Površinska predstavitev vezalcev tumorskih antigenov na bakterijah Lactococcus lactis NZ9000 in vrednotenje njihove vezave na izbrane človeške tumorske celične linije
Surface display of tumor antigen binders on Lactococcus lactis NZ9000 and evaluation of their binding to selected human tumor cell lines : doktorska disertacija

angleški
slovenski

doktorska dela

2021

Rak (medicina)   Rak debelega črevesa in danke   Rekombinantni proteini   Tarčna zdravila

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo
(Obvezni izvod spletne publikacije)

Kolorektalni rak (KRR) je zelo razširjen (tretji najpogostejši rak pri moških in drugi pri ženskah), z visokim številom smrtnih žrtev in slabo prognozo. Obstoječe zdravljenje je drago in zahtevno, poleg tega povzroča hude neželene stranske učinke, zato je razvoj novih načinov zdravljenja ključnega pomena. Na progresijo KRR vpliva porušitev ravnovesja črevesne mikrobiote, katere del so koristne simbiotske bakterije in oportunistični patogeni. Medtem ko patogeni spodbujajo vnetje, simbiotske bakterije pripomorejo k vzdrževanju nepoškodovane bariere črevesne sluznice. Med simbiotske bakterije sodijo tudi mlečnokislinske bakterije (MKB), ki so zaradi dolgoletne zgodovine uporabe v prehrani splošno priznane kot varne. Poleg blagodejnega delovanja MKB v črevesju, so rekombinantno spremenjene MKB uporabne tudi kot dostavni sistemi za terapevtske molekule. Za modelno MKB Lactococcus lactis je na voljo več različnih sistemov za površinsko predstavitev rekombinantnih proteinov. Fuzijski protein na bakterijsko površino pritrjujejo sidrne domene, med katerimi se najpogosteje uporablja C- končni del proteina AcmA (cAcmA), ki omogoči nekovalentno sidranje na peptidoglikan bakterijske celične stene. V prvem delu doktorske disertacije smo se osredotočili na oblikovanje alternative sidrnemu proteinu cAcmA. Pripravili smo 15 sidrnih proteinov, ki se na površino bakterije L. lactis sidrajo kovalentno ali nekovalentno in jih po obsegu površinske predstavitve primerjali s cAcmA. Sidrno zaporedje cAM12 iz genoma laktokoknih fagov se je izkazalo kot enakovredno sidrnemu proteinu cAcmA. Poleg tega smo ugotovili, da se cAM12 pritrjuje na drugo mesto na bakterijski površini kot cAcmA, in bi ga tako lahko uporabili kot njegovo alternativo. V drugem delu doktorske disertacije smo se osredotočili na razvoj MKB L. lactis s površinsko predstavljenimi proteinskimi vezalci za ciljanje tumorskih celičnih linij. Rakave celice namreč na svoji površini prekomerno izražajo tumorske antigene, kar se v terapiji izkorišča za ciljano zdravljenje. Za kolorektalni rak je značilno izražanje več različnih tumorskih antigenov (1). Mi smo se osredotočili na tri, EpCAM, HER2 in Gb3. EpCAM in HER2 preizkušajo za uporabo v diagnostiki (2) in terapiji (3), izražanje Gb3 pa je zanimivo, ker korelira s progresijo KRR (4). Uporabili smo neimunoglobulinska vezalca za ciljanje EpCAM in HER2, ter lektin, B podenoto toksina Shiga, za vezavo na Gb3. Pri tem smo uporabljali plazmid pNZDual, ki omogoča hkratno izražanje dveh proteinov, poleg vezalca tumorskih antigenov še reporterski infrardeči fluorescentni protein za detekcijo ter potrdili njuno izražanje in funkcionalnost. Za vrednotenje ciljane vezave tarčnih bakterij L. lactis smo uporabili več tumorskih celičnih linij; HeLa, HEK293, pri kateri smo s procesom transfekcije vnesli plazmid za prekomerno izražanje proučevanih tumorskih antigenov, ter kolorektalni celični liniji HT-29 in Caco-2. S konfokalno mikroskopijo smo na celični liniji HEK293 potrdili vezavo 39% tarčnih L. lactis za ciljanje tumorskega antigena EpCAM in 67% tarčnih L. lactis za ciljanje tumorskega antigena HER2. Vezava na kolorektalne celice je bila nekoliko slabša, vendar statistično značilna v primerjavi s kontrolo. Uspešno in specifično usmerjeno vezavo tarčnih bakterij L. lactis na izbrane tumorske celične linije smo potrdili tudi s pretočno citometrijo in pretočnim sistemom za spremljanje vezave bakterij na človeške celice v realnem času. V nadaljevanju smo delo razširili še s pripravo bakterij L. lactis s terapevtskim delovanjem. Osredotočili smo se na citokinsko signaliziranje, ki ima ključno vlogo pri spodbujanju vnetja in tako pripomore k progresiji KRR. Na površini bakterij L. lactis smo predstavili proteine REX, ki delujejo kot zaviralci receptorja IL-23, in ustavijo vnetno pot.

12.05.2023