stene INCW2, ki je ionsko vezana na celično steno. Invertaza razgradi saharozo, ki po floemu pride v placento-halazno plast v pedicelu, nastali glukoza in fruktoza pa se s protonskimi simporterji monosaharidov transportirata v endosperm (Miller in Chourey, 1992; Shannon in sod., 1986). V prenosnih celicah koruze se specifično izražajo tudi majhni, defenzinom podobni peptidi, bogati s cisteinom, ki imajo protiglivno aktivnost. Ti peptidi se nalagajo tudi v placento-halazni plasti (Thompson in sod., 2001). 2.2.5 Placento-halazna plast Placento-halazna plast (PHP) je materinsko tkivo tik pod bazalnim delom semenske zasnove oziroma pod bazo endosperma v poznejšem obdobju razvoja. PHP naj bi imela pomembno vlogo v prenosu vode, sladkorjev in drugih hranil v razvijajoče se seme (Felker in Shannon, 1980; Schel in sod., 1984; Thompson in sod., 2001). V času, ko se začne diferenciacija prenosnih celic (okoli 7 DPO), začnejo odmirati tudi celice v PHP (Shannon in sod., 1986). V zreli kariopsi je v predelu PHP razvita abscizijska plast, v kateri so naložene sekundarne spojine. Te jo temno obarvajo, zato jo imenujejo tudi »črna plast« (Kiesselbach, 1949). Slika 2.2 prikazuje skico bazalnega dela kariopse koruze, kjer je prikazana lokacija PHP. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 8 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 2.2. Skica placento-halazne plasti v bazalnem delu kariopse, okrog 10 DPO. Skica vzdolžnega prereza skozi kariopso koruze divjega tipa. bepc – bazalne endospermske prenosne celice, em – embrio, en – endosperm, p – perikarp, php – placento-halazna plast, ped – pedicel, n – ostanki nucela, ž – konci žil v pedicelu. Sliko narisala Karen Chamusco (Department of Plant Pathology, University of Florida, Gainesville, ZDA). 2.2.6 Mutanta mn1 Mutanto mn1, v kateri je prizadeto le zrno koruze, sta prvič opisala Lowe in Nelson (1946). Masa endosperma mn1 je le petina mase endosperma divjega tipa, mutacija pa ne vpliva na samo rastlino koruze. Kariopsa mutante mn1 ima »papirnat« in na vrhu ugreznjen perikarp (Lowe in Nelson, 1946). Vzrok takšnega fenotipa je izguba izocima invertaze iz celične stene INCW2, ki se specifično izraža v prenosnih celicah v bazalnem delu endosperma (Miller in Chourey, 1992; Cheng in sod., 1996). Zgodaj v razvoju mutante mn1 (okrog 9 DPO) endosperm začne zaostajati v rasti, nato se bazalni del endosperma loči od materinskega tkiva pod njim (placento-halazna plast), ker materinsko tkivo propade. Med endospermom in placento-halazno plastjo nastane značilna razpoka (Miller in Chourey, 1992). Zakaj je ob mutaciji, specifični za filialno tkivo, prizadeto tudi tkivo materinske generacije, še ni znano. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 9 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2.3 Kalitev kariopse Ob kalitvi embrio porabi hranila, ki so v endospermu. Hranila črpa s posebej prilagojenim prvim listom skutelumom. Plast skuteluma, ki je v stiku z endospermom, izloča encime za razgradnjo založnih snovi v endospermu. Drugi list, koleoptila, je spremenjen v ovoj okoli plumule, ki jo sestavlja nekaj pravih listov, zvitih v stožec. Primarna korenina (radikula) je zaščitena z ovojem - koleorizo. Ob kalitvi se najprej začne podaljševati primarna korenina skupaj s koleorizo; skupaj predreta perikarp, nato pa korenina kmalu prodre tudi skozi koleorizo. Tudi plumula in koleoptila se podaljšata in predreta perikarp. Sprva koleoptila raste hitreje, nato pa se ustavi, ko pride v stik s svetlobo in plumula prodre skozi njen vrh. V tem času se pojavijo že prve adventivne korenine, ki poženejo iz stebla tik nad nodijem koleoptile, pozneje pa se razvijejo še dodatne adventivne korenine na višjih internodijih stebla. Te potem oblikujejo šopast koreninski sistem koruzne rastline (Kiesselbach, 1949). V raziskavah razvoja korenin so se veliko ukvarjali z razvojem primarne korenine, ki je najpomembnejša za mlado kalico. Korenina raste na apikalnem delu, ki je zaščiten s koreninsko čepico. 2.3.1 Koreninska čepica Koreninska čepica opravlja več pomembnih nalog za rastlino. Apikalni meristem korenine ščiti pred poškodbami in vdorom patogenov, zaznava težnost, zmanjšuje upor korenine pri prodiranju v zemljo z luščenjem celic s površine čepice in izločanjem sluzi, s sluzjo tudi prilagaja fizikalno-kemijske razmere v rizosferi, omogoča komunikacijo z mikrobi in uravnava rast korenine v skladu s prejetimi signali (Barlow, 1975; Bengough in McKenzie, 1997; Hawes in sod., 2000). Celice koreninske čepice koruze izvirajo iz kaliptrogena, ki je distalni del apikalnega meristema korenine. Celice kaliptrogena oddeljujejo celice v smeri rasti korenine, te pa se v procesu diferenciacije povečujejo (Kiesselbach, 1949). V nedelečih se jedrih zunaj meristemskega območja še vedno poteka sinteza DNA v ciklih endoreduplikacije (Barlow, 1976). Stopnja endopoliploidnosti celic se tako veča, ko se celica premika vedno bolj proti obrobju čepice, v skladu z delitvami v meristemu. Najbolj zunanje, najstarejše celice v Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 10 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 kolumeli (osrednji steber celic v čepici) vsebujejo jedra s 16 C DNA (Barlow, 1977). Celice v zunanjih plasteh čepice vsebujejo hipertrofirana Golgijeva telesa, ki oddeljujejo velike vezikle, napolnjene s polisaharidi. Ti so vključeni v nastajanje in izločanje sluzi (Moore in Jones, 1967). Pri koruzi je specifična in najpomembnejša sestavina sluzi koreninske čepice fukoza, izločeni polisaharidi pa vsebujejo še glukozo, galaktozo, arabinozo, ksilozo in manozo (Harris in Northcote, 1970; Chaboud, 1983; Bacic in sod., 1986; Osborn in sod., 1999). Velik del glukoze v sluzi je v prosti monosaharidni obliki (Osborn in sod., 1999). S sintezo sluzi se niso veliko ukvarjali, vendar sta Harris in Northcote (1970) predlagala biokemijsko pot za sintezo sluzi, izvedeno iz njene kemične sestave. Z radioaktivno označeno glukozo sta potrdila, da je glukoza prekurzor za sintezo fukoze. Predlagala sta, da naj bi se vse monosaharidne enote sluzi sintetizirale iz saharoze prek UDP-glukoze in D-fruktoze. V skladu s tem modelom so rezultati Ricarda in sod. (1998), po katerih naj bi bila saharoza, in ne heksoze, glavni vir ogljika v koreninah. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 11 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2.4 Rast in razvoj organov Organizmi rastejo s celičnimi delitvami in povečevanjem celic. Potek in regulacija delitve celic je že dobro znana, vendar pa še ni ugotovljeno, od kje točno izvira signal, ki vodi delitev in rast celic, tako da izpolnijo genetsko določen morfogenetski načrt. Razvoj organizmov obravnavata dve glavni teoriji, »celična« in »organizemska«, ki pa naj sploh ne bi bili pravi alternativi, kot trdijo njuni zagovorniki (Tsukaya, 2002). Po celični teoriji so celice osnovni gradniki in rast organizmov je posledica povečevanja števila celic. Celice v meristemu naj bi se po svojem genetskem programu avtonomno delile in povečevale v določenem vzorcu, kar vodi do končne oblike organa. Po organizemski teoriji so celice le razdeljen prostor v organizmu in so celične delitve bolj posledica rasti organizma, kot pa so njen vzrok. Celične delitve so posledica povečevanja tkiva, ki ga z mitozami delijo na dele, ki jih lahko obvladajo posamezna jedra (Kaplan, 1992). Vendar pa niti znotraj enega organizma ni enosmerne povezave med delitvijo celic in rastjo organov; širjenje tkiva je lahko posledica delitve celic, delitve celic pa so lahko posledica širjenja tkiva (Jacobs, 1997). Ker sta obe omenjeni teoriji preveč strogo določeni, so Beemster in sod. (2003) predlagali nov model, ki ju povezuje. Celice so z delitvami in rastjo osnovne enote rastlinske morfogeneze, rastni procesi pa so nadzorovani na nivoju organa (organizma) z izmenjavo rastnih regulatorjev. Tako je dosežena povezava med dogajanjem v posameznih celicah in v celotnem organu, kar omogoča, na primer, nadomestitev prizadete celične delitve s povečanim širjenjem celic (Doonan, 2000). Takšen model je predlagal tudi Tsukaya (2002) in ga imenoval »neocelična teorija«. Nastale celice se nato diferencirajo za opravljanje specifičnih nalog. Gradient razvoja so opazovali v kličnih listih boba (Vicia faba). Na enem koncu so bile mlade, mitotsko aktivne celice, na drugem pa starejše celice, ki so se podaljševale, pomnoževale genom z endoreduplikacijo in nalagale založne snovi (Weber in sod., 1997). V koreninski čepici so opazili gradient celic od mitotsko aktivnih nediferenciranih celic v meristemu prek osrednjih celic s statoliti, ki zaznavajo gravitacijo, do velikih zunanjih celic, ki izločajo sluz (Sievers in Braun, 1996). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 12 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2.4.1 Celični cikel in vrednost C Celični cikel je proces, ki vodi do nastanka dveh hčerinskih celic. Razdeljen je na štiri faze: G1, S, G2 in M. V fazi S se podvoji DNA, v fazi M pa se jedro in celica delita. Med celičnim ciklom se spreminja količina jedrne DNA. Ponavadi količino jedrne DNA izražamo kot vrednost C, pri čemer C pomeni konstantno (angl. »constant«) vrednost. Vrednost 1 C je količina nepodvojenega haploidnega genoma osebka, na primer v jedrih tetrad po mejozi. Vrednost C je neodvisna od števila kromosomov, ki se znotraj vrste lahko spreminja zaradi poliploidnosti (Swift, 1950). V somatskih celicah sporofitov kritosemenk, ki se mitotsko delijo, jedra vsebujejo od 2 C (telofaza mitoze, faza G1) do 4 C DNA (faza G2, profaza mitoze). Vmesne vrednosti količine DNA pa jedra vsebujejo v S fazi, ko se DNA podvaja. Najmanjša in največja vrednost C znotraj posamezne stopnje ploidnosti sta v razmerju 1 : 2 (Bennet in Smith, 1976). Glavni kontrolni mehanizmi, ki vodijo celični cikel, so evolucijsko skoraj nespremenjeni. Celični cikel v organizmih od kvasovk, rastlin do sesalcev vodijo serinske/treoninske kinaze z imenom od ciklinov odvisne kinaze. Njihova aktivnost je natančno uravnana, da vzdržujejo pravo časovno zaporedje procesov v delitvi celic. Na delovanje ciklinov in od ciklinov odvisnih kinaz vplivajo različni rastlinski hormoni in sladkorji. V nekaterih primerih se celični cikel spremeni v posebno obliko – endoreduplikacijo, ki vodi v endopoliploidizacijo celic (Stals in Inze, 2001). 2.4.2 Endoreduplikacija Endoreduplikacija je najpogostejši mehanizem, ki vodi do endopoliploidnih celic. Endopoliploidija je obstoj celic z različno stopnjo ploidnosti v sosednjih celicah v istem organizmu in se pogosto pojavlja pri rastlinah, razširjena pa je tudi pri praživalih (protistih), členonožcih, mehkužcih in sesalcih. Nagl (1976) sklepa, da se endopoliploidnost pojavlja pri vrstah z majhnim genomom, ker naj bi bila za nekatere celične funkcije potrebna večja količina jedrne DNA. Vendar te povezave pozneje niso nedvoumno dokazali, saj se je pokazala le šibka negativna korelacija med osnovno količino DNA v jedrih in stopnjo endopoliploidnosti (Barlow, 1978; Barow in Meister, Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 13 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2003). Najpomembnejši dejavnik, ki vpliva na pojav endopoliploidnosti, je taksonomski položaj vrste (Barow in Meister, 2003). Endoreduplikacija je spremenjen celični cikel, v katerem se DNA podvaja, vendar se jedro in celica ne delita. To vodi v nastanek kromosomov z 2n kromatidami (n se povečuje s številom endociklov), število kromosomov pa ostane nespremenjeno. V endoreduplikaciji sodeluje večina komponent normalnega celičnega cikla, spremenjena je le regulacija njihovega izražanja (Traas in sod., 1998; Joubes in Chevalier, 2000). Pravi pomen endopoliploidizacije še ni znan, obstaja pa tesna povezava med stopnjo ploidnosti in velikostjo celic (Melaragno in sod., 1993; Kondorosi in sod., 2000). Poskusi na kvasovkah so pokazali spremenjeno izražanje genov v izogenih sevih, ki so se razlikovali le po stopnji ploidnosti. Pri njih je bila korelacija izražanja s ploidnostjo za nekatere gene pozitivna, za nekatere pa negativna (Galitski in sod., 1999). Endoreduplikacija v rastlinskih tkivih je tesno povezana s procesom diferenciacije celic. Te naj bi se z endopoliploidizacijo pripravile na poznejše povečanje prostornine (Traas in sod., 1998), povečala naj bi se tudi njihova metabolna aktivnost (Baluška in Kubica, 1992). Ob tem celice izgubijo sposobnost celične delitve (Barlow, 1978). 2.4.3 Programirana celična smrt v razvoju rastlin V živalskih celicah programirana celična smrt (PCS) poteka kot apoptoza: začne se s krčenjem celice in kondenzacijo kromatina, nato se jedro in pozneje vsa celica razgradita in razdelita v apoptotska telesca, ki jih fagocitirajo sosednje celice. Značilna je razgradnja DNA z endonukleazami v fragmente z velikostjo mnogokratnika 180 baznih parov, kar je vidno na elektroforetskem gelu kot lestvica. Tako razgrajeno DNA lahko zaznamo z reakcijo TUNEL, v kateri se z encimom terminalno deoksinukleotidil transferazo na proste 3' OH konce vežejo označeni nukleotidi. Apoptoza je bila opisana pri živalih od glist do sesalcev, pri rastlinah pa je ni ali je vsaj zelo redka. Ironično pa beseda »apoptosis« izvira iz rastlinskega sveta – je grška beseda, ki pomeni odpadanje cvetnih listov in listov z dreves (Dangl in sod., 2000). Pri rastlinah so opazili krčenje celic in kondenzacijo kromatina, našli so kaspazam podobne encime, opazili so tudi razrez DNA v lestvico, vendar se namesto izraza apoptoza bolj uporablja Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 14 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 »apoptozi podobna« celična smrt. Ostankov rastlinskih celic sosednje celice namreč ne fagocitirajo, ker to zaradi celičnih sten ni mogoče (Danon in sod., 2000). Kljub temu so opazili zbiranje vsebine celice v telesca, podobna apoptotskim, v programirani celični smrti, ki je sledila delovanju toksinov (Wang in sod., 1996) in v nastajanju aerenhima v koreninah (Gunawardena in sod., 2001) Na tak način v rastlinah odmirajo celice, ki so odslužile svojo vlogo, kot so celice endosperma, suspenzorja embria, celice koreninske čepice, celice v procesu senescence in celice, vključene v abscizijo rastlinskih delov, vegetativna celica peloda, sinergide, antipode in še druge. Celice, ki šele po smrti začnejo opravljati svojo funkcijo, pa programirano odmrejo po poti, ki se zelo razlikuje od apoptotske poti pri živalih. Tak primer so elementi trahej v ksilemu, nekateri trihomi, sklereide in sklerenhimska vlakna (Krishnamurthy in sod., 2000). Celice trahej se pred smrtjo povečajo, navadno je vključena tudi endopoliploidizacija, sintetizirajo sekundarno celično steno, nato pa se njihova vsebina hitro razgradi s hidrolitskimi encimi iz vakuole (Obara in sod, 2001). Po poti PCS, vendar po drugačnih mehanizmih, odmrejo tudi celice pri nastajanju aerenhima v koreninah, celice alevronske plasti semena ob kalitvi in celice v preobčutljivostni reakciji, ki s smrtjo nekaj celic na mestu vdora patogena omeji njegovo razširitev po rastlini (Pennel in Lamb, 1997; Dangl, 2000). Celicam endosperma je usojeno, da odmrejo pred zrelostjo kariopse, vendar se za razliko od skoraj vseh drugih evkariotskih celic, v katerih poteka PCS, njihova vsebina ne razgradi in mrtve celice obdržijo jedra in organele. Celična trupla ostanejo v mumificiranem stanju in se razgradijo šele ob kalitvi (Dangl, 2000). PCS se začne v centralnemu delu endosperma okrog 16 DPO, v predelu celic z najvišjo stopnjo endopoliploidnosti, nato napreduje proti zgornjemu delu kariopse, na koncu se razširi še proti bazi. Razrez DNA v obliki lestvice, značilne za apoptotski tip celične smrti, so opazili okrog 28 DPO in pozneje (Young in sod, 1997; Young in Gallie, 2000). Že v zgodnjem razvoju (okrog 7 DPO) so z elektronsko mikroskopijo opazili propadanje celic endosperma, ki obdajajo embrio (Schel in sod., 1984). Giuliani in sod. (2002) pa so opisali PCS v embriogenezi v strukturah, ki ne prispevajo k poznejši zgradbi rastline. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 15 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2.5 Vloga sladkorjev v razvoju rastlin Rastline proizvajajo sladkorje v procesu fotosinteze in jih potem uporabljajo kot substrate v metabolizmu in gradnike celic. Da so ti procesi usklajeni, vključene gene uravnavajo tudi sladkorji. Ti prek različnih mehanizmov zaznavanja v celici usmerjajo izražanje genov, aktivnost encimov in razvoj celic. Sladkorji vplivajo na fotosintezo, glikolizo, glioksilatni metabolizem, metabolizem dušika, metabolizem saharoze in škroba, obrambne procese in celični cikel. Na procese ne vplivajo s samo prisotnostjo, temveč verjetneje preko reakcij njihovega metabolizma. Mesta zaznavanja so verjetno različni transporterji sladkorjev in reakcija s heksokinazo (Koch, 1996; Jang in Sheen, 1997; Smeekens, 2000). Saharoza je oblika sladkorjev za transport na velike razdalje po rastlini, služi pa tudi kot signalna molekula, ki uravnava izražanje genov v različnih tkivih. Uravnalno deluje na gene za založne proteine, sintezo škroba in nekatere obrambne proteine (Jang in Sheen, 1997; Weber in sod., 1997; Smeekens, 2000). Saharoza in heksoze večkrat enako učinkujejo na procese v rastlini, zato v literaturi mnogokrat opisujejo le »vpliv sladkorjev« na nek proces. Vendar pa so Weber in sod. (1996) opazili različen vpliv heksoz in saharoze v razvijajočem se semenu boba (Vicia faba): heksoze so pozitivno vplivale na celične delitve, saharoza pa je sprožila založne procese. Sladkorji v obliki polisaharidov so pomembni kot gradniki rastlinskih celic in kot založne snovi. UDP-glukoza, ki nastane iz saharoze, je prekurzor za sintezo celuloze (Amor in sod., 1995). Domnevajo tudi, da je prekurzor za sintezo polisaharidov v sluzi koreninske čepice (Harris in Northcote, 1970). Saharoza, ki po floemu pride do razvijajoče se kariopse, se porabi v sintezi škroba. Encima, ki sta vključena v mobilizacijo saharoze v različne metabolne procese, sta saharoza sintaza in invertaza (Sturm in Tang, 1999). 2.5.1 Invertaza Invertaza (ß-fruktofuranozidaza, EC 3.2.1.26) je encim, ki nepovratno cepi saharozo v glukozo in fruktozo. Fiziološka vloga invertaze naj bi bila razporejanje saharoze med fotosintetskim izvorom in ponorom v rastlini (Eschrich, 1980). Weber in sod. (1997) domnevajo, da naj bi bila invertaza ključnega pomena pri razvoju semena. Invertaza je v Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 16 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 dveh oblikah: topni (v vakuoli in citoplazmi) in ionsko vezani na celično steno (Sturm, 1999). Obe obliki imata več izocimov. V razvoju kariopse koruze je na celično steno vezana oblika veliko bolj aktivna kot topna oblika, saj je odgovorna za 90 % vse invertazne aktivnosti (Cheng in sod., 1996). Izocim INCW2 se specifično izraža v celicah na bazi endosperma, ki so specializirane za prenos hranilnih snovi v razvijajoči se endosperm (Cheng in sod., 1996). Aktivnost invertaze doseže vrh okrog 12 dni po oprašitvi, nato upade (Tsai in sod., 1970; Cheng in sod., 1996). Z avtoradiografskimi metodami so ugotovili, da se saharoza v pedicelu odlaga iz floema, tam pa se razgradi na glukozo in fruktozo. Večina vseh sladkorjev v placento-halazni plasti je v obliki heksoz, ki se transportirajo v endosperm, kjer se saharoza deloma ponovno sintetizira (Shannon, 1968; Porter in sod., 1985). V koruzi in bobu (Vicia faba) naj bi invertaza z razgradnjo saharoze v zgodnjem razvoju semena igrala pomembno vlogo v zagotavljanju heksoz, ki vzdržujejo mitotske delitve in le manjšo vlogo v zagotavljanju substratov za sintezo škroba (Weber in sod., 1997; Cheng in Chourey, 1999). Vrh aktivnosti INCW2 je 12. DPO, kar se ujema s fazo intenzivnih celičnih delitev v endospermu (Cheng in sod., 1996; Cheng in Chourey, 1999). Velika večina aktivnosti INCW2 je pogrešljiva, saj so z analizo mutant z zmanjšanim izražanjem določili, da že okoli 6 % aktivnosti invertaze v primerjavi z aktivnostjo v divjem tipu zadostuje za razvoj normalnega fenotipa (Cheng in sod., 1996). V mutantah mn1 brez invertaze v bazalnih celicah endosperma pa se razvije fenotip miniature-1. Mutante imajo zelo zmanjšana zrna z nagubanim perikarpom, endosperm pa se loči od propadajočega materinskega tkiva placento-halazne plasti (Miller in Chourey, 1992). V placento-halazni plasti mutant mn1 je bilo veliko več saharoze v primerjavi z Mn1, manj pa je bilo glukoze in fruktoze (Zhou, 2000). 2.5.2 Saharoza sintaza Saharoza sintaza (UDP-glukoza:D-fruktoza 2-?-D-glukoziltransferaza, EC 2.4.1.13) je encim, ki katalizira reverzibilno pretvorbo saharoze in UDP v fruktozo in UDP-glukozo. Ima pomembno vlogo v metabolizmu, saj saharozo usmerja v različne biokemijske poti, povezane z metabolnimi, strukturnimi in založnimi procesi v rastlinskih celicah. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 17 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Biokemijske in genetske raziskave kažejo, da je in vivo vloga saharoza sintaze produkcija UDP-glukoze, ki je prekurzor za sintezo UDP-galaktoze, škroba, celuloze in kaloze (Amor in sod., 1995; Ruan in sod., 1997; Chourey in sod., 1998; Sturm in Tang, 1999). V vseh doslej raziskanih rastlinskih vrstah so našli dva ali več homolognih genov (ortologov), ki vodijo do različnih izocimov saharoza sintaze, ki imajo navadno tkivno in celično značilne vzorce izražanja. V koruzi so opisali tri gene za saharoza sintazo: Sus1, Sh1 in Sus3. Prva dva prispevata več kot 99 % vseh proteinov saharoza sintaze v različnih tkivih (Carlson in sod., 2002). V mladih koreninah se izražata SUS1 in SH1 izocima, vendar so v koreninski čepici zaznali le SUS1 protein (Rowland in sod., 1989). Podobno se le en gen za saharoza sintazo izraža v koreninskih čepicah ječmena (Guerin in Carbonero, 1997) in krompirja (Fu in Park, 1995). Imunolokalizacijske študije so pokazale večjo koncentracijo saharoza sintaze v zunanjih celicah koreninske čepice koruze (Kladnik, 1999). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 18 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2.6 Namen dela Na mikroskopski ravni smo želeli proučiti nekatere procese, ki so vključeni v razvoj koruze. Raziskovali smo procese v bazalnem delu zrna, kjer poteka prenos asimilatov iz materinskega tkiva v endosperm, in ugotavljali, če ter kako, so ti procesi povezani z majhnostjo endosperma mutante mn1. Nadalje smo želeli ugotoviti, kako je saharoza sintaza povezana z diferenciacijo celic v koreninski čepici. Da bi razvojne procese kvantitativno proučili na ravni celotnega tkiva, smo želeli izdelati modele za ovrednotenje citoloških parametrov v treh dimenzijah. V delu smo preverjali naslednje hipoteze: (1) Endosperm mutante mn1 je manjši zaradi manjšega števila celic in manjše rasti celic, posledično pa imajo celice endosperma mn1 tudi manjšo stopnjo endoreduplikacije. (2) V nastanek razpoke med endospermom in materinskim tkivom v mutanti mn1 je vključena programirana celična smrt. Zaradi razpoke se prekine dotok hranil in rast endosperma se ustavi. Programirana celična smrt je vključena tudi v nastanek abscizijske plasti v poznem razvoju kariopse v obeh genotipih. (3) Glede na znano sestavo polisaharidne sluzi koreninske čepice je vloga saharoza sintaze v koreninski čepici zagotavljanje sladkornih monomerov za sintezo sluzi. Nalaganje saharoza sintaze v celicah koreninske čepice je povezano z diferenciacijo celic in je večje v celicah z višjo stopnjo endopoliploidnosti. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 19 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3 MATERIAL IN METODE 3.1 Rastlinski material 3.1.1 Opis rastlin V raziskavi smo uporabili rastline koruze (Zea mays L.), »incestne« linije W22 (Wisconsin 22). Genotipi rastlin so bili Mn1 Mn1 (divji tip), mn1 mn1 (mutanta invertaze iz celične stene INCW2) in Mn1 mn1 (heterozigot). Zrna, iz katerih smo vzgojili rastline, je prispeval dr. Prem S. Chourey iz Oddelka za rastlinsko patologijo na univerzi University of Florida, Gainesville, Florida, ZDA. 3.1.2 Vzgoja rastlin do zrelosti Rastline smo vzgojili v dveh sezonskih serijah na polju in v rastlinjaku dr. Choureyja. Prva serija rastlin je bila vzgojena na polju in je bila zrela za opraševanje v maju leta 2001. Iz te serije smo uporabili kariopse, izrezane iz storžev 16 dni po oprašitvi (DPO), v katerih smo izmerili stopnjo endopoliploidnosti in velikost celic v endospermu. Druga serija rastlin je bila vzgojena v rastlinjaku in je bila zrela za opraševanje konec marca in v aprilu leta 2002. Iz te serije smo uporabili kariopse za merjenje stopnje endopoliploidnosti in velikosti celic v endospermu 4 do 12 DPO in za vsa ostala histološka barvanja preparatov kariops od 0 do 28 DPO. Rastline v rastlinjaku smo vzgojili v prsti za lončnice v 15-litrskih loncih. Zalivali smo jih vsak dan, enkrat na teden smo dodali umetno gnojilo Osmocote. Dnevno-nočni ritem je bil naraven (rastlinjak je bil steklen, brez umetne osvetlitve). Na vsaki rastlini sta pognali dve karpelni socvetji, ki smo ju pokrili z vrečko iz povoščenega papirja (»shoot bag«, 7 × 20 cm), da smo preprečili nekontrolirano oprašitev. Oprašili smo le socvetje, ki je bilo večje (navadno zgornje). V nekaj dnevih so iz socvetja pognali laski (vratovi plodnic). Z britvico smo odrezali konce laskov skupaj s konicami listov, ki ovijajo socvetje. Do naslednjega dne so laski zrasli za nekaj centimetrov. Na tak način smo dosegli enako višino laskov, kar je olajšalo nanos peloda na vse vratove plodnic. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 20 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Vrh stebla smo previdno upognili v vodoravno lego, na prašnično socvetje namestili večjo papirnato vrečko (20 × 40 cm) in odločno stresli pelod v vrečko. Rastline divjega tipa in mutante mn1 mn1 smo oprašili s pelodom iz iste rastline (samooprašitev) oziroma s pelodom rastlin enakega genotipa (v primeru rastlin divjega tipa, ki so imele zelo malo peloda). Rastline Mn1 mn1 smo oprašili s pelodom mn1 (iz rastlin mn1 mn1). V tem primeru je bila generacija potomcev deljena 1 : 1. Polovica potomcev je imela genotip endosperma Mn1 Mn1 mn1 in enak fenotip kot divji tip, saj že ena sama kopija Mn1 gena zadostuje za razvoj normalnega fenotipa (Cheng in sod., 1996). Druga polovica potomcev z genotipom mn1 mn1 mn1 pa je imela fenotip miniature-1 (Slika 3.1). Slika 3.1. Vzgoja rastlin koruze v rastlinjaku in storž koruze z 1 : 1 deljenim potomstvom, 12 DPO. Polovica kariops v storžu ima normalen fenotip (genotip endosperma Mn1 Mn1 mn1), druga polovica pa fenotip miniature-1 (majhne zgubane kariopse, genotip endosperma mn1 mn1 mn1). Iz zgornjega dela storža smo s skalpelom izrezali razvijajoče se kariopse. Na eni od rastlin divjega tipa smo karpelno socvetje oprašili s pelodom mn1; v tem primeru so imeli vsi potomci genotip endosperma Mn1 Mn1 mn1 in fenotip divjega tipa. Iz te rastline smo zaradi pomanjkanja kariops z genotipom endosperma Mn1 Mn1 Mn1 uporabili kariopso 10 DPO (s fenotipom divjega tipa) za analizo stopnje endopoliploidnosti in velikosti celic. Po oprašitvi smo karpelno socvetje spet pokrili z vrečko, na kateri smo označili datum oprašitve in genotipa starševskih rastlin (v primeru samooprašitve samo z Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 21 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 znakom ?). Oploditve se zgodi v enem dnevu po oprašitvi (Kiesselbach, 1949). Čas po oprašitvi smo uporabili kot merilo razvoja kariopse. Starost kariops smo označevali kot »dnevi po oprašitvi« – DPO. Po oprašitvi smo v razmakih po 2 dni s skalpelom izrezovali razvijajoče se kariopse iz storža in jih fiksirali, kot je opisano v poglavju 3.2.1.2. 3.1.3 Vzgoja kalic Kalice koruze divjega tipa (Zea mays L., linija W22) smo gojili v sterilnih in nesterilnih razmerah v prsti in v vodi. Polovico zrn smo površinsko sterilizirali v 25-odstotni (v/v) razredčini komercialnega natrijevega hipoklorita (Šampionka Renče, Slovenija) z destilirano vodo s 15-minutnim mešanjem na magnetnem mešalu. Nato smo zrna sprali s sterilno destilirano vodo, jih sterilno imbibirali in dali kaliti v velike petrijevke na vlažen filtrirni papir. Drugo polovico zrn smo imbibirali v nesterilni vodi in dali kaliti v petrijevke na vlažen filtrirni papir. Kalitev je potekala v temi pri sobni temperaturi. Ko so bile radikule kalic dolge 20–30 mm, smo jih prenesli v sterilizirano ali nesterilizirano prst oziroma vodo. Kalice v vodi smo namestili na stiroporne splave z luknjami; skozi luknjo je rastla primarna korenina, zrno in koleoptila pa sta bila na zraku. V prsti oziroma vodi so kalice rastle še 3 dni v temi, nato smo izmerili dolžino primarne korenine in koreninski vršiček fiksirali v FAA (glej 3.2.1.3). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 22 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.2 Priprava preparatov 3.2.1 Fiksacija rastlinskega materiala 3.2.1.1 Formalin – ocetna kislina – etanol (FAA) FAA (v literaturi opisan kot »formalin acetic acid«) je najpogosteje uporabljani fiksativ v rastlinski histologiji. Sestavljen je tako, da so učinki sestavin na tkivo uravnoteženi. Formalin zamreži proteine in prepreči njihovo precipitacijo v etanolu, skupaj jih naredita netopne, vendar pa dobro ne ohranita nukleoproteinov, zato je za fiksacijo jedra dodana še ocetna kislina. Alkohol skrči celice, ocetna kislina povzroča nabrekanje; alkohol in formalin otrdita tkivo, ocetna kislina pa preprečuje otrditev. FAA dobro ohrani jedra, vendar pogosto skrči protoplaste (Jensen, 1962). Fiksativ smo pripravili tik pred uporabo in ga ohladili na 4 °C, ali pa smo ga krajši čas hranili v hladilniku pri 4 °C. FAA fiksativ (100 ml). Zmešaj 50 ml 96-odstotnega etanola, 35 ml destilirane vode, 10 ml 37-odstotnega formaldehida in 5 ml koncentrirane ocetne kisline (led ocetne kisline). 3.2.1.2 Fiksiranje kariops V rastlinjaku smo razvijajoče se kariopse fiksirali v hladnem fiksativu FAA v 20-mililitrskih stekleničkah na ledu. Pred fiksacijo smo kariopsam odrezali lateralni strani, tako da je ostal okoli 3 mm debel mediani del. Stekleničke smo prenesli v laboratorij in jih izpostavili vakuumu (namizna oljna vakuumska črpalka) za 15 minut, da je iz tkiva izšel zrak. Če se tkivo ni potopilo v fiksativu, ko smo izpustili vakuum, smo ga ponovno vzpostavili in izpustili. Kariopse smo fiksirali 16 do 20 ur pri 4 °C v hladilniku in naslednji dan še 6 ur postfiksirali v Farmerjevem fiksativu (mešanica 3 : 1 absolutni etanol : led ocetna kislina). Po fiksaciji smo tkivo prenesli v 96-odstotni etanol in shranili pri -20 °C. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 23 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.2.1.3 Fiksiranje kalic Pred fiksacijo smo primarne korenine kalic, ki so rastle v prsti, previdno sprali v vodi. Terminalne dele primarnih korenin (približno 3 mm) smo odrezali s skalpelom, prenesli v 20-mililitrske stekleničke s hladnim FAA fiksativom in izpostavili vakuumu (vodna vakuumska črpalka) za 15 minut, da je iz tkiva izšel zrak. Če se tkivo ni potopilo v fiksativu, ko smo izpustili vakuum, smo ga ponovno vzpostavili in izpustili. Koreninske vršičke smo fiksirali 24 ur pri 4 °C v hladilniku. 3.2.2 Priprava rezin 3.2.2.1 Dehidracija vzorcev Vzorce, fiksirane v FAA, smo dehidrirali v seriji razredčin terciarnega butilnega alkohola (TBA; Sigma, ZDA) in etanola, vsak korak po 1 dan. Vzorce, ki so bili shranjeni v 96-odstotnem etanolu smo dehidrirali od 4. koraka naprej. Dehidracija je potekala pri sobni temperaturi, od 6. koraka naprej pa v inkubacijski pečici pri 56–60 °C, ker čisti TBA pri sobni temperaturi kristalizira (temperatura tališča 25,5 °C; ChemFinder.Com, 2003). Med dehidracijo je tkivo ostalo v istih stekleničkah, razredčine smo menjali s plastičnimi pipetami za enkratno uporabo. TBA razredčine (100 ml vsaka): 1. 10 ml TBA, 40 ml 96-odstotnega EtOH, 50 ml dH2O 2. 20 ml TBA, 50 ml 96-odstotnega EtOH, 30 ml dH2O 3. 35 ml TBA, 50 ml 96-odstotnega EtOH, 15 ml dH2O 4. 55 ml TBA, 45 ml 96-odstotnega EtOH 5. 75 ml TBA, 25 ml 96-odstotnega EtOH 6. 100 ml TBA 7. 100 ml TBA (v tem koraku se lahko v TBA doda kapljica safranina ali eozina, ki obarva tkivo, kar olajša rezanje na mikrotomu) 8. 100 ml TBA Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 24 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.2.2.2 Vklapljanje v parafin Stekleničke z vzorci v TBA v inkubacijski pečici smo napolnili s koščki prečiščenega parafina Paraplast Plus (Sherwood Medical, ZDA), ki se je v 24 urah stopil in zmešal s TBA. Stekleničke so ostale odprte, tako da je TBA počasi izhlapeval. Naslednji dan smo parafin/TBA nadomestili s svežim parafinom in nato še dvakrat v razmaku 12 ur. Ko vsebina stekleničke ni imela več vonja po TBA, smo vzorce vključili v parafinske bloke. Vključevanje je potekalo na topli plošči, na kateri je bil iz aluminijaste folije postavljen pokrit in s treh strani zaprt prostor, ki je zadrževal toploto. S pinceto, segreto na alkoholnem gorilniku, smo vzorec iz stekleničke prenesli v staljen parafin v kovinskem modelu, prekrili s plastičnim nosilcem, zalili s parafinom, postavili najprej v mrzlo vodo za 20 minut, nato pa na led, da se je parafinski blok ločil od modela. Parafinske bloke smo shranjevali pri sobni temperaturi, ob težavah pri rezanju (kompresija rezin, parafinski trak se ne oblikuje) pa smo jih ohladili v hladilniku pri 4 °C. 3.2.2.3 Rezanje na mikrotomu Mikroskopske rezine smo pripravili na rotacijskem mikrotomu Autocut 2040 (Reichert-Jung, Nemčija) z zamenljivimi rezili za enkratno uporabo. Parafinski blok smo z britvico trapezoidno obrezali okrog vzorca, tako da sta bili vzporedni stranici bloka vzporedni z rezilom. Ob rezanju se je oblikoval trak, ki smo ga razrezali na majhne skupine rezin. Rezine smo nanesli na destilirano vodo na čistih objektnih stekelcih na topli plošči (40 °C) in pustili, da so se posušile in prilepile na stekelca (navadno okrog 24 ur). Debeline rezin razvijajočih se kariops za merjenje ploidnosti so bile 12 µm za 4. DPO, 16 µm za 6. DPO in 20 µm za 8. do 16. DPO (kompromis med tem, da rezine vsebujejo velika jedra in da se majhna jedra še ne prekrivajo med sabo), enake debeline so bile uporabljene tudi za druga barvanja. Pri barvanju z reakcijo TUNEL so bila rezine kariops debele 10 µm. Debelina rezin koreninskih vršičkov, uporabljenih za merjenje ploidnosti, je bila 16 µm, za imunolokalizacijo SUS1 pa 10 µm. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 25 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.3 Histokemične reakcije 3.3.1 Kvantitativno barvanje DNA po Feulgenu Metodo smo uporabili za merjenje ploidnosti jeder v tkivnih rezinah. Pri barvanju s Feulgenovo reakcijo se jedra rdeče obarvajo po vezavi Schiffovega reagenta na najmanj dve aldehidni skupini, nastali po odstranitvi purinskih baz adenina in gvanina iz DNA s kislo hidrolizo. DNA se s Feulgenovo reakcijo barva kvantitativno (Feulgen in Rossenbeck, 1924). Uporabili smo postopek, prilagojen po Greilhuberju in Temsch (2001), s podaljšanim časom kisle hidrolize zaradi formaldehidne fiksacije (Greilhuber osebna komunikacija; Fox, 1969). Parafinske rezine na objektnih stekelcih smo barvali v Coplinovih kozarcih (prostornina tekočine 40 ml, stekelca stojijo pokončno v raztopini, konec stekelca z oznakami ostane suh). Iz rezin smo najprej odstranili parafin s ksilenom (2 × 5 minut). Nato je sledila rehidracija v vrsti razredčin etanola (100-, 96-, 70-, 30-odstotni, vsak korak po 5 minut, pri sobni temperaturi) do destilirane vode. Hidroliza je potekala v 5 M HCl (kalibrirana razredčina, Merck, Nemčija) 75 minut v vodni kopeli pri 20 °C, nato smo jo ustavili v ledeno mrzli destilirani vodi (5 min). Barvanje s Schiffovim reagentom je trajalo 120 minut pri 20 °C, nato smo prebitek barvila odstranili s spiranjem v SO2-vodi (0,5-odstotni K2S2O5 v 50 mM HCl, 2 × 2 minuti, 2 × 10 minut, 20 minut), rezine sprali v destilirani vodi (3 minute), dehidrirali v obratni etanolni vrsti (vsak korak po 5 minut) do ksilena (2 × 5 minut) in pokrili s krovnim sredstvom za pripravo trajnih preparatov DPX (Fisons, VB) ter krovnim stekelcem. Priprava Schiffovega reagenta. V 800 ml vrele destilirane vode raztopi 4 g pararosanilin klorida (Sigma, ZDA), premešaj in ohladi na 50 °C. Raztopino vakuumsko prefiltriraj prek dvojnega filtra iz steklenih vlaken (GF/C, O 90 mm; Whatman, VB), raztopini dodaj 120 ml 1 M HCl in 12 g K2S2O5 (Merck, Nemčija) in pusti čez noč v temi pri sobni temperaturi. Naslednji dan raztopini dodaj 4 g aktivnega oglja za razbarvanje (Sigma, ZDA), premešaj in nato vakuumsko prefiltriraj prek dvojnega filtra iz steklenih vlaken v suho steklenico (barvilo mora biti prozorno). Schiffov reagent hrani v hladilniku pri 4 °C. Priprava SO2-vode (250 ml). V 248 ml destilirane vode odpipetiraj 2,5 ml 5 M HCl. V digestoriju dodaj 1,25 g K2S2O5 (Merck, Nemčija) in premešaj. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 26 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.3.2 Barvanje DNA z DAPI Fluorokrom DAPI (4’,6’ diamino-2-phenylindole·2HCl) se veže v mali žleb dvoverižne DNA, predvsem na AT zaporedja (Kubista, 1987). Ob vezavi na DNA se fluorescenca DAPI poveča za okoli 20-krat (Barcellona in sod., 1990). Ob ekscitaciji z UV svetlobo (ekscitacijski maksimum 358 nm) oddaja modro fluorescenco (emisijski maksimum 461 nm). V tkivnih rezinah specifično barva jedra. Iz rezin smo odstranili parafin v ksilenu (2 × 5 minut), rezine rehidrirali v padajoči etanolni vrsti (100-, 96-odstotni etanol po 5 minut, 70-, 30-odstotni etanol, destilirana voda po 3 minute) in uravnotežili v McIlvaineovem pufru pH 7 (5 minut). Okoli rezin smo popivnali odvečno tekočino, nanje nanesli raztopino DAPI (600 nM) za barvanje in inkubirali 15 minut v temi pri sobni temperaturi. Nato smo rezine sprali z destilirano vodo in pokrili s krovnim stekelcem. Če je bilo barvanje z DAPI zadnji korak v postopku barvanja (na primer po koncu barvanja z reakcijo TUNEL), smo DAPI dodali v vodni pokrivni medij Gel Mount (Sigma, ZDA). Če preparat ni bil v pufru z vrednostjo pH blizu 7 (na primer McIlvaineov pufer ali PBS), smo preparat uravnotežili z inkubacijo v McIlvaineovem pufru (5 minut). Z objektnega stekelca smo popivnali odvečno tekočino, nanesli dve ločeni kapljici Gel Mount-DAPI in pokrili s krovnim stekelcem. Slike preparatov smo posneli z UV ekscitacijo. Modra barva fluorescence jeder in celičnih sten na črnem ozadju ne omogoča zadostnega kontrasta za natančno pregledovanje slik. Zato smo za boljšo vidljivost struktur v nekaterih primerih slike pretvorili v siv negativ, kot v metodi merjenja velikosti celic (glej 3.6.3.1). Založna raztopina DAPI (1000×). 0,2 mg DAPI (Sigma, ZDA) raztopi v 1 ml destilirane vode. Krajši čas hrani pri 4 °C v temi, za daljše shranjevanje razdeli na alikvote in shrani v zmrzovalniku pri -20 °C. McIlvaineov pufer (pH 7,0). Pred uporabo zmešaj 8 delov 0,2 M Na2HPO4 in 2 dela 0,1 M citronove kisline. Raztopina DAPI (600 nM) za barvanje. 10 µl založne raztopine DAPI razredči v 10 ml McIlvaineovega pufra. Gel Mount-DAPI. V 1 ml Gel Mounta (Sigma, ZDA) odpipetiraj 1 µl založne raztopine DAPI (1000×). Previdno premešaj, da ne vneseš mehurčkov zraka. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 27 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.3.3 Barvanje fragmentirane DNA z reakcijo TUNEL Reakcija TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated X-dUTP nick end labeling) se uporablja za in situ določanje celic, v katerih poteka fragmentacija DNA (na primer v procesu programirane celične smrti). V reakciji terminalna deoksinukleotidil-transferaza (TdT, E.C. 2.7.7.31) veže označene nukleotide na proste 3'-OH konce DNA, neodvisno od predloge, kot kofaktorje pa potrebuje dvovalentne kovinske katione, kot sta Co2+ in Mg2+ (Deng in Wu, 1983; Promega Enzyme resource guide, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, 2003). Za barvanje smo uporabili komplet za določanje jeder s fragmentirano DNA »In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein« (Roche Diagnostics GmbH, Nemčija), ki za detekcijo uporablja nukleotide, označene s fluoresceinom. Iz rezin kariops smo odstranili parafin v ksilenu (2 × 5 minut), rehidrirali rezine v padajoči etanolni vrsti (100-, 96-odstotni etanol po 5 minut, 70-, 30-odstotni etanol, destilirana voda po 3 minute) in rezine obkrožili s PAP pisalom (kot v 3.4.1), navadno dve poskusni rezini in dve rezini za negativno kontrolo. Vsebino celic smo naredili dostopnejšo za reakcijo TUNEL z inkubacijo rezin s proteinazo K (20 µg/ml), kar je trajalo 15 minut pri sobni temperaturi, nato smo rezine sprali s pufrom PBS (2 × 3 minute). Na poskusne rezine smo nanesli mešanico označenih nukleotidov in TdT encima (»Labeling solution« in »Enzyme solution« iz kompleta, pripravljeno tik pred uporabo, 50 µl na preparat), na kontrolne rezine pa le raztopino z označenimi nukleotidi ali PBS. Rezine smo pokrili s koščki Parafilma (American National Can, ZDA) in 60 minut inkubirali v vlažni komori (Slika 3.2) pri 37 °C v temi. Po koncu inkubacije smo parafilm odstranili tako, da smo okoli nanesli toliko pufra PBS, da je parafilmski košček vzplaval na površino pufra in smo ga lahko odstranili s pinceto. Rezine smo sprali v PBS (3 × 3 minute) v Coplinovih kozarcih. Z objektnega stekelca smo odstranili odvečno tekočino, na rezine nanesli Gel Mount-DAPI (kot v 3.3.2) in pokrili s krovnim stekelcem. Zeleno fluorescenco s fluoresceinom označenih nukleotidov smo opazovali z ekscitacijo v modrem delu spektra (450–490 nm), modro fluorescenco DAPI pa z ekscitacijo v UV (365 nm). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 28 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Založna raztopina proteinaze K (100×). 2 mg proteinaze K (GibcoBRL, ZDA) raztopi v 1 ml sterilizirane destilirane vode. Razdeli na alikvote po 10 µl in shrani pri -20 °C. Delovna raztopina proteinaze K (20 µg/ml). V epruveto eppendorf z 10 µl založne raztopine proteinaze K odpipetiraj 970 µl destilirane vode, 10 µl 1 M Tris pH 7,5 (Sigma, ZDA) in 10 µl 0,5 M EDTA (Sigma, ZDA). Založna raztopina PBS (10×). V približno 800 ml destilirane vode raztopi 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,45 g Na2HPO4 in 2,4 g KH2PO4. Z destilirano vodo dopolni do 1000 ml. Mešaj približno 15 minut, da se soli popolnoma raztopijo. Avtoklaviraj in shrani pri sobni temperaturi. Pufer PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 in 1,5 mM KH2PO4). Zmešaj 100 ml založne raztopine PBS (10×) in 900 ml destilirane vode. Uravnaj pH na 7,4 z dodajanjem 1N HCl. ¦ v^ ^=J Slika 3.2. Vlažna komora. Velika petrijevka (O ~20 cm) z nekaj plastmi mokrega filtrirnega papirja na dnu. Objektna stekelca ležijo na gumijastih trakovih, ki preprečujejo premikanje stekelc in neposreden stik z vodo. 3.3.4 Barvanje kondenziranega kromatina s kristal vijoličnim Barvanje s kristal vijoličnim v kombinaciji z barvanjem s safraninom uporabljajo v mikrobiologiji za barvanje po Gramu, v rastlinski citologiji pa jo uporabljajo za barvanje kromosomov v mitozi. Kondenziran kromatin v jedrih se obarva vijolično, citoplazma pa ostane kristalno čista (Jensen, 1962). Rezine smo barvali kot opisujeta Baker in Jordan (1953). Rehidrirane rezine smo barvali 15 minut z 1-odstotno vodno raztopino kristal vijoličnega (Crystal Violet, Merck, Nemčija), sprali z destilirano vodo, nanesli 1-odstotno raztopino I2 v 2-odstotni vodni raztopini KI, sprali z destilirano vodo, na hitro dehidrirali v 70-, 96- in 100-odstotnem etanolu (10 sekund vsak korak), ksilen (2 × 5 min) in pokrili s trajnim pokrivnim medijem Permount (Electron Microscopy Sciences, ZDA) in krovnim stekelcem. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 29 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.3.5 Barvanje kutina in suberina s Sudan IV Barvila Sudan (Sudan B, Sudan III in Sudan IV) se uporabljajo za barvanje lipidov. Barvilo je raztopljeno v alkoholu in prehaja v lipidno fazo v tkivu, kjer je bolje topno (Jensen, 1962). V rastlinskem tkivu se suberin obarva rdeče-oranžno, kutin pa rdeče. Na kutin vezan Sudan IV oddaja močno rdečo fluorescenco ob ekscitaciji z modro svetlobo. Iz rezin smo odstranili parafin v ksilenu (2 × 5 minut), inkubirali v 100- in 96-odstotnem etanolu po 5 minut in nato 20 minut barvali z 0,5-odstotnim Sudan IV v 85-odstotnem etanolu. Preparate smo sprali v 50-odstotnem etanolu (~1 minuta) in pokrili s 50-odstotnim glicerolom in krovnim stekelcem. 3.3.6 Barvanje lignina s floroglucinolom Reakcija s floroglucinolom v 20-odstotni HCl je standardna tehnika za lokalizacijo lignina v rastlinskem tkivu (Johansen, 1940). Lignin v tkivu se obarva rdeče-vijolično. Iz rezin smo odstranili parafin v ksilenu (2 × 5 minut) in jih rehidrirali v etanolni vrsti (100-, 96-, 70-, 30-odstotni etanol) do vode (vsak korak po 5 minut). Nato smo na objektno stekelce nanesli nasičeno raztopino floroglucinola (Phloroglucinol, Sigma, ZDA) v 20-odstotni HCl, pokrili s krovnim stekelcem in takoj posneli slike. 3.3.7 Barvanje kaloze z anilin modro – fluorescenčno metodo Anilin modro – fluorescenčna metoda se uporablja za barvanje kaloze v rastlinskem tkivu (Currier, 1957), zaradi uporabe alkalnega pufra pa smo lahko opazovali tudi premik fluorescenčnega spektra fenolnih kislin iz hidroksicinamične skupine (Harborne, 1998). Preparate, barvane z DAPI (kot v 3.3.2), smo potem, ko smo posneli slike z UV ekscitacijo, postavili v Coplinove kozarce z destilirano vodo za nekaj minut, da so se krovna stekla ločila od preparatov na objektnih steklih. Preparate smo sprali v treh menjavah destilirane vode in nato na rezine nanesli 0,005-odstotno raztopino vodotopnega barvila anilin modro (Aniline Blue, water soluble, Merck, Nemčija) v 0,15 M K2HPO4, pH Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 30 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 8,2. Po 10 minutah smo na preparate namestili krovna stekelca (brez spiranja) in opazovali z UV ekscitacijo. Kalozo smo opazili kot zelene točke v nekaterih celičnih stenah. Zaradi alkalnega medija se je spremenila tudi avtofluorescenca celičnih sten. Modra fluorescenca sten je prešla v svetlo modro in zeleno območje. Vzrok za premik fluorescenčnega spektra celičnih sten je bil samo pH pufra, kar smo potrdili z opazovanjem fluorescence preparatov, inkubiranih v samem 0,15 M K2HPO4, in z naparevanjem preparatov z amonijevimi parami (Harborne, 1998). 3.3.8 Barvanje flavonoidov z Naturstoffreagenz A Naturstoffreagenz A (NST, difenilborova kislina-2-aminoetilester) tvori komplekse s 3-hidroksi flavoni, katerim se po vezavi batokromno premakne absorbcijski maksimum (Jork in sod., 1989). Flavonoidi z UV ekscitacijo oddajajo zeleno-rumeno do oranžno fluorescenco. Iz rezin smo odstranili parafin v ksilenu (2 × 5 minut) in jih rehidrirali v etanolni vrsti (100-, 96-, 70-, 30-odstotni etanol) do vode (vsak korak po 5 minut). Na rehidrirane rezine smo nanesli 1 % Naturstoffreagenz A (Sigma, ZDA) v metanolu. Ker je metanol hitro hlapel, smo po minuti inkubacije dodali še kapljico destilirane vode, da se rezine niso izsušile. Sprememba v fluorescenci flavonoidov je vidna takoj po dodatku Naturstoffreagenz A. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 31 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.4 Imunohistokemične reakcije 3.4.1 Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 Imunolokalizacijo izocima saharoza sintaze SUS1 smo izvedli s primarnimi poliklonskimi zajčjimi protitelesi proti SUS1, pripravljenimi v laboratoriju dr. Prema S. Choureyja (Echt in Chourey, 1985), in kompletom za imunolokalizacijo »HistoGold« za iskanje zajčjih primarnih protiteles (Zymed Laboratories, ZDA). Sekundarna protitelesa iz kompleta so konjugirana s 5 nm delci koloidnega zlata. Ti delci so jedra za precipitacijo elementarnega srebra, ki naredi mesta vezave sekundarnih protiteles vidna s svetlobno mikroskopijo. Z detekcijsko metodo, za katero je v rabi koloidno zlato, se izognemo težavam z nespecifičnimi reakcijami, ki lahko nastanejo pri uporabi sekundarnih protiteles, konjugiranih z alkalno fosfatazo ali peroksidazo. Ves postopek imunolokalizacije smo izvedli pri sobni temperaturi. Rehidracija, dehidracija in spiranje v PBS je potekalo v Coplinovih kozarcih. Iz rezin koreninskih vršičkov smo odstranili parafin s ksilenom (2 × 5 minut). Ksilen je treba pogosto menjati (na približno 20 preparatov), da učinkovito raztopi parafin. Rezine smo rehidrirali v padajoči etanolni vrsti (100-, 96-, 70-, 30-odstotni etanol, vsak korak po 5 minut) do destilirane vode in uravnotežili v pufru PBS (pH 7,4). Okoli rezin smo popivnali odvečno tekočino in dve skupini rezin obkrožili s PAP pisalom (Zymed Laboratories, ZDA), ki naredi hidrofobno pregrado okrog rezin. Ta preprečuje mešanje reagentov na stekelcu in obenem omogoči porabo čim manjše količine reagentov. Prva skupina rezin (navadno dve rezini) je bila poskusna, inkubirali smo jo s primarnimi protitelesi; druga je bila kontrolna, inkubirali smo jo z neimunim zajčjim serumom (ne vsebuje protiteles proti SUS1). Nespecifična vezavna mesta za protitelesa smo deaktivirali z inkubacijo v raztopini »Blocking solution« iz kompleta (10 minut) in nato poskusne rezine inkubirali v razredčini primarnih protiteles 1 : 500 v PBS v vlažni komori (velika petrijevka z nekaj plastmi vlažnega filtrirnega papirja, Slika 3.2), kontrolne rezine pa z enako razredčino neimunega zajčjega seruma (30 minut pri sobni temperaturi). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 32 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Rezine smo sprali v PBS (3 × 5 minut) in jih nato inkubirali v razredčini sekundarnih protiteles iz kompleta (kozja protitelesa proti zajčjim protitelesom), sprali v PBS (3 × 5 minut) in inkubirali v sveže pripravljeni raztopini »SilvEnhance« iz kompleta. Iz omenjene raztopine se izloči srebro, ki se veže na delce zlata na sekundarnih protitelesih in jih poveča, da postanejo vidni s svetlobnim mikroskopom. Reakcijo nalaganja srebra smo pustili teči toliko časa, da je postalo barvanje rezin vidno (okoli 5 minut), nato smo jih sprali v destilirani vodi in dehidrirali v obratni etanolni vrsti do ksilena in preparat pokrili s krovnim sredstvom za pripravo trajnih preparatov Permount (Electron Microscopy Sciences, ZDA) ter krovnim stekelcem. Založna raztopina PBS (10×). V približno 800 ml destilirane vode raztopi 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,45 g Na2HPO4 in 2,4 g KH2PO4. Z destilirano vodo dopolni do 1000 ml. Mešaj približno 15 minut, da se soli popolnoma raztopijo. Avtoklaviraj in shrani pri sobni temperaturi. Pufer PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 in 1,5 mM KH2PO4). Zmešaj 100 ml založne raztopine PBS (10×) in 900 ml destilirane vode. pH uravnaj na 7,4 z dodajanjem 1 N HCl. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 33 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.5 Mikroskopija Za opazovanje preparatov smo uporabljali mikroskop Axioskop 2 MOT (Carl Zeiss, Nemčija), opremljen s halogensko osvetlitvijo (HAL 100) za presevno vidno svetlobo in osvetlitvijo z žarnico z živosrebrovim lokom (HBO 50), ki oddaja svetlobo že v UV delu svetlobnega spektra, za osvetlitev preparata skozi objektiv (vzbujanje fluorescence). Mikroskop je bil opremljen z dvema kompletoma filtrov za fluorescenco: prvi (UV ekscitacija) je imel ekscitacijski filter 365 nm (band pass), delilnik žarkov pri 395 nm in emisijski filter 397 nm (long pass); drugi (modra ekscitacija) pa je imel ekscitacijski filter 450-490 nm (band pass), delilnik žarkov pri 510 nm in emisijski filter 515 nm (long pass). Objektiva, uporabljena pri zajemu slike, sta bila 10× (Plan Neofluar Ph1, NA=0,30; Carl Zeiss, Nemčija) in 40× (Plan Neofluar Pol, NA=0,85; Carl Zeiss, Nemčija) Za zajem slike smo uporabljali barvno CCD (charge coupled device) video kamero (DXC-950P, Sony, Japonska) z ločljivostjo 768 × 576 pikslov in s kartico Matrox Meteor za zajemanje slike v računalniku, ter barvno digitalno CCD kamero (AxioCam MRc, Carl Zeiss Vision, Nemčija) z ločljivostjo 1300 × 1030 pikslov. Video kamero DXC-950P smo uporabili pri meritvah IOG jeder v preparatih koreninskih čepic in kariops, intenzitete imunolokalizacijskega barvanja v koreninski čepici ter velikosti celic v koreninski čepici in preparatih kariops 16. DPO. Digitalno kamero AxioCam MRc smo uporabili pri meritvah velikosti celic v preparatih kariops od 4. do 12. DPO in pri zajemu slik preparatov, pobarvanih z DAPI, reakcijo TUNEL, anilin modro – fluorescenčno metodo, Sudan IV in floroglucinolom ter avtofluorescence celičnih sten. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 34 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.6 Kvantitativna analiza slike Mikrografije, zajete s kamero, smo obdelovali v programskem paketu za analizo slike KS400 (Carl Zeiss Vision, Nemčija). Od mnogih zmožnosti, ki jih ima program, smo uporabljali funkcije za zajem slike, operacije za obdelavo celotne slike in računanje s slikami, avtomatsko določanje objektov na sliki s segmentacijo, ročno določanje objektov, merjenje različnih morfoloških parametrov objektov in denzitometrijo. Program smo uporabljali tudi samo kot avtomatsko zapisovalno napravo pri ročnem štetju in merjenju dolžin ter širin. V KS400 smo napisali makro programe za avtomatizacijo daljših postopkov za analizo slike. 3.6.1 Denzitometrična meritev količine DNA Osnova za kvantitativno oceno količine DNA v jedrih je postopek barvanja po Feulgenu, ki stehiometrično barva DNA (glej 3.3.1). Jakost obarvanja merimo fotometrično z uporabo monokromatske svetlobe. Od količine barvila v objektu je odvisno, koliko svetlobe absorbira. S kamero na mikroskopu lahko merimo intenziteto svetlobe, ki pride skozi objekt, in jo primerjamo z intenziteto vpadne svetlobe. Iz razmerja nato izračunamo optično gostoto objekta, ki je linearno sorazmerna s količino barvila v objektu. Merilni sistem mora biti umerjen na znane vrednosti transmisije, zajem slike pa mora biti enakomeren po vsem vidnem polju. Transmitanca je razmerje med intenziteto vpadne svetlobe I0 in intenziteto izhodne svetlobe I in je neodvisna od absolutne intenzitete vhodne svetlobe: I T = (3.1) I0 Iz transmitance izračunamo absorbanco: A = -log10 T (3.2) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 35 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Absorpcija svetlobe je premosorazmerna s koncentracijo snovi in dolžino poti svetlobe skozi snov (Lambertov zakon – debelina snovi, Beerov zakon – koncentracija; »več piva spiješ, bolj se ti stemni«): A = K c d (3.3) K - ekstinkcijski koeficient, konstanta, označuje sposobnost snovi za absorpcijo fotonov; c - koncentracija snovi v vzorcu, d - dolžina poti svetlobe skozi vzorec Če je presek svetlobnega žarka, s katerim merimo absorpcijo, vedno enak, lahko absorbanco A izrazimo kot optično gostoto (OG), produkt c×d pa je v linearnem sorazmerju s količino barvila v prostornini vzorca, skozi katero potuje žarek. Ker želimo izmeriti le relativno količino DNA v jedrih, lahko konstanto K zanemarimo, linearno sorazmerje produkta c×d pa zadostuje za relativno meritev. Torej lahko iz enačb (3.1) in (3.2) izpeljemo: OG = log10— (3.4) Ker pa je struktura jeder nehomogena, kar zadeva koncentracijo DNA in debelino, ne moremo preprosto izmeriti transmisije skozi celotno jedro in to uporabiti za izračun OG jedra. Tako bi izmerili le povprečno intenziteto svetlobe, ki pride skozi jedro, vendar je zaradi logaritemskega razmerja med transmisijo in absorpcijo taka meritev napačna. Za jedro, razdeljeno na n delov, velja (seveda le, če so izmerjene intezitete posameznih delov jedra različne): n log^= ? = log— (3.5) Zato pri meritvi relativne količine DNA v jedrih uporabimo najmanjše elemente slike -piksle. V tem primeru je površina piksla tudi presek svetlobnega žarka, s katerim merimo OG posameznih delov jedra. Za vsak piksel v jedru iz njegove sive vrednosti izračunamo OG, ki jih seštejemo tako, da dobimo integrirano optično gostoto (IOG). IOG je linearno sorazmerna s količino DNA v jedru. Ker računamo s slikami, lahko tudi za vrednost intenzitete vpadne svetlobe vzamemo sivo vrednost piksla iz slike ozadja, ki je na istem Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 36 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 mestu kot piksel v jedru. Kot intenziteto vpadne oziroma presevne svetlobe vzamemo sivo vrednost piksla, saj sta v denzitometrično umerjenem sistemu linearno odvisni, z izhodiščem v (0, 0). IOG = log 0i (3.6) ?n II i=1 i n – število pikslov v jedru, Ii – intenziteta prepuščene svetlobe skozi jedro na mestu piksla i, I0i – intenziteta vpadne svetlobe na mestu piksla i. Enačbe za izračun transmisije in absorbance veljajo za absorpcijo monokromatske svetlobe, pa tudi absorpcija svetlobe v kompleksu DNA-Schiffov reagent je spektralno odvisna. Absorpcijski maksimum za jedra, barvana z reakcijo po Feulgenu, je pri 565 nm (Bedi in Goldstein, 1976). Zato je bil v svetlobni poti (pod kondenzorjem) nameščen zelen filter (band pass interferenčni filter, z vrhom transmisije pri 540 nm in širino vrha pri polovični transmisiji 90 nm), sive slike pa so bile zajete z zelenim kanalom kamere. 3.6.1.1 Umeritev sistema in odprava napak na zajeti sliki Za dobro meritev morata biti optimalno nastavljena že vir svetlobe in optična pot v mikroskopu. Žarnica mora biti centrirana, elementi optične poti v mikroskopu pa morajo biti nastavljeni po navodilih za Köhlerjevo osvetlitev. Na kamera mora biti izključeno ojačanje signala (gain 0 dB), da je naključni šum čim manjši, in izključena mora biti gama korekcija, da je odziv kamere linearen v večini njenega dinamičnega območja. Za denzitometrično merjenje IOG vrednosti jeder mora biti merilni sistem natančno umerjen; zajeta slika mora biti čim bolj enakomerno osvetljena, sive vrednosti, ki jih zajame kamera, pa je treba umeriti na vrednosti transmisije. Pred meritvijo vsakega preparata smo sistem kalibrirali, kot opisujeta Vilhar in Dermastia (2002). Za umeritev sistema so uporabili v našem laboratoriju napisane makre v KS400. Pri zajemu slike s čipom CCD in digitalizacijo signala s kartico za zajem slike v računalniku je vedno prisoten šum kot naključen odmik vrednosti pikslov v sliki od prave vrednosti, ki pa ga lahko nevtraliziramo z izračunavanjem povprečij zaporedoma zajetih Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 37 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 slik (Russ, 1999). Zato smo za vsako sliko, ki smo jo uporabili pri meritvi, zajeli 32 slik s hitrostjo, kot jo dopušča sistem, in izračunali povprečja po parih. Po prvem povprečevanju je ostalo 16 slik, nato 8, 4, in 2, na koncu je ostala le ena slika, v kateri so bile naključne variacije v vrednostih pikslov izravnane. Neenakomerno osvetlitev vidnega polja (pojav senčenja) smo izravnali s korekcijo slike kot jo opisujejo Pirard in sod. (1999). Če je bila napaka zelo izražena, smo jo popravili s centriranjem žarnice in ponovno nastavitvijo Köhlerjeve osvetlitve. Po postopku izravnave slike smo dobili sliko ozadja, s katero smo preračunali vsako zajeto sliko v meritvi in dobili enakomerno osvetljeno sliko s sivimi vrednostmi, razporejenimi od 0 do izbrane najvišje vredosti, v tem primeru 220. Zagotoviti je treba tudi linearno odvisnost med sivimi vrednostmi na sliki in resničnimi vrednostmi transmisije. Uporabljena video kamera ima dobro linearnost odziva, ki pa jo z denzitometrično kalibracijo še izboljšamo. Kamero smo denzitometrično umerili s kompletom filtrov nevtralne gostote (79 %, 70 %, 63 %, 50 %, 35 %, 20 %, 10 %, 5 % in 2,5 %) ki smo jih zaporedoma polagali v optično pot (v tem primeru na poljsko zaslonko) in zajemali slike praznega polja. Za vrednost transmisije 100 % smo zajeli sliko praznega polja brez uporabe filtrov, za vrednost transmisije 0 % pa smo zajeli sliko pri zaprti optični poti. Iz vrednosti transmisije in izmerjenih sivih vrednosti smo naredili umeritveno krivuljo (Slika 3.3), s pomočjo katere smo v meritvi pretvorili vsako sliko, v kateri so sive vrednosti potem ustrezale vrednostim transmisije. Polinom tretje stopnje je zadovoljivo sledil točkam umeritvene krivulje tudi v temnem območju kamere, kjer je odziv najbolj nelinearen. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 38 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0 Izmerjena OG 1,5 1 0,5 0 50 100 150 200 Izmerjena siva vrednost 250 0 -- 0,5 -- 1,5 Slika 3.3. Razmerje med izmerjeno sivo vrednostjo in resnično vrednostjo transmisije, ki jo predstavlja siva vrednost, ter optična gostota (OG), izračunana iz transmisije. Prikazana je tipična kalibracijska krivulja. Skozi umeritvene točke je položen polinom tretje stopnje, s katerim je pred meritvami generirana pretvorbena preglednica. Vsaka zajeta slika v meritvi je s pomočjo vrednosti iz preglednice prilagojena tako, da sive vrednosti v njej ustrezajo resničnim vrednostim transmisije (siva vrednost 0 ustreza transmisiji 0 %, vrednost 220 pa transmisiji 100 % in optični gostoti 0 - vrednost ozadja). 3.6.1.2 Merjenje stabilnosti osvetlitve Drsenje jakosti osvetlitve smo spremljali podobno, kot opisujeta Vilhar in Dermastia (2002) ter Puech in Giroud (1999). Osvetlitev je bila nastavljena na vrednost ozadja (okoli 220). Vsako minuto je bili zajeti slika in izmerjena povprečna siva vrednost v celotni sliki in v petih poljih, velikih četrtino velikosti slike (levo zgoraj, levo spodaj, desno zgoraj, desno spodaj in v centru). Za meritev je bila uporabljena slika, izračunana kot povprečje 32 zaporedoma zajetih slik, tako da v meritvah sivih vrednosti ni bilo odstopanj zaradi elektronskega šuma. Razlike v sivih vrednostih med posameznimi deli slike so posledica neenakomerne osvetlitve vidnega polja (pojav senčenja) in so bile v meritvi IOG izravnane s korekcijo senčenja (Slika 3.4). Za oceno elektronskega šuma (readout noise, šum pri prenosu in digitalizaciji signala) pa so bile uporabljene vrednosti pikslov v centru 32-ih slik. ker so bile zajete z največjo hitrostjo, se v vrednostih pikslov ne odraža drsenje jakosti 2 1 2 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 39 osvetlitve s časom. Koeficient variacije pokaže velikost elektronskega šuma in se s časom ni spreminjal (Slika 3.5). 230 229 228 227 226 225 224 223 222 221 220 219 II levo spodaj sredina levo zgoraj cela slika desno spodaj desno zgoraj povpr. siva vrednost centralni piksel 0 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 Čas (min) Slika 3.4. Nihanje jakosti osvetlitve in neenakomerna osvetlitev vidnega polja (brez korekcije senčenja). Kamera in žarnica prižgani tik pred merjenjem. Drsenje osvetlitve je največje ob ogrevanju, nato se ustali. Desno zgoraj so prikazana polja na sliki, v katerih je bila izračunana povprečna siva vrednost. Po korekciji senčenja se sive vrednosti v vseh delih slike izenačijo. 232 230 228 226 224 222 220 1,4% 1,2% 1,0% 0,8% 0,6% 0,4% 0,2% 0,0% 0 120 240 360 480 600 720 Čas (min) Slika 3.5. Siva vrednost in koeficient variacije pikslov v centru zaporedoma zajetih slik. Nihanje sive vrednosti piksla v centru merjene slike (32 slik, zajetih s hitrostjo sistema) in koeficient variacije vrednosti sredinskega piksla v 32 zajetih slikah vsako minuto. Siva vrednost piksla v centru 32 zaporedoma zajetih slik pri času 120 min, CV = 0,71 %; najmanjša vrednost = 223, največja vrednost = 229. Velikost elektronskega šuma (izražen kot koeficient variacije, CV) se ne spreminja s časom. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 40 3.6.1.3 Merjenje relativne količine DNA v tkivnih rezinah Relativno količino DNA v jedrih v tkivnih rezinah smo merili z »metodo interfaznega vrha« (Vilhar in sod., 2001), ki smo jo priredili za uporabo na rezinah, tako da se v meritvi poleg IOG in površine preseka jeder zapisujejo tudi absolutne koordinate jeder v prerezu tkiva. Pred meritvijo vsakega preparata smo sistem umerili s korekcijo senčenja in denzitometrično kalibracijo. Čeprav je bil postopek barvanja preparatov in merjenja standardiziran, smo IOG jeder primerjali le znotraj enega preparata (zaradi neznane variabilnosti med posameznimi barvanji in merjenji). Med preparati smo primerjali relativno količino DNA, izraženo v enotah C; 1 C je količina DNA v nepodvojenem haploidnem genomu. Vrednost C smo ocenili iz frekvenčne porazdelitve vrednosti IOG v diploidnem tkivu (embrio, perikarp ali nucel) tako, da smo vrednost 2 C priredili modusu prvega vrha porazdelitve IOG, nato pa vrednosti IOG vseh jeder preračunali v enote C. Ker se količina DNA z večanjem stopnje ploidnosti podvaja, smo vrednosti IOG pred izračuni porazdelitev logaritemsko transformirali; tako so bili vrhovi porazdelitev IOG enako oddaljeni (Slika 3.6). Jedra smo razdelili na posamezne skupine, ki ustrezajo stopnjam ploidnosti, tako da smo določili meje na aritmetični sredini med dvema zaporednima modusoma vrhov frekvenčne porazdelitve logaritmirane IOG. 150 100 50 100 200 300 400 500 600 700 IOG 150 100 50 23 log10 (IOG) Slika 3.6. Vpliv logaritemske transformacije na frekvenčno porazdelitev IOG vrednosti. Prikazana je frekvenčna porazdelitev IOG jeder, izmerjena v vzdolžni rezini koreninske čepice. 0 0 0 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 41 IOG jeder smo merili v vidnih poljih, ki so si sledila v obliki meandrov (Slika 3.7), tako da je bil pokrit celoten preparat. Za merjenje IOG smo uporabljali objektiv 40×, kar je kompromis med tem, da je v vsakem vidnem polju vsaj kakšno jedro, in tem, da je slika jedra sestavljena iz zadostnega števila pikslov za natančno meritev IOG. Pri taki povečavi je bila velikost vidnega polja 250×188 µm (uporabljena video kamera DXC-950P, Sony). Izračun koordinat je potekal po naslednjih enačbah: X = MarkerX + (CGRAVX - FrameMarkerX) Y = MarkerY - (CGRAVY - FrameMarkerY) (3.7) (3.8) X, Y - absolutni koordinati jedra v preparatu; MarkerX, MarkerY - absolutni koordinati referenčnega jedra, ki je izbrano v vsakem vidnem polju; CGRAVX, CGRAVY - relativni koordinati središča merjenega jedra v sliki; FrameMarkerX, FrameMarkerY - relativni koordinati referenčnega jedra v sliki. Vsi parametri na sliki so bili merjeni v mikrometrih. Ker je koordinatni sistem računalniške slike »obrnjen na glavo« (izhodišče je v zgornjem levem kotu, Y koordinate se večajo od zgoraj navzdol), je pri izračunu Y koordinate (enačba 3.8) pred oklepajem minus. Tako smo izračunavali koordinate glede na naravni koordinatni sistem, ki ima izhodišče v spodnjem levem kotu (glede na pozitivne X in Y koordinate). > < > < > < > < -^ Slika 3.7. Premikanje po preparatu z izbiranjem jeder. V vsakem vidnem polju (pravokotniki) je treba izbrati jedro (siva pika v vsakem pravokotniku), premakniti vidno polje na naslednji položaj na preparatu in spet izbrati isto jedro. Na tak način se koordinate merjenih jeder preračunavajo glede na celoten preparat. Smer premikanja po preparatu je nakazana s puščicami. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 42 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.6.2 Kvantitativno ovrednotenje imunolokalizacijskega barvanja Sprejeto v objavo v Canadian Journal of Botany. 3.6.2.1 Prikaz imunolokalizacijskega barvanja s psevdobarvami Preparate, pobarvane z imunolokalizacijskim barvanjem za SUS1, smo posneli v svetlem polju kot sivo sliko z objektivom 10× in video kamero DXC-950P. V različnih ponovitvah imunolokalizacije je bila intenzivnost barvanja lahko zelo različna, ker je reakcija ojačanja signala z nalaganjem elementarnega srebra na zlato, vezano na sekundarna protitelesa, dokaj nepredvidljiva zaradi hitrega poteka in nestabilnih reagentov. Zaradi primerljivosti porazdelitve imunolokalizacijskega barvanja med preparati smo območje sivih vrednosti, kjer je bil signal, raztegnili od 0 do 255 in nato slike prikazali v psevdobarvah, kjer smo lestvico sivih vrednosti (svetlost) nadomestili z barvno lestvico (Slika 3.8). S podobno lestvico psevdobarv smo prikazali tudi velikost celic in stopnjo endopoliploidnosti v endospermu. Uporaba psevdobarv olajša zaznavanje manjših razlik v svetlosti slike (Russ, 1999). Na izbranih preparatih smo kvantitativno ocenili število in položaj celic, v katerih je imunolokalizacijski signal bolj viden (opisano v poglavju 3.6.4). Kontrolne rezine na istem stekelcu smo posneli z enakimi nastavitvami in razpon sivih vrednosti prilagodili na enake vrednosti kot v poskusnih rezinah, inkubiranih s primarnimi protitelesi proti SUS1. 255 Slika 3.8. Pretvorba sivih vrednosti na sliki v psevdobarve. 3.6.2.2 Kvantitativno ovrednotenje imunolokalizacijskega barvanja v posameznih celicah v čepici Sivo sliko imunolokalizacijskega barvanja v koreninski čepici smo obdelali s filtrom, ki vsakemu pikslu priredi mediano vrednost pikslov v njegovi okolici. Tako smo zmanjšali lokalne variacije v sivih vrednostih pikslov zaradi metodološkega šuma. S pomočjo slike 0 siva vrednost Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 43 obrisov celic, dobljene pri merjenju velikosti celic (3.6.3, Slika 3.13), smo sliko imunolokalizacijskega barvanja razdelili na posamezne celice. V njih smo izmerili najmanjšo sivo vrednost in to uporabili kot oceno relativne količine SUS1 proteina v celici. Celice smo razvrstili v dva razreda, šibko in močno pobarvane celice, ki sta po naši predpostavki v čepici zavzemala enako prostornino. Za vsak preparat koreninske čepice smo določili mejno sivo vrednost; celice z najmanjšo sivo vrednostjo od 0 (0 je črna barva) do mejne vrednosti smo razvrstili v razred močno pobarvanih celic, »veliko SUS1«, celice z višjimi sivimi vrednostmi (do 255, ki je bela barva) pa v razred šibko pobarvanih celic, »malo SUS1« (Slika 3.9). A v _ i 100 µm B \s ¦ X ;*. ' -'A . • ¦ D 10 - 0 0 50 100 150 200 250 Najmanjša siva vrednost Slika 3.9. Kvantitativno ovrednotenje imunolokalizacijskega barvanja za saharoza sintazo SUS1. Zajeta siva slika (A), slika, obdelana s filtrom mediana (B), slika B z dodanimi obrisi celic (C), frekvenčni poligon izmerjenih sivih vrednosti v celicah na sliki C, s prekinjeno črto je označena mejna vrednost (D). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 44 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.6.2.3 Povezava imunolokalizacijskega signala s ploidnostjo celic Na istih rezinah ni mogoče hkrati izvesti kvantitativnega barvanja DNA in imunolokalizacije, ker metodi nista združljivi. Zato smo imunolokalizacijski signal za SUS1 in relativno količino DNA v celicah koreninske čepice povezali na osnovi položaja posameznih celic v različnih vzdolžnih rezinah. Podatke za vse rezine smo enako orientirali in postavili izhodišče koordinatnega sistema (0, 0) v sredinsko, najnižjo točko meje med čepico in telesom korenine. Koordinate celic v rezini, pobarvani po Feulgenu, smo položili prek koordinat celic v rezini, pobarvani z imunolokalizacijo. Na vsako od treh rezin, pobarvanih z imunolokalizacijo, smo zaporedoma položili podatke za šest rezin, pobarvanih po Feulgenu. Vsaki imunobarvani celici smo določili stopnjo ploidnosti kot mediano šestih podatkov za ploidnost celic, ki so bile najbližje v vsaki od šestih rezin, barvanih po Feulgenu. Na enak način smo vsaki celici z znano stopnjo ploidnosti določili stopnjo imunobarvanja za SUS1 (označili z »malo SUS1« ali »veliko SUS1«) kot mediano treh podatkov za imunobarvanje. S tem postopkom smo za vsako celico v devetih preiskovanih rezinah koreninskih čepic določili stopnjo ploidnosti in stopnjo imunolokalizacijskega barvanja za SUS1. 3.6.3 Meritev velikosti 3.6.3.1 Meritev velikosti celic Za merjenje velikosti celic smo izrabili avtofluorescenco celičnih sten ob ekscitaciji z UV svetlobo valovne dolžine 365 nm. Nepobarvane celične stene so z UV ekscitacijo oddajale modro fluorescenco zaradi vezanih fenolnih kislin (Lichtenthaler in Schweiger, 1998). Preparate koreninske čepice in preparate kariops 16 DPO smo merili z video kamero DXC-950P, druge preparate kariops (4 do 12 DPO) pa z digitalno kamero AxioCam MRc, ki je bolj občutljiva in zato primernejša za zajem fluorescenčne svetlobe. Za meritve smo uporabljali objektiv 10×. Pri taki povečavi je bila velikost vidnega polja 1003×752 µm (video kamera DXC-950P) oziroma 1379×1092 µm (digitalna kamera AxioCam MRc). V vsakem vidnem polju smo zajeli sliko fluorescence celičnih sten z UV ekscitacijo in sliko v presevni svetlobi s priprto zaslonko kondenzorja (sliko smo potrebovali predvsem za Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 45 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 orientacijo v preparatu). Nato smo sliko fluorescence celičnih sten pretvorili v sivo sliko, raztegnili kontrast in pretvorili v negativ. Tako smo dobili sliko temnih sten na svetlem ozadju, kar se je pokazalo kot najprimernejši kontrast za razločevanje struktur na sliki. Kadar je bila slika fluorescence dvoumna, smo jo lahko med meritvijo primerjali s sliko preparata, posneto v svetlem polju. Celice smo merili tako, da smo prek grafične tablice NewSketch 1212 III (Genius, Tajvan) obrisovali njihove stene (Slika 3.14 A) in beležili površino, najmanjši in največji premer prereza celic ter koordinate centra celic. Absolutne koordinate celic v preparatu smo računali kot v poglavju 3.6.1.3. Pozneje smo sliko obrisov celic uporabili za razdelitev slike imunolokalizacijskega barvanja v koreninski čepici na posamezne celice za količinsko ovrednostenje barvanja v celicah (glej 3.6.4) in za oceno 3-D strukture endosperma (glej 3.6.4.4). Prostornino posameznih celic smo v primeru koreninske čepice ocenili kot kvader (produkt površine prereza celice in najmanjšega premera), prostornino celic v endospermu pa kot kroglo (polmer smo izračunali iz površine prereza celice). Ker so celice v meristemu koreninske čepice sploščene v vzdolžni smeri, smo njihovo prostornino ocenili kot produkt površine prereza celice in največjega premera. Na tak način smo izračunali prostornino celic, katerih površina prereza je bila manjša od 180 µm2 (Bengough in sod., 2001). 3.6.3.2 Meritev velikosti koreninskih vršičkov Vzdolžne rezine koreninskih čepic smo barvali po Feulgenu in merili dolžino in širino čepice, število celic v liniji od meristema do konice čepice, površino prereza čepice od konice do meristema, število jeder v prerezu, širino telesa korenine in število celičnih linij v korenini na razdalji 300 µm od meristema (Slika 3.10). Za vsako obdelavo kalic smo izmerili parametre v petih preparatih koreninskih vršičkov, in sicer na dvanajstih zaporednih rezinah za vsak preparat. Mediano rezino smo poiskali na podlagi dolžine čepice, pomagali smo si tudi s površino prereza čepice, številom jeder v prerezu in številom celic v liniji od meristema do konice čepice. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 46 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 3.10. Merjeni parametri v koreninskem vršičku. V koreninskih vršičkih koruze smo merili: dolžino in širino čepice, število celic v liniji od meristema do konice čepice, površino prereza čepice od konice do meristema, število jeder v prerezu, širino telesa korenine in število celičnih linij v korenini na razdalji 300 µm od meristema. 3.6.4 Obdelava podatkov 3.6.4.1 Odstranjevanje dvojnikov Dvojniki so dvakrat izmerjeni podatki (IOG ali velikost celic) v istih celicah, ker se vidna polja v meritvah delno prekrivajo. Koordinate dvakrat izmerjenih podatkov so bile blizu skupaj, niso pa bile popolnoma enake. Zato smo vse podatke primerjali po metodi najbližjega soseda, ki vsakemu podatku poišče podatek, ki mu je najbližji. Iz vsakega para, kjer sta bila podatka preblizu skupaj, smo nato izločili en podatek. Mejno vrednost smo določili za vsako serijo podatkov iz enega preparata posebej; navadno je bila najmanjša dovoljena razdalja med dvema podatkoma 5 µm. Podatke za velikost celic smo še dodatno »očistili«. Uporabili smo dodatno merilo, po katerem je morala biti razdalja med centroma dveh celic večja kot polovica najmanjšega kalipernega premera vsake od celic. Merilo ni bilo ostro, da nismo izločili celic z delno prekrivajočimi se obrisi (Slika 3.11). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 47 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 X 5 µm 0€) S Slika 3.11. Prepoznavanje dvojnikov pri merjenju IOG in velikosti celic. Sliki dveh jeder, med katerima je razdalja manj oziroma več kot 5 µm (levo). Sliki dveh celic, med katerima je razdalja manjša oziroma večja od polovice najmanjšega premera celice (desno). Kjer sta podatka preblizu skupaj (označeno z x), je treba enega od njiju zbrisati. 3.6.4.2 Povezava podatkov za ploidnost in velikost celic Na preparatih smo najprej izmerili ploidnost jeder, nato pa še velikost celic. Podatke, iz katerih smo odstranili dvojnike, smo poravnali v preglednici v programu Excel (Microsoft Corporation, ZDA) na podlagi njihovih koordinat v preparatu. Po potrebi smo podatke zavrteli in premaknili (po enačbah 3.9 in 3.10), nato pa z metodo najbližjega soseda povezali podatke za ploidnost celic z velikostjo celic. Ker v nekaterih prerezanih celicah na preparatu ni bilo jeder ali pa so bila le-ta poškodovana, smo podatek za ploidnost najprej priredili celicam, ki vsebujejo jedra, nato pa preostalim celicam priredili vrednosti za ploidnost njihovih najbližjih sosedov. xrot = xcos? + ysin?+xp (39) yrot = ycos?-xsin ? +yp (310) xrot, yrot - koordinati x in y, zavrteni za kot (p okrog koordinatnega izhodišča (0, 0) in premaknjeni za xp, yp. 3.6.4.3 Ocena tridimenzionalne porazdelitve celic v koreninski čepici Ker so mnoga rastlinska tkiva radialno simetrična, lahko njihovo tridimenzionalno strukturo ocenimo iz vzdolžnega prereza. Število celic v koreninski čepici smo ocenili po prirejenem postopku, ki ga opisujejo Bengough in sod. (2001). Število celic smo ocenili tako, da smo za vsako celico v rezini izračunali, kolikokrat se lahko pojavi v loku, ki Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 48 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 ustreza polovici obsega kroga (?) s središčem v osi simetrije rezine in polmerom, ki ustreza razdalji centra celice od osi simetrije (Enačba 3.11 in Slika 3.12). N=? i=1 n ?r di (3.11) Vi J N – ocena števila celic v koreninski čepici, n – število celic v vzdolžni rezini, ri – razdalja centra celice od osi simetrije rezine, di – premer celice v pravokotni smeri glede na os simetrije. 200 400 600 800 200 400 600 800 200 400 - 600 - 800 200 400 600 800 Slika 3.12. Celice koreninske čepice v vzdolžnem prerezu in ocena števila celic v prečnem prerezu. Premer simbolov ustreza premeru celic. Prikazana je razporeditev izmerjenih celic v vzdolžni rezini (A) in ocenjena razporeditev celic v prečni rezini (B) na višini, označeni s prekinjeno črto na sliki A. Enote na oseh so v mikrometrih. Celice v koreninski čepici so večinoma podaljšane v vzdolžni smeri vzporedno z osjo simetrije čepice. Zato smo kot premer celice di v zgornji enačbi vzeli kar najmanjši premer celice (Slika 3.13). Meristemske celice pa so stisnjene v vzdolžni smeri, zato smo v tem primeru kot premer celice vzeli količnik površine prereza celice z najmanjšim premerom celice (tako smo dobili daljšo stranico prereza celice, če predpostavimo, da je ta pravokotnik). Na tak način smo izračunali di za celice, katerih površin prereza je bila manjša od 180 µm2 (Bengough in sod., 2001). Tako smo zajeli večino meristemskih celic. Prostornino posamezne celice smo ocenili kot kvader, in sicer kot produkt površine prereza celice in di. 0 0 0 0 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 49 Prostornino celotne koreninske čepice smo izračunali kot vsoto prostornin vseh celic. Ker se premer celice di pojavlja tako v izračunu števila celic in v izračunu prostornine celic, se pokrajša, tako da lahko prostornino čepice izračunamo neposredno iz produktov površin prerezov celic in njihovih oddaljenosti od osi vrtenja: n i=1 i=1 di x Sidi —> n V = y^x^Si (3.12) V – ocena prostornine koreninske čepice, n – število celic v vzdolžni rezini, Ni – ocenjeno število celic i, Vi – prostornina celice i, Si – površina prereza celice i, ri – razdalja centra celice od osi simetrije rezine, di – premer celice v pravokotni smeri glede na os simetrije. Slika 3.13. Obrisi celic v koreninski čepici. Prikazan je premer celice di, uporabljen v izračunu števila celic v celotni čepici. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 50 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.6.4.4 Ocena tridimenzionalne porazdelitve celic v endospermu Del objavljen v Plant Physiology 129 (2002) 23-30. (Priloga A) Porazdelitev celic v endospermu smo ocenili na podoben način kot v koreninski čepici. Na preparatih smo izmerili velikost celic z obrisovanjem celičnih sten. Za vsako celico smo zabeležili koordinate centra in površino prereza celice. Prostornino celic smo ocenili kot kroglo. Med merjenjem je sproti nastajala slika preparata, v kateri so bile velikosti celic predstavljene s sivimi vrednostmi pikslov (v logaritemski skali). Na nekaterih mestih so piksli manjkali zaradi poškodb v preparatu, izpuščenih celic ali nedotikajočih se celic. To smo popravili z »virtualno celularizacijo«, metodo prilagojeno po metodi generiranja mozaika po Matérnu (1960). Sliko smo na novo ustvarili tako, da smo vsakemu pikslu v sliki endosperma priredili sivo vrednost njemu najbližjega centra celice (Slika 3.14 A-D). Po podobnem postopku smo generirali tudi sliko razporeditve vrednosti C, le da smo vsakemu pikslu v endospermu priredili najbližjo vrednost C, izmerjeno po metodi merjenja IOG v tkivnih rezinah (glej 3.6.1.3). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 51 A C \^^^^\x D ^-*gjj^ Slika 3.14. Merjenje velikosti celic v endospermu in priprava slike za izračun 3-D modela endosperma. A – obrisovanje celic, B – slika prerezov celic, sive vrednosti pomenijo prostornino celic, C – slika centrov celic, D – na novo ustvarjena slika z »virtualno celularizacijo«. S 3-D modelom endosperma (glej 3.6.4.4.1) smo vzporedno obdelali sliko razporeditve velikosti celic in razporeditve vrednosti C. Za vsak voksel (voksel je ekvivalent piksla v treh dimenzijah, najmanjši element 3-D bitne slike) smo tako dobili podatek o prostornini celic, ki jih predstavlja, in njihovi vrednosti C. Z modelom smo lahko ocenili prostornino endosperma in število celic v njem: m V = ^ ( ni × v0 ) i=1 (3.13) V – prostornina endosperma, m – število virtualnih prečnih rezin, ni – število vokslov v prečni rezini i, v0 – prostornina enega voksla. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 52 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 viJ N= mak ]maks ni , j×— (3.14) N - število celic v endospermu, SVmaks - največja siva vrednost, uporabljena za kodiranje prostornine celic (v našem primeru 254), Cmax - največja vrednost C v preparatu, ni,j - število vokslov s sivo vrednostjo i, ki kodira prostornino celic in vrednostjo C j, v0 - prostornina enega voksla, vi - prostornina celice, ki jo predstavlja siva vrednost i. Posamezni členi vsot v enačbi (3.14) so se med izračunavanjem 3-D modela endosperma zapisovali v preglednico, tako, da smo dobili podatke o številu celic, ki pripadajo različnim razredom vrednosti C, razvrščene glede na prostornino celic v toliko razredov, kolikor sivih vrednosti je bilo uporabljenih za kodiranje prostornine celic (SVmaks). Za nadaljnje statistične analize smo celice po prostornini združili v večje razrede. 3.6.4.4.1 3-D model endosperma Iz popravljene 2-D slike endosperma (Slika 3.14 D) smo ekstrapolirali 3-D strukturo endosperma. Vzdolžno rezino smo v osnovi zavrteli okrog osi simetrije. Ker pa je tridimenzionalna oblika endosperma nepravilna, slike nismo zavrteli kot celote, ampak smo jo vrteli po posameznih vrsticah z višino enega piksla okrog njihovih osi simetrije. Za vsako vrstico pikslov (primer Slika 3.15 A in 3.16 A, Ia črta PQ in IIa črta ST) smo izračunali virtualni prečni prerez, sestavljen iz vokslov, kot je prikazano na Slikah 3.15 A in 3.16 A, Ib in IIb. Prečni prerez smo napolnili s sivimi vrednostmi na podlagi profila sivih vrednosti izvorne vrstice pikslov (Slika 3.15 A in 3.16 A, Ic in IIc). Za vrstice pikslov, ki niso bile v območju endosperma, kjer se rastoči embrio razvija v endospermskem žepu, smo prečni prerez ocenili kot krog s premerom PQ (Slika 3.15 A in 3.16 A, Ia in Ib). Profil sivih vrednosti smo zavrteli za ± 90° in dobili koncentrične pasove vokslov, ki so imeli enake sive vrednosti v polovicah krožnih lokov (Slika 3.15 A in 3.16 A, Ic). Celice endosperma v okolici embria so bile drugačne kot celice dorzalnega dela endosperma. V mlajših razvojnih stopnjah (od 4. do 8. DPO) je bil embrio popolnoma obdan z endospermom, v poznejšem razvoju (od 10. do 16. DPO) pa je bil embrio obdan z endospermom le z ene strani. Zato smo za oceno porazdelitve celic v delu endosperma pod Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 53 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 vplivom embria uporabili drugačen model za zgodnje (glej 3.6.4.4.2) in poznejše razvojne stopnje endosperma (glej 3.6.4.4.3). 3.6.4.4.2 3-D model endosperma mlajših razvojnih stopenj (4–8 DPO) Prečne prereze endosperma v območju embria smo ocenili na podlagi krožnic, katerih premer pada od premera endosperma (Slika 3.15 A, IIb razdalja ST) do premera embria (Slika 3.15 A, IIb razdalja UV), središče pa se premika od središča endosperma do središča embria (Slika 3.15 A, IIb). Profila sivih vrednosti med točkama S in U ter točkama V in T smo preračunali v pasove vokslov, kot je prikazano na Sliki 3.15 A, IIc. Na Sliki 3.15 B so prikazani primeri virtualnih vzdolžnih rezin, izračunanih z opisanim modelom (oznake 1, 2 in 3 ustrezajo oznakam na Sliki 3.15 A). lb lc Slika 3.15. Izdelava 3-D modela endosperma za razvojne stopnje od 4. do 8. DPO. A – vrtenje posameznih vrstic pikslov, izračunavanje virtualnih prečnih prerezov, B – izračunani virtualni vzdolžni prerezi. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 54 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.6.4.4.3 3-D model endosperma starejših razvojnih stopenj (10–16 DPO) Za oceno prečnih prerezov v območju endospermskega žepa (Slika 3.16 A, vodoravne vrstice med točkama V in Z) smo najprej povezali skrajni točki žepa z ravno črto (Slika 3.16 A, črta VZ). Za polmer endospermskega žepa smo privzeli razdaljo TU, razdaljo SU pa za premer kroga, ki je očrtan prečnemu prerezu endosperma (Slika 3.16 A, IIa in IIb). Velikosti celic, ki obkrožajo endospermski žep, so bile drugačne kot velikosti celic v zunanjih plasteh endosperma, ki mejijo na perikarp. Zato smo definirali »območje vpliva embria« kot krog na osnovi treh točk (Slika 3.16 A, prekinjena črta v IIb): sredina profila sivih vrednosti (K) in točki presečišča med krogom, očrtanim endospermu, in krogom endospermskega žepa (L in M). Profil sivih vrednosti med točkama S in T smo preračunali v pasove vokslov, kot je prikazano na Sliki 3.16 A, IIc. Sive vrednosti pikslov med točkama K in T so bile uporabljene za izračun vrednosti vokslov v »območju vpliva embria«, vrednosti pikslov med točkama S in K pa za izračun vrednosti vokslov v preostalem delu endosperma. Na Sliki 3.16 B so prikazani primeri virtualnih vzdolžnih rezin, izračunanih z opisanim modelom (oznake 1, 2, 3 in 4 ustrezajo oznakam na Sliki 3.16 A). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 55 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 3.16. Izdelava 3-D modela endosperma za razvojne stopnje od 10. do 16. DPO. A – vrtenje posameznih vrstic pikslov, izračunavanje virtualnih prečnih prerezov, B – izračunani virtualni vzdolžni prerezi. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 56 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 3.6.4.5 Statistična obdelava podatkov Podatke, ki so bili eksponentne narave (velikost celic, količina DNA), smo pred analizami logaritmirali, tako se je njihova porazdelitev približala Gaussovi porazdelitvi. Za opis porazdelitev smo uporabljali parametrične ali neparametrične kazalce, odvisno od oblike porazdelitve. Za primerjave posameznih razredov znotraj ene ponovitve smo vedno uporabljali enosmerno analizo variance, ker ima večjo moč pri majhnih vzorcih kot neparametrična oblika (Kruskal-Wallis) in ni občutljiva za majhne odklone oblike porazdelitev od normalne (Motulsky, 1995). Posamezne skupine smo primerjali med seboj s Tukeyjevim posttestom (GraphPad Prism verzija 3.02 za okolje Windows, GraphPad Software, ZDA). Kjer smo primerjali le dva razreda, smo uporabili t-test. Iz median oziroma aritmetičnih sredin, izračunanih iz posameznih ponovitev, smo računali povprečja, standardno deviacijo in standardno napako. Podatke smo prikazovali s frekvenčnimi porazdelitvami in razpršenimi grafi. Za statistično analizo smo uporabljali program GraphPad Prism 3 in Microsoft Excel 97 (Microsoft Corporation, ZDA), grafe pa smo narisali v programih GraphPad Prism 3, Microsoft Excel 97 in SigmaPlot 8 (SPSS Science Software GmbH, Nemčija). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 57 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4 REZULTATI 4.1 Vizualizacija celičnih procesov v kariopsi Del objavljen v Plant Physiology 129 (2002) 23-30. (Priloga A) Razvoj kariopse smo spremljali na medianih vzdolžnih rezinah. Rezine kariops, izrezanih iz storžev 0 do 28 dni po oprašitvi (DPO), smo barvali z različnimi histološkimi tehnikami. Na podlagi pregledanih preparatov smo v obdobju razvoja od 4. do 12. DPO izbrali po eno tipično kariopso genotipov Mn1 (divji tip) in mutante mn1, v prejšnji raziskavi pa smo 16. DPO izbrali po dve kariopsi obeh genotipov. V izbranih kariopsah se je 4. DPO v endospermu že končala celularizacija, v nekaterih drugih kariopsah pa smo v tem času še opazili necelulariziran osrednji del endosperma. V času od 4. do 16. DPO v celicah endosperma še ni veliko suhe snovi, ki v poznejših razvojnih stopnjah onemogoča izdelavo nepoškodovanih parafinskih rezin celotne kariopse. Na medianih vzdolžnih rezinah izbranih kariops, starih od 4 do 16 DPO, smo natančneje raziskali razvoj kariopse s kvantitativnim barvanjem DNA in merjenjem velikosti celic. Kariopse 4 do 12 DPO so bile vzgojene na rastlinah v rastlinjaku, kariopse 16 DPO pa na rastlinah na polju, zato sta skupini podatkov v prikazu rezultatov meritev ločeni. 4.1.1 Razporeditev jeder v kariopsi Na Slikah 4.1 do 4.6 je prikazana primerjava razporeditev izmerjenih jeder v medianih vzdolžnih rezinah kariops divjega tipa Mn1 in mutante mn1 v času od 4 do 16 dni po oprašitvi. V meritvi smo izmerili le jedra, ki se niso prekrivala med seboj in niso bila poškodovana. Zato je bilo izmerjenih jeder v vseh primerih manj, kot je bilo vseh jeder, vidnih v rezini. Izmerjena jedra smo znotraj vsakega tkiva (nucel, perikarp, embrio, endosperm) razdelili na razrede vrednosti C na osnovi vrhov, ki so se oblikovali v frekvenčnih porazdelitvah relativne vsebnosti DNA v jedrih. V razred perikarp smo uvrstili jedra v celicah stene plodnice in v celicah pedicela, ki meji na semensko zasnovo. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 58 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Podrobnejše analize vsakega tkiva posebej so opisane v poglavjih 4.1.2.1 (nucel), 4.1.2.2 (perikarp), 4.1.3.1 (embrio) in 4.1.3.2 (endosperm). Jedra 2 C do 8 C so bila v nucelu, perikarpu in embriu (diploidna tkiva), jedra 3 C do 192 C pa v endospermu (triploidno tkivo). Razvoj kariops divjega tipa in mutante mn1 je bil podoben v času od 4. do 8. DPO (Slike 4.1 do 4.3). 4. DPO je večino prostora v semenski zasnovi zavzemal diploidni nucel, triploidni endosperm je zavzemal le malo prostora. V nadaljnjem razvoju je rastoči endosperm postopoma nadomeščal nucel. V bazalnem delu endosperma so bila vidna diploidna jedra embria, ki je do 8. DPO popolnoma obdan z endospermom. V endospermu so bila jedra različnih vrednosti C enakomerno porazdeljena. V času 6 in 8 DPO so imela jedra v notranji plasti stene plodnice (bližje nucelu) večinoma vrednosti 2 C, jedra v zunanji plasti pa večinoma 4 C. Razvoj kariops od 10. DPO naprej se je razlikoval med obema genotipoma (Slike 4.4 do 4.6). Perikarp na apikalnem delu kariopse mn1 ni bil v tesnem stiku z endospermom kot pri Mn1, ampak je bil naguban, med perikarpom in endospermom je bil v tem delu prazen prostor (zrak). Apikalni del mn1 endosperma ni bil zaobljen kot v Mn1. Razporeditev jeder različnih vrednosti C v endospermu je bila podobna pri obeh genotipih. Na obodu endosperma so prevladovala jedra z nizkimi vrednostmi C, v osrednjem delu endosperma pa so bila jedra z najvišjimi vrednostmi C. Razporeditev celic v endospermu, kjer smo vsaki celici priredili vrednost C, je prikazana na Sliki 4.36. V času od 4. do 8. DPO je bil razvijajoči se endosperm obdan z nucelom, v katerem so bila večinoma jedra 2 C in 4 C. V nucelu Mn1 pa smo 8. DPO opazili tudi več endopoliploidnih jeder 8 C (Slika 4.3 in Slika 4.7). Od 10. DPO naprej je bil nucel prisoten le še kot tanka plast med endospermom in perikarpom z redkimi jedri. Jedra v zunanji plasti perikarpa so postala endopoliploidna. Prva jedra z vrednostjo 8 C smo opazili 6. DPO, od 12. DPO naprej pa so se pojavljala v večjem številu v perikarpu obeh genotipov (Slika 4.5). Od 10. DPO naprej embrio na videz ni bil več popolnoma obdan z endospermom in je rastel med endospermom in perikarpom. Vendar je bila med embrijem in perikarpom še Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 59 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 eno celico debela plast alevronskih celic, tako da je bil embrio še vedno znotraj endosperma (Slike 4.4 do 4.6). Votlina, v kateri raste embrio, je endospermski žep. Anatomski znak, po katerem se kariopsa mn1 loči od kariopse divjega tipa, je tudi razmik med bazalnim delom endosperma in placento-halazno plastjo (materinskim tkivom tik pod endospermom). Od 8. DPO naprej je bilo v placento-halazni plasti območje, v katerem ni bilo jeder (Slike 4.3 do 4.6) v obeh genotipih. Vendar so bile na tem mestu še ohranjene celične stene (glej 4.1.2.3.2), v kariopsi Mn1 je bil endosperm še v stiku z materinskim tkivom, v kariopsi mn1 pa smo opazili tudi ločenost bazalnega dela endosperma od celic placento-halazne plasti. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 60 Slika 4.1. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 4 DPO. Izmerjenih 4948 jeder v Mn1 in 4638 jeder v mn1. Rastline so bile vzgojene v rastlinjaku. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 61 ¦"^s; Slika 4.2. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 6 DPO. Izmerjenih 5037 jeder v Mn1 in 4782 jeder v mn1. Rastline so bile vzgojene v rastlinjaku. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 62 Slika 4.3. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 8 DPO. Izmerjenih 5244 jeder v Mn1 in 5045 jeder v mn1. Rastline so bile vzgojene v rastlinjaku. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 63 Slika 4.4. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 10 DPO. Izmerjenih 3996 jeder v Mn1 in 5896 jeder v mn1. Rastline so bile vzgojene v rastlinjaku. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 64 Slika 4.5. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 12 DPO. Izmerjenih 6278 jeder v Mn1 in 5939 jeder v mn1. Rastline so bile vzgojene v rastlinjaku. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 65 > > •v. 9*1 •TČ*«* ..-••¦ .*.»« Slika 4.6. Stopnja endopoliploidnosti v kariopsi koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 16 DPO. Za oba genotipa je prikazana po ena vzdolžna rezina od dveh izmerjenih. Izmerjenih 8924 jeder v Mn1 in 7246 jeder v mn1. Rastline so bile vzgojene na polju. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 66 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.2 Citološka analiza materinskega tkiva 4.1.2.1 Nucel 4.1.2.1.1 Število jeder posameznih razredov ploidnosti v vzdolžnih rezinah kariopse V nucelu divjega tipa Mn1 in mutante mn1 je bilo največ jeder na začetku proučevanega obdobja razvoja (4. do 6. DPO), do 10. DPO pa se je njihovo število strmo zmanjšalo. V kariopsi Mn1 12 DPO in kariopsi mn1 10 DPO smo izmerili ploidnost jeder v zadnjih ostankih nucela. Za nucel je bil značilen velik delež jeder 4 C proti 2 C, v njem pa smo opazili tudi endopoliploidna jedra 8 C. Jeder 8 C je bilo največ 8. DPO v obeh genotipih, vendar pa je njihovo število v Mn1 zelo presegalo število v mn1. V vzdolžnih rezinah kariops Mn1 10 DPO, mn1 12 DPO in obeh genotipov 16 DPO nismo opazili jeder nucela (Slika 4.7 in Slika 4.8). Jedra v nucelu smo ločili na razrede vrednosti C na podlagi frekvenčnih porazdelitev faktorja C, izračunanega iz IOG jeder (Slika 4.8). V Mn1 je bil vrh 2 C nižji v primerjavi s 4 C kot v mn1. V Mn1 je bil dobro viden tudi vrh 8 C (Slika 4.8), ki ga je v mn1 predstavljalo le nekaj posameznih jeder (Slika 4.9). Za jedra 4 C iz mikroskopskih preparatov ne moremo z gotovostjo trditi, ali jedra 4 C pripadajo že prvemu endoreduplikacijskemu ciklu ali pa so to jedra v G2 fazi mitoze. Verjetno pa je populacija 4 C jeder mešana. Z vedno večjo stopnjo endopoliploidnosti se je večala tudi velikost jeder. Razporeditev jeder se je po stopnji endopoliploidnosti (prikazana kot faktor C) in velikosti (prikazana kot logaritem površine preseka jeder v rezini) oblikovala v skupine (Slika 4.9). V obeh genotipih je bila velikost jeder v enakem območju za jedra v posameznih skupinah (Slika 4.9). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 67 1000 800 600 400 200 0 4 6 Mn1 mn1 8 10 12 16 4 6 Dnevi po oprašitvi 8 10 12 16 8C 4C 2C Slika 4.7. Število izmerjenih jeder v nucelu v vzdolžnih rezinah kariops koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 68 nucel 4 6 8 10 350 300 250 200 150 100 50 0 350 300 250 200 150 100 50 0 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Mn1 mn1 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 250 200 150 100 50 0 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 160 140 120 100 80 60 40 20 0 50 --45 40 - 35 30 - 25 20 -15 10 - 5 0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti /v L 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.8. Frekvenčna porazdelitev jeder v nucelu glede na relativno vsebnost DNA. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 69 nucel 12 12 10 8 Mn1 mn1 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.8. Frekvenčna porazdelitev jeder v nucelu glede na relativno vsebnost DNA. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Meje med razredi jeder z različno stopnjo endopoliploidnosti so označene s križci (×) na osi x. Pri razvojnih stopnjah, za katere podatki niso prikazani, v rezini ni bilo jeder nucela. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 70 nucel Mn1 mn1 4 6 8 10 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 - 1,4 1,2 1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti i fc-r 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2,4 2,2 - 2,0 1,8 - 1,6 - 1,4 1,2 -• 1,0 2,4 - 2,2 2,0 - 1,8 1,6 - 1,4 1,2 -' 1,0 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.9. Površina preseka jeder in stopnja endopoliploidnosti jeder v nucelu. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 71 nucel 12 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 Mn1 mn1 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.9. Površina preseka jeder in stopnja endopoliploidnosti jeder v nucelu. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Pri razvojnih stopnjah, za katere podatki niso prikazani, v rezini ni bilo jeder nucela. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 72 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.2.1.2 Fragmentacija DNA v jedrih nucela Da bi ugotovili naravo propadanja celic v nucelu, smo na vzdolžnih rezinah kariops izvedli reakcijo TUNEL. Od 6. do 8. DPO smo v jedrih nucela opazili močno zeleno fluorescenco s fluoresceinom označenih nukleotidov, ki so se vezali na proste 3' OH konce DNA (Slika 4.10). Barvanje je dokazovalo, da je bila DNA v jedrih nucela razrezana z endonukleazami že pred propadom celic. Specifičnost reakcije smo potrdili s primerjavo fluorescence jeder, barvanih s TUNEL reakcijo, in fluorescence jeder, barvanih z DAPI, ki barva vso DNA v vseh jedrih. Jedra v nucelu so se močneje barvala z reakcijo TUNEL, kot jedra v perikarpu (Slika 4.10, Mn1 6 DPO) ali jedra v endospermu (Slika 4.10, mn1 8 DPO). Slika 4.10 tudi prikazuje, da je signal fluorescence jeder, barvanih z reakcijo TUNEL, podoben v kariopsi divjega tipa (Mn1 6 DPO) in v kariopsi mutante mn1 (mn1 8 DPO). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 73 1 p n . . 100pm DAPI TUNEL *2**; n .• en Slika 4.10. Fragmentacija DNA v jedrih nucela. Vzdolžni rezini razvijajoče se kariopse divjega tipa Mn1 6 DPO in mn1 mutante 8 DPO (mn1). DAPI obarva vsa jedra, z reakcijo TUNEL pa močneje svetijo jedra s fragmentirano DNA. Pomen oznak: p – perikarp, n – nucel, en – endosperm. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 74 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.2.2 Perikarp 4.1.2.2.1 Število jeder posameznih razredov ploidnosti v vzdolžnih rezinah kariopse V proučevanih vzdolžnih rezinah kariops divjega tipa Mn1 in mutante mn1 je bilo v perikarpu približno enako število izmerjenih jeder v razvojnih stopnjah od 4. do 16. DPO. Tudi med obema genotipoma ni bilo pomembnih razlik (Slika 4.11). Število jeder 2 C in 4 C je bilo približno enako v vseh opazovanih razvojnih stopnjah v obeh genotipih. Več 2 C jeder je bilo le v perikarpu Mn1 4 in 6 DPO. Več endopoliploidnih jeder 8 C smo opazili v perikarpu Mn1 12. DPO in pozneje, v perikarpu mn1 pa 10. DPO in pozneje. Glede na celotno število jeder odstopa le perikarp Mn1 10 DPO, vendar zaradi premalo podatkov ne moremo sklepati o statističnem pomenu odstopanja. Jedra v perikarpu smo ločili na razrede vrednosti C na podlagi frekvenčnih porazdelitev faktorja C, izračunanega iz IOG jeder (Slika 4.12). V perikarpu sta bila vrhova frekvenčnih porazdelitev, ki ustrezata jedrom 2 C in 4 C, približno enako visoka pri obeh genotipih v vseh pregledanih stopnjah razvoja (rahlo odstopa le Mn1 4 in 6 DPO). Opaznejši vrh, ki ustreza jedrom 8 C, se je pojavil 12. DPO pri Mn1 in 10. DPO pri mn1 (Slika 4.12). Pred tem časom so bila v perikarpu prisotna le posamezna jedra 8 C (Slika 4.13). Za jedra 4 C iz mikroskopskih preparatov ne moremo z gotovostjo trditi, ali jedra 4 C pripadajo že prvemu endoreduplikacijskemu ciklu ali pa so to jedra v G2 fazi mitoze. Verjetno je populacija 4 C jeder mešana. Z vedno večjo stopnjo endopoliploidnosti se je večala tudi velikost jeder. Razporeditev jeder se je po stopnji endopoliploidnosti (prikazana kot faktor C) in velikosti (prikazana kot logaritem površine preseka jeder v rezini) oblikovala v skupine (Slika 4.13). V obeh genotipih je bila velikost jeder v enakem območju za jedra v posameznih skupinah (Slika 4.13). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 75 5000 4000 3000 Mn1 2000 1000 0 mn1 8 10 12 16 4 6 8 10 12 Dnevi po oprašitvi 16 Slika 4.11. Število izmerjenih jeder v perikarpu v vzdolžnih rezinah kariops koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1. Pri 16. DPO prikazani podatki za eno od dveh izmerjenih rezin pri obeh genotipih (prikazani na Sliki 4.6). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 76 perikarp Mn1 mn1 4 6 8 10 800 700 600 500 400 300 200 100 0 800 700 600 500 400 300 200 100 0 600 500 400 300 200 100 0 350 300 250 200 150 100 50 0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 600 500 400 300 200 100 0 400 350 300 250 200 150 100 50 0 600 500 400 300 200 100 0 600 500 400 300 200 100 0 *-* 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti u. 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.12. Frekvenčna porazdelitev jeder v perikarpu glede na relativno vsebnost DNA. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 77 perikarp Mn1 mn1 12 16a 16b 600 500 400 300 200 100 0 300 250 200 150 100 50 0 400 350 300 250 200 150 100 50 0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 120 100 80 60 40 20 0 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.12. Frekvenčna porazdelitev jeder v perikarpu glede na relativno vsebnost DNA. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Meje med razredi jeder z različno stopnjo endopoliploidnosti so označene s križci (×) na osi X. Pri 16. DPO so prikazani podatki za dve izmerjeni rezini, pri ostalih pa za eno izmerjeno rezino. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 78 perikarp Mn1 mn1 4 6 8 10 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 - 1,4 1,2 1,0 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2,4 -¦ 2,2 - 2,0 - 1,8 - 1,6 - 1,4 - 1,2 - 1,0 -¦ 2,4 -¦ 2,2 2,0 -1,8 1,6 1,4 -^j 1,2 1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 - 1,4 1,2 1,0 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.13. Površina preseka jeder in stopnja endopoliploidnosti jeder v perikarpu. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 79 perikarp Mn1 mn1 12 16a 16b 2,4 2,2 - 2,0 1,8 -1,6 - 1,4 1,2 -1,0 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2,4 2,2 - 2,0 1,8 - 1,6 - 1,4 1,2 -• 1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.13. Površina preseka jeder in stopnja endopoliploidnosti jeder v perikarpu. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Pri 16. DPO so prikazani podatki za dve izmerjeni rezini, pri ostalih pa za eno izmerjeno rezino. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 80 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.2.3 Placento-halazna plast Rokopis pripravljen za objavo. 4.1.2.3.1 Stopnja endopoliploidnosti jeder Od 4. do 6. DPO je bila stopnja ploidnosti jeder v placento-halazni plasti (PHP) večinoma 2 C in 4 C v kariopsah obeh genotipov. Med njimi smo opazili le posamezna jedra z vsebnostjo DNA 8 C (Slika 4.1 in Slika 4.2, jedra tik pod semensko zasnovo). V kariopsi divjega tipa je bila 8. DPO v območju PHP vidna skupina endopoliploidnih jeder 8 C, v mutanti mn1 jih ni bilo (Slika 4.3). V času 10 DPO je bila večja skupina 8 C jeder vidna v PHP v mutanti mn1. Prav tako smo jih opazili v divjem tipu, vendar v manjšem številu (Slika 4.4). V rezinah kariops 12 in 16 DPO smo v obeh genotipih v PHP opazili skupino jeder 8 C v plasti pod jedri z vsebnostjo DNA 2 C in 4 C. Nad njimi pa je bila plast, kjer jeder ni bilo (Slika 4.5 in Slika 4.6). 4.1.2.3.2 Izguba jeder in morfologija celic v placento-halazni plasti Razvoj PHP smo spremljali v času od 0 do 28 DPO. Zgodnji razvoj bazalnega dela kariopse je potekal enako pri divjem tipu Mn1 in mutanti mn1. V neoplojeni semenski zasnovi smo videli embrionalno vrečko, ki jo je obdajala množica jeder nucela. Pod semensko zasnovo, v PHP, so vse celice vsebovale jedra (Slika 4.14, 0 DPO). V območju endosperma in embria smo 2. DPO opazili nekaj jeder filialne generacije, v PHP ni bilo sprememb (Slika 4.14, 2 DPO). 4. DPO je bil endosperm že celulariziran, pod dorzalno stranjo endosperma (stran od embria) pa smo v PHP opazili nekaj celic v skupini, ki so bile brez jeder (Slika 4.14, 4 DPO). Šesti dan po oprašitvi je bil v obeh genotipih viden embrio kijaste oblike, v PHP pod bazo endosperma pa smo opazili večje območje celic brez jeder kot v kariopsi 4. DPO (Slika 4.14, 6 DPO). V poznejšem razvoju se je nadaljevalo izginjanje jeder iz celic v PHP; razširilo se je v bazalni smeri proti žilam v pedicelu, prav tako se je razširilo proti dorzalni strani kariopse, skupaj z rastočim endospermom (Slika 4.14, 8 do 28 DPO). Do 8. DPO med genotipoma še ni bilo večjih razlik (Slika 4.14, 8 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 81 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 DPO), 10. DPO pa je bila plast celic brez jeder v mutanti mn1 že debelejša kot v Mn1 (Slika 4.14, 10 DPO). Slika 4.14. Večanje števila plasti celic v placento-halazni plasti, ki izgubijo jedra; 0–28 DPO. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 82 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Mn1 mn1 .* » vem* * t •• ¦ -; h, etv - * : ¦ $ V. . - ' . • -% - , . / ft Ti :• * *¦ ¦ ¦ ¦r • ¦¦ ¦ w- * * * * ¦ * ifir.t »¦ ^ • # ¦ ¦ rjy/ __L_l__¦__¦ L it-___c.__¦-'_______ ^-—-w^ •¦ , 4 *. ¦ « « ¦ * + V t > V F * ¦ -• * • ' "v":-"- '¦ - ^.i .'.>.. JU. ¦ ^ ¦ ¦ ¦ , * f ¦ ¦ ¦ :*. ¦ttt*". . -•: ¦¦t :,y en It' ¦t . i , * ¦ » » ** -. *-v«*V .>*::¦¦„L-!*¦..¦?* ^"'¦ped Slika 4.14. Večanje števila plasti celic v placento-halazni plasti, ki izgubijo jedra; 0–28 DPO. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani; slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 83 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 4.14. Večanje števila plasti celic v placento-halazni plasti, ki izgubijo jedra; 0–28 DPO. (Nadaljevanje slike s prejšnjih dveh strani.) Vzdolžne rezine razvijajočih se kariops so barvane z DAPI, posnete slike pa so prikazane v sivem negativu. Placento-halazna plast je na vsaki sliki v spodnjem delu, ventralna stran kariopse je vedno na levi. Pomen oznak: ev – embrionalna vrečka, n – nucel, php – placento-halazna plast, ped – pedicel, em – embrio, en – endosperm. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 84 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Da bi ugotovili, ali je število plasti celic brez jeder različno v obeh genotipih, smo prešteli število plasti na ventralni strani PHP, kjer je bila plast brez jeder najdebelejša. Primer štetja plasti je prikazan na preparatih kariops obeh genotipov, 12. DPO (Slika 4.15). Štetje plasti celic, ki so izgubile jedra, od 0 do 28. dne po oprašitvi, je pokazalo, da se število plasti ni bistveno razlikovalo med obema genotipoma. V obeh genotipih se je v obdobju od 4 do 24 DPO razvilo 5 do 25 plasti celic brez jeder (Slika 4.16). Vidna razlika med genotipoma je bila le v obliki celic v PHP. V divjem tipu so bile celice bolj podolgovate in ožje v smeri pravokotno na PHP, kot pa celice v mn1, kjer so bile te bolj nepravilnih oblik in širše v smeri pravokotno na PHP (Slika 4.15). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 85 Mn1 mn1 Slika 4.15. Štetje plasti celic v placento-halazni plasti, ki so izgubile jedra. Prikazani sta vzdolžni rezini kariops Mn1 in mn1 12. DPO. Območje celic brez jeder je obrobljeno s črno črto, štetje plasti celic je prikazano s križci. Ventralna stran kariopse je na levi. Vzdolžni rezini sta barvani z DAPI in prikazani v sivem negativu. 30 25 20 15 10 5 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 Dnevi po oprašitvi Slika 4.16. Število plasti celic brez jeder v placento-halazni plasti. Prikazana sta povprečje in standardna deviacija števila plasti celic brez jeder v placento-halazni plasti kariops divjega tipa Mn1 in mutante mn1 v času od 0 do 28 DPO (vsaka točka predstavlja meritev na treh preparatih). Plasti so preštete v smeri pravokotno na placento-halazno plast na ventralni strani kariopse. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 86 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 V območju PHP neoplojenih semenskih zasnov celice niso izgubile jeder v času, ko se je to zgodilo v oplojenih semenskih zasnovah na istem storžu. Prikazan je vzdolžni prerez skozi neoplojeno in oplojeno semensko zasnovo iz istega storža, 12. DPO (Slika 4.17). Celice v primerljivem območju PHP so v neoplojeni semenski zasnovi vsebovale jedra, medtem ko smo v kariopsi 12. DPO opazili več plasti celic brez jeder. Slika 4.17. Neoplojena semenska zasnova in razvijajoča se kariopsa (oplojena) iz istega storža, 12 DPO. Vzdolžni rezini sta barvani z DAPI in prikazani sivem negativu. Pomen oznak: ev – embrionalna vrečka, n – nucel, php – placento-halazna plast, ped – pedicel, em – embrio, en – endosperm. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 87 V plasti celic, ki je mejila na območje celic brez jeder v PHP, smo opazili jedra z zelo kondenziranim kromatinom (Slika 4.18). To smo opazili v kariopsah divjega tipa in v mutanti mn1. V naslednjih plasteh celic, ki so bile bolj oddaljene od praznih celic, pa je bil kondenziran kromatin (heterokromatin) v jedrih normalno, pegasto razporejen (kondenziran kromatin je bil viden v obliki točk znotraj jeder). A < 1 • ¦ t* » * : ¦ * _______ B • < -50|jm Slika 4.18. Kondenzirana jedra v placento-halazni plasti v kariopsi Mn1 (A) in mn1 (B), 10 DPO. Vzdolžni rezini sta barvani s kristal vijoličnim. Puščice kažejo na jedra, ki so zelo kondenzirana. 4.1.2.3.3 Fragmentacija DNA v jedrih placento-halazne plasti Vzdolžne rezine kariops smo barvali z reakcijo TUNEL, v kateri so se s fluoresceinom označeni nukleotidi vezali na proste 3' OH konce poškodovane DNA. V rezinah kariops, starih od 2 do 6 DPO, v PHP nismo opazili TUNEL pozitivnih jeder. Značilno fluorescenco v jedrih smo opazili šele 8. DPO, in sicer v obeh genotipih. Število takih jeder se je povečalo do 10. DPO (Slika 4.19) in so bila vedno v nekaj plasteh tik pod celicami brez jeder. V nekaterih primerih smo fluorescenco po reakciji TUNEL opazili kot točke na obodu celice (Slika 4.19, manjša slika v sliki mn1 10 DPO). Z modro ekscitacijo, s katero smo vzbujali fluoresceno fluoresceina, smo videli tudi avtofluorescenco vsebine celic. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 88 Mn1 mn1 Slika 4.19. Fragmentacija DNA v jedrih celic v placento-halazni plasti. Vzdolžne rezine kariopse divjega tipa Mn1 in mutante mn1 8 in 10 DPO, barvane z reakcijo TUNEL. Jedra s fragmentirano DNA oddajajo zeleno fluorescenco. Manjša slika v mn1 10 DPO prikazuje povečavo, na kateri je vidna celica s TUNEL pozitivnimi točkami ob celični steni. Kontrolne rezine so bile inkubirane samo s fluoresceinom označenimi nukleotidi, brez TdT encima. Pomen oznak: en – endosperm, php – placento-halazna plast, ped – pedicel. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 89 4.1.2.3.4 Nalaganje sekundarnih spojin v celične stene Vzdolžne rezine kariops divjega tipa in mn1 mutante, starih 16 DPO, smo barvali s Sudan IV za kutin in suberin (Slika 4.20) in floroglucinolom v HCl, da bi dokazali prisotnost lignina (Slika 4.21). Nobeno od obeh barvanj ni pobarvalo celic v PHP. S Sudan IV se je barvala kutikula integumenta in suberinizirane celice okoli žil v pedicelu, s flororoglucinolom-HCl pa stene ksilemskih elementov v pedicelu. Slika 4.20. Vzdolžni rezini kariops divjega tipa (A) in mutante mn1 (B), 16 DPO, barvani s Sudan IV. Lipidne snovi se barvajo rdeče. Viden kutin v kutikuli integumenta in suberin okoli žil v pedicelu. Slika 4.21. Vzdolžna rezina kariopse divjega tipa, 16 DPO, barvana s floroglucinolom v HCl. Lignin v stenah ksilemskih elementov, pobarvan rdeče-vijolično. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 90 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Z barvanjem z anilin modrim – fluorescenčno metodo smo pobarvali vzdolžne rezine kariops od 2. do 16. DPO, da bi določili prisotnost kaloze v stenah PHP (Slika 4.22), vendar je s to metodo nismo dokazali. Celične stene v PHP tik pod endospermom so z UV ekscitacijo sicer oddajale zeleno fluorescenco, ki je bila drugačne barve kot fluorescenca drugih celičnih sten (modra). S poznejšimi poskusi smo dokazali, da se zeleno obarvanje sten v istem območju razvije tudi v preparatih, ki smo jih izpostavili samo alkalnemu mediju (brez barvila anilin modro); preparat smo bodisi naparili z amonijevimi parami ali pa ga inkubirali v 0,15 M K2HPO4 (pH 8,2) (Slika 4.23 in Slika 4.24). Premik fluorescence iz modre v zeleno območje dokazuje prisotnost vezanih hidroksicimetnih fenolnih kislin v celičnih stenah. Prve takšne celice smo opazili od 2. do 4. DPO, vendar je bila takrat zelena fluorescenca še šibka v primerjavi s poznejšimi razvojnimi stopnjami (Slika 4.22). Število plasti celic, ki so oddajale zeleno fluorescenco, se je do 8. DPO povečalo na okrog 10 in ostalo na taki vrednosti vse do 28. DPO (zadnja preiskana razvojna stopnja). Z opazovanjem preparatov po inkubiranju v alkalnem mediju in po barvanju z barvilom Naturstoffreagenz A (NST) smo določili dve različni območji v okviru PHP. Obe sta bili dobro prepoznavni šesti dan po oprašitvi. V alkalnem mediju so celične stene v približno sedmih plasteh celic v PHP tik pod endospermom svetile zeleno, po čemer so se te celice razlikovale od spodaj ležečih plasti. Te so po barvanju z NST oddajale rumeno-zeleno fluorescenco. Območje celic, obarvanih z NST, je segalo do žilnega prepleta v pedicelu (Slika 4.23). Barvanje z NST je dokaz za prisotnost flavonoidov v teh celicah. Celice, katerih celične stene oddajajo zeleno fluorescenco v alkalnem, se niso barvale z NST. V neoplojenih semenskih zasnovah nismo opazili barvanja z NST. Z njim so se celice najprej obarvale 2 do 4 DPO. Jakost obarvanja je dosegla vrh 6 DPO in se ni več bistveno spremenila v nadaljnjem razvoju kariopse; enako velja za število plasti celic v PHP, ki so v alkalnem mediju oddajale zeleno fluorescenco (Slika 4.24). V nevtralnem mediju (destilirana voda) je večina celičnih sten v PHP z UV ekscitacijo oddajala močno modro avtofluorescenco, le celične stene tik pod endospermom so svetile opazno šibkeje (Slika 4.24, dH2O). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 91 Mn1 mn1 l Slika 4.22. Vzdolžne rezine kariops divjega tipa Mn1 in mutante mn1, 2–16 DPO, barvane z DAPI in anilin modrim v 0,15 M K2HPO4 (pH 8,2). Pomen oznak: en – endosperm, php – placento-halazna plast, ped – pedicel. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 92 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Mn1 mn1 Slika 4.23. Fenolne snovi v placento-halazni plasti v kariopsah divjega tipa in mutante mn1, 6 DPO. Zgoraj (alkalno): vzdolžni rezini kariops v alkalnem mediju: preparat Mn1, naparjen z amonijevimi parami, in preparat mn1, inkubiran v 0,15 M K2HPO4 pH 8,2. Spodaj (NST): vzdolžni rezini kariops, barvani z Naturstoffreagenz A v metanolu. Vse slike posnete z UV ekscitacijo. Pomen oznak: en – endosperm, php – placento-halazna plast, ped – pedicel. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 93 Mn1 mn1 Slika 4.24. Fenolne snovi v placento-halazni plasti v kariopsah divjega tipa in mutante mn1, 16 DPO. Zgoraj (alkalno): vzdolžni rezini kariops v alkalnem mediju: preparata Mn1 in mn1, inkubirana v 0,15 M K2HPO4 pH 8,2. Sredina (NST): vzdolžni rezini kariops, barvani z Naturstoffreagenz A (v metanolu). Spodaj (dH2O): avtofluorescenca celičnih sten v rezinah v destilirani vodi. Vse slike posnete z UV ekscitacijo. Pomen oznak: en – endosperm, php – placento-halazna plast, ped – pedicel. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 94 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.3 Citološka analiza filialnega tkiva 4.1.3.1 Embrio 4.1.3.1.1 Število jeder posameznih razredov ploidnosti v vzdolžnih rezinah kariopse Število jeder v embriu, ki smo jih izmerili v vzdolžnih rezinah kariops divjega tipa Mn1 in mutante mn1 od 4. do 16. DPO, se je strmo večalo od nekaj jeder 4 DPO do več tisoč jeder 16 DPO (Slika 4.25). V embriu so prevladovala jedra 2 C in 4 C; endopoliploidna jedra smo v proučevanem obdobju v embriu opazili zelo redko, le nekaj jeder 8 C v embriu Mn1 v času 12 in 16 DPO. Za embrio je bil značilen velik delež jeder 2 C glede na 4 C (Slika 4.25, zgoraj in Slika 4.26). Število jeder v rezinah se je večalo eksponentno (Slika 4.25, spodaj), kar kaže, da je embrio mitotsko zelo aktivno tkivo. V obdobju od 4. do 12. DPO je bilo v rezinah približno enako število jeder v obeh genotipih v istem času po oprašitvi, pa tudi velikost embria je bila podobna (Slike 4.1 do 4.5). Zato sklepamo, da je v embriu obeh genotipov v obdobju od 4. do 12. DPO približno enako število celic. 16. DPO pa smo v embriu mn1 izmerili mnogo manj jeder kot v embriu Mn1 (Slika 4.25). Embria sta se razlikovala tudi po velikosti (Slika 4.6). Jedra v embriu smo ločili na razrede vrednosti C na podlagi frekvenčnih porazdelitev faktorja C, izračunanega iz IOG jeder (Slika 4.26). 4. DPO smo v rezini opazili le nekaj jeder embria (Slika 4.27). Pozneje se število jeder povečuje in v frekvenčnih porazdelitvah oblikujejo vrhove. Vrh, ki je ustrezal jedrom z vsebnostjo DNA 2 C, je bil v vseh stopnjah v obeh genotipih večji od vrha 4 C. Jedra 4 C so bila večja od jeder 2 C (Slika 4.27). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 95 5000 4000 3000 2000 1000 0 10000 1000 E 100 i 10 = 1 -I Mn1 mn1 8 10 12 16 4 6 Dnevi po oprašitvi 8 10 12 1012 16 4 6 8 Dnevi po oprašitvi 10 12 16 4C 2C 16 Slika 4.25. Število izmerjenih jeder v embriu v vzdolžnih rezinah kariops koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1. Število jeder je prikazano na linearni skali (zgoraj) in na logaritemski skali (spodaj). Pri 16. DPO so prikazani podatki za eno od dveh izmerjenih rezin pri obeh genotipih (prikazani na Sliki 4.6). Podatki so prikazani ločeno, ker so bile kariopse iz druge poskusne serije. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 96 embrio Mn1 mn1 4 6 8 10 10 7 - S 4 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti i' i: k 2 4 8 16 32 64128 Stopnja endopoliploidnosti 4,5 4 3,5 ! 3^ n •co 1,5 1 0,5 0 30 25 a 20 T3 ¦92. i" 15 > «o 10 5 0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti i; 1 0 16 14 12 (D I10 Y 8 > * 6 4 2 0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti La 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.26. Frekvenčna porazdelitev jeder v embriu glede na relativno vsebnost DNA. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) 2 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 97 embrio Mn1 mn1 12 16a 16b 160 140 120 0) ¦o 100 2 80 I "O 40 20 0 1200 1000 te 800 "D -O, i 600 ¦> S x» 200 100 300 250 te 200 ¦o ¦9J. F 150 > JS <0 100 50 0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti J L i-----------1 L 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti J 1/ L 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.26. Frekvenčna porazdelitev jeder v embriu glede na relativno vsebnost DNA. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Meje med razredi jeder z različno stopnjo endopoliploidnosti so označene s križci (×) na osi X. Pri 16. DPO prikazani podatki za dve izmerjeni rezini, pri ostalih pa za eno izmerjeno rezino. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 98 embrio Mn1 mn1 4 6 8 10 2,4 i;: -C 1,0 2,4 i;: 1,0 2,4 i;: c 1,0 2,4 i;: I 1,4 1,2 -1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti > 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti *- 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2,4 I« I» »:: 1,0 2,4 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.27. Površina preseka jeder in stopnja endopoliploidnosti jeder v embriu. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 99 embrio Mn1 mn1 12 16a 16b 2,4 IZ I« 1,0 2,4 i:; i- 1,0 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti ^* 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti 2 4 8 16 32 64 128 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.27. Površina preseka jeder in stopnja endopoliploidnosti jeder v embriu. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Pri 16. DPO prikazani podatki za dve izmerjeni rezini, pri ostalih pa za eno izmerjeno rezino. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 100 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.3.2 Endosperm 4.1.3.2.1 Število jeder posameznih razredov ploidnosti v vzdolžnih rezinah kariopse Število jeder v endospermu, ki smo jih izmerili v vzdolžnih rezinah kariops divjega tipa Mn1 in mutante mn1, se je večalo od 4. do 12. DPO (Slika 4.28). Število jeder 16 DPO ni neposredno primerljivo z drugimi podatki, ker so bile rastline vzgojene v drugačnih razmerah kot materinske rastline serije 4 do 12 DPO. Jedra v endospermu smo ločili na razrede vrednosti C na podlagi frekvenčnih porazdelitev faktorja C, izračunanega iz IOG jeder (Slika 4.29). Število in pojavljanje jeder različnih stopenj endopoliploidnosti je bilo podobno v obeh genotipih. Ker je v endospermu potekala endoreduplikacija, smo v zaporednih razvojnih stopnjah našli jedra z vedno večjo vsebnostjo DNA (endopoliploidna jedra). Na sliki 4.28 je vidno število jeder, ki so v rezini v večjem številu, na frekvenčnih porazdelitvah jeder pa so vidni vrhovi tudi za jedra, prisotna v majhnem številu (Slika 4.29). 4. DPO so bila v endospermu le jedra z vsebnostjo DNA 3 C in 6 C. Šesti dan po oprašitvi so prevladovala jedra 3 C in 6 C, opazili pa smo nekaj endopoliploidnih jeder stopnje 12 C (Slika 4.29, 6 DPO). 8. DPO smo v endospermu opazili večinoma jedra 3 C, 6 C in 12 C, opazili pa smo tudi nekaj jeder 24 C. 10. DPO smo poleg jeder 3 C do 24 C opazili tudi jedra 48 C in 96 C. Jedra z najvišjo opaženo stopnjo endopoliploidnosti, 192 C, smo našli v endospermu Mn1 12. in 16. DPO, v mn1 pa 16. DPO. Z vedno večjo stopnjo endopoliploidnosti se je večala tudi velikost jeder (Slika 4.30). Pri stopnji endopoliploidnosti 24 C je premer jeder v endospermu dosegel ali presegel 20 µ m, kolikor so bile debele rezine (Slika 4.31). Jedra višjih vrednosti C pa so bila še večja, tako da so največja jedra (192 C v Mn1 12 DPO) v premeru merila kar okoli 40 µ m. Premer jeder istih stopenj endopoliploidnosti (ne upoštevaje najvišjih vrednosti C pri vsakem DPO zaradi maloštevilnih izmerjenih jeder) je bil približno enak pri Mn1 in mn1 (Slika 4.31). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 101 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2500 2000 1500 1000 500 0 Mn1 mn1 8 10 12 16 4 6 Dnevi po oprašitvi 8 10 12 16 192C 96C 48C 24C 12C 6C 3C Slika 4.28. Število izmerjenih jeder v endospermu v vzdolžnih rezinah kariops koruze divjega tipa Mn1 in mutante mn1. Pri 16. DPO prikazani podatki za eno od dveh izmerjenih rezin pri obeh genotipih (prikazani na Sliki 4.6); podatki so prikazani ločeno, ker so bile materinske rastline vzgojene v drugačnih razmerah kot za serijo 4–12 DPO. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 102 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endosperm Mn1 mn1 4 6 8 10 35 30 .. 25 o T3 .2.20 1 15 iČO 10 100 90 80 o 7° 1. 60 J" 50 S 40 •CO 20 10 / i -XI—W r"~~X 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 140 120 ._ 100 cu S, 80 o Š 60 40 20 y\ 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.29. Frekvenčna porazdelitev jeder v endospermu glede na relativno vsebnost DNA. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 103 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endosperm Mn1 mn1 12 16a 16b 250 200 150 S 100 50 300 250 te 200 ¦o ¦32, 1" 150 > *» 100 50 0 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti I k l i k^^— 140 120 ,_ 100 (U .L. 80 o '1 60 40 20 J k -xi—xi K \ >v «-------- 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti J --*- V \r Va rxix—|— 300 250 a 200 "O ¦ «o 100 50 0 J V l v \^ "\/->. 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.29. Frekvenčna porazdelitev jeder v endospermu glede na relativno vsebnost DNA. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Meje med razredi jeder z različno stopnjo endopoliploidnosti so označene s križci (×) na osi X. Pri 16. DPO prikazani podatki za dve izmerjeni rezini, pri ostalih pa za eno izmerjeno rezino. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 104 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endosperm Mn1 mn1 4 6 8 10 3,5 i» f 1,5 4 1,0 3,5 I" I» I« |,,5 1,0 3,5 I" I» I« |,,5 1,0 3,5 I" I» I« |,,5 1,0 *' 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti *» #* r •' 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3,5 -r T= 3,0 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.30. Površina preseka jeder in relativna količina DNA v jedrih v endospermu. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 105 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endosperm Mn1 mn1 12 16a 16b t 3,0 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti "fe 3,0 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.30. Površina preseka jeder in relativna količina DNA v jedrih v endospermu. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Pri 16. DPO so prikazani podatki za dve izmerjeni rezini, pri ostalih pa za eno izmerjeno rezino. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 106 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endosperm Mn1 mn1 4 6 8 10 60 50 .3 40 o Ü, 30 o 1 20 Q. 10 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 60 50 L 40 o °L 30 o 1 20 Q. 10 60 50 a 40 o S. 30 jj> 20 Q. 10 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.31. Premer jeder v endospermu glede na stopnjo endopoliploidnosti. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 107 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endosperm Mn1 mn1 12 16a 16b 60 60 50 - 50 - 3 40 - y % 40 - I. 30 -1 20 -Q. / Premer jeder o o y Jr r/\ 10 - ^r 10 - r^T 0 0 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.31. Premer jeder v endospermu glede na stopnjo endopoliploidnosti. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Prikazan je premer jeder ± SD. Vodoravna prekinjena črta predstavlja debelino vzdolžne rezine. Pri 16. DPO so prikazani podatki za dve izmerjeni rezini, pri ostalih pa za eno izmerjeno rezino. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 108 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.3.2.2 Število in prostornina celic v celotnem endospermu (ocena s 3-D modelom) V kariopsah divjega tipa Mn1 in mutante mn1 od 4. do 16. DPO smo s 3-D modelom ocenili število celic v endospermu, prostornino endosperma, prostornino embria in celotno površino endosperma (Preglednica 4.1). Osnova za oceno tridimenzionalne strukture endosperma so bile slike obrisov celic, prikazane na Sliki 4.32. V času od 4. do 12. DPO smo podatke ocenili na podlagi ene vzdolžne rezine skozi kariopso vsakega genotipa, 16. DPO pa smo izmerili podatke v dveh kariopsah za vsak genotip. V začetku razvoja (4 do 8 DPO) je bila porazdelitev celic v endospermu enakomerna (glede na njihovo velikost), v poznejšem razvoju smo majhne celice opazili le v zunanjih plasteh endosperma, osrednji del pa so napolnjevale velike celice (Slika 4.32). Število celic in prostornina endosperma sta se hitro, skoraj eksponentno večala do okrog 10. DPO. Endosperm mn1 je imel v začetku (4 in 6 DPO) več celic, nato pa je endosperm Mn1 dosegel (8 in 10 DPO) in presegel (12 in 16 DPO) število celic ter prostornino endosperma mn1 (Slika 4.33). Preglednica 4.1. Število celic, prostornina in površina endosperma Mn1 in mn1; podatki ocenjeni s 3-D modelom. Dnevi po oprašitvi (DPO) Število celic v endospermu Prostornina endosperma (mm3) Prostornina embria (mm3) Površina endosperma (mm2) Mn1 mn1 Mn1 mn1 Mn1 mn1 Mn1 738433 751145 422042 403571 31,41 33,23 9,28 5,95 1,53 1,51 0,64 0,64 44,54 45,19 mn1 4 673 1930 0,02 0,02 10-4 10-4 0,32 0,29 6 12525 25758 0,24 0,47 5×10-4 2×10-4 1,54 2,63 8 109446 88769 2,29 2,51 0,004 0,006 7,95 7,28 10 528947 492060 14,72 13,09 0,09 0,08 24,89 24,04 12 996149 676086 34,97 19,98 0,22 0,19 45,89 32,35 16a1 16b1 1 Pri 16. DPO so prikazani podatki za dve izmerjeni kariopsi, ki pa sta iz druge sezonske serije rastlin kot kariopse od 4. do 12. DPO. 19,33 14,43 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 109 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 i X I Z-Z Z- z z Zi —^— El ¦ ¦ II ^ r "V k J> r^** ši Slika 4.32. Velikost celic v medianih vzdolžnih rezinah kariopse koruze. Kariopse 16. DPO so iz druge poskusne serije kot preostale, zato so prikazane ločeno. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 110 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 107i 106i 105i 104 103i 102i 10 i 1 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Dnevi po oprašitvi 102-10 i 1 = 101i 102- c o o - Mn1 - mn1 4 6 8 10 12 14 16 18 Dnevi po oprašitvi 1 - 0,1 24 10 6 8 10 12 14 16 18 Dnevi po oprašitvi 1 0,1 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Dnevi po oprašitvi Slika 4.33. Število celic in prostornina endosperma. Število celic v endospermu, ocenjeno s 3-D modelom iz medianih vzdolžnih rezin kariops koruze (A). Razmerje med številom celic v kariopsi mutante mn1 in kariopsi divjega tipa Mn1 (B). Prostornina endosperma, ocenjena s 3-D modelom (C). Razmerje med prostornino endosperma v kariopsi mutante mn1 in kariopsi divjega tipa Mn1 (D). Pri 16. DPO sta bili izmerjeni po dve kariopsi za vsak genotip. Prikazana sta oba podatka (A, C), razmerja v B in D so izračunana iz srednjih vrednosti obeh podatkov. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 111 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 V izračunu s 3-D modelom smo celice razdelili v več razredov glede na njihovo prostornino in prikazali prispevek posameznih razredov celic k celotnemu številu celic v endospermu in prostornini endosperma (Slika 4.34). Štiri dni po oprašitvi so celice zavzemale le ozko območje velikosti celic. Celice v Mn1 so bile večje kot celice v mn1 (Slika 4.34, položaj porazdelitve 4 DPO). V naslednjih razvojnih stopnjah smo opazili pojavljanje in večanje števila vedno večjih celic in tudi manjših celic. Največ celic v endospermu so predstavljale majhne celice, ki pa, čeprav so bile številne, niso veliko prispevale k prostornini endosperma. Za povečanje prostornine endosperma so bile odgovorne predvsem velike celice, ki so zavzemale le majhen del v skupnem številu celic (Slika 4.34). Hitrost rasti je bila največja na samem začetku razvoja endosperma, potem pa se je relativni prirastek števila celic in prostornine endosperma zmanjševal; to vidimo po tem, da se razdalja med posameznimi krivuljami razporeditev celic na Sliki 4.34 zmanjšuje od 4. do 12. DPO. Endosperm obeh genotipov je bil 16. DPO manjši kot 12. DPO, vendar so bile kariopse 16. DPO iz druge sezonske serije rastlin kot kariopse 4. do 12. DPO. Ker so bile rastline vzgojene v različnih razmerah, jih ne moremo neposredno primerjati. Kljub temu je 16 DPO porazdelitev števila celic in prostornine, ki jo zavzemajo v endospermu po razredih prostornine celic, zelo podobna razporeditvi celic 12 DPO (Slika 4.34). Razmerje med številom celic v endospermu mn1 in Mn1 je najmanjše v skrajnih razredih velikosti celic. V endospermu mn1 je relativno manj zelo majhnih in zelo velikih celic kot v endospermu Mn1, predvsem v času od 8. do 16. DPO. Šestnajst dni po oprašitvi je v mn1 manj celic kot v Mn1 tudi v osrednjem območju prostornin celic, pri tej stopnji je več celic le v najmanjšem razredu velikosti celic (Slika 4.35). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 112 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 10- 102 Mn1 mn1 104 106 102 104 Prostornina celic (µm3) 106 108 Slika 4.34. Število celic in prostornina, ki jo zavzemajo celice v endospermu divjega tipa Mn1 in mutante mn1 4 do 16 DPO. Celice so razdeljene v razrede glede na njihovo prostornino. Število celic in prostornina v endospermu, ki jo zavzemajo, sta prikazana na logaritemski skali. Pri 16. DPO prikazane srednje vrednosti iz dveh izmerjenih kariops. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 113 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 10 1 0,1 0,01 102 104 106 Prostornina celic (µm3) 108 Slika 4.35. Razmerje med številom celic v endospermu mutante mn1 in divjega tipa Mn1 v posameznih razredih velikosti celic. Ker so celice urejene v razrede glede na prostornino celic, je to razmerje enako tudi razmerju prostornin endosperma, ki ga napolnjujejo celice obeh genotipov. Pri 16. DPO prikazane srednje vrednosti iz dveh izmerjenih kariops. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 114 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.3.2.3 Število in prostornina celic v celotnem endospermu (ocena s 3-D modelom) glede na stopnjo endopoliploidnosti Na osnovi slik prerezov endosperma na Sliki 4.36 smo s 3-D modelom ocenili tudi število celic z različnimi stopnjami endopoliploidnosti v celotnem endospermu. Na Sliki 4.36 je dobro vidna porazdelitev celic v endospermu. Od 4. do 8. DPO so celice z različnimi stopnjami endopoliploidnosti enakomerno razporejene po endospermu. Od 10. DPO naprej pa so bile celice z visoko stopnjo endopoliploidnosti le v osrednjem delu endosperma, celice nizkih vrednosti C pa le v zunanjih plasteh endosperma. Porazdelitev celic z vedno večjo stopnjo endopoliploidnosti (Slika 4.36) se je ujemala s porazdelitvijo celic z vedno večjo prostornino (Slika 4.32). V endospermu obeh genotipov so bile v osrednjem delu celice z visoko vrednostjo C in veliko prostornino. Razlika med genotipoma je bila v bazalnem delu endosperma, kjer so v času od 10. do 16. DPO v Mn1 prevladovale celice z vrednostmi C od 6 do 48 C, v mn1 pa le od 6 do 12 C. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 115 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 &?-^ m. Xf. <&$ Slika 4.36. Stopnja endopoliploidnosti celic v medianih vzdolžnih rezinah kariopse koruze. Stopnja endopoliploidnosti je bila izmerjena na istih rezinah kot velikosti celic (Slika 4.32). Kariopse 16 DPO so iz druge poskusne serije kot preostale, zato so prikazane ločeno. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 116 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Sestava endosperma je bila, glede na zastopanost celic z različnimi vrednostmi C, podobna pri obeh genotipih. Do 10. DPO sta endosperma obeh genotipov vsebovala približno enako število celic in imela enako prostornino, 12. in 16. DPO pa je bil endosperm mn1 veliko manjši od Mn1 (Slika 4.37). V endospermu obeh genotipov so po številu celic prevladovale celice 3 C, celic vsake nadaljnje stopnje endopoliploidnosti je bilo manj. Kljub majhnemu številu pa so celice višjih stopenj endopoliploidnosti zavzemale velik delež prostornine endosperma. Osmi dan po oprašitvi so največji del prostornine zavzemale celice 6 C, 10. DPO celice 6 C do 24 C, 12. in 16. DPO pa so največji del prostornine endosperma zavzemale celice 12 C do 48 C (Slika 4.38). 1200 1000 800 Mn1 mn1 600 400 200 0 35 30 25 20 15 10 5 0 4 6 8 1012 16 Dnevi po oprašitvi 4 6 8 1012 16 Dnevi po oprašitvi 192C 96C 48C 24C 12C 6C 3C Slika 4.37. Sestava endosperma po vrednostih C 4 do 16 DPO. Prikazana sta število celic (zgoraj) in prostornina endosperma (spodaj). Pri 16. DPO so prikazane srednje vrednosti iz dveh izmerjenih kariops. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 117 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 700 600 500 -400 8 300 > 200 Mn1 mn1 >co 100 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 3 6 12 24 48 96 192 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.38. Število celic posameznih stopenj endopoliploidnosti v endospermu in prostornina, ki jo zavzemajo v endospermu 4 do 16 DPO. Pri 16. DPO so prikazane srednje vrednosti iz dveh izmerjenih kariops. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 118 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 V času od 10. do 16. DPO se je v obeh genotipih prostornina celic povečevala s povečevanjem stopnje endopoliploidnosti. V času 4 in 6 DPO je bila prostornina vseh celic približno enaka, pri Mn1 pa smo 8. DPO prvič opazili večjo prostornino celic pri večjih vrednostih C (Slika 4.39). Povečevanje prostornine celic je bilo najbolj izrazito pri stopnjah endopoliploidnosti 6 C do 48 C. Celice 192 C so imele podobno prostornino kot celice 96 C. Primerjava medianih prostornin celic med Mn1 in mn1 je pokazala, da so bile v mn1 celice stopenj ploidnosti 24 do 192 C v času od 10. do 16. DPO manjše kot celice Mn1 (Slika 4.40). Celice istih stopenj endopoliploidnosti so imele približno enako prostornino v času 10 do 16 DPO, izstopale so le celice 48 C in 96 C v mn1 12. DPO. V zgodnjih stopnjah razvoja so bile celice 3 C večje kot v poznejših stopnjah (Slika 4.40). V času 4 do 6 DPO je bilo v endospermu mn1 več celic vseh vrednosti C kot v Mn1, ki so 6. DPO zavzemale tudi večjo prostornino v endospermu. Četrti dan po oprašitvi so celice mn1 zavzemale enako prostornino v endospermu kot Mn1, bile pa so približno dvakrat manjše kot celice v endospermu Mn1 (Slika 4.41). Od 8. do 16. DPO je bilo število 3 C celic v mn1 le 50-70 % števila celic v Mn1. 8 do 12 DPO je bilo število celic 6 C do 24 C podobno v obeh genotipih. Deseti dan po oprašitvi smo v mn1 opazili veliko več celic 48 C in 96 C. 16. DPO je bilo v endospermu mn1 v vseh razredih endopoliploidnosti manj celic kot v Mn1 (približno 50 %), zavzemale pa so le od 10 do 40 % prostornine v endospermu v primerjavi s celicami Mn1 istih stopenj endopoliploidnosti. Tudi 12. DPO so celice mn1 od 12 C do 96 C zavzemale manj prostornine (20 % do 70 %) v endospermu v primerjavi z Mn1 (Slika 4.41). Prostornina celic višjih stopenj endopoliploidnosti je bila izrazito manjša v mn1 endospermu 10. in 16. DPO (20 do 50 % prostornine celic v Mn1). Prostornina celic 24 C do 96 C je bila manjša tudi 12. DPO, vendar ne v taki meri (Slika 4.41 C). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 119 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 107 106 105 104 103 102 106 105 104 103 102 106 105 104 103 102 Mn1 mn1 4 DPO h^ 6 DPO H- 8 DPO H+-1 6 12 24 48 96 192 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti celic (vrednost C) Slika 4.39. Prostornina celic v endospermu glede na stopnjo endopoliploidnosti. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 120 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 107 106 105 104 103 102 106 105 104 103 102 106 105 104 103 102 Mn1 mn1 10 DPO T ^^^ I I 12 DPO 16 DPO 3 6 12 24 48 96 192 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti celic (vrednost C) Slika 4.39. Prostornina celic v endospermu glede na stopnjo endopoliploidnosti. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Prikazani so mediana prostornina in prvi ter tretji kvartil. Pri 16. DPO so prikazani podatki za eno od dveh izmerjenih rezin pri obeh genotipih. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 121 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 106 105 104 103 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti (C) Slika 4.40. Mediana prostornina celic v endospermu divjega tipa (črni simboli) in mutante mn1 (rdeči simboli) glede na stopnjo endopoliploidnosti 4 do 16 DPO. Pri 16. DPO so prikazane srednje vrednosti iz dveh izmerjenih kariops. Razmerje mn1 / Mn1: število celic 10 0,1 Razmerje mn1 / Mn1: prostornina endosperma Razmerje mn1 / Mn1: prostornina celic DPO -&-16 -± 12 o 10 ¦8 e6 •4 6 12 24 48 96 192 3 6 12 24 48 96 192 3 6 12 24 48 96 192 Stopnja endopoliploidnosti (C) Slika 4.41. Razmerje števila celic (A), prostornine endosperma (B) in medianih prostornin celic (C) v mn1 proti Mn1 endospermu 4 do 16 DPO. Pri 16. DPO so prikazane srednje vrednosti iz dveh izmerjenih kariops. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 122 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Celice z vsebnostjo DNA 3 C in 6 C so bile 4. in 6. DPO podobno porazdeljene glede na prostornino celic znotraj vsakega endosperma (Slika 4.42) in so zavzemale podobno prostornino v endospermu (Slika 4.43). V Mn1 smo 8. DPO opazili celice 24 C, ki so bile porazdeljene le v razredih celic z večjo prostornino (Slika 4.42). V obdobju od 10. do 16. DPO pa smo opazili izrazit vzorec porazdelitev celic različnih stopenj endopoliploidnosti. Z vsako naslednjo stopnjo vrednosti C je bilo celic manj, njihova porazdelitev, glede na prostornino celic, pa je bila vedno bolj premaknjena k velikim prostorninam celic (Slika 4.42). Prostornina, ki so jo celice posameznih vrednosti C zavzemale v endospermu, je bila podobna od 4. do 10. DPO v obeh genotipih, 12. in 16. DPO pa smo opazili manjši prispevek prostornine celic mn1 predvsem pri celicah z visokimi stopnjami endopoliploidnosti, 12 C in več (Slika 4.43). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 123 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 106 105 104 103 102 10 1 105 104 103 102 10 1 105 104 103 102 10 1 Mn1 mn1 4 DPO 6 DPO 8 DPO 192C -•-96C 48C -•-24C 12C -•-6 C -•-3C 102 103 104 105 106 107 102 103 104 105 106 107 108 Prostornina celic (µm3) Slika 4.42. Število celic v endospermu glede na prostornino celic in stopnjo endopoliploidnosti. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 124 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 106 105 104 103 102 10 1 105 104 103 102 10 1 105 104 103 102 10 1 Mn1 mn1 -•- 192C -•-96C 48C -•-24C •- 12C -•-6C — 3C 16 DPO 102 103 104 105 106 107 102 103 104 Prostornina celic (µm3) 105 106 107 108 Slika 4.42. Število celic v endospermu glede na prostornino celic in stopnjo endopoliploidnosti. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Pri 16. DPO so prikazani podatki za eno od dveh izmerjenih rezin pri obeh genotipih. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 125 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0 0,08 0,06 0,04 0,02 0 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Mn1 mn1 -•- 192C 96C •-48C -•-24C •- 12C -•-6C — 3C 102 103 104 105 106 107 102 103 104 105 106 107 108 Prostornina celic (µm3) Slika 4.43. Prostornina endosperma, ki jo zavzemajo celice v razredih glede na prostornino celic in stopnjo endopoliploidnosti. (Slika se nadaljuje na naslednji strani.) Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 126 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4 3 2 1 Mn1 mn1 10 DPO -•- 192C 96C •-48C -•-24C •- 12C -•-6C 3C 0 102 103 104 105 106 107 102 103 104 105 106 107 108 Prostornina celic (µm3) Slika 4.43. Prostornina endosperma, ki jo zavzemajo celice v razredih glede na prostornino celic in stopnjo endopoliploidnosti. (Nadaljevanje slike s prejšnje strani.) Ploščina pod krivuljo porazdelitve pomeni prostornino, ki jo zavzemajo celice posameznega razreda vrednosti C v endospermu. Pri 16. DPO so prikazani podatki za eno od dveh izmerjenih rezin pri obeh genotipih. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 127 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.1.3.2.4 Fragmentacija DNA v jedrih endosperma ob embriu V zgodnjem razvoju endosperma (do 16. DPO) smo fragmentacijo DNA opazili v obeh genotipih le v jedrih endosperma, ki so bila v celicah ob embriu. Prikazana je slika vzdolžnih rezin skozi kariopsi divjega tipa Mn1 in mutante mn1 10 DPO, pobarvanih z reakcijo TUNEL (Slika 4.44). Slika 4.44. Fragmentacija DNA v jedrih celic endosperma ob embriu. Vzdolžni rezini razvijajoče se kariopse divjega tipa Mn1 in mn1 mutante (mn1) 10 DPO. DAPI obarva vsa jedra, z reakcijo TUNEL pa močneje svetijo jedra s fragmentirano DNA. Pomen oznak: p - perikarp, em -embrio, en - endosperm. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 128 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.2 Vizualizacija celičnih procesov v koreninski čepici Del sprejet v tisk v Canadian Journal of Botany 4.2.1 Kalitev in rast kalic Semena koruze divjega tipa linije W22 so kalila 100-odstotno, vendar so se po kalitvi pokazale razlike v rasti med poprej steriliziranimi in nesteriliziranimi kariopsami. Primarne korenine kalic smo izmerili tri dni po kalitvi, ko so bile dolge 20 do 30 mm. Povprečna dolžina primarnih korenin iz nesteriliziranih zrn je bila 20 ± 7 mm, iz steriliziranih zrn pa 29 ± 7 mm (povprečje ± standardna deviacija). Razlika v dolžinah primarnih korenin je bila statistično pomembna (t test, GraphPad Prism 3.02). Kalice smo prenesli v različne substrate, kjer so rastle še 72 ur, nato smo spet izmerili dolžino primarnih korenin (Slika 4.45). Prirastek in hitrost rasti korenin v posameznih substratih sta prikazana v Preglednici 4.2. Vpliv substrata na rast primarnih korenin smo testirali posebej za sterilizirana in nesterilizirana zrna (test ANOVA in post-test po Tukeyu, GraphPad Prism 3.02). Pri kalicah, vzgojenih iz steriliziranih zrn, ni bilo razlik v dolžini primarne korenine med kalicami vzgojenimi v sterilizirani in nesterilizirani prsti, enako je veljalo za kalice vzgojene v sterilizirani in nesterilizirani vodi. Statistično značilne razlike v dolžini primarne korenine smo opazili med kalicami vzgojenimi v vodi in prsti, ne glede na sterilizacijo substrata. Pri kalicah, vzgojenih iz nesteriliziranih zrn, pa so po dolžini primarne korenine statistično odstopale le kalice vzgojene v nesterilizirani prsti. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 129 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Preglednica 4.2. Dolžina in prirastek primarnih korenin po gojenju v različnih substratih. prst voda nesterilizirana sterilizirana nesterilizirana sterilizirana NENBb NESBb SENBb SESBb NWNBb NWSBb SWNBb SWSBb začetek - 0h (mm)a 20 ± 8 30 ± 8 18 ± 5 28 ± 9 21 ± 7 31 ± 6 22 ± 8 27 ± 6 konec - 72h (mm)a 50 ± 16 62 ± 6 30 ± 12 56 ± 9 70 ± 21 77 ± 13 71 ± 30 83 ± 18 prirastek (mm) 30 32 12 28 49 46 49 56 hitrost rasti (mm h-1) 0,41 0,45 0,17 0,39 0,69 0,64 0,68 0,77 a Povprečna dolžina primarne korenine ± SD; porazdelitev dolžin za vse skupine je podobna normalni (Kolmogorov-Smirnov test za odklon opazovane porazdelitve od Gaussove, N=11 (NENB, SENB, SESB, SWNB) ali N=12 (NESB, NWNB, NWSB, SWSB)). b Oznake substratov, v katerih so rastle kalice in oznake kalic: NE – nesterilizirana prst, NW – nesterilizirana voda, SE – sterilizirana prst, SW – sterilizirana voda; SB – kalice, vzgojene iz steriliziranih zrn, NB – kalice, vzgojene iz nesteriliziranih zrn 100 75 50 25 0 0 72 Trajanje rasti v substratu (h) Slika 4.45. Dolžina primarne korenine kalic koruze. Prikazano je povprečje dolžin primarnih korenin pred prenosom v ustrezen substrat in po 72 urah rasti v tem substratu. Oznake substratov, v katerih so rastle kalice: NE – nesterilizirana prst, NW – nesterilizirana voda, SE – sterilizirana prst, SW – sterilizirana voda; SB – kalice, vzgojene iz steriliziranih zrn, NB – kalice, vzgojene iz nesteriliziranih zrn Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 130 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.2.1.1 Morfološki parametri koreninskih vršičkov Morfološke parametre koreninskih vršičkov smo izmerili v kalicah, ki so rastle v različnih substratih (nesterilizirana prst/voda, sterilizirana prst/voda). Med koreninskimi vršički korenin kalic, gojenih v različnih substratih ni bistvenih razlik glede skoraj vseh merjenih parametrov; razlika med povprečji različnih skupin je pod mejo statistične pomembnosti (Slika 4.46 C, E in G) ali tik nad njo (Slika 4.46 A, B, in D). Zaradi malo podatkov (5) v vsaki skupini test analize variance nima velike moči. Le pri širini telesa korenine smo opazili pomembne razlike (Slika 4.46 F). Statistično značilna razlika je bila opažena med koreninami, ki so rastle v prsti, in koreninami, ki so rastle v vodi, sterilizacija gojišča pa ni vplivala. Korenine, ki so rastle v prsti, so bile širše kot korenine, ki so rastle v vodi, imele pa so enako število nizov celic v prečnem preseku (Slika 4.46 F in G). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 131 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 A C E F 300 200 100 • ,; •, "• " . •" • b ab ab a 20 15 10 0 250 200 150 100 50 0 800 600 400 200 NESB NWSB SESB SWSB NESB NWSB SESB SWSB NESB NWSB SESB SWSB NESB NWSB SESB SWSB B D G 500 400 300 200 100 0 150000 100000 50000 75 50 25 ab ab NESB NWSB SESB SWSB ab ab NESB NWSB SESB SWSB NESB NWSB SESB SWSB Slika 4.46. Morfološki parametri, izmerjeni v medianih longitudinalnih rezinah vršičkov korenin, gojenih v različnih substratih. Razlike v parametrih med koreninami iz različnih substratov so testirane z analizo variance (ANOVA). Oznake podobnosti (a, b) so prirejene na podlagi posttesta po Tukeyju (stat. značilnost: F ***,; A, B, D *; C, E, G ni stat. značilnih razlik). Oznake substratov, v katerih so rastle kalice: NE – nesterilizirana prst, NW – nesterilizirana voda, SE – sterilizirana prst, SW – sterilizirana voda; SB – kalice, vzgojene iz steriliziranih zrn. N = 5 za vsak substrat. b a 0 b a 0 a a b b 0 0 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 132 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.2.2 Število celic v koreninski čepici in prostornina čepice V posameznih koreninskih čepicah smo s 3-D modelom ocenili število vseh celic in prostornino čepic devetih korenin, ki so rastle v vodi (NWSB in SWSB). Povprečno je bilo v čepici 6950 ± 290 celic, povprečna prostornina čepice pa je bila 0,039 ± 0,005 mm3 (povprečje ± standardna napaka, N = 9). Med številom celic v čepici in prostornino čepice nismo opazili povezave; koeficient r2 v linearni regresiji je bil 0,007 (Slika 4.47). 0,060 0,050 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000 0 2000 4000 6000 8000 10000 Število celic v koreninski čepici Slika 4.47. Razmerje med ocenjenim številom celic in prostornino koreninskih čepic. r2 je koeficient korelacije med številom celic in prostornino koreninskih čepic Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 133 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.2.3 Endopoliploidnost celic v koreninski čepici V vzdolžnih rezinah koreninskih vršičkov smo izmerili relativno količino DNA (IOG) v jedrih celic koreninske čepice. Slika 4.48 A prikazuje primer mediane rezine koreninske čepice z označeno velikostjo vidnega polja. Za vsako koreninsko čepico smo izmerili IOG v treh rezinah, mediani in obeh sosednjih. Tako smo dobili dovolj podatkov za izračun frekvenčnega poligona, na katerem so se pokazali vrhovi, v katerih so bile celice z različno količino DNA (Slika 4.48 B). Celice v območju meristema so po stopnji ploidnosti pripadale razredoma 2 C in 4 C. Osrednji del čepice so napolnjevale večinoma celice 4 C in 8 C, celice 16 C+ pa smo opazili na obrobju koreninske čepice (Slika 4.48 C). V vseh izmerjenih koreninskih čepicah smo našli jedra s stopnjami endopoliploidnosti 2 C, 4 C, 8 C in 16 C (Slika 4.49). Jedra s stopnjo endopoliploidnosti 32 C smo opazili zelo redko. Da bi se prepričali o resničnosti podatkov (na primer, da podatek ni izmerjen na dveh prekrivajočih se jedrih), smo še enkrat pregledali preparate. Jedra na mestih podatkov 32 C so res izstopala po velikosti (Slika 4.50 A). Zaradi malo podatkov smo jedra 32 C združili z jedri 16 C v skupen razred 16C+. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 134 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 g&sSi s/M'*'* ¦#&* ¦• *r ¦ . ». ¦ I', T 100 µm im' ¦F ¦ F i ¦ C 100 80 60 40 20 0 B i i y^ ^ 2C 4C 8C 16C+ Relativna količina DNA Slika 4.48. Stopnja endopoliploidnosti jeder v koreninski čepici. (A) Siva slika ene od medianih longitudinalnih rezin, uporabljenih za merjenje IOG. Slika je bila posneta z objektivom 10×; IOG jeder je bila merjena z objektivom 40×, velikost vidnega polja je označena s črtkanim pravokotnikom. (B) Frekvenčni poligon relativne količine DNA v jedrih, izražene v enotah vrednosti C. Navpične prekinjene črte označujejo razdelitev celic na razrede vrednosti C (2 C, 4 C, 8 C in 16 C+). (C) Stopnja endopoliploidnosti jeder v posameznih celicah v rezini na sliki A. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 135 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4 4 Slika 4.49. Relativna količina jedrne DNA v celicah čepic korenin, gojenih v različnih substratih. Prikazana je frekvenčna porazdelitev logaritmirane IOG jeder. Vrednost C v oznakah nad vrhovi ustreza količini DNA v nepodvojenem haploidnem genomu. Za vsakega od štirih substratov so prikazane porazdelitve log10(IOG) v treh koreninskih čepicah; v vsaki čepici je bila IOG izmerjena v treh zaporednih longitudinalnih rezinah (mediana in najbližji sosedi). Oznake substratov, v katerih so rastle kalice: NE – nesterilizirana prst, NW – nesterilizirana voda, SE – sterilizirana prst, SW – sterilizirana voda; SB – kalice, vzgojene iz steriliziranih zrn. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 136 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 4.50. Mediani longitudinalni rezini čepic korenin, gojenih v vodi (A) in v prsti (B). Puščica v sliki A kaže na položaj jedra 32 C. Preparata sta barvana z reakcijo po Feulgenu. Ker so se jedra iz čepic korenin, gojenih v vodi (Slika 4.49, NWSB in SWSB), jasneje ločila na posamezne vrhove po log10(IOG) vrednosti, pa tudi podatki so bili popolnejši zaradi manjšega prekrivanja jeder, smo le-teh šest čepic uporabili v nadaljnjih meritvah velikosti celic. Velikost celic smo izmerili z obrisovanjem celičnih sten in nato podatke za velikost povezali s podatki za stopnjo ploidnosti celic. Nato smo podatke o prostornini in položaju celic uporabili za oceno 3-D porazdelitve celic in iz teh izračunali povprečno prostornino celic v posameznih razredih vrednosti C. Prostornine celic se znotraj istega razreda vrednosti C niso bistveno razlikovale med proučevanimi koreninskimi čepicami (Slika 4.51). Enosmerna analiza variance logaritmiranih prostornin celic znotraj razredov vrednosti C je sicer pokazala statistično značilne razlike med povprečji v vseh razredih, razen v 16 C+, vendar je šlo le za manjše odstopanje enega (2 C: SW2 in 4 C: SW1) ali dveh preparatov (8 C: NW2 in SW2), kar je pokazal posttest po Tukeyju. Analiza variance med razredi vrednosti C je pokazala statistično značilno razliko med povprečji logaritmiranih prostornin celic, statistično značilen pa je tudi linearen trend večanja prostornin (p < 0,001, GraphPad Prism 3.02). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 137 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Povprečna prostornina celic se je večala s povečevanjem stopnje endopoliploidnosti (Slika 4.52). Prostornina celic 2 C je bila 1100 ± 100 µm3, celic 4 C 2100 ± 100 µm3, celic 8 C 8600 ± 600 µm3 in celic 16 C+ 31800 ± 4100 µm3 (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Celice smo uredili tudi glede na to, kako se je povečevala njihova prostornina in proučili število celic, ki so pripadale posameznim razredom vrednosti C, in prostornino, ki so jo celice zavzemale v koreninski čepici (Slika 4.53). Celice z najmanjšo prostornino so večinoma pripadale razredu 2 C. Z večanjem prostornine pa se je povečevala zastopanost celic z relativno večjo vsebnostjo DNA v jedrih. Največje celice so imele v jedrih 16 C in več DNA (Slika 4.53 A). Čeprav je celic z visoko stopnjo endopoliploidnosti relativno malo, te veliko prispevajo k prostornini koreninske čepice (Slika 4.53 B). Celic 2 C in 4 C je 76 % ± 2 % vseh celic v čepici (povprečje ± standardna napaka, N = 6), vendar prispevajo le 44 % ± 4 % prostornine koreninske čepice. Po drugi strani pa endoreduplicirane celice s stopnjo endopoliploidnosti 8 C in več predstavljajo le 24 % ± 2 % vseh celic, vendar napolnjujejo 56 % ± 4 % prostornine čepice. 2C ?T?T?? 4C 8C 16C+ — T i NW1 NW2 NW3 SW1 SW2 SW3 NW1 NW2 NW3 SW1 SW2 SW3 NW1 NW2 SW2 SW3 NW3 SW1 NW1 NW2 NW3 SW1 SW2 SW3 Slika 4.51. Prostornina celic različnih stopenj endopoliplodnosti v koreninskih čepicah. Prikazana je mediana, minimum, 1. kvartil, 3. kvartil in maksimum prostornine celic, izmerjene v preparatih šestih koreninskih čepic (NW1-3 in SW1-3; NW – kalice so rastle v nesterilizirani vodi in SW – v sterilizirani vodi). Podatki so ocenjeni s 3-D modelom. 10 10 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 138 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 2C 4C 8C 16C+ Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.52. Povprečna prostornina celic glede na stopnjo endopoliploidnosti. Prikazano je povprečje ± standardna napaka (N = 6) medianih prostornin celic v vsakem razredu vrednosti C v šestih koreninskih čepicah. Podatki so ocenjeni s 3-D modelom. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 139 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 A 1200 1000 800 600 400 200 0 102 B 8 6 4 2 0 103 104 105 Prostornina celic (µm3) 102 103 104 105 Prostornina celic (µm3) I ---------- 16C+ ----------8C ---------- 4C ......... 2C 1 \ t» .*. \ t ': \ ' '. \ i t ! ': \ / • \ ¦1 \ V"\ ¦i \S K. \ Ž /: W :f s -. v n. iSS^L. 106 16C+ 8C 4C " 2C /*"- / \ / * / v / v / v '"• \A .'' '' ^/\\ /-... / X \ \ .' •' / 'sV. V y «''¦¦.. s -b \ ..-• .i_.--* '¦¦.^*-^ "»v X 106 Slika 4.53. Frekvenčna porazdelitev celic v koreninski čepici glede na prostornino celic in stopnjo endopoliploidnosti. Porazdelitev števila celic z različnimi stopnjami endopoliploidnosti (A). Prispevek celic z različnimi stopnjami endopoliploidnosti k celotni prostornini koreninske čepice (B). Prikazano je povprečje ± standardna napaka (N = 6). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 140 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.2.4 Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 V koreninski čepici smo opazili značilen vzorec porazdelitve encima saharoza sintaze. Imunolokalizacijski signal je bil najšibkejši v območju meristema in vedno močnejši v smeri proti zunanjim, starejšim plastem čepice. Med vzorci porazdelitve imunolokalizacijskega barvanja v vršičkih korenin gojenih v nesterilizirani prsti (Slika 4.54), sterilizirani prsti (Slika 4.55), nesterilizirani vodi (Slika 4.56) in sterilizirani vodi (Slika 4.57) ni bilo večjih razlik. V paru so prikazane izvirne zajete sive slike in iste slike, prikazane v psevdobarvah. Rezine koreninskih vršičkov, gojenih v prsti, obkrožajo delci prsti, ki jih s previdnim spiranjem ni bilo mogoče odstraniti. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 141 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 4.54. Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 v vršičkih primarnih korenin, gojenih v nesterilizirani prsti. Imunolokalizacija, izvedena s sekundarnimi protitelesi, označenimi z zlatom, signal ojačan s srebrom. Zgoraj – rezina, inkubirana s primarnimi protitelesi proti SUS1 (1:500); spodaj – negativna kontrola z neimunim serumom. Levo – zajeta siva slika; desno – siva slika, pretvorjena v psevdobarve. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 142 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 4.55. Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 v vršičkih primarnih korenin, gojenih v sterilizirani prsti. Imunolokalizacija, izvedena s sekundarnimi protitelesi, označenimi z zlatom, signal ojačan s srebrom. Zgoraj – rezina, inkubirana s primarnimi protitelesi proti SUS1 (1:500); spodaj – negativna kontrola z neimunim serumom. Levo – zajeta siva slika; desno – siva slika, pretvorjena v psevdobarve. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 143 Slika 4.56. Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 v vršičkih primarnih korenin, gojenih v nesterilizirani vodi. Imunolokalizacija, izvedena s sekundarnimi protitelesi, označenimi z zlatom, signal ojačan s srebrom. Zgoraj – rezina, inkubirana s primarnimi protitelesi proti SUS1 (1:500); spodaj – negativna kontrola z neimunim serumom. Levo – zajeta siva slika; desno – siva slika, pretvorjena v psevdobarve. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 144 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 4.57. Imunolokalizacija izocima saharoza sintaze SUS1 v vršičkih primarnih korenin, gojenih v sterilizirani vodi. Imunolokalizacija, izvedena s sekundarnimi protitelesi, označenimi z zlatom, signal ojačan s srebrom. Zgoraj – rezina, inkubirana s primarnimi protitelesi proti SUS1 (1:500); spodaj – negativna kontrola z neimunim serumom. Levo – zajeta siva slika; desno – siva slika, pretvorjena v psevdobarve. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 145 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.2.5 Kvantifikacija imunolokalizacijskega barvanja Celice v koreninski čepici smo razdelili v dva razreda (»veliko SUS1« in »malo SUS1«) glede na jakost imunolokalizacijskega barvanja, ki smo jo ocenili iz sivih vrednosti v posameznih celicah. Za razdelitev smo uporabili merilo, po katerem naj bi celice vsakega razreda zavzemale polovico prostornine cele čepice. Na tak način smo se izognili težavam z interpretacijo sivih vrednosti, ki so v slikah vsakega preparata drugače razporejene zaradi različno močnega obarvanja preparata in zaradi razlik v zajemu slike (Slika 4.58, frekvenčni poligoni). Ker imunolokalizacijsko barvanje ni stehiometrično, ne moremo sklepati na pravo količino SUS1 proteina v celicah, lahko pa vidimo, v katerih celicah je količina SUS1 nad neko izbrano mejo, in predvsem, kje točno so te celice (Slika 4.58, levo). Svetle celice z majhno jakostjo barvanja za SUS1 so vrh v frekvenčnem poligonu sivih vrednosti, temne celice z visoko jakostjo barvanja za SUS1 pa so v dolgem levem repu vrha (Slika 4.58, desno). Povprečna prostornina »malo SUS1« celic je bila 2700 ± 200 µm3, prostornina »veliko SUS1« celic pa je bila 12100 ± 3800 µm3 (povprečje ± standardna napaka, N = 3, izračunano iz medianih prostornin v posameznih čepicah). Celice z majhno prostornino so večinoma pripadale »malo SUS1« razredu, s povečevanjem prostornine celic pa se je povečevala zastopanost celic z močnim imunolokalizacijskim signalom za SUS1 (Slika 4.59 A). V razredu »veliko SUS1« je bilo 28 % ± 7 % celic od vseh celic v čepici, napolnjevale pa so polovico prostornine čepice (Slika 4.59 B), v skladu z našo razdelitvijo celic v dva razreda. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 146 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 %> malo SUS1 veliko SUS1 1500 1000 500 veliko SUS1 I malo SUS1 50 100 150 200 250 minimalna siva vrednost . • «? & *7 > malo SUS1 ' veliko SUS1 | 1500 1000 500 0 0 50 100 150 200 250 minimalna siva vrednost „^: ¦ malo SUS1 • # |* veliko SUS1 | 1500 1000 500 0 0 50 100 150 200 250 minimalna siva vrednost Slika 4.58. Razporeditev celic, ki vsebujejo malo ali veliko SUS1 antigena, v koreninski čepici. Prikazane so razporeditve celic obeh razredov imunolokalizacijskega barvanja v čepicah treh korenin, gojenih v destilirani vodi. Na grafih koreninske čepice (levo) je premer simbolov, ki označujejo položaje celic, v sorazmerju z ocenjenim premerom celic. Na frekvenčnih poligonih (desno) je prikazana meja razdelitve celic v razreda »malo SUS1« in »veliko SUS1« glede na minimalno sivo vrednost v celici. Meja je postavljena tako, da celice vsakega razreda zavzemajo polovico prostornine celotne čepice; na osi y je prikazano ocenjeno število celic v celotni čepici. 100 200 300 400 500 600 700 800 100 200 300 400 500 600 0 0 700 800 100 200 300 400 500 600 700 800 100 200 300 400 500 600 700 800 100 200 300 400 500 600 700 800 100 200 300 400 500 600 700 800 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 147 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 A 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 102 B 10 8 6 4 2 0 102 --------- veliko SUS1 --------malo SUS1 103 104 105 Prostornina celic (µm3) 106 veliko SUS1 malo SUS1 1 03 1 04 1 05 Prostornina celic (µm3) 106 Slika 4.59. Frekvenčna porazdelitev celic v koreninski čepici glede na prostornino celic in jakost imunolokalizacijskega signala za SUS1. Porazdelitev števila celic z močnim (veliko SUS1) ali šibkim (malo SUS1) signalom za SUS1 (A). Prispevek celic z močnim ali šibkim signalom za SUS1 k celotni prostornini koreninske čepice (B). Prikazano je povprečje ± standardna napaka (N = 3). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 148 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 4.2.6 Povezava imunolokalizacijskega signala za SUS1 s stopnjo endopoliploidnosti celic Zastopanost celic z visoko jakostjo imunolokalizacijskega signala za SUS1 se je večala s povečevanjem prostornine celic podobno, kot se je večala zastopanost celic z vedno višjo stopnjo endopoliploidnosti (Slika 4.59 in Slika 4.53). Prav tako se je tudi prostorska razporeditev »veliko SUS1« celic (Slika 4.58 levo) prekrivala predvsem z razporeditvijo celic z visoko vsebnostjo DNA jedrih (Slika 4.48 C). Z iskanjem prostorsko najbližjih podatkov za jakost imunolokalizacijskega barvanja in relativno količino DNA v celicah v različnih rezinah smo ocenili, da bi imelo okrog 90 % 16 C+ celic tudi močan signal za SUS1 (»veliko SUS1«), v nasprotju z le 5 % 2 C celic (Slika 4.60). 100% 80% 60% 40% 20% 0% 2C 4C 8C 16C+ Stopnja endopoliploidnosti Slika 4.60. Razmerje med stopnjo endopoliploidnosti in jakostjo imunolokalizacijskega signala za SUS1 v celicah koreninske čepice. Število celic v celotni čepici je ocenjeno z modelom, ki so ga opisali Bengough in sod. (2001). Stopnja endopoliploidnosti in jakost imunolokalizacijskega signala za SUS1 sta bili izmerjeni v različnih rezinah in povezani na podlagi položaja celic v rezinah koreninske čepice. Povprečen delež celic z močnim signalom za SUS1 je bil izračunan za vsako stopnjo endopoliploidnosti v devetih čepicah; prikazano je povprečje ± standardna napaka. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 149 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5 RAZPRAVA IN SKLEPI 5.1 Razprava 5.1.1 Metode Že v preteklosti so natančno opazovali razvoj kariopse koruze (Kiesselbach, 1949) in razvoj mutante mn1 (Lowe in Nelson, 1946), vendar so šele novejše tehnologije omogočile res kvantitativne raziskave razvoja organov. Povezava svetlobne mikroskopije in računalniške analize slike v metodi slikovne citometrije je omogočila meritve različnih morfoloških parametrov in meritve različnih barvanj v preparatih. Natančno umerjen merilni sistem (mikroskop in kamera) lahko uporabljamo za kvantitativne denzitometrične metode. Takšna je na primer merjenje količine DNA v jedrih (Vilhar in sod., 2001), ki omogoča natančne meritve, ker lahko izbiramo jedra v posameznih fazah celičnega cikla, izognemo pa se tudi meritvam poškodovanih jeder. V naši raziskavi smo uporabili metodo slikovne citometrije za merjenje relativne količine DNA v jedrih. V vsakem preparatu kariopse smo izmerili IOG (ki je sorazmerna s količino DNA), nato pa smo podatke preračunali v vrednosti C glede na notranji standard. Kot standardno vrednost smo vzeli prvi vrh razporeditve IOG v embriu in mu priredili vrednost 2 C. Embrio je zagotovo diploidno tkivo z neredupliciranim genomom, saj v njem potekajo intenzivne mitoze. V zgodnjih stopnjah razvoja kariopse je bil embrio sestavljen še iz maloštevilnih celic, zato smo kot standard 2 C vzeli prvi vrh razporeditve IOG v perikarpu, ki je prav tako diploidno tkivo. Položaj vrha 2 C v frekvenčni porazdelitvi IOG jeder v perikarpu se je ujemal s položajem vrha 2 C v embriu starejših razvojnih stopenj. Jedra v endospermu so triploidna, zato so bili vrhovi vrednosti C 3, 6, 12 in tako naprej. Diploidno stanje embria in triploidno stanje endosperma je bilo potrjeno s štetjem kromosomov. V jedrih embria je 20 kromosomov, v jedrih endosperma pa 30 (Kiesselbach, 1949). Kowles in sod. (1990) so kot standard za določitev relativne količine DNA v jedrih endosperma prav tako uporabili jedra embria. Za določitev absolutne količine DNA so uporabili tudi piščančje eritrocite, vendar to ni bilo preveč natančno zaradi variabilnih podatkov o vsebnosti DNA v piščančjih eritrocitih. Premer jeder s stopnjo endopoliploidnosti 24 C in Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 150 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 več je bil enak debelini rezine ali celo večji (Slika 4.31), zato v rezinah nismo zajeli celotnih jeder. V jedrih je bilo zato vedno manj DNA glede na pričakovano vrednost. Kljub temu jih je bilo še vedno mogoče ločiti na posamezne vrhove v frekvenčnih porazdelitvah relativne vsebnosti DNA, le da so bili vrhovi pri višjih vrednostih C vedno bližje skupaj (Slika 4.29). V preparatih smo izmerili tudi velikosti celic in nato s 3-D modelom ocenili število vseh celic v endospermu. Število vseh celic v endospermu koruze so ocenili že s pretočno citometrijo in hemocitometrom, vendar se z omenjenima metodama izgubi informacija o razporeditvi celic v tkivu, ker je treba tkivo razstaviti na posamezne celice. Velika prednost slikovne citometrije je prav v tem, da omogoča tudi zapisovanje prostorske informacije, ko celične parametre merimo na specifično pobarvanih histoloških rezinah skozi tkivo. S pretočno citometrijo so število celic v endospermu ocenili nenavadno nizko (Kowles in sod., 1990) v primerjavi z metodo štetja celic s hemocitometrom (Jones in sod., 1985) in našimi rezultati. Ko izmerimo podatke na histološki rezini skozi tkivo, moramo za pregled nad stanjem v celotnem tkivu matematično oceniti število celic v treh dimenzijah. Zakaj je treba ovrednotiti podatke v treh dimenzijah? Samo iz preseka skozi tkivo ne moremo oceniti, kakšna so resnična razmerja med posameznimi skupinami celic v celotnem organu. Razlika je vidna ob primerjavi števila jeder posameznih vrednosti C, izmerjenih v endospermu v vzdolžni rezini (Slika 4.28), in ocenjenega števila vseh celic v endospermu (Slika 4.37). V prerezu je bilo podcenjeno število majhnih celic na robu endosperma. Tridimenzionalno strukturo tkiv je treba oceniti po stereoloških metodah, vendar ker je veliko rastlinskih tkiv radialno simetričnih, lahko tridimenzionalno strukturo ocenimo z vrtenjem podatkov okoli osi tkiva (Bengough in sod., 2001). Koreninska čepica je idealno radialno simetrična, zato smo njeno strukturo ocenili z vrtenjem celotnih podatkov okoli mediane osi vzdolžne rezine, kot to opisujejo Bengough in sod. (2001). Da bi lahko primerjali zgradbo endosperma divjega tipa in mutante mn1, smo izpeljali prilagojen matematični model. Ker celotno tkivo endosperma ni radialno simetrično, smo podatke o celicah v endospermu vrteli po posameznih vrsticah podatkov in nato sešteli posamezne krožne preseke. V modelu smo upoštevali tudi drugačno strukturo endosperma v predelu, kjer v njem ali ob njem raste embrio. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 151 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slaba stran uporabljene metode slikovne citometrije je njena zamudnost. Za vsako kariopso je treba pregledati celotno vzdolžno rezino po zaporednih vidnih poljih (približno 320 vidnih polj za preparat Mn1 12 DPO) in označiti vsa jedra, ki jih je bilo v pregledanih preparatih od 5000 do 8000, nato pa še ročno obrisati stene celic v endospermu, ki jih je bilo v preparatih od 100 (Mn1 4 DPO) do 6000 (Mn1 12 DPO). Zato smo si najprej s pregledovanjem preparatov ustvarili vtis o poteku razvoja pri endospermu Mn1 in mn1 in nato izbrali po eno tipično kariopso za vsak genotip za vsako stopnjo razvoja od 4. do 12. DPO, 16. DPO pa dve. Nato smo na vzdolžnih rezinah ovrednotili velikost celic in zastopanost jeder posameznih razredov vrednosti C. Težava metode je v tem, da podatki za zaporedne razvojne stopnje niso bili izmerjeni na istih kariopsah, ker meritev vključuje njihovo žrtvovanje. Ker je bilo podatkov premalo za statistične analize, smo si pri ovrednotenju podatkov pomagali z dejstvom, da smo opazovali razvojni proces skozi čas. Podatki, za katere je veljalo časovno odvisno padanje, večanje ali nespremenjeno stanje, so najverjetneje predstavljali resnične procese v razvoju kariopse. V koreninski čepici smo poleg kvantitativnega ovrednotenja količine DNA in velikosti celic tudi semikvantitativno ovrednotili količino imunolokalizacijskega barvanja saharoza sintaze. Ker reakcija imunolokalizacije ni stehiometrična, tako kot je bila uporabljena metoda barvanja DNA, smo celice v čepici na podlagi sivih vrednosti v sliki celic razdelili le na dva razreda: močno in šibko pobarvane celice. Kljub temu nam je že takšna groba razdelitev podatkov omogočila vpogled v odvisnost med nalaganjem saharoza sintaze, stopnjo endoploidnosti celic in velikostjo celic. Še natančnejše analize razvoja organov pa bodo mogoče, ko bodo razvite tehnike, ki bi omogočale neinvazivno preiskovanje intaktnih organov na ravni posameznih celic. Tehnologije, ki bi to lahko omogočale, so na primer računalniško podprta tomografija (Stuppy in sod., 2003), nuklearna magnetna resonanca (Roscher in sod., 1998) in morda tudi snemanje bioluminiscence (Chaerle in Van Der Straeten, 2001). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 152 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5.1.2 Zakaj je endosperm mn1 majhen? Šestnajst dni po oprašitvi je bila prostornina endosperma divjega tipa 32 mm3, sestavljalo ga je 740.000 celic. Prostornina enako starega endosperma mutante mn1 pa je bila približno 8 mm3, sestavljalo ga je 410.000 celic. Velika razlika v prostornini, v našem primeru je imel endosperm mutante mn1 le 25 % prostornine endosperma divjega tipa, je že pred pol stoletja belila glave raziskovalcev. Mutanto mn1 z zelo prizadetimi semeni sta že leta 1946 opisala Lowe in Nelson, a šele nova kvantitativna mikroskopska tehnika nam je omogočila pojasnitev nekaterih morfoloških posebnosti mutantine kariopse. Naši rezultati o zmanjšani prostornini endosperma mn1 in zmanjšanem številu celic v primerjavi z Mn1 16 DPO nakazujejo, da sta v endospermu mutante prizadeta tako delitev celic kot tudi njihovo povečevanje. Da bi ugotovili, kdaj in zakaj pride do prizadetega razvoja endosperma mutante mn1, smo raziskali zgodnji razvoj kariopse pri divjem tipu in mutanti mn1. 5.1.2.1 Razvoj materinskega tkiva Pregled vzdolžnih rezin kariops je pokazal, da je materinsko tkivo perikarpa 4. DPO že skoraj v celoti oblikovano. V vseh razvojnih stopnjah v obeh genotipih je bilo število jeder približno enako (Slika 4.11). Da je bilo v perikarpu Mn1 16 DPO izmerjenih manj jeder (Slika 4.11) je verjetno posledica metodološke ovire. Tudi če bi bilo v obeh genotipih približno enako število jeder, bi v rezini kariopse mn1 zajeli večji delež vseh jeder v perikarpu, ker je kariopsa divjega tipa večja kot kariopsa mutante. Ker se kariopsa v razvoju od 4. do 16. DPO povečuje (Slike 4.1 do 4.6), smo v vzdolžni rezini vedno zajeli manjši delež vseh jeder v perikarpu. V celotnem perikarpu se torej število jeder med razvojem kariopse verjetno povečuje, vendar z relativno majhnim prirastkom. S 40 % manj jeder od povprečja v preostalih kariopsah divjega tipa je izstopal perikarp Mn1 10 DPO, kar bi bilo lahko povezano z drugačnim genotipom endosperma. Kariopsa Mn1 10 DPO se je razlikovala od drugih kariops divjega tipa po tem, da je bila vzgojena na rastlini Mn1, oprašeni s pelodom mn1 (genotip perikarpa je bil enak kot pri drugih: Mn1Mn1, genotip Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 153 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endosperma pa je bil Mn1Mn1mn1), medtem ko so bile preostale kariopse s fenotipom divjega tipa homozigoti. V perikarpu smo 6. DPO opazili pojav prvih endopoliploidnih jeder z vsebnostjo DNA 8 C. Jedra z vrednostjo 8 C so bila od pojava naprej, še zlasti pa 12 DPO in pozneje, v perikarpu ves čas prisotna (Sliki 4.5 in 4.6). Čas skokovitega povečanja števila jeder 8 C 12. DPO se sklada z intenzivnim povečanjem prostornine endosperma (Preglednica 4.1). Povečanje vsebnosti jedrne DNA zaradi endoreduplikacije spremlja ustavitev mitotske aktivnosti in povečanje celice (Joubes in Chevalier, 2000). Z endopoliploidizacijo celic perikarpa in s tem povezanim povečanjem celic bi se perikarp povečal brez dodatnih delitev celic in tako sledil povečevanju površine endosperma. Na ta način se povečujejo celice v povrhnjici listov v Arabidopsis (Melaragno in sod., 1993). Povečanje stopnje endopoliploidnosti celic v perikarpu je bilo enako v Mn1 in v mn1, kar kaže, da za sprožitev endoreduplikacije ni potreben normalen razvoj filialnega tkiva. Posledično normalen razvoj perikarpa vodi do nastanka »prevelikega« prostora, znotraj katerega se razvija prizadeti endosperm mutante mn1. Po metodi, ki jo opisujeta Barow in Meister (2003), smo za perikarp izračunali vrednost cikla 0,55. To je več od postavljene zgornje meje za nepoliploidna tkiva 0,1. Na tej osnovi lahko perikarp koruze uvrstimo med endopoliploidna tkiva. Domnevamo, da je vrednost cikla 0,55 nekoliko previsoka, saj zaradi uporabljene metode na preparatih gotovo nismo izmerili vseh jeder, prekrivanje jeder pa je problematično predvsem pri majhnih jedrih. Posledično izračunano razmerje med posameznimi razredi vrednosti C ni povsem točno. V izvorni metodi je bila namesto slikovne citometrije uporabljena pretočna citometrija (Barow in Meister, 2003). V nadaljevanju smo v obeh genotipih pregledali materinsko tkivo nucela, znotraj katerega se razvija filialna generacija. Nucel napolnjuje velik del prostornine kariopse do 8. DPO, čeprav se število opaženih jeder zmanjšuje že od 4. DPO. 12. DPO v območju nucela z našo tehniko nismo več zasledili jeder, smo pa ostanke brezjedrne nucelarne membrane lahko videli na mikroskopskih preparatih med endospermom in perikarpom (Slika 4.20). V nucelu smo opazili tudi nekaj endopoliploidnih jeder z vsebnostjo DNA 8 C, kar po izračunani vrednosti cikla (Barow in Meister, 2003) 0,8 tudi nucel uvršča med endopoliploidna tkiva. Razmerje vrhov, ki je v prid jedrom z večjo stopnjo Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 154 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endopoliploidnosti v Mn1 v primerjavi z mn1 (Slika 4.8), kaže na intenzivnejšo endoreduplikacijo v Mn1 v primerjavi z mn1. Vzrok temu je najverjetneje variacija med dvema populacijama rastlin znotraj linije W22. Endosperm med svojo rastjo izpodriva celice nucela. V njih se sproži programirana celična smrt. Ta je apoptotične narave, na kar kaže fragmentacija DNA v jedrih, ki smo jo zasledili z reakcijo TUNEL (Slika 4.10). Enak signal z reakcijo TUNEL v jedrih obeh genotipov kaže na enak proces umiranja celic nucela. Podobne avtolitične procese so opazili med embriogenezo v razvijajoči se kariopsi koruze tudi v drugih tkivih, ki ne prispevajo k odrasli rastlini koruze (Giuliani in sod., 2002). 5.1.2.2 Razvoj embria Za rastlino najpomembnejši del kariopse je diploidni embrio, iz katerega se razvije hčerinska rastlina. Oplojena jajčna celica se začne deliti precej pozneje kot prvo jedro endosperma. Tudi mladi embrio se v zgodnjih fazah razvija precej počasneje kot endosperm. Ob prvi delitvi zigote, približno 40 ur po oploditvi, ima endosperm od 8 do 32 prostih jeder (Bommert in Werr, 2001). Prva delitev je orientirana pravokotno na os mikropila-halaza, tako da nastaneta majhna apikalna in velika bazalna celica (Bommert in Werr, 2001). Iz slednje se razvije suspenzor, ki pozneje odmre v procesu programirane smrti (Giuliani in sod., 2002). Majhna apikalna celica se razvije v embrio. Okrog 4. DPO embrio nima več kot 12 celic (Bommert in Werr, 2001). Glede na število jeder v vzdolžni rezini, so celične delitve v embriu od začetka spremljanja 4 DPO do 16 DPO pogoste, tako da je rast eksponentna. Večanje števila jeder v vzdolžni rezini je do 12. DPO enako pri obeh genotipih, 16. DPO pa je v mn1 bistveno manj jeder (Slika 4.25). Iz tega sklepamo, da je 16. DPO v embriu manj celic, zaradi česar je bil embrio mn1 tudi veliko manjši od embria Mn1 (Slika 4.6). Embrio je na tej stopnji prehransko že odvisen od endosperma (Kiesselbach, 1949) in ker je bil endosperm mn1 zelo prizadet, je bila slabša tudi rast embria. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 155 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5.1.2.3 Razvoj endosperma Del objavljen v Plant Physiology 129 (2002) 23-30. (Priloga A) Ker v materinskem tkivu divjega tipa in mutante nismo zasledili razlik v procesih in ker embrio bistveno ne prispeva k velikosti kariopse, smo predpostavili, da je opažen majhen fenotip kariopse mutante izključno posledica metabolizma v samem endospermu. Razlike smo nato raziskali na celični ravni. Prve tri jedrne delitve v triploidnem endospermu sledijo dokaj predvidljivim ravninam celičnih delitev, ki oblikujejo bolj ali manj organizirana delitvena območja. Sledijo hitre sinhrone delitve, ki vodijo do nastanka sincicijskega tkiva. Nato jedra potujejo na obrobje in se poravnajo vzdolž plazmaleme (Bommert in Werr, 2001). Celularizacija se začne s posebno obliko citokineze na stopnji do 1000 jeder in se nadaljuje centripetalno, dokler celotna endospermska votlina ne vsebuje jasno razločenih celic. Ponavadi je proces končan 4 DPO. Med celularizacijo se že oblikujejo trije glavni endospermski celični tipi: bazalne prenosne celice; območje, ki obdaja embrio; škrobni endosperm in alevronska plast (Bommert in Werr, 2001). Končani celularizaciji sledijo asinhrone mitotske delitve enojedrnih celic. Štiri dni po oprašitvi smo v endospermu divjega tipa izmerili okrog 700 celic, v endospermu mutante pa okrog 2000 celic (Preglednica 4.1). V času 6 DPO je bil endosperm Mn1 dvakrat manjši od mn1, tako po številu celic kot tudi po prostornini endosperma, v času 8 do 10 DPO pa je bil endosperm obeh genotipov približno enake velikosti (Slika 4.33 B in D). Več celic v zgodnjih fazah razvoja endosperma mutante je lahko posledica hitrejšega prehoda iz sincicijske faze v celularizacijsko. Mogoče je, da se je glede na število celic 4 DPO celularizacijska faza v divjem tipu šele končala. Sočasno bi bila lahko v mn1 celularizacija končana že prej in bi celice že prešle v prvi cikel mitotskih delitev. Iz dinamike rasti endosperma Mn1 in mn1 je razvidno, da je bil prirastek celic 6 DPO v mn1 precej manjši kot v divjem tipu, kar je povzročilo izenačenje števila celic in prostornine 8 DPO. Ali je hitrejši zgodnji razvoj endosperma mutante vezan na konkretni natančno izmerjeni osebek ali pa se endosperm mn1 v začetku vedno razvija hitreje, ni Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 156 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 jasno. Iz mikroskopskega pregleda več kariops pa lahko sklepamo, da je taka rast endosperma mutante običajna pri proučevani liniji rastlin. Število celic endosperma se skoraj eksponentno veča od 4. do 10. DPO (Slika 4.33), vendar je bila rast najhitrejša od 4. do 6. DPO. Pričakovali bi, da je pogostost mitoz največja na začetku razvoja endosperma, vendar Kowles in Phillips (1985) poročata o vrhu mitotske aktivnosti šele 8 do 10 DPO. Deset dni po oprašitvi se logaritemska krivulja števila celic ukrivlja navzdol. To pomeni upočasnjeno povečevanje števila celic pri obeh genotipih (Slika 4.33), čeprav je bil manjši prirastek števila celic v mn1 bistveno bolj izražen in sočasen s pojavom majhnega fenotipa kariopse mutante mn1 (Slika 4.4). Kowles in Phillips (1985) sta po desetem dnevu po oprašitvi izmerila hitro zmanjšanje mitotskega indeksa. 14 DPO in pozneje sta v osrednjem delu endosperma izmerila le eno mitotsko jedro na 413 opazovanih. Z našim 3-D modelom smo ocenili, da je 12 DPO v endospermu divjega tipa okrog 1.000.000 celic in v endospermu mutante okrog 700.000 celic. To število je približno podobno ugotovitvam Jonesa in sod. (1985), ki so pri tej starosti kariopse prav tako izmerili od 700.000 do 900.000 celic v križancu A619 x W64a. O precej manj celicah endosperma v enako starih kariopsah, le 200.000 po oceni s pretočno citometrijo, pa poročajo Kowles in sod. (1990). V primerjavi z divjim tipom se po dokaj izenačeni rasti med 6. in 8. DPO, deset dni po oprašitvi število celic primerjalno zmanjšuje v mutanti, ki ima 12. DPO le še 68 % celic Mn1 in 16. DPO celo le 55 %. Še očitnejše je zmanjšanje prostornine endosperma mutante, ki se iz podobne prostornine okrog 10. DPO zmanjša na 57 % 12. DPO in 16. DPO zavzema le še 24 % prostornine divjega tipa (Preglednica 4.1). Navedeni rezultati kažejo, da k majhnosti endosperma prispeva tako manjša mitotska aktivnost kot tudi manjše celice. Kljub zmanjšanju mitoz v osrednjem delu (Kowles in Phillips, 1985) so mitotsko aktivnost zasledili na obrobju endosperma do 20. DPO ali v nekaterih primerih še pozneje (Kowles in sod., 1990). Znatno število jeder z vsebnostjo DNA 3 C in 6 C na obrobju endosperma divjega tipa in mutante v času do 16 DPO (Slika 4.36) kaže, da se celice delijo tudi v tem primeru. Sočasno z zmanjševanjem mitoz se v posameznih jedrih celic osrednjega območja začne zelo povečevati količina DNA v procesu endoreduplikacije. Take celice se praviloma ne delijo več, temveč zelo zrastejo (Kondorosi in sod., 2000), s čimer se poveča Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 157 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 njihova prostornina (Slika 4.39). Spremembe v vsebnosti DNA so asinhrone, tako da je v jedrih sosednjih celic lahko zelo različna vsebnost DNA. Potek ciklov endoreduplikacije in sočasno povečevanje prostornine celic smo zasledili v obdobju 8 do 16 DPO (Slike 4.36, 4.32 in 4.39). V času od 8 do 12 DPO je bilo v osrednjem območju velikosti celic približno enako število celic. Opazna pa je bila težnja, ki se je stopnjevala do 16. DPO, zmanjševanja števila celic v mn1 v najmanjših in največjih razredih celic (Slika 4.35). Najmanjše celice so bile le na obrobju endosperma (Slika 4.32) in zmanjšanje njihovega števila v mn1 je tako lahko posledica manj delitev v primerjavi z divjim tipom. Manj največjih celic v mn1 pa nakazuje možnost, da je bilo v endospermu mutante prizadeto širjenje največjih celic. Ker so bile take velike celice predvsem v osrednjem endospermu, je bilo s prizadetim širjenjem celic v resnici prizadeto širjenje osrednjega dela endosperma. Čeprav v endospermih obeh genotipov večino prostornine zavzemajo velike celice (Slika 4.34), pa njihovo manjše število v osrednjem delu endosperma mn1 povzroči ekstremno zmanjšano prostornino po dvanajstem dnevu po oprašitvi (Preglednica 4.1). Ohranjene mitoze v perifernem delu endosperma (Slika 4.36, Kowles in Phillips, 1985) omogočajo širitev tkiva, ki je nujna zaradi velike širitve celic v osrednjem delu (Slika 4.32). Ker širjenje celic v endospermu mn1 ni tako izrazito, tudi ni nujno povečevanje površine endosperma. Opaženo manjše število obrobnih celic je morda neposredna posledica manjših celic v sredini. Morebitna posledica takih procesov je tudi različna oblika endosperma obeh genotipov. Sploščen apikalno-dorzalni del endosperma mn1 kaže, da je periferna plast endosperma »pripravljena« na širjenje, ker pa ni povečevanja celic osrednjega dela endosperma, površina ni »napeta«. Dejavnik, ki je povezan z velikostjo celic, je tudi količina DNA v jedrih (Kondorosi in sod. 2000). Zanimalo nas je, ali je ta v endospermu mn1 ohranjena. Tako v endospermu divjega tipa kot v mutanti smo prvi cikel endoreduplikacije zasledili 6. DPO, 16 DPO pa je bilo v obeh genotipih zaključenih vsaj 6 ciklov endoreduplikacije (Slika 4.29), kar kaže, da proces endoreduplikacije v mutanti ni prizadet. Štirje do pet ciklov endoreduplikacije v endospermu je splošnih pri večini pregledanih linij koruze, čeprav posamezna jedra nekaterih genotipov lahko dosežejo tudi do osem ciklov (Kowles in Phillips, 1985). Kowles in sod. (1992) poročajo o pregledu 35 mutant koruze, ki so imele manj celic in Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 158 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 zmanjšano stopnjo endoreduplikacije, razen ene mutante, ki je imela manj celic, a ohranjeno endoreduplikacijo. Kaže, da je mutanta mn1 primer podoben slednjemu. Iz tega lahko sklepamo, da ni splošnega pravila o neposredni povezanosti endoreduplikacije in mitoze v endospermu koruze, kot so iz pregleda mutant zaključili Kowles in sod. (1992). V obeh genotipih je bilo zelo podobno število jeder posameznih stopenj endopoliploidnosti (Slika 4.28, izmerjeno v vzdolžnih rezinah). Tudi ko smo podatke s 3-D modelom ocenili v vsem endospermu, so se sicer spremenila razmerja med celicami različnih vrednosti C, vendar so bili deleži celic posameznih vrednosti C v vsem endospermu podobni v obeh genotipih (Slika 4.37). Od 10. DPO naprej je bilo največ celic v obeh genotipih v razredu celic 3 C. Število celic se je zmanjševalo s povečevanjem stopnje endopoliploidnosti. Največji del prostornine endosperma so v obeh genotipih zavzemale celice visokih vrednosti C, z vrhom pri enakih C vrednostih v obeh genotipih (Slika 4.38). Premer jeder se je večal s stopnjo endopoliploidnosti, med jedri Mn1 in mn1 pa ni bilo večjih razlik v velikosti (Slika 4.31). Število celic različnih stopenj endopoliploidnosti je bilo različno pri obeh genotipih, vendar je bila razlika sorazmerna z razliko v številu celic pri obeh genotipih (Slika 4.33 B). Razlika je najbolj izrazita 16. DPO, kjer je bila pri vsaki stopnji endopoliploidnosti v mn1 le približno polovica celic v Mn1 (Slika 4.41 A). V endospermu mn1 je bilo v času od 8 do 16 DPO predvsem na obrobju manj celic 3 C kot v Mn1, kar je lahko znak za manj celičnih delitev (Slika 4.41 A). Več celic visokih stopenj endopoliploidnosti 10. DPO je verjetno posledica metodološke napake pri izbiri preparata/meritvi, saj je takšnih celic pri obeh naslednjih stopnjah (12 in 16 DPO) manj v mn1 kot v Mn1. Iz naših rezultatov lahko ugotovimo, da je korelacija med prostornino celic in stopnjo endopoliploidnosti celic (Slika 4.39 in Slika 4.42). Kowles in Phillips (1985) sta poročala tudi o statistično visoko značilni korelaciji med vsebnostjo DNA in prostornino jeder. S poznejšimi meritvami (Kowles in sod. 1990) so pozitivno korelacijo sicer potrdili, a kljub temu ugotovili, da ni tolikšna kot so poprej sklepali. Ne glede na to pa so še vedno opazili jasno težnjo, v kateri se med razvojem do 20. DPO veča delež večjih jeder. Čeprav je bila pozitivna povezava med prostornino celic in endopoliploidnostjo jasna tudi v celicah endosperma mutante mn1, pa so bile celice v vseh razredih vrednosti C v mn1 praviloma manjše od celic v Mn1 (Slika 4.40). Z napredovanjem endoreduplikacijskih ciklov se je Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 159 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 razlika še povečevala, kar kaže, da je bilo širjenje celic še posebno prizadeto pri višjih stopnjah endopoliploidnosti. 10. in 16. DPO je bila prostornina celic od 12 C do 192 C v mn1 le 30 do 50 % prostornine celic v Mn1. Dvanajst dni po oprašitvi smo prav tako opazili manjše celice, vendar v manjšem obsegu. Celice mn1 od 24 C do 96 C so imele 70 % prostornine celic Mn1 (Slika 4.41 C). Največji del endosperma so napolnjevale celice visokih vrednosti C (Slika 4.38 in Slika 4.43). Rezultati naše raziskave kažejo, da je prostornina, ki jo zavzemajo celice visokih vrednosti C v endospermu mn1, zelo zmanjšana v primerjavi z Mn1 v času od 10 do 16 DPO zaradi skupnega učinka manjše prostornine celic in manjšega števila celic (Slika 4.38 in Slika 4.43, razmerje: Slika 4.41). Sliki 4.42 in 4.43 prikazujeta razmerje med prostornino celic, stopnjo endopoliploidnosti in številom celic oziroma prostornino celic, ki jo zavzemajo v endospermu. Vzorec porazdelitev je podoben pri obeh genotipih, od 10. do 16. DPO pa lahko opazimo manj največjih celic (Slika 4.42, skrajni desni konec frekvenčnih porazdelitev je pri mn1 potisnjen malce v levo). Čeprav je bilo malo celic visokih stopenj endopoliploidnosti, zavzemajo večji del prostornine v endospermu (Slika 4.43). Na primer v endospermu divjega tipa 12. in 16. DPO celice 3 C in 6 C predstavljajo 80 % vseh celic in zavzemajo le 20 % prostornine endosperma, celice s stopnjo endopoliploidnosti 24 C in več pa predstavljajo le 7 % vseh celic in zavzemajo kar 60 % prostornine endosperma. Splošna razporeditev celic različnih velikosti (Slika 4.32) in različnih stopenj endopoliploidnosti (Slika 4.36) v endospermu je bila podobna v obeh genotipih. V času od 10 do 16 DPO so bile celice visokih vrednosti C v osrednjem delu endosperma, celice z nizkimi vrednostmi C pa so bile le v zunanjih plasteh endosperma. Ta opažanja so v skladu z opažanji drugih raziskovalcev, ki poročajo o večanju velikosti jeder in velikosti celic od alevronske plasti proti notranjosti endosperma (Tschermak-Woess in Enzenberg-Kunz, 1965; Kowles in Phillips, 1988; Larkins in sod., 2001). V času 4 do 8 DPO so bile celice različnih vrednosti C enakomerno razporejene v endospermu, celice v zunanji plasti pa so bile že v tem času opazno manjše od celic v notranjosti endosperma. Obrobne celice na bazi endosperma so celice alevronske plasti spremenjene v bazalne prenosne celice z značilnimi labirintskimi stenami. V prenosne celice se preoblikujejo še dve do tri naslednje plasti endosperma. Območje označuje specifično izražanje genov, ki je sledljivo od 12. DPO naprej (Bommert in Werr, 2001). V obeh proučevanih genotipih v Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 160 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 bazalnem delu endosperma ni bilo celic s količino jedrne DNA 3 C (razen pri 16a DPO, vendar so v tem primeru celice v bazalnem delu propadale; njihova jedra so bila zelo skrčena). Odsotnost celic 3 C potrjuje ugotovitve, da se prenosne celice nehajo deliti že zelo kmalu (Kiesselbach, 1949). Jedra celic v bazalnem delu endosperma mn1 pa so imela opazno nižje vrednosti C kot v Mn1 (Slika 4.36). V razvijajočih se kličnih listih boba (Vicia faba) so ugotovili, da sladkorji neposredno vplivajo na oblikovanje prenosnih celic. Morfologija prenosnih celic v kličnih listih se je razvila le na gojišču, ki je vsebovalo glukozo in fruktozo, ne pa, če je bila v gojišču samo saharoza (Offler in sod., 1997). Spremenjeno stanje sladkorjev bi lahko vplivalo tudi na diferenciacijo celic v bazalnem delu endosperma. Ker je mutanta mn1 označena z odsotnostjo encima invertaze celične stene v prenosnih celicah, v endospermu mn1 ni visoke koncentracije glukoze in fruktoze, ki ju v divjem tipu proizvaja ta encim. Zaradi odsotnosti invertaze celične stene v bazalnih prenosnih celicah mn1 pa je v endospermu več saharoze (Shannon, 1972; Miller in Chourey, 1992; Zhou 2000). Ali je spremenjeno stanje sladkorjev v endospermu mutante povezano z zmanjšano stopnjo endoreduplikacije celic v bazalnem delu endosperma, ni znano. Celice endosperma v bližini embria oblikujejo jasno določeno celično območje endospermskega žepa, znotraj katerega se razvija embrio. Celice, ki na endospermu predstavljajo površino žepa, so majhne, imajo gosto citoplazmo in imajo povsem ločeno izražanje genov (Opsahl-Ferstad in sod. 1997). Take majhne celice smo zasledili v času od 4 do 8 DPO, v času od 10 do 16 DPO, predvsem 16. DPO pa so bile celice v območju žepa večje in so imele višje vrednosti C, kot so jih imele celice v zunanjih plasteh na dorzalni strani endosperma (Sliki 4.32 in 4.36). O nastanku žepa je malo znanega. Ni znano, ali je sposobnost oblikovanja žepa notranja lastnost endosperma ali pa je zanjo potrebna povezava z embriem (Olsen in sod., 1999). Kakor koli, naši rezultati kažejo, da v celicah, ki sestavljajo žep, poteka fragmentacija DNA, kar smo 6. DPO opazili kot zeleno fluorescenco jeder, barvanih z reakcijo TUNEL (Slika 4.44). Od kod prihaja signal za začetek programirane smrti, ni jasno. Proces programirane celične smrti v območju endospermskega žepa je bil enak v divjem tipu in v mutanti. Podobno propadanje celic endosperma, ki mejijo na rastoči embrio, so 7. DPO z elektronsko mikroskopijo opazili tudi Schel in sod. (1984). Pri kariopsi divjega tipa 16 DPO je skupna prostornina Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 161 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endosperma in embria skoraj enaka skupni prostornini 12 DPO (Preglednica 4.1). V času od 12 do 16 DPO se embrio poveča trikrat, rast endosperma pa je že skoraj ustavljena. Zaradi umiranja celic v žepu bi se dejanska prostornina endosperma v nadaljnjem razvoju lahko celo zmanjševala. V procesu rasti endosperma mora biti povečevanje celic osrednjega dela endosperma usklajeno s povečevanjem površine endosperma, ki raste z antiklinimi delitvami celic v najbolj zunanjih plasteh endosperma (Kiesselbach, 1949). Rast je podobna pri obeh genotipih do 8. DPO, ko je vir hranil za rastoči endosperm še tkivo nucela. Kaže, da v tem času delitve celic v zunanji plasti endosperma sledijo enakemu razvojnemu programu. Po tem času pa začne rast endosperma mutante zaostajati v primerjavi z divjim tipom. Iz primerjave morfologije endospermov Mn1 in mn1 16 DPO bi lahko izpeljali morebiten scenarij razvoja endosperma mutante. Površina endosperma, ocenjena s 3-D modelom, je bila 45 mm2 v Mn1 in 17 mm2 v mn1. Ker je bila prostornina najmanjših celic približno enaka v obeh genotipih, lahko sklepamo, da je bilo v zunanji plasti endosperma mn1 trikrat manj celic kot v Mn1. Vzrok za manj celic bi bila lahko zmanjšana mitotska aktivnost v zunanjih plasteh. Površinsko manjši periferni del endosperma bi bil tako lahko fizična ovira za širjenje endosperma in signal za zmanjšano širitev osrednjega dela. Osrednje celice v endospermu mn1 so sicer imele enake stopnje endopoliploidnosti, vendar so dosegle manjše prostornine kot v Mn1. Vendar pa zgradba endosperma mn1 10 in 12 DPO ne podpira te fizikalne hipoteze. V primeru njene veljavnosti bi pričakovali podobno koordinirane dogodke širitve in delitev, kot jih vidimo v Mn1. Ker so celice v osrednjem delu 10 DPO že v veliki večini endopoliploidne in se ne morejo več deliti (Barlow, 1978), se od te faze razvoja naprej endosperm povečuje z delitvami le v zunanjih plasteh. Sodeč po videzu zunanje plasti endosperma mn1 10 in 12 DPO, v njej še vedno poteka dovolj delitev, ki bi zagotavljale širjenje osrednjih celic. Širjenje celic osrednjega dela bi moralo tudi v endospermu mn1 voditi do »napete« zunanje plasti endosperma, ker bi nanjo pritiskale od znotraj (Slika 4.32). Endosperm mn1 je 10 in 12 DPO na apikalno-dorzalnem delu sploščen, v nasprotju z obliko pri Mn1, kjer je v tem delu zaobljena masa celic. Za delitve celic v perifernih plasteh se zdi, kot da so predprogramirane za širitev osrednjega dela. Posledično je zunanja plast endosperma mn1 videti, kot bi bila prevelika za prostornino osrednjega dela Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 162 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 endosperma. V osrednjem delu endosperma mn1 se celice očitno ne širijo toliko kot v divjem tipu. Zdi se, kot da ne dosegajo prostornine, za katero imajo potencial glede na njihovo stopnjo endopoliploidnosti (Traas in sod., 1998). Iz tega sklepamo, da signal za neširjenje notranjih celic verjetno ni fizično manjše obrobje endosperma. Po drugem morebitnem scenariju razvoja endosperma mn1 je vzrok za majhnost endosperma mutante v manjšem širjenju celic osrednjega dela kot posledici spremenjenega metabolizma. V času 8 DPO začne delovati invertaza iz celične stene, ki je lokalizirana v bazalnem delu endosperma in vrh aktivnosti doseže 12. DPO (Cheng in sod., 1996). Invertaza iz celične stene je prostorsko in časovno prvi encim, ki hidrolizira v endosperm vstopajočo saharozo. Iz tega sklepajo, da so v reakciji sproščene heksoze tisti fiziološki sladkorji, ki so vključeni v zaznavanje sladkorjev, izražanje metabolnih genov in normalen razvoj semen (Cheng in Chourey, 1999; Jang in Sheen, 1997). Ob delovanju invertaze iz celične stene endosperm Mn1 postane močan ponor za fotoasimilate, endosperm mn1, ki nima invertaze iz celične stene, pa začne zaostajati v rasti (Cheng in sod., 1996). Za sladkorje so že dokazali, da regulatorno vplivajo na celični cikel. Weber in sod. (1998) so opazili več celičnih delitev v kličnih listih boba v delih, kjer je bila večja koncentracija heksoz, v delih z večjo koncentracijo saharoze pa so opazili endoreduplikacijo in založne procese. V mn1 še vedno prihajajo asimilati po floemu in se pasivno prenašajo v rastoči endosperm (Zhou, 2000). Vendar pa je zaradi odsotnosti invertaze več sladkorjev v obliki saharoze kot v obliki heksoz. Če bi bil razvoj podoben kot pri bobu, bi v mn1 ob večji koncentraciji saharoze pričakovali manjšo stopnjo delitev in večjo stopnjo endoreduplikacije ter več nalaganja škroba kot pri divjem tipu. Iz naših rezultatov ugotavljamo, da je endoreduplikacija potekala enako pri obeh genotipih (Slika 4.8). Prav tako sta v endospermu mutante podobna količina škroba na celico (Cheng in Chourey, 1999; Zhou, 2000) in raven ključnega encima biosinteze škroba, ADP-glukoza pirofosforilaze (Cheng in Chourey, 1999). Ne glede na zmanjšano koncentracijo heksoz v endospermu mn1 – kot posledici odsotnosti invertaze iz celične stene – pa tudi ni nujno, da bi bile delitve v mn1 zelo prizadete, saj so pokazali, da tudi saharoza lahko pozitivno vpliva na celični cikel (Riou-Khamlichi in sod., 2000). Iz naših rezultatov tako lahko sklepamo, da zmanjšana raven heksoz zaradi odsotnosti invertaze iz celične stene v prvi Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 163 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 vrsti vpliva na proces širjenja/rasti celic in v manjši meri na delitve ter kopičenje založnega škroba. Oblika mn1 endosperma kaže, da organizemska teorija celičnih delitev – torej da organ raste, celice pa le posledično razdeljujejo nastali prostor (Kaplan, 1992) – ne pojasni dobro razvoja endosperma mutante mn1. Razvoj endosperma mutante mn1 še najbolje pojasnjuje »neocelična hipoteza« (Tsukaya, 2002; Beemster in sod., 2003), po kateri sta delitev posameznih celic in rast sicer avtonomni, vendar uravnani s signali na ravni organa. Tako se v endospermu mn1 celice v zunanjih plasteh delijo po svojem razvojnem programu, po katerem mitoze vodijo širjenje tkiva (Jacobs, 1997). Zaradi odsotnosti invertaze iz celične stene je v mutanti mn1 širjenje celic v osrednjem delu endosperma prizadeto zaradi primankljaja sladkorjev kot gradnikov celic, saj so heksoze potrebne za metabolizem celic in kot prekurzorji za biosintezo celičnih sten. Ko pa površina endosperma postane prevelika glede na majhno prostornino celic v notranjosti, celice, ki se delijo v perifernih plasteh endosperma, dobijo signal, da jih je že preveč in pogostost celičnih delitev se posledično zmanjša. Zakaj so endospermi 16 DPO manjši kot 12 DPO? Kariopse 16 DPO so bile vzgojene v drugi poskusni seriji na polju. Ker so rastline opraševali izkušeni raziskovalci, je bila velika večina semenskih zasnov oplojenih, zato so kariopse rastle na storžih tesno ena zraven druge; od tod sploščena oblika endosperma s strani (Slika 4.6). Tudi tekmovanje za hranila je bilo večje med posameznimi kariopsami. Rastline, iz katerih smo dobili kariopse 4 do 12 DPO, smo opraševali neizkušeni mladi raziskovalci, zato je bilo veliko semenskih zasnov neoplojenih. Ker kariopse niso bile stisnjene ena ob drugo, je bil endosperm Mn1 12. DPO bolj ovalne oblike v primerjavi s 16. DPO in, verjetno zaradi manjšega tekmovanja za hranila, tudi nekoliko večji. Večja razlika pa je bila pri endospermu mn1, kjer je bil 16. DPO endosperm mn1 celo manjši kot je bil 10. DPO. Ker je endosperm mn1 šibak ponor za fotoasimilate, je vpliv manjšega tekmovanja za hranila verjetno veliko bolj očiten in je lahko pozitivno vplival na razvoj kariops mn1 iz serije 4 do 12 DPO. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 164 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5.1.3 Nastanek razpoke med endospermom in materinskim tkivom v kariopsi mn1 Rokopis pripravljen za objavo. Značilen znak, po katerem se kariopsa mn1 razlikuje od kariopse Mn1 je, poleg ohlapnega perikarpa tudi pojav razpoke med materinskim tkivom placento-halazne plasti (PHP) in endospermom mn1 po 9. DPO (Lowe in Nelson, 1946). Miller in Chourey (1992) sta nastanek razpoke pojasnila z domnevnim propadom celic materinskega tkiva PHP zaradi osmotskega šoka, ki naj bi bil posledica velike koncentracije saharoze v tem delu zaradi odsotnosti invertaze. Da bi natančneje raziskali domnevni proces propadanja celic, smo pregledali razvoj bazalnega dela kariopse v času od 0 do 28 DPO na vzdolžnih rezinah skozi razvijajoče se kariopse genotipov Mn1 in mn1 (Slika 4.14). Začetek izginjanja jeder v celicah materinskega tkiva tik pod endospermom smo opazili 4. DPO v obeh genotipih. O podobnem pojavu poročajo Shannon in sod. (1986), le da so začetek odmiranja celic v tej plasti opazili približno 7. DPO. S časom se je izginjanje jeder v celicah razširilo v naslednje plasti celic v bazalni smeri (proti pedicelu) in tudi proti dorzalnemu delu kariopse (Slika 4.14). Število plasti mrtvih celic se ni bistveno razlikovalo med Mn1 in mn1 (Slika 4.16), v obeh genotipih je bilo 28. DPO (zadnja pregledana razvojna stopnja) od 20 do 25 plasti celic brez jeder. Ko smo celice brez jeder v PHP pregledali z elektronsko mikroskopijo, smo videli, da so v njih le ostanki citoplazme v trakovih, od celic so ostale le celične stene (Slika 5.1 A). Kljub enakemu številu plasti celic pa je bila oblika mrtvih celic v PHP drugačna v Mn1 kot v mn1. Prazne celice v Mn1 so bile podolgovate oblike in stisnjene v bazalno-apikalni smeri, celice v mn1 pa so bile bolj nepravilnih oblik in niso bile stisnjene (Slika 4.15). Morebiten vzrok razlike je v normalnem razvoju perikarpa in prizadetem razvoju endosperma in embria v mutanti mn1. Ohlapne celice v PHP in opažena razpoka bi bile tako lahko posledica premajhnega endosperma, ki ni napolnjeval prostora znotraj perikarpa in zato ni pritiskal na celice PHP. Razpad celic v PHP, kot ga opisujeta Miller in Chourey (1992) v kariopsi mn1, gotovo ni vzrok za nastanek razpoke. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 165 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Razpoko smo opazili v kariopsah mn1 od 8. DPO naprej do 16. DPO, 28. DPO pa je ni bilo več (Slika 4.14). To se je zgodilo zato, ker so kariopse rastle na storžih, s katerih smo odstranili ovojne liste, da smo lahko izrezovali kariopse, in so bili pokriti le s povoščeno papirnato vrečko. Ker kariopse niso bile tesno pokrite, se je perikarp sušil bolj kot pri kariopsah, ki so rastle v nedotaknjenih storžih. Do 28. DPO se je perikarp že toliko posušil in skrčil, da je endosperm spet pritisnil ob materinsko tkivo PHP. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 166 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5.1.4 Poseben transportni sistem v placento-halazni plasti in nastanek abscizijske plasti Rokopis pripravljen za objavo. Izgubljanje jeder in posledično umiranje celic v PHP smo opazili v oplojeni semenski zasnovi, medtem ko v neoplojeni semenski zasnovi na istem storžu v času 12 DPO tega pojava ni bilo (Slika 4.17). Iz tega smo sklepali, da proces umiranja povzroči razvijajoča se filialna generacija. Kako pa se signal prenese iz filialnega v materinsko tkivo, ostaja snov za nadaljnje raziskave. Proces je bil zelo podoben tako v kariopsi divjega tipa kot mutante, kar nakazuje, da je to verjetno splošen razvojni proces. Kakšen je pomen takšnega obsežnega odmiranja celic v materinskem tkivu? Eden od ključnih podatkov za razumevanje procesa je mesto, kjer poteka. Plast, kjer celice odmrejo, je med delom pedicela, kjer se končujejo žile, in med ponorom za hranila, ki pridejo po žilah, endospermom. PHP naj bi imela pomembno vlogo v prenosu vode, sladkorjev in drugih hranil v razvijajoče se seme (Felker in Shannon, 1980). To območje kariopse je transportno aktivno, na kar kaže več lokaliziranih proteinov s transportnimi nalogami. V bazalnem delu endosperma koruze in v pedicelu, ne pa tudi v sami PHP, so našli v membrano vgrajen akvaporin (Barrieu in sod., 1998). Na bazi endosperma sta izražena transporter saharoze (Carlson in sod., 2002) in invertaza iz celične stene, ki poganja reakcije pretvorbe saharoze in s tem ustvarja močan koncentracijski gradient za transport heksoz v endosperm (Cheng in Chourey, 1999). Sistem, ki vključuje vse te proteine, bi lahko regulatorno vplival na silo za vlek vode in asimilatov skozi PHP iz žil, ki se končujejo v pedicelu, v endosperm. V prenosni plasti v materinskem tkivu so se razvile različne strukturne prilagoditve v različnih vrstah rastlin (Thorne, 1985). Najbolje je razvita pri tropskih poljščinah, kot sta koruza in sirek (Sorghum bicolor L.), kjer poteka prenos asimilatov le skozi bazo kariopse. V sirku je prenosna plast v obliki placentnega mešička (Manes in McBee, 1986). V poljščinah zmernega pasu poteka transport po celotni dolžini kariopse skozi snop žil, ki je vgnezden v perikarp, prenosna plast pa je omejena le na podaljšek nucela (Thorne, 1985; Olsen in sod., 1999). Transport asimilatov v seme uravnavajo aktivni transportni sistemi v filialnem tkivu (Thorne, 1985; Weber in sod., 1997; Thompson in sod., 2001; Rosche in Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 167 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 sod., 2002). Razvoj prenosne plasti v materinskem tkivu velikokrat vključuje smrt celic. V sirku celice v PHP odmrejo, nato se PHP loči od endosperma, da nastane votlina (Manes in McBee, 1986). Avtolitične procese so opazili v podaljšku nucela v ječmenu (Linnestad in sod., 1998) in pšenici (Dominguez in sod., 2001) ter v parenhimskih celicah s tankimi stenami v razvijajočih se kličnih listih boba (Weber in sod., 1997). Za nekatere od omenjenih procesov je že bilo dokazano, da potekajo po poti programirane celične smrti (Linnestad in sod., 1998; Young in Gallie, 2000). Dejstvo, da je bil proces odmiranja celic v PHP enak v vseh pregledanih kariopsah, kaže, da je odmiranje celic v PHP programirano tudi pri koruzi. Da bi ga bolje razumeli, smo pregledali nekaj ključnih citoloških značilnosti programirane celične smrti. Na osnovi pregleda zaporednih stopenj razvoja PHP lahko sklepamo, da programirana celična smrt v razvoju PHP poteka v dveh stopnjah, ki vključujeta dva različna programa umiranja. Začetek prvega programa celične smrti smo zasledili že 4. DPO. Jedra v celicah, ki so odmrle v tej fazi, niso pozitivno reagirala z reakcijo TUNEL, ki je značilen pokazatelj fragmentacije DNA. V celicah PHP smo z elektronsko mikroskopijo 9. DPO opazovali gradient odmiranja celic. Celice v plasti, ki je bila najbolj oddaljena od endosperma, so še imele vakuole, vendar je bila v zgornji plasti že vidna fragmentacija vakuole (Slika 5.1 D). V naslednjih plasteh v smeri proti endospermu so bile celice brez vakuole in niso imele vidnih razločnih celičnih organelov (Slika 5.1 C). Od celic v plasteh PHP še bližje endospermu pa so ostale vidne samo še celične stene in zelo skrčena vsebina celic v obliki trakov (Slika 5.1 A in B). Podobne celice v PHP sta 22. DPO opisala tudi Felker in Shannon (1980). Število plazmodezem med celicami v PHP se je zmanjševalo s časom razvoja kariopse. V času 5 DPO so bile v živih celicah še vidne plazmodezme, nato pa 9. DPO v istem območju med celicami ni bilo več plazmodezemskih povezav (Slika 5.1 E in F). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 168 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Slika 5.1. Propadanje vsebine celic v placento-halazni plasti Mn1, 9 DPO (A–D) in zmanjšanje števila plazmodezem v celicah tik pod endospermom, 5 DPO (E) in 9 DPO (G). Prikazane so celice v materinskem tkivu tik pod endospermom (A–D), A – najbližje endospermu, D – najbolj oddaljena od endosperma (v bazalni smeri). V – vakuola; puščice v A in B označujejo ostanke citoplazme. Konice puščic v E označujejo plazmodezme, v F puščica kaže mesto, kjer je bila plazmodezma. Slike posnela Karen Chamusco (Department of Plant Pathology, University of Florida, Gainesville, ZDA). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 169 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Celična smrt z razpadom vakuole tako zelo spominja na programirano celično smrt, po poti katere odmirajo celice bodočih elementov ksilema. V diferenciaciji trahejnih elementov se v vakuoli nakopičijo hidrolitski encimi, ki se ob razpadu vakuole sprostijo in zelo hitro razgradijo vsebino celice (Fukuda, 2000). Tudi po klasifikaciji programirane celične smrti, ki so jo opisali Krishnamurthy in sod. (2000), bi lahko smrt celic PHP uvrstili v isto kategorijo kot smrt trahejnih elementov: celice, ki odmrejo po diferenciaciji v specializirane celične tipe. Prav tako kot za trahejne elemente bi lahko trdili za celice PHP, da svojo funkcijo opravljajo šele po smrti. Od trahejnih elementov pa se celice v PHP ločijo po tem, da v njih nismo opazili obsežnega nalaganja sekundarne celične stene, ki poteka v diferenciaciji trahejnih elementov (Fukuda, 2000). Čeprav v stenah celic v PHP nismo opazili lignina (Slika 4.21), pa smo opazili prisotnost nekaterih hidroksicimetnih kislin (Slika 4.23 in Slika 4.24), ki so prekurzorji v sintezi lignina (Croteau in sod., 2000). Drugi val odmiranja celic se je začel 8. DPO v plasteh tik pod praznimi celicami. V jedrih teh celic smo zasledili fragmentacijo DNA. Na obodu nekaterih celic pri mn1 10 DPO smo opazili točke, ki so pozitivno reagirale z reakcijo TUNEL (Slika 4.19). Točke bi lahko bila telesca s fragmentirano DNA, ki so podobna apoptotskim telescem v živalskih celicah (Bursch in sod., 1990). Med raziskovalci še ni enotnega mnenja o prisotnosti pravih apoptotskih telesc pri rastlinah zaradi prisotnosti celične stene, ki onemogoča fagocitozo snovi umrlih celic. Kljub temu pa so zbiranje vsebine celice v manjša telesca opazili tudi v nekaterih tipih rastlinskih celic, v katerih so dokazali programirano celično smrt (Wang in sod., 1996; Gunawardena in sod., 2001). Domnevamo, da je bila prisotnost teh telesc le v PHP pri mutanti naključna in bi jih pri načrtnem iskanju podobnih struktur v različnih preparatih našli tudi v divjem tipu. V plasti celic tik pod celicami, ki so bile že mrtve, smo opazili kondenzacijo kromatina v jedrih (Slika 4.18). Od 8. do 10. DPO smo v območju PHP opazili tudi veliko endopoliploidnih jeder z vsebnostjo DNA 8 C (glej 4.1.2.3.1). Endopoliploidizacija je značilna za programirano celično smrt med diferenciacijo trahejnih elementov, vendar tam vsebnost DNA v jedrih doseže vrednosti C do 64 (Krishnamurthy, 2000). Kondenzacija jedra in fragmentacija DNA nista del procesa programirane celične smrti pri trahejnih elementih (Fukuda, 2000), sta pa znak za drug tip celične smrti, za apoptozi podobno celično smrt. Pri tem tipu smrti je prva tarča napada jedro, po razpadu Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 170 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 jedra pa se hitro razgradijo tudi drugi deli celice, vendar pogosto nepopolno (Wang in sod., 1996, Fukuda, 2000). Ker predvidevamo, da je PHP v zgodnjem razvoju kariopse predvsem prevajalno tkivo, nas je zanimalo, ali se v teh celicah sintetizirajo kakšne posebne sekundarne spojine, značilne na primer za sekundarne stene trahejnih elementov. Z različnimi barvanji smo v stenah celic PHP dokazali prisotnost različnih fenolnih spojin. Z opazovanjem avtofluorescence celičnih sten v alkalnem mediju smo opazili dve različno obarvani plasti v PHP. Zgornja plast, tik pod endospermom, je v alkalnem mediju oddajala zeleno fluorescenco, celice pod njo pa svetlo modro (Slike 4.22–4.24). Zgornja plast se je ujemala s celicami, ki so odmrle v prvem valu programirane celične smrti. Opazili smo največ okoli 10 plasti celic, ki so oddajale zeleno fluorescenco (Slike 4.22–4.24); to število plasti celic v PHP odmre že do 8. DPO (Slika 4.16). Take ugotovitve potrjujejo domnevo o drugem valu programirane smrti, ki se v PHP začne 8 DPO. Premik avtofluorescence z UV ekscitacijo iz modre v svetlo modro do zelene v alkalnem mediju je značilen za hidroksicimetne kisline, ki spadajo med fenolne kisline. Premik iz modre v zeleno je značilen za sinapinsko kislino, vendar v literaturi ni podatkov o prisotnosti te kisline v koruzi. Zato bi bile potrebne dodatne kemijske analize, da bi ugotovili pravo naravo fenolne spojine v zgornji plasti PHP. Premik iz modre v svetlo modro pa je značilen za kavno in ferulno kislino (Harborne, 1998). Ferulna kislina je še posebno v družini Poaceae, v primerjavi z dvokaličnicami, v večjih količinah kovalentno vezana na sladkorje v celičnih stenah (Lichtenthaler in Schweiger, 1998). Opažene hidroksicimetne kisline bi lahko bile del posebnih ligninov, ki se pojavljajo v neolesenelih rastlinah, sestavljajo pa jih monolignoli in hidroksicimetne kisline (Croteau, 2000). V PHP nižje od celic, kjer smo opazili premik avtofluorescence celičnih sten v zeleno, smo dokazali prisotnost flavonoidov z barvanjem z Naturstoffreagenz A (Slika 4.23, Slika 4.24, NST). V preparatih so sicer pobarvane celične stene, vendar pa ni znano, ali so flavonoidi v živih celicah prisotni v vakuolah ali v stenah, saj se pri fiksaciji membrane poškodujejo in vsebina se lahko sprosti iz celic. Flavonoidi naj bi imeli pomembno vlogo pri zaščiti rastline, pomembni pa so tudi kot pigmenti in signalne molekule (Croteau, 2000). V območju PHP se ob zrelosti kariopse razvije temno obarvana abscizijska plast (Kiesselbach, 1949). Verjetno je obarvanje posledica fenolnih snovi, saj se te ob oksidaciji Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 171 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 temno obarvajo (Croteau in sod., 2000). Serna in sod. (2001) so v PHP koruze našli peptid s protiglivnim delovanjem BAP 2 (»basal layer type antifungal protein 2«), ki se izloča iz celic na bazi endosperma in se nalaga v materinskem tkivu PHP med 12. in 15. DPO in naj bi bil vključen v protimikrobno zaščito razvijajočega se semena. Abscizijska plast v kariopsi koruze nima vloge v odpadanju zrelih kariops, saj te ostanejo pritrjene na karpelnem socvetju, ampak naj bi predvsem preprečevala vstop mikroorganizmov v filialno tkivo. Na zaščitno vlogo kaže tudi prisotnost flavonoidov. Obširno območje celic v PHP, v katerih so bili flavonoidi, je bilo vidno že 6. DPO (Slika 4.23), pred fazo, ko se začne intenzivno nalaganje hranil v endospermu (10-12 DPO, Kowles in sod., 1988). Abscizijska plast plodov ima podobno zgradbo in naloge kot abscizijska plast listov. Lahko se oblikuje že zgodaj v razvoju kot plast celic s tankimi stenami, ki je orientirana prečno čez pedicel. V listih je abscizijska plast sestavljena iz dveh delov: ločitvene in zaščitne plasti. V ločitveni plasti so celice s tankimi stenami, kjer se odpadajoči list odlomi. Zaščitna plast vsebuje celice, katerih naloga je zapečatenje rane, ki ostane na rastlini, ko list odpade (Mauseth, 1988). Če potegnemo vzporednice v zgradbi abscizijske plasti v listih in kariopsi koruze, lahko predpostavimo, da ločitveni plasti listov ustreza približno deset plasti celic v PHP, ki odmrejo do 8. DPO. Zaščitni plasti pa ustrezajo plasti celic v PHP, v katerih se naložijo flavonoidi. Glede tega bi bilo zanimivo raziskati razvoj abscizijske plasti v koruznem divjem sorodniku teozintu (Dorweiler in sod., 1993) ali v mutanti koruze tasselseed, pri kateri se kariopse razvijejo tudi v prašničnih cvetovih, v katerih pa so pecljate in niso tesno obdane z materinskim tkivom (Neuffer in sod., 1997). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 172 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5.1.5 Razvoj koreninske čepice V raziskavi procesov v koreninski čepici smo najprej analizirali rast korenin v različnih substratih. Izbrati smo želeli take razmere za gojenje kalic, ki bi bile zanimive za nadaljnje ovrednotenje procesov v razvoju koreninske čepice. Proučili smo zgradbo koreninske čepice glede na stopnjo endopoliploidnosti celic in prisotnost izocima saharoza sintaze SUS1 v celicah. Kopičenje SUS1 v zunanjih celicah koreninske čepice bi bilo lahko povezano s povečano metabolno sposobnostjo endopoliploidnih celic. SUS1 v teh celicah pa bi bila lahko vključena v dostavo monosaharidnih prekurzorjev za sintezo polisaharidov sluzi. 5.1.5.1 Vpliv substrata na rast korenin Da bi izbrali ustrezen substrat in način gojenja za nadaljnje analize, smo kalice vzgojili iz kariops koruze, ki so bile pred kalitvijo površinsko sterilizirane ali pa ne. Ko so kariopse vzkalile, smo jih prenesli v različne substrate: nesterilizirano prst (NE), sterilizirano prst (SE), nesterilizirano vodo (NW) in sterilizirano vodo (SW). Primarne korenine kalic smo izmerili pred prenosom v ustrezen substrat. Kalice smo tri dni gojili v substratu in nato spet izmerili dolžino primarne korenine. Zaradi okužb je bila variabilnost dolžin korenin iz nesteriliziranih kariops po koncu rasti v ustreznem substratu (Preglednica 4.2, NB) večja kot pri površinsko steriliziranih kariopsah (Preglednica 4.2, SB) v vseh substratih (Preglednica 4.2, NE, SE, NW, SW). Prirastek in hitrost rasti primarnih korenin smo izračunali iz povprečnih dolžin korenin v vsakem substratu (Preglednica 4.2). Izstopajoče majhen prirastek pri nesteriliziranih zrnih, ki so rastla v sterilizirani prsti (Preglednica 4.2, SENB), je bil posledica večje okužbe kalic. S sterilizacijo morda uničimo normalne populacije mikrobov v prsti, nato pa z nesteriliziranimi semeni vnesemo patogene. Na Sliki 4.45 je razvidno, da sta bila prirastek in hitrost rasti odvisna predvsem od substrata v katerem so rastle kalice (prst ali voda), ne pa od sterilizacije kariops ali substrata (Slika 4.45). Mediani prirastek primarnih korenin, gojenih v prsti, je bil 29 mm, v vodi pa 49 mm. Mediana hitrost rasti primarnih korenin, gojenih v prsti, je bila 0,40 mm h-1, v vodi pa 0,69 mm h-1. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 173 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Da bi ovrednotili rast primarnih korenin v različnih substratih, smo izmerili določene morfološke parametre na koreninskih vršičkih kalic. Za meritve morfoloških parametrov smo zaradi manjše variabilnosti uporabili samo kalice, vzgojene iz steriliziranih zrn. Pomembne razlike smo opazili pri širini telesa korenine (Slika 4.46 F), razlike pri drugih parametrih pa so bile tik nad mejo statistične značilnosti (dolžina, širina in površina prereza koreninske čepice; Slika 4.46) ali pa pod njo (število celic v stolpcu v čepici, število jeder v prerezu čepice in število nizov celic v telesu korenine; Slika 4.46). Korenine, ki so rastle v prsti, so bile širše, imele pa so enako število nizov celic v prečnem preseku (Slika 4.46 F in G). Celice v telesu korenine so bile torej širše (v smeri pravokotno glede na os korenine), hitrost rasti korenin pa je bila manjša kot pri koreninah iz vode. To lahko pomeni, da je bilo v prsti ovirano podaljševanje celic v telesu korenine. Pilet (1986) je opisal obratno sorazmerno zvezo med dolžino koreninske čepice in hitrostjo rasti korenin. Dolžine čepic skupaj z oceno hitrosti rasti korenine smo uporabili za klasifikacijo korenin (Preglednica 5.1). Korenine kalic, ki so rastle v vodi, spadajo po klasifikaciji korenin po Piletu (1986) v kategorijo srednje hitro rastočih korenin. Korenine iz prsti pa odstopajo od opisanih vrednosti, saj imajo enako dolge čepice kot korenine, ki so rastle v vodi, njihova hitrost rasti pa je manjša (po Piletu bi pričakovali večjo). Vendar je Pilet obratno zvezo dokazal za korenine, ki so rastle v enakih razmerah (v vlažnem ozračju), tu pa primerjamo rast korenin v različnih substratih. V tem poskusu je bila torej dolžina čepice neodvisna od substrata, hitrost rasti primarne korenine pa je bila manjša v prsti kot v vodi. Povezava med hitrostjo rasti korenine in dolžino koreninske čepice je bila celo pozitivna (Preglednica 5.1). Preglednica 5.1. Povprečna dolžina koreninske čepice in hitrost rasti primarne korenine. NESBa NWSBa SESBa SWSBa Povprečna dolžina koreninske čepice ± SD (µm) 290 ± 30 290 ± 20 270 ± 30 340 ± 40 Hitrost rasti primarne korenine (mm h-1)b 0,45 0,64 0,39 0,77 a Oznake substratov, v katerih so rastle kalice: NE – nesterilizirana prst, NW – nesterilizirana voda, SE – sterilizirana prst, SW – sterilizirana voda; SB – kalice vzgojene iz steriliziranih zrn. b Hitrost rasti izračunana kot razlika med povprečno dolžino primarnih korenin pred rastjo in po rasti v ustreznem substratu, deljena s časom rasti (72 h). Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 174 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5.1.5.2 Stopnja endopoliploidnosti celic v koreninski čepici Celice koreninske čepice nastajajo v kaliptrogenu, ki je distalni del apikalnega meristema korenine (Kiesselbach, 1949). V tem območju smo opazili največ celic z vsebnostjo DNA 2 C in 4 C (Slika 4.48 C), ki ustrezata fazam G1 in G2 celičnega cikla. Celice, ki so zunaj meristemskega območja, se ne delijo več, vendar so v njih prav tako opazili sintezo DNA (Barlow, 1976). V jedrih teh celic se DNA podvaja v ciklih endoreduplikacije. Nastanejo celice s stopnjo endopoliploidnosti 8 C in več. V zunanjih celicah kolumele (osrednji steber tkiva v čepici) se razvijejo jedra z vsebnostjo DNA do 16 C (Barlow, 1977). V kolumeli smo opazili celice s količino DNA do 16 C (Slika 4.48 C), v perifernem delu čepice pa smo opazili tudi jedra 32 C (Slika 4.50 A). Jeder 32 C je bilo zelo malo, zato smo jih v analizah združili z jedri 16 C v skupen razred 16 C+. Stopnjo endopoliploidnosti jeder smo izmerili v koreninskih čepicah korenin, gojenih v različnih substratih, opisanih v prejšnjem poglavju (5.1.5.1). V vseh proučevanih čepicah smo opazili jedra s količino DNA od 2 C do 16 C (Slika 4.49). Jedra iz čepic korenin, gojenih v vodi (Slika 4.49, NWSB in SWSB), so se jasneje ločila na posamezne vrhove vrednosti C. Tudi podatki so bili popolnejši zaradi manjšega prekrivanja jeder, zato smo le teh šest čepic uporabili v nadaljnjih meritvah velikosti celic. Iz podatkov o položaju in prostornini celic smo ocenili 3-D strukturo koreninske čepice, ki smo jo izračunali za šest čepic, v katerih smo izmerili stopnjo endopoliploidnosti, in za tri čepice, v katerih smo ocenili imunolokalizacijsko barvanje (5.1.5.3). Ocenjeno število celic (6950 ± 290, povprečje ± standardna napaka, N = 9) je primerljivo z rezultati drugih študij. Clowes (1976) je v koreninskih čepicah kultivarja »Golden Bantam« naštel povprečno 7900 celic (v razponu 3900–20900), Bengough in sod. (2001) pa 8870 ± 390 celic v kultivarju »Mephisto« (povprečje ± standardna napaka, N = 6). Ocenjeno število celic je sicer manjše od objavljenih vrednosti, kar lahko pripišemo razmeram gojenja kalic v vodi, kjer se celice stalno luščijo s površine čepice (Hawes in sod., 2000). Prostornina celic znotraj vsakega razreda vrednosti C se ni razlikovala med proučenimi čepicami (Slika 4.51), in se je večala s stopnjo endopoliploidnosti celic (Slika 4.52). To se sklada s prevladujočo hipotezo, da je velikost celic odvisna od količine DNA v njihovih jedrih (Melaragno in sod., 1993; Kondorosi in sod., 2000; Kudo in Kimura, 2002). Celice z Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 175 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 visoko stopnjo endopoliploidnosti, so bile v čepici maloštevilne, vendar so zaradi njihove velikosti prispevale velik delež k prostornini čepice (Slika 4.53). 5.1.5.3 Lokalizacija saharoza sintaze v koreninski čepici Lokacijo izocima saharoza sintaze SUS1 v koreninski čepici smo določili z imunolokalizacijo na preparatih koreninskih čepic korenin, gojenih v prej opisanih substratih (5.1.5.1, Slike 4.54 do 4.57). Jakost barvanja je bila spremenljiva, vendar smo z uporabo prikaza s psevdobarvami opazili vedno enak vzorec porazdelitve imunolokalizacijskega signala. V predelu meristema je bilo barvanje za SUS1 šibko, na obrobju koreninske čepice pa močnejše. Imunolokalizacijsko barvanje za SUS1, v povezavi z velikostjo celic, smo ovrednotili s 3-D modelom na treh preparatih čepic korenin, gojenih v vodi (Slika 4.58). V celicah z majhno prostornino smo izmerili večinoma majhno količino barvanja za SUS1, velike celice pa so vsebovale veliko SUS1 (Slika 4.59). Povprečna prostornina celic z visoko vsebnostjo SUS1 je bila štirikrat večja od prostornine celic z majhno količino SUS1 (4.2.5). Pristnost izocima saharoza sintaze SUS1 (ne pa SH1) v koreninski čepici koruze so potrdili na ravni izražanja genov in ravni proteinov (Rowland in sod., 1989). Encim naj bi bil vključen v odgovor rastline na pomanjkanje kisika (Chen in Chourey, 1989; Rowland in sod., 1989; Koch in sod., 1992; Zeng in sod., 1998). Vendar še ni študije, ki bi pokazala porazdelitev saharoza sintaze znotraj koreninske čepice. Guerin in Carbonero (1997) sta predlagala, da naj bi bila saharoza sintaza v koreninski čepici ječmena vključena v sintezo škroba v celicah osrednjega dela čepice. Vendar naša opažanja kažejo, da je saharoza sintaza v koreninski čepici koruze pomembna predvsem v celicah zunanjih plasti čepice. Te vsebujejo hipertrofirane Golgijeve vezikle (Moore in Jones, 1976), ki so napolnjeni s polisaharidi, bogatimi s fukozo (Roy in sod., 2002). Saharoza sintaza je lahko vezana na membrano Golgijevih veziklov (Buckeridge in sod., 1999) ali na plazemsko membrano (Carlson in Chourey, 1996). Zagotavljala naj bi UDP-glukozo za sintezo polisaharidov. Saharoza sintaza v zunanjih celicah koreninske čepice bi torej lahko zagotavljala UDP-glukozo za sintezo polisaharidov sluzi, lahko pa bi zagotavljala tudi proste heksoze. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 176 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5.1.5.4 Povezava med endopoliploidnostjo in količino SUS1 proteina ter morebitna vloga saharoza sintaze v koreninski čepici Porazdelitev celic glede na nizko/visoko vsebnost saharoza sintaze SUS1 je bila podobna kot porazdelitev celic z nizko/visoko vsebnostjo DNA, in sicer tako prostorsko (Slika 4.48 in Slika 4.58) kot tudi glede na prostornino celic (Slika 4.53 in Slika 4.59). S povezavo podatkov o stopnji endopoliploidnosti celic in vsebnosti SUS1, glede na lokacijo celic v rezinah, smo ugotovili, da ima približno 90 % celic 16 C tudi močan signal za SUS1, v nasprotju z le 5 % 2 C celic (Slika 4.60). Mogoče je tudi, da v 2 C celicah sploh ni močnega signala za SUS1 in je vrednost 5 % le posledica metodološkega šuma, povezanega z metodo povezave obeh podatkov (vrednosti C in SUS1) s polaganjem podatkov iz različnih rezin eno na drugo. Glede na prostorsko porazdelitev celic v čepici so celice z visoko vsebnostjo SUS1 prevladovale v delu čepice, kjer je bila stopnja endopoliploidnosti celic 8 C in več (Slika 4.48 in Slika 4.58). Podobno razporeditev v koreninski čepici kot saharoza sintaza ima še nekaj s sluzjo povezanih proteinov. GDP-D-manoza-4,6-dehidrataza se izraža v zunanjem delu čepice (Ponce in sod., 2000). Ta encim katalizira prvi korak v de novo sintezi GDP-L-fukoze (Bonin in sod., 1997), ki je glavni in specifični sestavni del polisaharidne sluzi v koruzi (Harris in Northcote, 1970; Bacic in sod., 1986; Osborn in sod., 1999). Gen zmGRP4, ki kodira z glicinom bogat protein, se močno izraža v perifernem delu koreninske čepice in šibko tudi v epidermidi korenine (Matsuyama in sod., 1999; Ponce in sod., 2000). Arabinogalaktanski protein, ki je sestavni del sluzi (Bacic in sod., 1986), se prav tako specifično izraža v celicah zunanjega dela koreninske čepice (Ponce in sod., 2000). Čeprav v omenjenih primerih niso merili stopnje endopoliplidnosti, lahko na podlagi podobnosti zgradbe koreninske čepice v različnih kultivarjih koruze (Bengough in sod., 2001; ta študija) sklepamo, da so se našteti proteini prav tako pojavljali v območju celic z visoko stopnjo endopoliploidnosti. Samo stopnja endopoliploidnosti verjetno ni edini dejavnik, ki vpliva na kopičenje SUS1 proteina v zunanjih celicah koreninske čepice. Tudi pozicijska informacija je verjetno zelo pomembna. Vendar je višja stopnja endopoliploidnosti lahko prednostna za celico, saj ima tako lahko večjo sposobnost za izražanje encima, njegovo kopičenje ali aktivnost. V metabolno aktivnih tkivih naj bi endoreduplikacija zagotovila povečano število genov zato, Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 177 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 da bi se lahko povečalo izražanje genov (Baluška in Kubica, 1992; Edgar in Orr-Weaver, 2001; Joubes in Chevalier, 2000) in da bi omogočila povečano prepisovanje jedrnih genov, ki so potrebni za sestavljanje več organelov na celico (Joubes in Chevalier, 2000). Število organelov na celico se v koreninski čepici res veča, ko se veča razdalja med celico in meristemom v procesu diferenciacije (Juniper in Clowes, 1965). Več Golgijevih veziklov (Moore in Jones, 1967), z vezano saharoza sintazo na membrani, bi tako lahko omogočalo intenzivno sintezo polisaharidov sluzi. Našteta dejstva kažejo, da je izražanje določenih proteinov, povezanih s sluzjo (Matsuyama in sod., 1999; Ponce in sod., 2000; ta študija), povečano s pomočjo endoreduplikacije, vendar pa še ne ponujajo končnega dokaza, da endoreduplikacija omogoča večje izražanje proteinov prek povečanega števila genov, povezanih s sluzjo. Zato bi bilo zanimivo raziskati še sintezo sluzi v rastlinah, ki v koreninski čepici nimajo endopoliploidnih celic. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 178 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 5.2 Sklepi Postavili smo model, ki omogoča oceno tridimenzionalne strukture endosperma. Model bi lahko uporabili tudi za oceno strukture drugih rastlinskih tkiv, ki so na prečnem prerezu približno radialno simetrična. S slikovno citometrijo smo ocenili prostorsko razporeditev nekaterih celičnih parametrov v preiskovanih tkivih: velikost celic, količino DNA v jedrih, velikost jeder in stopnjo imunolokalizacijskega barvanja. To tehniko je mogoče uporabiti za kvantitativno oceno razporeditve katere koli druge lastnosti celic v tkivu, ki jo je mogoče izmeriti z uporabo različnih mikroskopskih tehnik in barvanj. S spremljanjem razvoja kariopse smo ugotovili, da je endosperm mn1 majhen zaradi manjše rasti celic, zaradi katere je v endospermu tudi manj delitev. V endospermu je pri obeh genotipih do 10. DPO podobno število celic, nato je 12. DPO v endospermu mn1 le še 68 % celic v primerjavi z Mn1, 16. DPO pa celo le 55 %. Kljub zmanjšanemu številu delitev celic pa je bil ohranjen proces endoreduplikacije. V enakem času je poteklo v mn1 enako število endociklov kot v endospermu divjega tipa. Prostornina celic se je povečevala v skladu z vsebnostjo DNA v njihovih jedrih. Celice višjih stopenj endopoliploidnosti (24 C in več) so imele v mn1 manjšo prostornino v primerjavi s celicami enakih stopenj v Mn1, kar je bistveno prispevalo k manjši prostornini endosperma mn1 od 10. DPO naprej. Razpoka v kariopsi mn1 med endospermom in materinskim tkivom placento-halazne plasti ni posledica razpada celic materinskega tkiva, temveč je le posledica odmika premajhnega endosperma mn1 od normalno razvite placento-halazne plasti, v kateri pa poteka programirano odmiranje celic v obeh genotipih. V materinskem tkivu placento-halazne plasti med žilami v pedicelu in filialnim endospermom je bilo opaziti obsežno odmiranje celic v plasteh v času od 4 do 20 dni po oprašitvi. Celice odmrejo po poti programirane celične smrti, od njih pa ostanejo le celične stene. Potek odmiranja ni odvisen od genotipa. V Mn1 se mrtve celice zaradi pristiska endosperma stisnejo, v mn1 pa ostanejo široke. V placento-halazni plasti naj bi mrtve celice v začetnem razvoju kariopse služile transportu hranilnih snovi v endosperm, v Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 179 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 poznejšem obdobju pa se v tem območju razvije abscizijska plast. V placento-halazni plasti smo opazili nalaganje različnih fenolnih spojin – hidroksicimetnih kislin in flavonoidov, zato ima plast verjetno vlogo tudi v protimikrobni zaščiti razvijajočega se zrna. V celicah zunanje plasti koreninske čepice smo opazili relativno večjo količino saharoza sintaze SUS1 kot v osrednjih celicah. Celice v zunanji plasti koreninske čepice koruze so velike, endopoliploidne in proizvajajo polisaharidno sluz. Glede na vlogo saharoza sintaze v zagotavljanju sladkornih monomerov pri sintezi različnih polisaharidov sklepamo, da bi bila lahko vključena tudi v sintezo sluzi. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 180 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 6 POVZETEK V koruzi (Zea mays L.) smo na citološki ravni pregledali nekatere razvojne procese v endospermu in koreninski čepici. Razvoj celotne kariopse smo spremljali v času od 4 do 16 dni po oprašitvi (DPO). Glede na število jeder v vzdolžnih rezinah skozi kariopso se je število celic v embriu v tem času eksponentno večalo, število celic v nucelu se je zmanjševalo, število celic v perikarpu pa je v proučevanem obdobju ostalo približno enako. V perikarpu, v katerega se v zrelem plodu razvije stena plodnice, smo našli poliploidna jedra z vsebnostjo DNA do 8 C. Endopoliploidna postanejo tudi jedra nucela. V času rasti endosperm nadomešča tkivo nucela, v katerem potekajo avtolitični procesi. Nucel kmalu propade in se ohrani le kot nucelarna membrana z redkimi jedri. Razvoj endosperma smo proučili s pomočjo 3-D modela, ki je omogočil oceno tridimenzionalne strukture endosperma na podlagi podatkov, izmerjenih v mediani vzdolžni rezini skozi kariopso. V endospermu smo izmerili velikost celic z obrisovanjem njihovih celičnih sten, nato pa smo vsaki celici priredili še stopnjo endopoliploidnosti, izmerjeno s kvantitativno denzitometrično meritvijo relativne vsebnosti DNA v jedrih, pobarvanih z reakcijo po Feulgenu. V času od 4 do 8 DPO je bila porazdelitev jeder z različno vsebnostjo DNA v endospermu enakomerna, nato pa je postal endosperm jasno razdeljen na obrobni del, kjer so bile majhne celice z nizko vsebnostjo DNA, in osrednji del, kjer so bile velike celice z visoko stopnjo endopoliploidnosti. Razvoj kariopse divjega tipa smo primerjali z razvojem kariopse mutante mn1, ki je brez izocima invertaze iz celične stene INCW2. Izocim se izraža v prenosnih celicah na bazi endosperma in ustvarja močan vlek asimilatov v razvijajoče se seme. Mutanta ima zelo prizadet endosperm, ki ima v zreli kariopsi lahko le petino mase endosperma divjega tipa. V mutanti je bila od 10. DPO naprej prizadeta rast celic v osrednjem delu endosperma, kjer so bile celice z največjo prostornino in stopnjo endopoliploidnosti. Celice z enako stopnjo endopoliploidnosti so imele v mn1 manjšo prostornino v primerjavi z divjim tipom. Čeprav je bilo celic z visoko stopnjo endopoliploidnosti malo, so prispevale bistven del prostornine endosperma. Zato je bila prostornina endosperma mn1 manjša prav zaradi manjše širitve/rasti velikih celic. Sam proces endoreduplikacije v mn1 ni bil prizadet, saj smo v obeh genotipih opazili enako število vrhov v frekvenčnih porazdelitvah relativne Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 181 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 količine DNA v jedrih; 16 DPO je bila najvišja stopnja endopoliploidnosti v obeh genotipih 192 C. Zaradi prizadete ekspanzije/rasti celic v osrednjem delu se je verjetno zmanjšala tudi pogostost delitev celic v zunanjih plasteh endosperma mn1. V endospermu mn1 je bilo 10 DPO še približno enako število celic kot v Mn1, 12 DPO je bilo v mn1 68 % celic, 16 DPO pa le 55 % celic v primerjavi z Mn1. Okrog 9. DPO nastane med endospermom mn1 in materinskim tkivom placento-halazne plasti razpoka. Da bi ugotovili, zakaj nastane, smo pregledali razvoj bazalnega dela kariopse divjega tipa in mutante mn1 v času od 0 do 28 DPO. V obeh genotipih smo opazili odmiranje celic v materinskem tkivu, ki se je začelo že 4 DPO. Ker je bil proces vedno enak, ugotavljamo, da je vanj vključena programirana celična smrt. Najprej je odmrlo nekaj celic v placento-halazni plasti pod dorzalno stranjo endosperma (ki je 4 DPO zavzemal le majhen prostor na ventralni strani kariopse), nato pa se je odmiranje razširilo v plasteh v smeri proti bazalnemu delu kariopse (proti žilam v pedicelu) in skupaj z rastočim endospermom proti dorzalnemu delu kariopse. V času od 4 do 20 DPO je odmrlo okrog 20 do 25 plasti celic materinskega tkiva v obeh genotipih. Razpoka v mn1 je le posledica odmika premajhnega endosperma, ki se ne razvija več v skladu z normalno razvitim materinskim tkivom perikarpa in pedicela. Odmrle celice so se skoraj popolnoma izpraznile, od njih so ostale le celične stene in ostanki citoplazme v obliki trakov. Predvidevamo, da je odmiranje celic del procesa, v katerem nastane poseben transportni sistem, prek katerega se iz žil, ki se končujejo v pedicelu, hranila transportirajo v rastoči endosperm. Glede na značilnosti celic in poteka njihove programirane smrti je bila placento-halazna plast časovno in prostorsko razdeljena na dve območji. V prvem območju, ki je bilo tik pod endospermom, se je programirana celična smrt začela 4 DPO, v jedrih celic pa nismo opazili fragmentacije DNA. Do 8 DPO je odmrlo približno 10 plasti celic, v celičnih stenah pa so se pred smrtjo naložile fenolne kisline (hidroksicimetne kisline), ki so po barvi avtofluorescence v alkalnem mediju spominjale na sinapinsko kislino. Programirana smrt celic v drugem območju, ki je tik pod prvim območjem, se je začela 8 DPO. Zanjo je bila značilna fragmentacija DNA in kondenzacija jeder, v celičnih stenah pa so se naložile fenolne kisline, ki so po barvi avtofluorescence v alkalnem meidiju spominjale na ferulno in kavno kislino. V celicah v tem območju so se že zelo zgodaj naložili tudi flavonoidi. Fenolne kisline in flavonoidi so bili naloženi v obeh območjih že 8 Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 182 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 DPO, njihova količina pa se v nadaljnjem razvoju ni več bistveno spremenila. Morebitna vloga flavonoidov bi bila lahko protimikrobna zaščita razvijajoče se kariopse. V tem območju se pri vrstah s pecljatimi plodovi razvije abscizijska plast, pri koruzi pa se ob zrelosti kariopse le naložijo snovi, ki obarvajo placento-halazno plast črno in naj bi prekinile prenos vode in hranil v zrelo kariopso. Tudi zgradbo koreninske čepice smo ocenili v treh dimenzijah. Kvantitativno smo ocenili razmerje med velikostjo celic, njihovo stopnjo endopoliploidnosti in količino izocima saharoza sintaze SUS1. Mediane vzdolžne rezine vršičkov primarnih korenin smo analizirali z imunolokalizacijo, kvantitativnim DNA barvanjem in slikovno citometrijo. Signal imunolokalizacije SUS1 v celicah in njihova stopnja endopoliploidnosti sta se večala od meristemskega območja do obrobja koreninske čepice in sta bila najvišja v celicah v zunanji plasti čepice. Vsebnost DNA v jedrih takih celic je bila 8 C in več, prostornina celic pa je bila največja v vsej čepici. Visoka vsebnost SUS1 v zunanjih, endopoliploidnih celicah nakazuje povezavo med endoreduplikacijo in povečanim nalaganjem tega encima v celicah. Naloga zunanjih celic je sinteza sluzi, zato predvidevamo, da je saharoza sintaza vključena v zagotavljanje monosaharidnih prekurzorjev za sintezo sluzi. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 183 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 7 SUMMARY The development of maize (Zea mays L.) endosperm and root cap was analyzed on the cytological level using quantitative image analysis of histological tissue sections. Development of the whole caryopsis was monitored from 4 to 16 days after pollination (DAP). On the basis of the number of nuclei in median longitudinal sections of caryopsis, we concluded that the number of cells in the embryo increased exponentially, the number of cells in the nucellus decreased, while the number of cells in the pericarp remained approximately the same. Endopolyploid nuclei with DNA content 8 C (1 C is the amount of DNA in an unreplicated haploid genome) were found in the pericarp which develops from the ovary wall. The nucellus also contained endopolyploid nuclei. During the development of the caryopsis, endosperm replaces the nucellar tissue. Consequently, autolytic processes occur in the nucellus, which degenerates and remains in the form of a nucellar membrane with only a few nuclei. We studied the development of endosperm using a model that allowed us to estimate a three-dimensional structure for endosperm from parameters measured in the median longitudinal sections of caryopsis. Cell size was measured by outlining the cell walls. The level of endopolyploidy, which was estimated by quantitative densitometric measurement of relative DNA content in nuclei stained by Feulgen reaction, was then assigned to each cell. The nuclei, which contained different amounts of DNA, were randomly distributed throughout the whole endosperm during 4 to 8 DAP. However, at later developmental stages, the endosperm structure differentiated to the outer part, where small cells with a low DNA content prevailed, and to the central part, with large cells containing nuclei of high levels of endopolyploidy. We compared the development of wild-type caryopsis with the development of mn1 (miniature 1) mutant caryopsis that lacks INCW2, an isozyme of cell wall invertase. The isozyme is expressed specifically in transfer cells at the base of the endosperm and is believed to generate a steep concentration gradient for the transport of assimilates in the developing seed. Mutant mn1 is characterized by the greatly reduced size of the endosperm, which weighs only a fifth of the wild-type endosperm in the mature caryopsis. From 10 DAP onwards, growth of cells in the central part of mn1 endosperm was impaired. Cells with the same level of endopolyploidy had a smaller volume in mn1 than in Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 184 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 the wild-type. The number of cells with high levels of endopolyploidy was low, but they contributed a major part of the endosperm volume. The volume of mn1 endosperm was reduced because of the lower expansion of these large cells. The process of endoreduplication was not affected in mn1. In both genotypes we observed, at the same developmental stages, the same number of peaks in the frequency distribution of relative DNA amount in nuclei. The highest level of endopolyploidy observed was 192 C at 16 DAP in both genotypes. The frequency of cell division in the peripheral layers of endosperm was probably also reduced as a consequence of the impaired expansion of the central cells in mn1 endosperm. At 10 DAP, the mn1 endosperm contained approximately the same number of cells as the wild-type endosperm; however at 12 DAP the number of cells in mn1 was 68% and at 16 DAP only 55% of the cells in wild-type. Around 9 DAP, a physical gap is known to appear between mn1 endosperm and maternal tissue of the placento-chalazal layer. In order to determine its origin, we examined the development of the basal part of wild-type and mn1 caryopses between 0 and 28 DAP. In both genotypes we observed the death of cells in maternal tissue, starting at 4 DAP. The regular progression of this process in both genotypes and in different caryopses indicates that programmed cell death is involved. In the beginning only a few cells died in the placento-chalazal layer underneath the dorsal side of the endosperm (at 4 DAP, endosperm occupied a relatively small space on the ventral side of caryopsis). The death of cells later increased in layers towards the basal part of caryopsis, in the direction of vascular endings in the pedicel, and towards the dorsal part of caryopsis, and was correlated with endosperm expansion. Approximately 20 to 25 layers of cells in maternal tissue died in the period from 4 to 20 DAP in both genotypes. The gap in mn1 was just the consequence of a diminutive endosperm that did not develop in coordination with normally developed maternal tissue of pericarp and pedicel. Dead cells became almost completely empty, containing only the cell walls and cytoplasmic remains in the form of ribbons. We infer that the programmed death of cells is part of a process that leads to the formation of a special transport system that serves for transport of nutrients from vascular endings in the pedicel to the developing endosperm. In the placento-chalazal layer we observed two zones that were distinguished spatially and temporally by the substances in the cells and the mode of programmed cell death. Programmed cell death in the first zone, located directly Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 185 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 underneath the endosperm, started at 4 DAP, although DNA fragmentation in the nuclei of dying cells was not detectable. Up to 8 DAP, approximately 10 layers of cells died. These cells deposited a special class of hydroxycinnamic acid in their cell walls. These phenolic acids resembled sinapic acid, judged by the colour shift from blue to green of the UV induced autofluorescence in alkaline medium. Programmed cell death in the second zone (underneath the first zone, away from endosperm) started at 8 DAP. In dying cells we observed DNA fragmentation and condensation of nuclei. In the cell walls of these cells a shift in UV induced autofluorescence in alkaline medium from blue to bright blue was seen, characteristic of ferulic and caffeic acid. Very early in development we also observed deposition of flavonoids in the cells of the second zone. Phenolic acids and flavonoids were already deposited in the cells at 8 DAP, in amounts that did not change significantly during later development. Flavonoids could have a role in antimicrobial protection of the developing caryopsis. The pedicellate seed species are known to develop an abscission layer in the placento-chalazal region of caryopsis; however, in maize, this layer no longer has an abscission function in caryopsis. Special substances are deposited in this region that give the placento-chalazal layer a black colour and are thought to terminate transfer of water and nutrients in the mature caryopsis. The three-dimensional structure of the maize root cap was studied to evaluate quantitatively the relationship between the size of the cells, their endopolyploidy level and the abundance of the sucrose synthase isozyme SUS1. Median longitudinal root cap sections were analysed using immunolocalization, quantitative DNA staining and image cytometry. Both the immunolocalization signal for the SUS1 protein and the endopolyploidy level increased from calyptrogen (root cap meristem) towards the root cap periphery, and were thus highest in the outer cells. Most of these cells had a nuclear DNA content of 8 C or higher, and the largest volumes of all root cap cells. The high amount of SUS1 protein in the outer, endopolyploid cells suggests an association between endoreduplication and the abundance of this enzyme. The outer cells are involved in mucilage production, leading to the proposal that sucrose synthase provides monosaccharide precursors for mucilage synthesis. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 186 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 8 VIRI Amor Y, Haigler CH, Johnson S, Wainscott M, Delmer DP. 1995. A membrane-associated form of sucrose synthase and its potential role in synthesis of cellulose and callose in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 9353-9357. Bacic A, Moody SF, Clarke AE. 1986. Structural analysis of secreted root slime from maize (Zea mays L.). Plant Physiology 80: 771-777. Baluška F, Kubica Š. 1992. Relationship between the content of the basic nuclear proteins, chromatin structure, rDNA transcription and cell size in different tissues of the maize root apex. Journal of Experimental Botany 252: 991-996. Baker JR, Jordan BJ. 1953. Miscellaneous contributions to microtechnique. Quarterly Journal of Microscopical Science 94: 237-242. Barcellona ML, Cardiel G, Gratton E. 1990. Time-resolved fluorescence of DAPI in solution and bound to polydeoxynucleotides. Biochemical and Biophysical Research Communication 170: 270-280. Barlow PW. 1975. The root cap. V: The development and function of roots. Torrey JG, Clarkson DT (ur.). London, Academic Press: 21-54. Barlow PW. 1976. The integrity and organization of nuclear DNA in cells of the root cap of Zea mays probed by terminal deoxynucleotidyl transferase and microdensitometry. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie 80: 271-278. Barlow PW. 1977. The time-course of endoreduplication of nuclear DNA in the root cap of Zea mays. European Journal of Cell Biology 16: 98-105. Barlow PW. 1978. Endopolyploidy: towards an understanding of its biological significance. Acta Biotheoretica 27: 1-18. Barow M, Meister A. 2003. Endopolyploidy in seed plants is differently correlated to systematics, organ, life strategy, and genome size. Plant, Cell and Environment 26: 571-584. Barrieu F, Chaumont F, Chrispeels MJ. 1998. High expression of the tonoplast aquaporin ZmTIP1 in epidermal and conducting tissues of maize. Plant Physiology 117: 1153-1163. Bedi KS, Goldstein DJ. 1976. Apparent annomalies in nuclear Feulgen-DNA contents. Role of systematic microdensitometric errors. Journal of Cell Biology 71: 68-88. Beemster GTS, Fiorani F, Inze D. 2003. Cell cycle: the key to plant growth control? Trends in Plant Science 8: 154-158. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 187 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Bengough AG, Iijima M, Barlow PW. 2001. Image analysis of maize root caps – estimating cell numbers from 2-D longitudinal sections. Annals of Botany 87: 693-698. Bengough AG, McKenzie BM. 1997. Sloughing of root cap cells decreases the frictional resistance to maize (Zea mays L.) root growth. Journal of Experimental Botany 48: 885-893. Bennet MD, Snith JB. 1976. Nuclear DNA amounts in Angiosperms. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 274 (933): 227-274. Berger F. 1999. Endosperm development. Current Opinion in Plant Biology 2: 28-32. Bommert P, Werr W. 2001. Gene expression patterns in the maize cayopsis: clues to decisions in embryo and endosperm development. Gene 271: 131-142. Bonin PC, Potter I, Vanzin GF, Reiter W-D. 1997. The MUR1 gene of Arabidopsis thaliana encodes an isoform of GDP-D-mannose-4,6-dehydratase, catalysing the first step in de novo synthesis of GDP-L-fucose. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 94: 2085-2090. Borisjuk L, Walenta S, Weber H, Mueller-Klieser W, Wobus U. 1998. High-resolution histographical mapping of glucose concentrations in developing cotyledons of Vicia faba in relation to mitotic activity and storage processes: glucose as a possible developmental trigger. Plant Journal 15: 583-591. Buckeridge MS, Vergara CE, Carpita NC. 1999. The mechanism of synthesis of a mixed-linkage (1›3),(1›4)ß-D-glucan in maize. Evidence for multiple sites of glucosyl transfer in the synthase complex. Plant Physiology 120: 1105-1116. Bursch W, Paffe S, Putz P, Barthel G, Schultehermann R. 1990. Determination of the length of the histological stages of apoptosis in normal liver and in altered hepatic foci of rats. Carcinogenesis 11: 847-853. Carlson SJ, Chourey PS. 1996. Evidence for plasma membrane-associated forms of sucrose synthase in maize. Molecular and General Genetics 252: 303-310. Carlson SJ, Chourey PS, Helentjaris T, Datta R. 2002. Gene expression studies on developing kernels of maize sucrose synthase (SuSy) mutants show evidence for a third SuSy gene. Plant Molecular Biology 49: 15-29. Chaboud A. 1983. Isolation, purification and chemical composition of maize root cap slime. Plant and Soil 73: 395-402. Chaerle L, Van Der Straeten D. 2001. Seeing is believing: imaging techniques to monitor plant health. Biochimica et Biophysica Acta 1519: 153-166. ChemFinder.Com. 2003. http://chemfinder.cambridgesoft.com. Iskalni niz: »TBA«. Zadnji dostop: 24.10.2003. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 188 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Cheng W-H, Taliercio EW, Chourey PS. 1996. The Miniature1 seed locus of maize encodes a cell wall invertase required for normal development of endosperm and maternal cells in the pedicel. The Plant Cell 8: 971-983. Chen YC, Chourey PS. 1989. Spatial and temporal expression of the two sucrose synthase genes in maize: immunohistological evidence. Theoretical and Applied Genetics 78: 553-559. Cheng W, Chourey PS. 1999. Genetic evidence that invertase-mediated release of hexoses is critical for appropriate carbon partitioning and normal seed development in maize. Theoretical and Applied Genetics 98: 485-495. Chourey PS, Taliercio EW, Carlson SJ, Ruan YL. 1998. Genetic evidence that the two isozymes of sucrose synthase present in developing maize endosperm are critical, one for cell wall integrity and the other for starch biosynthesis. Molecular and General Genetics 259: 88-96. Clowes FAL. 1976. Cell production by root caps. New Phytologist 77: 399-407. Croteau R, Kutchan TM, Lewis NG. 2000. Natural products (secondary metabolites). V: Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Buchanan B, Gruissem W, Jones R (ur.). Rockville, American Society of Plant Physiologists: 1250-1318. Currier HB. 1957. Callose substance in plant cells. American Journal of Botany 44: 478-488. Dangl JL, Dietrich RA, Thomas H. 2000. Senescence and programmed cell death. V: Biochemistry & Molecular Biology of Plants. Buchanan B, Gruissem W, Jones R (ur.). Rockville, American Society of Plant Physiologists: 1044-1100. Danon A, Delorme V, Mailhac N, Gallois P. 2000. Plant programmed cell death: A common way to die. Plant physiology and Biochemistry 38: 647-655. Deng GR, Wu R. 1983. Terminal transferase – use in the tailing of DNA and for invitro mutagenesis. Methods in Enyzmology 100: 96-116. Doehlert DC, Smith LJ, Duke ER. 1994. Gene expression during maize kernel development. Seed Science Research 4: 299–305. Dominguez F, Moreno J, Cejudo FJ. 2001. The nucellus degenerates by a process of programmed cell death during the early stages of wheat grain development. Planta 213: 352-360. Doonan J. 2000. Social controls on cell proliferation in plants. Current Opinion in Plant Biology 3: 482-487. Dorweiler J, Stec A, Kermicle J, Doebley J. 1993. Teosinte glume architecture 1: a genetic locus controlling a key step in maize evolution. Science 262: 233-235. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 189 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Echt CS, Chourey PS. 1985. A comparison of two sucrose synthase isozymes from normal and shrunken maize. Plant Physiology 79: 530-536. Edgar BA, Orr-Weaver TL. 2001. Endoreplication cell cycles: more for less. Cell 105: 297-306. Eschrich W. 1980. Free space invertase: its possible role in phloem unloading. Ber. Dtsch. Bot. Ges. 93: 363-378. Fath A, Bethke P, Lonsdale J, Meza-Romero R, Jones R. 2000. Programmed cell death in cereal aleurone. Plant Molecular Biology 44: 255-266. Felker FC, Shannon JC. 1980. Movement of 14C-labeled assimilates into kernels of Zea mays L. III. An anatomical examination and microautoradiographic study of assimilate transfer. Plant Physiology 65: 864-870. Feulgen R, Rossenbeck H. 1924. Mikroskopisch-chemischer Nachweis einer Nucleinsäure von Typus der Thymonucleinsäure und die darauf beruhende elektive Färbung von Zellkernen in mikroskopischen Präparaten. Hoppe-Seyler's Zeitschrift für physiologische Chemie 135: 203-248. Fox DP. 1969. Some characteristics of the cold hydrolysis technique for staining plant tissues by the Feulgen reaction. Journal of Histochemistry and Cytochemistry 17: 266-272. Fu H, Park WD. 1995. Sink- and vascular-associated sucrose synthase functions are encoded by different gene classes in potato. The Plant Cell 7: 1369-1385. Fukuda H. 2000. Programmed cell of tracheary elements as a paradigm in plants. Plant Molecular Biology 44: 245-253. Galitski T, Saldanha AJ, Styles CA, Lander ES, Fink GR. 1999. Ploidy regulation of gene expression. Science 285: 251-254. Greilhuber J, Ebert I. 1994. Genome size variation in Pisum sativum. Genome 37: 646-655. Greilhuber J, Temsch EM. 2001. Feulgen densitometry: some observations relevant to best practice in quantitative nuclear DNA content determination. Acta Botanica Croatica 60: 285-298. Guerin J, Carbonero P. 1997. The spatial distribution of sucrose synthase isozymes in barley. Plant Physiology 114: 55-62. Giuliani C, Consonni G, Gavazzi G, Colombo M, Dolfini S. 2002. Programmed cell death during embryogenesis in maize. Annals of Botany 90: 287-292. Gunawardena AHLAN, Pearce DM, Jackson MB, Hawes CR, Evans DE. 2001. Characterization of programmed cell death during aerenchyma formation induced by ethylene or hypoxia in roots of maize (Zea mays L.). Planta 212: 205-214. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 190 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Haberlandt G. 1884. Physiologische Pflanzenanatomie. Leipzig, W. Engelman. Harborne JB. 1998. Phytochemical methods. 3rd edition. London, Chapman and Hall: 302 str. Harris PJ, Northcote DH. 1970. Patterns of polysaccharide biosynthesis in differentiating cells of maize root-tips. Biochemical Journal 120: 479-491. Hawes MC, Gunawardena U, Miyasaka S, Zhao X. 2000. The role of root border cells in plant defense. Trends in Plant Science 5: 128-133. Heiser CB. 1990. Seed to civilization, the story of food. Harvard University Press: 240 str. Jacobs T. 1997. Why do plant cells divide? Plant Cell 9: 1021-1029. Jang J, Sheen J. 1997. Sugar sensing in higher plants. Trends in Plant Science 2: 208-214. Jensen WA. 1962. Botanical Histochemistry – principles and practice. University of California, Berkeley. W. H. Freeman and Company: 408 str. Johansen DA. 1940. Plant Microtechnique. New York, McGraw-Hill. Jones RJ, Roessler J, Ouattar S. 1985. Thermal environment during endosperm celldivision in maize – effects on number of endosperm cells and starch granules. Crop Science 25: 830-834. Jork H, Funk W, Fischer W, Wimmer H. 1989. Dünnschicht-Chromatographie, Reagenzien und Nachweismethoden (Band 1a). Weinheim, VCH Verlagsgesellschaft: 468 str. Joubes J, Chevalier C. 2000. Endoreduplication in higher plants. Plant Molecular Biology 43: 735-745. Juniper BE, Clowes FAL. 1965. Cytoplasmic organelles and cell growth in root caps. Nature 208: 864-865. Kaplan DR. 1992. The relationship of cells to organisms in plants: Problems and implications of an organismal perspective. International Journal of Plant Science 153: S28-S37. Kiesselbach TA. 1949. The structure and reproduction of corn. University of Nebraska Agricultural Experiment Station Research bulletin 161: 1-96. Kladnik A. 1999. Lokalizacija genske ekspresije nekaterih encimov sladkornega metabolizma v tkivih koruze (Zea mays L.). Diplomska naloga. Ljubljana, Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo. Koch KE, Nolte KD, Duke ER, McCarthy DR, Avigne WT. 1992. Sugar levels modulate differential expression of maize sucrose synthase genes. The Plant Cell 4: 59-69. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 191 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Koch KE. 1996. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Reviews in Plant Physiology and Plant Molecular Biology 47: 509-540 Kondorosi E, Roudier F, Gendreau E. 2000. Plant cell-size control: growing by ploidy? Current Opinion in Plant Biology 3: 488-492. Kowles RV, Phillips RV. 1985. DNA amplification patterns in maize endosperm nuclei during kernel development. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 82: 7010-7014. Kowles RV, Phillips RV. 1988. Endosperm development in maize. International Review of Cytology 112: 97-136. Kowles RV, Srienc F, Phillips RL. 1990. Endoreduplication of nuclear DNA in the developing maize endosperm. Developmental Genetics 11: 125-132. Kowles RV, McMullen MD, Yerk G, Phillips RL, Kraemer S, Srienc F. 1992. Endosperm mitotic activity and endoreduplication in maize affected by defective kernel mutations. Genome 35: 68-77. Krishnamurthy KV, Krishnaraj R, Chozhavendan R, Samuel Christopher F. 2000. The programme of cell death in plants and animals – A comparison. Current Science 79: 1169-1181. Kubista M, Akerman B, Norden B. 1987. Characterization of interaction between DNA and 4',6-diamidino-2-phenylindole by optical spectroscopy. Biochemistry 26: 4545-4553. Kudo N, Kimura Y. 2002. Nuclear DNA endoreduplication during petal development in cabbage: relationship between ploidy levels and cell size. Journal of Experimental Botany 53: 1017-1023. Larkins BA, Dilkes BP, Dante RA, Coelho CM, Woo YM, Liu Y. 2001. Investigating the hows and whys of DNA endoreduplication. Journal of Experimental Botany 52: 183-192. Lichtenthaler HK, Schweiger J. 1998. Cell wall bound ferulic acid, the major substance of the blue-green fluorescence emission of plants. Journal of Plant Physiology 152: 272-282. Linnestad C, Doan DNP, Brown RC, Lemmon BE, Meyer DJ, Jung R, Olsen OA. 1998. Nucellain, a barley homolog of the dicot vacuolar-processing protease, is localized in nucellar cell walls. Plant Physiology 118: 1169-1180. Lowe J, Nelson OE, Jr. 1946. Miniature seed – a study in the development of a defective caryopsis in maize. Genetics 31: 525-533. Maness NO, McBee GG. 1986. Role of placental sac in endosperm carbohydrate import in sorghum caryopses. Crop Science 26: 1201-1207. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 192 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Martinčič A, Wraber T, Jogan N, Ravnik V, Podobnik A, Turk B, Vreš B. 1999. Mala Flora Slovenije: ključ za določanje praprotnic in semenk. Ljubljana, Tehniška založba Slovenije: 845 str. Matérn B. 1960. Medd Statens Skogsforskningsinst 49: 1-144. Matsuyama T, Satoh H, Yamada Y, Hashimoto T. 1999. A maize glycine-rich protein is synthesized in the lateral root cap and accumulates in the mucilage. Plant Physiology 120: 665-647. Mauseth JD. 1988. Plant Anatomy. The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc.: 560 str. Melaragno JE, Mehrotra B, Coleman AW. 1993. Relationship between endopolyploidy and cell size in epidermal tissue of Arabidopsis. Plant Cell 5: 1661-1668. Miller ME, Chourey PS. 1992. The maize invertase-deficient miniature-1 seed mutation is associated with aberrant pedicel and endosperm development. Plant Cell 4: 297-305. Moore DJ, Jones DD. 1967. Golgi apparatus mediated polysaccharide secretion by outer root cap cells of Zea mays. Planta 74: 286-301. Motulsky H. 1995. Intuitive Biostatistics. Oxford University Press: 386 str. Nagl W. 1976. DNA endoreduplication and polyteny understood as evolutionary strategies. Nature 261: 614-615. Neuffer MG, Coe EH, Wessler SR. 1997. The Mutants of Maize. Cold Spring Harbor Laboratory Press: 468 str. Obara K, Kuriyama H, Fukuda H. 2001. Direct evidence of active and rapid nuclear degradation triggered by vacuole rupture during programmed cell death in zinnia. Plant Physiology 125: 615-626. Olsen OA, Linnestad C, Nichols SE. 1999. Developmental biology of the cereal endosperm. Trends in Plant Science 4: 253-257. Offler CE, Liet E, Sutton EG. 1997. Transfer cell induction in cotyledons of Vicia faba L. Protoplasma 200: 51-64. Opsahl-Ferstad H-G, Le Deunff E, Dumas C, Rogowsky PM. 1997. ZmEsr, a novel endosperm-specific gene expressed in a restricted region around the maize embryo. Plant Journal 12: 235-246. Osborn HMI, Lochey F, Mosley L, Read D. 1999. Analysis of polysaccharides and monosaccharides in the root mucilage of maize (Zea mays L.) by gas chromatography. Journal of Chromatography A 831: 267-276. Pennel RI, Lamb C. 1997. Programmed cell death in plants. Plant cell 9: 1157-1168. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 193 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Pilet PE. 1986. Importance of the cap in maize root growth. Planta 169: 600-602. Pirard E, Lebrun V, Nivart J-F. 1999. Optimal acquisition of video images in reflected light microscopy. European Microscopy and Analysis, July 1999: 9-11. Ponce G, Lujan R, Campos ME, Reyes A, Nieto-Sotelo J, Feldman LJ, Cassab GI. 2000. Three maize root-specific genes are not correctly expressed in regenerated caps in the absence of the quiescent center. Planta 211: 23-33. Porter GA, Knievel DP, Shannon JC. 1985. Sugar efflux from maize (Zea-mays-L) pedicel tissue. Plant Physiology 77: 524-531. Promega Enzyme resource guide, Terminal Deoxynucleotidyl Transferase. 2003. http://www.promega.com/guides/polym_guide/tdt.pdf. Zadnji dostop: 24.10.2003 Puech M, Giroud F. 1999. Standardisation of DNA quantitation by image analysis: quality control of instrumentation. Cytometry 36: 11-17. Raghavan V. 2003. Some reflections on double fertilization, from its discovery to the present. New Phytologist 159: 565-583. Ricard B, VanToai T, Chourey P, Saglio P. 1998. Evidence for the critical role of sucrose synthase for anoxic tolerance of maize roots using a double mutant. Plant Physiology 116: 1323-1331. Riou-Khamlichi C, Menges M, Healy JMS, Murray JAH. 2000. Sugar control of the plant cell cycle: Differential regulation of Arabidopsis D-type cyclin gene expression. Molecular and Cellular Biology 20: 4513-4521. Rosche E, Blackmore D, Tegeder M, Richardson T, Schroeder H, Higgins TJV, Frommer WB, Offler CE, Patrick JV. 2002. Seed-specific overexpression of a potato sucrose transporter increases sucrose uptake and growth rates of developing pea cotyledons. Plant Journal 30: 165-175. Roscher A, Emsley L, Raymond P, Roby C. 1998. Unidirectional steady state rates of central metabolism enzymes measured simultaneously in a living plant tissue. Journal of Biological Chemistry 273: 25053-25061. Rowland LJ, Chen YC, Chourey PS. 1989. Anaerobic treatment alters the cell specific expression of Adh-1, and Sus genes in roots of maize seedlings. Molecular and General Genetics 218: 33-40. Roy SS, Mittra B, Sharma S, Das TK, Babu CR. 2002. Detection of root mucilage using an anti-fucose antibody. Annals of Botany 89: 293-299. Ruan Y-L, Chourey PS, Delmer DP, Perez-Grau L. 1997. The differential expression of sucrose synthase in relation to diverse patterns of carbon partitioning in developing cotton seed. Plant Physiology 115: 375-385. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 194 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Russ JC. 1999. The image processing handbook, third edition. CRC Press in SpringerVerlag: 771 str. Schel JHN, Kieft H, Van Lammeren AAM. 1984. Interactions between embryo and endosperm during early developmental stages of maize caryopsis (Zea mays). Canadian Journal of Botany 62: 2842-2853. Schweizer L, Yerk-Davis GL, Phillips RL, Srienc F, Jones RJ. 1995. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 92: 7070-7074. Serna A, Maitz M, O'Connel T, Santandrea G, Thevissen K, Tienens K, Hueros G, Faleri C, Cai G, Lottspeich F, Thompson RD. 2001. Maize endosperm secretes a novel antifungal protein into adjacent maternal tissue. Plant Journal 25: 687-698. Setter TL, Flannigan BA. 2001. Water deficit inhibits cell division and expression of transcripts involved in cell proliferation and endoreduplication in maize endosperm. Journal of Experimental Botany 52: 1401-1408. Shannon JC. 1968. Carbon-14 distribution in carbohydrates of immature Zea mays kernels following 14CO2 treatment of intact plants. Plant Physiology 43: 1215-1220. Shannon JC. 1972. Movement of 14C-labeled assimilates into kernels of Zea mays. L. I. Pattern and rate of sugar movement. Plant Physiology 49: 198-202. Shannon JC, Porter GA, Knievel DP. 1986. Phloem unloading and transfer of sugars into developing corn endosperm. V: Phloem transport. Cronshaw J, Lucas WJ in Giaquinta RT (ur.). Alan R. Liss, Inc.: 265-277. Sievers A, Braun M. 1996. The root cap: structure and function. V: Plant Roots: The Hidden Half, second edition. Waisel Y, Eshel A, Kafkafi U (ur.). Marcel Dekker Inc.: 31-49. Smeekens S. 2000. Sugar-induced signal transduction in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 51: 49-81. Stals H, Inze D. 2001. When plant cells decide to divide. Trends in Plant Science 6: 359-364 Stuppy WH, Maisano JA, Colbert MW, Rudall PJ, Rowe TB. 2003. Three-dimensional analysis of plant structure using high-resolution X-ray computed tomography. Trends in Plant Science 8: 2-6. Sturm A. 1999. Invertase. Primary structures, functions, and roles in plant development and sucrose partitioning. Plant Physiology 121: 1-7. Sturm A, Tang G-Q. 1999. The sucrose-cleaving enzymes of plants are crucial for development, growth and carbon partitioning. Trends in Plant Science 4: 401-407. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 195 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Swift H. 1950. The constancy of desoxyribose nucleic acid in plant nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 36: 643-654. Thompson RD, Hueros G, Becker H-A, Maitz M. 2001. Development and functions of seed transfer cells. Plant Scence 160: 775-783. Thorne JH. 1985. Phloem unloading of C and N assimilates in developing seeds. Annual Reviews of Plant Physiology 36: 317-343. Traas J, Hülskamp M, Gendreau E, Höfte H. 1998. Endoreduplication and development: rule without dividing? Current Opinion in Plant Biology 1: 498-503. Tsai CY, Salamini F, Nelson OE. 1970. Enzymes of carbohydrate metabolism in the developing endosperm of maize. Plant Physiology 46: 299-306. Tschermak-Woess E, Enzenberg-Kunz U. 1965. Die Struktur der hoch endopolyploiden Kerne im Endosperm von Zea mays, das auffallende Verhalten der Nukleolen und ihr Endopolyploidiegrad. Planta 64: 149-169. Tsukaya H. 2002. Interpretation of mutants in leaf morphology: Genetic evidence for a compensatory system in leaf morfogenesis that provides a new link between cell and organismal theories. International Review of Cytology – A Survey of Cell Biology 217: 1-39. Vilhar B, Dermastia M. 2002. Standardisation of instrumentation in plant DNA image cytometry. Acta Botanica Croatica 61: 11-26. Vilhar B, Greilhuber J, Dolenc Koce J, Temsch EM, Dermastia M. 2001. Plant genome size measurement with DNA image cytometry. Annals of Botany 87: 719-728. Wang H, Li J, Bostock RM, Gilchrist DG. 1996. Apoptosis: a functional paradigm for programmed plant cell death induced by a host-selective phytotoxin and invoked during development. Plant Cell 8: 375–391. Weatherwax, 1954. Indian corn in old America. New York, The MacMillan Company: 253 str. Weber H, Borisjuk L, Wobus U. 1996. Controlling seed development and seed size in Vicia faba: a role for seed coat-associated invertases and carbohydrate state. Plant Journal 10: 823-834. Weber H, Borisjuk L, Wobus U. 1997. Sugar import and metabolism during seed development. Trends in Plant Science 2: 169-174. Young TE, Gallie DR, DeMason DA. 1997. Ethylene-mediated programmed cell death during maize endosperm development of wild type and shrunken2 genotypes. Plant Physiology 115: 737-751. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). 196 Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 Young TE, Gallie DR. 2000. Programmed cell death during endosperm development. Plant Molecular Biology 44: 283-301. Zeng Y, Wu Y, Avigne WT, Koch KE. 1998. Differential regulation of sugar-sensitive sucrose synthases by hypoxia and anoxia indicate complementary transcriptional and posttranscriptional responses. Plant Physiology 116: 1573-1583. Zhou Y. 2000. Development and assimilate partitioning in wildtype and miniature phenotype maize kernels. Doktorska disertacija. The Pennsylvania State University, College of Agricultural Sciences, ZDA. Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 9 ZAHVALA Za odlično mentorstvo se zahvaljujem prof. dr. Marini Dermastia. Doc. dr. Barbari Vilhar se zahvaljujem za izdelavo 3-D modela endosperma, poučevanje mikroskopije, neprecenljivo pomoč pri delu in dobre diskusije. Zahvaljujem se prof. dr. Premu Choureyu, da me je gostil v svojem laboratoriju in mi omogočil dobiti veliko novega znanja. Za pomoč v laboratoriju 'čez lužo' se zahvaljujem Karen Chamusco, Susan Carlson, Earlu Talierciu, Melanie Cash, Rupali Datta in Wayneu Juricku. Zahvaljujem se dr. Andreju Blejcu za pomoč pri 3-D modeliranju, dr. Nejcu Joganu za pomoč pri botanični terminologiji in vsem na Katedri za Botaniko za dobro sodelovanje. Hvala Lukatu za stoično prenašanje vseh mojih zahtev po kemikalijah in prostoru za delo v histološkem laboratoriju. Hvala Švabu, Janji in Matevžu za kratkočasne pogovore, vzpodbude in pomoč. Pozdrav svima Balkancima iz Gejnsvila, še posebej pa sem hvaležen Aleksi Obradoviću in njegovi družini. Zahvaljujem se svoji in Sanjini familiji, da so mi dajali streho nad glavo, spodbudo v glavo in hrano v želodec. Hvala moji najdražji Sanji, da si me vedno znova spominjala, da je treba tudi uživati! Kladnik A. Citološka analiza razvoja endosperma in koreninske čepice koruze (Zea mays L.). Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Odd. za biologijo, 2003 10 PRILOGE Priloga A Objavljen znanstveni članek: Vilhar B, Kladnik A, Blejec A, Chourey PS, Dermastia M. 2002. Cytometrical evidence that the loss of seed weight in the miniature1 seed mutant of maize is associated with reduced mitotic activity in the developing endosperm. Plant Physiology 129: 23-30. Scientific Correspondence Cytometrical Evidence That the Loss of Seed Weight in the miniature1 Seed Mutant of Maize Is Associated with Reduced Mitotic Activity in the Developing Endosperm1 Barbara Vilhar, Alesˇ Kladnik, Andrej Blejec, Prem S. Chourey, and Marina Dermastia* Department of Biology, Biotechnical Faculty, University of Ljubljana, Vecna pot 111, SI–1001 Ljubljana, Slovenia (B.V., A.K., M.D.); National Institute of Biology, Vecna pot 111, SI–1001 Ljubljana, Slovenia (A.B.); and University of Florida and United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Gainesville, Florida, 32611–0680 (P.S.C.) “If you know a thing only qualitatively, you know it no more than vaguely. If you know it quantitatively—grasp-ing some numerical measure that distinguishes it from an infinite number of other possibilities—you are beginning to know it deeply.” (C. Sagan, Billions and Billions, 1997). Using new approaches to quantitative image anal-ysis, we provide the first direct evidence, to our knowledge, that loss of seed weight in the maize (Zea mays) miniature1 (mn1) seed mutant is associated with reduced mitotic activity and inhibited cell expansion, whereas there are no alterations in the progress of endoreduplication in the mutant compared with the wild-type endosperm. Furthermore, we contribute substantial new information about the spatial distribution of various developmental processes at the cellular level in the maize endosperm. Enlargement of the maize endosperm relies upon two cellular processes: cell division and cell expansion, which is in turn related to endoreduplication of nDNA (Kondorosi et al., 2000; Larkins et al., 2001). Intense mitotic activity occurs between 8 and 14 DAP (days after pollination; Kowles and Phillips, 1985; Schweizer et al., 1995). Cell division ceases in the central endosperm by about 12 DAP, but continues until late developmental stages in the peripheral cell layers, away from the embryo (Kiesselbach, 1949; Kowles and Phillips, 1985, 1988). Endoreduplication begins at 10DAP (Kowles and Phillips, 1985; Schweizer et al., 1995). The highest nDNA amount, expressed as C value, is typically 96C to 192C, as quantified by measurements of the nuclear volume (Tschermak-Woess and Enzenberg-Kunz, 1965), Feulgen cytophotometry (Kowles and Phillips, 1985), 1 This work was supported by the USA-Slovenia cooperation in science and technology grant no. 331–01–838050 and Mercator d.d. (travel grant). A.K. is a recipient of a PhD grant from the Ministry of Education, Science, and Sport (Republic of Slovenia; grant no. S1–487–001/20070/99). This paper is Florida Agricul-tural Experimental Journal Series no. R–08656. * Corresponding author; e-mail marina.dermastia@uni-lj.si; fax 386–12573390. www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.001826. and flow cytometry (Kowles et al., 1992; Schweizer et al., 1995; Larkins et al., 2001; Settler and Flannigan, 2001). In the period between 12 and 15 DAP, storage products start to accumulate (Tsai et al., 1970). The total number of endosperm cells at 16 DAP has been measured with flow cytometry (Kowles et al., 1992; Schweizer et al., 1995; Settler and Flannigan, 2001) or with nuclei counts after digestion of the endosperm with cell wall degrading enzymes (Jones et al., 1985) and is estimated to be 54,000 to 700,000. The mn1 seed mutant shows a drastic reduction in endosperm size compared with that of the wild type, Mn1, with the weight of the mature miniature en-dosperm being only 20% that of the wild type (Lowe and Nelson, 1946). The causal basis of the mn1 seed phenotype is the loss of cell wall invertase, INCW2, encoded by the Mn1 gene (Miller and Chourey, 1992; Cheng et al., 1996), which is specifically expressed at the base of the endosperm (Cheng et al., 1996). In both maize and fava bean (Vicia faba), cell wall inver-tase cleavage of Suc during the early stages of seed development is believed to play a critical role in providing hexose sugars to maintain mitotic division and only a minor role in providing substrates for starch biosynthesis (Weber et al., 1997; Cheng and Chourey, 1999). Indirect evidence suggests that in the maize endosperm, the peak of INCW2 activity at 12 DAP temporally coincides with the phase of intense cell divisions in the endosperm (Cheng et al., 1996; Cheng and Chourey, 1999). However, it has never been directly demonstrated that INCW2 deficiency in the mn1 maize endosperm is associated with reduced mitotic activity. To investigate whether the small size of the mn1 endosperm is a consequence of impaired mitosis, cell expansion, or endoreduplication, we compared cyto-logical parameters in homozygous Mn1 (wild-type) and mn1 (miniature) kernels of the W22 inbred line of maize harvested at 16 DAP. We analyzed the spatial distribution of cells by sizes and endopolyploidy lev-els (C values) in longitudinal sections of the en-dosperm using image cytometry. On the basis of the longitudinal sections, we constructed a three-dimensional (3-D) model of the endosperm. Plant Physiology, May 2002, Vol. 129, pp. 23–30, www.plantphysiol.org © 2002 American Society of Plant Biologists 23 Scientific Correspondence Figure 1. Construction of the 3-D model of the endosperm. A through D, Estimation of cell volume and nDNA amount on the 2-D longitudinal section. E and F, Extrapolation from 2-D data to the 3-D endosperm model. For explanation of figures, see “The 3-D Model of the Endosperm.” 24 Plant Physiol. Vol. 129, 2002 Scientific Correspondence Figure 2. Structure of the wild type and the miniature endosperm in relation to the cell volume. Two 16-DAP kernels of each genotype were compared using the 3-D model of the endosperm. A, Distribution of cell volumes in the endosperm. Inset shows the ratio between the mean number of cells in the miniature and in the wild-type endosperm at respective cell volume classes. B, Volume of endosperm occupied by cells with different cell volumes. A and B, Wild-type kernel no. 1 (F; total number of cells 738,000; total endosperm volume 31.4 mm3); wild-type kernel no. 2 (f; 751,000 cells; 33.2 mm3); miniature kernel no. 1 (E; 422,000 cells; 9.3 mm3); and miniature kernel no. 2 (D; 404,000 cells; 6.0 mm3). Cell volume is shown in logarithmic scale. THE 3-D MODEL OF THE ENDOSPERM The endosperm model was based on measurement of the cell area and nDNA amount on the endosperm median longitudinal section. The same Feulgen-stained section was used for cell area and nDNA amount measurements. Image analysis instrumentation was as by Vilhar et al. (2001). For all described measurements, we developed macros based on the KS400 image analysis software package (Carl Zeiss Vision, Munich). To estimate the cell volume and nDNA amount on the two-dimensional (2-D) longitudinal section (Fig. 1, A-D), we interactively outlined the cell walls of individual cells on the image grabbed from a microscope (Fig. 1A). For each cell, we recorded its posi- Plant Physiol. Vol. 129, 2002 tion (centroid coordinates shown as dots in Fig. 1A) and measured the cell area. The cell volume was estimated from the cell area, assuming that each cell was a sphere. The cell volume data were shown as gray values on the image (Fig. 1B). To overcome the problem of missing data (areas where no cells have been outlined; white regions in Fig. 1B), the image of the longitudinal section was reconstructed with the virtual cellularization method (Fig. 1D), an adapted version of the random sets mosaic method (Matern, 1960). Each pixel in the endosperm was assigned to its nearest cell outline centroid (Fig. 1C), which led to separation of the endosperm into virtual cells. To each virtual cell, the cell volume of its respective centroid was assigned. The cell volumes were displayed as gray values (Fig. 1D; note the almost identical pattern of gray values in B and D and the absence of areas with missing data in D compared with B). A similar procedure, based on C-value data instead of cell area, was used to construct the image showing nDNA amounts. Hence, using virtual cellularization, both the cell volume and the C value were assigned to each virtual cell on the analyzed section. The next step of model construction was extrapolation from 2-D data to the 3-D endosperm model (Fig. 1, E and F). The image shown in Figure 1D was the 2-D basis for estimation of distribution of cells in 3-D. The longitudinal section was, in essence, rotated around its longitudinal axis. To correct for the irregular 3-D shape of the endosperm, the endosperm was not rotated as a whole. Instead, the image of the longitudinal section was sliced along the y axis, with slice thickness of 1 pixel. For each pixel line (Fig. 1E, Ia line PQ and IIa line ST), a virtual cross-section composed of voxels was created (Fig. 1E, Ib and IIb). The area of the virtual cross-section was filled in with gray values (Fig. 1E, Ic and IIc) on the basis of the gray-value profile along the selected pixel line. For pixel lines in the regions without the embryo pocket, the assumed cross section was a circle with the diameter equal to distance PQ (Fig. 1E, Ia and Ib). The gray-value profile was rotated for ±90°, resulting in concentric bands of voxels with the same gray value (Fig. 1E, Ic). For pixel lines in the region with the embryo pocket, the extreme points at the top and bottom of the embryo pocket were first connected with a straight line (Fig. 1E, line VZ). The distance TU was assumed to be the radius of the embryo pocket circle, whereas the distance SU corresponded to the diameter of the endosperm circle (Fig. 1E, IIa and IIb). The sizes of cells surrounding the embryo pocket were different from the outer layers of the endosperm bordering with the pericarp (Fig. 5A). Hence, the “region of embryo influence” was defined as a circle based on three points (Fig. 1E, IIb, dashed line): the midpoint of the gray-value profile (K) and the intercepts between the endosperm circle 25 Scientific Correspondence Figure 3. Frequency distribution of nDNA amounts in longitudinal sections of the wild type (A and C) and the miniature mutant (B and D) in endosperm (A and B) and in embryo (C and D) of 16-DAP kernels. DNA was quantitatively stained with the Feulgen reaction (Greilhuber and Ebert, 1994), and permanent slides were prepared (Vilhar et al., 2001; the KS400 protocol). For each nucleus, tissue type (embryo or endosperm), position (centroid coordinates of the nucleus), nuclear area, and nDNA amount were recorded. nDNA amount was measured with DNA image cytometry following the interphase-peak method (Vilhar et al., 2001; Vilhar and Dermastia, 2002). The distribution of nDNA amounts for the embryo cells (C and D) showed two peaks, corresponding to the 2C and 4C value (dashed lines). The mode of the embryo 2C peak was used as an internal calibration standard for conversion of the nDNA amount data from arbitrary units to C values. The limits between two consecutive peaks were set at midpoint between their modes (crosses on the x axis), allowing each nucleus to be assigned to a certain DNA replication level (C-value class). Arrows on A and B indicate misplacing of the high C-value peaks. At high C values, a part of the nucleus was not contained on the section, because the nuclear diameter was larger than section thickness (20 /um). A, 1,658 nuclei; B, 1,331 nuclei; C, 4,231 nuclei were measured; and D, 1,862 nuclei. and the embryo pocket circle (L and M). The gray-value bands were fitted into the virtual cross section (example in Fig. 1E, IIc). The gray values from KT were used for voxels within the region of embryo influence, and those from SK were used for all other endosperm voxels. Examples of virtual serial longi-tudinal sections generated with the described 3-D model are presented in Figure 1F (1, 2, 3, and 4 26 correspond to respective labels in Fig. 1E). The de-scribed 3-D model of the endosperm enabled con-struction of frequency distribution of the voxel gray values, which was used to estimate the total number of cells in the endosperm. The number of cells at different endopolyploidy levels was calculated ac-cording to the above procedure, using the images shown in Figure 5B as the basis for 3-D modeling. Plant Physiol. Vol. 129, 2002 Scientific Correspondence Figure 4. Structure of the wild type and the miniature endosperm in relation to DNA replication levels. Two 16-DAP kernels of each genotype were compared using the 3-D model of the endosperm. A, Distribution of cells belonging to different C-value classes; inset shows the ratio between the number of cells in the miniature and in the wild-type endosperm at respective C-value classes. B, The median cell volume of cells belonging to different C-value classes; inset shows the ratio between the median cell volume in the miniature and in the wild-type endosperm at respective C-value classes. The ratio shown in insets was calculated on the basis of the mean value of the respective parameters for each genotype. C, Volume of endosperm occupied by cells belonging to different C-value classes. A through C, Wild-type kernel nos. 1 and 2 (F and f); miniature kernel nos. 1 and 2 (E and D). The data for the 96C and the 192C class were pooled together due to a small number of cells. C value is shown in logarithmic scale. Plant Physiol. Vol. 129, 2002 CYTOLOGICAL PARAMETERS IN THE WILDTYPE AND MINIATURE ENDOSPERM The total endosperm volume, estimated with the 3-D model, was 31 mm3 consisting of 740,000 cells in the wild-type kernel and 8 mm3 with 410,000 cells in the miniature kernel. Compared with the wild type, the number of cells in the miniature endosperm was 55%, whereas the endosperm volume was only 25%, indicating that in addition to impaired cell proliferation, there is also a reduction in the cell size contrib-uting to the smallness of the mn1 endosperm (Fig. 2). The distribution of cell volumes was asymmetrical in both genotypes, with the majority of cells having a relatively small cell volume (Fig. 2A). However, com-pared with wild type, the miniature endosperm was deficient in the number of large cells (Fig. 2A, inset). Although most of the endosperm was occupied by large cells in both genotypes, increasing deficiency in the number of cells at increasing cell size resulted in the severely decreased total volume of the miniature endosperm (Fig. 2B). At least six endoreduplication cycles were com-pleted by 16 DAP in the endosperm of both geno-types (Fig. 3), showing that the progress of endoredu-plication was not affected in the miniature endosperm compared with the wild type. The distribution of cells at a certain endopolyploidy level (C-value class) showed the same pattern in both genotypes (Fig. 4A), except that the number of cells in each C-value class in the miniature endosperm was only 40% to 60% that of the wild type (Fig. 4A, inset), in agreement with the overall deficiency in the total number of cells in the miniature endosperm (Fig. 2). In a previous study, 35 defective kernel mutants in maize (Kowles et al., 1992) were found to have both reduced cell numbers and reduced endopolyploidy levels, with the excep-tion of one mutant that had a reduced cell number but functional endoreduplication. The miniature mutant is another example of the latter type of defective kernel mutation. Reduced number of cells together with functional endoreduplication in the miniature endosperm demonstrates that mitosis and endoredu-plication are not directly coupled processes in the maize endosperm, as previously noted by Kowles et al. (1992). A positive correlation between the cell volume and the amount of nDNA in both genotypes showed that cell enlargement and endoreduplication are interde-pendent processes (Fig. 4B). However, the median cell volume at each endopolyploidy level was smaller in the miniature than in the wild-type endosperm. The ratio between the cell volume in the miniature and the wild-type endosperm decreased with increasing en-dopolyploidy level (Fig. 4B, inset), indicating that in the miniature mutant cell expansion was particularly impaired at high endopolyploidy levels. Cells at 12C to 48C values occupied the largest part of the en-dosperm volume in both genotypes. Nevertheless, the absolute endosperm volume belonging to each 27 Scientific Correspondence Figure 5. Structure of the wild-type and the miniature endosperm. Two 16-DAP kernels of each genotype were compared. A, Spatial distribution of cells with different volumes on the longitudinal section of the endosperm; images generated with the virtual cellularization method; for better visual perception, cell volumes calculated as gray values (see Fig. 1D) are shown (Legend continues on facing page.) 28 Plant Physiol. Vol. 129, 2002 Scientific Correspondence Figure 5. (Legend continued from facing page.) in pseudocolor scale. Sections from left to right, Wild-type kernel no. 1 (3,788 cells were outlined on the longitudinal section), wild-type kernel no. 2 (3,592 cells), miniature kernel no. 1 (2,974 cells), and miniature kernel no. 2 (2,660 cells). B, Spatial distribution of cells at different DNA replication levels on the longitudinal section of the endosperm; images generated with the virtual cellularization method; C values are shown in pseudocolor scale; sequence of sections is the same as in A. C and D, Stacked histograms showing the number of cells in relation to the cell volume and the DNA replication level. E and F, Stacked histograms showing the endosperm volume occupied by cells with different cell volumes and the DNA replication levels. C through F, Data obtained with the 3-D model of the endosperm; the data for the 96C and the 192C class were pooled together due to a small number of cells. endopolyploidy level was smaller in the miniature than in the wild-type kernel (Fig. 4C), due to a com-bined effect of a reduced number of cells and a reduced cell size. The histograms in Figure 5, C through F, show the complex relationship among the number of cells, the cell size, and the endopolyploidy level in the maize endosperm. The structural patterns were similar in both investigated genotypes with two exceptions: The miniature endosperm was characterized by smaller cells at respective endopolyploidy levels than the wild type, and by the absence of the largest cells. Although large cells at higher endopolyploidy levels were not numerous in either genotype, they contrib-uted most to the final volume of the endosperm and were, thus, essential for endosperm enlargement. For example, only 7% of cells in the wild-type kernel had the nDNA amount of 24C value or higher, but these cells comprised 60% of the total endosperm volume (Fig. 5, C and E). The cells with 3C and 6C nDNA amounts had a share of 80% in the total number of cells; yet, they only contributed 20% to the total endosperm volume. In both genotypes, the smallest cells were located in the outer layers of the endosperm, whereas larger cells occupied the central region (Fig. 5A), in agreement with previous observations that the sizes of both the nuclei and the cells increase from the aleu-rone layer to the central endosperm in different maize lines (Tschermak-Woess and Enzenberg-Kunz, 1965; Kowles and Phillips, 1988; Larkins et al., 2001). The layers of endosperm cells lining the embryo pocket contained larger cells at higher endopolyploidy levels than the outer endosperm layers away from the embryo in both genotypes (Fig. 5, A and B). The central endosperm cells can only expand rap-idly during crown development if cell growth is co-ordinated with enlargement of the endosperm sur-face, sustained by anticlinal divisions of the peripheral cells (Kiesselbach, 1949). The surface of the endosperm, without the embryo pocket and the basal region, was about 40mm2 in the wild-type kernel but only 15 mm2 in the miniature, as estimated from the 3-D model. Because the size of cells in the outer most layer was similar in both genotypes, the estimated number of these outer cells was about three times lower in the miniature than in the wildtype endosperm. Thus, it seems likely that impaired mitosis in the peripheral layers of the miniature en-Plant Physiol. Vol. 129, 2002 dosperm imposes physical constraints upon expansion of the central cells. Indeed, regarding the same pattern of endoreduplication process in the miniature endosperm and in the wild type (Fig. 3), miniature cells at respective endopolyploidy levels were smaller than expected (Fig. 4B). The lower levels of metabolically released, osmot-ically active sugars (hexoses) and precursors for cell wall biosynthesis available to the miniature en-dosperm due to the INCW2 deficiency may lead to a reduced cell expansion in the peripheral region. This may, in turn, cause a reduced mitotic activity in the outer cell layers through cell size control mecha-nisms, in agreement with the hypothesis of “expansion leads mitosis” (Jacobs, 1997). INCW2 deficiency may also result in a premature high ratio of Suc to hexose in the endosperm, which may favor cell differentiation and starch accumulation over cell division, as has been shown for fava bean (Weber et al., 1997). Although the mechanisms involved in regulation of cell cycle and differentiation in relation to sugar levels are presently largely unknown, the pre-sented results support the hypothesis that the role of cell wall invertase in control of seed development in maize is similar to its regulatory role described in fava bean (Weber et al., 1997). ACKNOWLEDGMENTS In memoriam of Profs. Elisabeth Tschermak-Woess (1917–2001) and Oliver E. Nelson (1920–2001). Received December 18, 2001; returned for revision January 23, 2002; accepted February 7, 2002. LITERATURE CITED Cheng WH, Chourey PS (1999) Theor Appl Genet 98: 485–495 Cheng WH, Taliercio EW, Chourey PS (1996). Plant Cell 8: 971–983 Greilhuber J, Ebert I (1994) Genome 37: 646–655 Jacobs T (1997) Plant Cell 9: 1021–1029 Jones RJ, Roessler J, Quattar S (1985) Crop Sci 25: 830–834 Kiesselbach TA (1949) Research Bulletin 161. Agricultural Experiment Station, University of Nebraska, Lincoln Kondorosi E, Roudier F, Gendreau E (2000) Curr Opin Plant Biol 3: 488–492 29 Scientific Correspondence Kowles RV, McMullen MD, Yerk G, Phillips RL, Krae-mer S, Srienc F (1992) Genome 35: 68–77 Kowles RV, Phillips RL (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: 7010–7014 Kowles RV, Phillips RL (1988) Int Rev Cytol 112: 97–136 Larkins BA, Dilkes BP, Dante RA, Coelho CM, Woo Y, Liu Y (2001) J Exp Bot 52: 183–192 Lowe J, Nelson OE Jr (1946) Genetics 31: 525–533 Mate´rn B (1960) Medd Statens Skogsforskningsinst 49: 1–144 Miller ME, Chourey PS (1992) Plant Cell 4: 297–305 Sagan C (1997) Billions and Billions. Headline Book Publishing, London Schweizer L, Yerk-Davis GL, Phillips RL, Srienc F, Jones RJ (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92: 7070–7074 Settler TL, Flannigan BA (2001) J Exp Bot 52: 1401–1408 Tsai CY, Salamini F, Nelson OE (1970) Plant Physiol 46: 299–306 Tschermak-Woess E, Enzenberg-Kunz U (1965). Planta 64: 149–169 Vilhar B, Dermastia M (2002) Acta Bot Croat 61: 11–25 Vilhar B, Greilhuber J, Dolenc Koce J, Temsch EM, Der-mastia M (2001) Ann Bot 87: 719–728 Weber H, Borisjuk L, Wobus U (1997) Trends Plant Sci 2: 169–174 30 Plant Physiol. Vol. 129, 2002