Farm Vestn 2013; 64: 341-412; UDK 615 CODEN FMVTA, SLO ISSN 0014-8229 december 2013, letnik 64 f FARMACEVTSKI J VESTNIK št. 5 OSREDNJA TEMA: KRONIČNA LEVKEMIJA V v I / STROKOVNO GLASILO SLOVENSKE FARMACIJE I PHARMACEUTICAL JOURNAL OF SLOVENIA Izdaja: SLOVENSKO FARMACEVTSKO DRUŠTVO, Dunajska 184 A, SI - 1000 Ljubljana * / f / i ' J //// Pot do zdravja f+ai c(,- mjtlnjvi In uefin ¡udie 5fno woi«inop?ii)a za nfodolo K*ovil i ntni-rto ponurBH iroOMM fa h\jmqnc m whl.tinanli o modid/b v SlevMiin OtMujlojo km hHioif varnogl In iar--.-. vui" 5va|& doli ruvo^iomo MiinO iri pcitino froviaroti logtjnom ¡auptJJO JlE^.Ho okorni? in t)6Wkiict •tit fjrugii vdisvihtnf in ^enrvireta mionovi': ZbvoaaiTKi it: ao nam pif™i/*nt por.uja neSfcla Premagala ¡in laht-s i nenerviiiTi lqwpolni-?vnn|fliTi S lotmostnlrTil siDrUvtmi |n »Sipio mbinoirin^ii ta drngifi trtlcli Cn DCmi LU O < z z O cc changed the strategy for treatment of CML and improved the quality of life and survival rates of the patients. Here, we describe the disease and review its diagnostics, methods of treatment and monitoring of the therapy, as well as the role of a pharmacist in the treatment of CML. KEY WORDS: chronic myeloid leukemia, BCR-ABL1, treatment, inhibitor of tyrosine kinase filce), prištevamo v oddelek dozorevanja. Pri odraslem zdravem človeku najdemo v krvi izključno segmentirane in redke paličaste granulocite [3]. Za KML je značilna kromosomska sprememba, pri kateri z dvojno zamenjavo (recipročna translokacija) kromosomskih delov med kromosomoma 9 (9q34.1) in 22 (22q11.2) nastaneta dolg kromosom 9 (9+) in skrajšan kromosom 22, imenovan kromosom Philadelphia (Ph) [4]. Ime je dobil po mestu, kjer so ga v šestdesetih letih prejšnjega stoletja odkrili [5]. Kromosomsko spremembo označimo kot t(9;22)(q34.1 ;q11.2). Posledica te kromosomske spremembe je zlitje dveh genov: gena BCR (s kromosoma 22) in gena ABL1 (s kromosoma 9) na Philadelphia kromosomu (slika 1) [6-8]. Nastali zliti gen BCR-ABL1 nosi zapis za tirozin-kinazo (beljakovino BCR-ABL1), ki je odgovorna za razvoj KML. Tirozin-kinaza vzdržuje stalno aktivacijo signalnih poti v celici, kar pospeši proliferacijo matičnih celic, moti dozorevanje in preprečuje apoptozo (celična smrt). Zaradi tega je KML klonska bolezen in genetsko spremenjene celice preplavijo kostni mozeg. Genetska nestabilnost klona celic lahko vodi do neodzivnosti (rezistenco) na zdravljenje in do napredovanja bolezni, nastanka sekundarne akutne levkemije [9]. ALI STE VEDELI? • Najpomembnejša zgodovinska koraka za poznavanje patogeneze KML in razvoj uspešnega zdravljenja bolezni sta bila odkritje Philadelphia kromosoma leta 1960 in opredelitev kromosomske spremembe kot translokacije med kromosomoma 9 in 22 leta 1973. • Imatinib, zaviralec tirozin-kinaze BCR-ABL1, je prvo tarčno zdravilo, ki so ga razvili na osnovi poznavanja vzroka bolezni na molekulski ravni. • Pri bolnikih s KML je ob pojavu bolezni v telesu lahko prisotnih tisoč milijard levkemičnih celic. Zdravljenje z zaviralcem tirozin-kinaze zmanjša število levkemičnih celic na milijon ali manj celic. To je meja, kjer z najobčutljivejšo metodo t.j. z verižno reakcijo s poli-merazo (PCR) še zaznamo bolezen. KML predstavlja 15-20 % vseh levkemij pri odraslih bolnikih. Letna incidenca pa je 1-2 nova bolnika / 100.000 prebivalcev, po naših podatkih v Sloveniji znaša incidenca 0.75 bolnika na sto tisoč prebivalcev [10, 11]. Povprečna starost ob ugotovitvi bolezni znaša 50 do 60 let, v Sloveniji 57 let, čeprav se lahko pojavi v vseh življenjskih obdobjih, tudi v otroštvu [10, 11]. Prevalenca KML v zahodnem svetu v zadnjih Slika 1: Shematski prikaz kromosomske spremembe recipročne translokacije (dvojna zamenjava) med daljšo roko kromosomoma 9 in 22 (t(9;22)(q34.1;q11.2)). Nastane dolg kromosom 9 (9+) in skrajšan kromosom 22, imenovan kromosom Philadelphia (Ph), na katerem se nahaja zliti gen BCR-ABL1. Figure 1: Shematic diagram of a reciprocal translocation between the long arms of chromosomes 9 and 22 (t(9;22)(q34.1;q11.2)), with the resultant formation of the long chromosome 9 (9+) and shortened chromosome 22, named Philadelphia chromosome (Ph chromosome). ^s a result of the reciprocal translocation, BCR-ABL1 gene is formed on the Ph chromosome. letih konstantno narašča, verjetno zaradi izjemnega učinka novih zdravil, zaviralcev tirozin-kinaze (TKI), na preživetje. Izpostavitev ionizirajočemu sevanju je edini poznan dejavnik tveganja za nastanek bolezni [8]. 3 DIAGNOSTIKA 2 OPIS BOLEZNI Klinična slika KML je posledica pretirane razrasti zrelih in dozorevajočih granulocitov, predvsem nevtrofilnih granulo-citov, pa tudi eozinofilnih in bazofilnih. Ta razrast malignih celic v kostnem mozgu ovira normalno nastajanje in dozorevanje ostalih krvnih celic, npr. eritrocitov, monocitov, me-gakariocitov, iz katerih nastanejo trombociti, ter limfocitov. Zaradi motenega razvoja eritrocitov se pojavi anemija in zaradi motenega nastajanja megakariocitov se pojavijo krvavitve. Poleg tega je okrnjena tudi obramba proti tujkom, saj so maligni granulociti slabše oziroma ne-funkcionalni. Brez zdravljenja KML zavzame svoj naravni potek, ki traja 3-5 let in gre skozi tri različna klinična obdobja: kronično obdobje, pospešeno obdobje in blastno preobrazbo. Za kronično obdobje, v katerem odkrijemo 85 % bolnikov, je značilno, da običajno poteka brez kliničnih znakov in bolnike večinoma odkrijemo slučajno. To obdobje lahko traja 3-5 let, če se ne zdravi, preide v pospešeno obdobje (včasih to obdobje manjka), oziroma v blastno preobrazbo -stanje enako akutni levkemiji. Pospešeno obdobje in bla-stno krizo lahko opredelimo tudi skupaj kot napredovalo fazo bolezni. V tem obdobju zasledimo spremembe v laboratorijskih izvidih torej v krvni sliki z močno povečanim številom levkocitov in prisotnimi malignimi celicami v periferni krvi. Pri bolniku je pogosto prisotna anemija in trom-bocitopenija ter povečana vranica in posledično bolečina pod levim rebrnim lokom. Možne so okužbe. Pri bolniku v napredovali fazi bolezni je potrebno ukrepati takoj in uvesti ustrezno terapijo. Simptomi ob napredovanju KML so običajno sistemski (splošna utrujenost, izguba teka, hujšanje, znojenje), občutek tiščanja v trebuhu zaradi povečanih organov, redkeje krvavitve zaradi motene funkcije trombocitov. Kar 40-50 % bolnikov je ob odkritju bolezni brez težav, bolezen pa ugotovimo ob slučajnem pregledu krvne slike. Pri več kot polovici bolnikov s kliničnim pregledom ugotovimo močno povečano vranico, redkeje jetra [6-8]. Za potrditev diagnoze KML napravimo pregled celotne krvne slike ter izvedemo punkcijo (citološki pregled) in biopsijo (histološki pregled) kostnega mozga. Celice in tkiva pregledamo z mikroskopom. Za citogenetske in moleku-larno-genetske preiskave za dokaz prisotnosti kromosoma Ph in/ali zlitega gena BCR-ABL1 pa uporabimo metode molekularne biologije. S pregledom krvne slike ugotovimo, da se močno razraščajo celice bele vrste (levkociti) vseh razvojnih stopenj, občasno je lahko povečano tudi število trombocitov. V začetku je anemija blaga ali je ni, stopnjuje se, ko KML napreduje. Število levkocitov je večinoma 50 - 200 x 109/L lahko tudi več (pri zdravih ljudeh 4 - 10 x 109/L) [1, 2, 12]. Histološki in citološki pregled kostnega mozga pokaže veliko gostoto celic, povečan je delež nezrelih celic v granu-locitni vrsti (predvsem mielocitov in metamielocitov), več je tudi eozinofilcev in bazofilcev. Eritroblasti (nezreli eritrociti) so maloštevilni. Pri nevtrofilnih granulocitih so opazni znaki motenega dozorevanja jedra, citoplazme in tudi granulacij. V pospešenem obdobju ali blastni preobrazbi pri mikroskopskem pregledu opazimo povečano število levkemičnih blastov v kostnem mozgu, velikokrat tudi v periferni krvi. Pogosteje gre za mieloblastno kot za limfoblastno preobrazbo KML, način zdravljenja je za vsako različen [1, 2]. Prisotnost kromosoma Ph dokažemo s standardno cito-genetsko preiskavo (kariotipizacija) na vzorcu kostnega mozga. Rezultat izrazimo kot delež (%) pozitivnih celic (v metafazi) s kromosomom Ph. Zliti gen BCR-ABL1 doka-žemo na osnovi prisotnosti genskega prepisa, torej specifične mRNA za ta zliti gen. Uporabimo metode za analizo mRNA, in sicer verižno reakcijo s polimerazo in obratnim prepisovanjem (RT-PCR), ali pa za analizo DNA, in sicer fluorescenčno hibridizacijo in situ (FISH) v vzorcu periferne krvi ali kostnega mozga [2, 13]. 3 o i! LU č OT Z < Z N SE OT tč LU O LU _I a LU cc Q_ LU > LU O < z z O cc 4 ZDRAVLJENJE KML IN NOVOSTI V ZDRAVLJENJU Zgodovinski mejniki v zdravljenju KML so potekali skozi zadnjih 100 let. Pravi preskok je povzročilo odkritje kromosoma Ph leta 1960 [5]. S tem odkritjem je postalo proučevanje KML za znanstvenike zelo zanimivo. Če je bilo pred letom 1960 zdravljenje KML predvsem simptomatsko z obsevanjem vranice in še prej z arzenikom, pa je po letu 1960 zdravljenje z busulfanom prvič učinkoviteje kontroliralo število levkocitov. Okoli leta 1970 se je pojavilo zdravljenje s hidroksiureo, ki so jo bolniki boljše prenašali, prvič pa se je tudi preživetje blago podaljšalo. V letih 1975 in kasneje sledijo podatki o alogenični presaditvi kostnega mozga kot možnosti ozdravitve bolnikov s KML. V osemdesetih letih so z interferonom alfa pri nekaterih bolnikih dosegli popolni citogenetski odgovor in dolgo preživetje. V devetdesetih letih so znanstveniki prvič predlagali uporabo zaviralcev tirozin-kinaze (angl. Tyrosine Kinase Inhibitor, TKI) in substanco (GCP57148B) tudi razvili pri Ciba-Geigy. Danes to substanco imenujemo imatinib. Klinične raziskave je pričel Brian Druker. Temu sledi hitra zgodba o uspehu zdravljenja KML s TKI [14]. Tako so danes na voljo že TKI tretje generacije, pri katerih je rezistenca ob mutacijah v genu BCR-ABL1 manjša in zato terapija učinkovita pri širšem krogu bolnikov z BCR-ABL1-pozitivno KML (preglednica 1) [15, 16]. ALI STE VEDELI? • Nekatere genske spremembe, ki jih odkrijemo pri bolnikih z levkemijo ob pojavu bolezni, nam lahko služijo kot specifičen označevalec malignega klona. S kvantitativnim PCR spremljamo raven tega označevalca med in po zdravljenju in tako ocenimo učinkovitost zdravljenja. Pravimo, da določimo minimalno preostalo bolezen. • V Sloveniji imamo Združenje levkemičnih bolnikov in bolnikov z limfomi »L&L«, (limfom.levkemija@gmail.com), ki je bilo ustanovljeno 2007. Združenje je neprofitna organizacija, ki združuje bolnike, njihove sorodnike in prijatelje ter strokovnjake na področju levkemij in limfomov. Slovensko združenje je vključeno v Lymphoma Coalition and Myeloma Euronet in v CML Advocates Network, ki pomaga bolnikom s KML in njihovim svojcem. 4.1 ZDRAVLJENJE BOLNIKOV, KI JIH ODKRIJEMO V KRONIČNEM IN NAPREDOVALEM OBDOBJU BOLEZNI Imatinib 400 mg/dan je bila standardna oblika zdravljenja bolnikov v kroničnem obdobju KML po evropskih priporočilih iz leta 2009 [13]. V letošnjem letu so izšla nova evropska priporočila (2013)[16]. Za bolnike v kroničnem obdobju KML priporočajo enega od treh TKI, ki so dobili dovoljenje evropske (EMA) in ameriške (FDA) agencije za zdravila za to indikacijo. Uporabimo lahko imatinib 400 mg/dan, nilo-tinib 300 mg/12 ur ali dasatinib 100 mg/dan. Ta tri zdravila lahko uporabimo tudi kot prvo, drugo ali naslednje linije zdravljenja KML. Uporabimo lahko standardne, zgoraj opisane odmerke, ali višje, tudi že ustaljene odmerke. Bosu-tjnib 500 mg/dan sta odobrili FDA in EMA za KML-bolnike, ki ne prenašajo predhodnega zdravljenja (intoleranca), ali le-to ni bilo učinkovito (rezistenca). Ponatinib 45 mg/dan je odobrila FDA za intolerantne ali rezistentne bolnike na predhodno zdravljenje. Radotinib ima enako indikacijo in ga imajo le v Koreji. Na ameriškem tržišču je še omacetak-sin, ki ni TKI, temveč spada v skupino homoharingtoninov. Priporočila zdravljenja kroničnega obdobja KML so v preglednici 2. Busulfana ne priporočajo več. Hidroksiureo lahko predpišemo kratek čas pred uvedbo TKI, dokler ne potrdimo diagnoze KML. Skupna uporaba TKI in interferona alfa je možna, vendar poteka le v študijah. Zdravljenje s citostatiki v kroničnem obdobju KML ni priporočljivo, koristno pa je v pospešenem obdobju bolezni in v blastni preobrazbi kot priprava na presaditev krvotvornih matičnih celic (PKMC). Alogenična PKMC (aloPKMC) še vedno ostaja edini način zdravljenja, s katerim lahko pozdravimo bolezen, in je pomembna za bolnike, ki se slabo odzivajo na zdravljenje s TKI. V zadnjih 14 letih odkar zdravimo s TKI (v Sloveniji 11 let), sodi aloPKMC v tretjo ali četrto linijo zdravljenja, ko odpove tudi druga generacija TKI. Priporočila so pripravljena na osnovi učinkovitosti zdravil v dosedanjih kliničnih raziskavah. Izbira zdravila (TKI) pa je odvisna še od prenašanja in varnosti zdravila, značilnosti bolnika, njegove starosti in pridruženih bolezni, ki najpomembneje vplivajo na našo odločitev. CD O C ÇD (D H— CD ÛC O w Œ O C > 2 < CO S 3 cc w 2 00 LO LO (N lu lu O LO (N O LO co (N en LO (N co (N N- (N lo (N (N 00 (N LO (N C § S cc 00 LO co N- (N co (N c § cc cc C .œ ? CE ft C £ CC ž cl .çB "Ö CO (D C © CT) _Q '¡z te _q te w CC Q .ce ce "ö ct ce ¡2 cd Q S CT) _Q "c _Q D W O m .ra ^ £ -.¡j ce SP 10% in/ali Ph+ 36-95% Ni PHO in/ali Ph+ >95% Po 6 mesecih BCR-ABL1 < 1% in/ali Ph+ 0 BCR-ABL1 1-10% in/ali Ph+ 1-35% BCR-ABL1 >10% In/ali Ph+ >35% Po 12 mesecih BCR-ABL1 < 0,1% BCR-ABL1 > 0,1-1% BCR-ABL1 >1% In/ali Ph+ > 0% Potem in kadarkoli BCR-ABL1 < 0,1% Dodatne kromosomske nepravilnosti v Ph- celicah (-7, or 7q-) Izguba PHO Izguba PCitO Potrjena izguba glavnega MolO Mutacije (npr: T315I) Klonske kromosomske nepravilnosti v Ph+ celicah PHO-popolni hematološki odgovor, PCitO- popolni citogenetski odgovor, Glavni MolO-glavni molekularni odgovor odziv bolezni na zdravljenje ni povsem optimalen, zahteva pogostejše kontrole in menjavo zdravila v primeru prehoda v skupino neuspešnega zdravljenja [16]. 4.4 SPREMLJANJE USPEŠNOSTI ZDRAVLJENJA Uspešnost zdravljenja spremljamo s celotno krvno sliko, standardizirano kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (kvantitativni PCR) in/ali s citogenetsko preiskavo ter preiskavo FISH. Odgovor na zdravljenje ocenimo ob treh, šestih in dvanajstih mesecih od začetka zdravljenja s TKI (preglednica 3). Odgovor na zdravljenje ocenjujemo na treh ravneh: na nivoju še prisotnih kliničnih znakov bolezni (t.i. hematološki odgovor), na nivoju še prisotnih malignih celic s kromosomom Ph (celic Ph+) (t.i. citogenetski odgovor) ter na nivoju (še) prisotnega izražanja zlitega gena BCR-ABL1 (t.i. molekularni odgovor). Zdravljenje je uspešno, kadar ni več kliničnih znakov in sprememb v krvni sliki, kar se opredeli kot popolni hematološki odgovor, PHO), ko s citogenetsko preiskavo ne ugotovimo več celic Ph+ v kostnem mozgu (popolni citogenetski odgovor) in ko se število kopij gena BCR-ABL1 zmanjša za več kot 1000-krat od začetne standardne vrednosti, kar opredelimo kot glavni molekularni odgovor (glavni MolO). Nato učinek zdravljenja s TKI spremljamo s standardiziranim kvantitativnim PCR na tri mesece iz vzorca periferne krvi vse do doseženega stabilnega glavnega MolO, nato na tri do šest mesecev. Ob kontrolah rutinsko opravimo tudi pregled krvne slike in drugih biokemičnih parametrov za oceno delovanja ledvic, jeter in statusa železa v telesu. V primeru re-zistence na zdravljenje s TKI, poslabšanja (nepojasnena anemija, levkopenija in trombocitopenija) oz. napredovanja bolezni opravimo še dodatne preiskave, ki pripomorejo k razjasnitvi vzrokov takšnega stanja bolezni. Te preiskave so citogenetska preiskava vzorca kostnega mozga, kjer ugotavljamo, ali so v celicah s kromosomom Ph (Ph+) ali v celicah brez kromosoma Ph (Ph-) prisotne še druge kromosomske spremembe, ugotavljanje pridobljenih mutacij v genu BCR-ABL1, ki lahko vplivajo na učinek zdravljenja s TKI, in citološki in histološki pregled kostnega mozga [16]. LU > LJJ O < z z O cc Najpomembnejša in najobčutljivejša preiskava za spremljanje uspešnosti zdravljenja KML je standardizirani kvantitativni PCR, s katerim določimo raven izražanja gena BCR-ABL1 v levkocitih periferne krvi. Raven izražanja gena BCR-ABL1 predstavlja razmerje med številom kopij prepisa BCR-ABL1 in številom kopij prepisa ABL1, določenih s kvantitativnim PCR. Razmerje izrazimo kot delež, odstotek (%) na mednarodnem desetiškem logaritemskem merilu (International Scale, IS), kjer 10 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,0032 % in 0,001 % ustreza zmanjšanju za 1, 2, 3, 4, 4.5 in 5 logaritmov pod začetno standardno vrednostjo, ki so jo določili v raziskavi IRIS [30, 31]. V tej raziskavi je bila začetna standardna vrednost (100 %) določena kot mediana vrednosti razmerja BCR-ABL1 in referenčnega gena BCR 30 nezdravljenih bolnikov v kroničnem obdobju bolezni. Pomembna ugotovitev te raziskave je, da velika večina bolnikov s KML, zdravljenih z imatinibom, doseže popolni ci-togenetski odgovor in da imajo bolniki, ki dosežejo glavni MolO po 18 mesecih zdravljenja z imatinibom, zelo veliko verjetnost, da bolezen v 5 letih ne bo napredovala [32, 33]. Glavni MolO (0,1 %, angl. Major Molecular Response, MMR) je v raziskavi ustrezal zmanjšanju za 3 desetiške logaritme od začetne standardne vrednosti (100 %). Ti vrednosti sta tudi osnova za mednarodno desetiško logaritemsko merilo [31]. Pravimo, da ima laboratorij standardiziran kvantitativni PCR v realnem času za določanje izražanja ravni gena BCR-ABL1, če lahko predstavi rezultate na mednarodnem merilu. Pri novejših zdravilih, kot sta nilotinib in dasatinib, je delež bolnikov, ki doseže glavni MolO v krajšem času večji. Tudi delež bolnikov z globljim MolO odgovorom kot je glavni MolO, npr. zmanjšanje števila levkemičnih celic za 4 (MolO 4.0) ali 4.5 logaritma (MolO 4.5), je večji. Molekularni odgovor 4.5 je že tista stopnja, pri kateri je v laboratoriju težko izmeriti prepis BCR-ABL1 s kvantitativnim PCR oziroma izračunati, kakšna je občutljivost kvantitativnega PCR, s katero bi lahko zanesljivo določili to stopnjo odgovora [16]. Preiskavo kvantitativni PCR opravimo čimprej, takrat ko zaznamo pomemben porast ravni izražanja BCR-ABL1 (npr. porast ravni za 0,5 do 1,0 logaritem; > 5 X). Porast ne pomeni nujno neuspeha zdravljenja, ampak je razlog potrebno raziskati. Možni vzroki so prekinitev ali opustitev jemanja zdravila ali odpornost proti zdravljenju. Čeprav je vzrokov za pojav odpornosti proti zdravljenju s TKI več, sta klonska evolucija in pojav točkovnih mutacij v kinazni domeni beljakovine BCR-ABL1 najpomembnejša dejavnika, ki sta medsebojno povezana [16, 34]. Drugi vzroki so vpliv na farmakokinetiko zdravila in aktivacija alternativnih signalnih poti, ki vodijo do rasti celic neodvisno od BCR-ABL1 [34]. 4.4.1 Pojav drugih kromosomskih sprememb pri kronični mieloični levkemiji Druge kromosomske spremembe v celicah Ph+ ali Ph-lahko ugotovimo ob pojavu bolezni, praviloma pa ko bolezen napreduje. Pri 80 % bolnikov v blastni krizi ugotovimo dodatne kromosomske spremembe. Fenomen je poznan in opisan kot klonska evolucija. Dodatne kromosomske spremembe, kot so trisomija kromosoma 8, trisomija kromosoma Ph [+der(22)t(9;22)(q34;q11)], izokromosom 17 (i(17)(q10)), trisomija 19 in ider(22)(q10)t(9;22)(q34;q11) znotraj klona celic Ph+ vplivajo na potek bolezni, potek bolezni je manj ugoden. Klonalne kromosomske spremembe v celicah Ph- kostnega mozga se lahko pojavijo v 5 do 10 % bolnikov. Najpomembnejše so spremembe kromosoma 7 (monosomija 7 ali delecija dela kromosoma 7 (del(7q)), ker nakazujejo na tveganje za mielodisplazijo in akutno levkemijo, kar je lahko razlog za odločitev za dolgoročno spremljanje zdravljenja bolnika z biopsijo kostnega mozga. Preiskavo FISH večinoma uporabljamo za potrditev popolnega citogenetskega odgovora, kjer je rezultat negativen, ali za opredelitev ali potrditev dodatne kromosomske spremembe v Ph+ ali v Ph-negativnih celicah [16]. 4.4.2 Pojav mutacij v genu BCR-ABL1 pri kronični mieloični levkemiji Eden izmed vzrokov za pojav odpornosti proti zdravljenju s TKI je pojav točkovnih mutacij v genu BCR-ABL1. Klinično pomembne mutacije določimo s klasičnim sekvenci-ranjem, določitvijo nukleotidnega zaporedja odseka DNA v BCR-ABL1, ki kodira kinazno domeno beljakovine BCR-ABL1 [15, 16]. Med njimi so nekatere, ki močno vplivajo na odzivnost na zdravljenje s TKI. Takšna mutacija je tudi zamenjava treonina za izolevcin na mestu 315 (T315I) ami-nokislinskega zaporedja beljakovine BCR-ABL1, ki povzroči pojav klona, ki je odporen proti imatinibu, niloti-nibu in dasatinibu. Za nilotinib in dasatinib je manj odpornih mutacij kot za imatinib in se med seboj ne pokrivajo, razen mutacije T315I [15, 16, 35]. 4.5 PRENEHANJE ZDRAVLJENJA IN NOSEČNOST Velja priporočilo, da bolniki s KML, ki imajo optimalen odgovor na zdravljenje s TKI, neomejeno dolgo nadaljujejo zdravljenje v standardnem odmerku zdravila. Že nekaj let potekajo kontrolirani poskusi prenehanja zdravljenja pri bolnikih, ki so vzdrževali dlje časa globok molekularni odgovor MolO 4.5 in več. V Evropi je najbolj znana študija STIM (stop imatinib). 40 % bolnikov je kljub prenehanju jemanja zdravila obdržalo globok molekularni odgovor 1-4 leta. Pri drugih pa so s ponovnim zdravljenjem hitro zopet dosegli želeni odgovor. Vendar pa so podatki še preskopi za priporočila o prenehanju jemanja TKI. Druga možnost je in-termitentno zdravljenje z imatinibom. V redkih primerih pri posameznih bolnikih lahko izven študije prenehamo zdravljenje s TKI, če imamo kvalitetno, mesečno laboratorijsko spremljanje bolnika. To je še posebej pomembno za obdobje nosečnosti, saj je zdravljenje s TKI kontraindicirano ob spočetju zarodka in v nosečnosti [13, 16]. 5 NEŽELENI UČINKI PRI ZDRAVLJENJU KRONIČNE MIELOIČNE LEVKEMIJE Z ZAVIRALCI TIROZIN-KINAZE TER UKREPANJE IN VLOGA FARMACEVTA Pri zdravljenju s TKI se lahko pojavijo hematološki in nehe-matološki neželeni učinki (NŽU) (preglednica 4). Slednji so pogostejši in so običajno posledica zavore kostnega mozga. Najbolj izražen hematološki NŽU je nevtropenija, torej stanje z znižanim številom nevtrofilnih granulocitov v krvi. Redkeje se pojavita tudi trombocitopenija (zmanjšanje trombocitov) in anemija (zmanjšanje eritrocitov) v krvi. Ker so nevtrofilni granulociti odgovorni predvsem za fagocitozo tujkov in/ali bakterij, je pri tem NŽU povečana nevarnost okužb. Zato je prvi ukrep usmerjen v preprečevanje oziroma izogibanje okužbam oziroma temu, da povečamo odpornost (vitaminski pripravki, ustrezna prehrana z dovolj sadja in zelenjave, gibanje). Nevtropenijo skušamo odpraviti z dodajanjem rastnih dejavnikov, ki pospešijo razvoj novih nevtrofilcev v kostnem mozgu in omogočijo, da se 3 o i! LU č OT Z < Z N SE OT tč LU O LU _I a LU cc Q_ Preglednica 4: Neželeni učinki zdravljenja z zaviralci tirotin-kinaze (TKI) [36]. Table 4: Adverse events associated with inhibitor of tyrosine kinase (TKI) [36]. Imatinib Nilotinib Dasatinib 400 mg 2 x 400mg 2x70mg Hematološki • Nevtropenija (stopnje 3 ali 4); NG <1 x 109/L 14-35% 28-37% 46-80% • Trombocitopenija (stopnje 3 ali 4); Tr <50 x1 09/L 8-20% 28-37% 41-81% • Anemija (stopnje 3 ali 4) 3-7% 8-23% 18-75% Nehematološki • Slabost • Zvečana lipaza • Zastoj tekočine • Driske • Zvišan krvni sladkor (plevralni, perikardialni • Zastoj tekočine • Zvečan bilirubin izliv, edemi, ascites) (plevralni, • Zvečane transaminaze • Dušenje perikardialni izliv, • Izpuščaj • Driske edemi, ascites) • Srbenje kože • Glavobol • Prebavne težave • Slabost • Utrujenost • Mišični krči • Glavobol • Izpuščaj • Izpuščaji • Bruhanje NG-nevtrofilni granulociti, Tr-trombociti. LU > ÜJ O < z z O cc njihovo število v krvi spet normalizira. Dodajamo granulo- citne rastne dejavnike, za zdravljenje anemij pa epoetine vkombinacijis pripravki železa [36]. Nehematološki NŽU pri zdravljenju s TKI so redkejši in zelo različni. Slabost je pogost nehematološki NŽU in se lahko pojavi pri 50 % bolnikov, zdravljenih z imatinibom. Slabosti lahko močno zmanjšajo sodelovanje bolnikov pri zdravljenju, nekateri celo prenehajo s terapijo, zato je smiselno učinkovito ukrepanje proti slabosti. Slabost je manjša, če bolniki ima-tinib jemljejo s hrano in tekočino, kar pa ni priporočljivo pri terapiji z nilotinibom, saj ga je potrebno jemati na prazen želodec. Za preprečevanje slabosti običajno dodatno predpišemo antiemetike. Zadrževanje vode je NŽU, ki je bolj izražen pri zdravljenju z imatinibom kot nilotinibom. Pojavijo se relativno blagi simptomi, kot npr. otekline vek in gležnjev, vendar so ascites, peritonealni in perikardialni izlivi lahko resni NŽU pri terapiji z dasatinibom in ju zdravimo z diuretiki, včasih pa je potrebno prekiniti terapijo z dasatinibom. Srčno popuščanje pri zdravljenju z imatinibom ni nič pogostejše kot v ostali populaciji, vendar je na to potrebno bolnika opozoriti. Previdnost pa je potrebna pri terapiji z dasatinibom, ker je lahko povezan s podaljšanjem vala QT pri preiskavi EKG. Priporočljivo je, da pred uvedbo terapije preverimo EKG, nivo kalija in magnezija ter se izogibamo zdravilom, ki prav tako podaljšujejo val QT. Okužba z varicelo zoster je redka in se uspešno pozdravi z virustatiki (npr. aciklovir), potrebno pa je spremljanje zaradi nevarnosti ponovitve. Drugi NŽU, ki se lahko pojavijjo pri terapiji s TKI, so driske, prebavne motnje, izpuščaji, glavoboli in mišični krči (pri imatinibu). Farmacevt lahko pomaga pri lajšanju teh NŽU z zdravili ali zdravilnimi učinkovinami oziroma prehranskimi dopolnili. 6 SKLEP neodzivnih na zdravljenje s TKI ali pa bolezen napreduje kljub zdravljenju s TKI. Na razpolaga so še presaditev krvotvornih matičnih celic, če je bolnik v kondiciji oziroma primerne starosti, in druge oblike raziskovalnega zdravljenja v študijah [11]. Resni NŽU zdravljenja s TKI so redki, vendar je pomembno, da jih prepoznamo in ustrezno ukrepamo. Drugi NŽU, ki se lahko pojavijo pri terapiji s TKI, so driske, prebavne motnje, izpuščaji, glavoboli in mišični krči (pri imatinibu). Farmacevt lahko pomaga pri lajšanju teh NŽU z zdravili ali zdravilnimi učinkovinami oziroma prehranskimi dopolnili. 7 3 Z razvojem tarčnih zdravil, zaviralcev tirozin-kinaze, se je strategija zdravljenja KML povsem spremenila, s tem pa tudi kakovost življenja in preživetje bolnikov. Odgovor na zdravljenje nastopi hitro in v večini primerov tudi traja. Bolniki s KML z leti razvijejo stabilne molekularne odgovore, ki jih spremljamo z visoko občutljivim načinom, standardiziranim kvantitativnim PCR. Manjši del bolnikov s KML je 13. LITERATURA Vardiman JW, Melo JV, Baccarani M and Thiele J. Chronic myelogenous leukemia BCR-ABL1 positive. In: Swerdlow SH, Campo E, Harris NL et al. WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 2008: 32-37. Modic M. Mieloproliferativne novotvorbe. In: Košnik M, Mrevlje F, Štajer D, Černelč P, Koželj M. Interna medicina. Littera Picta, d.o.o., Slovensko medicinsko društvo, 2011: 1312-15. Pretnar J, Mlakar U, Černelč P, Andoljšek, D. Krvne celice. In: Košnik M, Mrevlje F, Štajer D, Černelč P, Koželj M. Interna medicina. Littera Picta, d.o.o., Slovensko medicinsko društvo, 2011: 1243-50. 4. Rowley J. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature 1973; 243: 290-293. 5. Nowell PC, Hungerford DA. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia. Science 1960; 142: 1497. 6. Hehlmann R, Hochhaus A, Baccarani M, European LeukemiaNet. Chronic myeloid leukemia. Lancet 2007; 370: 342-50. 7. Sawyers C. Chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 1999; 340: 1330-40. 8. Van Etten RA. Clinical manifestations and diagnosis of chronic myelogenous leukemia. In: UpToDate, version 24.7.2013, 2013. 9. Radich J. Chronic Myeloid Leukemia 2010: Where Are We Now and Where Can We Go? Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010; 2010:122-8. doi: 10.1182/asheducation-2010.1.122. 10. Preložnik Zupan I, Pajic T, Glaser M, Grmek-Zemljic T, Grat M, Fikfak N. Epidemiološki podatki bolnikov s kronično mieloično levkemijo v Sloveniji. Zdrav Vestn 2008;. 77: 51-5. 11. Preložnik Zupan I, Pajič T, Glaser M, et al. Uspešnost zdravljenja KML v Sloveniji v obdobju inhibitorjev tirozinske kinaze. Zdrav Vestn 2012; 81: 56-64. 12. Pretnar J, Žontar D, Podgornik H, Pajič T. Laboratorijske preiskave v klinični hematologiji. In: Košnik M, Mrevlje F, Štajer D, Černelč P, Koželj M. Interna medicina. Littera Picta, d.o.o., Slovensko medicinsko društvo, 2011: 1251-61. B Baccarani M, Cortes J, Pane F, et al. Chronic Myeloid Leukemia: An Update of Concepts and Management Recommendations of European LeukemiaNet. J Clin Oncol 2009; 27: 6041-51. 14. Deininger MW. Chronic Myeloid Leukemia: an historical perspective. Hematology Am Soc Hematol Educ Progra, 2008; 2008:418. doi: 10.1182/asheducation-2008.1.418. 15. Soverini S, Hochhaus A, Nicolini FE, Gruber F, Lange T, Saglio G, et al. BCR-ABL kinase domain mutation analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet. Blood 2011; 118: 1208-15. 16. Baccarani M, Deininger MW, Rosti G, Hochhaus A, et al. European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: 2013. Blood, 2013; 122: 872-84. 17. Hochhaus A, Kreil S, Corbin AS, et al., Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy. Leukemia 2002; 16: 2190-6. 18. Shah NP, Nicoll JM, Nagar B. et al., Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell 2002; 2: 117-25. 19. Soverini S, Colarossi S, Gnani A, et al. Resistance to dasatinib in Philadelphia-positive leukemia patients and the presence or the selection of mutations at residues 315 and 317 in the BCR-ABL kinase domain. Haematologica 2007; 92: 401-4. 20. Talpaz M, Shah N P, Kantarjian H, et al. Dasatinib in imatinib-resistant Philadelphia chromosome-positive leukemias. N Engl J Med 2006; 354: 2531-41. 21. Gruber FX, Ernst T, Porkka K, et al. Dynamics of the emergence of dasatinib and nilotinib resistance in imatinib-resistant CML patients. Leukemia 2011; 26: 172-7. 22. McCormack PL and Keam SJ. Dasatinib: a review of its use in the treatment of chronic myeloid leukaemia and Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukaemia. Drugs 2011; 71: 1771-95. 23. Hughes T, Saglio G, Branford S, et al. Impact of baseline BCR-ABL mutations on response to nilotinib in patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase. J Clin Oncol 2009; 27: 4204-10. 24. Martens UM. Small Molecules in Oncology. In: Schlag PM, Senn, H-J. Recent Results in Cancer Research, SpringerVerlag, 2010. 25. Redaelli S, Mologni L, Rostagno R, et al. Three novel patient-derived BCR/ABL mutants show different sensitivity to second and third generation tyrosine kinase inhibitors. Am J Hematol 2012; 87: E125-8. doi: 10.1002/ajh.23338. Epub 2012 Oct 9. 26. Amsberg GK, Schafhausen P. Bosutinib in the management of chronic myelogenous leukemia. Biologics 2013; 7: 115-22. 27. Cortes JE, Kantarjian H, Brummendorf TH, et al. Safety and efficacy of bosutinib (SKI-606) in chronic phase Philadelphia chromosome-positive chronic myeloid leukemia patients with resistance or intolerance to imatinib. Blood 2011; 118: 456776. 28. Cassuto O, Dufies M, Jacquel A, et al. All tyrosine kinase inhibitor-resistant chronic myelogenous cells are highly sensitive to ponatinib. Oncotarget 2012; 3: 1557-65. 29. Cortes JE, Kantarjian H, Shah NP, et al. Ponatinib in refractory Philadelphia chromosome-positive leukemias. N Engl J Med 2012; 367: 2075-88. 30. Drucker BJ, Guilhot F, O'Brien SG, et al. Five-year follow-up of imatinib therapy for newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic-phase shows sustained responses and high overall survival. N Eng J Med 2006; 355: 2404-17. 31. Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors -recommendations for 'harmonizing' current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006; 108: 28-37. 32. lacobucci I, Saglio G, Rosti G, et al. Achieving a major molecular response at the time of a complete cytogenetic response (CCgR) predicts a better duration of CCgR in imatinib-treated chronic myeloid leukemia patients. Clin Cancer Res 2006; 12: 3037-42. 33. Press RD, Love Z, Tronnes AA, et al. BCR-ABL mRNA levels at and after the time of a complete cytogenetic response (CCR) predict the duration of CCR in imatinib mesylate-treated patients with CML. Blood 2006; 107: 4250-6. 34. Apperley JF. Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukaemia. Lancet Oncol 2007; 8: 1018-29. Pajič T, Lamovšek N, Fink M, Zupan Preložnik I, Černelč P. Analiza mutacij v kinazni domeni proteina BCR-ABL1 pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo in z nezadostnim odgovorom na zdravljenje z zaviralcem tirozinske kinaze. Zdrav Vestn 2012; 81 supl 2: II-174-9. Krstanoska F, Bricman Umek I, Fikfak N, Čeh M, Preložnik Zupan, I. Resni neželeni učinki zdravljenja kronične mieloične levkemije z zaviralci tirozinske kinaze - prikaz primerov in pregled literature. Zdrav Vestn 2011; 80: 413-21. 35 3S 3 O Ž LU č œ z < z N SE OT tč LU O LU _l O LU cc Q_ LU > LU < Z £ < z z O cc KRONIČNA LIMFATIČNA LEVKEMIJA CHRONIC LYMPHOCYTIC LEUKEMIA AVTORJI / AUTHORS: Doc.dr. Helena Podgornik, univ.dipl.inž.kem.inž., spec.med.biok.1 Neda Gržinič, mag.farm.2 Prof.dr. Peter Černelč, dr.med., spec.intern.med.1 1 Univerzitetni klinični center Ljubljana, Oddelek za hematologijo, Zaloška 7, Ljubljana 2 Univerzitetni klinični center Ljubljana, Lekarna, Zaloška 7, Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: helena.podgornik@kclj.si 1 POVZETEK Kronična limfatična levkemija (KLL) je najpogostejša levkemija pri odraslih, ki jo enostavno prepoznamo zaradi limfocitoze v krvni sliki. Za potrditev diagnoze, predvsem pa oceno prognoze potrebujemo zahtevne preiskave od pretočne citometrije do citogene-tike, ki jih izvajajo strokovnjaki v specializiranih laboratorijih. Izsledki teh preiskav so pomembni, ko skupaj z bolnikom izberemo, zdravnik in farmacevt pa vodita, predvsem najbolj zahtevne načine zdravljenja. Večino bolnikov, ki so povprečno starejši od 70 let in imajo več kroničnih bolezni, zdravimo manj intenzivno, skrbno pa moramo upoštevati medsebojne vplive novo predpisanih zdravil za zdravljenje KLL z zdravili, ki jih bolnik že prejema, da zagotovimo uspešno zdravljenje s čim manj neželenimi pojavi. ABSTRACT Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common hematologic malignancy in adults. Absolute lymphocytosis is indicative for diagnosis of CLL which should be further confirmed by sophisticated diagnostic procedures which are performed by experts in specialized laboratories. Confirmation of diagnosis and determination of important prognostic markers is based on findings obtained by flow cytometry and cytogenetics. These findings are of utmost importance when the most demanding treatment is needed. It is chosen in strong collaboration with patient and latter controlled by physician and pharmacist. In majority of cases which are older than 70 years in average and have different comorbidi-ties, treatment is however, less aggressive. Interferences between drugs intended for CLL treatment with other already prescribed drugs should be taken into account to diminish side effects. UVOD Kronična limfatična levkemija (KLL) je bolezen, pri kateri se v venski krvi, kostnem mozgu, limfatičnem tkivu in vranici kopičijo majhni, nefunkcionalni limfociti B, ki morfološko izgledajo zreli (1, 2). Gre za najpogostejšo levkemijo odraslih zahodnega sveta, ki pa navkljub napredku v razumevanju njenega nastanka in razvoju novih zdravil še vedno ostaja za večino bolnikov neozdravljiva. Pojavnost bolezni, ki jo ocenjujejo na 3-5 na 100 000 prebivalcev letno, je odvisna od starosti in spola. Pri moških je 2-krat pogostejša kot pri ženskah. Ker je večina obolelih odkrita naključno, je pojavnost na splošno podcenjena. Nanjo močno vpliva tudi geografski dejavnik, saj je bolezen npr. znatno redkejša v Aziji (3). KLL se pojavlja v družinah. Sorodniki bolnikov s KLL v prvem kolenu imajo trikrat večjo verjetnost kot splošna populacija, da bodo zboleli za KLL. Med sorodniki bolnikov je pogostejša tudi monoklonska B-celična limfocitoza (MBL). Gre za stanje, ko pri osebi najdemo v krvi manjši klon limfocitov B z imunofenotipskimi značilnostmi celic B, kot pri KLL. MBL je predmet poglobljenih raziskav, ker njena vloga pri razvoju KLL ni jasna, z uporabo vse bolj občutljivih diagnostičnih postopkov pa jo srečujemo vedno pogosteje (3). Vzrokov za nastanek KLL ne poznamo. Raziskave so izključile povezavo z izpostavljenostjo sevanjem, virusnim okužbam in različnim kemikalijam. Izjema so nekateri herbicidi, ki so povzročili bolezen pri kmetijskih delavcih v ZDA (3, 4). Zanesljivo pa vemo, da začne pojavnost KLL po petdesetem letu starosti strmo naraščati (5). Razlogov za to je več. Zmanjšuje se tvorba limfocitov B, medtem ko se napake signalizacije B-celičnega receptorja množijo. Splošno pa ima na nastanek raka vpliv kopičenje reaktivnih ki-sikovih spojin, ki povzročajo genomsko nestabilnost, zmanjšanje T-celične imunosti in posledično neučinkovito izločanje malignih celic B, ter krajšanje telomer (6, 7). Povprečna starost ob odkritju je pri moških 70 let, pri ženskah 74 let, medtem ko je povprečna starost ob smrti pri moških 74 let, pri ženskah pa 81 let (3). ALI STE VEDELI? • Levkemija je skupni izraz za maligne novotvorbe he-matopoetskega tkiva, pri katerih najdemo levkemi-čne celice v krvi. Limfomi pa so skupina malignih novotvorb limfocitov B ali T. Glede na vrsto celic je torej KLL maligni limfom, ker pa se limfomske celice izplavljajo v kri, govorimo o levkemiji. • KLL je najpogostejša levkemija odraslih zahodnega sveta. Največji dejavnik tveganja za KLL je poleg starosti še spol. Vzroka, zakaj je KLL pogostejša pri moških kot pri ženskah, ne poznamo. KLL so dolgo razumeli kot homogeno bolezen, v zadnjem obdobju pa so raziskave pokazale, da gre za morfološko, imunološko in genetsko heterogeno bolezen, kar se odraža tako na njenem poteku kot pri odzivu na zdravljenje (8). Klinično je lahko KLL dolgo stabilna s pričakovano življenjsko dobo, ki je skoraj primerljiva z normalno, do hitro napredujoče, ki vodi v zgodnjo smrt (3). Tretjina bolnikov preživi dlje od 20 let in sploh ne potrebuje zdravljenja. Pri 3-10% bolnikov bolezen hitro napreduje (Richterjev sindrom), lahko pa preide v prolimfocitno levkemijo. Bolezen lahko spremljajo zapleti, kot so avtoimunska hemolitična anemija, av-toimunska trombocitopenija in okužbe. 2 ZNAČILNOSTI BOLEZNI Klon limfocitov B se pri KLL razrašča, tako da pogosto predstavljajo tudi do 99% vseh mononuklearnih celic v venski krvi. S tem povzročijo zmanjšanje števila normalnih celic imunskega odziva in so neposreden vzrok imunske pomanjkljivosti pri bolnikih s KLL. V nasprotju z večino malignih celic, se pri KLL deli le 2-5% limfocitov B, medtem ko večina celic miruje v G0 fazi celičnega cikla. Vendar pa imajo te celice znatno daljšo življenjsko dobo (nekaj mesecev) v primerjavi z normalnimi limfociti B (nekaj dni). Delno gre to pripisati rastnim dejavnikom mikrookolja, v večji meri pa zmanjšani hitrosti apoptoze, ki jo povzroči tako zmanjšana aktivnost pro-apoptotičnih kot povečana aktivnost anti-apoptotičnih dejavnikov. Spremenjeno ravnovesje proin anti-apoptotičnih dejavnikov, ki je zdaj tudi osrednja tema raziskav novih terapevtskih učinkovin, je posledica nenormalnih genov in proteinov (9). Doslej niso določili še nobene genetske preureditve, ki bi bila neposredno odgovorna za nastanek KLL, pač pa so zanjo značilne številne različne preureditve. Intersticijska delecija na dolgem kraku kromosoma 13 (40-60% bolnikov) ima za posledico izgubo področja, ki ne kodira zapisa za protein, pač pa za nekatere mikroRNA (miR-15a, miR-16-1), ki preko zaviranja tarčnih genov delujejo kot genski regulatorji. Poveča se izražanje genov za proteina Bcl2 in TCL1. Prvi kot zaviralec apoptoze, drugi pa preko aktivacije proteina NFkB in inaktivacije proteina BAD, sta močna dejavnika podaljšanega preživetja (10). Mehanizem patoge-neze pri drugih pogostejših kromosomskih spremembah je soroden, njihova stična točka pa protein p53. Delecija na kromosomu 17 (okrog 10% nezdravljenih bolnikov) vodi v izgubo tumor supresorja TP53, posledično pa proteina p53, ki je glavni mediator apoptoze pri okvari DNA, in ključni dejavnik zagotavljanja genomske stabilnosti. Gen ATM na kromosomu 11 (11q22) nosi zapis za kinazo, ki fosfori-lira p53, njegova izguba (10% bolnikov) pa tako vnovič zmanjša apoptozo. Pri trisomiji kromosoma 12 (10-20% bolnikov) je ključna podvojitev gena MDM2, ki pospešuje razgradnjo p53 v proteasomih, s čimer negativno uravnava njegovo aktivnost (9). 3 o i! LU č OT Z < Z N SE OT tč LU O LU a LU cc Q_ LU > LU < Z £ < z z O cc Pri večini bolnikov s KLL so dokazali spremenjeno aktivnost signalizacijskih proteinov. Medtem ko je zvečana aktivnost anti-apoptotične PI3K (fosfoinotid 3-kinaza), je domala nefunkcionalna pro-apoptotična protein kinaza R. Z recep-torjem povezana tirozin kinaza ZAP-70, ki se praviloma izraža na limfocitih B le pri KLL, podaljša njihovo preživetje tako, da okrepi signalizacijo preko površinskih IgM (9, 11). 4 NAPOVEDNI DEJAVNIKI PRI KLL Določitev ustreznih napovednih dejavnikov ni pomembna le za oceno napredovanja bolezni, pač pa je ključna za izbiro ustreznega zdravljenja glede na tveganje posameznega bolnika in biološko ozadje njegove bolezni. Eden od glavnih izzivov pri KLL je določitev optimalnega časa in načina prvega zdravljenja. Zato je opredelitev nekaterih na-povednih dejavnikov pomembna ob postavitvi diagnoze, drugih pa pred začetkom določenega zdravljenja. Potek bolezni se pri bolnikih znotraj posamezne skupine klinično razvojne stopnje Rai-jeve ali Binet-ove razvrstitve, temelječe na povečanih obodnih bezgavkah, vranici in jetrih ter prisotnosti anemije ali trombocitopenije, lahko znatno razlikuje (12). Ti dve lestvici ob prvem pregledu bolnika le orientacijsko napovedujeta potek bolezni, za natančnejšo oceno poteka, predvsem pa izbire zdravljenja, so se v zadnjem desetletju uveljavili številni napovedni dejavniki temelječi na genetskih, fenotipskih in molekularnih značilnostih levkemičnega klona (13). Podvojitveni čas limfocitov je preprost parameter, ki dobro odraža kinetiko napredovanja bolezni. Krajši od enega leta označuje hitrejši potek bolezni in krajše preživetje (14). Serumska timidin kinaza, p2-mikroglobulin, in topni CD23 so prav tako povezani s tumorskim bremenom in preživetjem. Med celičnimi označevalci sta napovedno pomembna prisotnost CD38 in ZAP-70. Napovedni dejavnik, v katerega je bilo usmerjeno zelo veliko raziskav, je mutacijski status gena za težko verigo imunoglobulinov IgVH. Izražanje ZAP-70 je povezano z nemutiranim statusom IgVH pa tudi s preureditvami gena TP53. Vsak od teh kazalcev napoveduje neugoden potek bolezni, njihova uporaba pa je še vedno bolj raziskovalna kot rutinska (12). Zanesljivo največjo težo in najširšo rutinsko uporabo imajo citogenetske preureditve. Napovedno najugodnejša je osamljena najdba del(13), pri kateri je celokupno preživetje 133 mesecev, medtem ko je pri bolnikih z normalnim ka-riotipom 111 mesecev. Napovedno vmesna je tako kot normalni kariotip trisomija kromosoma 12 (114 mesecev), medtem ko sta drugi dve preureditvi, ki ju rutinsko tudi v Sloveniji določamo pri vseh bolnikih s KLL, napovedno neugodni. Pri izgubi gena ATM (del(11q)) je srednje preživetje 79 mesecev, pri izgubi gena TP53 (del(17p)) pa le 32 mesecev (1). Delecija gena ATM je značilna za t.i. atipično KLL in za bolnike z izrazito limfadenopatijo. Navadno se odzivajo na zdravljenje, vendar se bolezen praviloma hitro ponovi. Bolniki z del(17p) imajo vedno hiter potek bolezni in so neodzivni na zdravljenje s fludarabinom. Določitev del(17p) pred zdravljenjem je zato ključna zaradi specifičnega zdravljenja z nekaterimi monoklonskimi protitelesi (13). V zadnjem obdobju so raziskave z uporabo sekveniranja naslednje generacije prinesle novo znanje o genetski kompleksnosti in heterogenosti KLL. Izpostaviti gre napovedno zelo neugodne mutacije gena TP53 brez istočasne izgube homolognega alela (okrog 5% bolnikov) (15). Kot ponavljajoče so se pokazale mutacije, ki vplivajo na aktivacijo signalizacije preko NOTCH in napake izrezovalno-povezovalnega kompleksa (spliceosome) (16). Pri bolnikih s KLL je spremenjen tudi vzorec metilacije DNA, ki je praviloma hipometilirana. Gre torej za možne nove napovedne dejavnike oziroma potencialne tarče zdravljenja katerih na-povedni pomen bo potrebno še potrditi. 5 UGOTAVLJANJE BOLEZNI Prvi pogoj za postavitev diagnoze pri KLL je številčna koncentracija limfocitov B v venski krvi večja od 5 x 109/L. Prav zato je KLL edina podvrsta ne-Hodgkinovega limfoma, pri kateri je venska kri ustrezen vzorec za vse preiskave, ki jih opravimo ob postavitvi diagnoze in histopatološki pregled ni nujen (17). Zdravnik se lahko odloči za punkcijo kostnega mozga, da oceni stopnjo infiltracije z limfomskimi celicami. V tem primeru diagnostične preiskave opravimo tudi na vzorcu kostnega mozga. Krvna slika je preiskava, ki navadno pripelje bolnika v obravnavo k hematologu. Ob postavitvi diagnoze je število limfocitov večje od 10 x 109/L, pogosto presega tudi 100 x 109/L. V diferencialni krvni sliki najdemo morfološko »normalne« zrele limfocite, ki pa so mehansko občutljivi, zato pri pripravi krvnega razmaza razpadejo v t.i. Gumprechtove sence. Zaradi infiltracije kostnega mozga z limfociti B imajo bolniki ob odkritju bolezni lahko anemijo, ob napredovanju bolezni pa tudi trombocitopenijo. Imunska trombocitope-nija se lahko razvije kadarkoli med potekom bolezni. Ker je določitev številčne koncentracije limfocitov B ključna za postavitev diagnoze, je pretočna citometrija izhodiščna diagnostična preiskava. Pri KLL imajo limfociti B značilen imunofenotip, po katerem se razlikujejo od drugih limfomov B, in sicer CD5+/CD19+/CD20šibko/CD23+/FMC7- (3). Diferencialno diagnostično imunofenotipizacija loči KLL od limfoma plaščnih celic ali spleničnega marginalno-celi-čnega limfoma. Če pri preiskovancu najdemo klon limfocitov B z značilnim imunofenotipom za KLL, njihova koncentracija pa je manjša od 5 x 109/L, govorimo o MBL. S pretočno citometrijo določamo tudi izražanje proteina ZAP-70, ki je tehnično zahtevno in zato zaenkrat tudi še ni standardizirano (8). Prisotnost citogenetskih preureditev je ena od značilnosti KLL, vrsta in število teh preureditev pa je neodvisni napo-vedni dejavnik poteka bolezni (1). Čeprav so apoptotične poti pri KLL nenormalne, pa niso okvarjene, zato limfociti B pri KLL zelo hitro odmrejo, če jih gojimo in vitro (9). Ta njihova lastnost, po kateri se znatno razlikujejo od večine malignih celic, otežuje standardno citogenetsko preiskavo, ki temelji na analizi metafaznih kromosomov deleče se celice. Odkritje, da dodatek CpG-oligodeoksinukleotida in ci-tokina IL-2 stimulira limfocite B k delitvi in vitro, je botroval temu, da se je delež bolnikov, kjer najdemo kromosomske Slika 1: Pojavnost napovedno pomembnih kromosomskih preureditev pri slovenskih bolnikih s KLL (N=444). Figure 1: Frequency of recurrent chromosomal aberrations in Slovenian CLL patients (N=444). preureditve s proganjem kromosomov, približal tistemu, kjer jih odkrijemo z molekularno citogenetsko preiskavo fluorescenčno in situ hibridizacijo FISH (18). Z uporabo pa-nelov ustreznih DNA-sond, s katerimi določamo prisotnost delecij na dolgem kraku kromosomov 11 ter 13 ter na kratkem kraku kromosoma 17, ter trisomije 12 (del(11q), del(13q), del(17p), +12) odkrijemo kromosomske spremembe pri več kot 80 % bolnikov (19). Slika 1 prikazuje pogostnost teh preureditev pri slovenskih bolnikih s KLL, ki je zelo primerljiva z objavami v literaturi. ALI STE VEDELI? • Povišana telesna temperatura, nočno potenje in nenamerna izguba telesne teže so sicer nespecifični znaki, so pa zelo značilni za bolnike z limfomi, in jih imenujemo simptomi B. Večina bolnikov s KLL jih spočetka sicer nima, zato jo pogosto odkrijemo naključno. Sčasoma pa se poleg teh lahko pojavijo še neboleče povečane bezgavke, utrujenost, izguba apetita ter pogostejše okužbe. • Večina bolnikov ob postavitvi diagnoze KLL zdravljenja ne potrebuje, 60 % bolnikov pa ga tudi nikoli ne bo. 6 ZDRAVLJENJE Zelo veliko bolnikov ima ob ugotovitvi KLL malo razširjeno bolezen in nima težav. Teh bolnikov ne zdravimo, ampak jih skrbno spremljamo v hematološki ambulanti in pri izbranem družinskem zdravniku (20). V primeru napredovanja bolezni in pojava težav napravimo dodatne citogenetske preiskave za oceno prognoze in izbire najustreznejšega zdravljenja. Izbira zdravljenja je odvisna od starosti bolnika, njegove fizične zmogljivosti, stopnje razširjenosti bolezni, pridruženih kroničnih bolezni ter opredelitve citogenetskih nepravilnosti. Bolnikom mlajšim od 60 let brez pridruženih bolezni in z neugodnimi citogenetskimi nepravilnostmi (del(17p), del(11q)), ki napovedujejo hiter potek bolezni, predlagamo program za možnost ozdravitve s kombinacijo intenzivnega zdravljenja s citostatiki in monoklonskim protitelesom ter alogensko presaditvijo krvotvornih matičnih celic (APKMC), ki je edini možen način ozdravitve bolezni (20, 21, 22). 3 o i! LU č OT Z < Z N SE OT tč LU O LU _I a LU cc Q_ LU > LU _I < Z £ < z z O cc Citogenetsko ugodne bolnike intenzivno zdravimo s kombinacijo zdravil R-FC (rituksimab, fludarabin, ciklofosfamid), citogenetsko neugodne pa z visokimi odmerki glukokorti-kidov in alemtuzumabom ali ofatumumabom s ciljem doseči popolno remisijo bolezni pred APKMC. Starejše bolnike, ki niso kandidati za intenzivno zdravljenje iz več razlogov, pa zdravimo s kombinacijami rituksimab-klorambucil, rituksimab-fludarabin ali rituksimab-bendamu-stin. Cilj zdravljenja je zmanjšati tumorsko maso in odpraviti težave. Najpogostejši načini zdravljenja so navedeni v Preglednici 1. 6.1 ALKILIRAJOČI CITOSTATIKI Eno prvih zdravil, ki se je začelo uporabljati za zdravljenje KLL, je klorambucil. Še vedno se večinoma uporablja le za zdravljenje starejših bolnikov s pridruženimi kroničnimi boleznimi. Učinkovitost zdravljenja povečamo z dodatkom rituksimaba. Pri bolnikih s hudimi anemijami in/ali trombo-citopenijami zdravljenju s klorambucilom dodamo še me-tilprednizolon (20, 21, 24). Citotoksično delovanje zdravila ciklofosfamid temelji na delovanju njegovih alkilirajočih presnovkov na DNA. Zdravilo ima tudi močno imunosupresivno delovanje. Bendamustin je alkilirajoči citostatik, ki se uporablja pri bolnikih, kjer fludarabin ni učinkovit. Neposredno pred ben-damustinom je zaradi preobčutljivostnih reakcij potrebno dati premedikacijo z analgetikom/antipiretikom, glukokor-tikosteroidom in antihistaminikom. Ciklofosfamid je visoko do srednje, bendamustin pa srednje emetogen citostatik, zato se ob njuni uporabi priporoča uporaba antiemetika (23, 24). 6.2 NUKLEOTIDNI ANALOGI Pri zdravljenju KLL se iz te skupine večinoma uporablja le fludarabin, ki je analog adenozina in deluje tako, da zavira sintezo DNA preko zaviranja encima RNA-polimeraza II na zmanjšano sintezo beljakovin. (23, 24). 6.3 GLUKOKORTIKOSTEROIDI Zdravilo metilprednizolon se lahko uporablja kot samostojno zdravilo v velikih odmerkih pri zdravljenju odporne oblike KLL ali v nizkih odmerkih v kombinaciji z nekaterimi citostatiki (20, 22). 6.4. MONOKLONSKA PROTITELESA Zdravilo alemtuzumab je humanizirano monoklonsko protitelo, ki se veže na antigen CD52, ki je izražen predvsem na površini normalnih in malignih limfocitov B in T v krvi in povzroči lizo teh celic. Z njim zdravimo bolnike, kjer zdravljenje s fludarabinom ni učinkovito ter bolnike z del(17p), katerih preživetje je najkrajše. Zdravljenje z alemtuzuma-bom zaradi hudih neželenih pojavov in pogostih okužb potrebuje skrben nadzor in dodatno preventivno dajanje protimikrobnih zdravil (23, 24). Rituksimab je himerno mišje/humano monoklonsko protitelo, ki se specifično veže na transmembranski antigen CD20, ki se nahaja tako na nekaterih običajnih limfocitih, kot na malignih celicah B. Vezava rituksimaba na antigen CD20 na limfocitih B povzroči celično apoptozo (23, 24). Ofatumumab je humano monoklonsko protitelo, ki se specifično veže na poseben epitop, ki zajema tako male kot velike zunajcelične zanke molekule CD20 na običajnih limfocitih B ter malignih celicah B. Vezava ofatumumaba povzroči od komplementa odvisno citotoksičnost in posledično lizo tumorskih celic ter od protiteles odvisno ci-totoksičnost na celicah, ki izražajo CD20. Novejše raziskave kažejo, da deluje tudi na celice odporne na rituksimab (23, 24). 6.5 PRESADITEV KRVOTVORNIH MATIČNIH CELIC Alogenična PKMC, ki velja za verjetno edino možnost ozdravitve, se uporablja večinoma le pri mlajših bolnikih z izrazito neugodnimi napovednimi dejavniki (del(17p)) ali neodzivnostjo na večino zdravil za KLL, saj je smrtnost zaradi neželenih učinkov zdravljenja precejšnja. Nemielobla-tivna alogenična PKMC, pri kateri se uporabljajo nižji odmerki citostatikov, je manj toksična in zato primerna tudi za malo starejše bolnike. Z avtologno PKMC lahko povečamo delež uspešnosti zdravljenja in podaljšamo čas do ponovnega nastopa težav, vendar klinične raziskave do sedaj niso potrdile prednosti avtologne PKMC pred standardnim zdravljenjem (20, 22). 6.6 NOVOSTI PRI ZDRAVLJENJU KLL Za zdravljenje KLL še vedno potekajo številne klinične raziskave z uporabo novih, predvsem tarčnih zdravil. Neka- Preglednica 1: Nekatere najpogosteje uporabljene sheme za zdravljenje kronične limfatične levkemije (20, 22, 23). Table 1: Some of the most commonly used schemes for the treatment of chronic lymphocytic leukemia (20, 22, 23). Zdravljenje Način dajanja Odmerek zdravila Število krogov zdravljenja Interval med zaporednimi krogi zdravljenja klorambucil (metilprednizolon) p.o. 10 mg/m2; 1.-5.dan (32 mg m2;1.-5.dan) 4-8 28 dni fludarabin p.o. 40 mg/m2 1.-5.dan 4-8 28 dni fludarabin i.v. 25 mg/m2 1.-5.dan 4-8 28 dni fludarabin ciklofosfamid p.o. 40 mg/m2 150 mg/m 1.-5.dan 2; 1.-5.dan 4-8 28 dni fludarabin ciklofosfamid i.v. 25 mg/m2; 1.-3.dan 250 mg/m2; 1.-3.dan 4-8 28 dni fludarabin ciklofosfamid rituksimab i.v. 25 mg/m2; 1.-3.dan 250 mg/m2; 1.-3.dan 375-500 mg/m2; 1.dan 4-8 28 dni metilprednizolon i.v. 1000-1500 mg/dan, 1.-3.dan 3-4 21 dni alemtuzumab s.c. 30 mg; trikrat tedensko < 36 2-3 dni bendamustin i.v. 100 mg/m2; 1., 2.dan 6 28 dni ofatumumab i.v. 300 mg/dan 2000 mg/dan 1 2-12 7 dni (1.-8. krog) 28 dni (9.-12. krog) 3 O i! LU OT Z < Z N SE OT tč LU O LU _I a LU cc Q_ tera izmed njih so humano monoklonsko protitelo obinu-tuzumab (GA101) ter selektivna zaviralca kinaz, idelalisib (GS-1101) in ibrutinib. Zdravila preizkušajo kot samostojno zdravljenje ter v različnih kombinacijah z drugimi zdravili za zdravljenje KLL. Rezultati so zelo vzpodbudni, vendar zdravila še niso na voljo za redno uporabo. 7 VLOGA FARMACEVTA PRI ZDRAVLJENJU KLL morajo biti pozorni na njihove znake. Pozorni morajo biti tudi na znake krvavitve, ki so lahko posledica trombocito-penije (krvavitev v kožo in dlesni, iz telesnih votlin). Če bolnik toži, da se počuti zelo slaboten, ga napotimo k zdravniku, saj je pri bolniku lahko prišlo do anemije. Farmacevt v javni lekarni lahko tudi preveri ustreznost odmerjanja peroralnih zdravil ter možne medsebojne vplive med zdravili. V bolnišnični lekarni se farmacevti vključujemo v zdravljenje KLL na več ravneh. Za bolnike pripravimo individualizirane pripravke s parenteralno citostatično učinkovino ali mono-klonskim protitelesom, preverimo ustreznost odmerjanja teh zdravil in pregledamo skladnost teh zdravil z zdravili, ki jih bolnik prejema zaradi zdravljenja drugih bolezni (26). Glavna naloga farmacevtov v javnih lekarnah je predvsem ustrezno svetovanje bolnikom o pravilnem rokovanju z nevarnimi učinkovinami, med katere sodijo citostatiki. Bolnika je potrebno opozoriti tudi na možnost pojava neželenih učinkov zdravljenja s citostatiki in biološkimi zdravili. Največja težava so predvsem okužbe zaradi nevtropenije, zato 8 NEŽELENI UČINKI IN MEDSEBOJNI VPLIVI ZDRAVIL 8.1 NEŽELENI UČINKI CITOSTATIČNIH ZDRAVIL Neželeni učinki pri zdravljenju s citostatiki so posledica ci-totoksičnega delovanja na maligne in tudi zdrave hitro deleče se celice. Najpogostejši neželeni učinki citostatikov, ki se uporabljajo za zdravljenje KLL, so mielosupresija, težave s kožo ter prebavili, sindrom razpada tumorskih celic, motnje reprodukcije, kronična utrujenost ter nastanek sekun- LU > LU _I < Z £ < z z O cc darnih malignih obolenj. Neželeni učinki, ki se odražajo na prebavilih so slabost in bruhanje, izguba apetita, mukozitis, driska ter zaprtje. Posledica zaviralnega delovanje citosta-tikov na kostni mozeg so okvare v dozorevanju krvnih celic, kar lahko povzroči anemijo, trombocitopenijo in nevtrope-nijo, ki se navadno pojavi med 7. in 14. dnem po začetku zdravljenja. Zaradi zavrtega imunskega sistema so pogoste tudi hude in številne okužbe (bakterijske, virusne, glivi-čne).Neželeni učinki citostatikov na kožo so zelo različni in sicer od izpuščajev, alopecije, do zelo resnih, kot sta Ste-vens-Johnsonov sindrom in toksična epidermalna nekro-liza. Večina citostatičnih učinkovin ima mutageno, kancerogeno, genotoksično in teratogeno delovanje, zato je z zdravili potrebno rokovati previdno ter v času zdravljenja in nekaj mesecev po njem uporabljati učinkovito zaščito pred zanositvijo. Matere, ki prejemajo citostatična zdravila, ne smejo dojiti (21, 23, 25, 27). Poleg splošnih neželenih učinkov se pri zdravljenju s cito-statičnimi zdravili za zdravljenje KLL kažejo še nekateri drugi neželeni učinki. Klorambucil lahko povzroča tudi okvare jeter, bolezni živčevja, sterilni cistitis, intersticijsko pljučno fibrozo ter pljučnico. Pri zdravljenju s ciklofosfa-midom so pogoste okvare sečil, preobčutljivostne reakcije, povišana telesna temperatura, jetrne okvare, konvulzije, bolezni dihal, zadrževanje tekočin v telesu, srčno-žilni zapleti ter težave z očmi. Neželeni učinki zdravila bendamu-stin so lahko tudi preobčutljivostne reakcije (tudi resne anafilaktične), srčno-žilni zapleti, bolečine v mišicah, mrzlica, povišana telesna temperatura in zadrževanje tekočine v telesu. Med zdravljenjem s fludarabinom lahko pride do življenjsko pomembnih avtoimunskih pojavov in sicer do avtoimunske hemolitične anemije, avtoimunske trombocitopenije in trombocitopenične purpure. Ostali pogosti neželeni učinki, ki se pojavljajo pri zdravljenju s fluda-rabinom so še kašelj, edemi ter okvare nevrološkega sistema (periferna nevropatija, encefalopatija) (23, 25, 27). 8.2 NEŽELENI UČINKI MONOKLONSKIH PROTITELES Najpogostejši neželeni učinki, ki se lahko pojavijo med zdravljenjem z monoklonskimi protitelesi so infuzijske reakcije, ki se kažejo s hipotenzijo, hipertenzijo, mrzlico, tahikardijo, kašljem, zvišano telesno temperaturo, glavobolom, težkim dihanjem, kožnim izpuščajem, utrujenostjo in lahko tudi z anafilaktično reakcijo. Te reakcije se lahko pojavijo kljub premedikaciji z analgetiki/antipiretiki, antihista- miniki in kortikosteroidi. V večji meri se pojavljajo pri začetnih odmerkih in redkeje pri podkožni aplikaciji. Ob zdravljenju z monoklonskimi protitelesi se pogosto pojavlja tudi nevtropenija in številne okužbe, ki se lahko pojavijo tudi do enega leta po končanem zdravljenju. Pogoste so tudi okužbe in reaktivacija virusa hepatitis B pri rituksimabu in ofatumumabu, tuberkuloze pri rituksimabu ter citomega-lovirusa pri alemtuzumabu. Zdravljenje spremljajo tudi ga-strointestinalne težave, kot so slabost, bruhanje, bolečine v trebuhu, zapora črevesja ter srčno-žilni zapleti (aritmija, tromboembolizmi). Pri zdravljenju z monoklonskimi protitelesi lahko pride tudi do sindroma razpada tumorskih celic (22, 23, 25, 27). 8.3 MEDSEBOJNI VPLIVI MED ZDRAVILI Nekatera citostatična in biološka zdravila za zdravljenje KLL (klorambucil, cikofosfamid, fludarabin, alemtuzumab, rituk-simab, ofatumumab) ter metilprednizolon, ki imajo tudi imu-nosupresivno delovanje in vstopajo v kar nekaj interakcij z zdravili. Ta zdravila lahko povečajo toksične učinke ter zmanjšajo terapevtsko delovanje živih cepiv in tudi povečajo verjetnost sistemskih virusnih okužb. Povečajo lahko delovanje in neželene učinke, predvsem zaviranje kostnega mozga in povečane možnosti okužb pri sočasnem zdravljenju s klozapinom, leflunomidom ter natalizumabom. Imunosupresivi lahko zmanjšajo terapevtski učinek BCG, zato je njuna sočasna uporaba kontraindicirana. Pripravki s škrlatnim ameriškim slamnikom, lahko zaradi svojega delovanja zavirajo terapevtsko delovanje imunosupresivov, zato se njihova sočasna uporaba odsvetuje. Sočasna to-pikalna uporaba takrolimusa ali pimekrolimusa z imunosu-presivi lahko privede do večjega pojava neželenih/toksičnih učinkov imunosupresivov (23, 24, 25). Pri sočasni uporabi sukcinilholina in ciklofosfamida lahko pride do povečane koncentracije tega mišičnega relak-santa, zato je potrebno odmerek tega zdravila pri bolniku, ki je prejel ciklofosfamid v roku 10 dni ali prej, zmanjšati ali pa uporabiti drugo terapijo. Sočasna terapija z zdraviloma tiotepa ter etanercept lahko povzroči povečane koncentracije ciklofosfamida v serumu ter večje možnosti za njegove toksične učinke. Sočasna uporaba klozapina in bendamustina je kontrain-dicirana, saj lahko bendamustin poveča možnost neželenih in toksičnih učinkov klozapina, predvsem pojav agranulo-citoze. Bendamustin se daje previdno v primeru sočasne aplikacije inhibitorjev (ciprofloksacin, norfloksacin, metok-salen, primakin) ali induktorjev CYP1A2 (fenobarbital, kar-bamazepin, primidon, rifampicin). Inhibitorji tega encima lahko povzročijo povišanje serumske koncentracije benda-mustina ter večje izražanje neželenih učinkov. Njegovi in-duktorji pa, zaradi nezadostne koncentracije bendamustina v serumu, lahko povzročijo zmanjšanje njegovega delovanja, zaradi še nejasnega mehanizma delovanja, pa lahko tudi povečajo njegove neželene učinke. Sočasni uporabi monoklonskih protiteles ter antihiperten-zivov se je bolje izogibati, saj le-ti lahko povečajo hipoten-zivni učinek monoklonskih protiteles (23, 24, 25, 28). 9 SPREMLJAJOČE IN PODPORNO ZDRAVLJENJE, KI JO LAHKO PREJME BOLNIK V LEKARNI tidepresivi. Različne bolečine, povezane s samo boleznijo ali neželenimi učinki zdravil, zdravimo s paracetamolom, nesteroidnimi antirevmatiki ali opioidi. Zadrževanje vode v telesu zdravimo z diuretiki (27, 29). Glede na kronično jemanje zdravil za zdravljenje raka je pomembno, da tako bolnik, zdravnik, negovalno osebje in tudi farmacevt neželene učinke poznamo, da jih lahko preprečimo ter v primeru pojava pravočasno ugotovimo in pravilno zdravimo (27). 10 SKLEPI Za zdravljenje in preprečevanje slabosti in bruhanja pri zdravljenju KLL povzročene s citostatiki uporabljamo an-tiemetike, predvsem antagoniste serotoninskih receptorjev (ondansetron, granisetron, tropisetron, palonosetron), v kombinaciji z glukokortikoidi in antagonistom nevrokinin-skih receptorjev, zdravilom aprepitant (27). Za zdravljenje driske se uporablja loperamid, peroralna re-hidracijska tekočina ter svetuje ustrezna prehrana. V primeru, da po nekaj dneh ni izboljšanja ali se pojavi še telesna temperatura, bolnika napotimo k zdravniku. Pri zaprtju svetujemo blaga odvajala ter pomen pravilne prehrane (27, 29). Klinično pomembne anemije, zdravimo z rekombinatnimi eritropoetini, epoetini, ki jim je pogosto potrebno dodajati še železove pripravke. Okužbe preprečujemo in zdravimo z različnimi antibiotiki ter antimikotiki (npr. sulfametoksazol / trimetoprim za preprečevanje okužbe s P. jiroveci, azoli za preprečevanje aspergiloz). Pri nekaterih bolnikih z nev-tropenijo je upravičena tudi uporaba rastnih dejavnikov za granulocite (filgrastim), ki skrajšajo trajanje nevtropenij. Za zdravljenje avtoimunske trombocitopenije in hemolitične anemije se uporablja metilprednizolon (20, 22, 23, 27). Bolniki z rakom, zaradi narave bolezni ter samega zdravljenja, pogosto potrebujejo tudi zdravljenje z anksiolitiki in an- Tako kot za uspešno zdravljenje vsake novotvorbe ali celo popolno ozdravitev, je tudi pri KLL potrebno upoštevati vse vidike sodelujočih strokovnjakov od natančne diagnoze do prognoze in zdravljenja. Način zdravljenja izberemo po predhodnem pogovoru z bolnikom, ki mu predstavimo prednosti in slabosti posameznih različno intenzivnih načinov zdravljenja in skupaj izberemo najboljši način. Vse opisano pa samo po sebi ne zagotavlja uspešnega zdravljenja, če skupaj s farmacevtom ne upoštevamo odmerjanja, priprave, načina dajanja, premedikacije in medsebojnih vplivov novo predpisanih zdravil za zdravljenje KLL z zdravili, ki jih bolnik že prejema, saj je povprečno star več kot 70 let in ima več kroničnih bolezni. Ne nazadnje, s centralno pripravo zdravil v bolnišnični lekarni, predvsem pa-renteralnih raztopin, lahko zmanjšamo stroške učinkovitega intenzivnega zdravljenja tudi do 30 %. 11 LITERATURA Dohner H, Stilgenbauer S, Benner A, et al. Genomic aberrations and survival in chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 2000; 343(26):1910-6. Watson L, Wyld P, Catovsky D. Disease burden of chronic lymphocytic leukaemia within the European Union. Eur J Haematol 2008; 81(4): 253-8. Dighiero G, Hamblin TJ. Chronic lymphocytic leukaemia. Lancet 2008; 371 (9617): 1017-29. Brandt L. Environmental factors and leukaemia. Med Oncol Tumor Pharmacother 1985; 2(1):7-10. Rozman C, Montserrat E. Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med 1995; 333(16): 1052-7. 3 O Ž LU č OT Z < Z N SE OT tč LU O LU _l O LU cc Q_ LU > LU < Z £ < z z O cc 6. Signer RA, Montecino-Rodriguez E, Dorshkind K. Aging, B lymphopoiesis, and patterns of leukemogenesis. Exp Gerontol 2007; 42(5):391-5. 7. Caligaris-Cappio F, Ghia P. The nature and origin of the B-chronic lymphocytic leukemia cell: a tentative model. Hematol Oncol Clin North Am 2004; 18(4): 849-62. 8. Rodriguez-Vicente AE, Diaz MG, Hernandez-Rivas JM. Chronic lymphocytic leukemia: a clinical and molecular heterogenous disease. Cancer Genet 2013; 206 (3): 49-62. 9. Chen J, McMillan NA.Molecular basis of pathogenesis, prognosis and therapy in chronic lymphocytic leukaemia. Cancer Biol Ther 2008; 7 (2): 174-9. 10. Calin GA, Croce CM. Genomics of chronic lymphocytic leukemia microRNAs as new players with clinical significance. Semin Oncol 2006; 33(2): 167-73. 11. Chen L, Apgar J, Huynh L, et al. ZAP-70 directly enhances IgM signaling in chronic lymphocytic leukemia. Blood 2005; 105(5): 2036-41. 12. Sellner L, Dietrich S, Dreger P, Glimm H, Zenz T. Can prognostic factors be used to direct therapy in chronic lymphocytic leukemia? Curr Hematol Malig Rep 2012; 7(1): 3-12. 13. Chiorazzi N. Implications of new prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2012; 2012:76-87. 14. Letestu R, Levy V, Eclache V, et al. Prognosis of Binet stage A chronic lymphocytic leukemia patients: the strength of routine parameters. Blood 2010; 116(22): 4588-90. 15. Zenz T, Eichhorst B, Busch R, et al. TP53 mutation and survival in chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol 2010; 28(29): 4473-9. 16. Puente XS, Pinyol M, Quesada V, et al. Whole-genome sequencing identifies recurrent mutations in chronic lymphocytic leukaemia. Nature 2011; 475(7354): 101-5. 17. NCCN Guidelines Version 2.2013 18. Dicker F, Schnittger S, Haferlach T, et al. Immunostimulatory oligonucleotide-induced metaphase cytogenetics detect chromosomal aberrations in 80% of CLL patients: A study of 132 CLL cases with correlation to FISH, IgVH status, and CD38 expression. Blood 2006; 108(9): 3152-60. 19. Stilgenbauer S, Bullinger L, Lichter P, at al; German CLL Study Group (GCLLSG). Chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2002; 16(6): 993-1007. 20. Zver S. Smernice za odkrivanje in zdravljenje kronične limfatične levkemije. Zdrav Vestn 2010; 79: 465-74 Brian L. Abbot. Chronic Lymphocytic Leukemia: Recent Advances in Diagnoses and Treatment. The Oncologist 2006; 11:21-30 Uptodate. http://www.uptodate.com/contents/search. Dostop: september 2013 Povzetki glavnih značilnosti zdravil. CBZ2. http://www.cbz.si/. Dostop: september 2013. Drug monograph. CCO Formulary 2013. https://www.cancercare.on.ca/. Dostop: september 2013 Lexi-comp. http://www.lexi.com/Dostop: september 2013. Knez L. Vloga farmacevta pri zagotavljanju varnosti onkoloških bolnikov med sistemskim zdravljenjem raka. Farm Vestn 2011; 62: 259-260 27. Pajk B. Neželeni učinki sistemskega zdravljenja raka. Onkologija za prakso, leto IX, št.2, december 2007. Drug information online. Drug interactions checker. www.drugs.com. Dostop: september 2013. Borštnar S, Bernot M, Čufer T et al. Napotki za premagovanje neželenih učinkov sistemskega zdravljenja raka. Onkološki inštitut Ljubljana, 2007. 21 22 23 24 25 26 28 29 NEINVAZIVNO PREDPORODNO PRESEJANJE ZA ANEVPLOIDIJE NA OSNOVI PROSTE PLODOVE DNA -PREGLED RAZVOJA IN PRIPOROČILA ZA KLINIČNO PRAKSO NON-INVASIVE PRENATAL SCREENING FOR ANEUPLOI-DIES USING CELL-FREE FETAL DNA - PROGRESS AND RECOMMENDATIONS FOR CLINICAL PRACTICE AVTORJI / AUTHORS: Darija Strah, dr. med, specialistka ginekologije in porodništva1 Janez Bernik, univ. dipl. bth 2 Ustanova 1 Diagnostični center Strah, Slamnikarska 3a, 1230 Ljubljana 2 Doktorski študent Biomedicine, Univerza v Ljubljani, Kongresni trg 12, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: darlja@strah.sl POVZETEK Odkritje in potrditev prisotnosti proste plodove DNA v krvnem obtoku nosečnice v letu 1997 predstavlja odločilen mejnik za raziskave na področju neinva-zivnega predporodnega testiranja (NIPT). Delež proste plodove DNA v povprečju znaša 10-20 %, čeprav močno variira in je odvisen od različnih dejavnikov. V preteklem desetletju so razvili različne metode za ugotavljanje kromosomskih anevploidij na osnovi proste plodove DNA. Kot najustreznejša, najbolj zanesljiva in tudi najpogosteje uporabljena se je uveljavila tako imenovana metoda masovnega paralelnega sekvenciranja. V kliničnih študijah se je pokazalo, da je metoda masovnega paralelnega se-kvenciranja, vključno z njenimi variacijami, primerna za visoko zanesljivo presejanje najpogostejših kromosomskih anevploidij v prvem trimesečju nosečnosti. Mnenja posameznih združenj so si podobna glede indikacij za NIPT, mnenja, kdo lahko svetuje pred in po testu, pa so si različna. Strokovnjaki so si edini, da NIPT trenutno predstavlja izjemno zanesljiv presejalni test, pri katerem mora biti vsak pozitiven izvid potrjen z eno od klasičnih oblik invazivne diagnostične preiskave. KLJUČNE BESEDE: neinvazivno predporodno presejanje, prosta plodova DNA, Downov sindrom, anevploidije, masovno paralelno sekvenciranje POVZETEK The discovery of cell-free fetal DNA (cffDNA) in maternal plasma in 1997 represents a key breakthrough to the further progress that has been made in the field of non-invasive prenatal testing (NIPT). On average 10-20 % of cffDNA is present in the maternal plasma; however this proportion varies strongly and it depends on different factors. In the last decade, several methods for detecting chromosomal aneuploidies in early pregnancy have been developed and amongst them massively parallel sequencing (MPS) has been indicated as the most accurate, appropriate and the most commonly used. Clinical studies have shown that the method of massive parallel sequencing together with its variations is suitable for highly reliable screening of the most common chromosomal aneuploidies in the 3 o i! UJ OT Z < Z N O UJ _i LU cc Q_ o £ < cc CL O Z o ¡3 o o cc o CL cc CL < O > £ cc Q LL _l a LL CC CL < Z Q LL > O Q O 00 O CC CL > O z 00 o < a O _i CL > LL Z < < N < LL 00 LL CC CL O Z Q O CC O CL Q LL CC CL 0 Z > first trimester of pregnancy. Several medical associations published their opinion and guidelines for the implementation of NIPT in clinical practice. Their statements are consistent in the aspect of the indications when NIPT should be advised to the pregnant women while there are some uncertainties regarding pre- and post- testing counseling to be answered. The experts agree that NIPT method represents highly accurate advanced screening test, therefore in case of positive results patients should undergo one of the conventional invasive diagnostic procedures. KEY WORDS: non-invasive prenatal testing, cell-free fetal DNA, Down syndrome, aneuploidies, massively parallel sequencing 2 PROSTA PLODOVA DNA 1 UVOD Presejalni testi za odkrivanje anevploidij v prvem trimesečju nosečnosti predstavljajo uveljavljeno klinično prakso predporodne oskrbe nosečnic že skoraj 20 let (1). Testi upoštevajo različne kriterije: starost nosečnice, ultrazvočno merjenje debeline nuhalne svetline (NS) ploda in drugih kromosomskih označevalcev v prvem trimesečju ter stanje hormonskih označevalcev v prvem in drugem trimesečju. Napovedano visoko tveganje za anevploidije potrdimo ali ovržemo bodisi z biopsijo horionskih resic v prvem ali am-niocentezo v drugem trimesečju. Glede na mednarodne podatke, s presejanjem nuhalne svetline in dvojnega hormonskega testa odkrijemo približno 90 % plodov z Dow-novim sindromom (DS), ob lažno pozitivni stopnji (FPR) 5 % (2). Primerljive rezultate dosegamo tudi v Sloveniji, kjer z merjenjem debeline NS in oceno nosne kosti odkrijemo 85 % plodov z DS ob 2,8 % FPR (3). Vendar glede na pre-valenco DS še vedno večina nosečnic opravi invazivno diagnostično preiskavo, pri kateri tvega neželeno prekinitev nosečnosti, izkaže pa se, da gre za lažno pozitivni izvid pre-sejalnega testa (3). Zato strokovna javnost spremlja razvoj novih metod neinvazivnega predporodnega testiranja (NIPT) za anevploidije na osnovi proste plodove DNA. Kljub začetni nejasnosti glede natančnega celičnega izvora proste plodove DNA v krvnem obtoku nosečnice (4) je nedavna raziskava pokazala, da slednja izhaja iz citotrofobla-sta, notranje plasti trofoblasta (5). Iz venske krvi nosečnice jo je moč izolirati od 7. gestacijskega tedna dalje (6). Njen delež znaša v povprečju 10-20 %, čeprav močno variira od 3-40 % (7,8,9), kar je odvisno od različnih dejavnikov, kot je gestacijski teden, telesna teža nosečnice in morebitni zapleti v nosečnosti (7,10,11). Njen razpolovni čas znaša od 4-30 minut, zato je v nekaj urah po porodu v krvnem obtoku matere ne zaznamo več (12). Fragmenti proste celične DNA ploda so zelo majhni, povprečne dolžine 150 baznih parov (bp) in le redko presegajo 300 bp (13,14). Možnosti neinvazivnega odkrivanja anevploidij pri plodu so bile prvič nakazane leta 1969, ko so potrdili prisotnost plodovih celic v krvnem obtoku nosečnic (15). Leta 1997 so z analizo kromosoma Y ugotovili, da se v krvnem obtoku nosečnic poleg plodovih celic nahaja tudi prosta plodova DNA (6), ki je v primerjavi s plodovimi celicami prisotna v veliko večji meri in je zato primernejša za analizo. Po letu 1997 je prišlo do opaznega porasta raziskav na področju določanja krvne skupine, spola in prisotnosti ali odsotnosti antigena D (RhD+ ali RhD-) ploda s pomočjo proste plodove DNA (16, 20). Možnost predporodnega odkrivanja anevploidij je zaživela z razvojem sekvenciranja nove generacije. 3 PREGLED METOD PREDPORODNEGA DOLOČANJA KROMOSOMSKIH ANEVPLOIDIJ NA OSNOVI PROSTE PLODOVE DNA Prosto DNA iz krvne plazme matere izoliramo s klasičnimi metodami izolacije DNA. Nadaljnja analiza z izoliranim dednim materialom je odvisna od posamezne metode določevanja prisotnosti kromosomskih anevploidij. Do danes so bile na področju neinvazivnih tehnik predporodnega odkrivanja anevploidij uporabljene različne metode, ki bodisi te- meljijo na analizi DNA, vključno z imunoprecipitacijo meti-liranih regij DNA (MeDiP) (21), profilom polimorfizmov posameznega nukleotida kromosoma 21 (22), bodisi na analizi RNA, vključno z analizo polimorfizma posameznega nukleotida (SNP) v genu PLAC4 z masno spektrometrijo (23) oziroma analizo več SNP-jev znotraj gena PLAC4 prek reverzne transkripcije in od ligacije odvisnega hkratnega pomnoževanja sond (RT-MLPA) (24). Prav tako so bile uporabljene metode, ki temeljijo na analizi profila serumskih proteinskih označevalcev (25). Z razvojem sekvenciranja nove generacije in posledičnim padcem cene sekvencira-nja se je kot najustreznejša, najbolj zanesljiva in tudi najpogosteje uporabljena uveljavila tako imenovana metoda masovnega paralelnega sekvenciranja (angl. massively parallel sequencing, MPS). 3.1 MASOVNO PARALELNO SEKVENCIRANJE S to metodo lahko danes rutinsko določimo zaporedje milijonov ali celo milijard fragmentov DNA (26). Določanje zaporedja poteka istočasno ob klonsko namnoženih fragmentih DNA v mnogih prostorsko ločenih celicah. Rezultat takega postopka so številna zaporedja krajših fragmentov DNA, pri čemer se isti fragment DNA prebere večkrat. To poimenujemo s terminom »pokritost«. Zaznavanje stopnje pokritosti je osnovni princip določanja kromosomskih nepravilnosti (27, 28). V primeru trisomije 21 gre pričakovati, da bo pokritost fragmentov, ki izhajajo iz kromosoma 21, v primerjavi s fragmenti iz ostalih kromosomov, statistično značilno večja. Povedano drugače, kadar fragment DNA iz kromosoma 21 preberemo statistično značilno večkrat kot običajno, lahko z izredno veliko zanesljivostjo določimo prisotnost trisomije 21 kromosoma. Enak princip velja tudi za ostale anevploidije. 3.2 NAKLJUČNA IN TARČNA METODA MPS Pri metodi MPS ločimo dva osnovna pristopa. Najpogosteje uporabljen pristop je tako imenovana naključna (ang. shotgun) metoda MPS (MPSS), ki je podrobneje opisana v raziskavi Ehricha s sod. (27). Fragmente DNA sekvenci-ramo po celotnem genomu, torej naključno, ne glede na to, kateremu kromosomu fragmenti DNA pripadajo. Sparks s sod. opiše razvoj tarčne (angl. target) metode MPS, ki so jo poimenovali DANSR (angl. digital analysis of selected regions) (29). Njena prednost je, da z njo analiziramo le frag- mente DNA, ki pripadajo izbranim kromosomom. Posledično je moč doseči večjo pokritost posameznega fragmenta, oziroma lahko istočasno analiziramo več vzorcev. Različica tarčne metode MPS je analiza le polimorfnih mest genoma (30), kar jim je omogočilo, da so pridobili ogromen nabor fragmentov DNA, ki so pripadali le plodu. 4 PREGLED RAZISKAV Do danes so bile z uporabo metode sekvenciranja DNA izvedene številne raziskave, v katerih so z metodo MPS analizirali uspešnost odkrivanja različnih oblik anevploidij, najpogosteje trisomij kromosoma 21 (T21) (9,27,31), T21 in T18 (32,33,34,35,36,37), T18 in T13 (38), T13 (39), analizo vseh treh trisomij (40), oziroma so se osredotočali tako na analizo najpogostejših treh trisomij, kot tudi na analizo anevploidij spolnih kromosomov (30,41,42,43). Večina raziskav je bila izvedenih na vzorcu nosečnic z visokim tveganjem (9,27,30-43). Nicolaides in sod. so kot prvi potrdili primernost metode tudi na vzorcu nosečnic z nizkim tveganjem (44). Značilnosti najpomembnejših raziskav na področju neinva-zivnega odkrivanja anevploidij so podrobneje predstavljene v Tabeli 1. 5 SEDANJE OMEJITVE NIPT PRI DOLOČEVANJU ANEVPLOIDIJ Tehnike NIPT v sedanjem razponu lahko z visoko občutljivostjo in majhno stopnjo lažno pozitivnih izvidov določijo T21, T18 in T13, vendar ne smemo pozabiti, da je večina študij opravljena na vzorcu nosečnic z visokim tveganjem in enoplodno nosečnostjo. Prav tako je malo podatkov glede odkrivanja mozaičnih oblik trisomij, čeprav je potencial in visoka specifičnost metode NIPT tudi tu že pokazana (42). Trenutne metode NIPT omogočajo uspešno analizo vzorcev, če je delež proste plodove DNA v krvnem obtoku matere višji od 4 %. V nedavno objavljeni študiji so pokazali, da ima pomemben vpliv na delež proste plodove DNA teža 3 o i! UJ č OT Z < Z N O UJ _i O LU cc Q_ £ < cc CL O Z >o Z _J o o cc o CL cc CL Z < o > £ cc Q LU _l C5 LU CC CL < Z Q LU > O Q O 00 O CC CL > O z 00 o < o O _i CL > LU Z < < N < LU 00 LU CC CL O Z Q O CC O CL Q LU CC CL O Z > § Tabela 1: Pregled najpomembnejših raziskav na področju predporodnega odkrivanja anevploidij na osnovi proste plodove DNA in tehnologije MPS Table 1: List of important publications in the field of non-invasive prenatal testing, based on free-fetal DNA and MPS technology. Raziskava Vzorec in število nosečnic Anevploidija Občutljivost Specifičnost Ehrich, 2011 (27) Nosečnice z visokim tveganjem, 490 nosečnic T21 100 % 99,7 % Chiu, 2011 (9) Nosečnice z visokim tveganjem, 753 nosečnic T21 100 % 97,9 % Palomaki, 2011(31) Nosečnice z visokim tveganjem, 4664 nosečnic T21 98,5 % 99,8 % Palomaki, 2012 (38) Nosečnice z visokim tveganjem, 4664 nosečnic T18 T13 100 % 91,7 % 99,7 % 99,1 % Bianchi, 2012(42) Nosečnice z visokim tveganjem, 2882 nosečnic T21 T18 T13 monosomija X 100 % 97,2 % 78,6 % 93,8 % 100 % 100 % 100 % 99,8 % Sparks, 2012 (37) Nosečnice z visokim tveganjem, 250 nosečnic T21 T18 100 % 100 % 99,2 % 99,2 % Ashoor, 2012 (35) Nosečnice z visokim tveganjem, 300 nosečnic T21 T18 100 % 98 % 100 % 100 % Nicolaides, 2012 (44) Nosečnice z nizkim tveganjem, 2049 nosečnic T21 T18 100 % 100 % *FPR: < 1 % *FPR: < 1 % Dan, 2012 (36) Nosečnice z visokim tveganjem, 11 105 nosečnic T21 in T18 100 % 99,96 % Jiang, 2012 (41) Nosečnice z visokim tveganjem, 903 nosečnice T21, T18 in T13 X, XXY, XXY 100 % 85,7 % 99,9 % 99,9 % Ashoor, 2013 (39) Nosečnice z visokim tveganjem, 2002 nosečnic T13 80 % 99,95 % Norton, 2012 (60) Nosečnice z visokim tveganjem, 3228 nosečnic T21 T18 100 % 97,4 % FPR: 0,03 % FPR: 0,07 % *FPR: lažno-pozitivni izvid (raziskava je bila izvedena na vzorcu nosečnic z nizkim tveganjem); T21: trisomija 21; T18: trisomija 18; T13: trisomija 13 nosečnice. V povprečju pri nosečnicah s težo 60 kg lahko pričakujemo manj kot 1 % primerov z deležem proste plodove DNA, manjšim od 4 %. Pri nosečnicah s težo 160 kg pa lahko pričakujemo, da bo delež proste plodove DNA prenizek v več kot 50 % primerov (11). Do sedaj imamo nekaj podatkov o testiranju NIPT pri dvo-ali večplodni nosečnosti, še posebno pri diskordantnosti. Canick s sod. poroča, da so uspešno odkrili 7 nosečnosti s T21 in eno nosečnost s T13, prav tako so pravilno določili vseh 17 evploidnih dvoplodnih nosečnosti (45). Teoretično lahko prisotnost DNA evploidnega zarodka razredči anev-ploidno DNA prizadetega zarodka v vzorcu in tako oteži oceno pravega stanja. Testiranje ni primerno za nepravilne oblike dvoplodne nosečnosti kot je npr. vanishing twin. 6 PRIPOROČILA ZA IZVAJANJE NIPT V zadnjem času se v vseh strokovnih člankih, v katerih so objavljeni izsledki kliničnih študij, uporabljajo izrazi: NIPT (angl. non-invasive prentatal testing), NIPS (angl. noninvasive prentatal screening) in NIDT (angl. non-invasive DNA testing). NIPT je torej izjemno zanesljiv presejalni test, v strokovni literaturi imenovan »advanced screening test« za odkrivanje trisomije 21., 18. in 13. kromosoma (46). Zato moramo vsak pozitiven izvid NIPT potrditi z eno od klasičnih oblik invazivne diagnostične metode (44). Združenje ACOG (The American College of Obstetricians and Gynecologists, The Society for Maternal - Fetal Medicine Publications Commitee) je decembra 2012 sprejelo priporočila za presejanje z NIPT (47). V mnenju so navedene indikacije, ob katerih je priporočljivo testiranje NIPT: • starost matere 35 let in več ob porodu, • ultrazvočni izvid ploda, ki nakazuje možnost anevploidije, • anamneza predhodne nosečnosti z dokazano anevploi-dijo, • pozitivni presejalni test bodisi zgodnje morfologije z nu-halno svetlino in/ali dvojnega hormonskega testa, se-kvenčnega, integriranega presejalnega testa ali četvernega hormonskega testa, • uravnotežena Robertsonova translokacija pri starših s povišanim tveganjem za trisomijo 21 ali 13. V okviru predtestnega svetovanja je treba poudariti, da gre za izredno zanesljiv presejalni test in da je namenjen le odkrivanju najpogostejših treh kromosomskih trisomij. Pozitivnemu testu NIPT sledi priporočilo za genetski posvet in invazivna diagnostična preiskava. Negativni izvid ne izključi nosečnosti s kasnejšimi možnimi zapleti. Test ni zamenjava za še vedno najbolj zanesljivi metodi kot sta amniocenteza in biopsija horionskih resic. Strokovnjaki so si enotni, da ostane sprejeto presejanje za DS v obsegu, kot ga izvajamo do sedaj (47). V primeru ultrazvočno vidnih sumljivih znakov za anevploidije naj se kot prva ponudi klasična invazivna diagnostika. Podobno mnenje je sprejelo tudi združenje ISPD (International Society of Prenatal Diagnosis). Testiranje NIPT je ob ustreznem genetskem svetovanju primeren presejalni test za nosečnice s povišanim tveganjem za trisomijo 21. Pozitiven rezultat testiranja NIPT je potrebno potrditi z invazi-vno diagnostično preiskavo (48). Združenje NSGC (National Society of Genetic Counselors) prav tako ugotavlja, da je NIPT testiranje primerno za nosečnice s povišanim tveganjem za kromosomske nepravilnosti. Testiranje NIPT naj bo nosečnicam ponujeno v sklopu privolitve po pojasnilu in z ustreznim genetskim svetovanjem. V primeru pozitivnega testa mora biti pacientka napotena na potrditev z invazivno diagnostično metodo (49). V Sloveniji priporočil za izvajanje NIPT kot uradno sprejetih smernic še nimamo. Mnenja posameznih združenj so si podobna glede indikacij za NIPT, mnenja, kdo lahko svetuje pred testom in po njem, so si različna. ACOG priporoča predtestno svetovanje, ki ne sme potekati kot del rutinskega vodenja nosečnosti, temveč kot posvet s podpisano privolitvijo po pojasnilu, opravi ga ginekolog porodničar (47). V primeru pozitivnega NIPT se nosečnico napoti na genetsko svetovanje. NSGC priporoča posvet genetskega svetovalca (49) pred in po testu. EuroGentest Network of Excellence definira pojem strokovnjaka s primernimi znanji, ki sme opraviti genetski posvet. Običajno je to specialist genetski svetovalec (klinični genetik, genetski svetovalec ali medicinska sestra z znanji genetskega svetovanja). Svetovanje lahko opravlja tudi strokovnjak druge stroke z osvojenim znanjem svetovanja, kot je npr. specialist ginekologije in porodništva v primerih predtestnega svetovanja pri tveganju za anevploidije zaradi povečane starosti nosečnice (50). Do NIPT so se opredelili tudi v Ameriškem združenju za medicinsko genetiko in genomiko (ACMG - American College of Medical Genetics and Genomics). Njihovo stališče je, da naj predtestno in potestno svetovanje opravlja ginekolog porodničar (prenatal/obstetric care provider), usposobljen strokovnjak (prenatal designee) oziroma genetski svetovalec. Predtestno svetovanje naj bo sestavni del NIPT, medtem ko naj se potestno svetovanje opravi v primeru pozitivnega NIPT (51). 7 POMEN NIPT ZA SEDANJE KLINIČNO DELO V vsem času od uvedbe presejanja za kromosomske nepravilnosti je bilo odkrivanje DS največjega pomena. Pre-sejanje na sprejeti način se je izkazalo uspešno tudi za odkrivanje drugih klinično pomembnih anevploidij pri nosečnicah z visokim tveganjem; z invazivnimi preiskavami je bilo odkritih tudi veliko klinično pomembnih mikroduplikacij ali delecij in z njimi povezanih genetskih sindromov (2). Pomemben pomislek, kadar razmišljamo o uvedbi NIPT kot primarnem presejanju za DS, je, da ne bomo odkrili vrste drugih klinično pomembnih nepravilnosti, kot je npr. Tur-nerjev sindrom ali triploidija. Veliko kromosomskih nepravilnosti se pri uveljavljenem presejanju ultrazvočne zgodnje morfologije z merjenjem nuhalne svetline in dvojnim hormonskih testom v 11. do 14. tednu nosečnosti kaže podobno, bodisi s povečano nuhalno svetlino ali podobnimi biokemičnimi lastnostmi (2). Zato je priporočeno, da ostane 3 o i! LU č OT Z < Z N O LU _I a LU cc Q_ £ < cc CL O Z o ¡3 o o cc o CL cc CL < o > £ cc Q LJJ _l a LJJ CC CL < Z Q LU > O Q O 00 O CC CL > O z 00 o < Qd O _i CL > LJJ Z < < N < LJJ 00 LJJ CC CL O Z Q O CC o CL Q LJJ CC CL O Z > ultrazvočno presejanje v 1. trimesečju z dvojnim hormonskim testom v obsegu, kot ga izvajamo sedaj. NIPT pravzaprav predstavlja komplementarno metodo dosedanjemu presejanju in nikakor ne zamenjave. Ne smemo pozabiti, da je ultrazvočno presejanje tudi diagnostično za nekatere večje strukturne nepravilnosti ploda in nekatere od njih, kot je npr. holoprosencefalija, moramo dodatno ovrednotiti z invazivno preiskavo (39). Invazivna diagnostična preiskava se priporoči tudi, kadar je NIPT za trisomijo 21 in 18 negativen, ultrazvočno pa zasledimo povišano NS ploda in strukturne defekte, omfalokelo, holoprosencefalijo, razširjen sečni mehur ali diafragmalno hernijo (2, 52, 53, 54, 55, 56, 57). Uveljavljeno presejanje za DS v 1. trimesečju poleg ocene zgodnje morfologije in stanja ploda napoveduje tudi možnost nastanka preeklampsije in oceno prezgodnjega poroda (58). Vsekakor je cena NIPT v primerjavi z ustaljenim presejanjem zelo omejujoč dejavnik, vendar pričakujejo, da se bodo stroški za preiskavo v nekaj letih znatno znižali (46). Drugi omejujoči dejavnik je čas, ki ga potrebujemo, da dobimo izvid. Rezultati NIPT so trenutno znani v 10 dneh. Zaradi tehničnih omejitev pri približno 5 % analiz izvida ni mogoče zagotoviti in lahko se zgodi, da nosečnica ultrazvočnega presejanja v 1. trimesečju ne uspe več opraviti (59). Pogoja za vključitev NIPT v ustaljene presejalne predporodne programe sta zmanjšanje stroškov preiskave z izpopolnjevanjem tarčnih metod MPS in skrajšanje časa, potrebnega za pridobitev izvida (59). 8 ZAKLJUČEK čnim testom in kot tak NIPT ne predstavlja zamenjave za ustaljeni diagnostični preiskavi kot sta amniocenteza in biopsija horionskih resic. Predstavljal naj bi novo komplementarno metodo presejanja ob ustaljenem načinu odkrivanja anevploidij v 1. trimesečju nosečnosti na osnovi ultrazvočne in hormonske preiskave. Gre za izjemno zanesljiv presejalni test, katerega pozitivne rezultate je potrebno potrditi z eno od invazivnih preiskav. 9 3 Rezultati do sedaj izvedenih raziskav s področja NIPT na osnovi proste plodove DNA so izjemno obetavni. Največ dokazov o primernosti metode imamo za določevanje tri-somije 21, vedno več podatkov je na voljo tudi za trisomiji kromosomov 13 in 18, kjer zaradi majhne prevalence slednjih obstaja nekoliko več omejitev. Novejše raziskave vključujejo vedno večje skupine preiskovank, kjer opisane vrednosti glede občutljivosti in specifičnosti predstavljajo nov mejnik presejanja za tri najpogostejše anevploidije z visoko stopnjo odkrivanja. Zaenkrat se ne smemo prenagliti, saj NIPT ne izkazuje diagnostičnih vrednosti. Ne moremo ga enačiti z diagnosti- 10. 11 LITERATURA Nicolaides KH, Azar G, Byrne D, et al. Fetal nuchal translucency: ultrasound screening for chromosomal defects in the first trimester of pregnancy. BMJ. 1992; 304: 867-869. Nicolaides KH. Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks. Prenat Diagn. 2011; 1: 7-15. Strah DM, Pohar Perme M, Geršak K. Ultrazvočno presejanje za kromosomopatije v prvem trimesečju nosečnosti pri 13049 naključno izbranih nosečnicah. Med Razgl. 2011; 50: S 2: 8792. Bischoff FZ, Lewis DE, Simpson JL. Cell-free fetal DNA in maternal blood: kinetics, source and structure. Hum Reprod Update. 2005; 11 (1): 59-67. Faas BH, de Ligt J, Janssen I, et al. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies using massively parallel sequencing-by-ligation and evidence that cell-free fetal DNA in the maternal plasma originates from cytotrophoblastic cells. Expert Opin Biol Ther. 2012; 12 Suppl 1: S19-26. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997; 350: 485487. Lo YM, Tein MS, Lau TK, et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet. 1998; 62: 768-775. Lun FM, Chiu RW, Allen Chan KC, et al. Microfluidics digital PCR reveals a higher than expected fraction of fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem. 2008; 54: 1664-1672. Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ. 2011; 11, 342: c7401. Sekizawa A, Jimbo M, Saito H, et al. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta, Clin Chem. 2002; 48 (2): 353-354. Ashoor G, Syngelaki A, Poon LC, Rezende JC, Nicolaides KH. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-3 weeks' gestation: relation to maternal and fetalcharacteristics. Ultrasound Obstet Gynecol. 2013; 41 (1): 26-32. 12. Lo YM, Zhang J, Leung TN, et al. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet. 1999; 64 (1): 218224. 13. Li Y, Zimmermann B, Rusterholz C, et al. Size separation of circulatory DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms. Clin Chem. 2004; 50: 1002-1011. 14. Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, et al. Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA by paired-end sequencing. Clin Chem. 2010; 56: 1279-1286. 15. Walknowska J, Conte FA, Grumbach MM. Practical and theoretical implications of fetal/maternal lymphocyte transfer. Lancet. 1969; 1: 1119-1122. 16. Honda H, Miharu N, Ohashi Y, et al. Fetal gender determination in early pregnancy through qualitative and quantitative analysis of fetal DNA in maternal serum. Hum. Genet. 2002; 110: 7579. 17. Lo, YM, Hjelm NM, Fidler C, et al. Prenatal diagnosis of fetal RhD status by molecular analysis of maternal plasma. N Engl JMed. 1998; 339: 1734-1738. 18. Finning, K. Martin P, Summers J, et. al. Effect of high throughput RHD typing of fetal DNA in maternal plasma on use of anti-RhD immunoglobulin in RhD negative pregnant women: prospective feasibility study. BMJ. 2008; 336: 816-818. 19. Daniels G, Finning K, Martin P, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal blood group phenotypes: current practice and future prospects. Prenat Diagn. 2009; 29: 101-107. 20. Van der Schoot CE, Soussan AA, Koelewijn J, et al. Noninvasive antenatal RHD typing. Transfus Clin Biol. 2006; 13: 53-57. 21. Papageorgiou EA, Karagrigoriou A, Tsaliki E, et al. Fetal-specific DNA methylation ratio permits noninvasive prenatal diagnosis of trisomy 21. Nat Med. 2011; 17 (4): 510-513. 22. Ghanta S, Mitchell ME, Ames M, et al. Non-invasive prenatal detection of trisomy 21 using tandem single nucleotide polymorphisms. PLoS One. 2010; 5 (10): e13184. 23. Lo YM, Tsui NB, Chiu RW, et al. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat Med. 2007; 13 (2): 218-223. 24. Deng YH, Yin AH, He Q, et al Non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21 by reverse transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification. Clin Chem Lab Med. 2011; 49 (4): 641646. 25. Narasimhan K, Lin SL, Tong T, et al. Maternal serum protein profile and immune response protein subunits as markers for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21, 18, and 13. Prenat Diagn. 2013; 33 (3): 223-231. 26. Schuster SC. Next-generation sequencing transforms today's biology. Nat Methods. 2008; 5 (1): 16-18. 27. Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, Tynan JA, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. Am J Obstet Gynecol. 2011; 204 (3): 205.e1-11. 28. Strah D, Prosta plodova DNK in klinična uporabnost pri določevanju kromosomskih anevploidij pri plodu. ISIS. 2013; 22 (1): 61-64. 29. Sparks AB, Wang ET, Struble CA, et al. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. Prenat Diagn. 2012; 32 (1): 3-9. 30. Zimmermann B, Hill M, Gemelos G, et al. Noninvasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenat Diagn. 2012; 32 (13): 1233-41. 31. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med. 2011; 13 (11): 913-920. 32. Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ. 2011 11; 342: c7401. 33. Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, de Feo E, et al. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. Clin Chem. 2011; 57 (7): 1042-1049. 34. Norton ME, Brar H, Weiss J, et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012; 207 (2): 137.e1-8. 35. Ashoor G, Syngelaki A, Wagner M, Birdir C, et al. Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first-trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012; 206 (4): 322.e1-5. 36. Dan S, Wang W, Ren J, Li Y, Hu H, et al. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors. Prenat Diagn. 2012; 32 (13): 1225-1232. 37. Sparks AB, Struble CA, Wang ET, et al. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012; 206 (4): 319.e1-9. 38. Palomaki GE, Deciu C, Kloza EM, et al. DNA sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome: an international collaborative study. Genet Med. 2012; 14 (3): 296-305. 39. Ashoor G, Syngelaki A, Wang E, Struble C, Oliphant A, Song K, Nicolaides KH. Trisomy 13 detection in the first trimester of pregnancy using a chromosome-selective cell-free DNA analysis method. Ultrasound Obstet Gynecol. 2013; 41 (1):21-5. 40. Lau TK, Chen F, Pan X, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of common fetal chromosomal aneuploidies by maternal plasma DNA sequencing. J Matern Fetal Neonatal Med. 2012; 25 (8): 1370-374. 41. Jiang F, Ren J, Chen F, et al. Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies. BMC Med Genomics. 2012; 5: 57. 42. Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, et al. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet Gynecol. 2012; 119 (5): 890-901. 43. Liang D, Lv W, Wang H, et al. Non-invasive prenatal testing of fetal whole chromosome aneuploidy by massively parallel sequencing. Prenat Diagn. 2013. doi: 10.1002/pd.4033. 44. Nicolaides KH, Syngelaki A, Ashoor G, et al. Noninvasive prenatal testing for fetal trisomies in a routinely screened firsttrimester population. Am J Obstet Gynecol. 2012; 207 (5): 374.e1-6. 45. Canick JA, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to identify Down syndrome and other trisomies in multiple gestations. Prenat Diagn. 2012; 32 (8): 730-734. 46. Chitty LS, Hill M, White H, Wright D, Morris S. Noninvasive prenatal testing for aneuploidy- ready for prime time? Am J Obstet Gynecol. 2012; 206: 269-275. 47. Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Committee Opinion No. 545. American College of Obstetricians and Gynecologists. Obstet Gynecol. 2012; 120: 1532-1534. 48. Benn P, Borrell A, Cuckle H, et al. Prenatal Detection of Down Syndrome using Massively Parallel Sequencing (MPS): a rapid response statement from a committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis, 24 October 2011. Prenat Diagn. 2012; 32 (1): 1-2. 49. Devers PL, Cronister A, Ormond KE, et al. Noninvasive Prenatal Testing/Noninvasive Prenatal Diagnosis:the Position of the National Society of GeneticCounselors. J Genet Couns. 2013. 3 O Ž LU č OT Z < Z N O LU _l O LU cc Q_ £ < cc CL O z o >o o cc o cl cc Q. < o > £ cc Q 50. EuroGentest Network of Excellence. Recommendations for genetic counselling related to genetic testing. http://www.eurogentest.org/. dostopano: 21-3-2013 51. The Noninvasive Prenatal Screening Work Group of the American College of Medical Genetics and Genomics, et al. ACMG statement on noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy. Genet Med. 2013. doi: 10.1038/gim.2013.29. 52. Nicolaides KH. Nuchal translucency and other first-trimester sonographic markers of chromosomal abnormalities. Am J Obstet Gynecol. 2004; 191: 45-67. 53. Snijders RJ, Noble P, Sebire N, et al. UK multicenter project on assessment of risk of trisomy 21 by maternal age and fetal nuchal-translucency thickness at 10-14 weeks of gestation: Fetal Medicine Foundation First Trimester Screening Group. Lancet. 1998; 352: 343-346. 54. Kagan KO, Avgidou K, Molina FS, et al. Relation between increased fetal nuchal translucency thickness and chromosomal defects. Obstet Gynecol. 2006; 107: 6-10. 55. Chitty LS, Kagan KO, Molina FS, et al. Fetal nuchal translucency scan and early prenatal diagnosis of chromosomal 56 abnormalities by rapid aneuploidy screening: observational study. BMJ. 2006; 332 :452-455. Pergament E, Alamillo C, Sak K, et al. Genetic assessment following increased nuchal translucency and normal karyotype. Prenat Diagn. 2011; 31: 307-310. 57. Leung TY, Vogel I, Lau TK, et al. Identification of submicroscopic chromosomal aberrations in fetuses with increased nuchal translucency and apparently normal karyotype. Ultrasound Obstet Gynecol. 2011; 38: 314-319. Nicolaides KH. A model for a new pyramid of prenatal care based on the 11 to 13 weeks' assessment. Prenat Diagn. 2011; 31: 3-6. Hui L. Non-invasive prenatal testing for fetal aneuploidy: charting the course from clinical validity to clinical utility. Ultrasound Obstet Gynecol. 2013; 41: 2-6. Norton ME, et al. Non-Invasive Chromosomal Evaluation (NICE) Study: results of a multicenter prospective cohort study for detection of fetal trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol. 2012; 207(2): 137.e1-137.e8 58 59 CD LU CC Q. < Z Q LU > o Q O 00 O CC Q. > o z 00 o < Q O _i Q. > LU Z < < N < LU 00 LU CC Q. O z Q O CC o Q. Q LU CC Q. O Z > § ZDRAVLJENJE IN PREPREČEVANJE MALARIJE ANTIMALARIAL THERAPY AND PROPHYLAXIS AVTORJA / AUTHORS: Katarina Starkl, mag. farm.1, doc. dr. Janez Mravljak, mag. farm.2, 11nstitut »Jožef Stefan«, Jamova cesta 39, 1000 Ljubljana 2 Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: janez.mravljak@ffa.uni-lj.si POVZETEK Kljub temu da je bilo veliko truda vloženega v izkoreninjenje malarije, ostaja svetovni zdravstveni problem, predvsem v državah tretjega sveta. Malarijo povzroča parazitska pražival iz rodu Plasmodium, prenaša pa se s pikom okuženega komarja iz rodu Anopheles. Do danes je bilo razvitih veliko antima-larikov, vendar je vsak od njih zaradi odpornosti na nekaterih geografskih območjih neučinkovit. S problemom malarije se spoprijemajo tudi turisti, ki se odpravljajo na območja, kjer se pojavlja malarija. Kemoprofilaksa je še vedno edini način preventive, saj učinkovitega cepiva proti malariji še ni. KLJUČNE BESEDE: malarija, antimalarik, oksidativni stres 1 PROBLEMATIKA POVZETEK Even though there has been a lot of effort put into elimination of malaria, it still remains a world health issue, especially in the third world countries. Malaria is caused by parasites protozoa of the genus Plasmodium and is transmitted by the bite of infected mosquito of the genus Anopheles. Many antimalarials have been found to treat malaria but all of them eventually have lost their efficacy in particular geographic regions due to resistance. Tourists visiting areas with malaria are also facing the risk of infection. Chemoprophylaxis is still the only prevention since there is no vaccine against malaria yet. KEY WORDS: malaria, antimalarial, oxidative stress LA o ž E TVE S N A N Z D E L a E R P Malarija se je razvila v naših primatskih prednikih in se potem prenesla na ljudi, ki so jo s selitvami širili po vsem svetu. Prvi opisi malarije oz. zanjo značilne ponavljajoče se zvišane temperature segajo na Kitajsko v 3. tisočletje pred našim štetjem (1). Do sredine 19. stoletja se je malarija razširila na raven endemije, kar pomeni, da je na območjih z malarijo živelo približno 90 odstotkov svetovnega prebivalstva. Pred drugo svetovno vojno je bila malarija zaradi odkritja načina prenosa okužbe, nadzora komarjev in širšega dostopa do zdravljenja izkoreninjena iz večjega dela Zahodne Evrope (2). Kljub napredku pri omejevanju bolezni je še danes svetovni zdravstveni problem (3). Leta 2010 je bilo po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije 216 milijonov primerov okužb z malarijo (81 % v afriški regiji) in 655 tisoč smrtnih žrtev (91 % v afriški regiji). Glavne žrtve so otroci, mlajši od petih let (86 %). Incidenca malarije se je od leta 2000 znižala za 17 %, smrtnost zaradi nje pa za 26 % (4). Svetovni cilj v boju z malarijo do konca leta 2015 je 75-odstotno znižanje incidence v primerjavi z letom 2000 in popolno izničenje števila smrtnih žrtev (4). Leta 2012 je bila približno polovica držav, kjer se malarija še pojavlja, na dobri poti, da bi dosegla ta cilj (5). Glavna ovira pri boju z malarijo je prilagodljivost plazmodija, ki hitro razvije odpornost na protiparazitne učinkovine (6). ÜJ o LU CC CL LU CC CL LU S CC o N Zaradi nezanimanja farmacevtske industrije so večino dosedanjih antimalarikov (klorokin, meflokin, primakin, halo-fantrin) razvili vladni in vojaški raziskovalni programi, nekatere so odkrili pri naključnem iskanju učinkovitosti naravnih produktov (artemisinin), ali pa so antimalarijsko aktivnost odkrili kot novo indikacijo pri že registriranih zdravilih (atovakon, tetraciklini, sulfonamidi) (7). Zadnje čase so se v iskanje novih antimalarikov aktivno vključile nekatere organizacije, najpomembnejša med njimi je Medicines for malaria venture, in farmacevtska podjetja, kar spodbuja razvoj novih antimalarikov. Idealno novo zdravilo proti malariji bi bilo varno, odporno proti multirezistentnim sevom, primerno za otroke in nosečnice, zaradi boljše vodljivosti pacientov pa učinkovito v čim manj odmerkih in stalo bi manj kot 1 dolar na zdravljenje, da bi bilo tudi cenovno dostopno ljudem na najbolj ogroženih območjih (8). 2 POTEK OKUŽBE Slika 1: Razvojni krog plazmodija (10) Figure 1: The life cycle of Plasmodium parasite (10). 2.2 OBLIKE MALARIJE 2.1 RAZVOJNI KROG PLAZMODIJA Razvojni krog plazmodija (Slika 1) je sestavljen iz spolnega cikla, ki poteka v samici komarja vrste Anopheles, in ne-spolnega cikla, ki poteka v ljudeh. Življenjski krogi različnih plazmodijevih vrst so si podobni. S pikom okuženega komarja se v krvni obtok sprostijo sporociti. V pol ure izginejo iz obtoka in vstopijo v jetrne celice, kjer poteče prederitro-citna faza razvoja. Po inkubacijski dobi (od 10 do 14 dni) se jetrne celice razpočijo, merociti se sprostijo nazaj v krvni obtok, kjer okužijo rdeče krvničke in tvorijo parazite, imenovane trofociti. Trofociti se pospešeno množijo v rdečih krvničkah, kar zajema eritrocitno fazo razvoja, ki je odgovorna za klinične znake malarije. Po mitotski delitvi trofo-citnega jedra nastane šizont, ki se naprej množi, da nastanejo številni merociti. Ko se eritrocit razpoči, se me-rociti sprostijo v krvni obtok, kjer lahko okužijo nove eritrocite, in tako se ponovi eritrocitna faza. Iz nekaterih merocitov se razvijejo moški in ženski gametociti, ki okužijo komarja; s tem se plazmodijev razvojni krog sklene, malarija pa širi. Sporociti nekaterih plazmodijevih vrst (P. vivax in P. ovale) lahko v hepatocitih tvorijo spečo obliko parazita (hipnocit), ki povzroča ponovne izbruhe še leta po prvotni okužbi (9). Malarijo pri človeku povzročajo štiri vrste plazmodija, in sicer P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae (9). Malarija, ki jo povzroča P. falciparum, je najbolj smrtonosna in prevladuje v Afriki. Malarija P. vivax je manj nevarna, a bolj razširjena. Ostali dve vrsti sta redki (5). Simptomi malarije so zvišana telesna temperatura, mrzlica, glavobol, čezmerno potenje, vrtoglavica, slabost, ponavljajoče se bruhanje, splošne konvulzije in v hudih oblikah tudi koma (9, 11). Pojavijo se od 7 do 9 dni po okužbi. Najnevarnejša okužba je okužba s P. falciparum (9), ki povzroči visoko stopnjo parazitemije, težko anemijo, cerebralno malarijo, celo odpoved ledvic, pljučni edem in smrt. Vzrok za večjo patogenost P. falciparum je njegova sposobnost okužbe rdečih krvničk vseh starosti, kar povzroči velik porast parazitoze in hudo anemijo. Ostale vrste lahko okužijo le nezrele eritrocite (retikulocite) ali stare eritrocite, ki jim membrana začne slabeti in so tik pred iztekom 120-dnev-nega življenjskega obdobja. Ti eritrociti skupaj predstavljajo le manjši delež vseh rdečih krvničk. P. falciparum povzroči tudi zlepljenje okuženih eritrocitov in prilepljanje teh skupkov na endotelijske celice malih žil, kar ustavi pretok krvi. Poleg tega sproži tudi škodljiv čezmeren imunski odziv. P. vivax, P. ovale in P. malariae povzročajo nizko stopnjo parazitemije, blago anemijo, redko tudi razpočenje vranice in nefrotski sindrom (12). Za malarijo značilni ponavljajoči se izbruhi zvišane telesne temperature so rezultat sočasnega razpočenja eritrocitov, iz katerih se sprostijo merociti. Ponovni izbruhi bolezni se pojavljajo pri tistih oblikah plazmodija, ki imajo izveneritro-citni cikel, saj lahko speča oblika parazita v jetrih po nekaj tednih ali mesecih povzroči ponovno okužbo. P. falciparum ne povzroča ponovnih izbruhov, njegov eritrocitni cikel pa traja 48 ur, zato povzroča t. i. maligno terciarno malarijo; terciarno zato, ker se zvišana telesna temperatura ponovi vsak tretji dan, ter maligno, ker je najnevarnejša oblika malarije in lahko smrtna. P. vivax povzroča benigno terciarno malarijo; benigno, ker je milejša oblika in redko smrtna. Ponovni izbruhi bolezni se lahko pojavijo še leta po prvotni okužbi, tako kot tudi po okužbi s P. ovale. Slednji povzroča redko obliko terciarne malarije. P. malariae ima 72-urni cikel in povzroča kvartarno malarijo, brez ponovnih izbruhov (9). 3 REGISTRIRANI ANTIMALARIKI Klorokin je zdravilo prvega izbora za zdravljenje malarije, ki jo povzroča P. vivax. V območjih, kjer se je pojavila odpornost na klorokin, se ta oblika malarije zdravi z artemisinin-skim kombiniranim zdravljenjem (ACT - angl. artemisinin combination therapy), v katerem je poleg artemisinina ali njegovega derivata še antimalarik z drugim mehanizmom delovanja. Od leta 2001 je ACT tudi zdravilo prvega izbora za zdravljenje nezapletene malarije, ki jo povzroča P. falci-parum. Najpogostejši kombinaciji ACT-ja sta artesunat-meflokin, ki je manj učinkovit v območjih z rezistenco na meflokin, in artemeter-lumefantrin (6). 3.1 KINOLINI Plazmodij sintetizira proteine iz aminokislin, ki jih pridobi z razgradnjo gostiteljevega hemoglobina v parazitovi pre-hrambni vakuoli. Pri tem se sprosti hem, ki bi v parazitu lahko sprožil oksidativni stres, saj ga zaradi odsotnosti encima hem oksigenaze ne more razgraditi po enakem principu kot vretenčarji. V parazitu se je zato razvila alternativna pot razstrupljanja hema, ki vodi do nastanka kristalov, imenovanih hemozoin (malarijski pigment). Kinolini povzročijo smrt parazita, tako da preprečijo kristalizacijo hema v he-mozoin (7). Med kinolini z delovanjem na proces razstrupljanja hema sta dve strukturno različni skupini: aminoalkoholi (kinin, meflokin, halofantrin, lumefantrin) (Slika 2) in 4-aminokino-lini (klorokin, amodiakin, piperakin, naftokin, pironaridin) (Slika 3). Kinin, prvi znani antimalarik, so začeli uporabljati v 17. stoletju (13). V tridesetih letih 20. stoletja ga je zamenjal klorokin, ki je najpomembnejši in najpogosteje uporabljeni antimalarik do danes (14). S širitvijo odpornosti na klorokin se je začel pospešen razvoj novih aminokinolinov in aminoalkoholov, npr. meflokin, amodiakin, halofantrin. Danes je odpornost na posamezne kinoline zelo razširjena (7). 8-Aminokinolini (Slika 4), med njimi je najpomembnejši primakin, delujejo na izveneritrocitne oblike plazmodija (ga-metociti P. falciparum, hipnociti P. vivax) (7). 3.2 ARTEMISININ IN NJEGOVI DERIVATI V kitajski tradicionalni medicini se enoletni pelin (Artemisia annua) uporablja že več kot dve tisočletji, sprva za zdravljenje hemoroidov, od 16. stoletja dalje pa tudi kot antipi-retik. V sedemdesetih letih 20. stoletja so odkrili njegovo antimalarijsko aktivnost. Za delovanje je odgovoren arte- 3 o i! LU č OT Z < Z N O LU a LU cc Q_ Slika 2: Strukture aminoalkoholov: kinin, meflokin, lumefantrin in halofantrin Figure 2: Structures of aminoalcohols: quinine, mefloquine, lumefantrine and halofantrine. LU o LU CC CL LU CC CL LU ž CC O N r klorokin Cl CH, pironaridin Slika 3: Strukture 4-aminokinolinov: klorokin, amodiakin, naftokin, piperakin in pironaridin Figure 3: Structures of 4-aminoquinolines: chloroquine, amodiaquine, naphtoquine, piperaquine and pyronaridine. R = H primakin R = Et pamakin Slika 4: Strukturi 8-aminokinolinov: primakin in pamakin Figure 4: Structures of 8-aminoquinolines: primaquine and pamaquine. plazemske koncentracije) (16). Nizka kupna moč ljudi na malarijsko najbolj ogroženih območjih je spodbudila razvoj antimalarijskih sinteznih peroksidov z enostavnejšo strukturo, saj je njihovo pridobivanje občutno cenejše od izolacije artemisinina iz naravnih virov. Kombinacija arterolana in piperakina je uspešno sklenila tretjo fazo kliničnih raziskav, tako da je prva kombinacija s sinteznim peroksidom. Leta 2012 je bila odobrena v Indiji (17). misinin z endoperoksidno skupino, ki po bioaktivaciji z železovimi ioni (Fe2+) tvori ogljikove radikale. Drugače kot druge oksidativne učinkovine, ki povzročajo neselektivne poškodbe v celicah, naj bi artemisininski radikali delovali bolj specifično. Raziskovalci predvidevajo, da naj bi alkilirali proteine, ne pa tudi DNA (7). Slaba topnost artemisinina tako v hidrofilnih kot v fiziološko sprejemljivih lipofilnih topilih je omogočala le peroralno aplikacijo, ki je sicer praktična, vendar pogosto ni izvedljiva pri bolnikih s hudo obliko malarije. To je spodbudilo razvoj pol-sinteznih derivatov, ki se lahko dajejo peroralno, parente-ralno ali rektalno. Najpomembnejši med njimi so lipofilni (artemeter, arteeter) in hidrofilni (artesunat in artelinska kislina) derivati ter dihidroartemisinin, ki je tudi razgradni produkt prej omenjenih derivatov (Slika 5) (15). V primerjavi z artemisininom imata artemeter in arteeter močnejšo anti-malarijsko aktivnost in boljše farmakokinetične lastnosti. Artemeter je najširše uporabljen derivat v zdravljenju, in sicer v obliki intramuskularnih injekcij ali kot kombinacija z lumefantrinom. Artesunat in artelinska kislina se uporabljata intravensko pri bolnikih s hujšimi oblikami malarije. Artesu-nat je navadno kombiniran z meflokinom ali amodiakinom. Artelinska kislina ima med vsemi derivati najboljši farmako-kinetični profil (najdaljši razpolovni čas in dosega največje 3.3 ZAVIRALCI SINTEZE FOLATA V nasprotju s človekom so plazmodij in ostali mikroorganizmi sposobni de novo sinteze folatnih kofaktorjev, ki sodelujejo v procesih prenosa enot C1. Sintezo tetra-hidrofolata prek dihidropteroata in dihidrofolata katalizirajo za parazite specifični encimi, med drugim tudi dihidropte-roat sintetaza (DHPS) in dihidrofolat reduktaza (DHFR), ki sta že uveljavljeni antibakterijski in antimalarijski tarči. Za dosego sinergističnega delovanja in manjše možnosti pojava odpornosti se pri zdravljenju malarije uporablja kombinacija zaviralca DHPS (sulfadoksin, dapson) (Slika 6) z zaviralcem DHFR (pirimetamin, progvanil in klorprogvanil) (Slika 7). Najpogostejša je kombinacija sulfadoksina in pi-rimetamina, vendar pa je odpornost vedno pogostejša (18). V tretji fazi kliničnih raziskav je tudi kombinacija sulfame-toksazola in trimetoprima, ki naj bi bila preventivna zaščita (17). 3.4 INHIBICIJA TRANSPORTA ELEKTRONOV Atovakon (Slika 8) je eden prvih antimalarikov, ki so bili razviti z racionalnim načrtovanjem zdravil (19). Po strukturi je analog koencima Q v dihalni verigi in poleg izgube mito- artemisinin 0-0 '"O' arterolan (OZ277) IMÎH (H2 h,c- r ime derivata h dihidroartemisinin ch3 artemeter ch2ch3 arteeter _/ \—cooh artelinska kislina artesunat Slika 5: Strukture artemisinina, njegovih derivatov in arterolana Figure 5: Structures of artemisinin, artemisinin derivatives and arterolane. h,n o o n^ n h' ° sulfadoksin h,n O O \V/ nh, h,n dapson O O H sulfametoksazol Slika 6: Strukture zaviralcev dihidropteroat sintetaze Figure 6: Structures of dihidropteroat synthetase inhibitors. 3 O Ž LU č œ z < z N O LU _l O LU cc Q_ pirimetamin Slika 7: Strukture zaviralcev dihidrofolat reduktaze Figure 7: Structures of dihydrofolate reductase inhibitors. hondrijskega membranskega potenciala zavira tudi biosin-tezo pirimidina. Zaradi hitrega pojava odpornosti na atova-kon ga je treba kombinirati z drugimi antimalariki (20). 3.5 TARČE ANTIBIOTIKOV V PLAZMODIJU 0 ho^il. h O ^J Slika 8: Struktura atovakona h /J Figure 8: Structure of atovakon atovaquone. Tudi nekateri antibiotiki imajo antimalarijsko delovanje. Te-traciklini (doksiciklin, tetraciklin), ki se uporabljajo samostojno za preventivno zdravljenje malarije, se pri zdravljenju kombinirajo z drugim hitreje delujočim antimalarikom. Rifampicin in makrolidi (azitromicin, klindamicin) pa so trenutno še v kombinacijah z drugimi antimalariki v procesu kliničnih preskušanj (21). Pri bakterijah omenjeni antibiotiki zavirajo sintezo proteinov v ribosomih - rifampicin prepreči njihovo transkripcijo, makrolidi in tetraciklini pa njihovo tran-slacijo (13). Pri plazmodiju prav tako zavirajo sintezo pro- teinov, molekulske tarče pa so še predmet raziskovanja, saj so plazmodijeve ribosomske komponente, ki so podobne bakterijskim, v apikoplastu in mitohondriju (22). LJJ o LJJ CC Q_ LJJ CC CL LJJ S CC o N 4 ANTIMALARIKI V KLINIČNIH RAZISKAVAH Metilensko modro (Slika 9) je bila prva sintezna spojina, ki se je začela uporabljati v zdravljenju. Dandanes jo še vedno uporabljamo za zdravljenje methemoglobinemije. Do odkritja klorokina se je metilensko modro uporabljalo tudi v antimalarijskem zdravljenju. Po odkritju klorokina je njegova uporaba pri zdravljenju malarije povsem zamrla, verjetno tudi zaradi neškodljivega, a motečega stranskega učinka - zelenega oz. modrega seča in modrikastih beločnic. Metilensko modro doseže antimalarijsko delovanje s kompe-titivno inhibicijo parazitove glutation reduktaze, kar povzroči oksidativni stres (23). V drugi fazi kliničnih raziskav so pokazali, da ima kombinacija metilensko modrega z artesu-natom učinkovito gametocidno delovanje (24). Kombinacije metilensko modrega s kinolini ali artemisinini so tako še predmet kliničnih raziskav (25). Velik uspeh med potencialnimi novimi antimalariki so spi-roindoloni, ki so v samo petih letih prešli od odkritja do kliničnih raziskav. Antimalarijsko delovanje dosežejo z znižanjem sinteze proteinov. Najobetavnejši kandidat, NITD609 (Slika 9), je trenutno v drugi fazi kliničnih raziskav (17). Sevuparin je heparinski derivat z manjšo antikoagulacijsko aktivnostjo, ki preprečuje zlepljenje eritrocitov in s tem hudo obliko malarije (26). Trenutno je kombinacija sevuparin-ato- vakon-progvanil v drugi fazi kliničnih raziskav (clini-caltrials.gov: NCT01442168). Albitiazolijev bromid (SAR97276) (Slika 9) je bistiazolna sol, ki je mimetik holina in zavira plazmodijevo de novo biosin-tezo fosfatidilholina na več stopnjah. Albitiazolijev bromid je v obliki intramuskularnih injekcij v drugi fazi kliničnih raziskav (27). Fosmidomicin (Slika 9) je encimski zaviralec v od mevalo-nata neodvisni izoprenoidni biosintezi v apikoplastu (28). Kombinacija fosmidomicina s klindamicinom je prav tako v drugi fazi kliničnih raziskav (29). 5 POTENCIALNE NOVE TARČE V PLAZMODIJEVIH METABOLNIH POTEH V plazmodijevih metabolnih procesih je udeleženih veliko encimov in njihovih substratov, prenašalcev, receptorjev, ostalih proteinov in lipidov, ki so možne tarče za nove an-timalarijske učinkovine. Razvoj učinkovine, ki deluje na drugo tarčo v metabolni poti, za katero že imamo antima-larik, lahko s kombiniranim zdravljenjem povzroči sinergi-stično delovanje in počasnejši razvoj odpornosti. Za iskanje novih antimalarikov so primernejše tarče, ki niso homolo-gne s pripadajočimi človeškimi, saj omogočajo boljšo selektivnost. CC O Q_ ID O LJJ CC O g 00 ^ O o LO Q_ O cc £ o CITOKROM P450 -OKSIDOREDUKTAZA (POR) V BIOSINTEZI HOLESTEROLA CYTOCHROME P450 -OXIDOREDUCTASE (POR) IN THE BIOSYNTHESIS OF CHOLESTEROL AVTORJA / AUTHORS: prof. dr. Damjana Rozman asist. dr. Klementina Fon Tacer, dr.vet.med. Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani, Inštitut za biokemijo, Center za funkcijsko genomiko in bio-čipe, Zaloška 4, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: klementina.fon-tacer@mf.uni-lj.si 1 UVOD Holesterol je pomemben gradnik membran živalskih celic, potreben tudi za nemoteno delovanje živčnega sistema in razvoj moških spolnih celic. Poleg strukturne vloge ima holesterol pomembno vlogo kot izhodna spojina v biosintezi številnih biološko aktivnih molekul, kot so žolčne kisline in steroidni hormoni. Nenazadnje pa je holesterol ključen tudi POVZETEK Holesterol ima številne fiziološke vloge v organizmu sesalcev in je ključen za razvoj zarodka. Genetske napake v biosintezi holesterola so vzrok različnih prirojenih napak. Patogeneza prirojenih napak je posledica tako pomanjkanja holesterola kot tudi škodljivih učinkov sterolnih intermediatov, ki se kopičijo. Lanosterol 14a-demetilaza (CYP51) katalizira prvi korak poznega dela biosinteze holesterola. Za svoje delovanje potrebuje donorja elektronov, cito-krom P450-oksidoreduktazo (POR). Pri nekaterih pacientih s sindromom podobnim Antley-Bixler-ju so ugotovili mutacije v genu POR. Poleg tega so podobne teratogene simptome opazili pri otrocih žensk, ki so med nosečnostjo uživale azole, močne inhibitorje glivnih CYP51, ki se uporabljajo pri zdravljenju sistemskih mikoz. Ugotovitvi nakazujeta, da pride do razvojnih motenj zaradi napak v biosintezi holesterola na ravni CYP51. Z našim delom smo želeli ugotoviti vpliv citokrom P450-oksidoreduktaze na biosintetsko pot holesterola v jetrih. Z analizo HPLC smo določili sterolni profil (količino holesterola, lanosterola, 7-dehidroholesterola, lato-sterola, FF-MAS in T-MAS) v jetrih miši, ki imajo tki-vno-specifično izničeni gen POR v jetrih. Ugotovili smo, da izničenje Por povzroči kopičenje lanoste-rola v jetrih, kjer je normalno lanosterola in ostalih sterolnih intermediatov razen holesterola zelo malo ali so celo pod mejo detekcije. Mutirane miši imajo v primerjavi s kontrolnimi živalmi 35-krat več lanosterola (397 ^g/g proti 11 ^g/g). Kljub velikemu kopičenju lanosterola se količina celokupnega holesterola v jetrih ni bistveno spremenila, ostali ste-roli pa so bili pod mejo detekcije v obeh skupinah. Naši rezultati kažejo, da je POR obvezni in nezamenljivi donor elektronov predvsem pri CYP51 posredovani reakciji. Brez POR se pretvorba lanosterola in najverjetneje tudi sinteza holesterola de novo ustavi. Kljub temu se količina holesterola v jetrih ne spremeni, saj homeostatski mehanizmi omogočijo uravnavanje koncentracije holesterola v jetrih s prevzemom LDL iz prehrane KLJUČNE BESEDE: holesterol, citokromi P450, CYP51, lanosterol, Antley-Bixler-jev sindrom ABSTRACT Cholesterol has several important physiological functions in mammals and is also indispensable during embryogenesis. Genetic defects of the cholesterol biosynthetic pathway lead to different inborn errors. The phenotypic abnormalities are caused by cholesterol deficiency and accumulation of intermediate sterols. Lanosterol 14a-demethylase (CYP51) catalyses the first step following cyclization of squa-lene in cholesterol biosynthesis. CYP51 requires cytochrome P450 oxidoreductase (POR) that is the obligate electron donor for the reaction. Some patients with Antley-Bixler syndrome have mutations in the POR gene. A similar phenotype was also observed after early in utero exposure to azoles, which are inhibitors of fungal CYP51 used to treat systemic mycoses. The reason in both cases might be the inhibition of cholesterol biosynthesis on the level of CYP51. The aim of our work was to determine the effect of cytochrome P450- oxidoreductase on cholesterol biosynthesis in liver. We used HPLC analysis to profile sterols (cholesterol, lanosterol, 7-dehydrocholesterol, lathosterol, FF-MAS and T-MAS) in the liver of wild mice and liver specific Por knock-out mice. We show that Por deletion caused strong accumulation of lanosterol. We observed 35-fold induction compared to wild type (397 ^g/g vs. 11 ^g/g). Despite the buildup of lanosterol, the amount of total liver cholesterol did not change. Our results confirm POR as an obligate and unchangeable electron donor for CYP51 mediated reaction. POR deficiency inhibits lanosterol conversion to FF-MAS as well as cholesterol biosynthesis de novo. Home-ostatic mechanisms are able to regulate cholesterol level, most probably through uptake of exogenous cholesterol from diet. KEY WORDS: cholesterol, cytochromes P450, CYP51, lanosterol, Antley-Bixler syndrome pri delovanju proteina Hedgehog (Hh) (1), ki uravnava em-brionalni razvoj (2). Molekula holesterola nastane v seriji več kot 30 reakcij in vseh 27 ogljikovih atomov holesterola izvira iz molekule acetil-CoA z 2 ogljikovima atomoma. Lanosterol je prvi ciklični intermediat v biosintetski poti (3), ki se v seriji deme-tilacij, redukcij in oksidacij pretvori v holesterol (Slika 1) (4). Po lanosterolu pa se biosintezna pot loči na dve možni veji z intermediati, ki imajo nasičeno (5) ali nenasičeno (6) A24-vez (Slika 1). Intermediati pred-lanosterolnega dela zalagajo celico s številnimi biološko pomembnimi molekulami, kot sta koencim Q10 in hem A (7). Tudi intermediati poznega dela imajo potencialne svoje biološke vloge. Dva sterola so izolirali iz spolnih žlez sesalcev in vplivata na razvoj in kvaliteto jajčnih celic (8, 9), iz 7-dehidroholesterola pa nastane vitamin D. Poleg tega so z nedavnimi raziskavami pokazali, da so pravzaprav sterolni intermediati tisti, ki so ključni za pato-genezo genetskih obolenj biosinteze holesterola (10). Le-ti _ se kopičijo in povzročijo napake pri fuziji obraznih struktur z (10) in razvoja las (11). ^ Ž V po-lanosterolnem delu biosintetske poti je opisanih šest prirojenih napak, ki so posledica mutacij v holesterogenih NST genih (12) in imajo določene skupne fenotipske značilnosti. < Antley-Bixler-jev sindrom (ABS) nastane kot posledica mu- ^ tacij v različnih genih, največkrat v receptorju fibroblastnih 3 rastnih faktorjev 2 (FGFR2). Fenotip podoben ABS so opa- z zili tudi pri otrocih, ki so bili v maternici izpostavljeni fluko- ^ nazolu, antimikotiku in inhibitorju lanosterol 14a-demetilaze O (CYP51) (13). Azoli se pogosto uporabljajo v kmetijstvu in tudi za zdravljenje živali in ljudi. Njihovo delovanje temelji na inhibiciji glivnega CYP51 (14). CYP51 katalizira demeti-lacijo lanosterola v biosintezni poti sterolov (15). Tako so pozornost pri pacientih z ABS usmerili tudi na CYP51 in sintezo holesterola (16, 17). V fibroblastih nekaterih pacientov, tistih brez mutacij v FGFR2, so ugotovili povečano količino lanosterola. Kopičenje lanosterola, ki je substrat encima CYP51, kaže na neaktivnost encima (18). Vendar pri pacientih mutacij v samem CYP51 niso našli (19), kasneje pa so odkrili, da je pri teh pacientih okvarjen gen za citokrom P450-oksidoreduktazo (POR) (20, 21). Protein POR je donor elektronov v številnih oksidoreduktivnih reakcijah, predvsem kataliziranih s citokromi P450. V biosintezi holesterola sta to 14a-demetilacija lanosterola s CYP51 in monooksigenacija skvalena s svalen-monooksigenazo (SQLE) (14). 3 o cc LU H OT ÜJ _I 0 1 Ñ üj OT O CO > CC O Q_ ID Q ÜJ CC O g oo O o LO CL O cc £ O Slika 1: Shema biosinteze holesterola. Kratice encimov predstavljajo simbol UniGene. HMGCR- HMG-CoA-reduktaza; LBR- lamin B receptor; TM7SF2- 14-dehidroholesterol-reduktaza; SC4MOL- sterol C4-metil-oksidaza, NSDHL-3-@-hidroksi-A5-steroid-dehidrogenaza, HSD3B3- 3^-ketosteroid-reduktaza, EBP-sterol-8,7izomeraza; SC5D- sterol-C5 desaturaza; DHCR7- 7-dehidroholesterol-reduktaza, POR- citokrom P450-oksidoreduktaza. FF-MAS- mejozo aktivirajoči sterol iz folikularne tekočine, 4,4-dimethyl-5a-cholesta-8,14,24-triene-3fi-ol; T-MAS- mejozo aktivirajoči sterol iz mod. Figure 1: Schematic representation of post-squalene part of cholesterol biosynthesis. Abbreviations of enzyme names correspond to UniGene Symbols. HMGCR- HMG-CoA reductase; LBR- lamin B receptor; TM7SF2- 14-dehydrocholesterol reductase; SC4MOL- sterol C4-methyl oxidase, NSDHL- 3-fi-hydroxy-A5-steroid dehydrogenase, HSD3B3- 30-keto-steroid reductase, EBP- sterol 8, 7 isomerase; SC5D- sterol- C5 desaturase; DHCR7- 7-dehydrocholesterol reductase. FF-MAS- follicular fluid meiosis activating sterol, 4,4-dimethyl-5a-cholesta-8,14,24-triene-3fi-ol; T-MAS- testis meiosis activating sterol, 4,4-dimethyl-5a-cholesta-8,24-diene-3fi-ol. Da bi preučiti vpliv POR na metabolizem holesterola, smo analizirali sterolni profil v jetrih miši z izničenim genom Por. 2 MATERIALI IN METODE Jetra miši divjega seva in L-PORKO (miši z izničenim genom Por v jetrih) smo dobili iz laboratorija prof. dr. Ro- landa Wolfa (University of Dundee) (pet v vsaki skupini) Analizo sterolov smo izvedli po že opisanem postopku (22) z manjšimi spremembami. Iz zamrznjenih in posušenih jeter (angl. freeze-dried) smo ekstrahirali lipide v ekstrakcijski tekočini (75% n-heptan : 25% izopropanol (v/v)). Organsko fazo smo posušili in ekstrahirane lipide umilili z enourno in-kubacijo v raztopini 10% KOH v 80% etanolu pri 60°C. Po alkalni hidrolizi smo pH uravnali z 1M KH2PO4 in ponovno izvedli ekstrakcijo, kot je opisana zgoraj. Organsko fazo smo posušili, raztopili v mobilni fazi za analizo HPLC z normalno fazo in izvedli ločitev na koloni ChromSpherSi, 5 ^.m, 250x4.6 mm (Varian) z mobilno fazo 99,5% n-heptan (J.T.Baker):0,5% izopropanol (J.T. Baker) (v/v) s pretokom 1,00 mL/min. Količino holesterola smo določili na osnovi kromatograma analize z normalno fazo pri 200 nm. Ker se lanosterol in T-MAS na normalni fazi ne ločita, smo frakcijo z intermediati (8-20 minut) polovili, posušili, raztopili v ace-tonitrilu in jih analizirali s pomočjo separacije na reverzni fazi na koloni C8-LiChrospher RP-8, 5 ^m, 250x4,6 mm (Varian) z mobilno fazo (v/v) 93% acetonitril (Fischer Scien-tific):7% vode s pretokom 1,00 mL/min. Na osnovi reten-cijskih časov (RT) standardov smo lahko določili lanosterol (Sigma L5768; RT 24,5 min na reverzni fazi in holesterol (Steraloids C6760; RT 21,3 min na normalni fazi), medtem ko so bili 7-dehidroholesterol (Steraloids C3000), latosterol (Steraloids C7400-000) in T-MAS in FF-MAS (laboratorijski standardi (22) pod mejo detekcije. 3 REZULTATI IN RAZPRAVA Želeli smo preučiti vlogo citokrom P450-oksidoreduktaze (POR) na biosintezo holesterola v jetrih. Citokrom P450-oksidoreduktaza (POR) namreč sodeluje kot donor elek- tronov pri dveh reakcijah v biosintezni poti, pri monooksi-genaciji skvalena s skvalen-epoksidazo in pri 14a-demeti-laciji lanosterola s CYP51 (Slika 1). Razvita sta bila dva modela miši z izničenim genom Por specifično v jetrih (L-PORKO) (23, 24). V jetrih miši divjega seva in L-PORKO (23) smo analizirali sterolni profil. Določili smo količino holesterola in lanosterola (Slika 2), medtem ko je bila količina 7-dehidroholesterola, latosterola, FF-MAS in T-MAS pod mejo detekcije. Količina lanosterola je v jetrih miši L-PORKO 35-krat povečana (397,48±138,87 ^g/g vs. 11,55±5,17 ^g/g; Slika 2A in B). Lanosterol je substrat za CYP51-posredovano reakcijo. Njegovo kopičenje kaže na to, da je CYP51 neaktiven in da je za CYP51 POR nezamenljiv donor elektronov. Monooksigenacija skvalena je v biosintezni poti pred CYP51 (Slika 1) in očitno poteče kljub odsotnosti POR. Skvalen-monooksigenaza ima verjetno alternativni vir elektronov, kot na primer citokrom b5/NADH-reduktazo (25). Kljub velikemu kopičenju lanosterola, ki kaže na to, da je sinteza holesterola na ravni CYP51 močno inhibirana ali celo ustavljena, se količina celokupnega holesterola v jetrih ni bistveno spremenila (4233,54±837,14 ^g/g vs. 5104,10±1869,77 ^g/g; Slika 2C in D). Ko količina holesterola pade, transkripcijski faktor SREBP2 namreč aktivira tako biosintezno pot kot tudi prevzem holesterola iz plazme LA o NI E TVE S N A N Z RI O Slika 2: Količina lanosterola in holesterola v jetrih miši z izničenim genom Por. Reprezentativni kromatogrami lanosterola (puščica) po analizi HPLC z reverzno fazo (A) in holesterola (puščica) z normalno fazo (C). Na osnovi kromatogramov smo določili količino lanosterola (B) in holesterola (D) v jetrih miši divjega seva (beli stolpci) in miši z izničenim genom Por (črni stolpci). Rezultati predstavljajo srednjo vrednost in standardno deviacijo petih živali. Figure 2: Lanosterol and cholesterol amount in the liver of wild type and liver specific Por knock-out mice. Representative reverse phase (A) and straight phase (C) HPLC chromatograms of lanosterol (A) and cholesterol (C) analysis. Quantification of lanosterol (B) and cholesterol (D) in the liver of wild type (white bars) and liver specific Por knock-out (black bars) mice. Results represent mean ± SD of 5 animals. 3 o cc LU I— OT LU _l O zu Ñ LU OT O CO > CC O CL ZD Q LU CC O g 00 ^ O o LO CL o cc Ü o preko z receptorjem LDL posredovane endocitoze (26). V jetrih miši L-PORKO je povišano izražanje holesterogenih genov, vendar to ne zadostuje za sintezo holesterola (24). Povečan pa je tudi prevzem lipoproteinov LDL, kar kaže znižana raven serumskega holesterola za 65% pri miših L-PORKO (23). 4 SKLEP Z našo analizo smo pokazali, da je encim citokrom P450-reduktaza nujen pri 14a-demetilaciji lanosterola v biosinte-zni poti holesterola. Posledica napak v genu Por oziroma eksperimentalno izničenje gena je neaktivnost encima POR in posledična inhibicija CYP51 in akumulacija lanosterola. Metilirani steroli pa ne morejo funkcionalno zamenjati holesterola (5), kar je skupaj s pomanjkanjem holesterola ključno pri patogenezi ABS in teratogenem delovanju azolov. Kljub temu, da je biosintetska pot prekinjena, pa je količina holesterola nespremenjena, najverjetneje zaradi homeo-statskih mehanizmov, ki omogočajo uravnavanje količine holesterola na ravni prevzema holesterola iz LDL delcev. 5 LITERATURA Incardona JP, Eaton S. Cholesterol in signal transduction. Curr Opin Cell Biol 2000; 12: 193-203. Bijlsma MF, Spek CA, Peppelenbosch MP. Hedgehog: an unusual signal transducer. Bioessays 2004; 26: 387-394. Waterham HR, Wanders RJ. Biochemical and genetic aspects of 7-dehydrocholesterol reductase and Smith-Lemli-Opitz syndrome Biochim Biophys Acta 2000; 1529: 340-356. Liscum L. Cholesterol biosynthesis. In: Vance DE, Vance JE, eds. Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes. Elsevier 2002; 409-431. Bloch KE. Sterol structure and membrane function. CRC Crit Rev Biochem 1983; 14: 47-92. Kandutsch AA, Russell AE. Preputial Gland Tumor Sterols. J Biol Chem 1960; 235: 2256-2261. Goldstein JL, Brown MS. Regulation of the mevalonate pathway. Nature 1990; 343: 425-430. Byskov AG, Andersen CY, Nordholm L, et al. Chemical structure of sterols that activte oocyte meiosis. Nature 1995; 374: 559562. Bokal EV, Fon Tacer K, Vrbnjak M, et al. Follicular sterol composition in gonadotrophin stimulated women with polycystic ovarian syndrome. Mol Cell Endocrinol 2006; 249: 92-98. 10. Engelking LJ, Evers BM, Richardson JA, et al. Severe facial clefting in Insig-deficient mouse embryos caused by sterol accumulation and reversed by lovastatin. J Clin Invest 2006; 116: 2356-2365. 11. Evers BM, Farooqi MS, Shelton JM, et al. Hair Growth Defects in Insig-Deficient Mice Caused by Cholesterol Precursor Accumulation and Reversed by Simvastatin. J Invest Dermatol 2010; 130(5):1237-48. 12. Porter FD, Herman GE. Malformation syndromes caused by disorders of cholesterol synthesis. J Lip Res 2011; 52 6-34. 13. Horvat S, Mcwhir J, Rozman D. Defects in cholesterol synthesis genes in mouse and in humans: lessons for drug development and safer treatments. Drug Metabolism Reviews 2011; 43: 6990. 14. Rozman, D, Monostory K. Perspectives of the non-statin hypolipidemic agents. Pharmacology & Therapeutics 2010; 127: 19-40. 15. Stromstedt M, Rozman D, Waterman MR. The ubiquitously expressed human CYP51 encodes lanosterol 14a-demethylase, a cytochrome P450 whose expression is regulated by oxysterols. Arch Biochem Biophys 1996; 329: 73-81. 16. Aleck KA, Bartley DL. Multiple malformation syndrome following fluconazole use in pregnancy: report of an additional patient. Am J Med Genet 1997; 72: 253-256. 17. Reardon W, Smith A, Honour JW, et al. Evidence for digenic inheritance in some cases of Antley-Bixler syndrome? J Med Genet 2000; 37: 26-32. 18. Keber R, Motaln H, Wagner KD, et al. Mouse knockout of the cholesterogenic cytochrome P450 lanosterol 14 alpha-demethylase (CYP51) resembles Antley-Bixler syndrome. J Biol Chem 2011; 286(33): 29086-97. 19. Kelley RI, Kratz LE, Glaser RL et al. Abnormal sterol metabolism in a patient with Antley-Bixler syndrome and ambiguous genitalia. Am J Med Genet 2002; 110: 95-102. 20. Fluck CE, Tajima T, Pandey AV, et al. Mutant P450 oxidoreductase causes disordered steroidogenesis with and without Antley-Bixler syndrome. Nat Genet 2004; 36: 228-230. 21. Fukami M, Horikawa R, Nagai T, et al. Cytochrome P450 oxidoreductase gene mutations and Antley-Bixler syndrome with abnormal genitalia and/or impaired steroidogenesis: molecular and clinical studies in 10 patients. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90: 414-426. 22. Baltsen M, Byskov AG. Quantitation of meiosis activating sterols in human follicular fluid using HPLC and photodiode array detection. Biomed. Chromatogr 1999; 13: 382-388. 23. Henderson CJ, Otto DM, Carrie D, et al. Inactivation of the hepatic cytochrome P450 system by conditional deletion of hepatic cytochrome P450 reductase. J Biol Chem 2003; 278: 13480-13486. 24. Gu J, Weng Y, Zhang QY et al. Liver-specific deletion of the NADPH-cytochrome P450 reductase gene: impact on plasma cholesterol homeostasis and the function and regulation of microsomal cytochrome P450 and heme oxygenase. J Biol Chem 2003; 278: 25895-25901. 25. Lamb DC, Kelly DE, Manning NJ, et al. Biodiversity of the P450 catalytic cycle: yeast cytochrome b5/NADH cytochrome b5 reductase complex efficiently drives the entire sterol 14-demethylation (CYP51) reaction. FEBS Letters 1999; 462: 283-288. 26. Brown MS, Goldstein JL. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell 1997; 89: 331-340. POMEN OCENE ALBUMINURIJE IN PROTEINURIJE PRI NOVOODKRITIH BOLNIKIH S SLADKORNO BOLEZNIJO TIPA 2 THE ROLE OF ALBUMINURIA AND PROTEINURIA ASSESSMENT IN NEWLY DIAGNOSED TYPE 2 DIABETES PATIENTS AVTORJI / AUTHORS: Brigita Mavsar-Najdenov, mag. farm., spec. klinične farmacije1 prim. Igor Rus, dr. med. spec. interne medicine2 doc. dr. Ivica Avberšek Lužnik, mag. farm. spec. klinične biokemije3 1 Splošna bolnišnica Jesenice, Lekarna 2 Splošna bolnišnica Jesenice, Center za hemodializo in CAPD 3 Splošna bolnišnica Jesenice, Oddelek za laboratorijsko diagnostiko NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E-mail: brigita.mavsar-najdenov@sb-je.si POVZETEK Ocenjena skupna prevalenca sladkorne bolezni v Sloveniji je podobna kot v razvitem svetu in se giblje med 4 in 6 %. Za zgodnje odkrivanje ledvične bolezni pri novoodkritih bolnikih s sladkorno boleznijo tipa 2 (SBT2) uporabljamo kazalce ledvičnega delovanja (ocena glomerulne filtracije (oGF)) in kazalce okvare ledvic (albuminurija (ACR) in proteinurija (PCR)). Namen naše raziskave je bil ugotoviti prevalence znižane oGF in bolezenske albuminurije ter bolezenske proteinurije pri novoodkritih bolnikih s SBT2. V raziskavo smo vključili 85 bolnikov s SBT2. Vsem bolnikom smo izmerili oGF, ACR in PCR. Ugotovili smo, da ima med 85 bolniki s SBT2 17 bolnikov znižano oGF, 27 bolnikov pa bolezensko albuminurijo. Med 58 bolniki brez albuminurije so trije bolniki z bolezensko proteinurijo. Med 68 bolniki z normalno oGF pa je kar 22 bolnikov z bolezensko albuminurijo oz. 18 bolnikov z bolezensko proteinu-rijo. Navedeni rezultati so pokazali, da so tudi v skupini bolnikov brez bolezenske albuminurije in v skupini bolnikov z normalno oGF, bolniki, ki imajo zaradi bolezenske proteinurije večje tveganje za razvoj srčno žilnih bolezni in bolezni ledvic. Pri teh bolnikih lahko s pravočasno in selektivno uvedeno terapijo zmanjšamo tveganje za nastanek srčno žilnih bolezni in bolezni ledvic. LA o ž E TVE S N A N Z KLJUČNE BESEDE: sladkorna bolezen tipa 2, glomerulna filtracija, albuminurija, proteinurija cc O POVZETEK The estimated prevalence of diabetes in Slovenia is similar to most countries of the developed world, ranging between 4 and 6%. Markers of renal function (glomerular filtration rate (GFR)) and markers of renal damage (albuminuria (ACR) and proteinuria (PCR)) are used for the early detection of renal disease in newly diagnosed type 2 diabetes patients. The aim of our study was to assess the prevalence of reduced GFR and increased ACR and PCR in newly diagnosed type 2 diabetes patients. 85 newly diagnosed type 2 diabetes patients were included in the study . We measured GFR, ACR and PCR in all of them. We found that in 85 type 2 diabetes pa- AP O ~2 Z Z E L O m O N R § D LAD S S i O m R ^ D O VOO O R P E 22 CC U O R P E 22 CC U U m L A E N E C O O P tients 17 patients had reduced GFR, while 27 of them had pathological albuminuria. In 58 patients that did not have albuminuria, we found 3 patients with pathological proteinuria. In 68 patients with normal GFR, 22 had pathological albuminuria and 18 had pathological proteinuria. The reported results show that a proportion of patients with no albuminuria and normal GFR have a higher risk of developing cardiovascular and renal disease due to pathological proteinuria. In these patients we can introduce measures early in the course of disease to reduce their risk of cardiovascular and renal morbidity. KEY WORDS: type 2 diabetes, albuminuria, proteinuria, glomerular filtration rate 1 UVOD Sladkorna bolezen (SB) je obsežen zdravstveni problem, ki bolnike izpostavi povečanemu tveganju za nastanek srčno žilnih bolezni in bolezni ledvic. Je med najpogostejšimi vzroki za napredovanje ledvične bolezni do končne odpovedi ledvic, ki zahteva nadomestno zdravljenje. Bolniki s končno odpovedjo ledvic imajo dokazano značilno višjo smrtnost, obolevnost in nižjo kakovost življenja (1). Pri odkrivanju bolnikov s kronično ledvično boleznijo (KLB) in na-daljni opredelitvi KLB kot diabetične ledvične bolezni (DLB) ali kot kronične ledvične bolezni druge etiologije uporabljamo kazalce ledvičnega delovanja in bolezni ledvic. Najpogosteje uporabljeni kazalec ledvičnega delovanja je ocena glomerulne filtracije (oGF). Za oceno in spremljanje napredujoče bolezni ledvic pa sta uporabna kazalca albu-minurija in proteinurija (2). Pri bolnikih s SB je merjenje al-buminurije pomembno za zgodnje odkrivanje DLB, medtem ko je prisotnost proteinurije pomemben dejavnik tveganja za napredovanje DLB. Albuminurija je bolj občutljiv kazalec za odkrivanje KLB od proteinurije, kar potrjuje tudi študija Atkins s sod., ki navaja, da 67,5% nediabetikov z albuminurijo nima proteinurije in da samo 8% nediabetikov s proteinurijo nima albuminurije (3). Proteinurija (več kot 0,150 g/dan) je kazalec ledvične bolezni in predstavlja po- memben dejavnik tveganja za napredovanje DLB (4). Tveganje za srčno-žilne zaplete se dodatno veča z naraščanjem izločanja proteinov v urinu in zniževanjem oGF. Albuminurija je kazalec KLB, srčno-žilnih bolezni in povečane umrljivosti, ne glede na prisotnost sladkorne bolezni (5). Dokazano je, da se tako pri diabetični, kakor tudi ne-diabetični ledvični bolezni delovanje ledvic pri večji vrednosti proteinurije hitreje slabša. (6) Bolniki s sladkorno boleznijo tipa 2 (SBT2) in z okvarjenim delovanjem ledvic imajo v primerjavi z bolniki s SBT2 brez okvarjenega delovanja ledvic, povečano tveganje za smrtnost. Kot vzrok za povečano smrtnost izstopajo zapleti in bolezni na srčno žilnem sistemu (7). Pri bolnikih s SBT2 so dokazali, da predstavlja kombinacija albuminurije z zmanjšano oGF, pomemben dejavnik tveganja za napredovanje ledvične okvare in srčnožilnih bolezni (8). Nekatere raziskave kažejo, da imajo bolniki s proteinurijo in normalno oGF slabše klinične izide od bolnikov brez proteinurije, vendar z zmanjšano oGF (9); druge pa, da imajo bolniki z zmanjšano oGF brez proteinurije povečano tveganje za splošno umrljivost od bolnikov z albuminurijo brez zmanjšane oGF (10). Čeprav običajno nastopi albuminurija pred znižanjem oGF, so pri bolnikih s SBT1 in s SBT2, ugotovili primere progresivnega zniževanja oGF brez povečanja albuminurije (11). Al-buminurija in znižana oGF odražata različne patobiokemične mehanizme pri poškodbi ledvic (12). Povečano izločanje albumina v urinu (bolezenska albuminurija) in zmanjšanje glomerulne filtracije sta dokazana dejavnika tveganja za progresivno ledvično bolezen in srčnožilne bolezni. Zgodnje odkrivanje kronične ledvične bolezni (KLB) omogoča uvedbo terapevtskih intervencij v zgodnji fazi, ko so še učinkovite pri zaustavljanju ali preprečevanju napredovanja ledvične bolezni do odpovedi ledvičnega delovanja ter pridruženih zapletov. Za zgodnje odkrivanje KLB pri bolnikih z večjim tveganjem, kamor uvrščamo tudi bolnike s SBT2, mednarodne in slovenske smernice priporočajo uporabo presejalnih testov za oceno albuminurije, proteinurije in glomerulne filtracije (12,13,14). Zaradi vpliva stanja hidracije na koncentracijo različnih beljakovin v urinu, laboratorij vrednosti za albuminurijo podaja kot količnik U- al-bumin/kreatinin (ACR) in vrednosti za proteinurijo kot količnik U-beljakovine/kreatinin (PCR), oboje v g/mol. Spodnja meja bolezenske albuminurije je v različnih državah različna. V naši državi je za bolezensko albuminurijo priporočena vrednost ACR več kot 3g /mol. O bolezenski proteinuriji pa govorimo, ko je vrednost PCR več kot 20 g/mol in ocena dnevne proteinurije več kot 0,150 g/dan (6,15). Za oGF je priporočena enačba MDRD (Modification of Diet in Renal Disease), pri čemer je znižana vrednost opredeljena pod 60 ml/min/1,73 m2. Na podlagi teh ugotovitev smo želeli proučiti populacijo bolnikov z novoodkrito SBT2, ki so bili obravnavani v ambulanti za diabetes Splošne bolnišnice Jesenice. Želeli smo ugotoviti prevalenco ledvične bolezni ter različne vrste ledvičnih okvar pri bolnikih s SBT2. centracijo albumina smo določili v srednjem curku drugega jutranjega vzorca urina. Oceno glomerulne filtracije smo izračunali na podlagi določitve plazemskega kreatinina s standardizirano laboratorijsko metodo s pomočjo enačbe MDRD. Po tej enačbi izračunana oGF velja v območju starosti od 18 do 75 let. V naši skupini preiskovancev je bilo 7 bolnikov starejših od 75 let. Pri teh bolnikih smo uporabili za izračun oGF korekcijski faktor (16). 2 MATERIALI IN METODE V raziskavo smo vključili bolnike z novo odkrito SBT2, ki so bili v obdobju od 01.01.2012 do 30.06.2013 obravnavani v ambulanti za diabetes Splošne bolnišnice Jesenice. Izključili smo nosečnice in bolnike z okužbami, poškodbami, sistemskimi boleznimi, onkološkimi boleznimi ter bolnike, ki se zdravijo s kortikosteroidi in/ali imunosupresivi. Skupno smo zajeli 85 bolnikov, od tega je bilo 42 žensk in 43 moških. Povprečna starost vključenih bolnikov je znašala 61,7 let. V raziskavi smo uporabili laboratorijske rezultate preiskav, ki so bile izvedene v sklopu redne obravnave bolnikov v ambulanti za diabetes Splošne bolnišnice Jesenice. V obdobju od januarja 2012 do junija 2013 je bilo v ambulanti obravnavanih 113 novoodkritih bolnikov s SBT2 (diagnoza jim je bila določena na primarni ravni zdravstvenega varstva, kjer so bili uvedeni prvi ukrepi za zmanjšanje glukoze v krvi). Vključili smo samo tiste bolnike s SBT2, ki so imeli v sklopu ambulantnega pregleda v Splošni bolnišnici Jesenice opravljene laboratorijske preiskave za oceno glikemije (koncentracija glukoze v plazmi (P-Glukoza), glikirani hemoglobin v krvi (HbA1c)), za oceno delovanja ledvic (koncentracija kreatinina v plazmi (P-Krea-tinin), oGF po MDRD), in za oceno proteinov v urinu (ACR, PCR in ocena dnevne proteinurije (oDP)). Analize so bile opravljene na Oddelku za laboratorijsko diagnostiko Splošne bolnišnice Jesenice na analizatorjih Siemens Expand Dimension. Uporabili smo sledeče diagnostične kriterije: bolezenska albuminurija pri vrednosti ACR nad 3,0 g albumina na mol izločenega kreatinina, bolezenska proteinurija pri PCR nad 20,0 g proteinov na mol izločenega kreatinina in ocena ledvične funkcije je znižana pri oGF pod 60ml/ min. Za oceno dnevne proteinurije (oDP) v skladu s priporočili patološke opredelimo vrednosti nad 0,150 mg/dan (12,13,14). Kon- Preiskovance smo razdelili v dva para skupin. Prvi par glede na vrednosti albuminurije in sicer v skupino 1 bolnike z normalno vrednostjo in v skupino 2 bolnike z bolezensko albuminurijo. Ker je pri novoodkritih bolnikih s SBT2 zelo pogosto že znižana funkcija ledvic, smo preiskovance razdelili še na drugi par glede na vrednost oGF in sicer v skupino 1 bolnike z normalno vrednostjo oGF in v skupino 2 bolnike z znižano vrednostjo oGF. Iskali smo statistično pomembne razlike med obema paroma skupin bolnikov, glede na izmerjene parametre (P-Glukoza, HbA1c, P-Kreatinin, ACR, PCR oDP in oGF). Raziskavo je odobrila Komisija za medicinsko etiko Splošne bolnišnice Jesenice, ki je ugotovila, da sta načrt in izpeljava usklajena z načeli Helsinške deklaracije o biomedicinskih raziskavah Svetovnega zdravniškega združenja in z določili Konvencije sveta Evrope za varstvo človekovih pravic in dostojanstva človeškega bitja v zvezi z uporabo biologije in medicine. Prav tako so v načrtu in izvedbi upoštevana načela Kodeksa medicinske deontolo-gije Slovenije, kakor tudi navodila državne komisije za medicinsko etiko. Za statistično analizo podatkov smo uporabili programski paket SPSS Software Statistical Package, version 15.0, SPSS Inc., Chichago, Illinois, USA. Rezultate biokemičnih meritev smo izrazili kot povprečno vrednost s standardno deviacijo (x ± SD) in kot mediano z območjem (min - max) pri parametrih, katerih porazdelitev ni bila normalna. Za testiranje normalnosti porazdelitve podatkov smo uporabili Kolmogorov-Smirnov test. Parametre, ki se med skupinami niso porazdeljevali normalno, smo primerjali s Krus-cal-Wallisovim testom. Rezultate smo opredelili kot statistično značilne pri stopnji tveganja p<0,05. 3 o i! LU č OT Z < Z N CC O £ o ~2 z N LJJ _l O m O z cc § 0 OT OT 1 O m cc O O o cc Q_ LU CC O cc Q_ LJJ ^ CC ID ID m < LJJ z LJJ o O O Q_ 3 REZULTATI Laboratorijske parametre za oceno glikemije, ledvične funkcije in/ali okvare smo izmerili 85 bolnikom s SBT2. Preiskovanci so bili v povprečju stari 61,7 let. Mediana pla-zemskih koncentracij glukoze je znašala 7,7 mmol/L HbAlc pa 7,8%. Koncentracije kreatinina so se gibale v območju od 55 do 149 mmol/L. Kazalci ocene delovanja ledvic in ledvične okvare (ACR, PCR, oDP in oGF) so bili razpršeni v širokem intervalu meritev. Osnovne demografske podatke bolnikov prikazujemo v preglednici 1. Na podlagi določenih vrednosti albuminurije smo v skupino 1 uvrstili bolnike z normalno vrednostjo albuminurije (N=58) in v skupino 2 bolnike z bolezensko albuminurijo (N=27). Izvedli smo primerjavo merjenih parametrov med skupinama. Skupini bolnikov 1 in 2 se po medianah starosti, pla-zemskih koncentracijah glukoze in HbAlc ter kreatinina in oGF, nista značilno razlikovali. Statistično značilne razlike med skupinama pa smo ugotovili pri parametrih albuminu-rije (ACR) in proteinurije (oDP in PCR). Pri pregledu rezultatov pri posameznih bolnikih v skupini 1 smo ugotovili, da je kljub odsotnosti albuminurije prisotna bolezenska pro-teinurija pri treh bolnikih, ki jih je v tej skupini potrebno še posebej natančno obravnavati. Rezultate prikazujemo v preglednici 2. Preglednica 1: Demografske značilnosti in laboratorijski parametri 85 bolnikov z novoodkrito sladkorno boleznijo tipa 2 Table 1: Demographic and laboratory parameters of 85 newly diagnosed type 2 diabetes patients. Parameter starost (leta) 61,7 ± 10,8 spol (moški/ženske) 43/42 P-Glukoza (mmol/L) 7,7 (3,5 - 20,1) HbA1c (%) 7,8 (5,3 - 14,1) P-Kreatinin (pmol/L) 80 (55 - 149) ACR (g/mol kreatinina) 1,57 (0,29 - 39,01) PCR (g/mol kreatinina) 13,2 (2,3 - 170,1) oDP (g/dan) 0,114 (0,021 - 1,497) oGF (ml/min/1,73 m2) 71,8 (30,4 - 115,0) Na podlagi določene oGF smo v skupino 1 uvrstili 68 bolnikov z normalno oGF in v skupino 2 17 bolnikov z znižano oGF. Izvedli smo primerjavo merjenih parametrov med skupinama. Ugotovili smo, da se skupini po starosti značilno razlikujeta. Bolniki z znižano oGF so starejši v primerjavi z bolniki z normalno oGF (p<0,001). Plazemske koncentracije kreatinina so v tej skupini pričakovano višje. Mediane vrednosti za ACR, PCR in oDP pa se med skupinama ne razlikujejo značilno. Pri pregledu rezultatov pri posameznih bolnikih pa smo ugotovili, da skupina z normalno oGF vključuje kar 22 pacientov z bolezensko albuminurijo (med temi jih bilo 18 z bolezensko proteinurijo). Ti pacienti potrebujejo selektivno in poglobljeno obravnavo. Rezultate prikazujemo v preglednici 3. 4 RAZPRAVA oGF - ocena glomerulne filtracije, oDP - ocena dnevne proteinurije, PCR - razmerje proteini na kreatinin, ACR- razmerje albumini na kreatinin V raziskavo smo vključili 85 bolnikov z diagnozo SBT2, ki so bili prvič po odkritju sladkorne bolezni obravnavani pri diabetologu v Splošni bolnišnici Jesenice. Vsem bolnikom smo izmerili laboratorijske parametre za oceno glikemije in delovanja ledvic. Ugotovili smo, da ima med 85 bolniki s SBT2 27 bolnikov bolezensko albuminurijo, 17 bolnikov pa znižano oGF. Med 57 bolniki brez albuminurije imajo trije bolniki bolezensko proteinurijo. Med 68 bolniki z normalno oGF pa je kar 22 bolnikov z bolezensko albuminurijo oz. 18 bolnikov z bolezensko proteinurijo. Albuminurija in znižana filtracijska sposobnost ledvic sta neodvisna dejavnika za razvoj koronarne srčne bolezni pri bolnikih s SBT2. Med preiskovanimi bolniki jih je imelo 31,7 % bolezensko albuminurijo in 20 % znižano oGF. Glede na izsledke tuje raziskave (17), ki na velikem vzorcu pacientov s SBT2 (N= 66069) navaja 24 % prevalenco mikro in ma-kroalbuminurije in 17,2 % prevalenco znižane oGF (< 60 mL/min/1,73 m2), smo mi odkrili višjo pojavnost bolezenske albuminurije in zmanjšanega delovanja ledvic. Preva-lenca albuminurije in zmanjšanega delovanja ledvic se v drugih študijah (18, 19) giblje od 15 do 61 %. V raziskavah so proučevali različne starostne skupine bolnikov s SBT2, ki so se razlikovali po rasi, lipidnem statusu in drugih dejavnikih tveganja za razvoj SBT2. Mi smo v raziskavo vključili samo 85 bolnikov, ki smo jih s pomočjo enkratne meritve biokemičnih kazalcev razdelili po diagnostičnih kriterijih za oceno albuminurije in delovanja ledvic. Namen Preglednica 2: Laboratorijski parametri bolnikov z novoodkrito sladkorno boleznijo tipa 2 v skupini 1 brez in v skupini 2 z bolezensko albuminurijo Table 2: Laboratory parameters in newly diagnosed type 2 diabetes patients in group 1 with normoalbuminuria and in group 2 with pathological albuminuria. Parameter Skupina 1 Skupina 2 P število bolnikov 58 27 starost (leta) 60 (32 - 79) 65 (40 - 84) 0,106 P-Glukoza (mmol/L) 7,4 (3,5 - 20,1) 7,7 (4,3 - 17,2) 0,585 HbAlc (%) 7,8 (5,3 - 13,3) 7,9 (6,0 - 14,1) 0,231 P-Kreatinin (pmol/L) 81 (57 - 149) 78 ( (55 - 120) 0,146 ACR (g/mol kreatinina) 1,14 (0,29 - 2,78) 10,1 (3,1 - 39,0) 0,000 PCR (g/mol kreatinina) 10,8 (2,3 - 26,9) 30,2 (9,5 - 170,1) 0,000 oDP (g/dan) 0,09 (0,021 - 0,236) 0,27(0,084 - 1,479) 0,000 oGF (ml/min/1,73 m2) 70,2 ( 30,4 - 104,6) 74 (37,2 - 115) 0,745 Skupina 1: 58 bolnikov brez albuminurije Skupina 2: 27 bolniki z albuminurijo oGF - ocena glomerulne filtracije, oDP - ocena dnevne proteinurije, PCR - razmerje proteini na kretainin, ACR- razmerje albumini na kreatinin Preglednica 3: Laboratorijski parametri bolnikov z novoodkrito sladkorno boleznijo tipa 2 v skupini 1 z normalno in v skupini 2 z znižano oGF Table 3: Laboratory parameters in newly diagnosed type 2 diabetes patients in group 1 with normal and in group 2 with decreased eGFR Parameter Skupina 1 Skupina 2 p število bolnikov 68 17 starost (leta) 59 (32 - 79) 70 (44 - 84) 0,001 P-Glukoza (mmol/L) 7,6 (3,5 - 20,1) 8,9 (5,8 - 15,4) 0,257 HbAlc (%) 7,8 (5,3 - 14,1) 8,2 (6,0 - 10,6) 0,520 P-Kreatinin (pmol/L) 77 (55 - 109) 95 (81 - 149) 0,000 ACR (g/mol kreatinina) 1,36 (0,29 - 29,26) 1,96 (1,11 - 39,01) 0,105 PCR (g/mol kreatinina) 13,1 (2,3 - 170,1) 15,4 (3,4 - 78,5) 0,733 oDP (g/dan) 0,114 (0,021 - 1,479) 0,135 (0,030 - 0,691) 0,649 oGF (ml/min/1,73 m2) 77 ( 60,1 - 115) 52,6 (30,4 - 59,7) 0,000 Skupina 1: 68 bolnikov z normalno vrednostjo GF Skupina 2: 17 bolnikov z zmanjšano vrednostjo GF oGF - ocena glomerulne filtracije, oDP - ocena proteinurije, PCR - razmerje proteini na kreatinin, ACR- razmerje albumini na kreatinin naše raziskave je bil usmerjen izključno na pridobitev podatkov o številu bolnikov z albuminurijo in brez albuminurije. Stopnja albuminurije zvišuje tveganje za kardiovaskularne bolezni. Albuminurija je v visoki povezavi z glikemijo in je pogostejša pri moških ter starejših bolnikih, s slabo urejeno sladkorno boleznijo. Pri teh so pogosteje dokazane mikrovaskularne spremembe na koronarkah (17). Naši bolniki spadajo med starejšo populacijo, zato so v večji nevarnosti za razvoj mikrovaskularnih okvar. Če pri-pomoremo k hitrejšemu odkrivanju bolnikov s SBT2 z več- jim tveganjem, lahko s pravočasnimi in usmerjenimi terapevtskimi pristopi zmanjšamo tveganje za zaplete in posredno zmanjšamo stroške zdravljenja, ki bi sledilo možnim srčno žilnim dogodkom. Še posebej smo želeli odkriti tiste paciente s SBT2, ki imajo ob normalni vrednosti albuminurije že bolezensko protei-nurijo. Našli smo tri takšne paciente, ki zaradi drugačne vrste okvare ledvic potrebujejo individualno terapevtsko in diagnostično obravnavo. o ~2 z N LJJ _l O m O z cc § 0 OT OT 1 O m cc O O o cc Q_ LU CC O cc Q_ LJJ CC ID ID CQ < LJJ Z LJJ O o o Q_ Zanimali so nas tudi bolniki, ki ob ugotovljeni bolezenski al-buminuriji še niso imeli znižane oGF. Ti bolniki imajo po podatkih iz epidemioloških študij visoko tveganje za razvoj koronarne srčne bolezni. Tveganje za razvoj koronarne srčne bolezni narašča s padanjem oGF. Zavedamo se, da je oGF lahko netočno izmerjena. Zaradi metodoloških in analitičnih dejavnikov je lahko precenjena ali podcenjena in predstavlja omejitev za natančno opredelitev delovanja ledvic. Kljub navedenim omejitvam menimo, da lahko z razvrstitvijo bolnikov s SBT2 glede na vrsto bolezni ledvic, odkrijemo tiste, ki potrebujejo drugačne pristope pri spremljanju in terapiji ter v zgodnji stopnji obravnave vplivamo na zmanjšanje tveganja za razvoj srčno žilnih bolezni. Merjenje proteinov v urinu je klinično pomembno zato, ker nudi informacije o diagnozi, prognozi in tveganju za razvoj in napredovanje ledvične bolezni, sladkorne bolezni in srčno žilnih bolezni. Kljub temu pa stroka še vedno ne more dati točnega odgovora na vprašanja, v katerih kliničnih situacijah meriti samo albuminurijo oz. proteinurijo ali pa oba kazalca. (3). Zaradi teh dejstev menimo, da je pri novoodkritih bolnikih s SBT2 smiselno meriti v zgodnji fazi obravnave teh bolnikov oba kazalca. Omejitve pri naši raziskavi predstavlja nizko število vključenih bolnikov s SBT2 in na analitični ravni izvedene le enkratne meritve albuminurije, proteinurije, oDP in oGF, kar pomeni odstop od priporočil v stroki. 5 SKLEP Kljub nekaterim omejitvam raziskave, je bila prevalenca bolezenske albuminurije in znižane vrednosti oGF pri naših bolnikih primerljiva z izsledki podobnih tujih raziskav. Zaključimo lahko z ugotovitvijo, da uporaba ustreznih biokemičnih kazalcev pri obravnavi novoodkritih bolnikov s SBT2 v ambulantah za diabetes omogoča odkrivanje bolnikov z okvarjenim delovanjem ledvic in tistih z znižano oGF, ki imajo večje tveganje za razvoj srčno žilnih bolezni in bolezni ledvic. Z uvedbo ustreznih intervencij na področju farmakoterapije in spremljanja bolnikov v zgodnji fazi SBT2 lahko zmanjšamo možnosti za pojav in napredovanje teh bolezni. 6 LITERATURA Pri skupini 85 novoodkritih bolnikov s SBT2 smo dokazali bolezensko albuminurijo pri 27 in znižano oGF pri 17 bolnikih. Med 58 bolniki brez albuminurije so imeli trije bolniki bolezensko proteinurijo. Za pravočasno uvajanje ustrezne terapije za preprečevanje nastanka in napredovanja srčno žilnih bolezini ter bolezni ledvic je zgodnje odkrivanje teh bolnikov še posebej pomembno. Med 68 bolniki z normalno oGF je imelo 22 bolnikov bolezensko albuminurijo in 18 bolnikov bolezensko proteinurijo. Pri normalni oGF je že lahko prisotna okvara ledvic, zato je zaradi pravočasnega uvajanja terapije tudi pri teh bolnikih pomembno, da jih z laboratorijskimi testi odkrijemo čimprej. 10. 11 12. American Diabetes Association: Nephropathy in Diabetes (Position Statement). Diabetes Care. 2004; 27 (Suppl. 1): S79 -S83 Johnson DW, Jones GR, Mathew TH et al. Chronic kidney disease and measurement of albuminuria or proteinuria: a position statement. Med J Aust. 2012; 197(4): 224-225 Atkins RC, Briganti EM, Zimmet PZ, Chadban SJ. Association between albuminuria and proteinuria in the general population: The AusDiab Study. Nephrol Dial Transplant. 2003; 18: 21702174 Palmer BF. Proteinuria as a therapeutic target in patients with chronic renal disease. Am J Nephrol. 2007; 27: 287-293 Guh JY. Proteinuria versus albuminuria in chronic kidney disease. Nephrology. 2010; 15(2): 53-56 Lindic J, Flisar Z, Krsnik M et al. Presejalne metode za kronicno ledvicno bolezen: ocena proteinurije in albuminurije. ISIS. april 2009: 42-46 Nag S, Bilous R, Kelly W et al. All-cause and cardiovascular mortality in diabetic subjects increases significantly with reduced estimated glomerular filtration rate (eGFR): 10 years' data from South Tees Diabetes Mortality study. Diabet Med. 2007; 24: 10-7 Ninomiya T, Perkovic V, de Galan BE et al. Albuminuria and kidney function independently predict cardiovascular and renal outcomes in diabetes. J Am Soc Nephrol. 2009; 20(8): 18131821 Hemmelgarn BR, Manns BJ, Lloyd A et al. Relation between kidney function, proteinuria and adverse outcomes. JAMA 2010; 303(5): 423-429 Foster MC, Hwang SJ, Larson MG et al. Cross-classification of microalbuminuria and reduced glomerular filtration rate. Arch Intern Med. 2007; 167(13): 1386-1392 Molitch MD, Steffes M, Sun W et al. Epidemiology of diabetes interventions and complications study group. Diabetes care. 2010; 33: 1536-1543 KDOQI Clinical Practice Guidelines and Clinical Practice Recommendations for Diabetes and Chronic Kidney Disease. Am J Kidney Dis. 2007; 49(2 Suppl 2): S12-154 13. Kidney Disease improving Global Outcomes. Official Journal of the international Society of Nephrology - KDiGO 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease http://www. kdigo.org/clinical_practice_guidelines/pdf/CKD/KDi GO_2012_CKD_GL.pdf. dostop: 09.09.2013 14. Združenje endokrinologov Slovenije, Diabetes forum in Klinični oddelek za endokrinologijo, diabetes in presnovne bolezni interne klinike Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana. Slovenske smernice za zdravstveno oskrbo bolnikov s sladkorno boleznijo tipa 2. Ljubljana 2008: 93-100 15. Lindič J, Krsnik M. Chronic kidney disease screening-estimation of proteinuria. invited lecture 3. 5th Slovenian congress of nephrology. 2012: 38-39 16. Bernstein LH, Zions MY, Salman AH, Zarich S, Rucinski J. Seamonds B, Berger S, Lesley DY, Fleischman W, Heitner JF. Effect of renal function loss on NT-proBNP level variations. Clinical Biochemistry 42; 2009: 1091-1098 17. Svensson MK, Cederholm J, Eliasson B et al. Albuminuria and renal function as predictors of cardiovascular events and mortality in a general population of patients with type 2 diabetes: A nationwide observational study from the Swedish National Diabetes Register. Diabetes and Vascular Disease Research. September 3, 2013 1479164113500798 18. Rodriguez-Poncelas A, Quesada Sabate M, Coll de Tuero G et al. Prevalence of occult chronic kidney disease and associated variables in a population of patients with type 2 diabetes. Med Clin (Barc). 2010; 134:239-245 19. Yokoyama H, Sone H, Oishi M et al. Prevalence of albuminuria and renal insufficiency and associated clinical factors in type 2 diabetes; the Japan Diabetes Clinical Data Management study (JDDM15). Nephrol Dial Transplant. 2009; 24: 1212-1219 LA O E TVE S N A N Z cc O PREBRALI SMO ZA VAS SHORT PHARMA NEWS UREDILA: prof. dr. Borut Štrukelj Lidija Gerzej, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo jalno z ostalo populacijo. Na osnovi obeh obširnih raziskav sklepajo, da je pojav melanoma povezan tudi z vsebnostjo in delovanjem androgenih hormonov. Vir: Wen-Qing Li, Abrar A. Quershi, Jing Ma e tal. Personal History of Prostate Cancer and Increased Risk of Incident Melanoma in the United States. Journal of Clinical Oncology on line, 2. november 2013 KLARITROMICIN IN ZAVIRALCI KALCIJEVIH KANALČKOV SO LAHKO USODNA KOMBINACIJA I A Z O S LI A R m E R P BOLNIKI Z RAKOM PROSTATE POGOSTEJE ZBOLIJO ZA MELANOMOM Skupina raziskovalcev iz zveznega instituta za preiskovanje raka v ZDA (National Cancer Institute) je v znanstveni reviji Journal of Clinical Oncology objavila obširno študijo na osnovi skoraj tridesetletnega spremljanja bolnikov z rakom prostate in sočasno pojavnostjo drugih vrst raka. Združili so rezultate dveh študij, kjer so v prvi študiji od leta 1986 spremljali več kot 42.000 bolnikov z rakom prostate in pojavnostjo melanoma, v drugi študiji pa so od leta 1982 z enakimi kriteriji analizirali več kot 18.000 bolnikov z rakom prostate. V obeh študijah skupaj so zabeležili več kot 700 primerov pojava melanoma, kar je približno 2 x več od primerljive populacije, ki ni zbolela za rakom prostate. Dvakrat večjo verjetnost, da bo bolnik, ki ima raka prostate, zbolel za melanomom, razlagajo z visoko vsebnostjo an-drogenih hormonov, saj so obenem opazili tudi večjo pojavnost aknavosti, ki je posledica povečane aktivnosti androgenih hormonov. Po zdravljenju raka na prostati se je tudi aknavost bistveno zmanjšala. Obenem raziskovalci ugotavljajo, da pri bolnikih z rakom prostate ni večje verjetnosti, da bi zboleli še za kako drugo obliko raka, primer- V najnovejši izdaji prestižne znanstvene revije JAMA so raziskovalci Univerze v Ontariju, skupaj s skupino znanstvenikov iz londonskega znanstvenega centra LHSC objavili izsledke, kjer ugotavljajo verjetno povezanost med številnimi hospitalizacijami in smrtnimi primeri zaradi sočasne uporabe klaritormicina in zaviralcev kalcijevih kanalčkov. Že dolgo je znano, da sta klaritromicin in eritromicin (ne pa azi-tromicin) močna zaviralca citokromnnih encimov, predvsem CYP 3A4. Ker so zaviralci kalcijevih kanalčkov (amlodipin, felodipin, verapamil, nifedipin, diltiazem in drugi) podvrženi metabolizmu encimske skupine CYP 3A4, lahko naraste koncentracija zaviralcev kalcijevih kanalčkov v krvi celo na vrednosti, ki so do petkrat višje od maksimalne dovoljene koncentracije, kar vodi do močnih neželenih učinkov s hi-potenzijo in celo smrtjo. V retrospektivni pregled so vključili 96.226 bolnikov s povprečno starostjo 76 let, ki so poleg stalnega zdravljenja z zaviralci kalcijevih kanalčkov zaradi akutnega vnetja prejeli klaritromicin in 94.083 bolnikov (povprečna starost: 76 let), ki so prejeli azitromicin v letih od 2004 do 2012. V več kot 50 odstotkih je bil izmed zaviralcev kalcijevih kanalčkov predpisan amlodipin. Zaradi sočasne uporabe klaritromicina in zaviralcev kalcijevih ka-nalčkov je bilo 420 bolnikov hospitaliziranih zaradi akutne odpovedi ledvic kot posledica močne hipotenzije, v času akutnega zdravljenja s klaritromicinom pa so zabeležili 984 (1,02 %) smrtnih primerov. Pri uporabi azitromicina in sočasnem jemanju zaviralcev kalcijevih kanalčkov je bilo zaradi akutne odpovedi ledvic hospitaliziranih 208 bolnikov in v času sočasnega zdravljenja zabeleženih 555 smrtnih primerov (0,59 %). Raziskovalci opozarjajo, da kljub znani neželeni interakciji med klaritromicimom ali eritromicinom in zaviralci kalcijevih kanalčkov, ki lahko vodijo do močne hipotenzije, akutne odpovedi ledvic in smrti, zdravniki še vedno predpisujejo nevarno sočasno terapijo. Vir: Sonja Gandhi, Jamie L. Fleet, David G. Bailey et al: Calcium-Channel Blocker-Clarithrommycin Drug Interactions and Acute Kindey Injury. JAMA on line, 9. november 2013. ROSIGLITAZON VAREN, SAJ NE POVEČUJE VERJETNOSTI ZA SRČNI NAPAD Novembra je Ameriška agencija za hrano in zdravila (FDA) izdala sklep o novih spoznanjih glede neželenih učinkov ro-siglitazona na srčnožilni splet, kar je bilo ugotovljeno v klinični študiji z imenom RECORD (Rosiglitazone Evaluated for Cardiovascular Outcomes and Regulation of Glycemia in Diabetes). Tako raziskovalci ugotavljajo, da je rosiglitazon varnejša zdravilna učinkovina glede neželenih učinkov na srce in ožilje, kot je bilo leta 2007 ugotovljeno v metaanalizi na osnovi prvih kliničnih študij. V študiji RECORD tako ugotavljajo, da bolniki, ki prejemajo rosiglitazon, niso podvrženi nič večji verjetnosti nenadnih srčnih dogodkov ali smrti, v primerjavi z bolniki, ki prejemajo druge peroralne antidia-betike. Kot pravi dr. Janet Woodcock, direktorica centra za vrednotenje in razvoj zdravil pri FDA, bo agencija v najkrajšem času spremenila navodila za predpisovanje in uporabo rosiglitazona in umaknila nekatera opozorila glede povečanih neželenih učinkov na srce in ožilje. Spomnimo, Evropska agencija za zdravila (EMA) je ravno zaradi omenjenega srčnožilnega tveganja pred tremi leti predlagala začasni odvzem dovoljenj za promet z zdravili, ki vsebujejo rosiglitazon. V EU je ukinitev dovoljenj za promet za ta zdravila zaenkrat še vedno v veljavi, pričakujemo pa, da bo na osnovi vloge imetnika dovoljenja za promet tudi EMA kmalu obravnavala ponovno vključitev rosiglitazona v terapijo VIR: FDA, Sporočilo za javnost, 25. november 2013 http://www.ema.europa.eu/ema/index.jsp7curhpages/medicines/ human/medicines/000268/human_med_000662.jsp&mid=WC0b01 ac058001d124; dostop 3. december 2013 FDA ODOBRILA UPORABO SORAFENIBA ZA ZDRAVLJENJE NAPREDOVANEGA RAKA ŠČITNICE Sorafenib (slika 1) je nizkomolekularni, sintezni zaviralec ti-rozinskih in Raf kinaz, posredno pa se z uporabo sorafe-niba upočasnjuje tudi intracelularna MAP kinazna kaskadna prožitev. V EU je sorafenib indiciran za zdravljenje bolnikov s karcinomom jeter in za bolnike z napredovalim karcinomom ledvičnih celic, pri katerih je bilo predhodno zdravljenje z interferonom alfa ali interlevkinom-2 neuspešno ali za katere je ocenjeno, da tako zdravljenje za njih ni primerno. Slika 1: Molekula sorafeniba V tretji fazi kliničnega testiranja pa je tudi kombinacija so-rafeniba in temsirolimusa v zdravljenju glioblastomov. Neželeni učinki sorafeniba so predvsem kožni izpuščaji z močnim srbenjem, povišan krvni tlak in driska, v manjši meri pa beležijo tudi zmerno eritrocitozo. 22. novembra 2013 je FDA odobrila indikacijo sorafeniba pri napredovanem metastatskem raku ščitnice. Zvezni urad za raka (National Cancer Institute) ocenjuje, da bo v letu 2013 samo v ZDA 60.000 bolnikov diagnosticiranih z rakom ščitnice in približno 2000 jih bo v tem letu umrlo. Varnost in učinkovitost sorafeniba so ugotavljali v klinični študiji, v katero je bilo vključenih 417 bolnikov, ki se niso odzivali na zdravljenje z radioaktivnim pripravkom joda. Sorafenib je podaljšal fazo preživetja, ko rakave celice niso napredovale. V skupini, ki je bila zdravljena s sorafenibom, je bila faza latence dolga enajst mesecev, pri bolnikih, ki niso prejemali sorafeniba, pa le 6 mesecev. Imetnik dovoljenja za promet je že vložil vlogo za odobritev sorafeniba za omenjeno indikacijo tudi v EU. V kolikor bo EMA zdravilo potrdila tudi za zdravljenje metastatskega raka ščitnice, bo sorafenib za to indikacijo na voljo v prvi polovici leta 2014. I < N O OT Ij < cc m LU CC Q_ Vir: FDA, Sporočilo za javnost, 22. november 2013 KORISTI UPORABE KOMBINIRANIH HORMONSKIH KONTRACEPTIVOV ŠE VEDNO ODTEHTAJO NJIHOVA TVEGANJA NAVZDOL OBRNJEN CRN TRIKOTNIK (?) - NOVA OZNAKA NA ZDRAVILIH ZA SPODBUJANJE POROCANJA NEŽELENIH UČINKOV I < N O OT Ij < cc m LU CC Q_ Koristi uporabe kombiniranih hormonskih kontraceptivov pri preprečevanju neželenih nosečnosti so še vedno večje od tveganja za razvoj venske tromboembolije. Takšen je zaključek Odbora za oceno tveganja na področju farmakovigi-lance (PRAC) v okviru Evropske agencije za zdravila po pregledu podatkov o varnosti zdravil iz te skupine. Tveganje za razvoj tega zapleta je pri uporabi hormonskih kontracep-tivov sicer malo višje, kakor pri populacij žensk, ki teh zdravil ne jemljejo in niso noseče. Tveganje je tudi odvisno od tipa progestogena v zdravilu. Zato PRAC zdravnikom priporoča, da ob predpisovanju kombiniranih hormonskih kontracep-tivov upoštevajo tveganja, ki se skozi čas spreminjajo, uporabnice pa bolje poučijo o možnem tveganju za razvoj venske tromboembolije ter jih opozorijo na znake in simptome tega zapleta. Med uporabnice z višjim tveganjem sodijo uporabnice s prekomerno težo, kadilke, ženske z višjo starostjo, ženske z migrenami, ženske, ki so rodile v preteklih tednih, in tiste, ki imajo vensko tromboembolijo v družinski anamnezi. Uporabnice je treba seznaniti, da morajo v primeru simptomov in znakov venske tromboembolije, ki vključujejo bolečino ali oteklino noge, nenadno nepojasnjeno zasoplost, hitro dihanje ali kašelj, bolečine v prsnem košu, šibkost ali omrtvičenost obraza, roke ali noge, takoj poiskati zdravniško pomoč. Tveganje za vensko tromboembolijo je najmanjše pri kon-traceptivih, ki vsebujejo progestogene levonorgestrel, nor-gestimat in noretisteron, in sicer 5-7 primerov na 10.000. Pri progestogenih etonogestrel in norelgestromin je bilo ocenjeno tveganje na 6-12 primerov na 10.000, pri gesto-denu, dezogestrelu in drospirenonu pa 9-12 primerov. Za kontraceptive, ki vsebujejo klormadinon, dienogest in no-megestrol, pa se še načrtujejo in izvajajo dodatne raziskave, saj je podatkov za primerjavo tveganj z ostalimi kontracep-tivi še premalo. Pri ženskah, ki ne uporabljajo kombiniranih hormonskih kontraceptivov in niso noseče, je pojavnost venske tromboembolije 2 primera na 10.000 žensk. Vir: EMA, Sporočilo za javnost, 22. november 2013 Na nekaterih zdravilih se od letošnje jeseni v navodilih za uporabo in povzetkih glavnih značilnosti zdravila pojavlja nova oznaka - navzdol obrnjen črn trikotnik. S to oznako bodo odslej opremljena vsa zdravila, ki sodijo v t.i. skupine zdravil, ki se še posebej pozorno spremljajo. Gre za enega od ukrepov nove evropske zakonodaje na področju farma-kovigilance. V skupini zdravil, ki bodo imela oznako in napis " t - Za to zdravilo se izvaja dodatno spremljanje varnosti", so predvsem novejša zdravila. Sem se tako uvršajo zdravila, ki so dovoljenje za promet pridobila v letu 2011 in kasneje. Omenjeno oznako bodo nosila tudi zdravila, za katera zaradi specifičnih razlogov v obdobju pred pridobitvijo dovoljenja za promet ni bilo mogoče zbrati dovolj podatkov o varnosti oziroma zdravila, pri katerih se je proizvajalec zavezal, da bo izvedel še dodatne klinične raziskave za pridobitev dodatnih podatkov o dolgotrajnem jemanju ali za detekcijo redkega neželenega učinka. Nova oznaka nikakor ne pomeni, da ta zdravila niso varna. Namen oznake je spodbuditi zdravstvene delavce ter uporabnike zdravil, da pri teh zdravilih še bolj dosledno poročajo neželene učinke zdravil, kadar do njih pride. Vsa zdravila se po dajanju na trg EU pozorno spremlja, ta, označena s črnim trikotnikom, pa se bo spremljalo še bolj natančno. Podatki, pridobljeni iz spontanega poročanja, iz okolja, kjer zdravilo jemlje večja in predvsem bolj raznolika populacija kot med kliničnimi raziskavami, so namreč zelo pomembni in prispevajo k popolnejši sliki razmerja varnosti in učinkovitosti posameznega zdravila. Ob morebitnih novih podatkih se nato lahko posodobijo navodila za uporabo z namenom varnejše in učinovite uporabe zdravila. V Sloveniji zdravstveni delavci neželene učinke poročajo Centru za zastrupitve, ki deluje na UKC Ljubljana oziroma Agenciji za zdravila in imetniku dovoljenja za promet. Poimenski seznam zdravil, ki se še posebej pozorno spremljajo, bo Evropska agencija za zdravila mesečno posodabljala in objavljala na svoji spletni strani. Vir: EMA, Sporočilo za javnost, 1-oktober 2013 ZDRAVILA V KOS IN RAJE SAMO K TELOVADBI? Metaepidemiološka raziskava, objavljena v ugledni britanski reviji British Medical Journal, je pokazala, da ima lahko telesna vadba podoben vpliv na zmanjšanje umrljivosti v sekundarni preventivi pri koronarni bolezni srca ter pri preprečevanju sladkorne bolezni kot zdravljenje z zdravili. Pri bolnikih, ki okrevajo po možganski kapi, pa se telesna vadba kaže celo bolj učinkovita kot zdravila. Ugotovitve temeljijo na metaanalizah 305 kontroliranih raziskav zdravil in/ali telesne vadbe, ki so vključevale 339.274 udeležencev. Poleg vpliva zdravil so nekatere raziskave vključevale različne vrste vadb glede na skupino vključenih bolnikov, kar-diorespiratorno vadbo pri bolnikih s koronarno boleznijo srca, telesna dejavnost pa je bila del večkomponentne spremembe življenskega sloga za preprečevanje sladkorne bolezni pri bolnikih z moteno toleranco za glukozo. Bolniki po možganski kapi so bili vključeni v vadbe, ki je vključevala kombinacijo vaj za moč in kardiorespiratornih vadb za zmanjšanje njihove invalidnosti, odvisnosti ter smrtnosti. Bolniki s srčnim popuščanjem so bili vključeni v aerobne vadbe in vadbe vzdržljivosti. Raziskovalci so ugotovili, da telovadba pri koronarni srčni bolezni zmanjšuje tveganje za smrt v enaki meri kot statini, blokatorji receptorjev beta, inhibitorji ACE in antitrombotiki. Pri bolnikih v stanju pre-dia-betesa jasnega vpliva na zmanjšanje umrljivosti niso pokazali niti inhibitorji alfa-glukozidaze, tiazolindioni, inhibitorji ACE, glinidi, niti telesna vadba. Le-ta pa je bila signifi-kantno bolj učinkovita pri zmanjševanju umrljivosti pri bolnikih po možganski kapi, pri preprečevanju druge kapi pa je bila bolj učinkovita kot antikoagulanti in antitrombotiki. Pri bolnikih s srčnim popuščanjem pa so se najbolje odrezali diuretiki v primerjavi s telesno vadbo, zaviralci ACE ali blokatorji receptorjev angiotenzina. Pomenljivo je tudi dejstvo, da je bilo v zgornjo analizo 305 raziskav vključenih zgolj 57 raziskav s 14.716 udeleženci, ki so bile posvečene preučevanju učinkov telesne vadbe, kar nakazuje na dejstvo, da se raziskovalci morda preveč osredotočajo na raziskovanje učinkov farmakološke obravnave in podcenjujejo ali celo ignorirajo ugodne učinke, ki jih kaže telesna vadba na zdravje. Avtorji raziskav upajo, da bodo te ugotovitve v prihodnosti spodbudile več dobro zasnovanih primerjalnih raziskav potenciala telesne vadbe kot možnosti zdravljenja na različnih terapevtskih področjih. Pa ne samo vadbe, temveč tudi drugih sprememb življenj- skega sloga, kot so prehrana, prenehanje kajenja in psiho-socialne intervencije. Viri. 1. H- Naci, J. P. A Ioannidis: Comparative effectiveness of exercise and drug interventions on mortality outcomes: metaepidemiological study; BMJ 2013;347:f5577 M. Mitka: Exercise May Match Medication in Reducing Mortality Associated With Cardiovascular Disease, Diabetes; JAMA. 2013;310(19):2026-2027 Zdaj pa izkoristite sporočilo te zadnje novičke in zaprite Farmacevtski vestnik, saj ste že pri koncu, ter posvetite naslednjih 45 minut, da razgibate svoje telo. Kako? Na vam najljubši način. I < N O OT Ij < CC m LU CC Q_ NOVI DOKTORJI ZNANOSTI NEW DOCTORS OF SCIENCE UREDILA: asis. dr. Janja Zupan, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo m O z A z N R O O D O dr. ANJA PIŠLAR, mag. farm. URAVNAVANJE NEVROTROFIČNE AKTIVNOSTI Y-ENOLAZE S PROTEOLITIČNIMI ENCIMI IN POMEN PRI NEVRODEGENERATIVNIH BOLEZNIH Mentor: prof. dr. Janko Kos, univ. dipl. kem. Somentorica: doc. dr. Nataša Obermajer, mag. farm. Anja Pišlar je v okviru doktorskega dela preučevala delovanje gama enolaze v nevronskih celicah v odvisnosti od delovanja cisteinske karboksipeptidaze katepsina X. Gama enolaza izkazuje glikolitično aktivnost, v zadnjem času pa je bilo ugotovljeno, da je tudi pomemben nevroprotektivni dejavnik in da vzpodbuja tvorbo nevritov, ki so ključni za delovanje živčnega sistema. Nevrotrofično delovanje izkazuje C-konec molekule, ta pa je lahko tarča katepsina X, ki s proteolizno cepitvijo izniči nevrotrofično delovanje gama enolaze. Anja Pišlar je raziskala molekularne mehanizme te regulacije. Odkrila je, da proteolitska cepitev C konca prepreči vezavo gama enolaze na prenašalni protein gama sintrofin. Na ta način gama enolaza ne preide iz ci- toplazme na plazemsko membrano in ne ojača signalnih poti, ki jih preko Trk receptorja sprožajo nevrotrofični rastni dejavniki. Nevroprotektivno vlogo gama enolaze je dokazala tudi na in vivo mišjem modelu Alzheimerjeve bolezni, kjer celice mikroglie v okolici amiloidnih plakov izločajo veliko količino gama enolaze, ki lahko zaščiti še žive nevronske celice pred toksičnim delovanjem amiloid beta peptida, katepsin X pa to zaščitno delovanje izniči. Patološko delovanje katepsina X je dokazala tudi na celičnem modelu Par-kinsonove bolezni, kjer je ta encim pomemben v apoptozi dopaminergičnih nevronov. Poznan mehanizem nevrotro-fičnega delovanja gama enolaze in pa vloga katepsina X v nevrodegenerativnih procesih omogoča uporabo aktivnih peptidov, ki posnemajo C konec gama enolaze in pa inhibitorjev katepsina X pri zaščiti nevronov, to pa predstavlja nov korak v razvoju učinkovin za zdravljenje nevrodegene-rativnih bolezni. Dr. Anja Pišlar je rezultate doktorskega dela do sedaj objavila v štirih člankih v revijah z dejavnikom vpliva, tudi v reviji, ki je prva na področju, kar nekaj člankov pa je še v različnih fazah objavljanja. dr. ROMANA ROŠIC, mag. farm. NAČRTOVANJE, IZDELAVA IN VREDNOTENJE BIOKOMPATIBILNIH NANOVLAKEN Z METODO ELEKTROSTATSKEGA SUKANJA Mentorica: prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm. Somentorica: izr. prof. dr. Saša Baumgartner, mag. farm. Disertacija Romane Rošic predstavlja aktualne vsebine s področja nanoznanosti oz. nanotehnologije, natančneje biokompatibilnih nanovlaken, ki zaradi svoje sestave in strukturne zgradbe posnemajo osnovne gradnike izvence-ličnega ogrodja tkiv in so tako potencialno primerna za razvoj dostavnih sistemov učinkovin, tkivnih nadomestkov in oblog za rane. Izdelava nanovlaken zahteva izviren postopek priprave, ki je specifičen za vsak polimer posebej, kot kažejo tudi dosedanji izsledki in dosežki v znanstveni literaturi. Za potrebe raziskovalnega dela je dr. Romana Rošič na UL FFA uvedla napravo in postopek za elektrostatsko sukanje in sicer tako nadzor procesa kot mehanizem nastanka in si tako postavila platformo za lažjo izbiro materialov. Pri delu je uporabljala sodobne metode fizikalnega vrednotenja raztopin in nanovlaken, kot so različne metode vrednotenja reoloških lastnosti polimernih raztopin (rotacijski in oscilacijski testi, reološke meritve na mejnih površinah, kapilarni in vibracijski viskozimetri), določanje specifične električne prevodnosti, površinske napetosti in gostote raztopin, ozkokotno rentgensko sipanje, vrstični elektronski mikroskop, infrardeča spektroskopija, tekočinska kroma-tografija visoke ločljivosti, statistične in korelacijske metode. Raziskovalno je največ delala v laboratorijih UL FFA, specifične instrumente je koristila na FKKT, napravo za ozkokotno rentgensko sipanje in SEM pa na Kemijskem inštitutu. Doktorandka je v celoti uspela raziskati in potrditi hipoteze: • izbira izhodnih polimernih raztopin in procesnih parametrov elektrostatskega sukanja je ključna za uspešno izdelavo nanovlaken, • izbor polimera in njegove lastnosti vplivajo na morfologijo nastalih nanovlaken, • izdelana nanovlakna predstavljajo ustrezno oporo celicam za rast v kroničnih ranah in vzdržujejo vlažno mikro-okolje, • v nanovlakna lahko vgradimo različne zdravilne učinkovine in tako izdelamo učinkovit dostavni sistem. Izbrano raziskovalno področje in dobljeni odlični rezultati so zanimivi za širšo raziskovalno skupnost doma in v tujini. Raziskave je dobro načrtovala in opredelila hipoteze in cilje celovito in tehnično natančno izvedla raziskovalno delo, objektivno analizirala in interpretirala podatke in s tem dobila inovativne ugotovitve. Disertacija predstavlja izviren in pomemben znanstveni prispevek k proučevanju tehnološkega postopka za izdelavo nanovlaken in vrednotenja lastnosti polimernih raztopin za uspešno izvedbo elektrostatskega sukanja. Poleg tega so njeni rezultati neposredno uporabni za gospodarstvo in podajajo smernice za uspešnejši in hitrejši začetek dela na področju izdelave nanovlaken. Zaenkrat so se kot najodmevnejši izkazali rezultati objavljeni v reviji European Polymer Journal (2012, 48: 1374-1384). Predstavljajo namreč izjemne izsledke, ki kažejo, da so po-limerne raztopine primerne za elektrostatsko sukanje le takrat, kadar tvorijo prevodne nestrukturirane disperzije, ki izkazujejo bistveno večjo stopnjo plastičnosti kot elastičnosti tako v notranjosti raztopine kot na mejni površini. Doktorandka je kot prva dokazala, da interfacialne reološke lastnosti, v primerjavi z »bulk« reološkimi lastnostmi, izkazujejo bistveno boljšo napovedno vrednost za uspešno izvedbo elektrostatskega sukanja. Objava rezultatov je dosegla izjemno odmevnost, saj se je članek že takoj po objavi (julij-september 2012) uvrstil na 7. mesto med najbolj iskanimi članki v reviji European Polymer Journal in ostal na elitnem seznamu tudi v naslednjih dveh trimesečjih (vir Sciencedirect Top 25). Zanimivost in perspektivnost objavljenih rezultatov potrjuje tudi dejstvo, da je bil članek povabljen k objavi na spletni strani Advances in Engineering (www.advancesinengineering.com), saj je uredniški odbor ocenil, da so izsledki raziskave izrednega pomena za področje inženirstva in inovativnih tehnologij. Dr. Romana Rošic ima v Cobiss bazi podatkov bibliografskih enot 7 znanstvenih člankov in sicer 6 v revijah s faktorjem vpliva, od tega 3 v A1 skupini. Rezultate je predstavila tudi na številnih mednarodnih znanstvenih srečanjih in 2 podiplomskih seminarjih za študente (Lyon, francija, Saarbrucken, Nemčija). Odmevnost raziskovalnega dela, izražena s številom citatov v Scopus, je 14 (10. 6. 2013). dr. MARTINA HRAST, mag. farm. NAČRTOVANJE IN SINTEZA INHIBITORJEV LIGAZ MUR IN D-ALANIL-D-ALANIN LIGAZE Mentor: prof. dr. Stanislav Gobec, mag. farm. Dr. Martina Hrast je zaključila doktorsko disertacijo z naslovom Načrtovanje in sinteza inhibitorjev ligaz Mur in D-alanil-D-alanin ligaze. Prekomerna in nepravilna uporaba protibakterijskih učinkovin je privedla do razvoja številnih rezistentnih oblik bakterijskih sevov, ki predstavljajo vedno večji globalni zdravstveni problem. V zadnjih letih zato poteka intenzivno iskanje novih protibakterijskih učinkovin z novimi, do sedaj neizkoriščenimi mehanizmi delovanja. Ena od pomembnejših tarč za razvoj protibakterijskih učinkovin je bakterijska celična stena oziroma encimi, ki sodelujejo v njeni biosintezi. Martina Hrast se je v svoji doktorski disertaciji osredotočila predvsem na encime, ki katalizirajo zno-trajcelične stopnje biosinteze celične stene - ligaze Mur (MurC-MurF) in d-alanin-d-alanin ligazo (Ddl). Kandidatka je v okviru doktorata razvila dve večji seriji biološko aktivnih spojin. S pomočjo sofisticiranih računalniških metod, ki zajemajo kombinacijo virtualnega rešetanja in molekulske di- OT O z < z N =5 CC O O o O OT O Z < z N =5 CC O O o O namike, je razvila začetno serijo zaviralcev DdlB. Nekatere spojine zadetki iz te serije so ji služili kot izhodišče za načrtovanje in sintezo serije sorodnih spojin z izboljšanimi lastnostmi. Te spojine so imele zaviralno delovanje na DdlB v mikromolarnem koncentracijskem območju, nekatere med njimi pa tudi in vitro protibakterijsko delovanje. Druga serija spojin, ki jih je razvila doktorandka, so derivati ciano-tiofena, ki delujejo kot zaviralci MurF. Pri tej seriji je potrebno izpostaviti, da gre za zaviralce ligaze MurF iz različnih bakterijskih sevov (MurF iz S. pneumoniae, E. coli in S. aureus), kar do sedaj v literaturi še ni bilo opisano. V okviru sodelovanja z Inštitutom za strukturno biologijo iz Grenobla (Francija) je doktorandka uspela pridobiti kristale MurF iz S. pneumoniae v kompleksu z inhibitorjem in uspešno razrešiti kristalno strukturo do resolucije 1,9 A. Na ta način je neposredno dokazala način vezave inhibitorja v aktivno mesto encima. Poleg omenjenega imajo nekateri zaviralci MurF iz tega razreda tudi in vitro protibakterijsko delovanje. dr. ZORAN HAM, mag. farm. RAZISKAVE IN PRIPRAVA NOVIH TRDNIH OBLIK ZDRAVILNIH UČINKOVIN Mentor: prof. dr. Uroš Urleb, mag. farm. Polimorfizem učinkovin je zelo pomemben za biološko uporabnost in zagotavljanje učinkovitosti, varnosti in kakovosti zdravil. Proces kristalizacije ima na koncu sintezne poti ključno vlogo pri kontroli kristalne oblike, distribucije velikosti delcev, oblike in morfologije kristalov in kristalitov. Kandidat je pripravil nove trdne oblike več zdravilnih učinkovin, definiral sintezne postopke in ključne parametre, ki vplivajo na njihovo pripravo in jih ovrednotil z različnimi fizikalno kemijskimi tehnikami. Za določitev kristalnih oblik vseh zdravilnih učinkovin je uporabili rentgensko praškovno difrakcijo. Termodinamske lastnosti trdnih oblik učinkovin je ovrednotil z diferenčno dinamično kalorimetrijo, z infrardečo in Ramansko spektroskopijo je pokazal razlike med trdnimi oblikami na molekularnem nivoju, z elektronsko mikroskopijo, dinamično sorpcijo vlage in določitvijo velikosti delcev je za različne učinkovine natančno določil morfološke značilnosti delcev in pokazal, da so nove trdne oblike učinkovin fizikalno stabilne in primerne za vgradnjo v kon- čne farmacevtske oblike. Potrdil je, da na osnovi novih kristalnih struktur dobimo natančnejši vpogled v lastnosti spojine v trdnem stanju in v kemizem specifične spojine. Rezultate dela s področja teme doktorske disertacije je dr. Zoran Ham objavil v dveh znanstvenih člankih, pri katerih je prvi avtor, rezultati raziskav so opisani tudi v dveh podeljenih mednarodnih patentih. dr. UROŠ TRSTENJAK, mag. farm. NAČRTOVANJE, SINTEZA IN VREDNOTENJE NOVIH INHIBITORJEV FAKTORJA XA IN ANTAGONISTOV GPIIB/IIIA KOT POTENCIALNIH DUALNIH ANTITROMBOTIČNIH UČINKOVIN Mentor: prof. dr. Danijel Kikelj, mag. farm. Somentor: doc. dr. Janez Ilaš, mag. farm. V okviru doktorskega dela je Uroš Trstenjak načrtoval, sin-tetiziral in biološko ovrednotil prve nizkomolekularne potencialne antitrombotične učinkovine z direktnim inhibitornim delovanjem na faktor Xa in antagonističnim delovanjem na fibrinogenski receptor s Ki oziroma IC50 vrednostmi v mikromolarnem območju. Spojini z najbolj uravnoteženo aktivnostjo na obeh tarčah sta izkazovali Ki (fXa) = 25.6 mM in IC50 (GPIIb/IIIa) = 35.0 pM ter Ki (fXa) = 37.0 mM in IC50 (GPIIb/IIIa) = 25.8 pM. Pripravil je tudi strukturno povsem nove submikromolarne antagoniste fibrino-genskega receptorja z 1,2,4-oksadiazol-5(4H)-onskim obročem. Primerjava enantiomernih parov aktivnih spojin je pokazala, da so (R)-enantiomeri kot antagonisti fibrino-genskega receptorja učinkovitejši od (S)-enantiomerov. Z zamenjavo morfolin-3-ona z 2-etoksikarbonilpiperidinom je selektivni direktni inhibitor faktorja Xa rivaroksaban pretvoril v dualni inhibitor faktorja Xa in trombina z razmeroma uravnoteženo nanomolarno aktivnostjo na obeh tarčah, dualno aktivnost pa je smiselno razložil s sidranjem v aktivni mesti obeh encimov. Dr. Uroš Trstenjak je v disertaciji razvil tudi sintezni poti za pripravo metil W-(4-nitrofenil)-3-oksomor-folin-2-karboksilata in izomernega etil W-(4-nitrofenil)-2-ok-somorfolin-3-karboksilata, pri čemer je bila v obeh primerih ključni korak z rodijevim(II) acetatom katalizirana reakcija intermolekularne vstavitve karbenskega intermediata v OH oziroma N-H vez. Na podlagi izoliranega stranskega produkta pri sintezi omenjenih spojin je uspešno razvili še sintezno pot za pripravo novih cikličnih aminokislin z N,O-acetalnim strukturnim motivom, pomembnih za pripravo peptidomimetikov. Doktorska disertacija Uroša Trstenjaka, ki je napisana v obliki poglavij, poleg dveh objavljenih odmevnih preglednih člankov s področja disertacije vsebuje tri objavljene oz. v objavo sprejete originalne znanstvene članke v uglednih mednarodnih znanstvenih revijah in dva rokopisa člankov poslana v objavo v mednarodne znanstvene časopise. dr. UROŠ KLANČAR. mag. farm. RAZVOJ FIZIOLOŠKO RELEVANTNIH METOD PRESKUSA RAZTAPLJANJA HIDROFILNIH OGRODNIH TABLET Z UPORABO FARMAKOPEJSKIH NAPRAV TER NJIHOVIH MODIFIKACIJ Mentorica: izr. prof. dr. Saša Baumgartner, mag. farm. Somentor: viš. razv. sod. dr. Igor Legen, mag. farm. Doktorska disertacija Uroša Klančarja sodi na področje farmacevtske tehnologije in je primer dobrega sodelovanja med Univerzo in gospodarstvom. Glavni cilj naloge je bil s pomočjo različnih farmakopejskih naprav za preskuse sproščanja ter njihovih modifikacij ponazarjati različne vplive prebavnega trakta na hidrofilne ogrodne tablete s podaljšanim časom sproščanja zdravilne učinkovine. Tablete je preskušal v različnih in vitro preskusih, dobljene rezultate pa je primerjal z in vivo podatki izvedenih farmakokinetičnih študij bioekvivalence. Kandidat je v svojem delu postavil 4 hipoteze, na katere je odgovoril z raziskavami, objavljenimi v dveh znanstvenih člankih ter enem, ki je poslan v objavo. V prvi študiji objavljeni v reviji s faktorjem vpliva nad 5 je kandidat na primeru ogrodnih tablet na osnovi hidroksipro- pilmetil celuloze predstavil razvoj fiziološko relevantne in di-skriminatorne metode preskusa sproščanja modelne učinkovine s slabšo topnostjo. Ugotovil je, da je mehanizem sproščanja pretežno erozijsko nadzorovan, zato na profil sproščanja v tem primeru vplivajo predvsem mehanske obremenitve v okolici tablete. V ta namen je razvil novo in vitro metodo, kjer je združil uporabo plastičnih kroglic z napravo 3 po USP. In vivo relevantnost nove metode je potrdil tudi z uporabo koncepta in vitro - in vivo korelacije, kjer je dokazal najvišjo stopnjo korelacije A. Svojo inovacijo ima zaščiteno tudi z mednarodnim podeljenim patentom. Dr. Uroš Klančar se je tudi v drugi študiji ukvarjal s posnemanjem mehanskih obremenitev na tableto pri potovanju skozi prebavni trakt in z načrtovanjem robustnih tablet. Pri tem je robustnost ogrodnih tablet povezal z intrinzično viskoznostjo uporabljenega polimera ter jo koreliral z mehansko občutljivostjo. Slednjo je vrednotil med samim preskusom sproščanja tako, da je ob določenem času tablete dodatno obremenil s steklenimi kroglicami in s tem ponazoril prehod tablete iz želodca v dvanajstnik, za kar so značilne močne mehanske obremenitve. Tudi rezultati te raziskave so že objavljeni v reviji s faktorjem vpliva. Doktorand Uroš Klančar ima v Cobiss bazi podatkov bibliografskih enot 2 izvirna znanstvena članka, eden je poslan v objavo, poleg tega ima objavljena 2 pregledna in en strokovni članek. Svoj originalni in inovativni pristop k delu pa kandidat dokazuje tudi kot soavtor dveh že podeljenih mednarodnih patentov in treh patentnih prijav. dr. ANA TORKAR, mag. farm. RAZVOJ SELEKTIVNIH INHIBITORJEV KATEPSINA L Mentor: prof. dr. Janko Kos, univ. dipl. kem. Somentorica: prof. dr. Tamara Lah Turnšek, univ. dipl. kem. Ana Torkar je v okviru doktorskega dela pripravila nove selektivne inhibitorje katepsina L in iz njih izpeljane fluorescenčne sonde za določanje njegove encimske aktivnosti. Katepsin L se povečano izraža v nekaterih vrstah tumorjev, njegova vloga pri napredovanju raka pa še ni pojasnjena. Na podlagi že znanih struktur katepsinskih inhibitorjev in vezavnih mest je dr. Ana Torkar sintetizirala knjižnico 50 peptidamidnih molekul s sistematično spremenjenimi ve- m O z < z N =5 CC O O o O OT O Z < z N =5 CC O O o O zalnimi mesti. Spojine, ki so izkazovale najboljšo selektivnost za katepsin L, je testirala na celičnih modelih gliobla-stoma in dokazovala vlogo katepsina L v celični apoptozi. Ugotovila je, da inhibitorji katepsina L povečajo celično apoptozo predvsem v prisotnosti arzenijevega trioksida ali drugih kemoterapevtikov, ki se uporabljajo pri zdravljenju raka. Z vstavitvijo fluorescenčne strukture na ogrodje inhibitorjev je pripravila sonde, primerne za detekcijo aktivne oblike katepsin L in vivo. Taka orodja so lahko zelo uporabna za opazovanje velikosti in invazivnih robov tumorjev, še posebej med njihovo kirurško odstranitvijo. Dr. Ana Torkar je rezultate doktorskega dela do sedaj objavila v štirih člankih v revijah z dejavnikom vpliva, ter kot referate na mednarodnih znanstvenih srečanjih. dr. PETER NADRAH, mag. farm. FUNKCIONALIZACIJA POROZNIH SILIKATNIH DELCEV ZA NADZOROVANO SPROŠČANJE UČINKOVIN Mentor: prof. dr. Odon Planinšek, mag. farm. Somentor: prof. dr. Miran Gaberšček, univ. dipl. kem. Dr. Peter Nadrah je v svojem doktorskem delu razvijal dostavne sisteme za nadzorovano sproščanje modelnih zdravilnih učinkovin v telesu. Osnovo sistemov so tvorili mezoporozni silikatni nanodelci funkcionalizirani z organskimi spojinami, ki omogočajo sproščanje modelnih učinkovin le v prisotnosti sprožitvenega dejavnika. V teh sistemih je učinkovina sorbirana v porah silikatnih delcev, njeno sproščanje pa uravnavajo molekularna vrata oz. zapiralne molekule, ki so vezane na zunanjo površino silikatnih delcev. V nadaljevanju je pripravil sisteme, kjer sta silikat in zapiralna molekula povezana z disulfidno vezjo. S tem je potrdil hipotezo, da je mogoče z uporabo različnih substituentov ob disulfidni vezi doseči različne kinetike sproščanja modelne učinkovine in hkrati doseči sproščanje le v prisotnosti sprožitvenega dejavnika ditiotreitola. Razvil je tudi konjugate med mezoporoznimi delci in modelno učinkovino, ki je na silikatne delce vezana kovalentno in se sprošča ob prisotnosti endogenega reducenta gluta-tiona. Dr. Peter Nadrah je razvil tudi nov sistem na osnovi mezo-poroznih silikatov, ki omogoča vizualizacijo nastopa sprožitvenega dejavnika. Delci postanejo fluorescenčni ob dodatku reducenta kot dejavnika. To pri raziskovanju opisanih terapevtskih sistemov omogoča enostavno spremljanje nastopa dejavnika, ki lahko hkrati sproži tudi sproščanje učinkovine. Rezultate svojega dela je objavil v štirih člankih v mednarodno priznanih revijah s faktorjem vpliva. Kandidat je kot molekularna vrata najprej uporabil dendri-mere različnih velikosti za nadzor sproščanja dveh modelnih učinkovin: dinatrijeve soli fluoresceina in karboksifluores-ceina. Rezultati so pokazali, da je nadzor sproščanja mogoče doseči, če dendrimere na silikatne delce vežemo z disulfidnimi vezmi, ki se cepijo v prisotnosti reducenta kot sprožitvenega dejavnika. Poleg tega je ugotovil, da delci z manjšimi dendrimeri omogočajo sproščanje bistveno večje množine modelne učinkovine v primerjavi z večjimi dendri-meri. IZ DRUŠTVENEGA ŽIVLJENJA ACTIVITIES OF THE SOCIETY UREDILE: Asist. Maja Jošt, mag.farm., spec.1 Simona Mitrovič, mag.farm., spec.2 Tajda Miharija Gala, mag.farm., spec.2 1 Univerzitetna klinika za pljučne bolezni in alergijo Golnik 2 Lekarna Univerzitetni klinični center Ljubljana POROČILO S 43. GENERALNE SKUPŠČINE EAHP -IZVEDENI IN NAČRTOVANI PROJEKTI NA PODROČJU BOLNIŠNIČNE FARMACIJE V DRŽAVAH ČLANICAH EAHP V LETIH 2012/2013 IN 2013/2014 Na generalni skupščini (GS) EAHP letos junija v Atenah smo v dveh dneh zelo polnega programa obravnavali predstavitev različnih aktivnosti, ki so potekale v okviru EAHP v letu 2013 ter se seznanili z načrti za leto 2014. Splošni del ali delovanje EAHP na področju »politike« Predstavitev predsednika Roberta Frontinija je zajemala politične aktivnosti, ki sta jih izvedla z lobistom Richardom Priceom na področju priznavanja specializacije iz bolnišnične farmacije in uvedbe črtnih kod na posamezno enoto zdravila (single unit), ki se uporabljajo v naprednejših bolnišnicah. Njuno delo je bilo poleg tega usmerjeno tudi v sodelovanje s sorodnimi organizacijami: EMA (sodelovanje bolnišničnih farmacevtov na področju kliničnih študij), EDQM (področje ponarejenih zdravil), EPSA (vključevanje študentov v delo EAHP), Europharm Forum (sodelovanje bolnišničnih farmacevtov in farmacevtov javnih in zasebnih lekarn), PGEU (skupna izjava o bodoči vlogi farmacevtov zlasti v kliniki). Predsednik je predstavil tudi dva projekta, in sicer »Survey EAHP 2010«; raziskavo o stanju bolnišnične farmacije v državah članicah, ki se je zaključila z objavo 5 člankov in brošuro. Drugi projekt »European Summit on Hospital Pharmacy«, katerega načrtovanje se je začelo v letih 2012/2013, bo izveden v maju 2014. Na tem srečanju bo ob sodelovanju združenj zdravnikov, medicinskih sester in bolnikov oblikovan jasen okvir razvoja bolnišnične farmacije v Evropi, ki bo temeljil na t.i. Baselskih izjavah iz leta 2008 (FIP Basel statement) in t.i. PPMI modelu, ki ga je leta 2010 sprejelo Ameriško združenje farmacetov v zdravstvenem sistemu (ASHP Dallas Summit). V nadaljevanju so nam svoje delo v preteklem letu predstavili še vodja administrativnega osebja in finančni direktor EAHP, predvsem glede organizacije kongresov, akademij in ostalih srečanj, strokovnega glasila EJHP, kot tudi glede vodenja računovodstva in finančnega poročila za preteklo leto ter predvidenih stroškov in prihodkov za leto 2013/2014. Svoj pogled na finančno poročilo sta predstavila tudi dva delegata, ki sta opravila svoje delo kot notranja revizorja. NOVOSTI V POSAMEZNIH DRŽAVAH V PRETEKLEM LETU Sledila je kratka, a zelo zanimiva predstavitev dosežkov bolnišnične farmacije v posameznih državah članicah v preteklem letu. Svoja poročila so predstavile vse države, ki so se udeležile GS, to je 29 držav od skupno 32 članic EAHP. Delovanje bolnišničnih farmacevtov poteka na zelo različnih nivojih, od prizadevanj za priznanje, da je bolnišnični farmacevt enakopraven poklic v zdravstvu (zdravstveni delavec), do sodelovanja pri zakonskih podlagah na področjih zdravil in medicinskih pripomočkov. V večini držav so bolnišnični farmacevti organizirali različne oblike strokovnih izobraževanj, kot so npr. simpoziji, e- izobraže- OT O z < z N R O O D O OT O Z < z N =5 CC O O o O vanje. Teme, s katerimi so se spopadli v različnih državah, so bile tudi: • Opozarjanje na težave glede pomanjkanja zdravil • Prenove študijskih programov (zlasti na področju specializacije) in predmetnikov dodiplomskega študija • Sodelovanje pri nacionalnih projektih za zagotavljanje varnosti bolnikov, predvsem na področju onkologije, uporabe zdravil pri starejših bolnikih, uporabe zdravil s podobnim videzom in/ali imenom,... • Uporaba črtnih kod ob postelji bolnika z vidka razvoja sistemov za zmanjševanje napak, povezanih z zdravili, kot tudi z vidika preprečevanja uporabe ponarejenih zdravil • Postavitev kazalnikov kakovosti v sklopu farmacevtske skrbi • Ureditev delovanja bolnišničnih farmacevtov v sklopu akreditacij bolnišnic. V nekaterih državah (Velika Britanija, Nizozemska, Irska, Švica ...) neodvisno od modela specializacije iz bolnišnične farmacije, ki ga predlaga EAHP, pripravljajo nadgradnjo izobraževanja farmacevtov dodiplomsko in podiplomsko, predvsem z namenom povečanja kliničnih spretnosti ob zaključku izboraževanja. V Veliki Britaniji so farmacevti izpostavili tudi pomembnost vključevanja farmacevtskih tehnikov v procese v bolnišnicah in dekriminiziranja napak, povezanih z zdravili. SODELOVANJE PRI SKUPNIH PROJEKTIH ALI ZGOLJ ZAVEDANJE IZZIVOV? V nadaljevanju GS so bile podrobneje predstavljene aktivnosti na področju priznavanja specializacije iz bolnišnične farmacije. Farmacevti predstavljajo enega od 7 poklicev (poleg zdravnikov, osebja zdravstvene nege, zobozdravnikov, babic, arhitektov in veterinarjev), ki so trenutno »avtomatsko« priznani v vseh državah EU. Vendar pa so le pri dveh poklicih (zdravniki, zobozdravniki) priznane tudi posamezne specialnosti (npr. kardiologija). EAHP si je pri Evropskem parlamentu prizadeval za dopolnilo direktive, ki bi omogočala priznanje specializacije iz bolnišnične farmacije med državami članicami in v oktobru so bili sprejeti predlagani amandmaji. Osnova za specializacijo iz bolnišnične farmacije bo predstavljal t.i. common training framework, ki ga bo EAHP zasnoval in predlagal na osnovi dosedanjih podatkov o že obstoječih specializacijah v državah članicah in raziskovalnem projektu Pharmine iz leta 2011. K sodelovanju pri oblikovanju tega modela, ki se bo začelo predvidoma konec leta 2013, so povabljene vse države članice. Zelo pereč problem v vseh državah članicah je tudi uvedba črtnih kod na posamezno enoto zdravila, ker industrija običajno ne kaže interesov za tovrstne spremembe. Pogovori potekajo med EAHP in EFPIA in EGA (evropski združenji proizvajalcev originatorskih in generičnih zdravil). EAHP je pobudnik sestanka med uporabniki (bolnišničnimi farmacevti), nacionalnimi agencijami in ministrstvi za zdravje ter predstavniki industrije, ki je bil v oktobru v Univerzitetni bolnišnici Leuven v Belgiji, kjer je bila predstavljena uporaba črtne kode ob postelji pacienta. Dotaknili smo se tudi aktivnosti na področju reševanja problema globalnega pomanjkanja zdravil, ki lahko nastane iz različnih razlogov (motnje v verigi preskrbe, proizvodnji, dostopnosti.....) ter vpliva oblikovanja cen in povračila stroškov s strani zavarovalnic na pomanjkanje zdravil. S pomanjkanjem zdravil so povezane tudi težave s t.i. paralelnim uvozom in izvozom zdravil predvsem pri zdravilih za redke bolezni. Zanimiva je bila tudi izmenjava mnenj, ki je sledila predsednikovi predstavitvi nove izjave EAHP glede medicinskih pripomočkov. Ob predlogu, da EAHP podpre zahtevo po centralni avtorizaciji za medicinske pripomočke z visokim tveganjem, so nekateri delegati izrazili skrb glede primernega znanja in izobraževanja v zvezi z medicinskimi pripomočki. Predsednik je opozoril na različno stanje v državah članicah, saj so glede na raziskavo EAHP (Survey EAHP 2010) medicinski pripomočki v nekaterih državah (Francija, Italija) ena od ključnih kompetenc bolnišničnih farmacevtov. Delegat iz Velike Britanije je utemeljil kompetenco za medicinske pripomočke z dejstvom, da so nekatere tekočine za intraven-sko uporabo, ki so uvrščene med medicinske pripomočke, že v domeni številnih bolnišničnih farmacevtov. Predstavljena je bila tudi izjava o varčevalnih ukrepih, pri kateri pa so delegati opozorili, da jo bo potrebno še dopolniti, še zlasti z vidika dobrobiti bolnikov, na katero varčevalni ukrepi lahko vplivajo v veliki meri. lefoniranja med programom, čemur smo čedalje pogosteje priča na izobraževanjih in sestankih. Večina delegatov zelo tekoče komunicira v angleščini, tudi delegati iz pregovorno šibkejših romansko govorečih držav niso prav nič zaostajali, prav nasprotno. Predstavitve so bile obvezno znotraj dovoljenih časovnih okvirov, diskusija pa, kljub različni razvitosti bolnišnične in klinične farmacije med državami, na enakopravnem nivoju, ne glede na položaj ali izkušenost delegatov. To pa je pravzaprav pogoj in dobra osnova za sodelovanje ter izmenjavo mnenj in idej. GS se je nadaljevala z razpravo o Direktivi o ponarejenih zdravilih. V razvoju sta namreč dva ločena sistema za preverjanje verodostojnosti zdravil. Glavno vprašanje je bilo, kje naj poteka verifikacija zdravil v bolnišnicah (ob prevzemu v bolnišnični lekarni, ob odprtju pakiranja v bolnišnični lekarni, ob izdaji iz bolnišnične lekarne, ob aplikaciji ob postelji bolnika). Sistemi v razvoju so bolj osredotočeni na javne lekarne, kjer verifikacija poteka ob izdaji zdravil pacientu. Tovrstni sistemi so bili že vpeljani v Turčiji, kjer pristnost zdravil preverjajo ob vstopu v bolnišnično lekarno, kar pa z vidika bolnišničnih farmacevtov pomeni zamuden proces (2 farmacevta v večjih bolnišnicah za polni delovni čas). Seznanili smo se tudi z napredkom revije EJHP, s pripravami na izobraževalne teme kongresov ter možnostmi za pridobivanje izkušenj v posameznih bolnišnicah za študente. Naslednji dan smo, razdeljeni v več skupin, v sklopu delavnic predstavljeno tematiko obravnavali še podrobneje ter nato ugotovitve in predloge kratko predstavili preostalim delegatom. Predstavili sta se tudi dve novi državi, članici EU, kandidatki za članstvo v EAHP, Malta in Romunija. Predstavitev je ponovno pokazala, da so med državami članicami precejšnje razlike glede stanja bolnišnične farmacije. KAJ PA BONTON? Kar me je kot novinko na tovrstnih srečanjih pozitvno presenetilo izven strokovnih vsebin programa, je bila sama organizacija in potek GS. GS je potekala izjemno točno -vodila jo je slovenska predstavnica v odboru, podpredsednica EAHP Tajda Miharija Gala. Ker posamezni delegati predstavljajo svojo državo, tudi pri udeležencih ni bilo nobenega zamujanja ali izostajanja, izhodov na kratke ali dolge telefonske seanse, ali še celo te- ZA KONEC...POZITIVNE STVARI, KI SE JIH LAHKO NAUČIMO Predvsem zaradi vključenosti industrije kot sponzorjev in seveda velike ciljne publike, ki jo EAHP kongresi naslavljajo, tovrstna izobraževanja tudi izdatno finančno prispevajo k uspešnemu poslovanju organizacije. Pri tem se je sicer težko izogniti pomislekom glede (ne)odvisnosti predstavljenih tem, kar je bilo izpostavljeno tudi na GS. Vendar EAHP uspeva zadržati neodvisnost z doslednim upoštevanjem Kodeksa etike EAHP, to je z neodvisno izbiro tematike posameznih seminarjev in predavanj ter predavateljev. Pozitivna pa je že tudi sama misel, da je v gospodarsko težkih časih organizacija izobraževanj lahko finančno uspešna. Redni bralci EJHP (s trenutno majhnim faktorjem vpliva) opažamo, da se je s spremembo založnika (sedaj Skupina British Medical Journals, od januarja 2012) in novim urednikom (prejšnjim direktorjem UK Cochrane centra), dvignila kakovost prispevkov, ki sledijo aktualnim temam. Slovenska bolnišnična farmacija je bila že trikrat predstavljena v EJHP Country Focus, kjer smo sodelovali s prispevki o razvoju in aktivnostih bolnišnične in klinične farmacije v različnih slovenskih bolnišnicah. Še vedno pa ostaja vprašanje in opomnik vsem nam slovenskim farmacevtom, zakaj svojega dela, ki je po kakovosti nedvomno primerljivo z delom farmacevtov v ostalih državah članicah, ne zmoremo kronati tudi z objavo strokovnih in znanstvenih člankov v EJHP, ki bo sčasoma pridobil tudi na faktorju vpliva. EAHP je aktivna na številnih področjih, tako kot organizacija, kot tudi posamezne članice. V Sloveniji se srečujemo s podobnimi težavami in izzivi kot ostale članice. Žal pa možnosti izmenjave izkušenj ne izkoristimo in (ne samo v Sloveniji) izumljamo marsikaj od začetka, z izgovorom, da je naš položaj nekaj posebnega. Predstavitev delovanj posameznih držav je koristno zlasti z vidika izmenjave mnenj in sodelovanja - npr. pri zdravilih s podobnim imenom in videzom, dopolnjevanjem kompetenc,... m O z < z N =5 CC O O o O Tovrstna srečanja in priprava poročil je nedvomno koristna tako med državami, kot tudi med bolnišnicami (farmacevti) znotraj ene države. Vsakokrat, ko moramo pripraviti poročilo, kaj smo v preteklem letu naredili in se seznanjamo, kako produktivni so bili kolegi iz drugih držav, si lahko ob pravem odmerku samokritike in samozavesti postavimo nove temelje za svojo strokovno rast in napredek. RAZPIS ZA PODELITEV DRUŠTVENIH PRIZNANJ V LETU 2014 Odbor za podeljevanje društvenih priznanj objavlja razpis za podelitev društvenih priznanj v letu 2014. Podružnice in sekcije prijavijo kandidate skladno z določili Pravilnika o podeljevanju društvenih priznanj najkasneje do 31. januarja 2014. Za utemeljitev uspešnosti kandidata mora predlagatelj navesti pozitivne spremembe v delovnem okolju, ki so posledica kandidatovih aktivnosti. Iz predloga mora biti razvidno, kako je kandidat v smislu kvalitete in kvantitete presegel svoje obveznosti, ki izhajajo iz opisa del in nalog delovnega mesta, ki ga zaseda. Predlogi morajo biti pripravljeni na obrazcih, ki so sestavni del Pravilnika. Predlog za podelitev društvenih priznanj mora predlagatelj poslati skupaj s prilogami v enem izvodu v elektronski obliki na naslov: info@sfd.si in v enem izvodu v tiskani obliki tajništvu Slovenskega farmacevtskega društva najkasneje do 31. januarja 2014. Elektronsko oddane prijave, posredovane po elektronski pošti, morajo biti popolnoma enake kot pisne, poslane z navadno pošto. Spoštovani bralci, avtorji im recenzenti! V imenu uredništva Farmacevtskega vestnika se vam želim tudi ob koncu leta 2013 zahvaliti za sodelovanje. V letošnjem letu je Farmacevtski vestnik ubral novo pot oziroma smo obrnili nov list. Uredniški odbor vsekakor upa, da vam je Farmacevtski vestnik v novi prenovi všeč tako oblikovno kot tudi seveda vsebinsko. Trudimo se po najboljših močeh izbirati zanimive teme, ki so v današnjem prostoru aktualne. Naj izkoristim tudi priložnost in povabim Vas, da se opogumite in tudi sami pošljete prispevke in s tem prispevate zanimive vsebine v naš/vaš Farmacevtski vestnik. Prispevki naj ne bodo za nas le črke in slike na papirju, oziroma nabirek točk za katere se potegujemo, ampak naj predstavljajo obogatitev/gojitev našega strokovnega jezika, kot tudi orodje za prenos znanja. Bodite aktivni! Upajte si! Veseli bomo vaših razmišljanj ter vsebin. Na koncu pa še želja, ki velja ob času, ko se leto spet obrne -V prihajajočem letu vam želimo veliko zdravja, osebnih uspehov in novih izzivov. Z lepimi željami, Petra Slanc Može - glavna urednica Recenzenti: mag. Miroslava Abazovic, mag. farm., spec. • doc. dr. Tomaž Bratkovič, mag. farm. prof. dr. Darko Černe, mag. farm., spec. • asist. Nejc Horvat, mag. farm. dr. Žiga Jakopin • izr. prof. dr. Janja Marc, mag. farm. doc. dr. Matjaž Jeras, mag. farm. • doc. dr. Mojca Kerec Kos, mag. farm. doc. dr. Mitja Kos, dr. med., spec. • prim. Mojca Kos Golja, dr. med. doc. dr. Nataša Kuželički, mag. farm. • dr. Gašper Marc, mag. farm. dr. Petra Slanc Može, mag. farm. • Tomi Laptoš, mag. farm. dr. Igor Locatelli, mag. farm. • prof. dr. Aleš Mrhar, mag. farm. prof. dr. Borut Štrukelj, mag. farm. • dr. Andrijana Tivadar, mag. farm. doc. dr. Tomaž Vovk, mag. farm. • asist. dr. Nataša Toplak, dr. med. dr. Simon Žakelj, mag. farm. FARMACEVTSKI VESTNIK Letnik 64, 2013 - Letno kazalo o N O PREGLEDNI in ORIGINALNI ZNANSTVENI ČLANKI Arterijska hipertenzija; primerjava sartanov in zaviralcev ACE (Vukan V) 3 Kronično srčno popuščanje - vidik farmacevta (Trobec K) 11 Atrijska fibrilacija in antitrombotiki (Dobrave Verbič M) 18 Predstavitev novih raziskav in odobrenih indikacij pri novih peroralnih antikoagulantih (Petre M) 25 Časovni potek resnih neželenih učinkov verapamila (Locatelli I) 33 Predpisovanje zdravil za srčnožilne bolezni v Sloveniji (Fürst J, Samaluk V) 39 Farmacevtska skrb pri hipertenziji; vloga kliničnega farmacevta v zunanji lekarni (Milovanovič M) 44 Farmacevt in merilniki krvnega tlaka (Farič Tuš V) 51 Biološki označevalci in njihova uporaba pri razvoju in zagotavljanju varnosti zdravil / (Fic A, Peterlin Mašič L, Sollner Dolenc M) 57 Sodobna uporaba zdravilnih rastlin v Evropski uniji (Janeš D) 91 Regulativa izdelkov iz zdravilnih rastlin (Razinger B) 94 Zdravilne rastline in vpliv regulatornih zahtev na javno zdravje - izziv ali priložnost (Kočevar Nared J) 103 Klinične raziskave v fitoterapiji (Kočevar Glavač N, Stojilkovski K) 112 Glukozamin - kritičen pogled z vidika delovanja in biološke uporabnosti (Kerec Kos M) 118 Astma - osnovne značilnosti bolezni in temelji zdravljenja (Morgan T) 124 Sodobna sintezna zdravila za zdravljenje astme (Kikelj D) 129 Sodobna biološka in rastlinska zdravila za zdravljenje astme (Berlec A) 137 Stroškovna učinkovitost zdravil za zdravljenje astme (Locatelli I, Trček J, Kos M) 143 Pljučne bolezni in cigarete: ali trošarina pokrije zdravljenje? (Štrukelj B) 146 Farmacevtske kognitivne storitve osnovane na pregledu zdravil (Kos M) 151 Farmacevtske kognitivne storitve - Pogled farmacevta v lekarni (Pisk N, Ilešič I) 156 Farmacevtske kognitivne storitve pri zdravljenju z zdravili - Pogled farmacevta na kliničnem oddelku bolnišnice (Petre M) 161 Farmacevtske kognitive storitev pri zdravljenju z zdravili - Pogled farmacevta svetovalca v ambulanti (Premuš Marušič A) 165 Klinični primeri bolnikov z astmo v bolnišnični praksi (Knez L) 169 Klinični primeri bolnikov z astmo v bolnišnični praksi; težave pri vodljivosti bolnikov (Toni J) 174 Astma - klinični primeri iz lekarniške prakse (Balaban M, Okretič Likovič N) 178 Nastanek, razvoj in diagnostika Alzheimerjeve bolezni (Emeršič A, Pirtošek Z) 191 Zdravljenje Alzheimerjeve bolezni (Emeršič A, Pirtošek Z, Stempelj M, Štrukelj B) 202 Socialno in ekonomsko breme Alzheimerjeve bolezni (Pirtošek Z) 208 Peptidni agonisti receptorja za glukagonu podobni peptid-1 ter njihova uporaba pri zdravljenju sladkorne bolezni tipa 2 in debelosti (Deželak M, Bavec A) 211 Zaviralci ureaze (Frlan R) 218 Teoretične osnove 13C dihalnih testov (Suhadolc K., Sešek Briški A., Osredkar J) 227 Samozdravljenje akutne driske pri otroku (Madjar M) 236 Vnetne revmatične bolezni (Ješe R, Tomšič M) 267 Zdravila za zdravljenje revmatičnih bolezni (Abazovic M) 272 Interakcije zdravil za zdravljenje revmatičnih bolezni (Roškar R) 281 Podobna biološka zdravila - vidik stroke, bolnika in plačnika (Laptoš T) 286 Uporaba bioloških zdravil v revmatologiji (Rotar Ž) 293 Zdravljenje revmatičnih bolezni pri otrocih in mladostnikih (Koren B) 299 Zavzetost za zdravljenje z zdravili - zakaj je tako nizka in kaj lahko storimo? (Antolič R) 304 Fizioterapija pri bolnikih z revmatičnimi boleznimi (Vinšek H) 309 Problematika pri izdaji zdravil na obnovljive recepte (Pisk N, Banovic A) 314 Kronična mieloična levkemija (Pajič T, Marc J, Preložnik Zupan I) 343 Kronična limfatična levkemija (Podgornik H, Gržinič N, Černelč P) 354 Neinvazivno predporodno presejanje za anevploidije na osnovi proste plodove DNA -pregled razvoja in priporočila za klinično prakso (Strah D, Bernik J) 363 Zdravljenje in preprečevanje malarije (Starkl K, Mravljak J) STROKOVNI ČLANKI Posebnosti pri zaviralcih adrenergičnih receptorjev p (Jošt M) 371 Citokrom P450 - oksidoreduktaza (POR) v biosintezi holesterola (Rozman D, Fon Tacer K) 380 Pomen ocene albuminurije in proteinurije pri novoodkritih bolnikih s sladkorno boleznijo tipa 2 (Mavsar Najdenov B, Rus I, Avberšek Lužnik I) 385 S klozapinom povzročena agranulocitoza (Štuhec M) 66 Samoprilagajanje srčnožilne terapije (Jagodic Vilfan AH) 68 Brezšivna skrb pri srčnožilnih bolnikih (Pehan S) 71 Obravnava revmatičnega bolnika ob uvedeni biološki terapiji - klinična primera iz lekarniške prakse (Ogulin D) 323 Nefarmakološki ukrepi pri revmatičnih težavah (Abram T) 328 Klinični primeri revmatičnih bolnikov v specialistični ambulantni obravnavi: potek bolezni in izzivi pri svetovanju (Laptoš T) 331 PREBRALI SMO ZA VAS (Štrukelj B, Gerzej L) 74, 246, 335, 392 NOVI DOKTORJI ZNANOSTI (Zupan J) 78, 250, 396 IZ DRUŠTVENEGA ŽIVLJENJA 256, 401 PREDSTAVITEV KNJIGE 187 OSEBNE VESTI 262 FARMACEVTSKI VESTNIK Vol 64, 2013 - Content o < o z i— LU REVIEW AND ORIGINAL SCIENTIFIC ARTICLES Pharmacist and non-invasive blood pressure monitoring devices (Farič Tuš V) 51 Arterial hypertension; comparison of ACE inhibitors and sartans (Vukan V) 3 Biomarkers and their use in drug safety assessment (Fic A, Peterlin Masic L, Sollner Dolenc M) 57 Chronic heart failure - a pharmacist's view (Trobec K) 11 Modern use of medicinal herbs in EU (Janes D) 91 Atrial fibrillation and antithrombotic therapy (Dobravc Verbic M) 18 Latest clinical trials and approved indications of new oral anticoagulants (Petre M) 25 Regulation of products derived from medicinal herbs (Razinger B) 94 Time course of serious adverse effects of verapamil (Locatelli I) 33 Prescribing of cardiovascular drugs in Slovenia (Fürst J, Samaluk V) 39 Pharmaceutical care in hypertension management; role of clinical pharmacist in community pharmacy (Milovanovic M) 44 Impact of regulatory requirements for herbals to public health - Challenge or opportunity (Kočevar Nared J) 103 Clinical trials in phytotherapy (Kočevar Glavač N, Stojilkovski K) 112 Glucosamine - a critical review of its efficacy and bioavailability (Kerec Kos M) 118 Astma - osnovne značilnosti bolezni in temelji zdravljenja (Morgan T) 124 o < o Modern synthetic drugs for treatment of asthma (Kikelj D) Modern biological and plant drugs for the treatment of asthma (Berlec A) 137 Cost-effectiveness of drugs for asthma treatment (Locatelli I, Trček J, Kos M) 143 Lung diseases and smoking: does excise duty cover all health expences? (Štrukelj B) 146 Pharmaceutical cognitive services based on medication review (Kos M) 151 Pharmaceutical cognitive services from the community pharmacist's perspective (Pisk N, Ilešič I) 156 Pharmaceutical cognitive services in pharmacotherapy - Pharmacist's perspective at a hospital ward (Petre M) 161 Pharmaceutical cognitive services in pharmacotherapy - Pharmacist's consultant perspective at an ambulance (Premuš Marušič A) 165 Asthma patients in a hospital setting - case reports (Knez L) 169 Asthma patients in a hospital settings - case report of a patient with poor compliance (Toni J) 174 Asthma: clinical cases in pharmacy practice (Toni J) 178 Ethiopathogenesis and diagnostics of Alzheimer disease (Emeršič A, Pirtošek Z) 191 Treatment of Alzheimer's disease (Emeršič A, Pirtošek Z, Štempelj M, Štrukelj B) 202 Alzheimer disease: social and economic burden (Pirtošek Z) 208 Glucagon like peptide-1 receptor agonists and their application in treatment of diabetes mellitus type 2 and obesity (Deželak M, Bavec A) 211 Urease inhibitors (Frlan R) 218 Theoretical basics 13C breath test (Suhadolc K., Sešek Briški A., Osredkar J) 227 Self-medication of acute diarrhoea in children (Madjar M) 236 Inflammatory rheumatic diseases (Ješe R, Tomšič M) 267 Drugs for the treatment of rheumatic diseases (Abazovic M) 272 Interactions between drugs for treatment of rheumatic diseases (Roskar R) 281 Similar biological medicinal products -a healthcare professional, a patient, and a healthcare payer perspective (Laptos T) Antimalarial therapy and prophylaxis (Starkl K, Mravljak J) Clozapine-induced agranulocytosis (Štuhec M) Non-pharmacological treatment in rheumatic disorders (Abram T) Use of biologic disease modifying drugs in rheumatology (Rotar Z) 293 Treatment of rheumatic diseases in childhood and adolescence (Koren B) 299 Medication interest - why is it so low and what can we do about it? (Antolic R) 304 Physiotherapy in patients with rheumatic diseases (Vinsek H) 309 Problems in dispensing medicines prescribed on the repeat prescriptions (Pisk N, Banovic A) 314 Chronic myeloid leukemia (Pajic T, Marc J, Preloznik Zupan I) 343 Chronic lymphocytic leukemia (Podgornik H, Grzinic N, Cernelc P) 354 Non-invasive prenatal screening for aneuploidies using cell-free fetal DNA - progress and recommendations for clinical practice (Strah D, Bernik J) 363 371 Cytochrome P450 - oxidoreductase (POR) in the biosynthesis of cholesterol (Rozman D, Fon Tacer K) 380 The role of albuminuria and proteinuria assessment in newly diagnosed type 2 diabetes patients (Mavsar Najdenov B, Rus I, Avberšek Lužnik I) 385 PROFESSIONAL ARTICLES Considerations regarding the use of ß blockers (Jošt M) 64 66 Medication self-adjustment in cardiovascular treatment (Jagodic Vilfan AH) 68 Seamless care in cardiovascular patients (Pehan S) 71 Rheumatic patients treatment after the introduction of biological therapy - clinical cases in pharmacy practice (Ogulin D) 323 328 Rheumatic patient in out-patient hospital setting -clinical case: Disease progress and counselling challenges (Laptoš T) 331 SHORT PHARMA NEWS (Štrukelj B, Gerzej L) 74, 246, 335, 392 NEW DOCTORS OF SCIENCE (Zupan J) 78, 250, 396 ACTIVITIES OF THE SOCIETY 256, 401 NEW BOOKS 187 PERSONAL NEWS 262 AVTORSKO KAZALO / INDEX OF AUTHORS Vol 64, 2013 - Content Abazovic M 272 Kikelj D 129 Premuš Marušič A 165 Abram T 328 Knez L 169 Razinger B 94 Antolič R 304 Kočevar Glavač N 112 Roškar R 281 Avberšek Lužnik I 385 Kočevar Nared J 103 Rotar Ž 293 Balaban M 178 Koren B 299 Rozman D 380 Banovic A 314 Kos M 143 Rus I 385 Bavec A 211 Kos M 151 Samaluk V 39 Berlec A 137 Laptoš T 286, 331 Sešek Briški A 227 Bernik J 363 Locatelli I 33, 143 Sollner Dolenc M 57 Černelč P 354 Madjar M 236 Starkl K 371 Deželak M 211 Marc J 343 Stojilkovski K 112 Dobrave Verbič M 18 Mavsar Najdenov B 385 Strah D 363 Emeršič A 191, 202 Milovanovič M 44 Suhadolc K 227 Farič Tuš V 51 Morgan T 124 Štempelj M 202 Fic A 57 Mravljak J 371 Štrukelj B 74, 146, 202, 246, Fon Tacer K 380 Ogulin D 323 335, 392 Frlan R 218 Okretič Likovič N 178 Štuhec M 66 Fürst J 39 Osredkar J 227 Tomšič M 267 Gerzej L 246, 335, 392 Pajič T 343 Toni J 174 Gržinič N 354 Pehan S 71 Trček J 143 Ilešič I 156 Peterlin Mašič L 57 Trobec K 11 Jagodic Vilfan AH 68 Petre M 25, 161 Vinšek H 309 Janeš D 91 Pirtošek Z 191, 202, 208 Vukan V 3 Ješe R 267 Pisk N 156, 314 Zupan J 78 250, 396 Jošt M 64 Podgornik H 354 Kerec Kos M 118 Preložnik Zupan I 343 o < £ OT CC O Si m Zdravljenj» globoka vernica Irombo» (GVT) in preprečevalni« ponovne GVT pn ■odraslih %XareJto z rivaroksabanom ■ <1 mihjam bolnikov • 100.000 bolnikov vključenih pn dpr«ts jahiIj vl( baliukov V pro^nm kliniinJh pruiVLri.in; uu w na re Ito.co m «■ registriran v v« Kot 1 JU državah • učinkovi (oil fl n K aron a V 11 klinknlti pf*tku£sn|lh • S rtflTitriranlh Jnditatjf malginikfl h Api ih ljiErmihc ambglijt pri Ddraillh bolnikih c nivalvulAma nI nji*t, fhbrliaiijo In r<-rim al.vti drjiimikh iiMgjnfn. Zdfavljonjn pljučna imbnlijo (K) ,r. prapr*{avanja ponovno P F pri odrnih rropr c lu m.i r.| ■■ Bt