r
ONKOLOŠKI INŠTITUT I MEDICINSKA FAKULTETA U LJUBLJANI

SPOSOBNOST IMUNSKIH METODA U KLINIČKOJ ONKOLOGIJI
Plesničar, S.
Sažetak: Prikazan je pokušaj analize vrednosti imunskih testova koji se danas primenjuju u kancerologiji. Upotrebljava se više vrsti testova, bilo nespecifičkih, koji prikazuju sposobnost organizma da se odazove antigenu, ili specifičkih za pojedini tip tumora. Ovaj rad obuhvata pretežno testove koji se veC rutinski upotrebljavaju.
Iz razloga što u odazivanju organizma prema rakavim Celijama glavnu ulogu igraju limfociti, vecina testova koji se primenjuju u kancerologiji ustanavlja u prvom redu osobine T- limfocita. Zbog toga medju testove nespecifične prirode, koji prikazuju sposobnost odazivnosti organizma, ubrajamo broj perifernih limfocita, sposobnost transformacije limfocita u perifernoj krvi i, konačno, kao jedini »in vivo« test, test aplikacije antigena u epidermis, tzv. kutani test. Danas možemo ocenjivati odazivnost organizma i na taj način da na osnovu histološkog nalaza ustanovimo stanje žlezda, i to onih koje ukazuju na odazivnost imun-skog sistema pa onih ,koje pokazuju potpuno iscrpljenje organa. Osim toga se pokazalo da je dobar pokazatelj i inhibicijski test migracije leukocita. Od poznatih specifičkih testova upotrebljavaju se u kliničkoj onkologiji u glavnom samo dva, i to: karcino-embrionijski antigen (CEA) i alfa-foto-protein (AFP).
UDK 616-006-077.3
Deskriptorji: neoplazme, imunološki testi, klasifikacija
Radiol. Iugosl., 1; 47-60, 1977
L	J
Uvod. — Karakteristično za rakavu bolest je da može trajati samo nekoliko tje-dana, a može i više godina (1).
U svakom trenutku tog obdoblja razvoj bolesti zavisi od proširenosti rakavog tkiva po organizmu, od njegove biološke aktivnosti i od brzine malignog rasta. Zato su diagnostičke metode koje mogu dopri-nositi k ocenjivanju stanja rakave bolesti u organizmu, vanredno dobrodošle, jer samo na osnovu utvrdjenja koliko je rakavog tkiva u organizmu i u kakvoj je fazi njen biološki potencijal, može se terapiju pravilnije dozirati.
U zadnje dve decenije razvila se tumor-ska imunologija. Vrednost te grane kan-cerologije je u torne da je ona dokazala da organizam nije nemi pratioc razvoja rakave bolesti, vec da na sve promene reagira, makar ponekad u svoju štetu, npr. sintezom blokirajucih protivtela.
Zbog toga medju najvažnija sticanja imunologije u kancerologiji ubrajamo
imunološke testove koji ocenjuju kako stanje organizma, tako rast tumora u tom organizmu (2).
Imunološki testovi. — Imunološki testo-vi koji ocenjuju opšte stanje organizma zovu se nespecifički testovi. Obzirom na to da je kod toga odazivnost celija od prvenstvenog značaja, ti testovi na razne načine proveravaju stanje Celične imuno-sti organizma, a u manjoj meri i stanje humoralne imunosti (3).
Neki od tih testova u praksi vec se primenjuju i to: brojenje limfocita, blastna transformacija limfocita, odredjivanje broja T-limfocita, odredjivanje stanja limfne žlezde i kožni testovi. Medju humoralne testove ubrajamo odredjivanje koncentracije imunoglobulina u serumu.
Druga vrsta testova koji se vec upotrebljavaju, odredjuje kvantitet tumorskog te-reta. To su u prvom redu testovi kojima proveravamo neke sastavine tumorskih Ce-
48
Plesničar, S.
lija, kao što su: alfa-feto-protein (AFP) i karcino-embrionski antigen (CEA). To su dva testa koji se danas svestrano upotreb-ljavaju, mada osim njih ima još i drugih testova za dokazivanje prisutnosti i količine tumorskog tkiva u organizmu.
U manjoj meri upotrebljavaju se još ti testovi: fluorescentni metod, metod odre-djivanja blokirajučih antitela, tehnika in-hibicije migracije leukocita i drugi manje poznati metodi.
Za tumor specifične antigene otkriva-mo pomoču nekih drugih metoda. Ti specifični antigeni su: alfa 2H-feto-protein, beta S-feto protein, leukemijski antigeni, he-terofilni fetalni antigen i fetalni sulfogli-koproteinski antigen.
Ima još nekih drugih imunskih testova koji se primenjuju u manjoj meri. To su: Makarijev kožni test, odredjivanje elektro-foretske mobilnosti makrofaga, karcino-placentarna alkalna fosfataza i radioimun-ske metode kod tumora sa ektopičnom sintezom hormona (4).
Nespecifični imunski testovi. — U tu
vrstu ubrajamo testove koje več godina-ma upotrebljavamo, i druge, nove testove kojih izvedba postala je u poslednje vreme tako jednostavna da čemo ih moči ru-
tinski izvoditi u bilo kojoj hematološkoj laboratoriji (npr. transformacija leukoci-ta).
a. Broj limfocita u perifernoj krvi. —
Normalno nadjemo u perifernoj krvi odraslog čovjeka od 20—30 % limfocita, ako je srednja vrednost za leukocite 7000 če-lija/mm3. Kod odraslog čovjeka zahvača 95 % područje od 1000 do 3500 limfocita, sa srednjom vrednošču 2200 limfocita na mm3^
Kod malignih bolesti, sa iznimkom lim-foproliferativnih bolesti, broj limfocita obično je snižen samo u kasnim stadijima (tabela 1). Ali, takvo sniženje odraz je sni-ženog celokupnog broja limfocita, tako da je postotni iznos identičan bez obzira na stadij bolesti.
Od večeg značenja je iatrogeno izazvana leukopenija, koja se javlja redovno kao posledica zračenja (slika 1). Njena težina ovisi od veličine polja, od zračenog pod-ručja, .od celokupne doze i od nominalne standardne doze (5, 6). Istotako se jake leukopenije pojavljuju posle primene mono- ili poli- kemoterapije. Kasne limfope-nije mogu značiti lošu prognozu kao što to može biti slučaj kod karcinoma dojke (7).
Leukociti* Limfociti*
Monociti''
Limfociti kao % leukocita
Monociti kao % leukocita
Stadij II	Stadij III	Stadij IV
(No. 31)	(No. 24)	(No. 26)
8.319	9.346	10.619
(5.200-14.200)	(4.400-18.100)	(4.800—34.400)
1.682	2.349	1.779
(500—4.180	(1.330—5.900)	(846-3.940)
440	673	634
(176-1.210	(122—1.690)	(74-1.704)
21,6 "',,	26.5 %	20,0 '-"„
(6-38)	(14-56)	(9—39)
5,6 %	6,6 ° n	5,6%
(2—11)	(1-12)	(1—12)
• Broj Celija izražen kao aritmetička sredina i sa varijacijskom širinom (broj celija mm').
Tabela l. — Promjene u vrednostima Celija periferne krvi kod serije pacijenata sa plucnim rakom za vreme prve diagnoze (Onkološki Inštitut, Ljubljana).
Sposobnost imunskih metoda u kliničkoj onkologiji
49
U glavnom možemo reči da nam broj limfocita dobro služi kao biološki monitor kod radio- i kemoterapije, a izgleda da može imati i prognostičku vrednost, jer indirektno pokazuje trenutno funkcional-nu sposobnost imunskog sistema.
b. Test hlastne transformacije limfocita (8). — Taj test se oslanja na svojstvo limfocita, da stimuliran antigenom prelazi u blastni oblik, tj. u veliku celiju sa velikim jezgrom i sa snažnom bazofilnom citoplaz-mom u kojoj su brojne vakuole. Jezgro sadrži brojne nukleole. Proces traja 3 dana, što znači da je limfocit u svoj meta-
bolizam utisnuo secanje na taj antigen i da se zbog toga kadgod može ponovo oda-zvati tom antigenu.
Iz razloga što nas kod samog testa zanima samo broj limfocita koji prelaze u blastnu transformaciju, možemo upotreb-Ijavati nespecifične biljne antigene. Medju nje ubrajamo fitohemaglutinin (PHA), koji transformira T- i B-limfocite i concana-valin — A (Con — A), koji transformira pretežno Ti — i L — limfocite.
Test se odvija tako da limfocitima dodamo antigen, bilo PHA ili. Con-A, i inkubi-ramo ih kod temperature 37° C tri dana.
Posle toga limfocite skupimo na mikro-
- 50
40
C:, 30
0 -500 500 -1000 1000-1500 1500-2000 2000-2500 2500-3000 3000-3500
Limfociti ( N / mm 3 1
Slika l. — Pad broja limfocita kod serije pacienata sa bronhialnim karcinomom pre ; posle zračenja i kod pojava recidive (Onkološki Inštitut, Ljubljana)




50
Plesničar, S.
skopskom staklu, obojima ih po May-Griinwaldu i Giemsi i brojimo transfor-mirane i obične limfocite do ukupno barem 300 celija. Iz toga izračunamo posto-tak transformiranih, blastnih oblika. Danas su u prodaji vec jednostavne podloge, kod kojih nam, ako upotrebimo mikro-metode, za eksperiment treba samo 300 mikro L krvi (8 kapi)* (9).
Normalno prelazi u transformaciju od 70-80 % svih limfocita.
Snižen broj transformiranih limfocita nadjemo pre svega kod urodjenih imuno-deficitarnih stanja, kao što su Di George-jev sindrom, timusna hipoplazija i drugo. Ali, te pramene mažemo naci i kod pri-dobivenih imunodeficitarnih stanja. Na primer, kod nekih malignih bolesti posto-tak hlastnih oblika vrlo se snizi, i to kod malignih limfama (limfosarkom, retikulo-sarkom), kod limfatične leukoze i u kasnim stadijima Mb. Hodgkina (10). Isto-tako nadjemo snižen broj blastnih oblika kod solidnih tumora (11), npr. kod karci-noma dojke i kod bronhijalnog karcino-ma (12, 13, 14). Posle uspešne terapije broj blastnih oblika ponovo se diže, mada vrlo retko postiže iste vrednosti. Kod maligno-ma pokušavaju sprovadjati test transformacije uporabam ekstrakta tumorskih tkiva. Sa najviše uspeha stimuliraju limfocite autologni ekstrakti tumorskih tkiva.
Opšte uzeto, brojenjem limfocita dobi-jemo uvid u kvantitet celija; transformacija pak nam prikazuje njihov kvalitet, to jest, funkcionalne sposobnosti.
c. Rozetni test T-^mfocita
Pošto je T-Iimfocit jedna od celija koje su citotoksične za malignu celiju, znanje o tome, koliko je tih celija, T-limfocita, u krvnom optoku, moglo bi nam dati po-mocne podatke za ocenjivanje stanja organizma.
To je moguce napraviti tako zvanim ro-zetnim testom. Kod tog testa mešamo lim-
* »Blasto Kit« — Instituto Sieroterapico Milanese S. Belfanti, Milano — Italia.
focite sa ovčjim eritrocitima zbog svoj-stva T-limfocita da vežu na svoju mem-branu ovčje eritrocite. Tako se stvori figura, slična ruži, i zato nazivamo takvu kombinaciju limfocita sa eritrocitima ro-zetom. Za obrazovanje tih rozeta nije po-treban nikakav pregradni humoralni faktor, zbog toga se te rozete zovu spontane E-rozete.
Kod tehnike inkubiranja limfocita sa eritrocitima preko noči, nadjemo normalno prosečno 48 % limfocita koji tvore E-rozete. Variacijska širina krece se od 30 do 75 %-
Koncentracija T-limfocita snižena je kod brojnih malignih bolesti (15), tako kod karcinoma dojke (16), bronha (17), glave i vrata (18), kod intrakranijalnih tumora (19), kod tumora creva, želuca, ezofa-gusa, epifarinksa, prostate i pankreasa i kod sarkoma različitih izvora (20).
Opšte uzev zapaža se da koncentracija T-limfocita pada kod napredovalih stadija i kod recidivantnih situacija sa metastazama. Naročito u primerima koji su le-čeni hemoterapijom, bile su utvrdjene van-redno niske vrednosti za T-limfocite (po-nekad samo 5 % E-rozetnih limfocita). Ipak se u remisiji vrednosti mogu ponovo povisiti i postici normalne vrednosti. Bolest kod koje nadjemo samo lokaliziran tumor, daje nam samo malko snižene vrednosti, a isto tako situacije kod kojih je tumor bio iako radikalno, ali pre kratko vreme odstranjen (tabela br. 2).
Tehniku tvorbe rozeta upotrebljavamo isto tako za odredjivanje B-limfocita. U tom primeru potrebni su za vezanje ovčjih eritrocita na B-limfocit serumski humoralni faktori. To su C3 frakcija komple-menta i antitela. Najprije vežemo ih na eritrocite, i tek zatim te eritrocite mešamo sa suspenzijam limfocita. B-limfociti vežu na svoju membranu eritrocite, na ko-jima se nalazi pomenuti pripremljeni kompleks. U primerima kad se radi o odre-djivanju B-limfocita, služimo se i nekog drugog njihovog svojstva, naime toga, da se na membrani i u citoplazmi B-limfocita
Sposobnost imunskih metoda u kliničkoj onkologiji
51
Rozetne Celije %
—	aritm. sredina
—	varijacijska širina
Limfociti (No/mm1)
—	aritm. sredina
—	varijacijska
kontrolne vrednosti (No = 31)
46,1
32,9-56,0
prvo lečenje (rani primeri) T1 ili T2 sa NO ili 3-godišnja remisija (No= 11)
prvo lečenje (kasni primeri) T3 ili T4 sa N2
ijili Ml ili generalizacija (No = 14)
36,0
27,0—43,0
2290 1110—5740
21,3 % 5,0—48,7
1640 720-2430
kasno lečenje (kasni primeri)
vec lečeni primeri, sada metastaze ili generalizacija (No = 14)
31,7 % 6,G—44,8
810 430—1000
* Vrednosti za normalnu populaciju iz literature: l. Bach. J. F.: 20—8
Transplant.
Rev., 16, 196, 1973; 2. Belpomme D. et al.: 50 % (30-75 %), Bull. Cancer, 61, 387, 1974;
3. Michlmayer G. et al.: 52,1 ± 3,8 %, Schweiz. Wochenschr., 104, 815, 1974. 5 *4Svi primeri nelečeni ili lečeni samo operativno.
Tabela 2. — Postotak E-rozetnih celija (T-limfocita) periferne krvi kod 39 primera ma-lignoma različitih lokalizacija. (Onkološki Inštitut, Ljubljana).
nalazi obilica imunoglobulina, zbog Cega za odredjivanje tih Celija upotrebljavamo imunofluorescentne tehnike. Direktnim metodom markiramo antitelo sa fluore-scentnom materijom, npr. sa fluorescentnim izotiocianatom. Na taj način markirano antitelo veže se sa membranskim antigenima na B-limfocitu, što možemo videti u fluorescentnom mikroskopu (3).
MoguCnost odredjivanja pojedinih m,ar-kera na limfocitima (tabela 3), i tirne sposobnost identifikacije T- i B- limfocita i njihovih podgrupa pokazala se korisna kod identifikacije Celije izvora pojedinih vrsti malignih limfoma (21). Tako je uspelo sa odredjivanjem markera utvrditi kod kojih malignih limfoma je početna Celija T-limfocit. U grupu malignih limfoma koji polaze iz T-limfocita ubrajamo: manji postotak hroničnih limfatičkih leukoza, mycosis fungoides, Sezaryjev sindrom i lim-foblastni limfom. Ipak, vecina malignih limfoma pripada grupi koje izvor je u raz-ličitim variantama B-limfocita. U tu grupu idu: veČina hroničnih limfatičkih leukoza, makroglobulinemija Waldenstrom, bolesti
teških lanaca, multipli mielom i maligni limfomi germinalnih centara. Interesant-no je da u grupu retikulosarkoma spada maligna varianta transformiranog limfocita, zbog toga poznajemo T- ili B- imuno-blastom, odnosno po predašnjoj klasifikaciji retikulosarkom (22) (tabela 4).
Razume se da granice medju pojedinim vrstama tih bolesti nisu tako oštre; kod hronične limfatičke leukoze možemo naci
Karakteristika	Limfocit Limfocit
celije	T	B
Rozete »E«	+	o
Rozete »EA«	o	-j-
Rozete »EAC«	o	
Imunoglobulini		
na membrani	o	+
(S-Ig)		
Imunoglobulini		
u citoplazmi	o	+
(Ip-lg)		
Recirkulacija	+	o
Tabela 3. — Imunske osobine celija koje služe identifikaciji T- i B-limfocita
4*
52
Plesničar, S.
npr. takvu heterogenost Celija da se ona rasteže od Bi- do B3- limfocita.
d. Histologija limfnih žlezda. — U tom
primeru ne radi se o imunskom testu u uskom smislu reči, vec o reevaluaciji histološke slike žlezda, koja bazira na sa-vremenom poznavanju funkcije limfocita. Poznato je da u germinalnim centrima žlezde nadjemo pre svega B- limfocite, u parakortikalnim regijama T-limfocite, a u medularnim predelima plazmatke i mono-cite. Dokazano je da je dužina preživeca pacijenta u korelaciji sa odredjenom strukturom žlezde kod karcinoma glave i vrata (23), vrata materice (24), kolona (25) i dojke (26).
Uglavnom kod rakavih bolesti poznaje-mo 4 histološke tipe žlezda: Prvi je lim-focitno predominantni tip žlezde za koji je karakteristična populacija malih limfocita, a pojavljuje se obično u vezi sa du-žim preživecem. Drugi su razviti germi-nalni centri, gde je doba preživeca, ako je uporedjujemo sa prvom, kraca, ali je duža u uporedjenju sa onom kod treceg histološkog tipa, to je tipa sa histološkom slikom limfocitne deplecije, gde limfociti isčezavaju iz žlezda. četvrti je histološki
tip nepromenjene, nestimulirane žlezde. Ne možemo isključiti mogucnosti da se po odredjenom redosledu u jednoj te istoj žlezdi odvijaju sve gore opisane promene, od stadija predominance limfocita do stanja deplecije žlezda. Zbog toga histološka slika deplecije limfocita može biti progno-stički slab znak, tako možda popuštanje imunske odazivnosti sa nastupajucom ka-heksijom. Svakako nam evaluacija histološke slike žlezda može dati uvid u otpor-nost organizma odnosno limfnog sistema u odredjenoj fazi rakave bolesti.
e. Kožni testovi kasne preosetljivosti. —
Kožni testovi vec se godinama upotreb-ljavaju za testiranje odazivnosti organizma kod različitih bolesti (npr. Kweim antigen kod sarkoidoze).
Patofiziološki osnov kožnog testa je u torne da pomocu intrakutane ili topične aplikacije antigena pokrenemo reakciju kasne preosetljivosti na mestu aplikacije tog antigena.
Reakcija se razvija tako da se na kraju gde smo aplicirali antigen, sakupe makro-fagi koji fagocitiraju antigen i započinju reakciju zajedno sa imunokompetentnim limfocitima. Kod toga se oslobadjaju neki
LIMFOMI, KOJI PROIZLAZE IZ »T« LIMFOCITA
To limfocit: limfoblastni limfom T — imunoblast: T — imunoblastom
T, i T2 limfocit: akutna limfatična leukoza, hronična limfatična leukoza, mycosis fungoi-des, sindrom Sezary
LIMFOMI, KOJI PROIZLAZE IZ »B« LIMFOCITA
Bi limfocit: »dobro diferenciran« maligni limfom, hronična limfatična leukoza B, leukocit(imunoblast): Burkitt'ov limfom, »slabo diferencirani« maligni limfom B3 limfocit (Celija pamCenja): hronična limfatična leukoza
Bi limfocit: (limfoplazmocitoidna Celija): makroglobulinemija Waldenstrom, bolesti teških lanaca
Bs limfocit (plazmatka): multipli mielom
B-Celije kliničnih centara: limfom centrocita (germinocita), limfom centroblasta (germino-blasta)
B? limfocit: Mb. Hodgkin, angioimunoblastni limfom
Tabela 4. — Podjela malignih limfoma s obzirom na proizlaznu maligno alteriranu Celiju imunskog sistema
Sposobnost imunskih metoda u kliničkoj onkologiji
53
farmakološki faktori, limfokini, u kojih vidu je da se (1) na mestu injiciranog anti-gena sakupi dovoljan broj limfocita i (2) da su ti limfociti upereni prema antigenu. To dogadjanje vrši se oko 3 dana, a posle tog vremena proverimo reakciju. Ako je reakcija pozitivna, na mestu aplikacije možemo opipati čvrstu, iznad nivoa kože podignutu zatvrdlinu koja je posledica lo-kalnog celičnog infiltrata.
U kancerologiji kožnim testovima merimo sposobnost imunskog odazova organizma pomocu reakcije zakašnjele pre-osetljivosti. Kod toga se služimo više vrstama antigena (27) (tabela 5). U načelu poznajemo: antigene, koje organizam vec poznaje, jer je sa njima vec prije nekad došao u dodir (npr. PPD, Varidase) i antigene, sa kojima se organizam po prvi put susrece. Sa njima merimo sposobnost organizma sa kojom se ponovo imunski oda-ziva na antigen. Takav je tipičan antigen DNCB (dinitrohlorobencen). Konačno upo-trebljavamo još specifične antigene — eks-trakte tumorskih autolognih ili alogenih celija odnosno tkiva, kao npr. tkiva ma-lignog melanoma.
1.	Testovi sa pozitivnim antigenima
(»Recall antigens«)
a)	PPD (Protein Purified Derivate)
b)	Varidase
(Streptokinase Streptodornase)
c)	Mumps — antigen
2.	Testovi za »de novo« imunizaciju
a)	DNCB (1-chloro, 2,4 — dimitrobenzene)
b)	PHA (Phytohaernagglutinin)
3.	Testovi sa antigenima, koji su specifični za tumor
a)	Ca colli — antigen (Mol. težina: ca. 175.000)
b)	Ca bronchi — antigen (Mol. težina: 45.000)
c)	Melanoma malignum — antigen
Tabela 5. — Kožni testovi u imunodiagno-stici malignoma
Vrednost kožnih testova je u jednostav-noj izvedbi i u dobroj korelaciji sa pro-gnozom bolesti. Ipak, kod testa, koji je ispao negativno, ne možemo razabrati koji od mehanizama, pokrenutih kod reakcije zakašnjele preosetljivosti, je okvaren. Zato kožni test mjeri celokupnost ove reakcije. U najboljoj korelaciji sa kliničkim tokom bolesti i sa prognozom je kožni test sa upotrebom DNCB-ja (28).
Tehnika sprovodjenja kožnog testa sa DNCB (slika 2): U stražnju stenu pazuha apliciramo 2000 gama DNCB-ja, rastoplje-nog u 0,1 ml acetona, i to na površinu od oko 20 mm u promeru. Kad se aplicirani rastvor osuši, prekrijemo ga flasterom i pustimo ga barem jedan dan. Posle te sen-zibilizacije organizma pričekamo 1:4 daa; u to vreme u područnim žlezdama umno-že se imunokompetentni limfociti. Zatim apliciramo na podlakticu iste ruke 100 gama DNCB-ja, rastopljenog u 0,1 ml acetona, i to na površinu sa promerom od ca. 20 mm. Posle 72 sata otčitamo, kakva je reakcija. Sam eritem još ne znači da je reakcija pozitivna; na mestu aplikacije mora se pojaviti i induracija, a ponekad još vezikulacija ili u jako pozitivnim pri-merima i ulceracija.
Vrednost kožnih testova proverena je proučavanjem različitih lokalizacija, naro-čito kod raka dojke, kod malignog melanoma, kod raka na glavi i na vratu i kod bronhogenog karcinoma (29).
Na našem materijalu, to jest na seriji pacijenata sa bronhogenim karcinomom epidermoidnog tipa, koji još nisu bili le-čeni i koje smo na osnovu TNM klasifikacije podelili u 3 stadije, upotrebili smo 3 kožne testove: PPD, Varidase i DNCB. Rezultati su pokazali da je doba prežive-ca najkraca u primerima gde je svih troje testova bilo negativnih. U toj grupi najviše bolesnika bilo je u trecem stadiju bolesti, dok je u grupi pacijenata koji su pozitivno reagirali na sve tri aplicirane antigene, doba preživeca bila je najduža, a kod vecine pacijenata bolest je bila u prvom stadiju (slika 3). Iz toga proizlazi
54
Plesničar, S.
Kožni test z D NCB*
(j 2000 f v 0,1 ml acetona O) ( aksila)	^^

/
1 1
SENZIBILIZACIJA
14 dni
I
100 f/ 0,1 ml Ipodleht)
V
48-72 ur
RETEST	ČITANJE
*
D i nitroklorobencen
Slika 2. — Shema sprovodjenja kožnog testa sa DNCB (dinitrohlorobencen)
da su kožni testovi zbog jednostavne pri-mene, zbog neopasnosti i zbog dobre pro-gnostičke vrednosti u kancerologiji sve-strano upotrebljivi.
f. Inhibicija migracije leukocita. — Ova
pretraga oslanja se na svojstvo limfocita da u kontaktu sa antigenom izlučuju farmakološki faktor koji inhibira migraciju leukocita iz kapilare. Tehnički zahtevi te pretrage su prilično veliki, pa se zbog te činjenice nije ekstenzivno upotrebljavala. Ipak su dosadašnji rezultati tog testa u dobroj korelaciji sa sposobnošcu organizma da se odazove antigenu pomocu reakcije zakašnjele preosetljivosti (30).
Ustanovilo se da ekstrakti rakavine dojke, a i brojnih drugih tumora uopšte, i tkiva malignih limfoma inhibiraju migra-ciju leukocita.
Ipak, ukoliko nam je poznato, dosada još nije bila izradjena studija o korelaciji izmedju tog testa i kožnih testova, zbog cega danas nije moguce kazati nešto više o torne da li test inhibicije migracije leukocita ima prognosti;;ku vrednost.
g. Karcino-embrionični antigen (CEA).
— Karcino-embrionični antigen je gliko-protein sa molekularnom težinom izmedju 200.000 i 300.000, koji se sintetizira i za-tim izlučuje iz Celije rakavih tkiva ento-
Sposobnost imunskih metoda u kliničkoj onkologiji
55
ŠTEVILO
POZITIVNIH
TESTOV
NUMIEI OF
IIACTIVE
Slll TEST
-
0
UUdin PACIENTI ANEI6IC PATIENTS
PREŽIVETJE PACIENTOV Z BRONHOGENIM KARCINOMOM
SURVIVAL OF PATIENTS WITH BRONCHOGENIC CARCINOMA
20
N »12
1	11
	i:
1	® S
1	S
1	
O
MESECI
.12 24 - MONTHS
ODSTOTEK IN ŠTEVILO PACIENTOV V VSAKI TNM GRUPI
PERCENTAGE ANO NUMBER OF PAT. IN EACH TNM STAGE GROUP

STAOIJ STAGE
I
II	:
111
25 '/. ( 3/12) 25'1. (3/12) ( 6/"l2)]
50 T.
ODSTOTEK PACIENTOV V SKUPINI DO CELOKUPNEGA ŠTEVILA PERCENT OF THE TOTAL NUMBER OF PATIENTS
PREŽIVETJE I mmci) MEAN SURVIVAL (months]


m
PACIENTI Z ENIM POZlT (OhlM TESffiM
PATIENTS WITH ONE. IEACIIVE SKIN TEST
N = 29
STADIJ	
STAGE	
I	45 ./.
11	24%
m :	31
O 12 24 MESECI - MONTHS
m
PACIENTI Z DVEMA POZIT. KOŽNIM* TESTOMA
PATIENTS WITH TWO IEACTIYE SKIN TTšf
N=25
STADIJ STAGE 1 11 m
28 '1, (7 I 25) 40 (10/25) 32 ( . 8 / 25 )
O	12 24
MESECI - MONTHS
0
540
PACIENTI S TREMI POZIT KOŽNIMI TESTI '
PATIENTS WITH THREE REACTIVE SKIN TEST
N = 5
STADIJ
STAGE
□
60 T. 3 / 5~T]
20* ( 1/5 ) 20^./, (1 /5 )
O	12 24
MESECI - MONTHS
Slika 3. — Rezultati ispitivanja imunske reaktivnosti pomoču triju kožnih testa (PPD, Varidase, DNCB) kod serije 71 pacienata sa bronhogenim karcinomom podjeljenih u tri grupe na bazi TNM klasifikacije (Onkološki inštitut Ljubljana)
56
Plesničar, S.
CEA
koncentracija
ZNACENJE
0,0-2,5 ng/ml
2,6—5,0 ng 'ml
5,1—10,00 ngml 10,1—20,0 ng/ml nad 20,0 ngml
kod malignoma
kod nemalignih bolesti
26,8 ° '0 malignoma entoder-malnog izvora i 51,5 O/, malignoma neentodermalnog izvora nema povišene koncentracije CEA
malignom možda prisutan malignom verovatno prisutan
verovatnost prisutnosti malignoma visoka
ukazuje na prisutnost malignoma kolona ili pankreasa ili'i metastaza
23,8 %pacijenata sa nemalig-nim bolestima u toj grupi (ciroza, kolitis, ecc.) i 22,1-' 0 teških pušača
8,1 % pacijenata sa nemalig-nim bolestima i 8,3 01 0 teških pušača u toj grupi
1,6 % svih primera nemalignih bolesti i 0,7 nV. teških pušača u toj grupi
vanredno retko kod benignih bolesti
Tabela 6. — Značenje različitih koncentracija karcino-embrioničkog antigena u serumu kod malignih bolesti
dermalnog izvora (kolon, rektum, bron-hus, pankreas, dojka) (31).
Raspon normalne koncentracije CEA u serumu je od 0—2,5 ng/ml seruma, ali je kod 18 % svih pušača koncentracije CEA povišena do 5,0 ng/ml seruma.
Koncentracija CEA obično je povišena kod karcinoma gastrointestinalnog trakta, bronhusa i dojke. Najčešce nadjemo povišene vrednosti kod karcinoma pankre-
asa (87 % svih slučajeva su pozitivni), kod kolorektalnog karcinoma (72 %), plucnog karcinoma (76 %) i želučanog karcinoma (61 %).
Kod nemalignih bolesti koncentracija je najviše puta povišena kod alkoholne ciroze (u 71 ° n svih testiranih slučajeva) (32). Dakako, najviše vrednosti su kod gore po-menutih karcinomskih lokalizacija. Iz iz-loženog sasvim je očito da je danas kon-
primarni proces	metastaze
(bez obzira na	metastaze) (bez obzira na	primarni proces)
progres	regres	prisutne	otsutne
Koncentracija CEA (ng/ml)
Aritmetička sredina 15,00	2,63	19,04	6,11
Varijacijska širina 1,4—25,00	0,0—25,00	1,7—25,00	0,0—25,00*
: Vrednosti 25 ng/ml ponavljaju se kao najviše zbog toga, jer smo te serume testirali samo sa indirektnom Hansen-ovom metodom koja omogucuje odredjivanje koncentracije CEA samo do te visine.
Tabela 7. — Prikaz koncentracije karcinoembrioničnog antigena (CEA) kod 105 pacijenata sa malignomima gastro-intestinalnog trakta obzirom na prisutnost metastaza ili stanja primarnog procesa (Onkološki inštitut — Ljubljana)
Sposobnost imunskih metoda u kliničkoj onkologiji
57
statOvanje koncentracije CEA kod odre-djenih karcinomskih lokalizacija od velike vrednosti (tabela 6).
Ako posmatramo vremenski tok razvoja malignoma gastrointestinalnog trakta, na-idjemo na pitanje, za koje razdoblje tog razvoja se CEA test može upotrebiti (33). Dosadašnji eksperimenti pokazali su da CEA test nije upotrebljiv kao »screening« metod, ali da je vrlo efikasan kao metod kod »follow-up« bolesnika, to znaci, posle završene primarne terapije malignoma. Zbog toga bi se trebali pridržavati pravila da se test rutinski izvodi prije početka pri-marnog lečenja, a posle lečenja da se prati kretanje tih vrednosti. U primeru uspešne, radikalne terapije vrednosti za CEA padaju na normalu, dok su u primeru ne-radikalnog tretiranja koncentracije CEA u serumu još uvek povišene. U slučaju recidiva ili pojava metastaza koncentracija CEA počinje da se diže 2—3 mjeseca prije nego što se recidiv klinički manifestira. Koncentracije iznad 20 ng/ml ukazuju u vecini primera na metastaze u jetri. Izu-zetni su karcinomi pankreasa sa jetrenih metastaza gde su vrednosti mnogo više od pomenutih. U izveštajima nadjemo da se koncentracija CEA menja i kod kemo- i/ili radioterapije (34), što zavisi od uspešnosti te terapije. Uglavnom danas smatramo da
stalno i postepeno dizanje koncentracije CEA opravdava upotrebu daljih diagno-stičkih postupaka (tabela 7).
U svrhu odredjivanja koncentracije CEA danas se najviše upotrebljava Hansen Z-gel metod* koji primenjujemo i kod nas. Metod je senzibilan, vrednosti za normal-nu populaciju bile su postavljene na os-novu eksperimenata na visokom broju bo-lesnika; metod nije previše skup, ali je izvedba umereno zahtevna, tako da nam je potrebna dobro opremljena laboratorija (35).
h. Test odredjivanja alfa-feto-proteina (AFP). — U klinici se upotrebljava, makar u manjoj mjeri, i test odredjivanja alfa-feto-proteina (AFP). To je fetalni protein koji kod elektroforeze migrira u alfa-1 regiji i čija molekularna težina je 70.000. U fetusu se sintetizira u kesici žutanjka, a kasnije u jetri. Kod odraslog čovjeka iznosi koncentracija AFP od O do 5,0 ng/ml seruma, u serumu trudnica do 100 ng/ml seruma, a u krvi fetusa od 2 do 6 X 106 ng/ml seruma (36, 37) tabela 8).
Koncentracija alfa-feto-proteina poviše-na je kod primarnih hepatoma i iznosi če-sto do 500 ng/ml seruma, dok se kod he-patopatije podiže najviše do 30 ng/ml. Masivni nodularni oblik hepatoma i razdife-
1.	Serumski protein, glikoprotein, migrira u alfa-regiji
2.	Molekularna težina: 70.000
3.	Sedimentacijska konstanta: 5,05
4.	Sadrži 4 % ogljikovih hidrata (heksoze), 14,7 % dušikovih sestavina
5.	Koncentracija kod odrasle osobe: 0—5 ng/ml seruma
Koncentracija u fetalnom serumu: 2—3 x 10' ng'ml seruma, ona je najviša u 10. do 16. mjesecu trudnocc
6.	Raspolovna doba 2 do 3,5 dana
7.	Koncentracija kod trudnice: do 100 ng/ml seruma
8.	Sinteza: fetalna jetra i placenta, vrecica od žutanjka, gastro-intestinalni trakt. U jetri-ma sintentiziraju celije, koje su u okolini ožilja. Tvori se u fetalnim hepatocitima
9.	Biološka funkcija: supstitut za albumin sa funkcijom ozmoze i transporta, veže estro-gene i suradjuje kod procesa metabolizma. Koncentracija AFP-ja sa narastanjem koncentracije albumina pada
Tabela 8. — Karakteristike alfa-feto proteina (AFP)
: F. Hoffman — La Roche et Co. A. G. — CEA »Roche« Test, Basel, Švica
58
Plesničar, S.
rencirani tip hepatoma sintetiZ'J.raju više alfa-feto-proteina nego ostali oblici hepatoma. AFP povišen je i kod embrionalnih tumora ovarija i testisa, npr. kod terato-karcinoma. U poslednje vreme ustanovili su da je AFP često povišen kod nekih primera malignoma želuca i prostate. Kod hepatoma je AFP povišen u 70 % svih slučaja (38, 39).
Najčešce se upotrebljava metod radialne difuzije u agarju, ali je osetljivost tog metoda niska: količina koju možemo kon-statovati je iznad 0,3 ng/100 ml seruma. Takve koncentracije mogu se naci kod hepatoma i kod embrionalnih tumora. Za preciznije odredjivanje moracemo prime-njivati metode radioimunskog tipa, sa ko-jima se može konstatovati koncentracije alfa-feto-proteina u zdravim osobama, gde koncentracija može postici i vrednosti do 25 ng/ml seruma.
Zaključak. — U zaključku moramo reci da je vrednost opisanih testova prije sve-ga statistične prirode, pa zato negativan test kod napredovale bolesti potvrdjuje slabu prognozu, dok je pozitivni test ne odbija.
Ustanovljeno je da sa prognozom još najbolje koreliraju rezultati kožnih testova. Kad bi kao antigen upotrebljavali auto-ili alo- ekstrakte tumorskih tkiva, korela-cija bi bila još bolja. U literaturi možemo naci podatke koji govore o torne da su se i bolesnici sa negativnom reakcijom na nespecifične antigene, još odazivali na tu-morske antigene. Pomocu rezultata kod upotrebe ekstrakta tumora kao antigena, mogli bi da dobijemo još bolji uvid u te-kuci patofiziološki proces. Pitanje, koje je još potrebno da se rešava, je, da li po-stoji i na koji način se izražava eventuel-na korelacija izmedju »in vivo« i »in vitro« testova, npr. kožnih testova sa blastnom transformacijom limfocita (40).
Otvoreno je i pitanje o reproducibilno-sti tih testova jer postoji u primeru kad je test dobro reproducibilan, mogucnost standardizacije tog testa.
Danas se u glavnom razvijaju testovi koji su specifički za tumor i koji poka-zuju funkcionalnu sposobnost onih Celija koje direktno sudjeluju kod procesa zavračanja i početka rasti tumora. Tu mislimo u prvom redu na odredjivanje T-Ce-lija, K-Celija, aktiviranih T-limfocita i ma-krofaga.
Bez obzira na navedene nedostatke, kod nekih lokalizacija veC prije terapije odre-djivamo tako zvani imunski profil boles-nika (41). Taj profil bi trebao da zahvati rezultate kožnih testova, transformacije limfocita, inhibiciju migracije leukocita i kod specifičkih lokalizacija specifički test, kao npr. kod karcinoma entodermalnog izvora odredjivanje karcinoembrionalnog antigena. Ipak, i ta slika ne informira nas dovoljno, i to iz razloga, jer neznamo sa-svim dobro koji tip imunoprofila najvero-dostojnije reflektira sposobnost imunske odazivnosti bolesnika.
Po tom pitanju najviše odgovara test sa karcino-embrionalnim antigenom. Moguč-nost konstatovanja recidiva veC nekoliko meseci prije nego je taj postao klinički evidentan, zaista je veliko dostignuCe; ma-kar i u tom primeru ostaje otvoreno pitanje usmerenosti terapeutske intervencije.
Summary
THE ROLE OF IMMUNOLOGICAL ASSAYS IN CLINICAL ONCOLOGY
The purpose of this paper is to extract and describe from a large number of known immunological tests, those assays which are in use in clinical oncology. Largerly, non specific tests are used far assessment of patient's immune capabilities, and, specific tests, like alpha-feto-protein are used far detection of the malignant disease.
Since in host resistance to the growth of neoplastic cells, T-cells appear to play a major role, the majority of so far used tests are connected with the determination of the number and/or function of limphocytes. Among tests in clinical use the following are mentioned: number of lymphocytes in peripheral blood, transfarmation capability of lymphocytes stimulated by plant anti-
Sposobnost imunskih metoda u kliničkoj onkologiji
59
gens, determination of T- and B-cell concentration in peripheral blood, and finally as the unique »in vivo« test the use of skin reactivity. The host resistance can be assessed by a reevaluation of the lymph node structure. Pathomorphology changes of the lymph nodes can indicate a good reactivity of the immune system, or, on the other side, a breakdown of the immune resistance. Leukocyte migration inhibition test was also found to correlate satisfactorely with the clinical course.
Among the so called specific test two of them, namely, carcino-embryonic-antigen and alpha-feto-protein, are of clinical interest. Carcino-embryonic-antigen is usefull as an indicator of the metabolic activity of tumors arising from entodermal tissue and is used in the follow-up of patients after the primary therapy was accomplished. The determination of alpha-feto-protein in patients with hepatomas and embrional tumors of testes and ovaries has its clinical value, but the usefulness of this test is restricted by the fact that the incidence of these tumors account for only a small percentage of all cases registered yearly.
So far, a small number of known in vitro and in vivo immunological test, have been introduced in clinical practice. This is due to the fact that the majority of tests lack a correlation with the clinical course of the disease, or are not giving pertinent informations concerning the extent of the disease or the immune resistance of the host.
Literatura
1.	Ritts E., Jr., H. B. Neel: An overview of cancer immunology. Mayo Clin. Proc. 49, 118-131, 1974.
2.	Plesnicar S.: Zmogljivost imunske diagnostike pri malignih boleznih. Zdrav. Vestn. 45, 421-425, 1976.
3.	Nakamura R. M.: Immunopathology. Clinical laboratory concepts and methods. Little, Brown and Company, Boston 1974.
4.	Stevenson G. T., D. J. R. Laurence: Report of a workshop on the imune response to solid tumours in man. Int. J. Cancer 16, 887-896, 1975.
5.	Cosimi A. B. et al.: Cellular immune competence of breast cancer patients receiving radiotherapy. Arch. Surg. 107, 531 do 535, 1973.
6.	McCredie J. A., W. R. Inch, R. M. Sutherland: Peripheral blood lymphocytes and breast cancer. Arch. Surg. 107, 162—165, 1973.
7.	Stjernsward J. et al.: Lymphopenia and change in distribution of human B and T lymphocytes in peripheral blood induced by irradiation for mammary carcinoma. Lancet, 2, 1352-1356, 1972.
8.	Rubin A. D.: The human lymphocyte in short-term tissue culture. Postgrad. Med. 41, 244-251, 1967.
9.	Nikolic Lj. et. al.: With reference to a simple kit for short-term lymphocyte culture tested in experimental animals. Boll. 1st. Sieroter. Milan. 55, 5-11, 1976.
10.	Papac R. J.: Lymphocyte transformation in malignant lymphomas. Cancer 26, 279-286, 1970.
11.	Kumar S., G. Taylor: The response to phytohaemagglutinin (PHA) of lymphocytes from cancer patients. J. Clin. Pathol. 26, 476-479, 1973.
12.	Jenkins V. K., M. H. Olson, H. N. Ellis: In vitro methods of assesing lymphocyte transformation in patients undergoing radiotherapy for bronchogenic cancer. Tex. Rep. Biol. Med. 31, 19-28, 1973.
13.	Thomas J. W. et al.: Effect of therapeutic irradiation on lymphocyte transformation in Jung cancer. Cancer 27, 1046—1050, 1971.
14.	Babusikova O., J. Medzihradsky: Survival of human peripheral blood lymphocytes in short-time PHA cultures in cancer patients and healthy controls. Neoplasma 21, 655-658, 1974.
15.	Wybran J., H. H. Fudenberg: Thymus-derived rosette-forming cells in various human disease states: cancer, lymphoma, bacterial and viral infections, and other diseases. J. Clin. Invest. 52, 1026—1032, 1972.
16.	Keller S. E. et al.: Decreased T-Iym-phocytes in patients with mammary cancer. J. Clin. Pathol. 65, 445—449, 1976.
17.	Anthony H. M. et al.: E and EAC resetting lymphocytes in patients with carcinoma of bronchus. II. A sequential study of thirthy patients: effects of BCG. Clin. Exp. Immunol. 20, 41—54, 1975.
18.	Olkowski Z. L., S. A. Wilkins. Jr.: T-lymphocyte levels in the peripheral blood of patients with cancer of the head and neck. Am. J. Surg. 130, 440-444, 1975.
19.	Krooks W. H., T. L. Roszman, A. S. Rogers: Impairment of rosette-forming T lymphocytes in patients with primary intra-cranial tumors. Cancer 37, 1869—1873, 1976.
20.	Benesova E., F. Herrnansky, J. Salko-va: E rosettes in lyrnphoproliferative diseases. Neoplasma 23, 23—30, 1976.
21.	Belpome D. et al.: La nature T ou B des cellules néoplasiques des leucémies lym-phoides. Bull. Cancer 61, 387-402, 1974.
60
22.	Astaldi G., G. C. B. Astaldi: Immuno-logia dei linfociti nella leucemia. Recent. Prog. Med. (Roma) 59, 246-265, 1975.
23.	Berlinger N. T. et al.: Immunologic assessment of regional lymph node histology in relation to survival in head and neck carcinoma. Cancer 37, 697—705, 1976.
24.	Tsakraklides V., O. T. Anastassiades, J. H. Kersey: Prognostic significance of regional lymph node histology in uterine cervical cancer. Cancer 31, 860—868, 1973.
25.	Patt D. J. et al.: Mesocoiic lymph node histology is an important prognostic indicator for patients with carcinoma of the sig-moid colon: an immunomorphologic study. Cancer 35, 1388—1396, 1975.
26.	Ellis R. J. et al.: Immunologic competence of regional lymph nodes in patients with breast cancer. Cancer 35, 655—659, 1975.
27.	Harris J., D. Copeland: Impaired im-munoresponsiveness in tumor patients. Ann. N. Y. Acad. Sci. 230, 56—85, 1974.
28.	Lee Y-T. N. et al.: Delayed cutaneous hypersensitivity and peripheral lymphocyte counts in patients with advanced cancer. Cancer 35, 748—755, 1975.
29.	Herberman R. B.: Cell-mediated immunity to tumor cells. Adv. Cancer Res. 19, 207—263, 1974.
30.	House A. K., S. Wisniewski, T. L. Wood-ings: Immunity in colonic tumor patients after operation: Determination by leukocyte-migration inhibition. Dis. Colon Rectum 18, 100-106, 1975.
31.	Zamcheck N.: Carcinoembryonic antigen. Quantitative variations in circulating levels in benign and malignant digestive tract diseases. Adv. Intern. Med. 19, 413—433, 1974.
32.	Rule A. H. et al.: Circulating carcinoembryonic antigen (CEA): Relationship to clinical status of patients with inflammatory bowel disease. Gut 14, 880—884, 1973.
33.	Kamholz S. L.: Immunologic diagnosis of human digestive tract cancer. Carcinoembryonic antigens. Am. J. Gastroenterol. 59, 233-243, 1973.
34.	Vider M. et al.: Carcinoembryonic antigen (CEA) monitoring in the management of radiotherapeutic and chemotherapeutic patients. Am. J. Roentgenol. 124, 630—635, 1975.
35.	Martin E. W. Jr. et al.: Carcinoembryonic antigen. Clinical and historical aspects. Cancer 37, 62-81, 1976.
36.	Abelev G. I.: Alphafetoprotein as a marker of embryospecific differentiations in normal and tumor tissues. Transplant. Rev. 20, 3—37, 1974.
37.	Martin F., M. S. Martin, C. Bour-geaux: Perspectives in cancer research. Fetal antigens in human digestive tumors. Eur. J. Cancer 12, 165-175, 1976.
38.	Kohn J. et al.: Serum-alpha,-fetopro-tein in patients with testicular tumours. Lancet 2, 433—436, 1976.
39.	Gassner M., P. J. Grob: Alphai -Fetoprotein, Hepatom und Teratom, Schweiz. Med. Wochenschr. 102, 465—471, 1972.
40.	Herberman R. B.: Cellular immunity to human tumor-associated antigens. A review. Isr. J. Med. Sci. 9, 300-307, 1973.
41.	Lurie B. B. et al.: Diagnosis and pro-nosis in colon cancer based on a profile of immune reactivity. J. Natl. Cancer Inst. 54, 319—325, 1975.
Adresa autora: Prof. dr. S. Plesničar, Onkološki inštitut, Vrazov trg 4, 61105 Ljubljana.