Pregledni članek	UDK 633.852.73:575
Prejeto: 2006-09-05
MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU
Dunja BANDELJ MAVSAR Univerza na Primorskem, Znanstveno-raziskovalno središče Koper, SI-6000 Koper, Garibaldijeva 1
E-mail: dunja.bandelj@zrs-kp.si
IZVLEČEK
Mikrosateliti se uporabljajo v genetskih raziskavah rastlin za študije raznolikosti, starševske analize, izdelavo genetskih kart in za genotipizacijo. Vsestranska uporabnost in popularnost mikrosatelitov temelji na pozitivnih lastnostih markerskega sistema: visoka pogostost pojavljanja v evkariotskih genomih, kodominatnost, hipervaria-bilnost, robustnost in visoka informacijska vrednost. Prvi mikrosateliti oljke so bili objavljeni v letu 2000 in od tedaj se pogosto vključujejo v različne genetske raziskave oljk. V delu so predstavljene karakteristike objavljenih mikro-satelitov oljke in njihova uporabnost v genetskih študijah.
Ključne besede: mikrosateliti, SSR, Olea europaea L., oljkarstvo, polimorfizem
MARCATORI MICROSATELLITARI E IL LORO IMPIEGO NELL'OLIVICOLTURA
SINTESI
I microsatelliti vengono utilizzati nelle ricerche genetiche delle piante, inerenti la diversita, l'analisi parentale, l'elaborazione di mappe genetiche e la genotipizzazione. L'impiego universale e la popolarita dei microsatelliti sono dovuti alle caratteristiche positive del sistema di marcatori: alta frequenza di presenza nei genomi eucariotici, codominanza, ipervariabilita, robustezza ed alto valore informativo. I primi microsatelliti dell'olivo sono stati pubblicati nel 2000 e da allora vengono di frequente inseriti in diverse ricerche genetiche degli olivi. Nell'articolo vengono presentate le caratteristiche dei microsatelliti dell'olivo pubblicati e il loro impiego negli studi genetici.
Parole chiave: microsatelliti, SSR, Olea europaea L., olivicoltura, polimorfismo
□ unja BANDELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
UVOD
Oljko že tisočletja gojijo na območju sredozemskega bazena, v glavnem zaradi pridobivanja oljčnega olja, ki ima izredno pomembno vlogo v človekovi prehrani. Zaradi ugodne sestave maščobnih kislin in vsebnosti številnih biološko pomembnih spojin uvrščamo oljčno olje med funkcionalna živila, za katerim povpraševanje na trgu nenehno narašča. Raziskave so pokazale, da so lastnosti oljčnega olja odvisne od sortne strukture oljk, h kakovosti in tipičnosti olja pa prispevajo tudi pedokli-matski dejavniki pridelovalnega območja in tehnologija predelave oljk. Sortna struktura je nastajala več stoletij in v literaturi je omenjenih več kot 1000 oljčnih sort, ki so se izoblikovale s selekcijskim pritiskom na agronomsko pomembne lastnosti ali spontano s križanjem gojenih in divjih oljk (Rugini & Baldoni, 2005). Izredna genska raznolikost oljk in pomanjkanje žlahtnjiteljskih programov, ki bi privedli do izboljšanja genskih virov, so glavni razlog pospešenega preučevanja genetske strukture oljk. Do razvoja molekulskih markerjev so raziskave genskih virov temeljile na uporabi klasičnih metod z opisovanjem morfoloških markerjev. Fenotipsko vrednotenje rastlinskega materiala je metodološko zapleteno, odvisnost morfoloških markerjev od dejavnikov okolja pa močno omejuje njihovo uporabo v genetskih študijah.
V zadnjih dvajsetih letih je razvoj številnih markerjev DNA omogočil revolucionarni pristop pri preučevanju strukture genoma in genske raznolikosti pomembnejših kmetijskih rastlin. Napredku molekularne biologije je sledilo tudi oljkarstvo, in markerji DNA se danes rutinsko uporabljajo za molekulsko karakterizacijo in identifikacijo oljčnih sort, v študijah izvora in domestikacije oljke, pri preučevanju genske variabilnosti divjih in kul-tiviranih oljk, identifikaciji markerjev, vezanih na agronomsko pomembne lastnosti, in pri genskem kartiranju (Bandelj ef al., 2002a). Večina razvitih markerskih sistemov je uporabnih tudi za genotipiziranje DNA oljk (RFLP, RAPD in AFLP). Kljub popularnosti teh tehnik pa je zanimanje med raziskovalci za novejše markerje, kot so mikrosateliti, vse večje. Z objavo tehnike mikrosa-telitov (Litt & Luly, 1989) so ti markerji postali najbolj priljubljeni za molekulsko karakterizacijo različnih rastlinskih vrst (Gupta & Varshney, 2000). Le-ti združujejo lastnosti različnih markerjev in jih v literaturi pogosto predstavljajo kot idealen markerski sistem. Prvi mikrosateliti oljke so bili identificirani in predstavljeni šele v letu 2000 (Rallo ef al., 2000; Sefc ef al., 2000) in od tedaj se uspešno vključujejo v genetske raziskave oljk z različnimi cilji.
Namen pričujočega dela je podrobneje predstaviti mikrosatelitski markerski sistem, opisati karakteristike identificiranih mikrosatelitov oljke ter predstaviti njihovo uporabnost v genetskih raziskavah oljk.
MIKROSATELITI V RASTLINAH
Skupna lastnost evkariotskih genomov je ta, da vsebujejo tandemsko ponavljajočo se DNA, ki so jo poimenovali satelitna DNA. Odkrili so jo pri ultracentri-fugiranju DNA v gradientnem mediju, ko se je le ta porazdelila v več plasti, med katerimi je plast vsebovala DNA, sestavljeno iz skupine tandemsko ponavljajočih se zaporedij. Satelitno DNA glede na dolžino osnovnega motiva delimo v tri skupine (Armour ef al., 1999):
1.	sateliti: sestavljeni so iz osnovnega nukleotidnega zaporedja (motiva) dolžine do 200 baznih parov (bp), več takih ponovitev skupaj tvori satelit, ki ima lahko skupno dolžino nekaj magabaznih parov in predstavlja nekaj odstotkov genoma,
2.	minisateliti: osnovni motiv je sestavljen iz več kot 10 nukleotidov, ki lahko dosežejo skupno dolžino od 0,5 do 30 kbp,
3.	mikrosateliti: osnovni motiv je kratek (od 1 do 6 bp) in na posameznem lokusu tvori ponovitve skupne dolžine od 20 do 100 bp.
V literaturi se pojavljajo različna poimenovanja mikrosatelitov: STR (angl. Short Tandem Repeats - kratke tandemske ponovitve), SSR (angl. Simple Sequence Repeats - enostavna ponovljiva zaporedja), SSLP (angl. Simple Sequence Length Polymorphism - polimorfizem dolžin enostavnih zaporedij) in VNTR (angl. Variable Number of Tandem Repeats - spremenljivo število tan-demskih ponovitev).
Glede na tip ponovitve osnovnega motiva, Chambers & MacAvoy (2000) predlagata naslednje poimenovanje mikrosatelitov:
-	popoln mikrosatelit (angl. pure microsatellite) je sestavljen iz enega samega motiva baz, ki se tandemsko ponavlja in ni prekinjen z nobeno drugo bazo, npr.
(AC)14;
-	sestavljen mikrosatelit (angl. compound microsatellite) sestavljata vsaj dva različna osnovna motiva ponovitve, npr. -(CT)22(CA)6;
-	popoln in prekinjen mikrosatelit (angl. interrupted pure microsatellite) ima osnoven motiv prekinjen z insercijo enega nukleotida ali več baznih parov, ki se razlikujejo od osnovnega motiva, npr. (CA)4TA(CA)7;
-	sestavljen in prekinjen mikrosatelit (angl. interrupted compound microsatellite) ima poleg vsaj dveh različnih osnovnih motivov še krajšo insercijo baznih parov, ki se razlikujejo od osnovnih motivov, npr. (AC)14AGAA(AG)12;
-	kompleksen mikrosatelit (angl. complex microsatellite) je širši izraz za popolne in sestavljene mikro-satelite, ki nastanejo zaradi insercij baz, ki predstavljajo kratko ponovitev, npr. (TC)4(T)6(CT)4CTCC (TCC)6.
Poznana so tudi zaporedja DNA, ki ne vsebujejo ponovljivih motivov, ampak so nekakšno vmesno stanje, sestavljena iz več mešanih motivov, ki rahlo nakazujejo
□ unja BANDELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
na tandemsko ureditev. Ta zaporedja so poimenovali z izrazom prikrita enostavnost (angl. cryptic simplicity), za katere Hancock (1999) meni, da predstavljajo propadajočo mikrosatelitsko regijo, izpostavljeno številnim točkovnim mutacijam. Kriptične regije so lahko tudi mesto nastanka novih mikrosatelitov (Tautz et al., 1986). Procesa izginjanja in nastajanja novega mikrosatelita potekata istočasno. Kratki mikrosateliti (imenovani tudi proto-mikrosateliti) nastajajo naključno, najprej pride do točkovnih mutacij, ki jim sledijo še redki zdrsi vijačnice med replikacijo (Levinson & Gutman, 1987).
Nestabilnost mikrosatelitskih lokusov in posledično velika variabilnost mikrosatelitskih markerjev sta prispevala k popularnosti markerskega sistema in njegove uporabe v mnogih evolucijskih in genetskih študijah. Velik polimorfizem je posledica sprememb v številu ponovitev osnovnega motiva, za kar sta odgovorna predvsem dva mehanizma, ki se verjetno dopolnjujeta (Eisen, 1999):
1.	Model nepravilnega parjenja zdrsnjenih verig med replikacijo DNA (model SSM - Slip-Strand Mispai-ring) predvideva mutacijo, ki jo povzroči zdrs DNA v kompleksu s polimerazo, kar lahko povzroči nekom-plementarnost matrične in nove sintetizirane verige. Ce popravljalni mehanizmi napake zaradi zdrsa ne odpravijo, ostane poravnava obeh verig nepravilna. Mikrosatelitske ponovitve se zlahka izvijejo iz vijač-nice v obliki zank. Nova sintetizirana veriga bo tako v naslednjih replikacijah spremenila svojo dolžino, pri mikrosatelitu se to kaže v nastanku ali izgubi ene ali več ponovitev.
2.	Neenak crossing-over (model UCO - Unequal Crossing-Over) nastane kot rezultat rekombinacije med homolognima kromosomoma, ki nista bila popolno poravnana. Verjetnost nepravilne poravnave je zaradi mikrosatelitskih ponovitev velika.
Mutacijska stopnja vseh mikrosatelitskih lokusov ni enaka. Dognano je bilo, da na njen nivo vplivajo: število ponovitev in nukleotidno zaporedje osnovnega motiva, dolžina ponavljajoče se enote, DNA-zaporedje obrobnih regij, prekinitve v mikrosatelitu, stopnja rekombinacije in transkripcije. Raziskave mutacijske stopnje in evolucijske dinamike mikrosatelitov s številnimi odkritimi protislovji je nazorno povzel Schlotterer (2000).
Številne raziskave so pokazale, da se nukleotidna zaporedja minisatelitov in mikrosatelitov ne pojavljajo samo v nekodirajočih regijah genoma, kot je bilo prvotno mišljeno, temveč tudi v zgornjih promotorskih regijah kodirajočih DNA-zaporedij evkariotskih genomov, kjer imajo domnevno vlogo regulatornih elementov. Številne mikrosatelitske ponovitve, odkrite pri človeku, so bile najdene tudi pri primatih, kar nakazuje na njihovo biološko funkcionalnost. Mikrosateliti v promotorskih regijah kodirajočih zaporedij DNA delujejo kot ojačevalci ekspresijskih vektorjev. Znano je, da lahko odsotnost mikrosatelitske ponovitve zmanjša regulatorno sposobnost promotorja. V nadaljevanju so s študijami ugotovili,
da lahko kratki nukleotidni in ponavljajoči se motivi v zgornjih aktivnih mestih ekspresijskih vektorjev služijo kot mesto vezave regulatornih proteinov. Predstavljene so bile tudi študije o vplivu dolžine mikrosatelitov na fenotipsko raznolikost (Kashi & Soller, 1999).
ZASTOPANOST MIKROSATELITOV PRI RASTLINAH
Podrobnejši pregled zastopanosti mikrosatelitov v genomu višjih rastlin sta med prvimi podala Morgante & Olivieri (1993), ki sta preučila pogostost pojavljanja di-nukleotidnih in trinukleotidnih mikrosatelitskih ponovitev. Pri pregledu podatkovnih baz nukleotidnih zaporedij sta ugotovila, da se tip AT ponovitve najpogosteje pojavlja in sestavlja kar 74% vseh dinukleotidnih mikrosatelitov. Sledila mu je ponovitev GT/AC s 24-od-stotno zastopanostjo, medtem ko je ponovitev AC/GT sestavljala le 1% vseh dinukleotidnih ponovitev. Dinu-kleotidne ponovitve CG avtorja nista zasledila. Med trinukleotidnimi ponovitvami sta bila motiva TAT in TCT najpogostejša. Pregled mikrosatelitov pri 34 različnih rastlinskih vrstah je pokazal, da so le ti v genomu pogosti in se pojavljajo na vsakih 50 kbp. V raziskavi pogostosti mikrosatelitov in tipov mikrosatelitskih ponovitev pri različnih evkariotskih genomih Toth et al. (2000) odkrivajo, da tri- in heksanukleotidne ponovitve mikrosatelitov prevladujejo v eksonih, saj izguba ali pridobitev take ponovitve ne poruši bralnega okvirja. Pojavljanje drugih tipov mikrosatelitov v medgenskih regijah in intronih pa je taksonomsko specifično. O podobnih izsledkih poročajo še Metzgar et al. (2000). V nekodogenih regijah obstajajo mono-, di- tri-, tetra- in heksanukleotidni mikrosateliti, za katere veljajo podobni mutacijski in selekcijski procesi. V kodogenih regijah se v večji meri pojavljajo tri- in heksanukleotidni mikrosateliti, ki so izpostavljeni močnejšim in bolj specifičnim selekcijskim pritiskom. V novejši raziskavi so Morgante et al. (2002) preučili zastopanost mikrosatelitskih ponovitev v genomskih in EST (Expressed Sequence Tags -izražena nukleotidna zaporedja) zaporedjih repnjakovca (Arabidopsis thaliana), riža, soje, koruze in pšenice. Odkrili so, da je frekvenca pojavljanja mikrosatelitov obratno sorazmerna z velikostjo genoma in deležem ponavljajoče se DNA, in da ostaja konstantna v kodogenem delu genoma. Mikrosateliti so večinoma pojavljajo v regijah, ki predstavljajo nedavno povečanje genoma pri rastlinah, njihova frekvenca je večja v prepisanih regijah, posebno v neprevedenem delu mRNA, kjer je lahko večja celo za 3-krat. Pri vseh rastlinah, ki so bile vključene v analizo, pa je frekvenca mikrosatelitov znatno večja v knjižnici EST, kjer so odkrili najpogostejšo ponovitev AG/CT in najmanjšo AT. Song et al. (2002) so ugotovili, da je med trinukleotidni mikrosateliti najpogostejši in tudi najbolj polimorfen pri pšenici motiv TAA. V nadaljevanju McCouch et al. (2002) poročajo o zastopanosti mikrosatelitov pri rižu, kjer je najpogostejši
Dunja BANDELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
motiv GA, sledita mu motiva AT in CCG. Najdaljši so bili mikrosateliti z motivom AT, najkrajši pa s ponovitvijo GA.
TEHNIKA NAMNOŽEVANJA MIKROSATELITSKIH LOKUSOV
Princip tehnike mikrosatelitskih markerjev se od tehnik AFLP in RAPD razlikuje v tem, da se v verižni reakciji s polimerazo namesto naključnih lokusov namno-žujejo znani lokusi. Ce je znano nukleotidno zaporedje obrobne regije mikrosatelita, se lahko izdela lokusno specifična začetna oligonukleotida, običajno dolžine 18-25 bp, ki omogočata namnožitev mikrosatelitske regije. Namnoženi aleli se ločijo z elektroforezo v po-liakrilamidnem gelu ali polimeru visoke ločljivosti, za zaznavanje mikrosatelitov pa se uporablja radioaktivnost ali barvanje s srebrom. Popularna je tudi uporaba fluorescentno označenih začetnih oligonukleotidov in zaznavanje namnoženih alelov z avtomatsko lasersko napravo, ki omogoča hitro nadaljnjo obdelavo rezultatov (Kozjak et al., 2003b; Štajner et al., 2005). Fluorescentno označevanje molekul DNA običajno zviša ceno analiz, vendar je danes na voljo tehnika ekonomičnega fluorescentnega označevanja molekul PCR (Schuelke, 2000), ki je bila preizkušena in uspešno uporabljena pri namnoževanju in zaznavanju mikrosatelitov kač (Scott et al., 2001) in oljke (Bandelj et al., 2004a).
LASTNOSTI MIKROSATELITOV IN UPORABNOST V GENETSKIH ŠTUDIJAH
Mikrosateliti združujejo lastnosti različnih markerjev, zaradi česar so izredno atraktivni za genetske študije rastlin. Poleg visoke pogostosti pojavljanja in enakomerne razpršenosti v evkariotskih genomih jih odlikujejo še kodominantna narava, hipervariabilnost, visoka stopnja polimorfizma ter informativnost (Morgante & Olivieri, 1993; Powell et al., 1996a; Weising et al., 1998). Prednost uporabe mikrosatelitskih markerjev je tudi v možnosti avtomatiziranja postopka. Robustnost jim pripisujejo zaradi dobre ponovljivosti rezultatov (Powell et al., 1996b; Jones et al., 1997).
Rezultati genotipizacije rastlin z mikrosateliti so med laboratoriji primerljivi, nekaj odstopanj pri dolžini alelov pa je vendarle možno zaslediti zaradi različnih postopkov ločevanja in detekcije namnoženih markerjev (Weber, 1990). Bowers et al. (1996) so pri primerjavi dolžin alelov zaznanih s srebrom in dolžin avtomatskega fluorescentnega zaznavanja odkrili razlike v velikosti od 1 do 2 bp. Podobno ugotavljajo tudi Kozjak et al. (2003a), ki so pri genotipizaciji klonov vinske trte kultivarja 'Refošk' na dveh mikrosatelitskih lokusih pri barvanju s srebrom odkrili 2 bp daljša alela v primerjavi z avtomatskim fluorescentnim zaznavanjem na laserski napravi ALFexpress. Kline et al. (1997) so ugotavljali pri-
merljivost rezultatov mikrosatelitske analize v 34 laboratorijih in odkrili, da so rezultati primerljivi, če alele poimenujejo opisno. Pri primerjavi alelov, ki so jih označili z dolžino, je prihajalo do razlik, večjih od 5 bp.
Poleg različnih elektroforetskih sistemov in postopkov zaznavanja alelov so manjša neskladja v dolžini alelov lahko tudi posledica pojava senčnih fragmentov. Weber & May (1989) pojav razlagata kot posledico zdrsa polimeraze Taq in matrične vijačnice med namno-ževanjem DNA v verižni reakciji s polimerazo. Murray et al. (1993) so z določitvijo nukleotidnega zaporedja senčnih fragmentov dinukleotidnega mikrosatelitskega lokusa ugotovili, da ti predstavljajo delecijo 2 bp, kar ustreza dolžini ene mikrosatelitske ponovitve. Pojav je izrazitejši pri dinukleotidnih mikrosatelitih in lahko povzroči nepravilno določitev dolžine alelov.
Med slabše lastnosti mikrosatelitskega markerskega sistema raziskovalci uvrščajo visoke stroške izolacije novih markerjev (Rafalski & Tingey, 1993; Squirrell et al., 2003). Tradicionalne postopke, ki vključujejo izdelavo delne genomske knjižnice, kloniranje in hibridi-zacijsko preverjanje velikega števila rekombinantnih klonov, zamenjujejo novejše tehnike, ki vključujejo izdelavo genomske knjižnice, obogatene z mikrosateliti (Jakše & Javornik, 2001). Uspešnost izolacije mikrosatelitov je odvisna od več korakov, od priprave genomske knjižnice pa vse do izdelave parov začetnih oligonu-kleotidov, ki imajo sposobnost namnoževanja specifičnih lokusov s polimorfnimi aleli (Squirrell et al., 2003).
Ko so mikrosateliti za določeno vrsto že poznani, se lahko uporabijo tudi za genetske analize sorodnih vrst, kar zniža stroške analiz, saj izdelava genomskih knjižnic v tem primeru ni potrebna. Obrobna nukleotidna zaporedja mikrosatelita so lahko med sorodnimi vrstami ohranjena, zato nekateri začetni oligonukleotidi, pripravljeni za eno vrsto, uspešno namnožujejo tudi domnevno ortologno regijo DNA druge vrste. Namnoženi produkti PCR pričakovane dolžine ne zagotavljajo nujno obstoj mikrosatelitov in dovolj velikega polimorfizma (Huang et al., 1998). Peakall et al. (1998) so z določitvijo nukleotidnega zaporedja dognali, da so razlike med aleli različnih vrst kompleksnejše, saj se ne razlikujejo samo v spremembi števila ponovitev osnovnega motiva, temveč tudi v strukturi mikrosatelita. Uspešnost medvrstne uporabe mikrosatelitskih markerjev se zmanjšuje s povečevanjem filogenetske oddaljenosti vrst (Schlötterer, 1998).
Uporaba začetnih oligonukleotidov sorodnih vrst za namnoževanje mikrosatelitskih regij je lahko povezana tudi s pojavom ničtih alelov (izpad namnožitve alela). Za nastanek ničtih alelov so odgovorne mutacije na mestih prileganja začetnih oligonukleotidov, ki preprečijo vezavo začetnih oligonukleotidov in s tem namnožitev mikrosatelita. Posledica so spremenjene frekvence alelov in genotipov, kar lahko privede do presežka homozigotov in podcenitve heterozigotnosti preučeva-
□ unja BANDELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
Tab. 1: Kronološka predstavitev genetskih raziskav oljke, pri katerih so bili uporabljeni mikrosatelitski markerji. Tab. 1: Chronological presentation of genetics investigations of olives with the aid of microsatellite markers.
Cilji raziskave	Opis raziskave	Referenca
Izolacija in karakterizacija mikrosatelitov	Identifikacija in karakterizacija 15-ih MS lokusov oljke (ssrOeUA-DCA).	Sefc et al., 2000
Izolacija in karakterizacija mikrosatelitov	Identifikacija in karakterizacija 5-ih MS lokusov oljke (IAS-oli).	Rallo et al., 2000
Genotipizacija oljčnih sort	Preučili identiteto dveh sort iz IT in CA (Oblonga in Frantoio) s 5 MS lokusi. Ugotovili identičnost sort na vseh lokusih.	Barranco et al., 2000
Izolacija in karakterizacija mikrosatelitov	Razvili 20 novih MS markerjev in predstavili karakterizacijo lokusov na 16-ih sortah (GAPU).	Carriero et al., 2002
Izolacija in karakterizacija mikrosatelitov	Identifikacija 30 MS lokusov in karakterizacija lokalnih oljčnih sort v Italiji (UDO).	Cipriani et al., 2002
Izolacija in karakterizacija mikrosatelitov	Identificirali 7 MS lokusov (EMO).	De la Rosa et al., 2002
Genotipizacija oljčnih sort z mikrosatelitskimi markerji	Genotipizirali oljčne sort iz nacionalnega kolekcijskega nasada. Za genotipizacijo uporabili 14 MS lokusov.	Bandelj et al., 2002b
Primerjalna študija RAPD, AFLP in MS tehnik pri identifikaciji in ugotavljanju sorodnostnih odnosov oljčnih sort	Preučili informativnost posameznega markerskega sistema. V analizo vključili 32 sort. Uporabili 8 predhodno objavljenih MS lokusov.	Belaj et al., 2003
Izdelava genetske karte	Za kartiranje uporabili RAPD, AFLP, RFLP in MS markerje. Uporabili MS lokuse bližnjih sorodnikov oljke.	De la Rosa et al., 2003
Namnoževanje MS oljke pri sorodnih vrstah znotraj rodu Olea	S 4-mi MS lokusi dosegli uspešno namnoževanje MS pri 13-ih različnih vrstah in podvrstah rodu Olea. Ugotovili visok polimorfizem in preučili sorodnost med vrstami.	Rallo et al., 2003
Vrednotenje genetske raznolikosti in preučevanje sorodnosti oljčnih sort	Preučili 19 oljčnih sort z uporabo 14-ih MS lokusov. Predstavili informacijske vrednosti lokusov.	Bandelj et al., 2004b
Izdelava integrirane genetske karte	190 markerjev (MS, RAPD, SCAR) uporabili za konstrukcijo karte, od tega 10 MS markerjev.	Wu et al., 2004
Aplikacija MS za preverjanje pristnosti ekstra deviških oljčnih olj	Izolacija DNA iz komercialnih oljčnih olj in namnoževanje MS. Primerjava genetskih profilov sort z aleli, odkritih v oljčnem olju. Poročanje o uspešnosti metode MS v "forenziki" oljčnih olj.	Breton et al., 2004
Klonska variabilnost	Analizirali variabilnost 130-ih vzorcev oljk. Genotipizacijo opravili na 14-ih MS lokusih. Pri več kot 60% vzorcih ugotovili homonime ali napačno označitev dreves v kolekciji in ugotovili visoko stopnjo variabilnosti znotraj oljčnih sort.	Lopes et al., 2004
Starševska analiza	Uporabili 8 MS za genotipizacijo 23 oljčnih sort, potencialnih za uporabo v žlahtnjiteljskih programih. 4 MS uporabili za testiranje križancev.	De la Rosa et al., 2004
Genotipizacija oljčnih sort in preučevanje genetske raznolikosti oljk	Preučili 46 akcesij 30-ih sort iz Sicilije (IT). V analizo vključili 12 MS lokusov.	La Mantia et al., 2005
Preučevanje sorodnostnih odnosov in identifikacija sort	Preučenih 111 akcesij 60-ih oljčnih sort z markerji AFLP in MS. Uporabili 27 MS lokusov, izdelali dendrogram in preučili sposobnost ločevanja sort z dvema markerskima sistemoma.	Montemurro et al., 2005
Aplikacija MS za preverjanje pristnosti ekstra deviških oljčnih olj	Izolacija DNA iz komercialnih oljčnih olj in namnoževanje MS. Uporabili 6 MS lokusov, izdelali začetne oligonukleotide za ugnezden PCR, uspešno namnoževanje MS, daljših od 188 bp.	Testolin & Lain, 2005
Upravljanje kolekcije oljk in identifikacija sort v Italiji	Preučili raznolikost 39 akcesij oljk iz Apulie (IT). Mikrosatelitom določili nukleotidno zaporedje in vsako sorto opisali s številom ponovitev osnovnega motiva MS. Uporabili 5 MS lokusov.	Muzzalupo et al., 2006
'unja BAN'ELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
nega lokusa. Obstoj ničtih alelov se lahko potrdi le s segregacijsko analizo. Pojavu se lahko izognemo z izdelavo novih specifičnih začetnih oligonukleotidov na novih mestih obrobnih zaporedij, če je to mogoče.
Za markerje, ki se uporabljajo na nivoju kromosomov pri kartiranju genoma, je pomembno, da so številčni in da se enakomerno pojavljajo v genomu. Tipičen mikrosatelitski lokus izpolnjuje oba kriterija, zato so mikrosateliti idealno orodje za kartiranje genoma. Zelo učinkoviti so tudi pri kartiranju lokusov, vezanih na kvantitativne lastnosti (QTL, Quantitative Trait Locus) (Chambers & MacAvoy, 2000).
Mikrosateliti so zaradi hipervariabilnosti idealno orodje tudi za molekulsko identifikacijo posameznikov. Vsak posameznik ima svojevrsten vzorec alelov, ki je osebno specifičen. Tehnika genotipizacije se rutinsko uporablja v sodno medicinskih raziskavah pri prepoznavanju oseb in ugotavljanju sorodstvenih vezi (Zupančič, 1998). Tudi pri rastlinah so mikrosateliti primerni za genotipizacijo in identifikacijo sort, kultivarjev, klonov in akcesij. S pomočjo mikrosatelitov se ugotavljajo nepravilnosti pri poimenovanju sort, ki so zaradi sinonimov in homonimov pogoste pri vegetativno množenih rastlinah.
Mikrosateliti so bili v rastlinski genetiki uspešno uporabljeni tudi pri ugotavljanju genetske sorodnosti. Ker se dedujejo kodominantno, so idealno orodje za starševske analize in analize rodovnikov. S pomočjo mikrosatelitov se pridobivajo informacije o žlahtnjenju rastlin, o nastanku in strukturi populacij rastlin ter njihovi dome-stikaciji. Kronološki pregled raziskav o razvoju mikrosa-telitskega markerskega sistema in njegove aplikacije v molekularno-genetskih raziskavah pri oljki je predstavljen v Tabeli 1.
PREDSTAVITEV KARAKTERISTIK OBJAVLJENIH MIKROSATELITOV OLJKE
Med letoma 2000 in 2006 je 5 raziskovalnih skupin poročalo o identifikaciji 77-ih mikrosatelitskih lokusov. Sefc ef al. (2000) so pregledali genomsko knjižnico s sondami GA in CA in identificirali 20 mikrosatelitov z motivom GA, 4 z motivom CA in 5 s sestavljenim motivom CA-GA. Začetne oligonukleotide so izdelali za 28 lokusov, mikrosatelite pa uspešno namnožili na 15-ih lokusih. Karakterazijo lokusov so predstavili v skupini 38 sort oljk iz Španije in 9 iz Italije.
Lokusi serije ssrOeUA-DCA so bili med prvimi objavljenimi, zato so bili tudi največkrat uporabljeni v genetskih študijah oljk. Molekulska karakterizacija oljčnih sort na 14-ih lokusih DCA je bila opravljena v Sloveniji (Bandelj ef al., 2004b) in na Portugalskem (Lopes ef al., 2004). Število namnoženih mikrosatelitov se med študijami razlikuje, saj je bilo v analize vključeno različno število sort različnega geografskega izvora. V vseh treh študijah (Sefc ef al., 2000; Bandelj ef al., 2004b;
Lopes ef al., 2004) je bila opažena heterozigotnost nižja od pričakovane na lokusih DCA4, DCA11 in DCA13, kar nakazuje na možnost obstoja ničtih alelov. Najvišja opažena heterozigotnost je bila ugotovljena na lokusih DCA3, DCA8, DCA9, DCA14, DCA16 in DCA18. V povprečju je bila opažena heterozigotnost v treh raziskavah visoka (0,722), kar kaže na veliko genetsko variabilnost oljk. Zohary & Spiegel-Roy (1975) menita, da so gojeni kloni oljk ekstremno heterozigotni. Pred do-mestikacijo so se oljke množile spontano s križanji, kar je bil razlog za povečano heterozigotnost, ki je rastlinam omogočila preživetje. V določenem obdobju pa je generativno razmnoževanje prešlo v vegetativno, tako da je heterozigotnost ostala fiksirana.
Informacijska vrednost polimorfizma (PIC vrednost) je odvisna od števila alelov in njihove frekvence na posameznem lokusu (Botstein ef al., 1980). Na osnovi povprečne vrednosti PIC (0,675) je bilo ugotovljeno, da so mikrosatelitski lokusi serije DCA zelo informativni. Med zelo informativne (PIC > 0,5) so se uvrstili vsi lokusi razen DCA5 in DCA13, 8 lokusov (DCA3, DCA4, DCA7, DCA9, DCA10, DCA14, DCA16 in DCA17) pa je izpolnjevalo tudi kriterij o primernosti lokusa za kartiranje (PIC > 0,7) (Bandelj ef al., 2004b).
Na lokusih DCA4 in DCA14 je bilo ugotovljeno kompleksno namnoževanje mikrosatelitov in odmik od pričakovanega dialelnega elektroforetskega vzorca, ki je običajen za diploidne organizme (Bandelj ef al., 2004b). Odmik se je pokazal v namnoževanju tretjega alela, kar je lahko posledica namnoževanja dodatnega lokusa. An-cestralne duplikacije kromosomov in poliploidni ali alo-poliploidni značaj rastlinske vrste so po navedbah iz literature največkrat vzrok večlokusnega namnoževanja mikrosatelitov. Pri oljki Cipriani ef al. (2002) poročajo, da 17% začetnih oligonukleotidov na novo izoliranih mikrosatelitov verjetno namnožuje dva različna lokusa. Avtorji menijo, da visoka frekvenca podvojenih DNA regij nakazuje na možnost v celoti podvojenega genoma, vendar njihovi rezultati ne zadostujejo, da bi ugotovili, ali je oljka poliploidnega ali alopoliploidnega značaja.
Pojav dominance kratkega alela, ki se kaže v pre-ferenčnem namnoževanju kratkih alelov (Wattier ef al., 1998), je bil opažen na lokusih DCA1, DCA10 in DCA17. Pri heterozigotnih genotipih, kjer sta bila navzoča kratek in dolg alel, je bila po barvanju s srebrom opažena večja intenziteta krajšega alela v primerjavi z daljšim, kar je verjetno posledica kompeticije namnoževanja kratkih in dolgih alelov v verižni reakciji s polimerazo (Bandelj ef al., 2004b). Selektivno namnoževanje alelov na takih lokusih lahko privede do pod-cenitve opažene heterozigotnosti in posledično vpliva na rezultate genetske analize.
Z obogatitvenim postopkom genomske knjižnice oljke z motivom GA so Rallo ef al. (2000) z radioaktivno označeno sondo identificirali 24 klonov z mikrosate-litom. 55% klonov je vsebovalo popolne mikrosatelite,
□ unja BANOELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
30% nepopolne, pri 15% pa je bil ugotovljen sestavljen motiv mikrosatelita. Odkrili so mikrosatelitske motive CA, TA, GAA v kombinaciji z GA v sestavljenem mikro-satelitu, v enem primeru pa poročajo tudi o heksa-nukleotidnem motivu AGAGGG. Lokusno specifične oli-gonukleotide so pripravili za 13 mikrosatelitskih regij. Namnoževanje mikrosatelitov so preizkusili na 46 oljčnih sortah različnega geografskega izvora in ugotovili, da le 5 lokusov namnoži polimorfne produkte PCR v pričakovanem velikostnem območju (IAS-oli06, IAS-oli11, IAS-oli 12, lAS-oli 17, IAS-oli22). Na dveh lokusih niso dosegli namnoževanja alelov, pri 4 so ugotovili kompleksno in nespecifično namnoževanje, dva lokusa pa sta bila monomorfna. Skupno število namnoženih alelov v skupini 46 oljčnih sort na 5-ih mikrosatelitskih lokusih je bilo 26. Največ alelov (9) so ugotovili na lokusu IAS-oli11, najmanj (4 in 3) pa na lokusih IAS-oli 17 ter IAS-oli06 in IAS-oli22. Lokusi z manjšim število alelov so zaradi večje verjetnosti identičnosti genotipov manj primerni za identifikacijo sort. Dedovanje mikrosatelitov so preverili z genotipizacijo potomcev križanja 'Leccino' X 'Dolce Agogia' in potrdili Mendlovsko dedovanje. Pri karakterizaciji izoliranih mikrosatelitov avtorji poročajo o pojavu ničtih alelov, senčnih fragmentov in kompleksnega namnoževanja lokusov. Na lokusu IAS-oli 12 so odkrili ničte alele, ki so verjetno posledica mutacij na mestih prileganja začetnih oligonukleotidov. Namnože-vanje nespecifičnih produktov PCR so ugotovili na lokusu IAS-oli08, zato so ga izključili iz nadaljnjih analiz. Pojav senčnih fragmentov, ki so bili izrazitejši pri zaznavanju alelov z avtomatizirano sekvenčno napravo ABI 310, so avtorji opazili na lokusu IAS-oli 11.
Genomsko knjižnico oljke, obogateno z motivom GA, so pripravili tudi Carierro et al. (2002). Avtorji so identificirali 54 pozitivnih klonov, med katerimi je 22 vsebovalo popolne dinukleotidne mikrosatelite, 15 nepopolne in 5 popolne trinukleotidne mikrosatelite. Preostalih 12 klonov so klasificirali med kompleksne mikrosatelite. Začetne oligonukleotide so izdelali za 20 mikrosatelitskih lokusov in na 10-ih dosegli uspešno namnoževanje polimorfnih alelov v skupini 16-ih sort oz. 20-ih akcesij. Na preostalih lokusih niso ugotovili polimorfnih markerjev. Najmanj alelov so odkrili na lokusih GAPU12 (2) in GAPU11 e17 (3). Sledila sta jima lokusa GAPU45 in GAPU59 s štirimi aleli. Največ alelov so ugotovili na lokusu GAPU101 (9), sledili so mu lokusi GAPU103A, GAPU47 in GAPU89 z 8 aleli. Skupno število namnoženih alelov pri 20-ih akcesijah oljk je bilo 57, v povprečju 5,7 alela na lokus. S predstavljenimi mikrosateliti so avtorji preučili genetsko sorodnost oljk italijanskega izvora, o natančnejši informacijski vrednosti mikrosatelitov pa niso poročali.
Cipriani et al. (2002) so določili nukleotidno zaporedje 60 pozitivnih kolonij dveh obogatenih genomskih knjižnic (AC/GT in AG/CT) oljke. Na 30 mikrosatelitskih lokusih so dosegli uspešno namnoževanje alelov v pri-
čakovani dolžini. Karakteristike mikrosatelitov so preučili na 12-ih sortah oljk italijanskega izvora. 28 mikrosatelitskih lokusov je bilo polimorfnih, na dveh pa poli-morfizma niso ugotovili (UD099-003, UD099-022). Z začetnimi oligonukleotidi UD099-007, UD099-009, UD099-022, UD099-034, UD099-036 sta se istočasno namnožila po dva lokusa. V povprečju so na lokusu odkrili po 3 alele, kar je v primerjavi z drugimi objavljenimi mikrosateliti oljke razmeroma malo. Na 7 lokusih sta bila ugotovljena le po 2 alela, na 9 lokusih so odkrili po 3 alele, na 3 lokusih 4 oz. 5 alelov. Kljub nizkemu številu namnoženih mikrosatelitov v 12-ih sortah oljk so avtorji analizirane sorte zlahka ločili. Podrobneje so preučili in primerjali sorti 'Casaliva' in 'Frantoio' ter 'Les' in 'Leccino'. Na osnovi genotipizacije večjega števila vzorcev sort 'Casaliva' in 'Frantoio' avtorji menijo, da 'Casaliva' pripada sortni populaciji 'Frantoio', vendar sta sorti genetsko različni. Enako velja tudi za sorti 'Leccino' in 'Les'.
De la Rosa et al. (2002) so predstavili še 7 novih mikrosatelitskih lokusov (EM0), ki so jih identificirali iz knjižnice, obogatene z dinukleotidnimi motivi GA in GT. Začetne oligonukleotide so izdelali za 13 mikrosatelitskih lokusov, vendar s 5-imi niso namnožili alelov v pričakovani dolžini, 2 lokusa pa sta bila monomorfna. Ka-rakterizacijo novih mikrosatelitov so predstavili v skupini 23-ih sort. V povprečju so odkrili 6,4 alela na lokus, najmanj na lokusu EM0L (2), največ pa na lokusu EM02 (9). Informacijsko vrednost polimorfizma lokusov so podali tudi z izračunom pričakovane in opažene hetero-zigotnosti. Najnižjo vrednost so opazili na lokusu z najmanjšim številom alelov EM0L. Z začetnimi oligonukleotidi lokusa EM030 so pri sorti Arbequina namnožili 4 alele, kar nakazuje na istočasno namnožitev več lokusov. Uspešnost namnoževanja oljčnih mikrosatelitov so ugotovili tudi pri sorodnih vrstah oljke; forziciji (Forsythia intermedia), velikem jesenu (Fraxinus excelsior), jasminu (Jasminum beesianum), osmantu (Osmanthus hetero-phyllus) in španskem bezgu (Syringa vulgaris).
UPORABNOST MIKROSATELITOV V GENETSKIH ŠTUDIJAH OLJK
Identifikacija in genotipizacija oljčnih sort
Enostavno, vegetativno razmnoževanje oljke je omogočilo intenzivno izmenjavo rastlinskega materiala v državah Sredozemlja, kar je povzročilo veliko zmedo pri imenovanju sort in klonov. Sinonimi in homonimi pomenijo oviro pri vrednotenju genskih virov oljke, zato je karakterizacija genotipov z molekulskimi markerji najbolj primeren način za pravilno identifikacijo sort, ki je ključnega pomena pri upravljanju kolekcij, ločevanju sadilnega materiala v drevesnicah in pri vzgoji certifi-ciranih sadik sort in klonov. Zaradi enostavnega vrednotenja alelnih profilov in zagotavljanja ponovljivosti
□ unja BANOELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
rezultatov med laboratoriji so mikrosateliti najprimernejše orodje za ločevanje sort.
Prvo obsežnejše delo na področju identifikacije oljčnih sort v Sloveniji je bilo prikazano v delu Bandelj et al. (2002b). V raziskavi je bilo določeno najmanjše število mikrosatelitov serije ssrOeUA-DCA (Sefc et al., 2000), s katerimi je bilo mogoče ločiti 19 oljčnih sort iz nacionalnega kolekcijskega nasada oljk v Strunjanu. Najprimernejši markerji so bili izbrani na osnovi naslednjih kriterijev: namnoževanje nekompleksnih elektroforetskih vzorcev s kakovostnimi PCR produkti, stabilna struktura mikrosatelita in visoka informacijska vrednost markerjev. Verjetnost enakosti genotipov (Pl), ki se uporablja kot merilo ločevanja genotipov, je pokazala nizko informacijsko vrednost lokusov DCA1, DCA5, DCA13 in DCA15. Pri omenjenih lokusih so bile vrednosti Pl višje, zato jih uvrščamo med markerje s slabšo sposobnostjo ločevanja in so manj primerni za identifikacijo. Največja sposobnost ločevanja genotipov oljk je bila odkrita pri lokusu DCA16, kjer je bila vrednost Pl najnižja (0,073). Na tem lokusu je bilo ugotovljenih 9 različnih alelov, največ efektivnih alelov (6,6) in največ različnih genotipov (14). Visoko informacijsko vrednost lokusa dokazuje tudi visoko število svojevrstnih genotipov (11). Dobro sposobnost ločevanja posameznikov je imel tudi lokus DCA10 z vrednostjo Pl 0,078 in na katerem je bilo odkritih največ sortno specifičnih alelov (7), ki omogočajo takojšnjo identifikacijo specifičnega genotipa. Med preostalimi lokusi je bil glede na število ugotovljenih edinstvenih genotipov (8) in kakovost PCR produktov za identifikacijo izbran še lokus DCA3. Na osnovi upoštevanih kriterijev so bili med 14-imi mikrosatelitskimi lokusi za identifikacijo izbrani DCA3, DCA10 in DCA16, katerih kombinacija je zagotavljala svojevrstne alelne profile, karakteristične za specifično sorto.
Barranco et al. (2000) so preučili uporabnost mikro-satelitskih markerjev pri ugotavljanju sinonimov sort. V analizo so vključili sorti 'Oblonga' iz Kalifornije in 'Frantoio' iz Italije. Pri morfološki karakterizaciji obeh sort v genski banki so odkrili, da sta sorti fenotipsko identični, zato so ju primerjali z mikrosatelitskimi markerji. Identičnost alelnih profilov so odkrili na petih lokusih (IAS-oli06, IAS-oli11, IAS-oli12, IAS-oli17, IAS-oli22). Na osnovi rezultatov molekulske in morfološke analize so potrdili, da sta sorti genotipsko identični.
Rallo et al. (2000) so s 5-imi lokusi (IAS-oli) ločili 95% od 46 analiziranih sort. Svojevrstne alele, ki omogočajo takojšnjo identifikacijo, so zaznali na dveh lokusih pri 3 sortah, kar je v primerjavi s serijo mikrosatelitov ssrOeUA-DCA, kjer je bilo ugotovljenih kar 25 sortno specifičnih alelov pri 10-ih sortah (Bandelj et al., 2002b), razmeroma malo. Slednje potrjuje visoko informacijsko vrednost lokusov serije ssrOeUA-DCA. De la Rosa et al. (2002) ravno tako poročajo o dobri ločevalni sposobnosti mikrosatelitov serije EMO, saj so s 4-mi lokusi (EMO2, EMO3, EMO13 in EMO30) ločili vseh 23 oljčnih sort.
Preučevanje genetske variabilnosti in sorodnosti oljk z mikrosateliti
Inventarizacija in ohranjanje genskih virov oljk ostajata prioriteti sodobnega oljkarstva. Poznavanje genetske variabilnosti je pomembno pri načrtovanju žlahtnjenja oljke, saj so pomanjkljive informacije o genskih virih glavni razlog, da oljka v preteklosti ni bila vključena v večje žlahtnjiteljske programe. Z namenom pospeševanja vzgoje sort, ki bi bile bolje prilagojene sodobnim agronomskim tehnologijam, v državah Sredozemlja ustanavljajo nacionalne in mednarodne kolekcije, kjer potekajo postopki vrednotenja in identifikacije genetskega materiala oljke.
Za ohranitev genskih virov oljke na Siciliji je bil v letu 1995 vzpostavljen kolekcijski nasad. Na osnovi predhodno objavljenih karakteristik mikrosatelitskih markerjev so La Mantia et al. (2005) napravili raziskavo genetske raznolikosti 46-ih vzorcev oljk, ki pripadajo skupini 30-ih sort. Genotipizacijo vzorcev so opravili na 12-ih mikrosatelitskih lokusih (DCA3, DCA4, DCA9, DCA16, GAPU101, GAPU59, UDO-008, UDO-009, UDO-O12, UDO-024, UD0-039, UD0-043), izbranih na osnovi sposobnosti odkrivanja visokega polimorfizma, odsotnosti pojava senčnih fragmentov in nekompleksnega na-množevanja alelov. Z izbranimi lokusi so v skupini analiziranih oljk namnožili 119 mikrosatelitov, v povprečju so ugotovili 9,5 markerja na lokus. Za lokus UD0-009 je bila ugotovljena nizka sposobnost ločevanja genotipov zaradi majhnega števila namnoženih markerjev in visoke frekvence ponavljanja treh alelov v skupini oljk. Pri tem lokusu so ugotovili tudi pojav fragmenta +1 bp, kar je preprečevalo pravilno določitev dolžine alelov. Na lokusih UD0-043 in DCA4 so opazili značilne vzorce zdrsnjenih alelov, pojav ničtih aleov pa je bil ugotovljen na lokusih UD0-008 in UD0-039. Pri več kot 16-ih vzorcih so ugotovili sinonime. Na osnovi izračunanih koeficientov sorodnosti oljk so izdelali dendrogram in poskušali ugotoviti, ali se oljke s Sicilije genetsko razlikujejo od sort, ki uspevajo v drugih območjih Sredozemlja. Razmestitev sort v skupine ni pokazala večje genetske sorodnosti med oljkami glede na fenotipsko podobnost in geografsko območje gojenja, kar avtorji pojasnjujejo kot posledico prenašanja rastlinskega materiala oljk med Sicilijo in drugimi sredozemskimi državami. Z analizo so ugotovili tudi starševstvo dveh sort. Sorta 'Giarfara' je nastala s križanjem sort 'Nocellara del Belice' in 'Cacaridduni', medtem ko je sorta 'Pizzo di Corvo' križanec sort 'Nocellara Etnea' in 'Tonda Iblea'.
Avtorji mikrosatelitov GAPU (Carriero et al., 2002) so markerje uporabili za preučitev genetske podobnosti 20 vzorcev oljk iz južne (Apulija, Kalabrija, Bazilika) in centralne Italije. Na osnovi izračunanih koeficientov podobnosti so z metodo UPGMA izdelali dendrogram, v katerem so bile sorte razdeljene v dve večji skupini. V prvi so se združile sorte, ki uspevajo na obali Ionskega
Dunja BANDELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
morja, druga skupina pa je bila razdeljena v dve manjši podskupini: kalabrijsko in apulijsko. Avtorji ugotavljajo, da so se sorte razvrstile v sorodnostne skupine glede na geografski izvor oljk.
V Sloveniji so bili mikrosateliti uporabljeni za ugotavljanje genetske sorodnosti oljčnih sort, ki uspevajo na območju Istre (Bandelj et al., 2004b). Z molekulsko raziskavo smo poskušali ugotoviti genetsko povezavo lokalnih sort z italijanskimi, saj je študija oljčne strukture konec 19. in v začetku 20. stoletja pokazala, da je sortiment oljk na območju Istre nastajal pod vplivom Italije, zaradi priseljevanja ljudi iz osrednje Italije na območje Beneške republike (Hugues, 1999). Podobnost je Hugues (1999) opazil tudi v poimenovanju sort. Za analizo so bili uporabljeni lokusi serije DCA (Sefc et al., 2000) in na osnovi rezultatov genotipizacije je bila preučena genetska podobnost 19-ih oljčnih sort. Rezultati razvrščanja v skupine so pokazali, da je 'Crnica', ki je bila v preteklosti najbolj razširjena sorta v Slovenski Istri, genetsko podobna toskanski skupini sort, kar potrjuje domneve Huguesa (1999). Večja genetska podobnost sort je bila opažena pri sortah z večjimi plodovi. V to skupino so se uvrstile tudi nekatere lokalne istrske sorte z večjimi plodovi. Razen toskanske skupine sort pa ni bilo opaziti večje genetske povezanosti sort glede na geografski izvor.
Genetsko variabilnost 130 vzorcev oljk, ki pripadajo skupini 67 sort, so z mikrosateliti serije DCA preučili Lopes et al. (2004). Ugotovili so, da obstaja velika variabilnost znotraj sort, saj so pri nekaterih oljkah odkrili razliko v več kot 15% namnoženih alelov. Z genotipizacijo pri nekaterih sortah niso potrdili sinonimov, omenjenih v podatkovni bazi FAO. Pri več kot 60% vzorcev pa so ugotovili homonime ali napačno označitev vzorcev v kolekciji. Mikrosateliti so se v študiji pokazali kot primerno orodje pri upravljanju kolekcij, identifikaciji sort in klonov ter reševanju sinonimov in homonimov.
Montemurro et al. (2005) so preučili genetsko podobnost 111-ih akcesij oljk (60 sort) iz Italije, Španije, Francije in Grčije. Polimorfizem in genetsko podobnost so analizirali s tremi kombinacijami AFLP markerjev in z 27-imi mikrosatelitskimi lokusi. S kombinacijo obeh markerskih sistemov so ločili vse genotipe oljk. V den-drogramu so bile sorte razvrščene v tri večje skupine glede na uporabnost plodov: za olje, za namizne oljke in kombinacija obeh.
Mikrosateliti gojenih oljk se zaradi ohranjenosti nukleotidnih zaporedij lahko uporabljajo tudi za preučevanja genetske variabilnosti na nivoju vrst iz rodu Olea. Taksonomsko je oljka (Olea europaea L.) razdeljena v 4 podvrste, ki uspevajo v Sredozemlju, Afriki in Aziji (subsp. europaea, cuspidata, laperrinei, cerasiformis) (Green & Wickens, 1989), nedavno pa sta bili kla-sificirani še dve podvrsti (guanchica in maroccana) (Vergas et al., 2001). Kompleks Olea so Rallo et al. (2003) preučili s 4-imi mikrosatelitskimi lokusi gojene oljke serije IAS-oli. S študijo so želeli preveriti in potrditi
ohranjenost mikrosatelitskih regij pri 15-ih vrstah in podvrstah rodu Olea. V analizo so vključili tudi 14 oljčnih sort. Namnoževanje vseh štirih mikrosatelitskih regij so dosegli pri 13-ih taksonih, 2 vrsti pa oljčnih mikrosatelitov nista namnožili. Velik polimorfizem namnoženih markerjev je omogočal nedvoumno identifikacijo večine vzorcev, skupno so odkrili 67 alelov in od tega je bilo več kot 50% svojevrstnih. Največ polimorf-nih markerjev je bilo opaženih na lokusu IAS-oli11, nekoliko manj pa na lokusih IAS-oli 17 in IAS-oli22. Ti rezultati potrjujejo uporabnost lokusov serije IAS-oli za preučevanje filogenije oljke, zanimivo pa je tudi dejstvo, da so Rallo et al. (2000) pri preučevanju 46-ih sort z isto serijo mikrosatelitov ugotovili bistveno manj alelov (26). Rezultati razvrščanja vzorcev v sorodnostne skupine so pokazali, da imajo lokusi sorodnih vrst verjetno različno genetsko ozadje, zaradi katerega je težko določiti dejansko genetsko sorodnost med preučevanimi vrstami. Le z lokusom IAS-oli 12 so dosegli logično razmestitev taksonov v podobnostne skupine, zato poudarjajo, da je za uspešnost ugotavljanja genetske podobnosti med vrstami in podvrstami oljke izbira ustreznega lokusa ključnega pomena. Znotraj vrste je dolžinski polimorfizem primerno merilo, pri večji oddaljenosti taksonov pa je treba predhodno preučiti mutacijski mehanizem in evolucijo mikrosatelita, sicer lahko izbira neustreznega lokusa privede do napačne interpretacije rezultatov. Kljub temu da so v študiji uporabili le 4 mikrosatelitske lokuse, je razvrstitev v sorodnostne skupine pokazala jasno ločitev med podvrstami in sortami. Na osnovi ugotovljenega polimorfizma je bila potrjena uporabnost lokusov za preučevanje genetske podobnosti v kompleksu Olea.
Genetsko raznolikost Olea europaea subsp. laperrinei sta z mikrosateliti preučila Baali-Cherif & Besnard (2005). Subsp. laperrinei je prvotno uspevala v saharskem gorovju, kasneje pa se je razširila še v druga afriška območja. Predvidevajo, da se je zaradi prilagajanj različnim in ekstremnim ekološkim razmeram izoblikovalo več ločenih populacij. Avtorja sta v raziskavo vključila 111 dreves podvrste laperrinei in 34 dreves podvrste europaea iz Alžirije. Na osnovi objavljenih karakteristik mikrosatelitov sta za analizo variabilnosti izbrala 8 lokusov gojene oljke (DCA1, DCA3, DCA8, DCA9, DCA14, DCA15, GAPU 45, EMO3) in lokus PA(ATT)2 bližnjega sorodnika oljke (Phillyrea angustifolia L.). Lokusi so bili izbrani na osnovi števila namnoženih alelov in njihovih dolžin, da so lahko opravili namnoževanje več lokusov hkrati. Z namenom, da bi se izognili pojavu ničtih alelov, sta upoštevala tudi vrednosti opažene in pričakovane heterozigotnosti posameznih lokusov. Število namnoženih alelov je bilo pri obeh podvrstah europaea (85 alelov) in laperrinei (89 alelov) podobno. V skupini oljčnih sort podvrste europaea sta največ alelov (16) odkrila na lokusih DCA8, DCA9, sledili so jima lokusi DCA14 (13 alelov), EMO3 (12
□ unja BANOELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
alelov) in DCA1 (10 alelov). Najmanj alelov pa je bilo ugotovljenih na lokusu GAPU45 (2). Podobne rezultate sta dobila tudi pri analizi podvrste laperrinei. Zanimivo je, da sta na lokusu DCA1 pri tej podskupini odkrila kar 24 različnih alelov. Na tem lokusu smo pri preučevanju 19-ih oljčnih sort iz nacionalnega kolekcijskega nasada v Sloveniji ugotovili le 5 alelov (Bandelj et al., 2004b), drugi dve skupini pa le po 4 alele (Sefc et al., 2000; Lopes et al., 2004). Število namnoženih alelov na lokus ni torej vedno zanesljivo merilo za izbiro najboljših lokusov za genetske analize oljke in je lahko v veliki meri odvisno od raznolikosti genetskega materiala, ki je vključen v raziskavo. Na lokusu DCA1 sta avtorja ugotovila tudi trialelni profil pri treh vzorcih populacije laperrinei, kar pripisujeta somatskim mutacijam in ohranitvi himerizma. Raziskava populacij podvrste laperrinei je pokazala, da je tudi znotraj majhnih populacij možno odkriti veliko variabilnost, kljub nespolnemu načinu razmnoževanja.
Uporabnost mikrosatelitov oljke v žlahtnjiteljskih programih
Mikrosateliti se lahko rutinsko uporabljajo tudi v žlahtnjiteljskih programih oljk. De la Rosa et al. (2004) so mikrosatelite uporabili za testiranje starševstva potomcev štirih avtofertilnih sort in potomcev sedmih kontroliranih križanj, ki so jih opravili v Španiji v programu žlahtnjenja oljke. Za analizo so med poznanimi mikrosateliti izbrali 8 lokusov serije EMO (De la Rosa et al., 2002) in DCA (Sefc et al., 2000) in najprej opravili genotipizacijo 23-ih oljčnih sort. Avtorji so ocenili informacijsko vrednost lokusov na osnovi števila namno-ženih alelov in sposobnosti ločevanja sort s kombinacijo alelov (genotipov) na posameznem lokusu. Največ sort so lahko ločili z lokusi EMO2 (11), EMO3 (10), DCA9 (16) in DCA18 (12), slabšo ločevalno sposobnost mar-kerjev pa so opazili na lokusih EMO13, EM030, EMO88 in EMO90. Lokuse z visoko informacijsko vrednostjo so nato uporabili za testiranje starševstva 149-ih potomcev. Nestarševske alele so ugotovili tako pri avtofertilnih rastlinah kot pri potomcih načrtovanih križanj. Pravilni alelni profili so bili ugotovljeni le pri treh kontroliranih križanj sort Picual in Arbequina. Z raziskavo so avtorji podali tudi nekaj pomembnih ugotovitev za načrtovanje križanj oljk. Ugotovili so, da je emaskulacija pri avtofertilnih sortah oljk nepotrebna in da je za zagotavljanje uspešnosti križanja potrebno opraševalne vrečke nameščati na materine rastline, preden se v zraku pojavi prvi pelod. Avtorji so 23 oljčnih sort na osmih lokusih predstavili z alelnimi profili v bp, kar bo v nadaljevanju omogočalo primerjavo rezultatov genotipizacije oljk med različnimi laboratoriji, kar pomeni velik prispevek k vzpostavljanju podatkovne baze za genotipizacijo oljke z mikrosatelitskimi markerji.
Preverjanje pristnosti sortne strukture oljčnih olj z oznako zaščiteno geografsko poreklo
Z Uredbo o zaščiti geografskih označb in označb porekla za kmetijske proizvode in živila (ES št. 510/ 2006) se oljčna olja z geografskim poreklom pridobivajo iz določenega sortimenta, ki je za območje značilen. Tehnologija DNA ponuja obetaven način kontrole provenience oljčnega olja, saj je v vsakem olju prisotna DNA sort oljk, iz katerih je bilo olje pridobljeno (Breton ef al., 2004; Woolfe & Primrose, 2004). V Italiji (Muz-zalupo & Perri, 2002; Busconi ef al., 2003; Testolin & Lai n, 2005; Pafundo ef al., 2005) in Franciji (Breton ef al., 2004) že poročajo o uspešni vzpostavitvi kontrole sledljivosti oljčnih olj z markerji DNA in aplikacije metode za preverjanje geografskega porekla. Raziskovalci pri tem poudarjajo, da je ključnega pomena ustrezna izbira molekulskih markerjev ter predhodno vzpostavljena podatkovna baza z opisi markerjev za sorte nekega pridelovalnega območja (Busconi ef al., 2003; Pasqa-lone ef al., 2004). Prve raziskave o uporabi mikrosatelitov pri določanju sort v oljčnem olju so pokazale, da so ti markerji primerni in najbolj perspektivni za genetsko kontrolo pristnosti oljčnih olj z geografskim poreklom (Breton ef al., 2004; Pasqualone ef al., 2004, Testolin & Lain, 2005).
Uporabnost mikrosatelitov pri kartiranju genoma oljke
Motivi za izdelavo genskih kart so lahko različni. Pri rastlinah se uporabljajo za kartiranje lokusov, povezanih s kvalitativnimi (enostavnimi) ali kvantitativnimi lastnostmi (QTL: Quantitative Trait Locus). Izdelana genska karta lahko rabi kot orodje, ki ga potrebujejo žlahtnjitelji pri načrtovanju procesa izboljšanja genskih virov rastlin. Gensko kartiranje temelji na principu, da se geni, ki so dovolj blizu na istem kromosomu, dedujejo vezano. Pri tem se ugotavlja pogostost rekombinacij, pri čemer se lahko oceni razdalja med geni ali genskimi markerji na istem kromosomu. Mikrosateliti so zaradi številčnosti v rastlinskih genomih zelo uporabni pri kartiranju.
Prvo vezano karto oljke so izdelali De la Rosa ef al. (2003), v katero so vključili markerje RAPD, AFLP, RFLP in mikrosatelite. Analizo dedovanja so opravili na 95-ih potomcih psevdotestnega križanja dveh visoko hetero-zigotnih sort 'Leccino' in 'Dolce Agogia'. Pripravljeni karti sta povezali 249 markerjev s pokritostjo 2765 cM pri sorti 'Leccino' in 236 markerjev s pokritostjo 2445 cM pri sorti 'Dolce Agogia'. Zaradi prisotnosti manjših vezanih skupin in nevezanih markerjev se karti nista razdelili v 23 vezanih skupin, kot so pričakovali. Avtorji sklepajo, da uporabljeni markerji niso enakomerno razpršeni v genomu oljke.
Wu ef al. (2004) so predstavili prvo integrirano karto oljke, ki so jo pripravili po principu psevdotestnega križanja sort 'Frantoio' in 'Kalamata'. V analizo so vklju-
□ unja BANOELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
čili 104 potomce F1 generacije in preučili dedovanje 178 markerjev RAPD, 9 mikrosatelitov in 3 markerje SCAR, med katerimi je bil en povezan z odpornostjo na glivo pavjega očesa. Integrirana karta je vsebovala 101 lokus, ki so bili razdeljeni v 15 skupin s povprečno razdaljo med lokusi 10,2 cM. Po prehodu potomcev križanja v rodno obdobje nameravajo avtorji v obstoječo gensko karto vključiti še morfološke markerje agronomsko pomembnih lastnosti, kot so čas cvetenja, odpornost na bolezni ter kakovostne parametre oljčnega olja in plodov (npr. oljevitost). Vezana karta bo temelj za bodoče programe žlahtnjenja oljk in bo uporabljena za identifikacijo lokusov, ki določajo kvantitativne lastnosti (QTL), ter za preučevanje genoma oljke.
ZAKLJUČKI
Lastnosti in prednosti mikrosatelitskega markerskega sistema pred drugimi razpoložljivimi markerji so dobro poznane. Z razvojem mikrosatelitov oljke so se ti markerji vključili v različne genetske študije: genotipi-zacija in identifikacija oljčnih sort, ugotavljanje genetske variabilnosti klonov in sort, preučevanje genetske podobnosti in strukture oljk različnih geografskih območji, izdelava genskih kart in starševske analize. Mikrosateliti veliko obetajo tudi na področju kontrole sortne sestave oljčnega olja z zaščitenim geografskim poreklom. V identifikacijskih študijah se je pokazalo, da bi bilo treba pri oljki vzpostaviti poenoten postopek identifikacije genotipov in podatkovno bazo z opisi referenčnih sort na nivoju DNA. Izbira mikrosatelitov se zdi logična, saj bo s tem omogočena primerljivost rezultatov med laboratoriji. Podatkovna baza z opisi oljčnih sort na visoko informativnih lokusih bo prispevala k pospešeni identifikaciji in karakterizaciji genskih virov oljke, rešitvi sinonimov in homonimov ter ugotavljanju geografskega izvora oljk. Vzpostavitev podatkovne baze genotipov oljk pridelovalnih območij je nujno potrebna tudi z vidika zagotavljanja genetske kontrole oljčnih olj s kakovostnimi oznakami.
Uporaba mikrosatelitskega markerskega sistema v genetskih študijah vključuje tudi analize informativnosti lokusov, saj vsi objavljeni mikrosateliti niso primerni kot markerji v molekularno-genetskih študijah. Razlikujejo se v kakovosti namnoževanja alelov in sposobnosti odkrivanja polimorfizma. Iz tega vidika je pomembno objavljene markerje predhodno testirati in izbrati le najbolj informativne glede na cilj raziskave. Najpogostejši kriteriji pri izbiri lokusov so število namnoženih alelov, heterozigotnost lokusa, informacijska vrednost polimorfizma (PIC vrednost) in verjetnost identičnosti genotipov (PI vrednost). Izbira je lahko tudi kompleksnejša, če upoštevamo, da so nekatere karakteristike markerjev odvisne tudi od strukture mikrosatelita. Pojavi ničtih alelov in senčnih fragmentov ter večlokusno namnoževanje mikrosatelitov lahko privedejo do napačne interpretacije
rezultatov, zato je pri izbiri najprimernejših lokusov za analize treba upoštevati tudi te kriterije.
Med objavljenimi mikrosateliti oljke so kar 4 študije potrdile izredno visoko informacijsko vrednost lokusov serije ssrOeUA-DCA (Sefc et al., 2000; Bandeljef al., 2004b; Lopes et al., 2004; La Mantia et al., 2005). Če povzamemo, so bili lokusi DCA3, DCA9, DCA10 in DCA16 najprimernejši za identifikacijo oljčnih sort zaradi nizke verjetnosti identičnosti genotipov. Zavoljo nizke informacijske vrednosti in visoke verjetnosti identičnosti genotipov ter majhnega števila efektivnih alelov so bili najslabši parametri variabilnosti opaženi pri lokusih DCA1, DCA5, DCA13 in DCA15. Verjetnost pojava ničtih alelov je bila največja pri lokusih DCA4, DCA11 in DCA13. Lokusa DCA4 in DCA14 namnožujeta kompleksne alelne profile, pri lokusih DCA1, DCA10 in DCA17 je bila ugotovljena dominanca kratkega alela (Bandelj et al., 2004b), lokusa DCA11 in DCA17 pa imata nestabilno mikrosatelitsko strukturo (Sefc et al., 2000).
V seriji mikrosatelitov IAS-oli (Rallo et al., 2000) so bili ugotovljeni najboljši parametri variabilnosti pri dveh lokusih IAS-oli 11 in IAS-oli 12, slabši pa pri lokusih IAS-oli06, IAS-oli 17 in IAS-oli22. Rezultati dveh študij (Rallo et al., 2000, 2003) so pokazali, da so lokusi serije IAS-oli morda primernejši za raziskave kompleksa Olea, saj je bilo pri preučevanju različnih podvrst oljke ugotovljeno bistveno večje število markerjev (67) v primerjavi s študijo 46-ih sort, kjer so odkrili le 26 mikrosatelitov.
Trideset objavljenih mikrosatelitskih lokusov serije UDO (Cipriani et al., 2002) je imelo v povprečju le po 3 mikrosatelite na lokus. Vzrok za tako nizko število ugotovljenih alelov je verjetno v ožji genetski podobnosti 12-ih sort, ki so jih avtorji vključili v analizo. La Mantia et al. (2005), ki so uporabili 6 UDO lokusov v študiji genetske strukture 46-ih akcesij oljk, so v povprečju namnožili bistveno več mikrosatelitov (7,8). Slabše parametre variabilnosti so odkrili na lokusu UD0-009, opažena heterozigotnost pa je bila nižja od pričakovane na lokusih UD0-008 in UD0-039, zato ti lokusi niso najbolj primerni za genetske študije.
Sodeč po številu namnoženih alelov na lokusih serije GAPU (Carriero et al., 2002) bi lahko med 20 objavljenimi lokusi izbrali kot primerne za genetske študije lokuse: GAPU101, GAPU103A, GAPU47, GAPU89, GAPU71B, GAPU71A, GAPU45 in GAPU59. La Mantia et al. (2005) so potrdili visoko informacijsko vrednost dveh lokusov: GAPU101 in GAPU59.
Dobri parametri variabilnosti so bili ugotovljeni tudi za serijo mikrosatelitskih lokusov EMO (De la Rosa et al., 2002). Na vseh lokusih razen EMOL so odkrili več kot 6 alelov, za EMO30 je bil značilno večlokusno namnoževanje markerjev, pri EMO90 pa je bila opažena heterozigotnost nižja od pričakovane. Nekoliko slabša sposobnost ločevanja sort je bila ugotovljena pri lokusih EMO13 in EMO88. Med informativne lokuse bi torej lahko uvrstili lokusa EMO2 in EMO3.
Dunja BANDELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
MICROSATELLITE MARKERS AND THEIR USE IN OLIVE GROWING
Dunja BANDELJ MAVSAR University of Primorska, Science and Research Centre Koper, SI-6000 Koper, Garibaldijeva 1 E-mail: dunja.bandelj@zrs-kp.si
SUMMARY
Microsatellites as one of the most popular marker systems are widely used in plant genetic research for diversity studies, linkage analysis, genetic map development and fingerprinting studies. Their wide usage is based on their excellent properties, such as high abundance in eucaryotic genomes, co-dominant nature, hypervariability, robustness and high information content. In olives, first microsatellites were published in 2000, and from then on they have been frequently included in different olive genetic investigations. The objective of this work was to present published microsatellites in olives, to review their characteristics and to survey their applicability in olive genetic studies.
Key words: microsatellites, SSR, Olea europaea L., olive growing, polymorphism
LITERATURA
Armour, J. A. L., S. A. Alegre, S. Miles, L. J. Williams & R. M. Badge (1999): Minisatellites and mutation processes in tandemly repetitive DNA. In: Goldstein, D. B. & C. Schlotterer (eds.): Microsatellites: Evolution and Applications. Oxford University Press, p. 24-33. Baali-Cherif, D. & G. Besnard (2005): High genetic diversity and clonal growth in relict populations of Olea europaea subsp. laperrinei (Oleaceae) from Hoggar, Algeria. Ann. Bot., 96(5), 823-830. Bandelj, D., J. Jakse & B. Javornik (2002a): Genetske raziskave oljke. Annales, Ser. Hist. Nat., 12(2), 239-248. Bandelj, D., J. Jakse & B. Javornik (2002b): DNA Fingerprinting of Olive Varieties by Microsatellite Markers. Food Technol. Biotechnol., 40(3), 185-190. Bandelj, D., J. Jakse & B. Javornik (2004a): Amplification of fluorescent-labelled microsatellite markers in olives by a novel, economic method. Acta agric. Slov., 83(2), 323-329.
Bandelj, D., J. Jakse & B. Javornik (2004b): Assessment of genetic variability of olive varieties by microsatellite and AFLP markers. Euphytica, 136, 93-102. Barranco, D., I. Trujillo & P. Rallo (2000): Are Oblonga' and 'Frantoio' olives the same cultivar? Hort-Science, 35, 1323-1325.
Belaj, A., Z. Satovic, G. Cipriani, L. Baldoni, R. Testolin, L. Rallo & I. Trujillo (2003): Comparative study of the discriminating capacity of RAPD, AFLP and SSR markers and their effectiveness in establishing genetic relationship in olive. Theor. Appl. Genet., 107, 736-744. Botstein, D., R. L. White, M. Skolnick & R. W. Davis (1980): Construction of genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet., 32, 314-331.
Bowers, J. E., G. S. Dangl, R. Vignani & C. P. Meredith
(1996): Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.). Genome, 39, 628-633. Breton, C., D. Claux, I. Metton, G. Skorski & A. Berville (2004): Comparative study of methods for DNA preparation from olive oil samples to identify cultivar SSR alleles in commercial oil samples: possible forensic applications. J. Agric. Food Chem., 52(3), 531-537. Busconi, M., C. Foroni, M. Corradi, C. Bongiorno, F. Cattapan & C. Fogher (2003): DNA extraction from olive oil and its use in the identification of the production cultivar. Food Chem., 83, 127-134. Carriero, F., G. Fontanazza, F. Cellini & G. Giorio
(2002):	Identification of simple sequence repeats (SSRs) in olive (Olea europaea L.). Theor. Appl. Genet., 104, 301-307.
Chambers, G. K. & E. S. MacAvoy (2000): Microsatellites: consensus and controversity. Comp. Biochem. Physiol. B, 126, 455-576.
Cipriani, G., M. T. Marrazzo, R. Marconi, A. Cimato & R. Testolin (2002): Microsatellite markers isolated in olive (Olea europaea L.) are suitable for individual fingerprinting and revealing polymorphism with ancient cultivars. Theor. Appl. Genet., 104, 223-228. De la Rosa, R., A. Angiolillo, C. Guerrero, M. Pellegrini, L. Rallo, G. Besnard, A. Berville, A. Martin & L. Baldoni
(2003):	A first linkage map of olive (Olea europaea L.) cultivars using RAPD, AFLP, RFLP and SSR markers. Theor. Appl. Genet., 106(7), 1273-1282.
De la Rosa, R., C. M. James & K. R. Tobutt (2002): Isolation and characterization of polymorphic microsatellites in olive (Olea europaea L.) and their transferability to other genera in the Oleaceae. Mol. Ecol. Notes, 2, 265-267.
□ unja BANDELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
De la Rosa, R., C. M. James & R. Tobutt (2004): Using microsatellites for paterny testing in olive progenies. HortScience, 39(2), 351-354.
Eisen, J. A. (1999): Mechanistic basis for microsatellite instability. In: Goldstein, D. B. & C. Schlotterer (eds.): Microsatellites: Evolution and Applications. Oxford University Press, p. 34-48.
Green, P. S. & G. E. Wickens (1989): The Olea europaea complex. In: Tan, K. (ed.): The Davis & Hedge Festschrift. Edinburgh University Press, p. 287-299. Gupta, P. K. & R. K. Varshney (2000): The development and use of microsatellite markers for genetic analysis and plant breeding with emphasis on bread wheat. Euphytica, 113, 163-185.
Hancock, J. M. (1999): Microsatellites and other simple sequences: genomic context and mutational mechanisms. In: Goldstein, D. B. & C. Schlotterer (eds.): Microsatellites: Evolution and Applications. Oxford University Press, p. 1-9.
Huang, W. G., G. Cipriani, M. Morgante & R. Testolin (1998): Microsatellite DNA in Actinidia chinensis: isolation, characterisation, and homology in related species. Theor. Appl. Genet., 97, 1269-1278. Hugues, C. (1999): Maslinarstvo I stre/ Elaiografia Istriana. Ceres, Zagreb, 284 str.
Jakše, J. & B. Javornik (2001): High Throughput Isolation of Microsatellites in Hop (Humulus lupulus L.). Plant Mol. Biol. Reporter, 19, 217-226. Jones, C. J., K. J. Edwards, S. Castaglione, M. O. Winfield, F. Sala, C. van de Wiel, G. Bredemeijer, B. Vosman, M. Matthes, A. Daly, R. Brettschneider, P. Bettini, M. Buiatti, E. Maestri, A. Malcevschi, N. Marmiroli, R. Aert, G. Volckaert, J. Rueda, R. Linacero, A. Vazquez & A. Karp (1997):. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Mol. Breeding, 3, 381-390. Kashi, Y. & M. Soller (1999): Functional roles of microsatellites and minisatellites. In: Goldstein, D. B. & C. Schlotterer (eds.): Microsatellites: Evolution and Applications. Oxford University Press, p. 10-23. Kline, M. C., D. L. Duewer, P. Newall, J. W. Redman, D. J. Reeder & M. Richard (1997): Interlaboratory evaluation of short tandem repeat triplex CTT. J. Forensic Sci., 42, 897-906.
Kozjak, P., Z. Korošec-Koruza & B. Javornik (2003a):
Characterisation of cv. refošk (Vitis vinifera L.) by SSR markers. Vitis, 42(2), 83-86.
Kozjak, P., Z. Korošec-Koruza & B. Javornik (2003b):
Microsatellite analysis by automated fluorescent detection using ALFexpress aparatures: A case of grapevine analysis. Zbornik Biotehniške Fakultete, Univerza v Ljubljani. Kmetijstvo, 81(1), str. 47-55. La Mantia, M., O. Lain, T. Caruso & R. Testolin (2005): SSR-based DNA fingerprints reveal the genetic diversity of Sicilian olive (Olea europaea L.) germplasm. J. Horticultural Sci. Biotechnol., 80(5), 628-632.
Levinson, G. & G. A. Gutman (1987): Slipped-strand misspairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Mol. Biol. Evol., 4, 203-221. Litt, M. & J. A. Luly (1989): A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinu-cleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet., 44, 397-401. Lopes, M. S., D. Mendonça, K. M. Sefc, F. S. Gil & A. Câmara Machado (2004): Genetic evidence of intra-cultivar variability within Iberian olive cultivars. HortScience, 39(7), 1562-1565.
McCouch, S. R., L. Teytelman, Y. Xu, K. B. Lobos, K. Clare, M. Walton, B. Fu, R. Maghirang, Z. Li, Y. Xing, Q. Zhang, I. Kono, M. Yano, R. Fjellstrom, G. DeClerck, D. Schneider, S. Cartinhour, D. Ware & L. Stein (2002):
Development and Mapping of 2240 New SSR Markers for Rice (Oryza sativa L.). DNA Res., 9, 199-207. Metzgar, D., J. Bytof & C. Wills (2000): Selection against frameshift mutations limits microsatellite expansion in coding DNA. Genome Res., 10, 72-80. Montemurro, C., R. Simeone, A. Pasqualone, E. Ferrar & A. Blanco (2005): Genetic relationships and cultivar identification among 112 olive accessions using AFLP and SSR markers. J. Horticultural Sci. Bitechnol., 80(1), 105-110.
Morgante, M., M. Hanafey & W. Powell (2002): Microsatellites are preferentially associated with nonrepetative DNA in plant genomes. Nat. Genet., 30, 194-200. Morgante, M. & A. M. Olivieri (1993): PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics. Plant J., 3, 175-182.
Murray, V., C. Monchawin & P. England (1993): The
determination of the sequence present in the shadow bands of an dinucleotide repeat PCR. Nucleic Acids Res., 21(10), 2395-2398.
Muzzalupo, I. & E. Perri (2002): Recovery and characterisation of DNA from virgin olive oil. Eur. Food Res. Tecnol., 214, 528-531.
Muzzalupo, I., N. Lombardo, A. Musacchio, M. E. Noce, G. Pellegrino, E. Perri & A. Sajjad (2006): DNA
Sequence Analysis of Microsatellite Markers Enhances Their Efficiency for Germplasm Management in an Italian Olive Collection. Am. Soc. Horticultural Sci., 131(3), 352-359.
Pafundo, S., C. Agrimonti & N. Marmiroli (2005):
Traceability of Plant Contribution in Olive Oil by Amplified Fragment Length Polymorphisms. J. Agric. Food Chem., 53, 6995-7002.
Pasqualone, A., C. Montemurro, F. Caponio & A. Blanco (2004): Identification of virgin olive oil from different cultivars by analysis of DNA microsatellites. J. Agric. Food Chem., 52(5),1068-1071. Peakall, R., S. Gilmore, W. Keys, M. Morgante & A. Rafalski (1998): Cross species amplification of soybean (Glycine max) simple sequence repeats (SSRs) within the genus and other legume genera: Implications for the
□ unja BANDELJ MAVSAR: MIKROSATELITSKI MARKERJI IN NJIHOVA UPORABNOST V OLJKARSTVU, 209-222
transferability of SSRs in plants. Mol. Biol. Evol., 15, 1275-1287.
Powell, W., G. C. Machray & J. Provan (1996a): Polymorphism revealed by simple sequence repeats. Trends Plant Sci., 1, 215-222.
Powell, W., M. Morgante, C. Andre, M. Hanafey, J. Vogel, S. Tingey & A. Rafalski (1996b): The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers for germplasm analysis. Mol. Breeding, 2, 225-238. Rafalski, J. A. & V. Tingey (1993): Genetic diagnosis in plant breeding: RAPDs, microsatellites and machines. Trends Genet., 9, 275-280.
Rallo, P., G. Dorado & A. Martin (2000): Development of simple sequence repeats (SSRs) in olive tree (Olea europaea L.). Theor. Appl. Genet., 101, 984-989. Rallo, P., I. Tenzer, C. Gessler, L. Baldoni, G. Dorado & A. Martin (2003): Transferability of olive microsatellite loci across the genus Olea. Theor. Appl. Genet., 107, 940-946.
Rugini, E. & L. Baldoni (2005): Olea europaea Olive. In: Litz, R. E. (ed.): Biotechnology of Fruit and Nut Crops. CABI Publishing, Oxfordshire, p. 404-428. Schlotterer, C. (1998): Microsatellites. In: Hoelzel, A. R. (ed.): Molecular Genetics Analysis of Populations: A Practical Approach. IRL Press, Oxford, p. 237-261. Schlotterer, C. (2000): Evolutionary dynamics of microsatellite DNA. Chromosoma, 109, 365-371. Schuelke, M. (2000): An economic method for the fluorescent labelling of PCR fragments. Nat. Biotechnol., 18, 233-234.
Scott, I. A. W., C. M. Hayes, S. Keogh, J. K. Webb (2001): Isolation and characterization of novel microsatellite markers from the Australian tiger snakes (Elapidae: Notechis) and amplification in the closely related genus Hoplocephalus. Mol. Ecol. Notes, 1, 117-119. Sefc, K. M., M. S. Lopes, D. Mendonça, M. Rodrigues Dos Santos, M. Laimer Da Câmara Machado & A. Da Câmara Machado (2000): Identification of microsatellite loci in olive (Olea europaea L.) and their characterization in Italian and Iberian olive trees. Mol. Ecol., 9, 1171-1173.
Song, Q. J., E. W. Fickus & P. B. Cregan (2002):
Characterization of trinucleotide SSR motifs in wheat. Theor. Appl. Genet., 104, 286-293. Squirrell, J., P. M. Hollingsworth, M. Woodhead, J. Russell, A. J. Lowe, M. Gibby & W. Powell (2003): How
much effort is required to isolate nuclear microsatellites from plants. Mol. Ecol., 12, 1339-1348. Štajner, N., J. Jakše, P. Kozjak & B. Javornik (2005): The isolation and characterization of microsatellites in hop (Humulus lupulus L.). Plant Sci., 168, 213-221. Tautz, D., M. Trick & G. A. Dover (1986): Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation. Nature, 322, 652-656.
Testolin, R. & O. Lain (2005): DNA Extraction from Olive Oil and PCR Amplification of Microsatellite Markers. J. Food Sci., 70(C108): doi:10.1111/j.1365-2621. 2005.tb09011.x.
Toth, G., Z. Gaspari & J. Jurka (2000): Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Res., 10, 967-981.
Vergas, P., F. Munoz Garmendia, J. Hess & J. Kadereit (2001): Olea europaea subsp. guanchica and subsp. maroccana (Oleaceae), two new names for olive varieties. Anal. Jardin Bot. Madrid, 58, 360-361. Wattier, R., C. R. Engel, P. Saumitou-Laprade & M. Valero (1998): Short allele dominance as a source of heterozygote deficiency at microsatellite loci: experimental evidence at the dinucleotide locus Gv1CT in Gracilaria gracilis (Rhodophyta). Mol. Ecol., 7, 15691573.
Weber, J. L. (1990): Informativeness of human (dC-dA)n-(dG-dT)n polymorphisms. Genomics, 7, 524-530. Weber, J. L. & P. E. May (1989): Abundant class of human DNA polymorphisms can be typed using the polymerase chain reaction. Am. J. Hum. Genet., 44, 388-396.
Weising, K., P. Winter, B. Huttel & G. Kahl (1998):
Microsatellites markers for molecular breeding. J. Crop Prod., 1, 113-143.
Woolfe, M. & S. Primrose (2004): Food forensics: using DNA technology to combat misdescription and fraud. Trend Biotechnol., 22(5), 222-226. Wu, S.-B., G. Collins & M. Sedgley (2004): A molecular linkage map of olive (Olea europaea L.) based on RAPD, microsatellite, and SCAR markers. Genome, 47(1), 2635.
Zohary, D. & P. Spiegel-Roy (1975): Beginnings of fruit growing in the Old World. Science, 187, 319-327. Zupančič, I. (1998): Genetski detektivi: prepoznavanje oseb in preverjanje sorodstvenih povezav s pomočjo preiskave DNA. Proteus, 60, 400-405.