Kvasovke – tovarne rekombinantnih proteinov Yeasts – factories for recombinant proteins Mateja Novak Ĝtagoj, Marjetka Podobnik Povzetek Kvasovka Saccharomyces cerevisiae, bolj poznana kot pekovska ali pivska kvasovka, ĉe tisoœetja igra pomembno vlogo pri pripravi hrane. Najbolje prouœeni evkariontski mikroorganizem pa je zaradi svojih lastnosti tudi pomembno orodje za pridobivanje rekombinantnih pro-teinov. S. cerevisiae je primeren gostiteljski organizem za visoko produkcijo ĝtevilnih proteinov: protiteles, hormonov, rastnih dejavnikov ter drugih farmacevtsko pomembnih makromolekul. Dobro poznavanje njene genetike in fiziologije omogoœa uspeĝno naœrtovanje vektorjev, post-translacijskih modifikacij in visoko-produkcijskih gostiteljskih sevov. Kljuœne besede: ekspresijski sistemi, rekombinantni proteini, kvasovka Saccharomyces cerevisiae, promotorji GAL, glikoinĉeniring. Abstract Yeast Saccharomyces cerevisiae, also known as a baker's or brewer's yeast, has played a considerable role in food production for several thousand years. The best characterized eukaryotic microorganism has several properties which have also established it as an impor-tant tool in expression of recombinant proteins. It is a suitable host organism for high level production of numerous proteins including hormones, growth factors, antibodies and other pharmaceutically important macromolecules. The well known genetics and physiology of yeast S. cere-visiae enable effective design of vectors, post-translational modifications and development of highly-productive host strains. Key words: expression system, recombinant protein, yeast Saccharomyces cerevisiae, GAL promoters, glycoengineering 1 Uvod Rekombinantna tehnologija DNA je v 70-letih postavila prelomnico v razvoju moderne biotehnologije. Naĝe poznavanje zgradbe in delovanja DNA je v zadnjih 100 letih napredovalo nekako po stopnjah, vendar pa so nekatera odkritja imela prav poseben vpliv na razvoj sodobne biotehnologije. Odkritje, da DNA prenaĝa genske informacije ter razvoj genskih metod za manipulacije in vitro so omogoœili izolacijo tarœnega gena iz doloœenega genetskega vira, vstavitev v ustrezen ekspresijski vektor ter njegovo izraĉanje v primernem ekspresijskem sistemu, to je gostitelju, ki je namenjen biosintezi tarœnega proteina. Prvi rekombinantni protein, ki se je pred 25 leti pojavil na ameriĝkem trĉiĝœu, je bil inzulin, pridobljen v bakteriji Escherichia coli (1). Sledil je strm vzpon tovrstnih uœinkovin v medicinski uporabi. Pripravki z rekombinantnimi uœinkovinami so v preteklih letih tako predstavljali kar 10 % celotne svetovne prodaje farma-cevtikov. Na trĉiĝœu je trenutno okrog 200 terapevtskih proteinov, v Evropski skupnosti jih je odobrenih okoli 90, dodatnih 500 pa jih je v fazi kliniœnega preizkuĝanja (2). 2 Ekspresijski sistemi Ekspresijski sistem oz. gostitelj heterologne DNA mora v kratkem œasu, s stabilnim produkcijskim procesom, ponovljivo proizvajati œim veœje koliœine pravilno zvitega in aktivnega tarœnega proteina. Izbira ekspresijskega sistema je najveœkrat pogojena z znaœilnostmi in namenom uporabe rekombinantnega proteina (Preglednica 1). Pri biosintezi farmacevtskih proteinov sta predvsem pomembna dejavnika, ki doloœata izbor ekspresijskega sistema, avtentiœnost in varnost produkta, nasprotno pa je pri produkciji npr. industrijskih encimov pomembno, da rekombinantna tehnologija DNA omogoœi hitro in ekonomiœno pridobivanje veœjih koliœin ĉelenega produkta (3). Produkcija farmacevtsko pomembnih rekombinantnih proteinov je zaenkrat omejena na bakterijo E. coli, navadno kvasovko S. cerevisiae, in na sesalske celice, medtem ko tehniœne encime biosintetizirajo v bakterijah, kvasovkah in filamentoznih glivah. Za produkcijo velikih koliœin proteinov v industrijskem merilu veœinoma uporabljamo mikroorganizme, zaradi njihove laĉje manipulacije in vitro, enostavnega gojenja in ekonomiœnosti proizvodnje. Pomanjkljivosti in omejitve opisanih organizmov (odsotnost posttranslacijske maĝinerije, nezmoĉnost tvorbe disulfidnih vezi, nepravilna in prekomerna glikozilacija), so zahtevali razvoj ĝe drugih ekspresijskih sistemov, primernejĝih za izraĉanje kompleksnejĝih proteinov humanega izvora, kot so: rastlinske celice, celice insektov in sesalske celice. Kot alternativa celiœnim ekspresijskim sistemom se v zadnjem œasu uveljavljajo tudi brezceliœni ekspresijski sistemi. Transkripcija in translacija matriœne DNA poteka in vitro najveœkrat avtomatizirano, v reakcijski meĝanici, ki vsebuje potrebne substrate (tRNA, aminokisline, ATP...) in bakterijski ekstrakt z RNA polimerazo in ribosomi. Prednosti se kaĉejo predvsem pri biosintezi proteinov, ki se v celicah izraĉajo v netopni obliki, so obœutljivi za razgradnjo z intracelularnimi proteazami, ali pa je njihova sinteza za celice toksiœna (5). Mateja Novak Ĝtagoj, mag. farm., Kemijski inĝtitut Ljubljana, Laboratorij za biosintezo in biotransformacijo, Hajdrihova 19, 1000 Ljubljana, Slovenija dr. Marjetka Podobnik, univ. dipl. kem., Kemijski inĝtitut Ljubljana, Laboratorij za biosintezo in biotransformacijo, Hajdrihova 19, 1000 Ljubljana, Slovenija farm vestn 2006; 57 235 Pregledni œlanki - Review Articles Preglednica 1. Primerjava znaœilnosti razliœnih ekspresijskih sistemov (4). Table 1. Characteristics comparision of different expression system (4). Znaœilnosti Bakterije (E. coli) Kvasovke (S. cerevisiae) Insektne celice Sesalske celice Hitrost rasti Hitra (30 min) Hitra (90 min) Poœasna (18-24 h) Poœasna (24 h) Rastno gojiĝœe Enostavno Enostavno Kompleksno Kompleksno Cena rastnega gojiĝœa 4, j, ^ f Prisotnost retrovirusov Moĉni Prisotnost pirogenov Moĉni Ne Ne Ne Stopnja izraĉanja proteina ‘ do ’ Molekulska masa proteina 4/ t t t Zunajceliœno izraĉanje Izloœanje v periplazmo Izloœanje v gojiĝœe Izloœanje v gojiĝœe Izloœanje v gojiĝœe Zvitje proteina Pogosto neustrezno Veœinoma pravilno Pravilno Pravilno Tvorba S-S mostiœkov Omejena Ni omejitev Ni omejitev Ni omejitev Agregacija Tvorba inkluzijskih teles Posamezen protein, Posamezen protein, Posamezen protein, nativna oblika nativna oblika nativna oblika N-glikozilacija Û Visoko manozna Preprosta, brez sialiœne kisline Kompleksna, veœinoma ustrezna O-glikozilacija Û ••• Fosforilacija Û ••• Acetilacija Û ••• Acilacija Û ••• g-karboksilacija ÛÛÛ? Legenda: ? Je Û Ni ’Visoka ‘Nizka 3 Kvasovka Saccharomyces cerevisiae Kvasovke so enoceliœni organizmi in spadajo med najenostavnejĝe evkarionte. Tako kot viĝji evkarionti imajo podobno osnovno subcelularno organizacijo s prisotnim jedrom, mitohondriji, endoplazmatskim retikulumom, golgijevim aparatom, sekretornimi vezikli, vakuolami in mikrotelesi. Pekovska kvasovka Saccharomyces cerevisiae med kvasovkami zasluĉi posebno mesto, saj je njena uporaba v prehrambene namene skoraj tako dolga kot naĝa civilizacija. Prednost S. cerevisiae je ĝe v tem, da ima status GRAS (Generally Regarded As Safe) in za veœino genskih manipulacij ni etiœno sporna. Dobro poznavanje njenih molekularnih in biokemijskih lastnosti je omogoœilo razvoj specifiœnih, tako klasiœnih kot rekombinantnih genskih tehnik. Prvi evkariontski klonirni in ekspresijski vektorji so bili razviti prav za S. cerevisiae (6). Na njihovi osnovi se je ĉe v zgodnjih 80-ih letih razvila proizvodnja ĝtevilnih, zlasti farmacevtsko zanimivih rekombinantnih proteinov v industrijskem merilu (Preglednica 2). Kvasovke kot gostiteljski sistem so primerni za intracelularno in ekstracelularno izraĉanje genov razliœnega izvora (humanega, ĉivalskega, rastlinskega ali virusnega). Izraĉanje tujih genov vkljuœuje veœ korakov (Slika 1): 1. Vkljuœitev tuje kodirajoœe sekvence DNA (cDNA) v primerno ekspresijsko kaseto (vektor), ki vsebuje kvasni promotor in terminator. 2. Transformacija oz. vnos vektorja v ustrezen gostiteljski sev ter stabilno vzdrĉevanje le-tega v celicah. 3. Sinteza heterolognega proteina pri specifiœnih, toœno doloœenih pogojih gojenja. 4. Izolacija in œiĝœenje tarœnega proteina. Slika 1: Oris tipiœnega postopka produkcije heterolognega (tujega) proteina. Figure 1: Description of typical procedure for heterologous (foreign) protein production. 236 farm vestn 2006; 57 Kvasovke – tovarne rekombinantnih proteinov Preglednica 2. Terapevtski proteini, ki jih proizvajajo v kvasovkah S. cerevisiae in P. pastoris (2). Table 2. Therapeutic proteins produced in yeasts S. cerevisiae and P. pastoris (2). Rekombinantni pripravki na trĉiĝœu Pripravek Rekombinantni protein Proizvajalec Ekspresijski sistem Actrapid inzulin NovoNordisk S. cerevisiae Ambrix hepatitis B antigen GlaxoSmithKline S. cerevisiae Comvax hepatitis B antigen Merck S. cerevisiae Elitex uratna oksidaza Sanofi-Synthelabo S. cerevisiae Glucagen glukagon Novo Nordisk S. cerevisiae HBVAXPRO hepatitis B antigen Aventis Pharma S. cerevisiae Hexavac hepatitis B antigen Aventis Pasteur S. cerevisiae Infarinx-Penta hepatitis B antigen GlaxoSmitKline S. cerevisiae Leukine granulocite-makrofage stimulitrajoœi dejavnik Berlex S. cerevisiae Novolog inzulin Novo Nordix S. cerevisiae Pediatrix hepatitis B antigen GlaxoSmithKline S. cerevisiae Procomvax hepatitis B antigen Aventis Pasteur S. cerevisiae Refuldan hirudin/lepirudin Hoechst S. cerevisiae Regranex rh trombocitni rastni dejavnik Ortho-McNeil Pharma (ZDA), Janssen-Cillag (EU) S. cerevisiae Revasc hirudin/desirudin Aventis S. cerevisiae Twinrix hepatitis B antigen GlaxoSmithKline S. cerevisiae Pripravki v razvoju Protein Indikacija Proizvajalec Ekspresijski sistem Angiostatin Antiangiogenski dejavnik EntreMed P. pastoris Elastazni inhibitor Cistiœna fibroza Dyax P. pastoris Endostatin Antiangiogenski dejavnik EntreMed P. pastoris Analog epidermalnega rastnega dejavnika Diabetes Transition therapeutics P. pastoris Inzulinu podoben rastni dejavnik-1 Pomanjkanje le tega Cephalon P. pastoris Humani serumski Stabilizacija volumna krvi Welfide P. pastoris albumin pri opeklinah/ĝoku Inhibitor kalikreina Prirojen angioedem Dyax P. pastoris S. cerevisiae zdruĉuje lastnosti prokariontov kot so hitra rast v enostavnih in poceni gojiĝœih, enostavna genska manipulacija ter sposobnosti viĝjih evkariontov - zmoĉnosti specifiœnih posttranslacijskih modifikacij: proteolitskega procesiranja, zvijanja proteinov, tvorbe disulfidnih vezi in glikozilacije. V primerjavi z bolj kompleksnimi evkariontskimi ekspresijskimi sistemi (celice CHO) je gojenje manj zahtevno, produkcija je hitra in ponavadi daje viĝji dobitek (3, 7). Poleg ĝtevilnih prednosti pa ima uporaba S. cerevisiae tudi nekaj pomankljivosti kot so: nezmoĉnost rasti do visokih gostot, neuœinkovito izraĉanje v gojiĝœe, prekomerna in nepravilna glikozilacija. bilo kar nekaj alternativnih kvasnih ekspresijskih gostiteljev kot so: Pichia pastoris (8) in Hansenula polymorpha (9), Yarrowia lypolytica (10), Kluyveromyces lactis (11), Schizosaccharomyces pombe (12). Zaradi veœje zmogljivosti sinteze in izloœanja heterolognih proteinov, se je za produkcijo v industrijskem merilu najbolj uveljavila metilotrofna kvasovka P. pastoris (Preglednica 2). Njene najpomembnejĝe prednosti so: rast do visokih gostot celiœne biomase na poceni gojiĝœu, stabilna vkljuœitev gena za ĉeleni protein v genom, inducibilno uravnavanje izraĉanja pod moœnim, natanœno uravnavanim promotorjem za alkoholno oksidazo in enostaven prenos v veœje merilo, brez izgube dobitka. 4 Pichia pastoris in druge ne-konvencionalne kvasovke Pomanjkljivosti in nekatere omejitve pri uporabi S. cerevisiae so spodbudile raziskovalce k odkrivanju naravnih potencialov drugih kvasovk in veœjih moĉnosti njihove genske manipulacije. Razvitih je 5 Pristopi za izboljĝanje produkcije rekombinantnih proteinov Raven biosinteze tarœnega proteina v veliki meri doloœajo lastnosti, ki so lastne izraĉenemu proteinu. Vendar pa lahko izkoristek precej farm vestn 2006; 57 237 Pregledni œlanki - Review Articles izboljĝamo z upoĝtevanjem razliœnih dejavnikov, ki vplivajo na izraĉanje genov ter stabilnost produkta. Vkljuœitev heterolognega gena v ekspresijski vektor ĝe ni zadosten pogoj za njegovo dobro izraĉanje. Izraĉanje genov je kompleksen veœstopenjski proces in problemi lahko nastopijo v vseh stopnjah, od transkripcije do stabilnosti proteina. Z razvojem molekularne genetike kvasovk se je moœno poveœalo razumevanje teh procesov. Na voljo imamo ĝtevilne optimizirane vektorje, rekombinantne visoko-produkcijske gostiteljske seve ter nova genska orodja in reĝitve, ki pripomorejo k izboljĝanju izkoristka biosinteze pravilno zvitih in bioloĝko aktivnih proteinov. V prispevku smo se omejili na specifiœne pristope, ki izboljĝajo sintezo genskih produktov na ravni transkripcije, in na tiste, ki omogoœajo produkcijo bioloĝko aktivnih, pravilno glikoziliranih proteinov. 5.1. Inĉeniring galaktoznega sistema Za uœinkovito izraĉanje tujih genov v kvasovkah so potrebn homologni promotorji, to so lastna zaporedja, ki uravnavajo izraĉanje genov. Njihova pravilna izbira predstavlja kritiœno odloœitev, ĝe zlasti œe ĉelimo proizvodnjo prenesti v veœjo merilo. Promotorji kvasovke vsebujejo vsaj tri elemente, ki uravnavajo uœinkovitost in natanœnost zaœetka prepisa: aktivacijsko zaporedje UAS, element TATA in iniciacijski element. Ĝtevilni vsebujejo tudi elemente, ki zavirajo transkripcijo. Veœina promotorjev je le delno uravnavanih Najmoœnejĝi, glikolitiœni promotorji so slabo uravnavani, kar zmanjĝuje njihovo uporabnost. Kljub temu imamo na voljo ĝe ĝtevilne druge; med najbolj preuœene v S. cerevisiae sodijo promotorske sekvence genov GAL1, GAL7 in GAL10, katerih proteinski produkti sodelujejo pri metabolizmu galaktoze. Galaktozni promotorji oz. t.i. promotorji GAL so pomembni za naœrtovanje in konstrukcijo vektorjev, saj omogoœajo visoko produkcijo. Znani sta dve kljuœni prednosti uporabe tovrstnih promotorjev. Prviœ, moĉnost gojenja celic v gojiĝœu, kjer je aktivnost teh promotorjev skoraj popolnoma zavrta, kar omogoœa gojenje do primerne gostote celic (biomase) in sosledno indukcijo. S tem je omogoœena tudi produkcija proteinov, katerih visoka raven moœno spremeni metabolizem in fiziologijo gostiteljske celice ter proteinov, ki so potencialno toksiœni za kvasno celico. Ter drugiœ, ti promotorji spadajo med najmoœnejĝe v S. cerevisiae. Izraĉanje galaktoznih genov je namreœ natanœno uravnavano: v prisotnosti induktorja -galaktoze se izraĉanje teh genov moœno poveœa, tudi do 1000-krat medtem ko glukoza moœno zavira njihovo izraĉanje (6, 13, 14). Znano je, da so neposredno ali posredno v uravnavanje sistema GAL vkljuœeni ĝtevilni geni oz. njihovi produkti (15-18). Pozitivni regulator je transkripcijski dejavnik Gal4p, ki se veĉe na promotorska zaporedja teh genov. Negativni regulator Gal80p v prisotnosti glukoze, z vezavo na Gal4p, prepreœuje indukcijo. GAL4 se v celici izraĉa v zelo nizki koliœini (le ena do dve molekuli). Za optimalno indukcijo promotorjev GAL pa je nujno potrebna zadostna raven proteina Gal4p v celici. To je posebej pomembno za produkcijo heterolognih proteinov, ki se izraĉajo iz plazmidov, ki so v celici prisotni v veœih kopijah (''multicopy'' plazmidi). V strokovni literaturi zasledimo veœ poskusov genskega inĉeniringa galaktoznega sistema z namenom optimizacije produkcije rekombinantnih proteinov. Ker je transkripcijski dejavnik Gal4p prisoten v celici v zelo nizki koliœini in zato omejuje indukcijo genov GAL, so raziskovalci poskusili premostiti to teĉavo. Reĝitev vsekakor ni v konstitutivnem prekomernem izraĉanju GAL4, kajti posledica tega je Slika 2: Odprti bralni okvir gena GAL1 smo v prvi fazi zamenjali s selekcijsko kaseto CORE, ki smo jo nato v drugi fazi popolnoma odstranili z odprtim bralnim okvirjem gena GAL4. Figure 2: The open reading frame of GAL1 gene was in the first phase replaced by the CORE selection cassette, that was in the second phase completely removed by the GAL4 open reading frame izguba regulacije. Leta 1984 je Laughon s sodelavci opisal transformirane kvasne seve, ki vsebujejo ''multi-copy'' plazmide s strukturnim genom GAL4 pod nadzorom promotorja GAL1 (19). V literaturi in v patentnem varstvu je opisana integracija ekspresijske kasete GAL10p-GAL4 v kromosomski lokus HIS3. V prisotnosti galaktoze so opazili 3-kratno poveœanje produkcije tarœnega proteina (20). Uporabo produkcijskih sevov, ki imajo mutiran gen GAL1, je utemelji ĉe Hovland s sodelavci, leta 1989 (21), in kasneje ĝe ĝtevilni drugi. Gen GAL1 kodira encim galaktokinaza, ki fosforilira galaktozo v galaktoza-1-P. Ugotovili so, da se pri mutiranih sevih (gal1), ki niso sposobni induktorja metabolno pretvarjati, izraĉanje tarœnih genov, ki so pod nadzorom promotorjev GAL, znaœilno poveœa. V sevih gal1 ostaja raven galaktoze v fermentacijskih gojiĝœih nespremenjena, kar omogoœa in zagotavlja stalno ter konstantno indukcijo promotorjev GAL Raziskovalci iz Laboratorija za biosintezo in biotransformacijo na Kemijskem inĝtitutu smo skonstruirali nov sev kvasovke S. cerevisiae v katerem smo lokus gena GAL1 s homologno rekombinacijo zamenjali z genom za transkripcijski aktivator Gal4p. GAL-rekombinantni sev vsebuje poleg konstitutivno izraĉajoœega gena GAL4 ĝe dodatno kopijo gena GAL4, ki se izraĉa pod nadzorom promotorja GAL1 (Slika 2). Opisana zamenjava genov GAL v genomu kvasovke je povzroœila bistveno izboljĝanje sinteze poroœevalske molekule, zeleno-fluorescirajoœega proteina (GFP). GAL-rekombinantni sev zatorej lahko uporabimo za visoko izraĉanje heterolognih genov, ki so uravnavani z galaktozno - inducibilnimi promotorji (22). 5.2. Glikozilacija proteinov in glikoinĉeniring Terapevtske proteine lahko v grobem razdelimo v tiste, ki niso posttranslacijsko modificirani, in v tiste, ki za svojo bioloĝko aktivnost farm vestn 2006; 57 Kvasovke – tovarne rekombinantnih proteinov potrebujejo posttranslacijsko procesiranje. Glikozilacija je najbolj pogosta in hkrati najbolj kompleksna posttranslacijska modifikacija proteinov. Ugotavljajo, da je vedno veœ fizioloĝko pomembnih molekul glikoproteinov, to je proteinov s kovalentno vezanimi ogljikovimi hidrati (Slika 4). Ti proteini sodelujejo pri mnogih bioloĝkih procesih, npr. prepoznavanju med celicami, imunskem odgovoru in strjevanju krvi. Œeprav je vloga mnogih glikoproteinov znana, pa pomen oligosaharidnih enot, ki so pripete na protein, ni vedno razjasnjen (23). Neglikozilirane proteine veœinoma proizvajajo v E. coli in S. cerevisiae, in ti trenutno predstavljajo 40 % vseh terapevtskih proteinov. Nekatere neglikozilirane proteine pridobivajo iz obeh ekspresijskih sistemov, kot na primer inzulin, ki ga proizvajajo v E. coli (Humulin) in v kvasovki (Novolog). Prokariontski gostitelji, kot je E. coli, proteinov ne glikozilirajo, niĉji evkarionti, kot so kvasovke ter insektne celice, pa izkazujejo drugaœen vzorec glikozilacije. Le malo nativno glikoziliranih proteinov proizvajajo v neglikozilirajoœih gostiteljih (interferon b-1b), kajti odsotnost glikozilacije lahko vpliva na razpolovni œas in druge, kliniœno pomembne lastnosti molekule. Neglikozilirane oblike glikoproteinov so ponavadi nepravilne zvite, bioloĝko neaktivne in se hitro izloœijo iz krvnega obtoka (24). Kvasovka S. cerevisiae ĉe v osnovi procesira oligosaharide na drugaœen naœin kot viĝji evkarionti. Ogljikove hidrate, vezane na proteine, pri œloveku sestavljajo predvsem monosaharidi manoza, galaktoza, fukoza, N-acetilgalaktozamin, N-acetilglukozamin, sialiœna kislina in glukoza. Ti monosaharidi sestavljajo kompleksen razvejan vzorec, v katerem je obiœajno manj kot 15 monosaharidnih molekul. Pri kvasovki je pripetih monosaharidov bistveno veœ, tudi do veœ 100 in so preteĉno sestavljeni iz manoze (Preglednica 3) (25, 26). Heterologni proteini, ki jih pridobivamo iz kvasovk, so tako pogosto premoœno glikozilirani oz. hipermanozilirani. Takĝne oblike pa imajo visoko afiniteto do manoznih receptorjev, ki so prisotni na makrofagih in endotelijskih celicah. Posledica je krajĝi razpolovni œas, niĉja uœinkovitost terapevtskega glikoproteina ter, kar je najhujĝe, nepravilno in napaœno vezani sladkorji lahko izzovejo nevarno imunsko reakcijo (3). Za proizvodnjo kompleksnih glikoproteinov, ki trenutno predstavljajo 60 % vseh terapevtskih proteinov, se zato uporabljajo sesalske celice, predvsem ovarijske celice kitajskega Preglednica 3. Glikozilacijski vzorec pri œloveku in pri kvasovkah. Table 3. Glycosylation pattern in human and yeast. Humani glikoproteini Kvasni glikoproteini Slika 3: Veœino œloveĝkih proteinov obdaja 'ogrodje sladkorjev'. Gensko spremenjene kvasovke dodajajo sladkorje pravilno. Figure 3: Most human proteins are surrounded by 'scaffold of sugar'. Engineered yeast can now make the correct attachments. hrœka (CHO). Te so sposobne glikozilirati tarœne proteine s humanim vzorcem, kljub temu pa se nekatere glikanske strukture, proizvedene v CHO, razlikujejo od humanih in so zato potrebne za uœinkovitost dodatne in vitro modifikacije (24). Zaradi zahtevnosti pridobivanja terapevtskih proteinov v sesalskih celiœnih linijah in poslediœno neekonomiœnosti, so raziskovalci z genskim inĉenirstvom poskuĝali humanizirati glikozilacijsko pot v kvasovki P. pastoris. Poskusi so bili usmerjeni v izbitje genov glikozilacijskih encimov, ki sodelujejo v procesu hipermanozilacije, in vnos genov, ki kodirajo encime, pomembne za sintezo, prenos in dodajanje humanih oligosaharidov. Zaœetni poskusi so bili neuspeĝni, ker heterologni encimi niso prispeli na mesto delovanja, to je v Golgijev aparat (27, 28). Nedavno pa so Gerngross in sodelavci predstavili skupino mutiranih sevov P. pastoris, ki specifiœno in pravilno glikozilirajo tarœne proteine. Glavna prednost gensko spremenjenih kvasovk je v homolognem pripenjanju oligosaharidov (29, 30). Naœrtovana in nataœno nadzorovana glikozilacija pa je kljuœna za izboljĝanje kliniœno pomembnih lastnosti terapevtskih makromolekul. 6 Sklep Idealnega ekspresijskega sistema ni, zato je potrebno pri izbiri sistema za biosintezo tarœnega proteina vedno narediti kompromis in izbrati tistega, ki najbolj ustreza naĝim zahtevam. Ĝestino vseh, na trĉiĝœu odobrenih terapevtskih proteinov pridobivajo z biosintezo v kvasovki S. cerevisiae. Œeprav obstajajo ĝtevilne omejitve pri uporabi te kvasovke kot gostitelja heterolognih genov, pa je prednost uporabe prav v tem, da so mnogi problemi znani, da obstajajo genska in biokemijska orodja in cela vrsta mutiranih sevov, s katerimi lahko nekatere izmed problemov odstranimo ali pa vsaj omejimo. Prednost kvasovk, v primerjavi s kompleksnejĝimi gostitelji kot so sesalske celice, torej ostaja v tem, da so preprostejĝe, enostavnejĝe, njihovo gojenje je cenejĝe in poznavanje boljĝe. farm vestn 2006; 57 Pregledni œlanki - Review Articles 7 Literatura 1. Villa-Komaroff L, Broome S, Naber SP et al. The synthesis of insulin in bacteria: a model for the production of medically useful proteins in prokaryotic cells. Birth Defect Orig Artic Ser 1980; 16: 53-68. 2. Walsh G. Biopharmaceutical benchmarks--2003. Nat Biotechnol 2003; 21: 865-870. 3. Eckart MR, Bussineau CM. Quality and authenticity of heterologous proteins synthesized in yeast. Curr Opin Biotechnol 1996; 7: 525-530. 4. Fernandez JM and Hoeffler JP. Comparison of expression systems. Fernandez JM and Hoeffler JP. Gene Expression Systems. Using nature for the art of expression. 14-11-2000. Academic Press. 15-12-2003. 5. The Basics: In Vitro Translation. Ambion, Inc. 5-12-2003. 10-12-2003. 6. Romanos MA, Scorer CA, Clare JJ. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast 1992; 8: 423-488. 7. Sudbery PE. The expression of recombinant proteins in yeasts. Curr Opin Biotechnol 1996; 7: 517-524. 8. Sreekrishna K, Potenz RH, Cruze JA et al. High level expression of heterologous proteins in methylotrophic yeast Pichia pastoris. J Basic Microbiol 1988; 28: 265-278. 9. Sudbery PE, Gleeson MA, Veale RA et al. Hansenula polymorpha as a novel yeast system for the expression of heterologous genes. Biochem Soc Trans 1988; 16: 1081-1083. 10. Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM. Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. J Biotechnol 2004; 109: 63-81. 11. Swinkels BW, van Ooyen AJ, Bonekamp FJ. The yeast Kluyveromyces lactis as an efficient host for heterologous gene expression. Antonie Van Leeuwenhoek 1993; 64: 187-201. 12. Giga H, Kumagai H. Expression system for foreign genes using the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Biotechnol Appl Biochem 1999; 30 (3): 235-244. 13. Douglas HC, Hawthorne DC. Enzymatic expression and genetic linkage of genes controlling galactose utilization in Saccharomyces. Genetics 1964; 49: 837-844. 14. Johnston M. A model fungal gene regulatory mechanism: the GAL genes of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev 1987; 51: 458-476. 15. Ren B, Robert F, Wyrick JJ et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science 2000; 290: 2306-2309. 16. Cornish-Bowden A, Cardenas ML. Complex networks of interactions connect genes to phenotypes. Trends Biochem Sci 2001; 26: 463-465. 17. Giaever G, Chu AM, Ni L et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature 2002; 418: 387-391. 18. Ĝtagoj NM, Comino A, Komel R. Fluorescence based assay of GAL system in yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Lett 2005; 244: 105-110. 19. Laughon A, Gesteland RF. Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene. Mol Cell Biol 1984; 4: 260-267. 20. Schultz LD, Hofmann KJ, Mylin LM et al. Regulated overproduction of the GAL4 gene product greatly increases expression from galactose-inducible promoters on multi-copy expression vectors in yeast. Gene 1987; 61: 123-133. 21. Hovland P, Flick J, Johnston M et al. Galactose as a gratuitous inducer of GAL gene expression in yeasts growing on glucose. Gene 1989; 83: 57-64. 22. Ĝtagoj NM, Comino A, Komel R. A novel GAL recombinant yeast strain for enhanced protein production. Biomol Engineering 2006; 23: 195-199. 23. Elliott S, Lorenzini T, Asher S et al. Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through glycoengineering. Nat Biotechnol 2003; 21: 414-421. 24. Gerngross TU. Advances in the production of human therapeutic proteins in yeasts and filamentous fungi. Nat Biotechnol 2004; 22: 1409-1414. 25. Silberstein S, Gilmore R. Biochemistry, molecular biology, and genetics of the oligosaccharyltransferase. FASEB J 1996; 10: 849-858. 26. Gemmill TR, Trimble RB. Overview of N- and O-linked oligosaccharide structures found in various yeast species. Biochim Biophys Acta 1999; 1426: 227-237. 27. Choi BK, Bobrowicz P, Davidson RC et al. Use of combinatorial genetic libraries to humanize N-linked glycosylation in the yeast Pichia pastoris. Proc Natl Acad Sci U.S.A 2003; 100: 5022-5027. 28. Callewaert N, Laroy W, Cadirgi H et al. Use of HDEL-tagged Trichoderma reesei mannosyl oligosaccharide 1,2-alpha-D-mannosidase for N-glycan engineering in Pichia pastoris. FEBS Lett 2001; 503: 173-178. 29. Hamilton SR, Bobrowicz P, Bobrowicz B et al. Production of complex human glycoproteins in yeast. Science 2003; 301: 1244-1246. 30. Wildt S, Gerngross TU. The humanization of N-glycosylation pathways in yeast. Nat Rev Microbiol 2005; 3: 119-128. farm vestn 2006; 57