Farm Vestn 2021; 72: 145 228; UDK 615 CODEN FMVTA, SLO ISSN 2536 4316 julij 2021, letnik 72 FARMACEVTSKI VESTNIK št. 3 OSREDNJA TEMA : NOVOSTI NA PODROcJU FARMACEVTSKE TEHNOLOGIJE STROKOVNO GLASILO SLOVENSKE FARMACIJE I PHARMACEUTICAL JOURNAL OF SLOVENIA Izdaja: SLOVENSKO FARMACEVTSKO DRUŠTVO, Dunajska 184 A, SI 1000 Ljubljana STROKOVNO GLASILO SLOVENSKE FARMACIJE | PHARMACEUTICAL JOURNAL OF SLOVENIA FARMACEVTSKI VESTNIK št. 3 | julij 2021 | letnik 72 ODGOVORNI UREDNIK: Borut Štrukelj GLAVNA UREDNICA: Nina Kocevar Glavac GOSTUJOCA UREDNICA: Alenka Zvonar Pobirk UREDNIŠKI ODBOR: Mitja Kos Janja Marc Andrijana Tivadar Matjaž Tuš Tomaž Vovk Alenka Zvonar Pobirk IZDAJATELJSKI SVET: Mateja Cvirn Novak Mirjana Gašperlin Alenka Karnicar Sara Kenda Janez Ilaš Nina Pisk Janez Toni NASLOV UREDNIŠTVA / ADDRESS OF THE EDITORIAL OFFICE: Slovensko farmacevtsko društvo, Dunajska 184a, 1000 Ljubljana T.: +386 (01) 569 26 01 Transakcijski racun pri Novi LB d.d. Ljubljana: 02010 0016686585. Brez pisnega dovoljenja uredništva Farmacevtskega vestnika so prepovedani reproduciranje, distribuiranje, javna priobcitev, predelava in kakršna koli druga uporaba avtorskega dela ali njegovih delov v kakršnem koli obsegu in postopku kot tudi tiskanje in predelava elektronske oblike. Izhaja petkrat letno. Letna narocnina je 70 EUR. Za tuje narocnike 100 US$. Tiska: COLLEGIUM GRAPHICUM Fotografija na naslovnici: Shutterstock Naklada: 3.600 izvodov Farmacevtski vestnik (Pharmaceutical Journal of Slovenia) is published 5 times a year by the Slovenian Pharmaceutical Society, Subscription rate in inland 70 EUR other countries US$ 100. Farmacevtski vestnik sofinancira Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije iz sredstev državnega proracuna iz naslova razpisa za sofinanciranje domacih znanstvenih periodicnih publikacij. Dragi kolegi in bralci Farmacevtskega vestnika, vsebina letošnje 3. številke je v skladu z letnim casom razgibana in vas bo popeljala v novosti na podrocju farmacevtske tehnologije in sorodnih ved. Sledili bomo življenjskemu ciklu zdravila, ki se zacne z odkritjem nove zdra­vilne ucinkovine, nadaljuje pa z nacrtovanjem ustrezne farmacevtske oblike ali dostavnega sistema in slednjemu prilagojene izbire pomožnih snovi ter proizvodnega procesa. V uvodnem prispevku predstavljamo konzervanse kot pomožne snovi za zagotavljanje mikrobiološke kakovosti zdravil, s poudarkom na novostih pri oznacevanju njihove vsebnosti in zgornjih varnih mej uporabe glede na smernice EMA. Drugi in tretji prispevek sta posvecena novostim s podrocja tehnoloških procesov. Liofilizacija je metoda izbora za pripravo stabilnih zdravil s proteinskimi ucinkovinami, ekstrakcija s subkriticno vodo pa se uveljavlja kot zelena, okolju prijazna tehnologija za pridobivanje rastlinskih ekstraktov. Premik po casovni lestvici izdelave zdravila nas pripelje do obli­kovanja sistemov za ciljano dostavo ucinkovin v debelo crevo, bodisi za lo-kalno zdravljenje bolezni debelega crevesa ali kot alternativna pot vnosa ucinkovin. Za vsak napredek je bistveno, da pogled usmerjamo ne le v se­danjost, temvec tudi v prihodnost, zato drugi del te številke Farmacevt­skega vestnika zaokrožujemo z novostmi, ki si utirajo pot v prakso. Polimerna nanovlakna imajo velik potencial ne le za dostavo ucinkovin, temvec tudi za izdelavo tkivnih nadomestkov. Na podrocju nanodostavnih sistemov pa se uveljavljajo tudi nanoteranostiki, ki omogocajo posamezniku prilagojeno zdravljenje in neinvazivno zgodnjo diagnostiko bolezni. Ceprav poletje prinaša bolj sprošcene pocitniške dni, je prav, da ne pozabimo na preventivne ukrepe, ki so tudi kljuc do bolj normalne jeseni. Nošenje zašci­tnih mask je tako še vedno aktualno, s tem pa tudi prispevek o testiranju ucinkovitosti filtrov in razvoju obraznih mask za zašcito pred virusi. Da no-vosti na tehnoloških podrocjih ni malo, potrjujejo najnovejši dosežki na po­drocju cepiv na osnovi informacijske RNA proti koronavirusu SARS-CoV-2. V zadnjem prispevku vas tako caka zanimivo branje o mehanizmih delova­nja, nacinu proizvodnje in dosedanjih klinicnih izkušnjah s profilakticnimi ce­pivi na osnovi te platforme. Morda pridobljeno znanje še koga spodbudi, da cepivo cim prej preskusi tudi v praksi. Upava, da vam bo poletna številka Farmacevtskega vestnika prinesla obilo zanimivih pa tudi uporabnih informacij, ki naj vam popestrijo pocitniške dni. Izr. prof. dr. Alenka Zvonar Pobirk, mag. farm., gostujoca urednica Prof. dr. Borut Štrukelj, mag. farm., odgovorni urednik 147 159 167 173 180 190 199 211 Mirjam Gosenca Matjaž, Alenka Zvonar Pobirk Mikrobiološka zašcita farmacevtskih izdelkov Antimicrobial preservation of pharmaceuticals Maja Bjeloševic, Pegi Ahlin Grabnar Pomen procesa liofilizacije v farmaciji Importance of lyophilisation in pharmacy Katja Schoss, Nina Kocevar Glavac Ekstrakcija s subkriticno vodo za pridobivanje rastlinskih ekstraktov Subcritical water extraction for the production of plant extracts Sara Brunec, Mirjana Gašperlin Tehnološke možnosti za dostavo zdravilnih ucinkovin v debelo crevo s peroralnimi farmacevtskimi oblikami Approaches to oral colon-specific drug delivery Anže Zidar, Julijana Kristl, Alenka Zvonar Pobirk Nanovlakna za dostavo ucinkovin in tkivno inženirstvo Nanofibers for drug delivery and tissue engineering Crt Dragar, Mirjana Gašperlin, Petra Kocbek Nanoteranostiki in njihov potencial v personalizirani medicini Nanotheranostics and their potential in personalised medicine Maruša Gostiša, Jurij Gostiša, Mirjam Gosenca Matjaž, Julijana Kristl Filtriranje zraka in razvoj obraznih mask iz nanovlaken za zašcito pred virusi Air filtration and the development of nanofiber face masks for protection against viruses Ana Vencelj, Tomaž Bratkovic Profilakticna cepiva na osnovi informacijske RNA proti nalezljivim boleznim Prophylactic messenger RNA-based vaccines against infectious diseases MIKROBIOLOšKA ZAšCITA FARMACEVTSKIh IZDELKOV ANTIMICROBIAL PRESERVATION OF PhARMACEUTICALS AVTORICI / AUThORS: doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž, mag. farm. izr. prof. dr. Alenka Zvonar Pobirk, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E mail: alenka.zvonar pobirk@ffa.uni lj.si PREGLEDNI ZNANSTVENI CLANKI 1 UVOD Mikrobiološka kakovost je bistveni del celokupne kakovosti vsakega farmacevtskega izdelka. Vanje jo »vgradimo« z upoštevanjem dobre proizvodne prakse (DPP) ter smernic, ki zagotavljajo ustrezno kakovost izdelkov tekom celotnega cikla zdravila, od izdelave do njegove uporabe. Predmet tega prispevka so nesterilne in sterilne farmacevtske oblike z vidika specificnih zahtev glede mikrobiološke kakovosti in uporabe konzervansov. Kriteriji sprejemljivosti za neste­rilne farmacevtske oblike se razlikujejo glede na nacin aplikacije zdravila in so podani v Evropski farmakopeji (Eur. Ph.) v poglavjih »Mikrobiološka kakovost nesterilnih farma­ POVZETEK Mikrobiološka kakovost farmacevtskih izdelkov je eden izmed kljucnih aspektov zagotavljanja kako­vostnih, varnih in ucinkovitih zdravil. Zaradi strogih standardov zagotavljanja kakovosti v farmacevtski industriji jo lahko dojemamo kot samoumevno. Pa vendar, kot smo izkusili v letu pandemije, ni nic samoumevno. V prispevku predstavljamo razlicne pristope mikrobiološke zašcite farmacevtskih iz­delkov z glavnim poudarkom na konzervansih, ki šcitijo izdelek pred sekundarno mikrobiološko kon­taminacijo med shranjevanjem, distribucijo in upo­rabo izdelka. Na primeru konzervansov, katerih varnostno vprašanje je bilo izpostavljeno v zadnjih letih in je v primeru benzilalkohola, benzalkonije­vega klorida in benzojske kisline oz. benzoatov tudi vodilo v nedavno revizijo oznacevanja zdravil s strani Evropske agencije za zdravila, želimo skozi prispevek izpostaviti tudi potrebo po nenehnem skrbnem spremljanju in oceni varnostnega tvega­nja, zlasti za najranljivejšo pediatricno skupino bol­nikov. KLJUCNE BESEDE: benzalkonijev klorid, benzilalkohol, konzervansi, mi-krobiološka kakovost, parabeni ABSTRACT The microbiological quality of pharmaceutical prod­ucts is one of the key aspects of ensuring quality, safety and effectiveness of medicines. Due to strict quality assurance standards in the pharmaceutical industry, it can be considered as self-evident. Yet, as we experienced in the year of the pandemic, nothing really is. This review presents various ap­proaches to microbiological protection of pharma­ceutical products with the main emphasis on preservatives posing protection from secondary microbiological contamination of products during their storage, distribution and usage. Finally, case studies of preservatives which safety concerns have been raised up in recent years, are presented. In the case of benzyl alcohol, benzalkonium chlo­ride and benzoic acid/benzoates, it resulted in a recent revision of medicine labelling by the Euro­pean Medicines Agency, which highlights the need for continuous careful monitoring and safety risk cevtskih izdelkov in substanc za farmacevtsko uporabo« (5.1.4.) ter »Mikrobiološka kakovost zdravil rastlinskega iz­vora za peroralno uporabo in ekstraktov za njihovo izde­lavo« (5.1.8.). Temeljijo na skupnem številu aerobnih mi-kroorganizmov in skupnem številu kvasovk in plesni ter odsotnosti specificnih patogenov. Sterilne farmacevtske oblike (vkljucujoc parenteralne farmacevtske oblike, far-macevtske oblikeza oko in dermalne farmacevtske oblike za uporabo na hudo poškodovani koži) pa izdelujemo iz assessment of preservatives and other excipients, especially for the most vulnerable paediatric group of patients. KEY WORDS: benzalkonium chloride, benzyl alcohol, microbio­logical quality, parabens, preservatives MIKROBIOLOšKA ZAšCITA FARMACEVTSKIh IZDELKOV snovi in po postopkih, ki zagotavljajo sterilnost in prepre-cujejo vnos in rast kontaminantov v skladu z zahtevami v poglavju »Metode priprave sterilnih izdelkov« (5.1.1.) (1). Do mikrobiološke kontaminacije izdelka lahko pride bodisi v fazi izbora sestavin, izdelave in polnjenja izdelka v pri­marno ovojnino (primarna kontaminacija) ali v casu shra­njevanja, transporta in uporabe (sekundarna kontami­nacija) (slika 1). Ker je primarna kontaminacija izdelka posledica uporabe surovin neustrezne mikrobiološke ka­kovosti ali neustrezne proizvodne prakse, je kljucno do-sledno upoštevanje kriterijev sprejemljivosti za mikrobiolo­ško kakovost substanc za farmacevtsko uporabo ter proizvodnja v skladu z zahtevami dobre proizvodne prakse. Do sekundarne kontaminacije pa pride zaradi kontaminacije in/ali razrašcanja mikroorganizmov med shranjevanjem in distribucijo izdelka (npr. zaradi neustreznega konzerviranja/ovojnine) ali v casu uporabe. Poznamo razli-cne strategije zašcite izdelkov pred sekundarno kontami­ Slika 1: Vzroki in posledice kontaminacije izdelkov z mikroorganizmi (MO) ter možni ukrepi za zagotavljanje ustrezne mikrobiološke (MB) kakovosti; prirejeno po (2). Figure 1: Causes, consequences and ways of preventing microbial contamination; adapted from (2). nacijo. Medtem ko pri fizikalnem pristopu omejimo mi-krobiološko kontaminacijo v izdelku z izbiro ustrezne ovoj-nine (npr. zrakotesno zaprti vsebniki z aplikatorjem), pri fi­zikalno-kemijskem pristopu zagotovimo vzpostavitev pogojev, ki so neugodni za preživetje mikroorganizmov. Kemijski pristop pa vkljucuje uporabo konzervansov kot pomožnih snovi, ki preprecujejo rast mikroorganizmov pri normalnih pogojih shranjevanja in uporabe (2, 3). 2 FIZIKALNO-KEMIJSKI PRISTOP MIKROBIOLOŠKE ZAŠCITE Poleg razpoložljivih hranil sta za rast mikroorganizmov nujni tudi ustrezna temperatura in vsebnost vlage. Fizikalno-ke­mijski pristop v veliki meri temelji na znižanju aktivnosti vode v izdelku. Z aktivnostjo vode (aw) opišemo vsebnost t. i. proste (bulk) vode in se razlikuje od celokupne vsebnosti vode, ki poleg proste vkljucuje tudi vezano vodo. Ker je mikroorganizmom razpoložljiva le prosta voda, poznavanje aw nesterilnih formulacij poda pomembno informacijo o dovzetnosti izdelka za sekundarno mikrobiološko konta­minacijo. aw opisuje enacba: aw = P/P0 = n1/(n1 + n2), pri cemer so P delni tlak vodne pare nad izbranim izdelkom in P0 delni tlak vodne pare nad cisto vodo pri enaki tem­peraturi, n1 moli topila (vode) in n2 moli topljenca. Znano je, da razlicni mikroorganizmi za svojo rast potre­bujejo razlicne kolicine proste vode. Na osnovi poznavanja aw izdelka in potrebne minimalne a w za rast posameznih mikroorganizmov (preglednica 1) lahko bolje nacrtujemo ustrezno mikrobiološko zašcito izdelka tako s pristopi za znižanje aw kot tudi z izbiro konzervansa, ki je prilagojena najverjetnejšim kontaminantom izdelka. V formulaciji lahko znižamo a w z vkljucitvijo pomožnih snovi, ki vežejo vodo (npr. hidrofilni polimeri, sotopila in soli) ali povecajo osmo­larnost izdelka (npr. sladkorji). Tako pri sirupih visoka vse­bnost sladkorjev bistveno zmanjša aw in s tem tudi potre­bno koncentracijo konzervansa, ki mora izdelek zašcititi predvsem pred osmotolerantnimi kvasovkami. Dolocene farmacevtske oblike, kot so praški, tablete, svecke in ma-zila, pa že v osnovi izkazujejo zelo nizko a w (tj. < 0,6) (4, 5). Na rast mikroorganizmov v formulaciji vpliva tudi tip emul­zije. Zaradi prisotnosti vode v notranji fazi so emulzije tipa V/O manj dovzetne za kontaminacijo kot emulzije tipa O/V. K boljši mikrobiološki stabilnosti pripomore tudi velikost kapljic, zato so nanoemulzije v prednosti pred klasicnimi emulzijami. Na zašcito izdelka lahko ugodno vpliva tudi sestava oljne faze (npr. z vecjo vsebnostjo fenolnih spojih). Tako tekoce emulzije kot tudi poltrdne emulzijske gele (tj. kreme) obeh tipov dodatno zašcitimo s konzervansi; izjema so sterilne formulacije, napolnjene v zrakotesnih vsebnikih (pogosto z zaporko z aplikatorjem) (2, 3). Na mikrobiološko odpornost pomembno vpliva tudi ph for-mulacije. Ker je optimalna vrednost ph za proliferacijo glav-nine mikroorganizmov med 5 in 8, predstavljajo izdelki z višjim ali nižjim ph manj ugodno okolje za njihovo rast in ra­zmnoževanje. To še zlasti velja za formulacije s ph pod 3 ali nad 9; pri ph pod 3 lahko rastejo le nekatere odporne plesni. ph vrednost izdelka pa pomembno vpliva tudi na izbiro ustreznega konzervansa, tako z vidika njegove ucinkovitosti kot tudi stabilnosti, kot predstavljamo v nadaljevanju (6, 7). Preglednica 1: Aktivnosti vode (aw), pri kateri so doloceni mikroorganizmi sposobni preživetja; povzeto po (3). Table 1: Proliferation ability of microorganisms in correlation to water activity (aw); adapted from (3). G+ – po Gramu pozitivne bakterije, G-– po Gramu negativne bakterije 0,96–0,99 G+ in G-bakterije (npr. Pseudomonas species), kvasovke in plesni 0,80–0,89 G+ bakterije (npr. Staphylococcus aureus), kvasovke in plesni 0,62–0,69 Osmotolerantne kvasovke (npr. Zygosaccharomyces rouxii) 3 KEMIJSKI PRISTOP MIKROBIOLOŠKE ZAŠCITE Konzervansi so pomožne snovi, ki v izdelku preprecijo rast mikroorganizmov v casu roka njihove uporabe, tudi po od­prtju. Njihova uporaba je nujna v vecodmernih tekocih in poltrdnih izdelkih. Ceprav mikroorganizmi za svoje razmno­ževanje potrebujejo vodo, je potrebno ustrezno zašciti tudi lipidne in trdne formulacije, saj se lahko v slednjih tvorijo po­drocja s prosto vodo, ki omogocajo njihovo rast in razmno­ževanje (npr. mikrobiološko kvarjenje mazil in razlicnih stikov). Vsi konzervansi in njihove koncentracije, dovoljene za upo­rabo v farmaciji, so navedeni v Handbook of Pharmaceutical Excipients in Eur. Ph. Dodatek konzervansov nikoli ne sme nadomestiti postopkov dobre proizvodne prakse, niti jih ne smemo dodajati z namenom, da bi preprecili razrašcanje mikroorganizmov v že kontaminiranih surovinah ali izdelkih. Glede na mehanizem delovanja (preglednica 2) locimo konzervanse, ki poškodujejo celicno steno in/ali membrano, s cimer vplivajo na permeabilnost in aktivnost (trans)mem­branskih encimov in ovirajo transport vode in hranilnih snovi. Tretja tarca je citoplazma mikroorganizmov, kjer ne­kateri konzervansi povzrocijo denaturacijo proteinov in en-cimov ali strukturne spremembe pomembnih komponent celic, zavirajo celicni metabolizem ali poškodujejo DNK oz. RNK. Pogosto je težko predvideti tocno mesto delovanja konzervansov, saj je slednje odvisno tudi od uporabljene koncentracije (6, 8). Pri izbiri primernega konzervansa moramo upoštevati tako vrsto farmacevtske oblike kot nacin aplikacije zdravila (pre­glednica 3) in starost bolnika. Ker idealen konzervans ne obstaja, v praksi izbiramo takšne, ki imajo cim vec nasled­njih lastnosti: 1) delovanje pri cim nižji koncentraciji (pri kateri mora biti tudi netoksicen in nealergen), 2) definirano kemijsko zgradbo, 3) širok spekter delovanja, 4) ucinkovi­tost v širokem ph obmocju, 5) ustrezno stabilnost (tudi pri povišani temperaturi, na svetlobi, pri razlicnih vrednostih ph, ki jim je lahko izpostavljen med izdelavo, shranjevanjem in uporabo izdelka), 6) primerno vodotopnost in porazde­litveni koeficient, ki omogoca, da ostane prednostno po­razdeljen v vodni fazi, 7) kompatibilnost z drugimi sestavi­nami izdelka in ovojnino, 8) v primeru (per)oralne in nazalne aplikacije pa so pomembne tudi ustrezne organolepticne lastnosti (okus, vonj) (7, 9). Vecina konzervansov le delno ustreza navedenim kriterijem, zato pogosto uporabljamo kombinacije konzervansov oz. konzervansov in drugih sestavin s sinergisticnim delovanjem, kar nam omogoca uporabo nižje koncentracije posameznega konzervansa. Ucinek slednjih podpirajo npr. kelatorji kovinskih ionov, nekatera topila, higroskopne spojine, zdravilne ucin­kovine in etericna olja. V praksi pogosto kombiniramo metil-in propilparaben, saj je protimikrobna aktivnost parabenov obratno sorazmerna z vodotopnostjo in narašca z daljšanjem alkilne verige (butil > propil > etil > metil). Veliko se uporablja tudi kombinacija parabenov in EDTA (7, 10, 11). Pri izbiri konzervansa moramo upoštevati tudi morebitne inkompatibilnosti s sestavinami formulacije (npr. površinsko aktivnimi snovmi) in izbrano ovojnino (možnost adsorpcije konzervansa na nekatere umetne mase in gumijaste za­porke) (preglednica 3). Dodaten izziv predstavlja konzervi­ranje vecfaznih sistemov zaradi porazdeljevanja kon­zervansa med oljno in vodno fazo v skladu z njegovim porazdelitvenim koeficientom (v primeru emulzijskih siste­mov) oz. možnosti adsorpcije konzervansa na trdne Preglednica 2: Mesto delovanja izbranih konzervansov v mikrobni celici; povzeto po (8). Table 2: Site of selected preservatives' activity in microbial cell; adapted from (8). Fenoli 2-fenoksietanol 2-fenoksietanol in drugi organski alkoholi Organske živosrebrove spojine organske živosrebrove spojine halogenirani konzervansi Klorheksidin, cetrimid klorheksidin, heksaklorofen klorheksidin (visoke koncentracije) Anionske površinsko aktivne snovi benzalkonijev klorid / delce (v primeru suspenzij) ali polimere, ki se uporabljajo kot zgošcevala. Na porazdeljevanje v oljno fazo moramo biti pozorni npr. pri bolj lipofilnih analogih parabenov (pro­pil-in butilparaben), medtem ko je za klorheksidin znacilno porazdeljevanje v micele in adsorpcija na polimerna su­spendirajoca sredstva. Oboje vodi v znižanje koncentracije konzervansa v vodni fazi, zato je potrebno ustrezno pove-cati njegovo koncentracijo v formulaciji (slika 2) (7, 9). Od ph formulacije ni odvisna le rast mikroorganizmov, am-pak tudi interakcije konzervansov s komponentami njihove celicne stene in s tem minimalna inhibitorna koncentracija konzervansa. Ucinkovitost slednjih je najboljša, ko je ph formulacije znotraj ph obmocja njihove optimalne aktivnosti (preglednica 3). Od ph odvisna aktivnost je povezana s kemijsko strukturo konzervansov. Kadar so slednji aktivni v neionizirani obliki (npr. kisline, alkoholi ali fenoli), je njihova ucinkovitost najboljša, ko je ph(formulaci je) = pKa(konzervansa). Vpliv ph na aktivnost konzervansov je sicer kompleksen, saj je protibakterijsko delovanje benzojske pa tudi propion­ske in sorbinske kisline veliko bolj odvisno od ph kot njihova aktivnost proti glivam, ki je ohranjena tudi pri višjih vredno­stih ph (2, 6, 7). 3.1 VREDNOTENJE UCINKOVITOSTI KONZERVANSOV Za vse konzervirane farmacevtske izdelke moramo dokazati upravicenost uporabe in ucinkovitost izbranih konzervansov s farmakopejskim preskusom »Ucinkovitost konzervansov« (5.1.3), s katerim vrednotimo celokupno protimikrobno za-šcito izdelka (1). K slednji skupno prispevajo znacilnosti formulacije, vgrajeni konzervansi in primarna ovojnina. Os-novni princip testa je masovna in namerna inokulacija iz­delka (najbolje v originalnem vsebniku) s standardnimi mi-kroorganizmi ter spremljanje njihovega števila skozi predpisano casovno obdobje. Protimikrobna zašcita je ustrezna, v kolikor pride po inokulaciji do znacilnega (in trajnega) zmanjšanja števila mikroorganizmov. Eur. Ph. definira inokulacijo testiranih izdelkov s Pseudo-monas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albi-cans ter Aspergillus brasiliensis do koncnega inokuluma 105 (v primeru gliv) oz. 106 (v primeru bakterij) kolonizirajocih enot (CFU) na ml oz. g izdelka. Dodatno lahko uporabimo tudi verjetne kontaminante kot Escherichia coli za peroralne formuacije ter Zygosaccharomyces rouxii za peroralne far-macevtske oblike z visoko koncentracijo sladkorja (sirupe). Kolicina dodane suspenzije mikroorganizmov pri tem ne sme presegati 1 % volumna izdelka, s cimer se izognemo redcenju izdelka oz. konzervansa. Inokulirano formulacijo shranjujemo zašciteno pred svetlobo pri 20 do 25 °C in glede na vrsto izdelka spremljamo število mikroorganizmov v casovnem intervalu 0 do 28 dni. Kot rezultat podamo lo-garitem zmanjšanja koncentracije mikroorganizmov (CFU/ml) glede na zacetni inokulum, ki mora glede na zah­tevano stopnjo mikrobiološke zašcite farmacevtskih izdel­kov ustrezati kriteriju A ali B. Kriterij A izraža priporocljivo Slika 2: Koncentracija molekule konzervansa v vodni fazi formulacije je odvisna od stopnje ionizacije molekule, porazdeljevanja v oljno fazo ali micele površinsko aktivnih snovi, možna je tudi adsorpcija na suspendirane delce ter adsorpcija/permeacija v plasticne zaporke. Prirejeno po (12). Figure 2: The concentration of active form of preservative molecules in an aqueous phase of formulations depends on the state of ionisation of the molecule, partitioning into oil droplets or surfactant micelles, as well as adsorption onto suspended solids or adsorption/permeation of plastic closures. Adapted from (12). Preglednica 3: Skupine pogosto uporabljanih konzervansov za razlicne nacine aplikacije s pH-obmocji, pri katerih so optimalno aktivni, ter nekaterimi substrati oz. adsorbenti, ki jih lahko deaktivirajo. Povzeto po (6–8). Table 3: Common preservatives for pharmaceutical products: pH of optimum activity plus some adsorbents/substrates playing a part in their inactivation. Adapted from (6–8). Metil-, etil-, propilparaben (in kombinacije) estri aromatskih karboksilnih kislin 4–8 nekatere plastike, ionsko izmenjevalne smole, želatina Na-benzoat in benzojska kislina aromatska karboksilna kislina = 4,5 kaolin (Per)oralno Sorbinska kislina, K-sorbat propionska kislina alifatske karboksilne kisline 4,5 3,9 polipropilen (PP), PVC, polietilen (PE) Metilparaben + Na-benzoat (kombinacija) - Benzilalkohol, 2-etoksietanol, klorobutanol aromatski in alifatski alkoholi =5 PE, gumaPE Metil-, etil-, propil-, butilparaben (in kombinacije) estri aromatskih karboksilnih kislin 4–8 nekatere plastike, ionsko izmenjevalne smole, želatina Parenteralno (vkljucno s cepivi) Benzojska kislina, sorbinska kislina aromatske in alifatske karboksilne kisline = 4,5 4,5 kaolin PP, PVC, PE Klorheksidin bigvanidi 5–7 Na-karbosimetil celuloza Fenol, m-krezol, 2-fenoksietanol fenoli 4–9 3–10 PVC, celulozni derivati Tiomersal, fenil živosrebrove soli organske živosrebrove spojine kisel ph 5–8 PE/druge plastike, gumarazlicna suspendirajoca sredstva ucinkovitost, ki jo je potrebno doseci. V utemeljenih pri­merih, kjer kriterija A ne moremo doseci (na primer zaradi vecje možnost neželenih reakcij), pa mora biti izpolnjen kriterij B (1). 4 PRIMERI UPORABE IN OZNACEVANJE DOLOCENIH KONZERVANSOV V ZDRAVILIH V l. 2017 je EMA revidirala navodila za oznacevanje zdravil v povezavi z nekaterimi pogosto uporabljanimi pomožnimi snovmi, s posebnim poudarkom na njihovem varnostnem profilu, zlasti za pediatricno populacijo (13). Podrobneje je proucila tudi konzervanse, in sicer benzilalkohol, benzal­konijev klorid in benzojsko kislino oz. benzoate, ki so ob tiomersalu in parabenih (slika 3) tudi sicer pod drobnogle­dom zaradi potencialnih škodljivih ucinkov na zdravje. 4.1 BENZILALKOhOL IN TIOMERSAL V VECODMERNIh PARENTERALNIh FARMACEVTSKIh OBLIKAh Poseben izziv za konzerviranje predstavljajo vecodmerne vodne parenteralne farmacevtske oblike, ki morajo zaradi možnosti kontaminacije med veckratnim odvzemom nujno Slika 3: Kemijske strukture izbranih konzervansov. Figure 3: Chemical strukture of selected preservatives. vsebovati konzervans (razen ce sama farmacevtska oblika izkazuje ustrezne protimikrobne lastnosti). Parenteralne far-macevtske oblike s klasicnimi zdravilnimi ucinkovinami, t. i. majhnimi molekulami, so najpogosteje konzervirane z benzilkoholom ali kombinacijo metil-in propilparabena (raz­merje 9 : 1 do skupno 0,2 %), pogosto se uporabljajo tudi fenol, klorbutanol, m-krezol, fenoksietanol ter tiomersal, vecinoma v zelo nizkih koncentracijah od 0,002 do 1 % (14–16). Konzerviranje parenteralnih farmacevtskih oblik s proteinskimi ucinkovinami, vkljucujoc monoklonska proti­telesa, pa je zlasti zahtevno zaradi možnih interakcij s kon­zervansom, ki lahko vodijo v fizikalno nestabilnost ali oksi­dacijo proteinske molekule. To je problematicno tako z vidika ucinkovitosti kot dolgorocne (ne)stabilnosti. Zaradi specificnih lastnosti so ti pripravki v obliki liofilizatov, kjer je v primeru vecodmernih farmacevtskih oblik konzervans (najpogosteje m-krezol, fenol, benzilalkohol ali benzalkonijev klorid) dodan v medij za rekonstitucijo (17). Benzilalkohol v parenteralnih farmacevtskih oblikah kla-sicno uporabljamo v koncentraciji 0,5 do 2 %, v parente­ralnih proteinskih pripravkih pa od 0,9 do 1,1 % (14). Deluje tudi kot lokalni anestetik, zaradi cesar je intramuskularna aplikacija manj boleca. Dodajamo ga tudi v peroralne far-macevtske oblike (do 2 %) in kozmeticne izdelke (do 1 %). Ucinkovit je proti vecini po Gramu pozitivnih bakterij, kva­sovk in plesni, manj pa proti po Gramu negativnim bakte­rijam. Izrazito problematicen je za nedonošencke in novo­rojencke po intravenski aplikaciji. Zaradi še nerazvitega encimskega sistema pride do akumulacije benzilalkohola in njegovega metabolita benzojske kisline, ki ob socasni metabolni acidozi vodi v življenje ogrožajoce stanje z zna-cilnim »sindromom lovljenja sape« (gasping syndrome), hu­dimi nevrološkimi in hematološkimi motnjami ter odpovedjo srca (18). Upoštevaje nove smernice EMA za oznacevanje morajo zato navodila za uporabo tako za zdravila za pa-renteralno pa tudi peroralno dostavo vsebovati opozorilo, da je/se benzilalkohol 1) povezan z nevarnostjo pojava resnih neželenih ucinkov, vkljucujoc »sindrom lovljenja sape«, pri mlajših otrocih; 2) ne uporablja pri novorojenckih do cetrtega tedna starosti, razen po navodilu zdravnika; 3) ne uporablja vec kot en teden pri otrocih do tretjega leta starosti, razen po navodilu zdravnika ali farmacevta ter 4) morajo nosecnice in dojece matere ter bolniki z boleznimi ledvic ali jeter posvetovati z zdravnikom ali farmacevtom o uporabi zaradi možnosti akumulacije v telesu in nastanka metabolne acidoze (19). Tiomersal v cepivih je še vedno aktualna tema, tako kot varnost cepiv v celoti, ki še zlasti v luci trenutne epidemio­loške situacije zaradi covid-19 le pridobiva na razsežnosti. Tiomersal je tako še vedno tema razlicnih polemik, ceprav njegove morebitne vpletenosti v povecano pojavnost avt­izma in ostalih razvojnih motenj niso dokazali v nobeni iz-med raziskav, izvedenih s tiomersalom v koncentracijah, ki se uporabljajo v cepivih (20, 21). Metil živo srebro (metil hg), s katerim najpogosteje pridemo v stik z morsko hrano (npr. tunino), je dejansko nevrotoksicna oblika organskega hg, zlasti za nerojene in majhne otroke. Svetovna zdrav­stvena organizacija je zato dolocila zgornjo varno vrednost za dnevno izpostavitev metil hg, ki je za majhne otroke, nosecnice, dojece matere in ženske v rodni dobi še bi-stveno nižja v primerjavi s povprecnim odraslim; v obeh primerih pa so upoštevani veliki varnostni faktorji. Navedene vrednosti se upoštevajo tudi za tiomersal, ki je skupaj s svojim metabolitom etil hg sicer veliko manj toksicen kot metil hg. Za razliko od slednjega, ki se nalaga v telesu, je za etil hg znacilna zelo hitra eliminacija. Kljub temu so iz previdnostnih razlogov na zacetku 21. stoletja v ZDA umak­nili tiomersal iz vecine cepiv, cemur je sledila tudi Evropa. Po trenutno dostopnih podatkih v Sloveniji dostopna cepiva ne vsebujejo tiomersala (22). 4.2 BENZALKONIJEV KLORID V PRIPRAVKIh ZA OKO Za konzerviranje pripravkov za oko priporocajo razlicne konzervanse (preglednica 3). Po razširjenosti mocno iz­stopa benzalkonijev klorid, ki se uporablja že od l. 1950 in je zaradi visoke ucinkovitosti, ustreznega varnostnega profila in nizke alergenosti prisoten v treh cetrtinah izdelkov. V vlogi konzervansa ga pogosto najdemo tudi v vodnih pripravkih za inhaliranje ali aplikacijo v nos, redko pa v far-macevtskih oblikah za druge poti vnosa (23). Kot konzer-vans se uporablja v koncentracijah 0,004 do 0,025 %. De-luje fungicidno ter baktericidno predvsem na po Gramu pozitivne bakterije, medtem ko se aktivnost proti po Gramu negativnim bakterijam ojaca v kombinaciji z EDTA (0,1 %). Zaradi dolge zgodovine uporabe so dobro raziskani tudi neželeni ucinki po nanosu benzalkonijevega klorida, pred­vsem v povezavi s kapljicami za zdravljenje glavkoma in uporabo umetnih solz za blaženje sindroma suhega ocesa, kjer kronicna in progresivna narava obeh bolezni zahteva vecletno uporabo pripravkov za oko. V obširnih klinicnih raziskavah so potrdili koncentracijsko in casovno odvisne neželene ucinke benzalkonijevega klorida na površino ocesa, ki se odražajo v paleti klinicnih znakov, od obcutka povecanega nelagodja, suhega ocesa, ostrega, bolecega ali srbecega obcutka in zmanjšane tvorbe ter obstojnosti solznega filma do vnetnih sprememb. Ker lahko slednji zelo poslabšajo sodelovanje bolnikov, so zaželene formu­lacije s podaljšanim delovanjem, ki mocno zmanjšajo iz­postavljenost ocesa benzalkonijevemu kloridu in omilijo navedene sopojave. Nasprotno pa njegova uporaba ni problematicna pri kratkotrajni uporabi, kot je v primeru zdravljenja vnetij ali infekcij (24–26). Težave, ki lahko spremljajo dolgotrajno uporabo benzal­konijevega klorida v pripravkih za oko, so obšli z enood­mernimi farmacevtskimi oblikami za oko. Slednje imajo iz­boljšan varnostni profil, a so tudi neprimerljivo dražje (za faktor 5–10) in v primerjavi z vecodmernimi konzerviranimi farmacevtskimi oblikami tudi bolj obremenjujejo okolje. Vse­bnik vsebuje 0,1 do 1 ml tekocine in naj bi ga po aplikaciji ene do dveh kapljic v posamezno oko ali obe ocesi zavrgli skupaj z zaostalo tekocino. V praksi jih ljudje zelo pogosto uporabljajo, dokler ne zmanjka vsebine, kar predstavlja vi-soko mikrobiološko tveganje. Omeniti velja tudi oteženo rokovanje z enoodernimi vsebniki pri starejših ali ljudeh z zmanjšano fino motoriko (npr. nerodno odpiranje pokrovcka ter težavno stiskanje vsebnika zaradi trše plastike). Alter-nativo slednjim predstavljajo inovativni vecodmerni vsebniki, ki med uporabo zagotavljajo sterilnost vsebine s pomocjo tehnoloških rešitev, ki vkljucujejo bifunkcionalno membrano s protimikrobnimi lastnostmi, globinski filter ali posebni enosmerni ventil, ki preprecuje vstop mikroorganizmov v notranjost vsebnika po odprtju (26). Zanimivo inovacijo na­menjeno konzerviranim kapljicam pa predstavljajo vsebniki s filtri, na katere se konzervans med aplikacijo adsorbira in tako ne pride v stik z ocesno sluznico (24). V vecodmernih kapljicah za oko uporabljamo tudi alterna­tivne konzervanse, vendar je nabor relativno majhen zaradi zahtevanih visoke protimikrobne ucinkovitosti in netoksi-cnosti (26). Glede na mehanizem delovanja v osnovi locimo dve skupini: a) Oksidirajoci konzervansi, ki oksidirajo posamezne komponente mikroorganizmov in vplivajo na sintezo nji­hovih proteinov. Po aplikaciji se pod vplivom svetlobe ali v stiku s solzno tekocino razgradijo ne neškodljive produkte. V uporabi so natrijev perborat (GenAqua®, Dequest®), stabiliziran oksiklorokompleks (Purite®, Ocu-Pure®) ter Sofzia®, ki je pufrna raztopina cinkovega klo­rida, borata, propilen glikola in sorbitola. Natrijev perborat je eden izmed prvih oksidirajocih konzervansov in v skladu z idejo »disappearing« konzervansov ob stiku z vodo tvori vodikov peroksid, ki ga v ocesni sluznici pri­sotne katalaze razgradijo na kisik in vodo. Stabiliziran oksiklorokompleks v raztopini tvori radikale klorovega dioksida, po aplikaciji na oko pa se pod vplivom svetlobe razgradi v natrijev klorid, kisik in vodo. Sicer maloštevilne raziskave potrjujejo znacilno manj izražene neželene ucinke na ocesno površino v primerjavi z benzalkonijevim kloridom (26). b) Polikvarternij-I (polyquaternium-I, Polyquad®) kot kon­zervans v tekocinah za lece uporabljamo že vec kot 30 let in številne raziskave potrjujejo njegovo ucinkovitost ter biokompatibilnost. Ceprav je kvarterna amonijeva spojina, ima v primerjavi z benzalkonijevim kloridom zna-cilno manj izražene neželene ucinke na ocesni površini. Polikation polikvarternij-I je namrec polimer in kot tak bistveno vecja molekula z manjšo sposobnostjo pene­tracije v tkiva (26, 27). Zadnje izdano mnenje EMA z leta 2009 glede uporabe konzervansov v pripravkih za oko sicer ne podaja sploš­nega priporocila o odsotnosti konzervansov, poudarja pa smotrnost uporabe pripravkov brez konzervansov v primeru dolgotrajne terapije ali za ljudi, ki so nanje obcutljivi. Ne-konzervirane farmacevtske oblike za oko EMA mocno pri­poroca za uporabo pri otrocih, zlasti novorojenckih. Kon­zervansi se morajo uporabljati v najnižji ucinkoviti koncentraciji glede na rezultat preskusa »Ucinkovitost kon­zervansov«, izogibati pa se je potrebno hg spojinam (npr. tiomersalu), tudi z vidika zmanjševanja izpostavljenosti oko­lja hg (28). Upoštevaje aktualne smernice EMA je potrebno v primeru zdravil za oci, ki vsebujejo benzalkonijev klorid, oznaciti, da 1) se le-ta lahko absorbira v mehke lece in jih obarva; 2) je potrebno pred aplikacijo zdravila lece odstraniti in jih ponovno vstaviti po 15 minutah; 3) benzalkonijev klorid lahko povzroci draženje oci, zlasti v primeru sindroma suhega ocesa ali težav z roženico. V primeru izrazitega neugodja, zbadanja ali bolecine po uporabi zdravila se je potrebno posvetovati z zdravnikom (29). 4.3 BENZOJSKA KISLINA IN BENZOATI V PERORALNIh, PARENTERALNIh IN DERMALNIh FARMACEVTSKIh OBLIKAh Za konzerviranje navedenih farmacevtskih oblik se ben­zojska kislina in predvsem njene K-ali Na-soli (benzoati) uporabljajo v koncentraciji 0,01 do 0,2 %. Glavno varnostno vprašanje se nanaša na njeno sposobnost sprošcanja bi-lirubina z albumina, varnostno tveganje pa je veliko zlasti za novorojencke, kar je tudi vodilo v revizijo navodil. Fizio­loška zlatenica je pogost pojav pri novorojenckih, prevelike koncentracije nevezanega oz. prostega bilirubina v serumu pa delujejo nevrotoksicno in lahko povzrocijo okvaro osred­njega živcevja (kernikterus). Tveganje je povezano tako s peroralno, parenteralno kot tudi dermalno aplikacijo (obseg dermalne absorpcije benzojske kisline je pri novorojenckih zelo velik) ter tudi s socasno aplikacijo benzilalkohola, ki se metabolizira do benzojske kisline. Na navodilih za upo­rabo zdravil za opisane poti aplikacije je zato potrebno oznaciti, da lahko benzojska kislina povzroci zlatenico (pre-poznavno po rumenem obarvanju kože in oci) pri dojenckih do cetrtega tedna starosti. V primeru dermatikov je zahte­vana še navedba dodatnega opozorila o možnosti lokal­nega draženja (30). 4.4 PARABENI V PERORALNIh IN DERMALNIh FARMACEVTSKIh OBLIKAh Parabeni so estri parahidroksibenzojske kisline in njihove natrijeve soli in so zadnjih 80 let eni najpogosteje upora­bljanih konzervansov v hrani, kozmeticnih in farmacevtskih izdelkih, ki jih ucinkovito zašcitijo proti kvasovkam in ples­nim, manj pa proti po Gramu negativnim bakterijam. Med-tem ko se po peroralni aplikaciji zelo hitro absorbirajo in metabolizirajo v jetrih ter izlocijo z urinom, se po dermalnem nanosu absorbirajo le v manjšem obsegu (za izracun meje varnosti se upošteva 3,7-odstotna dermalna absorpcija). Ker hidroliza do parahidroksibenzojske kisline v koži ni po­polna, jih zaradi možnega estrogenega delovanja ne mo-remo obravnavati kot popolnoma varne spojine. V EU tako sistematicno zbiramo in proucujemo podatke o njihovi var-nosti, s cimer je povezano tudi redno posodabljanje pred­pisov, ki urejajo njihovo uporabo v razlicnih izdelkih, ki smo jim pogosto socasno izpostavljeni. Z namenom doseganja sinergisticnega ucinka in s tem cim nižje vsebnosti kon­zervansov v izdelkih pogosto uporabljamo kombinacijo metil-in propilparabena. V farmaciji je najbolj razširjena v peroralnih farmacevtskih oblikah, kjer je njuna vsebnost najveckrat 0,015 do 0,2 % (metilparaben) oz. 0,02 do 0,06 % (propilparaben) (31). EMA sicer maksimalno dovo­ljeno koncentracijo propilparabena omejuje na 100 mg/kg/dan. Etilparben in butilparaben se manj uporabljata, slednji predvsem v dermalnih pripravkih. Parabeni imajo dolgo zgodovino uporabe tudi v kozmeticni industriji, kjer so jih povezovali zgolj z možnostjo pojava alergijskih reakcij. Odkar je bila l. 2004 v reviji Journal of Applied Toxicology objavljena raziskava, v kateri so porocali o povecani vsebnosti parabenov v tumorjih dojk onkoloških bolnic, v strokovni in širši javnosti poteka intenzivna diskusija o varnosti njihove uporabe v kozmeticnih izdelkih (za pod pazduho) in tveganjem za razvoj raka dojk. Ceprav sta tudi avtorja raziskave dodatno pojasnila, da parabenov nista oznacila kot vzrok za pojav raka in da nenazadnje niti ni znano, po kateri poti so parabeni prišli v tumorje oz. kaj je bil njihov izvor, je dvom o varnosti parabenov ostal. Znan­stveni odbor za potrošniške izdelke (Scientific Committee on Consumer products, SCCP) tako že 15 let intenzivno spremlja varnost parabenov v kozmeticnih izdelkih in je od leta 2005 izdal vec mnenj (zadnje v l. 2021). V vseh so prišli do zakljucka, da ni znanstvenih dokazov, ki bi kazali na po-vecano tveganje za razvoj raka dojk ob uporabi konzervira­nih kozmeticnih izdelkov za pod pazduho. So pa na podlagi teh raziskav uvrstili parabene med morebitne endokrine motilce, cemur so prilagodili njihove maksimalne dovoljene koncentracije in prepovedali uporabo dolgoverižnih deriva­tov (izopropil-in izbobutil-ter pentil-, fenil-in benzilparabeni niso dovoljeni v kozmeticnih izdelkih, ki so prišli na tržišce po l. 2014). Metil-in etilparaben še naprej veljata kot varna, njuna vsebnost v kozmeticnih izdelkih pa je lahko do 0,4 % (kot posamezen ester) oz. do 0,8 % (za zmesi parabenov). Od leta 2016 je maksimalna dovoljena koncentracija za propil-in butilparaben znižana na 0,14% (posamezno ali v kombinaciji). SCCS je pred kratkim izdal novo mnenje o varnosti propilparabena, ki je potrdilo izsledke iz leta 2016, za butilparaben pa je ponovna presoja varnosti še v teku. Na predlog SCCS je Evropska komisija leta 2016 tudi pre­povedala uporabo propil-in butilparabena v kozmeticnih izdelkih, ki se ne spirajo in so namenjeni negi plenicnega podrocja pri otrocih, mlajših od treh let (32–34). Pri proucevanju varnosti parabenov sodeluje tudi Evropska agencija za varnost hrane (EFSA), saj parabene v vlogi konzervansov uporabljamo tudi v živilih (maksimalna do-voljena vsebnost v koncnem živilu je do 0,2 % oz. 0,1 % v pijacah) (35). EFSA maksimalni skupni dnevni vnos metil-in etilparabena (navajana kot E218 in E214) omejuje na do 10 mg/kg telesne mase, medtem ko je uporaba propilpa­rabena v živilih v EU od l. 2006 prepovedana zaradi po­tencialnega vpliva na razvoj moških reproduktivnih organov. Pri metilparabenu tovrstnih ucinkov niso zaznali in še naprej velja za varnega tudi za celotno pediatricno populacijo. Na podlagi prepovedi uporabe propilparabena v hrani lahko utemeljimo tudi prepoved njegove uporabe v zdravilih za novorojencke, dojencke in majhne otroke, tudi v primeru kratkotrajne uporabe (36). 4.5 KONZERVANSI V ZDRAVILIh ZA OTROKE Primeri zgoraj opisanih konzervansov osvetljujejo zahtev­nost in vecplastnost oblikovanja zdravil za otroke, kjer sle­dimo splošnemu vodilu po cim bolj enostavni koncni for-mulaciji z minimalnim številom in vsebnostjo pomožnih snovi, brez nepotrebnih dodatkov. Ce je mogoce, se na­mesto konzervansov raje poslužujemo inovativnih tehno­loških rešitev. Kadar to ni možno, mora biti uporaba kon­zervansov tehtna in upravicena ter vedno v najnižjih koncentracijah, ki še zagotavljajo ustrezno zašcito. Po-manjkanje relevantnih klinicnih raziskav postavlja kljucno vprašanje, ali so varnostni podatki, pridobljeni na odraslih prostovoljcih, relevantni za pediatricno populacijo. Ali naj bo uporaba konzervansov prepovedana v vseh starostnih skupinah ali le za novorojencke in dojencke, morda le v primeru dolgotrajne uporabe? Morebiti so lahko dovoljeni za starejše otroke, vendar koliko stare? Ali je vprašljiva tudi kratkotrajna uporaba (36)? Nešteto vprašanj, odgovor pa ni en sam in še zdalec ne enoznacen. V pomoc glede dol­gotrajne izpostavljenosti lahko služijo podatki EFSA ter na novo vzpostavljena podatkovna baza STEP (Safety and Toxicity of Excipients for Pediatrics (37)), vsekakor pa je prva izbira vedno uporaba pripravkov brez konzervansov. Izpostavljenost konzervansom lahko zmanjšamo tudi s tem, da tradicionalne vecodmerne tekoce pripravke na­domestimo z alternativnimi otrokom prijaznimi farmacevt­skimi oblikami, kot so npr. orodisperzibilne tablete, minita­blete, oralni filmi in slamice, ki jih praviloma ni potrebno konzervirati (38, 39). 5 SKLEP Mikrobiološka kakovost je integralni del vsakega farma­cevtskega izdelka. Ustrezno nacrtovanje pomožnih snovi, vkljucno s konzervansi, je kljucnega pomena za razvoj op-timalnega zdravila. Poleg osnovnih informacij o konzer­vansih, katerih poznavanje je pomembno s tehnološkega vidika, moramo redno spremljati tudi informacije o njihovi varnosti, ki jih z namenom zagotavljanja kakovostnih in varnih zdravil kontinuirano nadgrajujejo. Regulatorni organi namrec nenehno spremljajo varnostni profil pomožnih snovi, vkljucujoc konzervanse, kar se odraža tudi v prila­gajanju zgornjih varnih mej uporabe in reviziji oznacevanja zdravil na osnovi najnovejših znanstvenih dognanj. Kljucno je, da bodo takšnemu trendu sledili tudi v prihodnje, zato so relevantne znanstvene raziskave, predvsem z vidika ocene varnostnega tveganja za razlicne nacine aplikacije in specificne skupine bolnikov, še kako upravicene. 6 LITERATURA 1. European Pharmacopoeia online 10.0 [Internet]. Council of Europe Edqm 01/2020 [cited 2021 March 15]. 625-27 p. Available from: https://pheur.edqm.eu/home 2. Halla N, Fernandes IP, Heleno SA, Costa P, Boucherit-Otmani Z, Boucherit K, et al. Cosmetics Preservation: A Review on Present Strategies. Molecules. 2018 Jun 28;23(7):1571. 3. Dao H, Lakhani P, Police A, Kallakunta V, Ajjarapu SS, Wu KW, et al. Microbial Stability of Pharmaceutical and Cosmetic Products. AAPS PharmSciTech. 2018 Jan;19(1):60-78. 4. Tapia MS, Alzamora SM, Chirife J. Effects of Water Activity (aw) on Microbial Stability as a Hurdle in Food Preservation. In: Barbosa-Cánovas GV, Fontana Jr. AJ, Schmidt SJ, Labuza TP, editors. Water Activity in Foods: Fundamentals and Applications, Second Edition [Internet]. John Wiley & Sons, Inc.; 2020 [cited 2021 April 15]. Chapter 14. Available from: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/978111876598 2.ch14 5. Cundell T. The role of water activity in the microbial stability of non-sterile drug products. Eur Pharm Rev. 2015 March,20(1):58-63. 6. Anurova MN, Bakhrushina EO, Demina NB, Panteleeva ES. Modern Preservatives of Microbiological Stability (Review). Pharma Chem J. 2019 Sept 53, 564–71. 7. American Pharmaceutical Review™ [Internet]. Antimicrobial Preservatives Part Two: Choosing a Preservative [update 2017 October; cited 2021 April 16]. Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/343543-Antimicrobial-Preservatives-Part-Two-Choosing -a-Preservative/ 8. American Pharmaceutical Review™ [Internet]. Antimicrobial Preservatives Part One: Choosing a Preservative System [update 2012 January; cited 2021 April 16]. Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/38886-Antimicrobial-Preservatives-Part-One-Choosing-a-Preservative-System/ 9. Baumgartner S., Bajramovic N. Varnost in ucinkovitost konzervansov v kozmeticnih izdelkih. V: Kocevar Glavac N, Zvonar A (Ur.). Kozmetologija I: trendi na podrocju kozmeticnih izdelkov: ucinkovitost in varnost sestavin: Fakulteta za farmacijo, Ljubljana; 2011. str. 39-52. 10. Fransway AF, Fransway PJ, Belsito DV, Warshaw EM, Sasseville D, Fowler Jr JF, DeKoven JG, et al. Parabens. Dermatitis. Jan/Feb 2019;30(1):3-31. 11. American Pharmaceutical Review™ [Internet]. Antimicrobial Preservatives Part Three: Challenges Facing Preservative Systems [update 2012 January; cited 2021 April 17]. Available from: https://www.americanpharmaceuticalreview.com/Featured-Articles/38874-Antimicrobial-Preservatives-Part-Three-Challeng es-Facing-Preservative-Systems/ 12. The solubility of drugs. In: Florence T, Attwood D, editors. Physicochemical Principles of Pharmacy. 4th ed. London: Pharmaceutical Press; 2006. p. 139-176. 13. EMA [Internet]. Excipients labelling [cited 2021 May 5]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/human­regulatory/marketing-authorisation/product-information/referenc e-guidelines/excipients-labelling 14. Meyer BK, Ni A, Hu B, Shi L. Antimicrobial preservative use in parenteral products: past and present. J Pharm Sci. 2007 Dec;96(12):3155-67. 15. Moser CL, Meyer BK. Comparison of compendial antimicrobial effectiveness tests: a review. AAPS PharmSciTech. 2011 Mar;12(1):222-6. 16. Nagarsenkar MS, Dhawan VV. Parenteral preparations. In: Adejare A, editor-in-chief. Remington (Twenty-third Edition) The Science and Practice of Pharmacy [Internet]. Academic Press; 2020 [cited 2021 May 10]. Chapter 29. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B978012820 0070000295?via%3Dihub 17. Gervasi V, Dall Agnol R, Cullen S, McCoy T, Vucen S, Crean A. Parenteral protein formulations: An overview of approved products within the European Union. Eur J Pharm Biopharm. 2018 Oct;131:8-24. 18. EMA. Excipients labelling [Internet]. Benzyl alcohol and benzoic acid group used as excipients [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/report/benzyl­alcohol-benzoic-acid-group-used-excipients-report-published-s upport-questions-answers-benzyl/chmp/508188/2013-t_en.pdf 19. EMA. Excipients labelling [Internet]. Questions and answers on benzyl alcohol used as an excipient in medicinal products for human use. Adopted [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific­guideline/questions-answers-benzyl-alcohol-used-excipient-me dicinal-products-human-use_en.pdf 20. DeStefano F, Monk Bodenstab H, Offit PA. Principal Controversies in Vaccine Safety in the United States. Clin Infect Dis. 2019 Aug 1;69(4):726-31. 21. Pollard AJ, Bijker EM. A guide to vaccinology: from basic principles to new developments. Nat Rev Immunol. 2021 Feb;21(2):83-100. 22. NIJZ [Internet]. Tiomersal in cepiva [datum dostopa 2021 May 6]. Dostopno na: https://www.nijz.si/sites/www.nijz.si/files/uploaded/tiomersal_in _cepiva.pdf 23. EMA. Excipients labelling [Internet]. Benzalkonium chloride used as an excipient [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/report/benzalkoniu m-chloride-used-excipient-report-published-support-questions­answers-benzalkonium_en.pdf 24. Baudouin C, Labbé A, Liang H, Pauly A, Brignole-Baudouin F. Preservatives in eyedrops: the good, the bad and the ugly. Prog Retin Eye Res. 2010 Jul;29(4):312-34. 25. Steven DW, Alaghband P, Lim KS. Preservatives in glaucoma medication. Br J Ophthalmol. 2018 Nov;102(11):1497-1503. 26. Walsh K, Jones L. The use of preservatives in dry eye drops. Clin Ophthalmol. 2019 Aug 1;13:1409-25. 27. Rolando M, Crider JY, Kahook MY. Ophthalmic preservatives: focus on polyquaternium-1. Expert Opin Drug Deliv. 2011 Nov;8(11):1425-38. 28. EMEA/622721/2009 [Internet]. EMEA public statement on antimicrobial preservatives in ophthalmic preparations for human use [cited 2021 April 28]. Available from: http://www.techtran.co.jp/reportd/emea091208.pdf 29. EMA. Excipients labelling [Internet]. Benzalkonium Chloride. Adopted questions and answers [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific­guideline/questions-answers-benzalkonium-chloride-used-excip ient-medicinal-products-human-use_en.pdf 30. EMA. Excipients labelling [Internet]. Benzoic acid and benzoates. Adopted questions and answers (Q&A). [updated 2017 October 9; cited 2021 May 7]. Available form: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific­guideline/questions-answers-benzoic-acid-benzoates-used-exci pients-medicinal-products-human-use_en.pdf 31. EMA [Internet]. Reflection paper on the use of methyl-and propylparaben as excipients in human medicinal products for oral use [updated 2015 October 22; cited 2021 May 7]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific­guideline/reflection-paper-use-methyl-propylparaben-excipients -human-medicinal-products-oral-use_en.pdf 32. European Commission [Internet]. Call for data on ingredients with potential endocrine-disrupting properties used in cosmetic products [updated 2021 February 15; cited 2021 May 10]. Available from: https://ec.europa.eu/growth/content/call-data-ingredients-potential-endocrine-disrupting-properties-used-cos metic-products-0_en 33. European Comission. SCCS [Internet]. OPINION ON Propylparaben (PP) [updated 2021 March 30-31; cited 2021 May 5]. Available from: https://ec.europa.eu/health/sites/default/files/scientific_committ ees/consumer_safety/docs/sccs_o_243.pdf 34. European Comission. SCCS [Internet]. The SCCS notes of guidance for the testing of cosmetic ingredients and their safetyevaluation11th revision [updated 2021 March 30-31; cited 2021 May 5]. Available from: https://ec.europa.eu/health/sites/default/files/scientific_committ ees/consumer_safety/docs/sccs_o_250.pdf 35. EUR-Lex [Internet]. UREDBA KOMISIJE (EU) št. 1130/2011 z dne 11. novembra 2011 o spremembah Priloge III k Uredbi (ES) št. 1333/2008 Evropskega parlamenta in Sveta o aditivih za živila z vzpostavitvijo seznama Unije aditivov za živila, odobrenih za uporabo v aditivih za živila, encimih za živila, aromah za živila in hranilih [cited 2021 May 3]. Available from: https://eur­lex.europa.eu/legal-content/SL/TXT/?uri=CELEX%3A32011R11 30 36. EMA [Internet]. Preservatives. Are they safe? [update 2010 May; cited 2021 April 28]. Available from: https://www.ema.europa.eu/en/documents/presentation/prese ntation-preservatives-are-they-safe_en.pdf 37. EuPfu [Internet]. STEP Database [update 2017 September 19; cited 2021 May 4]. available from: https://step-db.ucl.ac.uk/eupfi/appDirectLink.do?appFlag=login 38. van Riet-Nales DA, Schobben AFAM, Vromans H, Egberts TCG, Rademaker CMA. Safe and effective pharmacotherapy in infants and preschool children: importance of formulation aspects. Arch Dis Child. 2016 Jul;101(7):662-9. 39. Thabet Y, Klingmann V, Breitkreutz J. Drug Formulations: Standards and Novel Strategies for Drug Administration in Pediatrics. J Clin Pharmacol. 2018 Oct;58 Suppl 10:26-35. POMEN LIOFILIZACIJE V FARMACIJI IMPORTANCE OF LYOPhILISATION IN PhARMACY AVTORICI / AUThORS: asist. Maja Bjeloševic, mag. ind. farm. izr. prof. dr. Pegi Ahlin Grabnar, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E mail: pegi.ahlingrabnar@ffa.uni lj.si PREGLEDNI ZNANSTVENI CLANKI 1 UVOD Liofilizacija oz. sušenje z zamrzovanjem je široko upora­bljana metoda, za katero zanimanje v zadnjih letih strmo narašca. Gre za metodo sušenja, ki jo najpogosteje pove­zujemo s pripravo bioloških in biološko podobnih zdravil za parenteralno dajanje oz. sušenjem proteinskih ucinkovin. Omogoca tudi izdelavo farmacevtskih oblik, kot so praški za pripravo kapljic za oci ter peroralnih liofilizatov. Slednji vse bolj pridobivajo na pomenu predvsem z vidika razvoja novih farmacevtskih oblik za otroke in starostnike. Upo­rabnost liofilizacije se kaže tudi pri izdelavi cepiv in stabili­zaciji nanodostavnih sistemov (1). Liofilizacija povecuje sta­bilnost zdravilnih ucinkovin zaradi odstranitve vode, povecuje topnost slabo topnih zdravilnih ucinkovin preko njihove amorfizacije, omogoca zmanjšanje mase zdravil in POVZETEK Liofilizacija je danes metoda izbora za pripravo sta­bilnih formulacij s proteinskimi zdravilnimi ucinkovi­nami, njena uporaba in globlje razumevanje pa po­stajata cedalje bolj pomembna tudi z vidika priprave novih, pacientu prijaznih farmacevtskih oblik. Skladno z intenzivnim povecanjem števila novih bio-loških in biološko podobnih zdravil se farmacevtska industrija vse bolj usmerja k razvoju in optimizaciji procesa liofilizacije, z namenom zagotavljanja ka­kovostnih, varnih in ucinkovitih zdravil. Namen clanka je predstaviti proces liofilizacije in novosti na tem podrocju ter izpostaviti njegovo pomembnost na podrocju farmacije. KLJUCNE BESEDE: agresivno sušenje, biološka zdravila, liofilizacija, op-timizacija, sušenje z zamrzovanjem ABSTRACT Today, lyophilisation is the method of choice for the preparation of stable formulations with protein active ingredients, and its use and deeper understanding have become increasingly important in terms of preparation of new, patient-friendly dosage forms. In line with the intensive increase in the number of new biologic and biosimilar drugs, the pharmaceutical industry is increasingly focusing on the development and optimisation of the lyophilisation process, with the aim of providing quality, safe and effective drugs. The purpose of the article is to present the process of lyophilisation and innovations in this field, and to highlight its importance in the field of pharmacy. KEY WORDS: aggressive drying, biopharmaceuticals, freeze-drying, lyophilisation, optimisation; s tem lažji transport ter zaradi pretvorbe v suho obliko omogoca daljši rok uporabe zdravila. Farmacevtska industrija se vse bolj usmerja v raziskovanje na podrocju bioloških zdravil, ki predstavljajo sedem od desetih najbolj prodajanih zdravil v letu 2018 (preglednica 1) (2). Pojav prvega biološkega zdravila sega v zacetke osemdesetih let prejšnjega stoletja, ko je farmacevtsko podjetje »Eli Lily and Company« zacelo s prodajo zdravila s proteinsko ucinkovino rekombinantnim inzulinom. V sploš­nem danes porast v razvoju in prodaji predstavljajo biološko podobna zdravila, ki se pojavljajo kot posledica izteka pa-tentnih pravic originatorskim biološkim zdravilom (3). Biološka in biološko podobna zdravila imajo številne pred­nosti v primerjavi s klasicnimi zdravili, a gledano s tehnolo­škega vidika sta oblikovanje in proizvodnja tovrstnih zdravil zapletena procesa, ki zahtevata veliko znanja in izkušenj. Gre namrec za obcutljive in nestabilne, vecinoma protein-ske ali peptidne molekule, pri katerih preostri tehnološki pogoji izdelave lahko povzrocijo izgubo oz. spremembo njihove biološke aktivnosti, kar vodi do pojava resnejših neželenih ucinkov (4). Velika molekulska masa bioloških molekul ter njihova fizikalna in kemijska nestabilnost so bi-stveni parametri, po katerih se biološka zdravila razlikujejo od klasicnih sinteznih zdravil, obenem pa pri razvoju biolo­ških zdravil naletimo še na težave, kot so encimska raz­gradnja, imunogenost in kratek razpolovni cas (5). Vse ne­ POMEN LIOFILIZACIJE V FARMACIJI Preglednica 1: Deset najbolj prodajanih zdravil v svetovnem merilu v letu 20181 (2). Table 1: Ten best-selling drugs worldwide in 20181 (2). 1Odebeljeni tisk se nanaša na biološka zdravila. humira (adalimumab) artritis AbbVie 19,9 Keytruda (pembrolizumab) rak Merck & Co. 7,2 Avastin (bevacizumab) rak Roche 7,0 Opdivo (nivolumab) rak Bristol-Myers Squibb 6,7 Prevnar (cepivo) pnevmokokne okužbe Pfizer 5,8 Slika 1: Shematski prikaz poteka liofilizacije. Figure 1: Schematic representation of the lyophilisation. šteto je razlog za obicajno zelo nizko biološko uporabnost bioloških makromolekul po peroralni aplikaciji, zato kot omenjeno med biološkimi zdravili prevladujejo parenteralne farmacevtske oblike v obliki raztopin, suspenzij ali liofilizatov. Ravno slednji predstavljajo najbolj razširjeno farmacevtsko obliko bioloških zdravil, in sicer je bilo v preteklih desetih letih kar 40 do 50 % vseh odobrenih bioloških zdravil v lio­filizirani obliki (1). 2 SUŠENJE Z ZAMRZOVANJEM – LIOFILIZACIJA Liofilizacija (freeze-drying, lyophilisation) predstavlja obliko sušenja z uporabo nizkih tlakov in temperatur. Zdravilne ucinkovine biološkega izvora so vecinoma obcutljive na povišano temperaturo, zato pri pretvorbi raztopin v suho obliko ne moremo uporabiti obicajnih nacinov sušenja. Nizke temperature in tlaki pri sušenju z zamrzovanjem omogocajo odstranitev vode iz vzorca in pretvorbo le-tega v trdno obliko, tj. v liofilizat, ki mora imeti ustrezne kriticne lastnosti kakovosti produkta, kot sta izgled in delež rezi­dualne vode. Proces temelji na fizikalnem pojavu sublima­cije, kjer snov iz trdnega agregatnega stanja preide nepo­sredno v plinasto agregatno stanje brez predhodnega prehoda skozi tekoco fazo (slika 1). Liofilizacija sestoji iz treh zaporednih faz, ki so medsebojno odvisne. Na zacetku vzorce zamrznemo, nato sledi faza primarnega sušenja, kjer zaradi uvedbe visokega vakuuma prihaja do sublimacije proste vode. V zadnji fazi sekundarnega sušenja se zaradi desorpcije odstrani še vezana voda in tako koncni produkti vecinoma vsebujejo manj kot 2 % (m/m) rezidualne vode. Kljub številnim prednostim se je pri izbiri procesa liofilizacije potrebno zavedati, da gre za dolgotrajen in energetsko zelo potraten proces, posledica cesar so visoki stroški proizvodnje. Proces liofilizacije mora biti zato ustrezno na-crtovan in optimiziran. 2.1 ZAMRZOVANJE Zamrzovanje je prvi korak procesa liofilizacije, ki omogoca pretvorbo zacetne raztopine v trdno stanje. Zamrznjena voda se loci od zdravilne ucinkovine in pomožnih snovi, ki so vkljucene v formulacijo, posledicno pride do nastanka intersticijskega prostora med kristali ledu. Zamrzovanje se pricne s podhladitvijo raztopine, kjer pride do pojava nu-kleacije in rasti kristalov ledu. Ko se kristalizacija zakljuci, kar oznacuje konec zamrzovanja v raztopini, temperatura po zacetnem dvigu pade proti nastavljeni temperaturi polic, vecinoma okrog –40 °C. Nadaljnje ohlajanje vzorcev pov­zroci povecanje koncentracije topljencev v nastalem inter-sticijskem prostoru do kriticne koncentracije. Temperaturo, pri kateri je raztopina maksimalno nasicena in le-ta preide iz zmehcanega stanja v steklasto stanje, oznacujemo kot temperaturo steklastega prehoda maksimalno koncentri­rane zamrznjene raztopine (Tg’), ki je znacilna za amorfne sisteme, medtem ko za kristalne sisteme velja temperatura tališca evtektika (Teu) (6). V fazo zamrzovanja pogosto vkljucimo tudi korak temperi­ranja (annealing), ki zagotavlja kristalizacijo pomožnih snovi in posredno preko tvorbe kristalov ledu vpliva na hitrost sušenja. Temperiranje izvedemo tako, da vzorce segrejemo nad Tg’, to temperaturo nekaj casa vzdržujemo, nato pa vzorce ponovno zamrznemo na enako temperaturo, kot je bila dosežena pred fazo temperiranja (7). Zamrzovanje je dehidracijski proces, ki lahko ogrozi stabilnost proteinskih ucinkovin v primeru neustrezno izbranih proces­nih parametrov. Glavni parametri, ki vplivajo na velikost in morfologijo nastalih kristalov, so temperatura in cas zamr­zovanja ter hitrost ohlajanja. Pocasno ohlajanje (0,5 şC/min) vodi do nastanka vecjih homogenih kristalov, ki tvorijo boljše kanale za sublimacijo vodne pare v fazi sušenja, medtem ko za hitro ohlajanje velja ravno obratno (5, 8). Cas zamrzo­vanja je odvisen od ucinkovitosti toplotnega prenosa med polico liofilizatorja in dnom viale, zato morajo biti casi za do-seganje popolnoma zamrznjenega vzorca dovolj dolgi. 2.2 PRIMARNO SUšENJE Glavni cilj primarnega sušenja je odstranitev nastalega ledu s sublimacijo. Pojav sublimacije omogoca uvedba mocno znižanega tlaka v sušilno komoro in izbira ustrezne tem­perature polic. Cas primarnega sušenja je funkcija tempe­rature polic in tlaka v komori, ki neposredno vplivata na temperaturo produkta med sušenjem in hitrost sublimacije vodne pare. Na zacetku primarnega sušenja tlak v komori hitro pada, medtem ko temperatura polic postopoma na­rašca (slika 2). Ker se produkt zaradi sublimacije hladi, se njegova temperatura postopoma približuje nastavljeni tem­peraturi polic. Ko temperatura produkta (Tp) doseže tem­ Slika 2: Primer poteka liofilizacijskega cikla. Zelena krivulja predstavlja nastavljeno temperaturo polic, rdeca in modra dejanski temperaturi produkta ter roza nastavljen tlak sušenja. Figure 2: An example of a lyophilisation cycle. Green curve represents the set shelf temperature, red and blue curves represent actual product temperatures, and pink curve represents the set chamber pressure. peraturo polic, je sublimacija v celoti zakljucena in primarno sušenje se konca. Z izbiro ustreznih tlaka in temperature sušenja vplivamo tako na trajanje sušenja kot tudi na lastnosti produkta. Izbira tlaka in temperature sušenja je odvisna od specifi-cnosti sestave formulacije oz. fizikalno-kemijskih parame­trov zdravilne ucinkovine. Slednje je še posebej pomembno pri proteinskih ucinkovinah, kjer morata tlak in temperatura sušenja zagotavljati fizikalno in kemijsko stabilnost protein-skih molekul ter ustrezen videz liofilizata, obenem pa še vedno vzorec posušiti do sprejemljive vsebnosti rezidualne vode. Najpogosteje uporabljamo tlak sušenja v obmocju med 0,1 in 0,3 mbar. Previsoki tlaki sušenja lahko povzrocijo porušitev strukture liofilizata (kolaps), medtem ko lahko prenizki tlaki povzrocijo kontaminacijo sušenega materiala z oljem vakuumske crpalke, obenem pa vplivajo na zmanj­šanje kapacitete kondenzatorja (9). Temperatura sušenja mora biti skrbno izbrana z namenom optimizacije trajanja primarnega sušenja. Odvisna je od termicnih lastnosti sušenih formulacij, in sicer sta omejujoca dejavnika temperatura Tg’ in temperatura kolapsa (Tc). Slednja je najvišja temperatura vzorca, ki ne povzroci kolapsa liofilizacijske pogace. Kolaps definiramo kot izgubo strukture liofilizacijske pogace, ki se pojavi na makro ali mikro nivoju ter tako lahko vpliva na izgled in kakovost produktov. Porušena struktura povzroci zaporo por znotraj liofilizata, kar predstavlja oviro za sublimacijo vodne pare ter posledicno mocno upocasni potek sušenja. Kljub dejstvu, da gre za neželen pojav, pa je iz znanstvenih clankov razvidno, da kolaps velikokrat vpliva le na koncni izgled liofilizacijske pogace, medtem ko so kriticne lastnosti kakovosti produkta, kot sta rekonstitucijski cas in vsebnost rezidualne vode, še vedno ohranjene (10, 11). Dolgo je veljalo, da mora biti temperatura zamrznjenega vzorca med primarnim sušenjem pod Tc ali celo pod Tg’, z namenom doseganja ustreznega videza liofilizacijske pogace, kar strokovno opišemo kot konzervativno sušenje (12). Naprotno se danes na podrocju sušenja z zamrzovanjem vse bolj uveljavlja uporaba agresivnih pogojev sušenja, tj. sušenja vzorcev pri temperaturah, višjih od kriticnih temperatur Tg´ in v nekaterih primerih celo Tc (Tp > Tg’ in Tc), ki vecinoma ne vplivajo negativno na kriticne lastnosti kakovosti produkta (slika 3), medtem ko so casi sušenja bistveno krajši kot pri konzervativnem nacinu sušenja (13, 14). 2.3 SEKUNDARNO SUšENJE Sekundarno sušenje predstavlja zakljucno fazo procesa, pri kateri se zaradi povišanja temperature polic (slika 2) in pogosto tudi nekoliko nižjega tlaka preko procesa desorpcije iz vzorca odstrani še preostala vezana voda. Pomembno je, da na zacetku sekundarnega sušenja, ko je delež vezane vode velik, temperaturo polic dvigujemo postopoma, da s prehitrim povišanjem temperature ne povzrocimo kolapsa pogace, kar je še posebej pomembno za amorfne kompo­nente (15). Pri dolocanju casa sekundarnega sušenja si lahko pomagamo z neposrednim merjenjem deleža zaostale vlage v vzorcih in ko je le-ta na sprejemljivem nivoju, obicajno pod 2 % (m/m), lahko sekundarno sušenje zakljucimo. Kljub temu da vsebnost vlage v vzorcih mocno znižamo in s tem zagotovimo mikrobiološko in fizikalno-kemijsko stabilnost vzorcev, pa deleži vlage, manjši od 0,5 % (m/m), niso pri­porocljivi (15, 16). 3 OPTIMIZACIJA LIOFILIZACIJE Optimizacija ciklov se posredno zacne že v fazi razvoja formulacije, in sicer preko vkljucitve ustreznih pomožnih snovi. Poleg tega, da moramo v proteinske formulacije vkljuciti stabilizatorje, kot sta saharoza ali trehaloza, je pri­porocljivo, da formulacijam dodamo tudi ustrezna polnila. Namen polnil, med katerimi sta najpogostejša glicin in ma-nitol, je zagotavljati ustrezno strukturo liofilizacijske pogace tudi v primerih, ko je Tc amorfne faze presežena. Polnila med zamrzovanjem oz. temperiranjem kristalizirajo in tvorijo rešetko, ki predstavlja mehansko oporo za amorfne kom­ponente, in s tem preprecujejo kolaps liofilizacijske pogace (17). Dokazali so, da povišanje temperature za 10 °C med temperiranjem skrajša cas primarnega sušenja za do 34 % (18). Uporaba ustreznih pomožnih snovi tako omogoca sušenje pri višjih temperaturah produkta, s cimer vplivamo na skrajšanje casa primarnega sušenja in posledicno tudi celotnega cikla, nasprotno vkljucitev neustreznih pomožnih snovi vodi v porušenje liofilizacijske pogace. Slika 3: Kriticne lastnosti kakovosti produkta. Figure 3: Critical quality attributes of lyophilisates. 3.1 IZGLED LIOFILIZACIJSKE POGACE Izgled liofilizacijske pogace po koncu sušenja je eden najbolj kriticnih parametrov kakovosti produkta pri pripravi liofili­zatov, ki vpliva na uporabnost koncnega izdelka. Nepravil­nosti v izgledu liofilizacijske pogace so nezaželene pred­vsem z vidika uporabnika, ki jih lahko poveže s slabšo kakovostjo produkta. Vendar pa je pomembno lociti med kolapsom kot »kozmeticno« nepravilnostjo in kolapsom, ki vpliva neposredno na kakovost, varnost in ucinkovitost zdravila (10). Na pojav kolapsa v veliki meri vplivamo z izbiro ustreznih temperature in hitrosti zamrzovanja ter tem­perature in tlaka sušenja, kar je še posebej pomembno pri sušenju formulacij s proteini. Najpogostejše nepravilnosti liofilizacijske pogace, ki v vecini primerov ne pomenijo neu­streznosti izdelka, so skrcenje in manjše pokanje liofiliza­cijske pogace, t. i. meglenje notranje stene vial, penjenje vzorca ter pojav vulkana kot posledica dviga manjše koli-cine pogace (slika 4). 3.2 UPORABA PROCESNO-ANALIZNIh TEhNOLOGIJ IN MODELIRANJA NA PODROCJU LIOFILIZACIJE K optimizaciji ciklov danes mocno pripomore uporaba sod-obnih orodij procesno-analiznih tehnologij (PAT), ki omo­gocajo vpeljavo koncepta nacrtovanja kakovostnih izdelkov in procesov »Quality by Design« (QbD). QbD predstavlja novo paradigmo, katere cilj je vgrajevanje kakovosti v pro-ces in proizvod, ki temelji na predhodni identifikaciji kljucnih znacilnosti izdelka in kriticnih procesnih parametrov (19). Cilj uvedbe QbD je sistematicen pristop k razvoju proizvoda in procesa, njunemu razumevanju in vzpostavitvi procesne kontrole, z namenom pridobivanja kakovostnih proizvodov (20). Pri uvedbi QbD si lahko pomagamo s t. i. diagramom Ishikawa, kjer definiramo glavni problem in parametre, ki vplivajo na definirani problem (slika 5). S pojavom PAT so se pojavile stroge regulatorne zahteve glede vpeljave teh orodij v farmacevtsko industrijo, kljub temu pa so tovrstna orodja že del vsakodnevnega proiz­vodnega procesa farmacevtskih izdelkov (21). Tako so se orodja PAT pojavila tudi na podrocju sušenja z zamrzova­njem. Sistem TEMPRIS (temperature remote interrogation sy­stem) sestavlja 8 do 16 temperaturnih senzorjev, ki jih vsta­vimo neposredno v vzorce v vialah (slika 6a). Senzorji preko oddajnika pošiljajo signal do sprejemne enote, ki signal pretvori v temperaturno vrednost. Slednja se z uporabo ustrezne programske opreme izpiše na racunalniku, ki je povezan z liofilizatorjem. Sistem tako omogoca stalen nad­zor nad Tp med sušenjem (22). Sistem TrackSense Pro je v osnovi podoben sistemu TEMPRIS, le da senzorje napaja baterija (slika 6b). Sistem ne omogoca sprotnega prikaza temperature, ampak se podatki hranijo in so dostopni šele po koncu procesa (23). Manometricno dolocanje temperature (MTM, manometric temperature measurement) predstavlja neinvazivno tehno­logijo, kjer z razliko od prejšnjih dveh sistemov ne pose-gamo neposredno v vzorce. Sistem uporabljajo za sprem­ljanje kriticnih lastnosti produktov in procesa sušenja za celotno serijo sušenih vzorcev. MTM temelji na periodicnem dvigovanju tlaka znotraj komore, ki je med meritvijo izolirana od kondenzatorja. Dvig tlaka v komori popišemo z uporabo MTM-enacbe, ki na podlagi toplotnega in masnega pre­nosa posredno preko parnega tlaka ledu in upornosti trdne plasti proti toku vodne pare omogoca dolocitev najpo­membnejših parametrov produkta in procesa, kot so hitrost sublimacije, temperatura produkta, debelina suhe snovi in koeficient prenosa toplote. V primerih, ko je MTM sklopljen s programsko opremo SMARTTM , je omogocena nepo­sredna optimizacija primarnega sušenja, preko predhodno izbranih zahtev operaterja in dejanske povratne informacije o izdelku med merjenjem (23). Uporaba spektroskopskih tehnik (sonde NIR in RAMAN) med procesom sušenja predstavlja neinvazivno in nede­ Slika 4: Nepravilnosti v izgledu liofilizacijske pogace: skrcenje pogace (a), popokanje pogace (b), meglenje vzorca (c), penjenje vzorca (d) in vulkan (e). Prirejeno po 10. Figure 4: Irregularities in cake appearance: cake shrinkage (a), cake cracking (b), fogging (c), foaming (d) and volcano (e). Adapted after 10. Slika 5: Diagram Ishikawa, ki opredeljuje bistvene parametre, ki vplivajo na proces liofilizacije. Prirejeno po: http://file.scirp.org/Html/1­4600131_63220.htm. Tg’ – temperatura steklastega prehoda maksimalno koncentrirane zamrznjene raztopine; Teu – temperatura tališca evtektika; Tc – temperatura kolapsa; Tg – temperatura steklastega prehoda. Figure 5: Ishikawa diagram defining the main parameters influencing the lyophilisation process. Adapted after: http://file.scirp.org/Html/1­4600131_63220.htm. Tg´ – glass transition temperature of the maximally freeze-concentrated solution; Teu – eutetic temperature; Tc – collapse temperatre; Tg – glass transition temperature. struktivno »in line« metodo. Postavitev sond v sušilno ko­moro omogoca neprestano spremljanje poteka procesa in nadzor nad spremembami v vzorcih. Podatki se ves cas shranjujejo in v dolocenih casovnih intervalih izpisujejo v Slika 6: Senzor TEMPRIS za nadzor temperature (a) in senzor TrackSense Pro (b). Prirejeno po: https://www.tempris.com/; http://www.ellab.com/products/find-the-right-data­logger/tracksense-pro Figure 6: TEMPRIS sensor for temperature monitoring (a) and TrackSense Pro sensor (b). Adapted after: https://www.tempris.com/; http://www.ellab.com/products/find-the-right-data-logger/tracksense-pro. obliki spektrov. Z uporabo sond lahko dobimo podatke o poteku kristalizacije znotraj vzorcev, iz cesar lahko skle­pamo o koncu faze zamrzovanja. Prav tako lahko sprem­ljamo potek sublimacije in dolocimo koncno tocko primar­nega sušenja, obenem pa nam sondi omogocata detekcijo vsebnosti vlage v produktih, kar je pomemben podatek pri dolocanju casa sekundarnega sušenja (25). Trenutno je najpogosteje uporabljan sistem TDLAS, ki deluje na prin­cipu bližnje IR-spektroskopije. LyoTrack predstavlja senzor za dolocanje vlage oz. kolicine vodne pare v sušilni komori. Najveckrat ga uporabljamo za dolocanje konca primarnega sušenja, kar senzor zazna kot zmanjšanje deleža vodne pare. Programska oprema omogoca izrisovanje proces­nega grafa, kjer spremljamo delež vlage v komori v odvis­nosti od temperature in casa (24). Modeliranje pri liofilizaciji zmanjša število poskusov po prin­cipu »poskusi in napake«, kar vodi v povišanje stroškov procesa. S sistemom nacrtovanja eksperimentov (DoE, design of experiments) ugotovimo vpliv in interakcije med razlicnimi faktorji, ki temeljijo na povezavi kriticnih lastnosti vhodnih surovin (CMA), kriticnih procesnih parametrov (CPP) in kriticnih lastnosti kakovosti liofilizatov (CQA). Pri tem lahko v ospredje postavimo modeliranje same formu­lacije oz. procesa. V literaturi najpogosteje najdemo mo-deliranje faze primarnega sušenja. V okviru slednjega po­sledicno definiramo eksperimentalni prostor, pri cemer mo-deliranje najpogosteje temelji na teoriji koeficienta prenosa toplote in upornosti prenosa mase (19, 25). 4 SKLEP Proizvodnja bioloških zdravil predstavlja enega najzahtev­nejših postopkov, ki je sestavljen iz množice zaporednih korakov in katerega glavni cilj je priprava varnega, kako­vostnega in ucinkovitega zdravila. Liofilizacija je metoda izbora pri sušenju raztopin termolabilnih zdravilnih ucinko­vin, med katere uvršcamo tudi proteinske molekule. V izo­gib visokim stroškom liofilizacije so trendi na tem podrocju usmerjeni v iskanje rešitev za optimizacijo stroškov procesa, pri cemer novost predstavlja agresivno sušenje, torej su­šenje nad kriticnimi temperaturami produkta, brez vpliva na izgled liofilizata in stabilnost zdravilne ucinkovine. Vecjo ekonomicnost procesa danes omogocajo tudi številna orodja PAT, ki zagotavljajo ustrezno kakovost liofiliziranih produktov ter implementacija sodobnih matematicnih mo-delov za vrednotenje socasnega vpliva vec faktorjev, ki vse bolj nadomešcajo številne empiricne ponovitve eksperi­mentalnih poskusov. 5 LITERATURA 1. Kasper JC, Winter G, Friess W. Recent advances and further challenges in lyophilization. Eur J Pharm Biopharm. 2013;85:162-9. 2. Urquhart L. Top drugs and companies by sales in 2018. Nat Rev Drug Discov 2019; 18:245. 3. Štrukelj B. Razvoj, delitev in vloga bioloških zdravil. In: Štrukelj B, Kos J, editors. Biološka zdravila: od gena do ucinkovine. Ljubljana: Slovensko farmacevtsko društvo; 2007. p. 3-24. 4. Kocbek P. Od klasicnih do sodobnih dostavnih sistemov za biofarmacevtike. In: Kocevar Glavac N, Zvonar A, editors. Biološka zdravila. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo; 2015. p. 51-64. 5. Fjokjaer S, Otzen DE. Protein drug stability: A formulation challenge. Nat Rev Drug Discov. 2005;4:298-306. 6. Kasper JK, Friess W. The freezing step in lyophilization: Physico-chemical fundamentals, freezing methods and consequences on process performance and quality attributes of biopharmaceuticals. Eur J Pharm Biopharm. 2011;78:248-63. 7. Searles JA, Carpenter JF, Randolph TW. Annealing to optimize the primary drying rate, reduce freezing-induced drying rate heterogeneity, and determine T(g)' in pharmaceutical lyophilization. J Pharm Sci. 2001;90:872-87. 8. Connolly BD, Le L, Patapoff TW, Cromwell MEM, Moore JMR, Lam P. Protein Aggregation in Frozen Trehalose Formulations: Effects of Composition, Cooling Rate, and Storage Temperature. J Pharm Sci. 2015;104:4170-84. 9. Sp scientific. Basic Principles of Freeze Drying [Internet]. Stone Ridge, NY: Sp scientific, 2009 [updated 2020 June 5; cited 2020 June 15]. Available from: https://www.spscientific.com/freeze-drying-lyophilization-basics 10. Patel SM, Nail SL, Pikal MJ, Geidobler R, Winter G, Hawe A, Davagnino J, Gupta SR. Lyophilized Drug Product Cake Appearance: What Is Acceptable? J Pharm Sci. 2017;106:1706-21. 11. Wang DQ, Hey JM, Nail SL. Effect of collapse on the stability of freeze-dried recombinant factor VIII and alpha-amylase. J Pharm Sci. 2004;93:1253-63. 12. Depaz RA, Pansare S, Patel SM. Freeze-Drying Above the Glass Transition Temperature in Amorphous Protein Formulations While Maintaining Product Quality and Improving Process Efficiency. J Pharm Sci. 2016;105:40-9. 13. Bjeloševic M, Bolko Seljak K, Trstenjak U, Logar M, Brus B, Ahlin Grabnar P. Aggressive conditions during primary drying as a contemporary approach to optimise freeze-drying cycles of biopharmaceuticals. J Pharm Sci. 2018;122:292-302. 14. Johnson R, Lewis L. Freeze-Drying Protein Formulations above their Collapse Temperatures: Possible Issues and Concerns. American Pharmaceutical Review. 2011;14:50-4. 15. Tang X, Pikal MJ. Design of freeze-drying processes for pharmaceuticals: practical advice. Pharm Res. 2004;21: 191­200. 16. Remmele RL, Krishnan S, Callahan WJ. Development of stable lyophilized protein drug products. Curr Pharm Biotechnol. 2012;13:471-96. 17. Bjeloševic M, Zvonar Pobirk A, Planinšek O, Ahlin Grabnar P. Excipients in freeze-dried biopharmaceuticals: Contributions toward formulation stability and lyophilisation cycle optimisation. Int J Pharm. 2020;576. 18. Smith G, Arshad MS, Polygalov E, Ermolina I. Through-vial impedance spectroscopy of the mechanisms of annealing in the freeze-drying of maltodextrin: the impact of annealing hold time and temperature on the primary drying rate. J Pharm Sci. 2014;103:1799-810. 19. Koganti VR, Shalaev EY, Berry MR, Osterberg T, Youssef M, Hiebert DN, Kanka FA, Nolan M, Barrett R, Scalzo G, Fitzpatrick G, Fitzgibbon N, Luthra S, Zhang L. Investigation of design space for freeze-drying: use of modeling for primary drying segment of a freeze-drying cycle. Pharm Sci Tech. 2011; 12:854-61. 20. Yu LX. Pharmaceutical quality by design: product and process development, understanding, and control. Pharm Res. 2008;25:781-91. 21. U.S. Food and Drug Administration. Guidance for Industry PAT — A Framework for Innovative Pharmaceutical Development, Manufacturing, and Quality Assurance. [Internet]. Rockville: U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM), Office of Regulatory Affairs (ORA), 2004 [cited 2020 June 20]. Available from: https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidances/ucm070305. pdf 22. Schneid S. Investigation of Novel Process Analytical Technology (PAT) Tools for Use in Freeze-Drying Processes. Doktorsko delo. Nürnberg: der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, 2009. 23. Gieseler H, Kramer T, Pikal MJ. Use of manometric temperature measurement (MTM) and SMART freeze dryer technology for development of an optimized freeze-drying cycle. J Pharm Sci. 2007;96:3402-18. 24. De Beer TR, Vercruysse P, Burggraeve A, Quinten T, Ouyang J, Zhang X, Vervaet C, Remon JP, Baeyens WR. In-line and real­ time process monitoring of a freeze drying process using Raman and NIR spectroscopy as complementary process analytical technology (PAT) tools. J Pharm Sci. 2009;98:3430­46. 25. Preskar M, Videc D, Vrecer F, Gašperlin M. Investigation of design space for freeze-drying injectable ibuprofen using response surface methodology. Acta Pharm. 2021; 71:81-98. EKSTRAKCIJA S SUBKRITICNO VODO ZA PRIDOBIVANJE RASTLINSKIh EKSTRAKTOV SUBCRITICAL WATER ExTRACTION FOR ThE PRODUCTION OF PLANT ExTRACTS AVTORICI / AUThORS: asist. Katja Schoss, mag. ind. farm. izr. prof. dr. Nina Kocevar Glavac, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko biologijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E mail: katja.schoss@ffa.uni lj.si POVZETEK Zmanjšana poraba energije, ucinkovita pretvorba reaktantov v produkte, manj stranskih odpadkov, možnost vpetosti v krožno gospodarstvo ter vecja kakovost in varnost koncnih izdelkov so kljucne zahteve pri razvoju novih tehnologij in tehnologija s subkriticnimi tekocinami po optimizaciji ekstrakcijske metode v splošnem ustreza vsem naštetim kriteri­jem. Pogosto uporabljano topilo je voda, saj je okolju prijazna, lahko dostopna in ekonomsko opravicljiva. Subkriticna voda ima v primerjavi z vodo pri nor-malnih pogojih posebne lastnosti, kot so manjša gostota, manjša dielektricna konstanta, vecja ioni­zacijska konstanta in nižja površinska napetost. V clanku predstavljamo proces ekstrakcije s subkriti-cno vodo ter možnosti njene uporabe za pridobi­vanje rastlinskih izvleckov. KLJUCNE BESEDE: ekstrakcija, rastlinski izvlecki, subkriticna voda ABSTRACT Reduced energy consumption, efficient conversion of reactants into products, less by-products and higher quality and safety of finished products are key requirements in the development of new tech­nologies, and subcritical fluid technology generally meets all these conditions after optimisation of the method. A frequently used solvent is water, as it is environmentally friendly, easily accessible and eco­nomically justifiable. Subcritical water has specific properties compared to water under normal condi­tions, such as lower density, lower dielectric con­stant, higher ionization constant and lower surface stress. In the article, we present the process of ex­traction with subcritical water and the possibilities of its use in the production of plant extracts. KEY WORDS: extraction, plant extracts subcritical water PREGLEDNI ZNANSTVENI CLANKI 1 UVOD Ekstrakcija s subkriticnimi tekocinami je med sodobnimi, okolju prijaznimi tehnologijami ekstrakcije pritegnila veliko pozornosti zaradi njihovih edinstvenih lastnosti, ki omogo-cajo razlicne možnosti uporabe. Uporaba subkriticne vode je še posebej zanimiva, ker je voda kot topilo netoksicna, nevnetljiva in dostopna (1, 2). V nadaljevanju bomo pred­stavili lastnosti subkriticne vode, postopek, prednosti in slabosti ekstrakcije s subkriticno vodo ter primere uporabe te tehnologije za pridobivanje rastlinskih izvleckov, ki na­kazujejo obetavne možnosti tudi za farmacevtsko, kozme-ticno in prehrambno industrijo. 2 LASTNOSTI SUBKRITICNE VODE Subkriticna voda je ucinkovito topilo, katalizator in reaktant za hidrolizne pretvorbe in ekstrakcije. Ekstrakcija poteka pri temperaturah med 100 in 374 °C in pri tlaku v obmocju do 220 bar, da vodo vzdržuje v tekocem stanju (slika 1). Pri temperaturi nad 374 °C in tlaku nad 220 barov pa voda preide v superkriticno stanje. Lastnosti vode pri normalnih pogojih ter v subkriticnem in superkriticnem stanju so pred­stavljene v preglednici 1 (3, 4, 5). S spremembo temperature ekstrakcije in tlaka se spremenijo lastnosti vode kot ekstrakcijskega topila. Voda je polarno topilo z dielektricno konstanto (e) 78,5 pri normalnih pogojih. Odgovorna je za dobro topnost in ekstrakcijo polarnih spojin EKSTRAKCIJA S SUBKRITICNO VODO ZA PRIDOBIVANJE RASTLINSKIh EKSTRAKTOV pri sobnih pogojih. Pri temperaturi med 100 in 374 °C (pod dovolj visokim pritiskom, da voda ostane v tekocem stanju) pa se dielektricna konstanta vode mocno zniža in posledicno voda postane primerna za ekstrakcijo tako polarnih kot ne­polarnih spojin. Na primer, v subkriticnem stanju se dielek­tricna konstanta vode zmanjša na približno 33 pri temperaturi 200 °C (15 bar). Ta vrednost je primerljiva dielektricni kon­stanti nekaterih organskih topil, na primer metanola (e = 32,6; normalni pogoji), ki ga pogosto uporabljamo za ekstrakcijo spojin zmerne polarnosti. Pri temperaturi 250 °C znaša die­lektricna konstanta vode 27, z nadaljnjim višanjem tempe­rature na 300 °C pa pade na 20 (3, 4). Z doseganjem nižje polarnosti pri povišanih temperaturah lahko tehnologija ekstrakcije s subkriticno vodo ustvari vi-soke izplene ekstrakcije in hiter cas ekstrakcije številnih hi-drofobnih organskih snovi (npr. etericnih olj, mašcobnih ki­slin in karotenoidov) (3). Slika 1: Fazni diagram vode z oznacenim predelom, kjer je voda v subkriticnem stanju; povzeto po viru (36). Figure 1: Water phase diagram with a marked area, where water is in subcritical state; adapted from (39). Preglednica 1: Lastnosti vode pri razlicnih pogojih (3). Table 1: Water properties under different conditions (3). Temperatura (°C) 25 350 400 Gostota (kgm-3) 997,45 625,45 577,79 Disociacijska konstanta (/) 14,0 11,5 11,5 Pri povišanih temperaturah v subkriticnem stanju se poleg polarnosti znatno zmanjšajo tudi gostota vode (preglednica 1), površinska napetost in viskoznost. Zmanjšanje povr­šinske napetosti omogoca povecano omocenje ekstrak­cijskega materiala z vodo in hitrejše raztapljanje ciljnih spo­jin. Zmanjšana viskoznost vode poveca njeno prodiranje (difuzijo) v ekstrakcijski material, kar prav tako pospeši ek­strakcijo (3). Z višanjem temperature pa se pojavijo tudi oksidacijske lastnosti vode. Najmocnejše so prav ob prehodu v super­kriticno stanje, kar lahko povzroci kemijske spremembe snovi, ki se lahko odrazijo v zmanjšani topnosti (npr. fenolov) (3). Poleg omenjenih lastnosti se spreminjajo tudi ionizacijske lastnosti vode glede na temperaturo. Disociacijska kon­stanta (Kw) vode se poveca od 1,0 × 10-14 pri 25 °C do 1,2 × 10-12 pri 350 °C. To pomeni, da se ph spremeni s približno 7,0 na 5,5 (3). Te edinstvene lastnosti subkriticne vode skupaj z dejstvom, da je voda kot topilo lahko dostopna, poceni, nestrupena, nevnetljiva in okolju prijazna, vodijo do uveljavljanja številnih nacinov uporabe za ekstrakcijo, locevanje in izolacijo razli-cnih spojin (3). Možnosti uporabe podrobneje opisujemo v podpoglavju 5. 3 POSTOPEK EKSTRAKCIJE 3.1 PARAMETRI Glavni parameter ekstrakcije s subkriticno vodo je tempe­ratura, saj se z njo spreminjajo glavne kemijsko-fizikalne lastnosti, opisane v podpoglavju 2. Tlak ima omejen vpliv na lastnosti topila, pomembno pa je, da ohranja topilo v tekocem stanju. Ostali pomembni parametri ekstrakcije so razmerje topila in ekstrakcijskega materiala, pretok topila, velikost delcev ekstrakcijskega materiala, cas ekstrakcije, mešanje in uporaba sotopila. Izbira ustreznih delovnih po­gojev je lažje dolocljiva, ko je znana narava spojin, ki jih bomo ekstrahirali (3, 5). 3.2 NAPRAVA Za ekstrakcijo s subkriticno vodo obstajata dve vrsti opreme: dinamicni (neprekinjeni pretocni) sistem in staticni (serijski) sistem (slika 2). Crpalka dinamicnega sistema do­vaja vodo skozi grelno tuljavo do ekstrakcijske posode. Na ta nacin se voda predhodno segreje na temperaturo ekstrakcije. Voda nato prehaja skozi ekstraktor do hladilne tuljave, kjer se zbira. Tlak sistema nadzoruje zracna teko-cinska crpalka s tlakom od 2 do 200 bar, ogrevanje pa pecica. Da preprecimo odtekanje vzorca oz. njegovo iz­gubo in morebitno zamašitev cevi, mora imeti posoda za ekstrakcijo sintrane filtre iz nerjavecega jekla vsaj pri izstopu vode iz ekstraktorja. Dinamicen in staticen sistem sta si zelo podobna glede postavitve peci, cevi in ventilov. V na­sprotju z dinamicnim sistemom pa staticni nima crpalke in je pod podtlakom dušika, da preprecimo oksidacijo vzorca. Cas zadrževanja subkriticne vode v dinamicni opremi je krajši kot v staticni opremi, kar ima za posledico manjšo razgradnjo termolabilnih komponent. Najvecja pomanjklji­vost dinamicnega sistema za ekstrakcijo s subkriticno vodo je, da je zaradi vecje kompleksnosti naprave dražji od sta­ticnega sistema. Omeniti velja še, da je poraba vode vecja pri dinamicnem sistemu. Glavne prednosti dinamicnega sistema pa so krajši cas zadrževanja ekstrakcijskega topila ter posledicno manjša razgradnja termolabilnih snovi in vecji izplen (5). 4 PREDNOSTI IN SLABOSTI EKSTRAKCIJE S SUBKRITICNO VODO Pri subkriticni ekstrakciji z vodo je cas ekstrakcije navadno krajši in poraba topila je manjša v primerjavi z obicajnimi metodami ekstrakcije za pridobivanje sorodnih ekstraktov, kar vodi do manjših obratovalnih stroškov. Poleg tega je subkriticna ekstrakcija z uporabo vode namesto organskih topil varen ter okolju prijazen postopek s široko uporab­nostjo za pridobivanje funkcionalnih živil ter kozmeticnih in farmacevtskih sestavin. Ekstrakti so v splošnem bolj kom­pleksni z vidika kemizma, saj ekstrahiramo polarne in tudi manj polarne spojine, subkriticna voda pa je v subkriticnih pogojih tudi bolj difuzivna, zato daje vecje izplene. Vendar pa je pri uvajanju te metode izredno pomembna optimizacija ekstrakcijskih razmer. Predolg cas segrevanja lahko povzroci termicno razgradnjo spojin. Prav tako je vecja možnost za potek drugih kemijskih reakcij, kot je Maillardova reakcija. Ce želimo koncni produkt v suhi obliki, je slabost tudi dodatni korak sušenja oz. koncentriranja, ki ga moramo izvesti po ekstrakciji, saj iz naprave po izvedeni ekstrakciji dobimo vodni ekstrakt. Zato je treba pred uvedbo ekstrakcije s subkriticno vodo v industrijskem ob-segu sestaviti natancen protokol, da zagotovimo stroško­ Slika 2: Shematski prikaz ekstraktorja s subkriticno vodo; a) dinamicni ekstraktor, b) staticni ekstraktor. Figure 2: Schematic representation of a subcritical water extractor; a) dynamic extractor, b) static extractor. vno ucinkovitost postopka. Velik strošek pa predstavlja tudi nakup take opreme (4, 6, 7). 5 MOžNOSTI UPORABE Tehnologija s subkriticno vodo je v zadnjih letih zelo razi­skovano podrocje in v prihodnosti pricakujemo vec novih možnosti uporabe. Trenutno so najbolj aktualne uporaba produktov v farmaciji, predvsem pri proizvodnji pripravkov rastlinskega izvora, v kozmeticni industriji ter v živilstvu. 5.1 EKSTRAKCIJA FENOLNIh SPOJIN Vecina trenutno objavljenih raziskav o ekstrakciji s subkriticno vodo je osredotocena na antioksidante, predvsem fenolne spojine iz razlicnih virov. Fenoli so razmeroma polarne spojine in spojine z razlicno termicno stabilnostjo, kar je treba upo­števati pri izbiri ustreznih ekstrakcijskih razmer (3). Antioksi­dativne fenolne spojine so s subkriticno vodo ekstrahirali iz semen granatnega jabolka (Punica granatum) (8), grozdnih tropin (Vitis vinifera) (9), korenike ingverja (Zingiber officinale) (10), olupkov krompirja (Solanum tuberosum) (11), cvetov rumene žametnice (Tagetes erecta) (12) in plodov vrste pa-paje (Vasconcellea pubescens) (13). Povecanje izplena ekstrakcije antioksidativnih spojin so v nekaterih primerih dosegli z dodatkom sotopila, kot je etanol, kislina ali baza. Ugotovili so, da sta temperatura nad 175 °C in dolg cas ekstrakcije povezana z vecjo antioksidativno aktivnostjo v primeru cvetov rumene žametnice (12). Glede na kemijsko naravo antioksidativnih spojin, prisotnih v rastlini, lahko razmere ekstrakcije prilagodimo tako, da nekatere spojine selektivno ekstrahiramo. Antocianidini in fenolne kisline so primeri rastlinskih sekundarnih metabo­litov z antioksidativnim delovanjem, ki jih je možno selekti­vno ekstrahirati (14), saj lahko temperaturo, tlak in cas ek­strakcije optimiziramo glede na število prostih hidroksilnih skupin v molekuli (14, 15). Na ta nacin so proucevali ek­strakcijo fenolnih spojin iz oplodja manga (Mangifera indica) (3), zeli vednozelenega gornika (Arctostaphylos uva-ursi) (3) in lubja cimeta (Cinnamomum zeylanicum) (3), ekstrak­cijo mircetina, kvercetina in kemferola iz crnega caja (3), rutina iz ajde (Fagopyrum esculentum) (4), izoksantohumola iz hmelja (Humulus lupulus) (16) ter hesperidina in narirutina iz lupin citrusov (17), pri cemer so v tej raziskavi štirikrat povecali izplen v primerjavi s klasicno ekstrakcijo. 5.2 PRIPRAVA DRUGIh OBOGATENIh EKSTRAKTOV Spreminjanje pogojev ekstrakcije s subkriticno vodo v od­visnosti od temperature, tlaka, pretoka in dodanega soto­pila so proucevali tudi za pripravo ekstraktov, obogatenih z laktoni iz korenine kave kave (Piper methysticum) (18), ter sladilnih spojin steviozidov iz listov stevije (Stevie re-baudiana) (19, 20). 5.3 EKSTRAKCIJA POLISAhARIDOV Polisaharidi so velika skupina strukturno raznolikih polime­rov, ki vkljucujejo npr. škrob, celulozo, sluzi in pektine. Za­radi visoke polarnosti so dobri kandidati za ekstrakcijo s subkriticno vodo. Tako so s to metodo pridobili pektine iz jabolcnih tropin in lupin citrusov (22), polisaharide iz na­vadne kustovnice ali goji (Lycium barbarum) (6), hemicelu­loze iz listov oljne palme (23) ter mono-in oligosaharide iz kokosove moke (24). 5.4 PRIDOBIVANJE ALKALOIDOV Alkaloidi so rastlinski sekundarni metaboliti s širokim spek­trom bioloških aktivnosti, ki vsebujejo dušik. Ugotavljanje njihove vsebnosti je pogosto potrebno za vrednotenje in zagotavljanje ustrezne kakovosti rastlinskih drog. Ekstrak­cijo s subkriticno vodo so uporabili za ekstrakcijo kinolizi­dinskih alkaloidov citizina, sofokarpina, matrina, soforidina in oksimatrina iz vrste sofore Sophora flavescens (25) ter za ekstrakcijo izokinolinskih alkaloidov hidrastina in berbe­rina iz kanadskega hidrasta (Hydrastis canadensis) (26). 5.5 PRIDOBIVANJE ETERICNIh OLJ Ekstrakcijo s subkriticno vodo kot metodo pridobivanja etericnih olj opredeljujeta krajši cas ekstrakcije in vecji od­stotek vsebnosti kisikovih spojin v primerjavi z etericnimi olji, pridobljenimi s parno destilacijo. Metodo so uporabili za pridobivanje etericnih olj zeli rožmarina (Rosmarinus of­ficinalis) (27), lista origana in bazilike (28), iz listov rastline Thymbra spicata, znane tudi pod imenom sredozemski ti-mijan (29), zeli vrtnega šetraja (Satureja hortensis) (30), zeli poprove mete (Mentha × piperita) (30), listov modrega ev­kalipta (Eucalyptus globulus) (31), zeli navadnega komarcka (Foeniculum vulgare) (32), semen koriandra (Coriandrum sativum) (33) in korenine ingverja vrste Zingiber cassumunar (34). V vseh primerih so sestavo etericnega olja, ki so ga proizvedli z ekstrakcijo s subkriticno vodo pri razlicnih tem­peraturah, primerjali s sestavo etericnega olja, pridoblje­nega z destilacijo. Na splošno so z ekstrakcijo s subkriticno vodo v krajšem casu pridobili vecji odstotek hlapnih polarnih spojin (21). 6 SKLEP Metoda ekstrakcije s subkriticno vodo sodi med uvelja­vljajoce se zelene, okolju prijazne tehnologije za pridobivanje ekstraktov iz rastlinskega materiala. Kljucna ekstrakcijska parametra sta temperatura (>100 °C), saj z višanjem tem­perature znižujemo dielektricno konstanto vode, in tlak, ki je potreben, da vodo vzdržujemo v tekocem stanju. Bi-stvenega pomena je tudi cas ekstrakcije, saj ob daljšanju casa pogosto pride do razgradnje želenih produktov. Gla­vna razlika v sestavi tako pridobljenih ekstraktov glede na klasicne metode je širši nabor ekstrahiranih spojin zaradi posebnih lastnosti vode v subkriticnem stanju. Metodo že uporabljajo za izdelavo izvleckov v kozmeticni industriji, najverjetneje pa ji bosta kmalu sledili tudi farmacevtska in prehrambna industrija. Predvsem v slednji bi lahko ek­strakcija s subkriticno vodo v prihodnosti še dodatno pri­dobila na pomenu zaradi možnosti uporabe v krožnem gospodarstvu. 7 LITERATURA 1. Maroun RG, Rajha HN, El Darra N, El Kantar S, Chacar S, Debs E, et al. Emerging technologies for the extraction of polyphenols from natural sources. In: Polyphenols: Properties, Recovery, and Applications. Elsevier; 2018. p. 265–93. 2. Chakraborty S, Shaik L, Gokhale JS. Subcritical Water: An Innovative Processing Technology. In: Innovative Food Processing Technologies. Elsevier; 2021. p. 552–66. 3. Cvjetko Bubalo M, Vidovic S, Radojcic Redovnikovic I, Jokic S. New perspective in extraction of plant biologically active compounds by green solvents. Vol. 109, Food and Bioproducts Processing. Institution of Chemical Engineers; 2018. p. 52–73. 4. Essien SO, Young B, Baroutian S. Recent advances in subcritical water and supercritical carbon dioxide extraction of bioactive compounds from plant materials. Vol. 97, Trends in Food Science and Technology. Elsevier Ltd; 2020. p. 156–69. 5. Jokic S, Aladic K, Šubaric D. Subcritical water extraction laboratory plant design and application. Environ Sci. 2018; 6. Chao Z, Ri-Fu Y, Tai-Qiu Q. Ultrasound-enhanced subcritical water extraction of polysaccharides from Lycium barbarum L. Sep Purif Technol. 2013 Dec 13;120:141–7. 7. Nastic N, Švarc-Gajic J, Delerue-Matos C, Barroso MF, Soares C, Moreira MM, et al. Subcritical water extraction as an environmentally-friendly technique to recover bioactive compounds from traditional Serbian medicinal plants. Vol. 111, Industrial Crops and Products. 2018. p. 579–89. 8. He L, Zhang X, Xu H, Xu C, Yuan F, Knez Ž, et al. Subcritical water extraction of phenolic compounds from pomegranate (Punica granatum L.) seed residues and investigation into their antioxidant activities with HPLC-ABTS + assay. Food Bioprod Process. 2012 Apr 1;90(2):215–23. 9. Monrad JK, Suárez M, Motilva MJ, King JW, Srinivas K, Howard LR. Extraction of anthocyanins and flavan-3-ols from red grape pomace continuously by coupling hot water extraction with a modified expeller. Food Res Int. 2014 Dec 1;65(PA):77–87. 10. Anisa NI, Azian N, Sharizan M, Iwai Y. Temperature effects on diffusion coefficient for 6-gingerol and 6-shogaol in subcritical water extraction. In: Journal of Physics: Conference Series. Institute of Physics Publishing; 2014. p. 012009. 11. Singh PP, Saldańa MDA. Subcritical water extraction of phenolic compounds from potato peel. Food Res Int. 2011 Oct 1;44(8):2452–8. 12. Xu H, Wang W, Jiang J, Yuan F, Gao Y. Subcritical water extraction and antioxidant activity evaluation with on-line HPLC­ABTS·+ assay of phenolic compounds from marigold (Tagetes erecta L.) flower residues. J Food Sci Technol [Internet]. 2015 Jun 29 [cited 2020 Oct 23];52(6):3803–11. 13. Uribe E, Delgadillo A, Giovagnoli-Vicună C, Quispe-Fuentes I, Zura-Bravo L. Extraction techniques for bioactive compounds and antioxidant capacity determination of chilean papaya (Vasconcellea pubescens) fruit. J Chem. 2015;2015. 14. Ko MJ, Cheigh CI, Chung MS. Relationship analysis between flavonoids structure and subcritical water extraction (SWE). Food Chem. 2014 Jan 15;143:147–55. 15. Lekar A V., Borisenko SN, Vetrova E V., Sushkova SN, Borisenko NI. Extraction of quercetin from Polygonum hydropiper L. by subcritical water. Am J Agric Biol Sci. 2013 Nov 23;9(1):1–5. 16. Gil-Ramírez A, Mendiola JA, Arranz E, Ruíz-Rodríguez A, Reglero G, Ibáńez E, et al. Highly isoxanthohumol enriched hop extract obtained by pressurized hot water extraction (PHWE). Chemical and functional characterization. Innov Food Sci Emerg Technol. 2012 Oct;16:54–60. 17. Cheigh CI, Chung EY, Chung MS. Enhanced extraction of flavanones hesperidin and narirutin from Citrus unshiu peel using subcritical water. J Food Eng. 2012 Jun 1;110(3):472–7. 18. Kubátová A, Miller DJ, Hawthorne SB. Comparison of subcritical water and organic solvents for extracting kava lactones from kava root. J Chromatogr A. 2001 Jul 20;923(1– 2):187–94. 19. Teo CC, Tan SN, Yong JWH, Hew CS, Ong ES. Validation of green-solvent extraction combined with chromatographic chemical fingerprint to evaluate quality of Stevia rebaudiana Bertoni. J Sep Sci. 2009;32(4):613–22. 20. Yildiz-Ozturk E, Tag O, Yesil-Celiktas O. Subcritical water extraction of steviol glycosides from Stevia rebaudiana leaves and characterization of the raffinate phase. J Supercrit Fluids. 2014 Nov 1;95:422–30. 21. Abdelmoez W, Abdelfatah R. Therapeutic Compounds From Plants Using Subcritical Water Technology. In: Water Extraction of Bioactive Compounds: From Plants to Drug Development. Elsevier; 2017. p. 51–68. 22. Wang X, Chen Q, Lü X. Pectin extracted from apple pomace and citrus peel by subcritical water. Food Hydrocoll. 2014 Jul 1;38:129–37. 23. Norsyabilah R, Hanim SS, Suhaila N, Noraishah A, Kartina S. Subcritical water extraction of monosaccharides from oil palm fronds hemicelluloses (Pengekstrakan Air Subgenting Daripada Monosakarida Dari Hemiselulosa Pelepah Kelapa Sawit). Vol. 17, The Malaysian Journal of Analytical Sciences. 2013. 24. Khuwijitjaru P, Pokpong A, Klinchongkon K, Adachi S. Production of oligosaccharides from coconut meal by subcritical water treatment. Int J Food Sci Technol. 2014 Aug 1;49(8):1946–52. 25. Wang H, Lu Y, Chen J, Li J, Liu S. Subcritical water extraction of alkaloids in Sophora flavescens Ait. and determination by capillary electrophoresis with field-amplified sample stacking. J Pharm Biomed Anal. 2012 Jan 25;58(1):146–51. 26. Mokgadi J, Turner C, Torto N. Pressurized Hot Water Extraction of Alkaloids in Goldenseal. Am J Anal Chem. 2013;04(08):398– 403. 27. Herrero M, Plaza M, Cifuentes A, Ibáńez E. Green processes for the extraction of bioactives from Rosemary: Chemical and functional characterization via ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and in-vitro assays. J Chromatogr A. 2010 Apr;1217(16):2512–20. 28. Yang Y, Kayan B, Bozer N, Pate B, Baker C, Gizir AM. Terpene degradation and extraction from basil and oregano leaves using subcritical water. J Chromatogr A. 2007 Jun 8;1152(1–2):262– 7. 29. Ozel MZ, Gogus F, Lewis AC. Subcritical water extraction of essential oils from Thymbra spicata. Food Chem. 2003 Aug 1;82(3):381–6. 30. Kubatova A, Lagadec AJM, Miller DJ, Hawthorne SB. Selective extraction of oxygenates from savory and peppermint using subcritical water. Flavour Fragr J. 2001 Jan 1;16(1):64–73. 31. Jiménez-Carmona MM, Luque de Castro MD. Isolation of eucalyptus essential oil for GC-MS analysis by extraction with subcritical water. Chromatographia. 1999;50(9–10):578–82. 32. Gámiz-Gracia L, Luque de Castro MD. Continuous subcritical water extraction of medicinal plant essential oil: Comparison with conventional techniques. Talanta. 2000 May 5;51(6):1179– 85. 33. Eikani MH, Golmohammad F, Rowshanzamir S. Subcritical water extraction of essential oils from coriander seeds (Coriandrum sativum L.). J Food Eng. 2007 May 1;80(2):735– 40. 34. Chienthavorn O, Poonsukcharoen T, Pathrakorn T. Pressurized Liquid and Superheated Water Extraction of Active Constituents from Zingiber cassumunar Roxb. Rhizome. Sep Sci Technol. 2011 Feb 25;46(4):616–24. 1 UVOD Peroralne farmacevtske oblike so namenjene dostavi zdra­vilnih ucinkovin v dolocene dele prebavil bodisi za lokalno TEhNOLOšKE MOžNOSTI ZA DOSTAVO ZDRAVILNIh UCINKOVIN V DEBELO CREVO S PERORALNIMI FARMACEVTSKIMI OBLIKAMI APPROAChES TO ORAL COLON-SPECIFIC DRUG DELIVERY AVTORICI / AUThORS: Sara Brunec, mag. farm.1,2 prof. dr. Mirjana Gašperlin, mag. farm.2 1 Krka, d. d., Novo mesto, Šmarješka cesta 6, 8501 Novo mesto 2 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Aškerceva cesta 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E mail: sara.brunec@gmail.com POVZETEK Farmacevtske oblike s prirejenim sprošcanjem so po peroralnem vnosu na poti do debelega crevesja izpostavljene razlicnim dejavnikom. Za dostavo zdravilnih ucinkovin v debelo crevo morajo biti do-stavni sistemi zasnovani tako, da omogocijo sproš-canje zdravilnih ucinkovin šele v debelem crevesju, kjer lahko le-te delujejo bodisi lokalno bodisi sistem­sko po absorpciji. V prispevku predstavljamo pred­nosti in slabosti dostave zdravilnih ucinkovin v de­belo crevo po peroralni poti. KLJUCNE BESEDE: debelo crevo, dostava zdravilnih ucinkovin, pero­ralne farmacevtske oblike, prebavni trakt ABSTRACT After ingestion, controlled release oral dosage forms are exposed to different physiological factors. Colon-specific drug delivery systems have to be designed to enhance drug delivery to the colon. Oral route of drug administration can be used for both the systemic drug delivery and treating local gastrointestinal diseases. This review describes the physiological, pathophysiological and pharmaceu­tical considerations regarding drug delivery to the colon for the oral route of administration, as well as conventional and novel drug delivery approaches. KEY WORDS: colon, drug delivery gastrointestinal tract, oral do­sage forms PREGLEDNI ZNANSTVENI CLANKI bodisi za sistemsko zdravljenje bolezni (1). Ob porastu pri­merov bolezni debelega crevesja v zadnjih desetletjih je aktualna tema razvoj farmacevtskih oblik za ciljano dostavo v debelo crevo, predvsem zaradi ucinkovitosti zdravljenja ob socasnem zmanjšanju pojava sistemskih neželenih ucin­kov (1, 2). Ciljana dostava v debelo crevo pa je zanimiva tudi za sistemsko zdravljenje z zdravilnimi ucinkovinami, obcutljivimi na pogoje v zgornjih delih prebavnega trakta (2). Pri nacrtovanju farmacevtskih oblik za ciljano dostavo v debelo crevo je potrebno poleg lastnosti zdravilnih ucin­kovin upoštevati vec dejavnikov, ki vplivajo na sprošcanje zdravilnih ucinkovin iz farmacevtskih oblik in na absorpcijo v krvni obtok v primeru želenega sistemskega delovanja (1, 2). Pomembni dejavniki so cas zadrževanja farmacevt­ske oblike v posameznem delu prebavnega trakta, spre­minjanje ph vrednosti, encimska aktivnost, prisotnost mi-kroorganizmov, hrane in socasno apliciranih zdravilnih ucin­kovin, površina za absorpcijo in prekrvavljenost dela pre­bavnega trakta, kjer poteka absorpcija zdravilne ucinkovine v krvni obtok, razpoložljivost vode za raztapljanje zdravilne ucinkovine, prisotnost receptorjev ali prenašalcev za tran­sport zdravilne ucinkovine ter bolezenska stanja (1–5). 2 DOSTAVA ZDRAVILNIH UCINKOVIN V DEBELO CREVO PO PERORALNI APLIKACIJI Glavne funkcije prebavnega trakta so prebava zaužite hrane, absorpcija hranil in izlocanje odpadnih produktov (1). Zaužita hrana po požiralniku, ob delovanju peristaltike, preide v želodec, kjer je podvržena mehanskim vplivom, pod vplivom klorovodikove kisline in encimov (predvsem peptidaz) pa poteka kemijska razgradnja hranil do manjših gradnikov. Tanko crevo je najdaljši del prebavil, ki ima veliko površino zaradi izrastkov, imenovanih resice oz. vili (6). Glavna funkcija tankega crevesja je prebava in absorpcija hranilnih snovi, soli in vode (6). V debelem crevesju potekajo absorpcija, sekrecija in transport (6). Skozi usta zaužite farmacevtske oblike potujejo po prebavnem traktu po isti poti kakor hrana in so prav tako podvržene razlicnim de­javnikom in spreminjajocim se pogojem v razlicnih delih prebavil. Dostava zdravilnih ucinkovin v debelo crevo je uporabna tako za lokalno zdravljenje bolezni debelega cre-vesja, kot so kolorektalni rak, sindrom razdražljivega cre-vesja in kronicna vnetna crevesna bolezen (7), kot tudi za sistemsko zdravljenje z zdravilnimi ucinkovinami, ki niso stabilne v kislih pogojih (želodec) ali so podvržene encimski razgradnji v zgornjih delih prebavnega trakta (na primer proteini in peptidi) (2). Sluznica debelega crevesja je gladka in v primerjavi s tankim crevesjem nima resic. Prav tako ne vsebuje Panethovih celic, ki v tankem crevesju izlocajo ra­zlicne produkte, pomembne za vzdrževanje crevesne flore in obrambne funkcije crevesja (6). Med epitelijskimi celicami debelega crevesja so cašaste celice, ki izlocajo zašcitno sluz (6). Sluznico debelega crevesja naseljuje veliko število razlicnih vrst bakterij; med najbolj zastopanimi so bakterije iz rodov Bacteroides, Bifidumbacteria, Clostridium, Prevo­tella, Porphyromonas, Eubacterium, Ruminococcus, Strep­tococcus, Enterobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Fusobacteria in Peptostreptococcus (1, 8). Glavne prednosti peroralnih farmacevtskih oblik za ciljano dostavo v debelo crevo so: TEhNOLOšKE MOžNOSTI ZA DOSTAVO ZDRAVILNIh UCINKOVIN V DEBELO CREVO S PERORALNIMI FARMACEVTSKIMI OBLIKAMI • dostava zdravilne ucinkovine neposredno na mesto de­lovanja za lokalno zdravljenje, • boljši terapevtski ucinek lokalnega zdravljenja zaradi mi-nimiziranja izgub ob prehodu zgornjega dela prebavnega trakta, • zaradi manjših izgub je možen manjši odmerek, kar zmanjšuje tveganje za pojav sistemskih neželenih ucinkov, • manj interakcij z zdravilnimi ucinkovinami, ki se sprošcajo na drugih mestih v prebavilih, • manjši vpliv na zdravilne ucinkovine (npr. proteinske in peptidne zdravilne ucinkovine), obcutljive na kisline in encime, prisotne v vecji meri v zgornjem delu prebavnega trakta, in posledicno vecja biološka uporabnost teh zdra­vilnih ucinkovin v primeru sistemskega zdravljenja, • boljša sodelovalnost bolnikov pri zdravljenju s peroralnimi farmacevtskimi oblikami v primerjavi s parenteralnimi ali rektalnimi (2, 7, 9, 10). Pri oblikovanju dostavnih sistemov za ciljano dostavo zdra­vilnih ucinkovin v debelo crevo po peroralni poti se soo-camo z razlicnimi izzivi. Zdravilne ucinkovine so ob prehodu skozi prebavni trakt izpostavljene metabolizmu prvega pre­hoda in razlicnim dejavnikom, ki vplivajo na stabilnost, top-nost in absorpcijo (npr. vplivi na ph – del prebavnega trakta, hrana, zdravila, starost; vplivi na cas prehoda vzdolž prebavnega trakta – hrana, pomožne snovi, viskoznost crevesne vsebine; adsorpcija zdravilne ucinkovine na mo-lekule iz hrane – pektini in vlaknine; vezava zdravilne ucin­kovine na kovinske ione; encimska razgradnja zdravilne ucinkovine) (1, 11). Primarno je potrebno prepreciti neže­leno sprošcanje zdravilne ucinkovine iz dostavnega sistema že v zgornjih delih prebavnega trakta, pri cemer moramo upoštevati fiziološke in patofiziološke znacilnosti prebav­nega trakta (2). Fiziološke znacilnosti se nanašajo predvsem na spreminjajoce se ph vrednosti vzdolž prebavnega trakta, cas zadrževanja zaužite vsebine v posameznih delih pre­bavnega trakta in gibljivost crevesja, prisotnost vode, en-cimov, mikroorganizmov in zaužite hrane ter permeabilnost barier (2). Patofiziološke znacilnosti so povezane s specifi-cnimi pogoji ob razlicnih boleznih – tako so npr. pri bolnikih s crevesnimi boleznimi ravni reaktivnih kisikovih zvrsti in vnetnih citokinov višje v primerjavi z zdravimi posamezniki, izraženo je neravnovesje pomembnih antioksidantov v te­lesu, sluznica prebavil je prizadeta in ima posledicno spre­menjeno permeabilnost (2). Pri peroralnih farmacevtskih oblikah je nastop ucinka zaradi potrebnega casa za ab-sorpcijo zdravilne ucinkovine kasnejši v primerjavi z neka­terimi drugimi farmacevtskimi oblikami (npr. intravenske injekcije). Peroralne farmacevtske oblike so zato manj pri­merne za zdravljenje pri nujnih stanjih (1). Slabost peroralnih farmacevtskih oblik je lahko tudi neprijeten okus zdravilne ucinkovine ali draženje želodcne sluznice (1). Debelo crevo predstavlja poseben izziv za dostavo zdra­vilnih ucinkovin, saj je vode v lumnu zaradi obsežne ab-sorpcije malo, prisotna pa je zelo viskozna zašcitna sluz, ki otežuje solubilizacijo zdravilnih ucinkovin (3, 12). Ciljano dostavo zdravilnih ucinkovin v debelo crevo lahko zagoto­vimo z izbiro primernega dostavnega sistema, ki ga je po­trebno nacrtovati na podlagi fizikalno-kemijskih lastnosti zdravilne ucinkovine, lastnosti polimerov in ostalih pomožnih snovi, ki sestavljajo dostavni sistem ter patofiziologije same bolezni (4, 13). Dodatno omejujoc dejavnik je v nekaterih primerih zahtevna tehnologija izdelave dostavnih sistemov, ki je povezana z visokimi stroški (1–3, 5, 14). Za nekatere dostavne sisteme obstaja tudi premalo podatkov o njihovi varnosti (15). 3 PRISTOPI ZA OBLIKOVANJE DOSTAVNIH SISTEMOV ZA DOSTAVO ZDRAVILNIH UCINKOVIN V DEBELO CREVO Izbira primernega sistema za dostavo zdravilnih ucinkovin v debelo crevo je odvisna od kemijske strukture, stabilnosti, porazdelitvenega koeficienta, funkcionalnih skupin in drugih lastnosti zdravilne ucinkovine, patofiziologije bolezni ter fizi­kalno-kemijskih lastnosti pomožnih snovi (1–3). Razlicni na­ravni, sintezni in polsintezni polimeri lahko zdravilno ucinkovino v dostavnem sistemu ustrezno zašcitijo pred spremembami ph in encimsko aktivnostjo vzdolž prebavnega trakta. Polimeri so pomembne sestavine razlicnih dostavnih si­stemov – od klasicnih ogrodnih do kompleksnejših osmot­sko nadzorovanih sistemov (8). Dodatne možnosti dostave zdravilnih ucinkovin v debelo crevo v zadnjem casu omo­goca tudi nanotehnologija (8). Z izbranimi pomožnimi snovmi lahko nadzorujemo cas zacetka sprošcanja zdra­vilne ucinkovine, medtem ko je mesto sprošcanja lahko pogojeno tudi s prisotnostjo dolocenih mikroorganizmov in reaktivnih kisikovih zvrsti ter tlaka v prebavni cevi (13). V nadaljevanju bomo predstavili naslednje primere dostav­nih sistemov za dostavo zdravilnih ucinkovin v debelo crevo: • na ph obcutljive dostavne sisteme, • casovno odvisne dostavne sisteme, • dostavne sisteme, odvisne od mikroorganizmov oz. nji­hovih encimov (biorazgradljivi polimeri, predzdravila), • dostavne sisteme, odvisne od tlaka v prebavni cevi, • osmotsko nadzorovane dostavne sisteme, • bioadhezivne dostavne sisteme. 3.1 NA ph OBCUTLJIVI DOSTAVNI SISTEMI Vrednosti ph se razlikujejo glede na odsek prebavnega trakta, kar lahko izkoristimo pri nacrtovanju dostavnih si­stemov. V želodcu je ph na tešce med 1,5 in 2 (1), po obroku ali ob dolocenih bolezenskih stanjih pa lahko znatno poraste (16). V dvanajstniku je ph okrog 6, najvišji ph – okrog 7,4 – pa je normalno v koncnem delu tankega cre-vesja (ileumu) (1). Na zacetku debelega crevesja v navzgor­njem kolonu lahko ph pade malo pod 6 (1), v danki pa so vrednosti okrog 6,7 (1). Znižanje ph ob prehodu iz tankega crevesja v debelo crevo je posledica prisotnosti kratkover­ižnih mašcobnih kislin, ki nastajajo ob bakterijski razgradnji polisaharidov ter oligosaharidov in vplivajo tudi na peristal-ticno aktivnost (9, 17–19). Mehanizem sprošcanja zdravilne ucinkovine iz na ph ob­cutljivih dostavnih sistemov temelji na strukturnih spre­membah polimerov v dolocenem obmocju ph (nevtralni ali rahlo alkalni ph). Tovrstne polimere lahko pri tabletah in kapsulah uporabimo v oblogah, ki nadzorujejo sprošcanje bodisi pri enoenotnih bodisi pri vecenotnih farmacevtskih oblikah, in morajo biti odporne na nizke vrednosti ph v že­lodcu in v proksimalnem delu tankega crevesja; v termi­nalnem delu ileuma in na prehodu v debelo crevo pa pod vplivom višjega ph pride do strukturnih sprememb poli­merov in sprošcanja zdravilne ucinkovine. Primerni so ko­polimeri metakrilne kisline in derivati hidroksipropilmetilce­luloze (1, 2). Pri nižjem ph netopna obloga ob prehajanju zgornjega dela prebavnega trakta šciti zdravilno ucinkovino pred želodcnimi sokovi, žolcem in mikroorganizmi, medtem ko višje vrednosti ph sprožijo raztapljanje obloge in posle-dicno sprošcanje zdravilne ucinkovine iz dostavnega si­stema in s tem zagotavljajo prirejeno sprošcanje (1). Druga možnost je vgradnja na ph obcutljivih polimerov v ogrodne sisteme, pri katerih prihaja v dolocenem ph obmocju do erozije oz. raztapljanja polimera in s tem do difuzije zdravilne ucinkovine iz farmacevtske oblike (1, 3, 8, 20). Kljucni de­javniki pri nacrtovanju na ph obcutljivih dostavnih sistemov so uporaba kombinacij razlicnih polimerov, upoštevajoc kolicino uporabljenega polimera, uporaba plastifikatorjev, variabilnost vrednosti ph prebavnega trakta pri posamez­niku in med posamezniki, koncentracija elektrolitov in cas prehoda crevesne vsebine (1, 17). Slabost na ph obcutljivih dostavnih sistemov je, da se ph med posamezniki ali celo pri isti osebi na istem mestu v prebavni cevi lahko spreminja (npr. zaradi prisotnosti hrane, bolezni, starosti, cirkadianega ritma in drugih socasno zau­žitih zdravil) (1, 7). Posledicno lahko padec vrednosti ph na zacetku debelega crevesja prepreci sprošcanje zdravilne ucinkovine ali pa se zdravilna ucinkovina iz dostavnega si­stema zacne sprošcati že v spodnjem delu tankega cre-vesja, (2, 3, 7, 13, 17, 21). 3.2 CASOVNO ODVISNI DOSTAVNI SISTEMI Casovno odvisni dostavni sistemi sprostijo zdravilno ucin­kovino po dolocenem casu ali v vec casovnih tockah. Tak­šni dostavni sistemi so uporabni v primerih, ko je zaželeno, da se zdravilna ucinkovina sprosti iz farmacevtske oblike ob tocno dolocenem casu ali na dolocenem mestu v pre­bavni cevi glede na predviden cas prehoda crevesne vse­bine (14). Mehanizem casovno odvisnega sprošcanja je možno doseci z uporabo hidrofilnih polimerov (etilceluloza, hidroksipropilmetilceluloza), ki postopoma nabrekajo in omogocajo zakasnitev sprošcanja zdravilne ucinkovine (1). Sprošcanje zdravilne ucinkovine je nadzorovano z nabre­kanjem polimera, ki v stiku z vodo tvori gel, vdiranjem vode v ogrodje, raztapljanjem zdravilne ucinkovine in njenim pre­hajanjem skozi nabreklo polimerno plast ter erozijo ogrodja (1). Patentirani so tudi naprednejši sistemi, ki imajo dodatne mehanizme sprošcanja – npr. od ph in casovno odvisno sprošcanje (1, 3, 22). Primer sistema s kombiniranim me-hanizmom sprošcanja je sistem, sestavljen iz nerazgradlji­vega telesa kapsule, cepa iz hidrogela, ki zapira odprti del telesa kapsule, in v vodi topne kapice kapsule, ki pokriva cep iz hidrogela. Cela kapsula ima še gastrorezistentno oblogo, ki se pod vplivom ph okolja razgradi v tankem crevesju. Kapica kapsule se ob stiku z vodo raztopi, nato zacne hidrogel nabrekati in se po dolocenem casu iztisne iz telesa kapsule, zdravilna ucinkovina, ki se nahaja v telesu kapsule, pa se sprosti. Cas nabrekanja hidrogela doloca casovni zamik sprošcanja zdravilne ucinkovine (1, 3, 22). Slabost casovno odvisnih dostavnih sistemov je velika va­riabilnost v casu prehoda vzdolž posameznih delov pre­bavnega trakta, še zlasti v prisotnosti zaužite hrane. Cas prehajanja je odvisen od fizioloških in patofizioloških de­javnikov (npr. pospešeno prehajanje skozi debelo crevo pri razdražljivem crevesju) (1). 3.3 OD MIKROORGANIZMOV ODVISNI DOSTAVNI SISTEMI Ti sistemi temeljijo na specificnih encimskih reakcijah, ki lahko potekajo v debelem crevesju zaradi prisotnosti mi-kroorganizmov. Encimi mikroorganizmov lahko razgradijo vezi v ogljikovih hidratih in proteinih. V debelem crevesju so dolocili preko 400 razlicnih rodov bakterij, od katerih jih je 20do30% iz rodu Bacteroides. Druge pomembne anaerobne bakterije so še iz rodov Bifidobacterium, Eu-bacterium, Enterococcus, Peptostreptococcus, Rumino-coccus in Clostridium. Encimi, ki jih izlocajo, v glavnem katalizirajo hidrolize (esteraze, amidaze, glikozidaze, glu­kuronidaze, sulfataze) in redukcije (nitroreduktaze, azore­duktaze, sulfoksid reduktaze, hidrogenaze) (1–3, 17, 20). Prvi možni pristop je nacrtovanje predzdravil, kjer lahko z ve­zavo ustreznih funkcionalnih skupin na molekulo zdravilne ucinkovine dosežemo farmakološko aktivno obliko po en-cimski razgradnji v debelem crevesju (1, 3, 14). Predmet proucevanja je bila predvsem azoreduktazna aktivnost bakterij v debelem crevesju (1). Pri tem pristopu lahko poleg ciljane dostave zdravilne ucinkovine v debelo crevo izboljšamo tudi njene topnost, permeabilnost in stabilnost (1). Ta pristop iz­korišcajo npr. farmacevtske oblike s predzdravili 5-aminosa­licilne kisline (sulfasalazin, olsalazin), ki jih uporabljamo za zdravljenje kronicnih vnetnih crevesnih bolezni. Sulfasalazin se slabo absorbira v zgornjih delih prebavnega trakta, v de­belem crevesju pa se v prisotnosti azoreduktaz razgradi do 5-aminosalicilne kisline, ki deluje pri zdravljenju kronicnih vne­tnih crevesnih bolezni (1). Drug pristop vkljucuje uporabo polimerov v ogrodnih ali rezervoarnih dostavnih sistemih. Po-lisaharidi so lahko rastlinskega (gvarjev gumi, inulin) ali žival­skega izvora (hitosan, hondroitin sulfat), pridobljeni iz alg (al­ginati) ali s pomocjo mikroorganizmov (dekstran) (3, 14, 20). Neškrobni polisaharidi so odpornejši na razgradnjo v tankem crevesju in se razgradijo v debelem crevesju (1). hidrofilni polimeri privzamejo vodo in nabrekajo med pomikanjem po prebavnem traktu. Omogocajo prehajanje bakterij in/ali en-cimov skozi hidratirano plast, kar sproži razgradnjo polimera in sprostitev zdravilne ucinkovine iz farmacevtske oblike (1). Slabost dostavnih sistemov, odvisnih od mikroorganizmov, je premajhna specificnost sprošcanja zdravilne ucinkovine, predvsem zaradi prisotnosti velikega števila vrst bakterij vzdolž celotnega prebavnega trakta in variabilnosti v za­stopanosti posameznih rodov bakterij pri posameznikih v odvisnosti od fizioloških in patofizioloških sprememb. Pa-tofiziološke spremembe v crevesni mikroflori lahko nastajajo npr. zaradi bolezni crevesja ali uporabe antibiotikov. Po-sledica spremembe v številu in zastopanosti bakterij je spremenjeno izlocanje encimov, ki so pomembni za sproš-canje zdravilne ucinkovine iz dostavnega sistema. V neka­terih primerih pa zaradi hitrega prehoda farmacevtske oblike skozi prebavni trakt encimi nimajo na voljo dovolj casa za delovanje (npr. v primeru diareje) (1). Pri dostavnih sistemih z mocno hidrofilnimi polimeri lahko v prisotnosti vode pride tudi do neželenega predcasnega sprošcanja zdravilne ucin­kovine iz farmacevtske oblike, zato so raziskovalci prou-cevali možnosti kemijskih modifikacij polisaharidov in kom­biniranja s hidrofobnimi polimeri (1). Za optimalno sprošcanje zdravilne ucinkovine je kljucno ravnotežje med hidrofilnimi in hidrofobnimi lastnostmi polimerov. Polimeri, ki so manj vodotopni, lahko sicer dlje zadržijo zdravilno ucinkovino znotraj dostavnega sistema, vendar se lahko tudi prepozno razgradijo. Pri nacrtovanju takšnih sistemov je pomembno, da preprecimo predcasno sprošcanje zdra­vilne ucinkovine v želodcu ali tankem crevesju in prepozno sprošcanje v samem debelem crevesju (1–3, 14). 3.4 TLACNO NADZOROVANI DOSTAVNI SISTEMI Presnovo hrane v prebavni cevi spremlja ritmicno krcenje gladkega mišicja vse od požiralnika do konca debelega crevesja. Za razliko od pogostejših peristalticnih valov v drugih delih prebavne cevi se le-ti v debelem crevesju izrazijo na kratko in le tri-do štirikrat dnevno, vendar so mocnejši in tako pomembno zvišajo tlak v lumnu debelega crevesja. Primer dostavnega sistema, ki ima vgrajen mehanizem sprošcanja zdravilne ucinkovine glede na okoliški tlak, je kapsula z ovojnico iz etilceluloze, netopne v vodi (14). Poli­merna kapsula razpade pod vplivom visokega tlaka v lumnu debelega crevesja, kljucni dejavniki pri oblikovanju pa so debelina ovojnice kapsule in velikost kapsule (3, 14). Izziv pri nacrtovanju tlacno nadzorovanih dostavnih siste­mov je doseci ustrezno raztapljanje zdravilne ucinkovine, kar je v normalnih pogojih oteženo zaradi obilne reabsorp­cije vode in posledicno velike viskoznosti crevesne vsebine v debelem crevesju. V opisanem dostavnem sistemu v obliki kapsule z ovojnico iz etilceluloze je možna rešitev te­koca vsebina z raztopljeno zdravilno ucinkovino (14). 3.5 OSMOTSKO NADZOROVANI DOSTAVNI SISTEMI Osmotsko nadzorovani sistemi so sestavljeni iz jedra z zdravilno ucinkovino in osmotsko aktivne pomožne snovi (osmogen). Obdani so s polprepustno membrano, ki nad­zoruje vstopanje vode v jedro. S hidratacijo in nabrekanjem osmogena narašca osmotski pritisk znotraj farmacevtske oblike in povzroca sprošcanje zdravilne ucinkovine skozi eno ali vec odprtin (3, 4, 17). Tudi osmotsko nadzorovane sisteme je zaradi razlicnih ca-sov prehoda skozi prebavno cev izziv nacrtovati tako, da se zdravilna ucinkovina sprosti na izbranem mestu. Teh­nologija je zahtevna in povezana z višjimi proizvodnimi stro­ški (3, 14). 3.6 BIOADhEZIVNI DOSTAVNI SISTEMI Cilj nacrtovanja bioadhezivnih sistemov je podaljšati cas stika dostavnega sistema s površino sluznice debelega crevesja, da se lahko sprosti cim vec zdravilne ucinkovine (14, 23). Polimeri, ki so jih uporabili v raziskavah bioadhe­zivnih dostavnih sistemov, so polikarbofili, poliuretani in polietilen oksid (3). Ahmad in sodelavci (3, 24) so uporabili škrob iz sorte riža Assam Bora za dostavo metronidazola v debelo crevo v obliki bioadhezivnih mikrodelcev. Bioad­hezivni sistemi omogocajo podaljšan stik zdravilne ucin­kovine z mestom delovanja oz. absorpcije, so manj pod-vrženi encimskih reakcijam in zaradi manj pogostega jemanja zdravila omogocajo vecje sodelovanje bolnikov pri zdravljenju (3, 25). Izzivi pri oblikovanju tovrstnih dostavnih sistemov so doseganje bioadhezije na želenem mestu de­lovanja in izbira biokompatibilnih polimerov (3, 25). 4 TRENDI RAZVOJA DOSTAVNIH SISTEMOV ZA DOSTAVO ZDRAVILNIH UCINKOVIN V DEBELO CREVO Zaradi premajhne specificnosti oziroma neželenega sproš-canja zdravilnih ucinkovin tudi na drugih mestih v prebav­nem traktu in s tem povezanimi neželenimi ucinki zdravil raziskovalci proucujejo nove možnosti za nacrtovanje pe­roralnih dostavnih sistemov za dostavo zdravilnih ucinkovin v debelo crevo. Alternativni pristopi vkljucujejo nacrtovanje dostavnih sistemov, ki so v organizmu odvisni od dveh ali vec dejavnikov (npr. vrednost ph in casovna odvisnost, vrednost ph in prisotnost dolocenih mikroorganizmov) (1). Patentirali so razlicne sisteme, ki so tehnološko rezervoarni ali ogrodni sistemi, na voljo kot eno-ali vecenotne farma­cevtske oblike (1). Skupna znacilnost teh sistemov je izbira pomožnih snovi, ki zagotavljajo vsaj dvojni nadzor sproš-canja zdravilne ucinkovine iz dostavnega sistema in s tem doseganje mestno specificnega delovanja v debelem cre-vesju (1, 3, 4, 13, 14, 21). Nekatere pomembne prednosti imajo dostavni sistemi, osnovani na nanotehnologiji. Na-nodelci lahko zaradi manjše velikosti lažje in hitreje prodrejo v vnetno tkivo, ki je znacilno za kronicne vnetne crevesne bolezni, v primerjavi z vecjimi dostavnimi sistemi bodisi za­radi vecje permeabilnosti patoloških tkiv bodisi jih privza­mejo vnetne celice imunskega sistema (1, 7). Majhnost dostavnega sistema je v primeru hitrega privzema v vnetna tkiva ali celice prednost tudi v primeru driske, ki pri vecjih farmacevtskih oblikah lahko povzroci prehitro izlocanje le­teh iz telesa (1). Nanodelci v primerjavi z vecjimi dostavnimi sistemi teoreticno lahko dosežejo enak ali boljši terapevtski ucinek že pri nižjih odmerkih vgrajene zdravilne ucinkovine (1). Pri inovativnih pristopih oblikovanja dostavnih sistemov na osnovi nanotehnologije pa je potrebno še dodatno vred­notenje varnosti, saj so tovrstni podatki omejeni (1). 5 SKLEP Predstavljeni dostavni sistemi so iztocnica za razmišljanje o novih možnih pristopih nacrtovanja dostavnih sistemov za dostavo zdravilnih ucinkovin v debelo crevo, ki postaja vse pomembnejše mesto delovanja zdravilnih ucinkovin – po eni strani zaradi optimizacije lokalnega zdravljenja bolezni debe­lega crevesja, po drugi strani kot raziskovanje novih možnosti dostave zdravilnih ucinkovin za sistemsko zdravljenje. Izzivi za oblikovanje ucinkovitih dostavnih sistemov za dostavo zdravilnih ucinkovin v debelo crevo segajo vse od fizioloških preprek (ph, cas prehoda crevesne vsebine, prisotnost en-cimov in mikroorganizmov) do zagotovitve varnosti ter ne­nazadnje ekonomike industrijske proizvodnje. Pristopi kom­biniranja vec mehanizmov sprošcanja zdravilnih ucinkovin (npr. s pomocjo mikroorganizmov in razlicne vrednosti ph) so ucinkovitejši od pristopov s samo enim mehanizmom. 6 LITERATURA 1. Hua S. Advances in Oral Drug Delivery for Regional Targeting in the Gastrointestinal Tract -Influence of Physiological, Pathophysiological and Pharmaceutical Factors. Front Pharmacol [Internet]. 2020 Apr 28 [cited 2021 Mar 9];11. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7212533/ 2. Lee SH, Bajracharya R, Min JY, Han J-W, Park BJ, Han H-K. Strategic Approaches for Colon Targeted Drug Delivery: An Overview of Recent Advancements. Pharmaceutics. 2020 Jan 15;12(1). 3. Amidon S, Brown JE, Dave VS. Colon-targeted oral drug delivery systems: design trends and approaches. AAPS PharmSciTech. 2015 Aug;16(4):731–41. 4. Philip AK, Philip B. Colon targeted drug delivery systems: a review on primary and novel approaches. Oman Med J. 2010 Apr;25(2):79–87. 5. Abuhelwa AY, Williams DB, Upton RN, Foster DJR. Food, gastrointestinal pH, and models of oral drug absorption. Eur J Pharm Biopharm Off J Arbeitsgemeinschaft Pharm Verfahrenstechnik EV. 2017 Mar;112:234–48. 6. Košnik M, Mrevlje F, Štajer D, Cernelc P, Koželj M, Andoljšek D, et al. Interna medicina. 4th ed. Ljubljana: Littera picta: Slovensko medicinsko društvo; 2011. 563–69, 595–96 p. 7. Naeem M, Awan UA, Subhan F, Cao J, Hlaing SP, Lee J, et al. Advances in colon-targeted nano-drug delivery systems: challenges and solutions. Arch Pharm Res. 2020 Jan;43(1):153–69. 8. Arévalo-Pérez R, Maderuelo C, Lanao JM. Recent advances in colon drug delivery systems. J Control Release Off J Control Release Soc. 2020 Nov 10;327:703–24. 9. Wilson CG. The transit of dosage forms through the colon. Int J Pharm. 2010 Aug 16;395(1–2):17–25. 10. Banerjee A, Pathak S, Subramanium VD, G D, Murugesan R, Verma RS. Strategies for targeted drug delivery in treatment of colon cancer: current trends and future perspectives. Drug Discov Today. 2017 Aug;22(8):1224–32. 11. Martinez MN, Amidon GL. A mechanistic approach to understanding the factors affecting drug absorption: a review of fundamentals. J Clin Pharmacol. 2002 Jun;42(6):620–43. 12. Schiller C, Fröhlich C-P, Giessmann T, Siegmund W, Mönnikes H, Hosten N, et al. Intestinal fluid volumes and transit of dosage forms as assessed by magnetic resonance imaging. Aliment Pharmacol Ther. 2005 Nov 15;22(10):971–9. 13. Teruel AH, Gonzalez-Alvarez I, Bermejo M, Merino V, Marcos MD, Sancenon F, et al. New Insights of Oral Colonic Drug Delivery Systems for Inflammatory Bowel Disease Therapy. Int J Mol Sci. 2020 Sep 5;21(18). 14. Ratnaparkhi MP, Somvanshi FU, Pawar SA, Chaudhari SP, Gupta JP, Budhavant KA. Colon Targeted Drug Delivery System. International Journal of Pharma Research & Review [Internet]. 2013 Aug [cited 2019 Jul 26];2(8):33-42. Available from: https://pdfs.semanticscholar.org/3ba7/61bc9065317dbbbfb5ad f81bd32494d30680.pdf. 15. Zhu W, Chuah YJ, Wang D-A. Bioadhesives for internal medical applications: A review. Acta Biomater. 2018 Jul 1;74:1–16. 16. Arévalo-Pérez R, Maderuelo C, Lanao JM. Recent advances in colon drug delivery systems. J Control Release Off J Control Release Soc. 2020 Nov 10;327:703–24. 17. Prasanth VV, Jayaprakash. R, Mathew ST. Colon specific drug delivery systems: a review on various pharmaceutical approaches. Journal of Applied Pharmaceutical Science [Internet]. 2012 Jan. [cited 2019 May 11];02 (01)163-169. Available from: https://www.japsonline.com/admin/php/uploads/363_pdf.pdf. 18. Cuche G, Cuber JC, Malbert CH. Ileal short-chain fatty acids inhibit gastric motility by a humoral pathway. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000 Nov;279(5):G925-930. 19. Cherbut C. Motor effects of short-chain fatty acids and lactate in the gastrointestinal tract. Proc Nutr Soc. 2003 Feb;62(1):95– 9. 20. Patel MM. Formulation and development of di-dependent microparticulate system for colon-specific drug delivery. Drug Deliv Transl Res. 2017 Apr;7(2):312–24. 21. Kang J-H, Hwang J-Y, Seo J-W, Kim H-S, Shin US. Small intestine-and colon-specific smart oral drug delivery system with controlled release characteristic. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2018 Oct 1;91:247–54. 22. Shahdadi Sardo H, Saremnejad F, Bagheri S, Akhgari A, Afrasiabi Garekani H, Sadeghi F. A review on 5-aminosalicylic acid colon-targeted oral drug delivery systems. Int J Pharm. 2019 Mar 10;558:367–79. 23. Phuong HLT, Thao TDT. Mucoadhesive Formulation Designs for Oral Controlled Drug Release at the Colon. Curr Pharm Des. 2021 Jan 31;27(4):540–7. 24. Ahmad MZ, Akhter S, Ahmad I, Singh A, Anwar M, Shamim M, et al. In vitro and in vivo evaluation of Assam Bora rice starch-based bioadhesive microsphere as a drug carrier for colon targeting. Expert Opin Drug Deliv. 2012 Feb;9(2):141–9. 25. Shaikh R, Raj Singh TR, Garland MJ, Woolfson AD, Donnelly RF. Mucoadhesive drug delivery systems. J Pharm Bioallied Sci. 2011 Jan;3(1):89–100. NANOVLAKNA ZA DOSTAVO UCINKOVIN IN TKIVNO INžENIRSTVO NANOFIBERS FOR DRUG DELIVERY AND TISSUE ENGINEERING AVTORJI / AUThORS: Anže Zidar, mag. farm. prof. dr. Julijana Kristl, mag. farm. izr. prof. dr. Alenka Zvonar Pobirk, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E mail: alenka.zvonar pobirk@ffa.uni lj.si 1 UVOD Na podrocju zdravil se v zadnjem casu pojavlja vse vec na­prednih dostavnih sistemov, ki pogosto omogocajo dose-ganje boljše biološke uporabnosti in nadzorovano sproš-canje ucinkovin ter imajo nekatere druge prednosti v primerjavi s tradicionalnimi farmacevtskimi oblikami. Med napredne dostavne sisteme sodijo poleg razlicnih nano­delcev tudi nanovlakna, ki so jih prvic opisali leta 1934, ko POVZETEK Nanovlakna so edinstven inovativen sistem za do-stavo zdravilnih ucinkovin in za tkivno inženirstvo. V zadnjih letih so doživela izjemen razvoj, kar bo omo-gocilo izdelavo novodobnih zdravil in tkivnih nado­mestkov za zdravljenje mnogih bolezni in poškodb. Nanovlakna so izdelana z elektrostatskim sukanjem iz naravnih in/ali sinteznih polimerov z razlicno se­stavo in strukturo (enoslojna, vecslojna in vecplastna) ter izkazujejo edinstveno kombinacijo strukturnih, funkcionalnih in mehanskih lastnosti. Prilagodljivost nanovlaken je privedla do razvoja širokega nabora dostavnih sistemov za razlicne ucinkovine in pod-pornih struktur za obnovo tkiv. V preglednem clanku predstavljamo pripravo nanovlaken z elektrostatskim sukanjem, doseganje razlicnih profilov sprošcanja vgrajenih majhnih molekul in biofarmacevtikov za zdravljenje ter obnovo tkiv. Polimerna nanovlakna v tkivnem inženirstvu podpirajo razmnoževanje in rast celic ter na ta nacin spodbudijo obnovo tkiva. Na-novlakna kljub mnogim prednostim predvsem zaradi nezadostnih podatkov o njihovi varnosti in omejitev v industrijski proizvodnji še niso v klinicni uporabi, jih pa lahko pricakujemo kmalu. KLJUCNE BESEDE: dostavni sistemi, elektrostatsko sukanje, nanov­lakna, polimer, sprošcanje ucinkovin, tkivno inže­nirstvo ABSTRACT Nanofibers provide unique systems for drug delivery and tissue engineering. In recent years, major ad­vances have been made towards the formulation of innovative medicines and tissue replacements for the treatment of disease and injury. Nanofibers are made by electrospinning of natural and/or syn­thetic polymers, and as such, they can have a range of different compositions and structures (e.g., monolayers, multilayers, ‘sandwich’). They also show unique combinations of structural, functional and mechanical properties. This flexibility has led to the development of a wide assortment of nanofibers as drug-delivery systems and tissue-re­generation structures. This review covers the prepa­ration of nanofibers by electrospinning and provides the details on their release kinetics for small so patentirali postopek njihove izdelave. Zaradi pomanjkanja ustrezne tehnologije je razvoj na tem podrocju v vecji meri zastal do konca dvajsetega stoletja, ko so se možnosti za izdelavo in posledicno tudi interes industrije mocno povecali (1). Nanovlakna so zelo tanka in teoreticno neomejeno dolga. Premer nanovlaken je najveckrat od 10 do 1000 nm, imajo veliko specificno površino glede na maso in raz­novrstne površinske lastnosti. Za njihovo uporabo so zelo pomembne ustrezne strukturne, funkcionalne in mehanske lastnosti, kot sta visok Youngov modul in posledicno visoka natezna trdnost (2–4). Za biomedicinske namene danes raziskujejo nanovlakna za uporabo v dostavnih sistemih ucinkovin in tkivnem inženirstvu, za izdelavo filtrov za filtracijo zraka in preprecevanje okužb (kot del obraznih mask), kot sestavine pametnih ovojnin za shranjevanje živil, sestavine gradbenih materialov, pa tudi v sistemih za pridobivanje, prenos in shranjevanje elektricne energije (3, 5–7). Nanov­lakna z zdravilno ucinkovino lahko vgradimo v farmacevtske oblike z razlicnimi profili sprošcanja ucinkovin ali pa jih upo­rabimo pri tkivnem inženirstvu za spodbujanje obnove tkiv (8–10). V nanovlakna lahko vgrajujemo male molekule ucin­kovin, peptide in proteine, nukleinske kisline in celice (11, 12). V literaturi tako zasledimo raziskave o nanovlaknih kot dostavnih sistemih za ucinkovine z raznovrstnim farmako­loškim delovanjem (protivnetnim, protimikrobnim, antineo­plasticnim, analgeticnim, antialergijskim ali kontracepcijskim ucinkom). Ena izmed aktualnih tehnologij za inženirstvo in izdelavo nanovlaken je elektrostatsko sukanje, ki omogoca preoblikovanje izbrane koloidne raztopine pod vplivom elek­trostatskih sil v tanek curek in nastanek nanovlaken z žele­nima debelino in morfologijo. V prispevku predstavljamo iz­delavo in uporabo nanovlaken za dostavo zdravilnih ucinkovin ali pripravo tkivnih nadomestkov (slika 1). 2 ELEKTROSTATSKO SUKANJE Najpomembnejša metoda za izdelavo nanovlaken za bio-medicinske namene je elektrostatsko sukanje, ki omogoca izdelavo vlaken farmacevtske kakovosti (4, 13). To je proces, pri katerem se curek raztopine polimera zaradi mocnega elektricnega polja na poti od šobe do zbirala podaljša, stanjša, posuši in posledicno naloži na zbiralu (slika 2). Zna-cilnosti slednjih so odvisne od lastnosti koloidne raztopine polimera (viskoznost, elektricna prevodnost in površinska molecules and biopharmaceuticals, and their use for treatment and tissue engineering. Polymeric nanofibers in tissue engineering support proliferation and growth of cells, hence encouraging tissue re­generation. Despite the many advantages of nanofibers, they are not yet in clinical use. This is mainly due to insufficient data on their safety and limitations in their industrial production, but these aspects are expected to be overcome soon. KEY WORDS: drug delivery, drug release, electrospinning, nanofibers, polymer, tissue engineering Slika 1. Videz nanovlaken v razlicnih merilnih skalah: a) množica plasti nanovlaken tvori belo membrano, kot jo vidimo s prostim ocesom; b) posnetek nekaj plasti nanovlaken s keratinocitom, pritrjenim na površini, v mikrometrskem obmocju; c) posnetek nanovlaken z vrsticnim elektronskim mikroskopom v nanometrskem obmocju. Figure 1. Appearance of nanofibers on different scales a) many layers of nanofibers form white membrane that is seen with a naked eye, b) a few layers of nanofibers with an attached keratinocyte in a micrometre scale c) nanofibers captured with an electron microscope in a nanometre scale. Slika 2: Shema naprave za elektrostatsko sukanje z glavnimi elementi. Figure 2: Schematic representation of a nanofiber electrospinning set-up. napetost), procesnih (velikost in oblika šobe, napetost in razdalja med šobo in zbiralom ter vrsta zbirala) in okoljskih parametrov (relativna zracna vlaga in temperatura) (3, 14, 15). Nanovlakna izdelamo bodisi iz koloidne raztopine ali taline enega ali vec polimerov (t. i. kompozitna nanovlakna) bodisi iz taline lipidov (v tem primeru mora biti sistem za dovajanje tekocine skozi šobo opremljen z dodatno grelno enoto). V nadaljevanju bomo podrobneje prikazali elektro­statsko sukanje koloidne raztopine polimera (2, 4, 7, 9). Medtem ko je naprava za elektrostatsko sukanje na videz enostavna (slika 2), je izdelava nanovlaken zahteven in od številnih zgoraj omenjenih parametrov odvisen proces. Na-pravo sestavljajo rezervoar s šobo, vir visoke napetosti, crpalka za uravnavanje pretoka raztopine in zbiralna elek­troda (zbiralo). Napetost med šobo in zbiralom je lahko enosmerna (stalna) ali izmenicna (obicajno nastavimo med 10 in 100 kV) (13). Poznamo tudi vec izvedb šobe, ki je lahko enokanalna (enostavna), dvokanalna (koaksialna) ali veckanalna; iz nje izhaja eden ali vec curkov hkrati. Prav tako so razpoložljiva razlicna zbirala (ravna ploskev, vrtec valj, mrežasto zbiralo). Vrsta zbirala vpliva na nastanek na­kljucno ali vzporedno urejenih nanovlaken (3, 4). Elektrostatsko sukanje temelji na ionizaciji koloidne raztopine v elektricnem polju. Na izhodu šobe se nastajajoca kapljica pod vplivom tlaka, elektricne sile, površinske napetosti te­kocine in njene viskoznosti oblikuje v t. i. Taylorjev stožec, ki se nadaljuje v vse tanjši polimerni curek. V prvi fazi gibanja potuje curek naravnost proti zbiralu in se medtem podaljšuje in tanjša. Ko se curek tanjša, se na površini povecuje go-stota naboja in s tem odbojne sile, zaradi katerih se zacne curek vrtinciti proti zbiralu. To vodi še v nadaljnje tanjšanje curka in povecanje njegove specificne površine, kar še po­speši izhlapevanje topila. Proces izdelave se zakljuci z na­laganjem posušenega nanovlakna na zbiralo (3, 4, 7). Ena glavnih znacilnosti elektrostatskega sukanja je možnost vgradnje najrazlicnejših ucinkovin v vlakna z namenom, da se jim izboljša biološka uporabnost, pospeši raztapljanje ali doseže nadzorovano sprošcanje. Poleg tega je mogoca neprekinjena proizvodnja z nizko porabo energije, zaradi cesar je lahko alternativa široko uporabljanemu zamrzo­valnemu sušenju in sušenju z razprševanjem (16). Doslej je nizka stopnja proizvodnje laboratorijsko prilagojenih na­prav omejevala industrijsko uporabo te tehnologije, a danes so na trgu že razlicne rešitve, razvite za razširjeno proiz­vodnjo vlaken s poudarkom na farmacevtskih izdelkih (12, 16). 3 NANOVLAKNA KOT DOSTAVNI SISTEMI 3.1 VRSTE NANOVLAKEN Glede na morfologijo in mesto vgradnje ucinkovine locimo tri glavne kategorije nanovlaken: enoslojna, vecslojna ter vecplastna nanovlakna (slika 3). V enoslojnih nanovlaknih je ucinkovina enakomerno raz­porejena po celotnem vlaknu, ki ga sestavlja en polimer (enokomponentna vlakna) ali mešanica vec polimerov (veckomponentna ali kompozitna nanovlakna), ki za­gotavljajo nacrtovano sprošcanje ucinkovine, mehansko trdnost in elasticnost vlaken. Obnašanje enoslojnih nanovla-ken v telesu je odvisno od topnosti polimera. Nanovlakna iz hidrofilnih polimerov se v bioloških tekocinah hitro raztopijo in omogocajo takojšnje sprošcanje ucinkovine. Pri nanov­laknih s podaljšanim sprošcanjem pa je sprošcanje ucinkovine odvisno od erodiranja ali razgradnje uporabljenih polimerov v biološkem okolju oziroma difuzije ucinkovine. Za izdelavo nanovlaken lahko uporabimo tudi mukoadhezivne polimere, ki omogocajo daljši stik s sluznico ali tkivom (4, 17). Vecslojna nanovlakna so zgrajena iz dveh ali vec slojev (jedro in zunanji sloj/i) z ucinkovino v enem ali vec slojih (18). Izdelamo jih s pomocjo koaksialne šobe, ki ima vec kanalov in omogoca nastanek vec slojev hkrati. Pri takšnem nacinu izdelave lahko za notranjo plast nanovlakna upora­bimo tudi polimere, ki sami po sebi niso zmožni tvoriti na­novlaken, a s svojimi znacilnostmi pomembno prispevajo k lastnostim izdelanih nanovlaken (npr. vpliv na stabilnost in profil sprošcanja ucinkovine). Glede na strukturo so vec­slojna nanovlakna lahko ogrodna ali rezervoarna. Pri ogrodnih vecslojnih nanovlaknih nadzoruje sprošcanje polimerno ogrodje, v katerem je ucinkovina enakomerno porazdeljena. V odvisnosti od ogrodnega polimera lahko dosežemo takojšnje ali prirejeno sprošcanje ucinkovine. Z ustrezno kombinacijo polimerov lahko dosežemo dvojni profil sprošcanja, pri cemer se ucinkovina iz zunanjega sloja sprosti takoj, iz notranjega pa pocasneje (4, 19). Vec­slojna nanovlakna lahko oblikujemo tudi v obliki rezer­voarnih nanovlaken, kjer zunanji sloj tvori prepustno pre­grado, ki nadzoruje sprošcanje ucinkovine, vgrajene v notranjem sloju. Rezervoarni tip nanovlaken je primeren predvsem za podaljšano sprošcanje ucinkovin (4, 19, 20). Vecplastna nanovlakna dobimo z zaporednim elektrostat-skim sukanjem plasti raztopin polimera ali polimera z ucin­kovino na zbiralo. Pri tem nastane sistem, v katerem spodnja in zgornja plast nanovlaken predstavljata pregrado za sproš-canje ucinkovine, ki je vgrajena v sredinski plasti nanovlaken (t. i. »sendvic tip« nanovlaken). Za izdelavo tovrstnih sistemov so primerni predvsem nabrekajoci hidrofilni polimeri (21). 3.2 POLIMERI Za izdelavo nanovlaken uporabljamo številne biokompati­bilne naravne in sintezne polimere, ki se razlikujejo po vrsti, številu in ureditvi monomernih enot, ki dolocajo fizikalno­kemijske lastnosti (molekulska masa, polarnost, vodotop­nost in prisotnosti razlicnih funkcionalnih skupin) (3). V pre­glednici 1 so zbrani najpomembnejši polimeri za oblikovanje razlicnih vrst nanovlaken. 3.3 VGRAJEVANJE UCINKOVIN Ucinkovino dodamo v raztopino polimera in jo tako nepo­sredno vgradimo v nanovlakna med samim procesom elek­trostatskega sukanja ali pa jo adsorbiramo na že oblikovana nanovlakna (slika 4) (8, 17). V obeh primerih je lahko ucin­ Slika 3: Precni prerez razlicnih vrst nanovlaken z vgrajeno ucinkovino. Razlicni odtenki sive predstavljajo razlicne polimere oz. razlicne sloje/plasti, ucinkovina pa je oznacena s crnimi pikami. Figure 3: Cross section of different types of nanofibers with incorporated drugs. Different shades of grey represent different polymers or layers of nanofibers, and drug is represented by black dots. Slika 4: Nacini vgrajevanja ucinkovine v nanovlakna. Barva raztopine pred sukanjem se ujema s slojem nanovlakna po sukanju. Barve predstavljajo razlicne polimere. Figure 4: Different drug loading techniques in nanofibers. Colours of original dispersions correlate with nanofiber layers after electrospinning. Colours represent different polymers. Preglednica 1: Pregled nanovlaken glede na kinetiko sprošcanja in primeri polimerov za njihovo izdelavo. Table 1: Summary of nanofibers with different release kinetics and polymers for their formulation. Nanovlakna s takojšnjim sprošcanjem Enokomponentna nanovlakna • Sintezni polimeri: polietilenglikol (PEG) (22), polivinilalkohol (PVA) (23), polimlecna kislina (PLA), polivinilpirolidon (PVP) (24), poliakrilati, Soluplus® (polivinil kaprolaktam­polivinil acetat-polietilenglikol razvejan kopolimer) (8, 23, 24) • Naravni in polsintezni polimeri: hitosan, alginat, dekstran, kolagen, želatina, fibroin (protein svile) (25) Veckomponentna nanovlakna • Soluplus® in PVA; poloksameri in PEG; alginat in PEG (15); hitosan in PEG (26); PVP in PVA (27) Nanovlakna s podaljšanim sprošcanjem Enoslojna ogrodna nanovlakna • Polikaprolakton (PCL) (28), hidroksipropilmetilceluloza, kopolimer mlecne in glikolne kisline (PLGA) (3) • Polikaprolakton in želatina, polikaprolakton in hitosan, PVA in etilhidroksietilceluloza, natrijev alginat in gelan (8) Vecslojna ogrodna nanovlakna • Polikaprolakton (zunanji sloj) in PVA (jedro) (20), PMMA (zunanji sloj) in PVA (jedro) (18); PLGA (zunanji sloj) in PVP (jedro) (19) Vecslojna rezervoarna nanovlakna • Polimlecna kislina (PLA) in tiohitosan (zunanji sloj) in PEG (jedro) (8, 29) • Glicerol monostearat (zunanji sloj) in etilceluloza (jedro) (30) Vecplastna nanovlakna • želatina (zunanji plasti) in želatina z ucinkovino (notranja plast) (21) Vecslojna ogrodna nanovlakna • PEG (zunanji sloj) in PLA (jedro) (31) Temperaturno odzivna nanovlakna • Poli(N-izopropilakrilamid) in etilceluloza (32) ph odzivna nanovlakna • Eudragit RS100, Eudragit S100 (derivata polimetilakrilne kisline) (33) kovina v tekoci disperziji (raztopina, emulzija ali suspenzija) raztopljena, emulgirana ali suspendirana. Ucinkovino (samo ali vgrajeno v nanodelce) lahko tudi adsorbiramo na na­novlakna (slika 4). Z adsorpcijo specificnih ligandov (npr. protitelesa, folna kislina) lahko povecamo funkcionalnost nanovlaken. V nanovlakna lahko vgrajujemo male molekule ucinkovin, peptide in proteine, nukleinske kisline in celice (11, 12, 34). Aktualno je vgrajevanje celic in bakterijskih spor v nanovlakna za namen obnove in podpore mikrobiote na mestu delovanja (34). Nanovlakna izdelujemo z name-nom doseganja lokalnega ali sistemskega delovanja vgra­jene ucinkovine (4). 3.4 PROFILI SPROšCANJA UCINKOVIN IZ NANOVLAKEN Poleg morfoloških lastnosti je zelo pomembna lastnost na­novlaken tudi sposobnost dostave ucinkovine z izbrano farm vestn 2021; 72 kinetiko sprošcanja. Sprošcanje ucinkovin iz nanovlaken je lahko takojšnje ali prirejeno (slika 5), kar je odvisno od vrste polimera oz. njihovih zmesi ter od strukture nanovla-ken (4). Primeri polimerov in struktur nanovlaken za dose-ganje dolocene kinetike sprošcanja so navedeni v pregled­nici 1. Iz nanovlaken s takojšnjim sprošcanjem se ucinkovina sprosti zelo hitro. Pri ucinkovinah z dobro vodotopnostjo in hitro absorpcijo lahko s takšnimi nanovlakni hitro dose-žemo terapevtski ucinek (npr. v nekaj minutah). K hitremu sprošcanju ucinkovin pomembno prispeva tudi velika spe­cificna površina nanovlaken. Ob ustrezni izbiri polimera lahko takojšnje sprošcanje dosežemo z enoslojnimi ali vec­slojnimi nanovlakni z ucinkovino le v zunanjem sloju (8, 28). Pri slabo vodotopnih ucinkovinah je izziv vecji; hitrost raztapljanja slednjih lahko med drugim izboljšamo s pri­pravo stabilne amorfne oblike ucinkovine v nanovlaknu (11). Za pripravo slednjih je pomembno, da za raztapljanje polimera in ucinkovine izberemo topilo, ki zelo hitro in v celoti izhlapi. Sam proces elektrostatskega sukanja mora biti dovolj hiter, da preprecimo kristalizacijo ucinkovine med oblikovanjem nanovlakna (8). Farmacevtske oblike s prirejenim sprošcanjem, ki vklju-cujejo podaljšano, vecfazno in zakasnelo sprošcanje, se od oblik s takojšnjim sprošcanjem razlikujejo v hitrosti in/ali mestu sprošcanja ucinkovine. V primerjavi s takojšnjim sprošcanjem je za tovrstne sisteme znacilno pocasnejše sprošcanje ucinkovine ali z dolocenim casovnim zamikom, možno pa je tudi podaljšano sprošcanje ucinkovine skozi daljše casovno obdobje. Ti sistemi so primerni za nadzo­rovano dostavo ucinkovine na izbrano mesto aplikacije (4, 8). Za podaljšano sprošcanje je znacilna pocasna kinetika sprošcanja ucinkovine skozi dolocen cas (vec dni, tednov ali mesecev), bolj konstantna koncentracija ucinkovine v krvi in s tem povezana manjša možnost neželenih ucinkov (8). Primerna so predvsem enoslojna nanovlakna iz hidrof­obnih polimerov, pa tudi rezervoarna ter vecplastna na­novlakna (slika 3). Torej je poleg strukture nanovlaken bi-stvena tudi izbira primernega polimera (preglednica 1). Sprošcanje ucinkovine iz takšnih nanovlaken je nadzoro­vano z difuzijo ucinkovine skozi polimerno ogrodje (PCL), erozijo (hitosan) ali razgradnjo polimernega ogrodja (PLGA) (4, 8, 35). Za farmacevtske oblike z vecfaznim sprošcanjem je znacilno sprošcanje ucinkovine z razlicnimi kinetikami sprošcanja v razlicnih casovnih intervalih. To najlažje do-sežemo z vecslojnimi nanovlakni, pri katerih zunanji sloj zagotovi takojšnje sprošcanje, notranji pa zakasnelo ali po­daljšano sprošcanje. Tudi v tem primeru velja, da je poleg strukture nanovlaken bistvena izbira primernih polimerov, ki omogocajo razlicne kinetike sprošcanja (31). Zakasnelo sprošcanje lahko dosežemo z vecslojnimi nanovlakni ali z nanovlakni iz polimerov, odzivnih na dra­žljaje (t. i. inteligentni polimeri). Slednji vsebujejo funkcio­nalne skupine, ki se odzivajo na dolocene dejavnike v okolju (npr. na majhne spremembe vrednosti temperature, ph, ionske moci ali elektromagnetnega polja) in na ta nacin spreminjajo lastnosti polimera. S tem uravnavajo sprošcanje vgrajene ucinkovine iz nanovlaken. Takšni po­limeri so zelo aktualni za nacrtovanje dostavnih sistemov, namenjenih ciljani dostavi ucinkovine in sprošcanju na to­cno dolocenem mestu v prebavnem traktu ali drugje v te­lesu (4, 8, 32). Temperaturno odzivna nanovlakna se spremenijo in sprostijo ucinkovino ob spremembi temperature zaradi segrevanja pod vplivom telesne temperature ali pa zaradi umetnega povišanja s segrevanjem z infrardeco svetlobo (32). pH odzivna nanovlakna uporabljamo za dostavo ucinkovine na doloceno mesto v prebavnem traktu. Primer tovrstnega sistema so gastrorezistentna nanovlakna, ki sprostijo ucinkovino v dvanajstniku, ter nanovlakna, ki sprostijo ucinkovino na zacetku debelega crevesja (33). Velika prednost nanovlaken, ki sicer prestavljajo relativno novo obliko dostavnih sistemov, je njihova vsestranska uporabnost. Z izbiro ustreznih polimerov, strukture nanov­laken ter parametrov elektrostatskega sukanja lahko do-sežemo prakticno vse uveljavljene kinetike sprošcanja ucin­ Slika 5: Razlicni profili sprošcanja ucinkovine iz nanovlaken: neprirejeno oz. takojšnje sprošcanje in prirejeno (podaljšano, vecfazno in zakasnelo) sprošcanje. Figure 5: Different profiles of drug release from nanofibers: immediate release and modified release (prolonged release, multiphase release and delayed release). kovine. Omogocajo tudi vgradnjo ucinkovine v amorfni obliki in njeno stabilnost skozi daljše casovno obdobje. Koncne farmacevtske oblike za nanovlakna so tablete, kapsule in orodisperzibilne farmacevtske oblike (nanovlakna pred polnjenjem ali stiskanjem zmeljejo) ter vsadki in zdra­vilni obliži (4, 8, 12). 4 TKIVNO INžENIRSTVO Tkivno inženirstvo je del regenerativne medicine, ki celicam zagotavlja umetno zunajcelicno ogrodje (scaffold). Omo­goca pritrjevanje, naseljevanje, diferenciacijo, rast in ra­zmnoževanje celic. Tako pripravljen tkivni nadomestek pre­nesemo na poškodovano tkivo, kjer spodbuja njegovo obnovo. Tkivni nadomestek sestavljajo ogrodje iz polimer­nih nanovlaken, tkivno specificne celice in rastni dejavniki ali ucinkovine (9). Za izdelavo takšnih nanovlaken pogosto uporabljamo naravno pridobljene polimere zaradi dobre tkivne biokompatibilnosti, podobnosti z zunajcelicnim ogrodjem in možnostjo pristnih interakcij s celicami (6). Tudi sintezne polimere lahko zasnujemo tako, da posne­majo zunajcelicno ogrodje in dostavijo ter sprošcajo rastne dejavnike in sorodne spojine kot odziv na fiziološke signale. S tem posnemajo naravni proces celjenja, spodbujanja obnove tkiva in zmanjšujejo brazgotinjenje. Tkivni nado­mestki služijo kot opora za razrast celic in obnovo tkiva. Nadomestki morajo posnemati specificne biokemijske, strukturne in mehanske lastnosti biološkega tkiva, a ne smejo povzrocati negativnega imunskega odgovora (36, 37). Nanovlakna morajo zagotavljati podporo in spodbujati naseljevanje ter razmnoževanje celic toliko casa, dokler se tkivo ne obnovi. Poleg intrinzicnih lastnosti nanovlaken pa lahko obnovo tkiva izboljšamo z vgrajevanjem rastnih de­javnikov v nanovlakna, ki spodbujajo deljenje celic in njihovo naseljevanje na obmocje poškodbe (38). Z vidika odstra­nitve tkivnega nadomestka z mesta obnove tkiva je pri na-crtovanju zelo pomembno, da se hitrost razgradnje na­novlaken ujema s hitrostjo obnove tkiva (39). Raziskave kažejo boljše rezultate tkivnih nadomestkov iz naravnih materialov (40). Na možnost infiltracije celic in njihovo ra­zrast imata velik vpliv debelina nanovlaken in velikost por, zato je priprava tridimenzionalne zgradbe podpornega ogrodja zelo pomembna. S pripravo slednjega z elektro­statskim sukanjem lahko dosežemo primerne strukturne lastnosti in hkrati nadzorovano sprošcanje vgrajene ucin­ kovine. Nanovlakna kot tkivni nadomestki so v obliki razli-cno velikih poroznih membran ali vsadkov in služijo kot podlaga za gojenje tkivnih celic in omogocajo njihov prenos z gojišca v kliniko in samo aplikacijo (41, 42). 4.1 KOžA IN CELJENJE RAN Tkivni nadomestki sodelujejo pri celjenju ran in nadomeš-cajo fiziološke funkcije kože. Omogocati morajo dostop kisika ter spodbujati keratinocite k naseljevanju in razmno­ževanju ter strukturiranju posameznih kožnih plasti. Po drugi strani pa imajo tudi zašcitno vlogo, saj preprecujejo vdor mikroorganizmov v poškodovano tkivo. Glavne celice, ki sodelujejo pri obnovi kože, so keratinociti. Na membrano naselimo keratinocite, ki se pritrdijo in razmnožujejo na na­novlaknih. Ce tkivni nadomestek s keratinociti dodamo na poškodovani del kože, ti pospešijo njeno obnovo s sproš-canjem rastnih dejavnikov. Podporna membrana iz nanov­laken keratinocitom nudi tudi ustrezno zašcito pred zuna­njim okoljem. Polimeri, ki jih uporabljamo za izdelavo kožnih tkivnih nadomestkov na osnovi nanovlaken, so poliuretani, kopolimer mlecne in glikolne kisline in derivati ter polika­prolakton (6, 9, 38, 43). 4.2 PODPORNA MEMBRANA žILNE STENE žile so sestavljene iz vec tkivnih plasti. Takšni morajo biti tudi žilni nadomestki na osnovi nanovlaken, saj želimo, da je obnovljena žila primerljiva ostalim. Poleg strukturne pod-obnosti z žilno steno mora žilni nadomestek vzdržati tudi pulziranje krvnega tlaka zaradi bitja srca. Shema izdelave podporne membrane žilne stene je prikazana na sliki 6. Podporna membrana iz nanovlaken za žilno steno je se­stavljena iz vec plasti, ki vkljucujejo razlicne kombinacije polimerov glede na funkcijo plasti: protein svile fibroin, že­latino, kolagen, polikaprolakton, polimlecno kislino in po­liuretane (9, 43). 4.3 DRUGE MOžNOSTI UPORABE Nanovlakna uporabljamo tudi za obnovo in delno nado­mestitev funkcije v kostnem tkivu, hrustancu, ligamentih, tetivah in za gojenje perifernih nevronov. Za nadomestitev oporne funkcije kostnega tkiva morajo imeti tkivni nado­mestki ustrezno mehansko trdnost, kar bolnikom omogoca povrnitev fiziološke funkcije. Glavne celice za obnovo kost­nega tkiva so osteoblasti in hondrociti, ki jih nasadimo na podporno ogrodje iz nanovlaken. Ogrodje mora omogocati infiltracijo hondrocitov in osteoblastov, ki po dolocenem casu nadomestijo organski del kostnine in spodbujajo kal­cifikacijo kosti (26, 41, 44). Za izdelavo kostnih vsadkov uporabljamo kombinacije biološko razgradljivih naravnih in sinteznih polimerov, najpogosteje polimlecno kislino, ko­polimer mlecne in glikolne kisline, polikaprolakton in kolagen (9). Nevronov trenutno še ne moremo nadomestiti z nanovlakni, lahko pa izdelamo podlago za njihovo rast in obnovo. Pod-laga iz nanovlaken mora omogocati rast celic v isto smer, kot so nevroni usmerjeni v perifernem živcu. Za to upora­bljamo vzporedno urejena nanovlakna iz polianilina in poli­kaprolaktona, izdelana z elektrostatskim sukanjem na zbi­ralo v obliki vrtecega valja. Za spodbujanje rasti vgradimo v nanovlakna nevrotroficne in rastne dejavnike glia celic, ki usmerjajo rast in pospešujejo delitev (9). Za obnovo hrustanca potrebujemo porozen, mehansko stabilen vsadek, ki omogoca infiltracijo in pritrjevanje hon-drocitov (45). Za obnovo ligamentov in tetiv so potrebne podobne lastnosti, vendar je treba zagotoviti tudi vzporedno usmerjenost nanovlaken, ki zagotavlja dobro natezno trdnost. Nanovlakna iz polikaprolaktona, kolagena tipa 2 in hitosana ustrezajo lastnostim za obnovo navedenih tkiv (9). 5 POGLED V PRIHODNOST Kljub velikim prednostim, ki jih prinašajo nanovlakna, jih na evropskem in ameriškem trgu regulatorni organi še niso odobrili za uporabo v zdravilih. Prve materiale z nanovlakni je odobrila ameriška Agencija za hrano in zdravila (FDA) za zobne zalivke (46). Zaradi nanovelikosti so regulatorni or-gani previdni pri odobritvi nanomaterialov, saj ima vsak material nanovelikosti specificne lastnosti, zato je treba iz­vesti vec biokompatibilnostnih raziskav kot za delce iz ena­kega materiala vecjih velikosti. Sestava in tehnološki po­stopek odlocilno vplivata na fizikalno-kemijske lastnosti nanovlaken in sprošcanje ucinkovine v primeru dostavnega sistema, poleg tega v primeru tkivnih nadomestkov tudi na strukturne in mehanske lastnosti. Razvoj in izdelava kompozitnih nanovlaken, ki temeljijo na združevanju razli-cnih polimerov, obetata zelo natancno prilagajanje lastnosti nanovlaken dolocenemu namenu uporabe in širita nabor dostavnih sistemov in tkivnih nadomestkov za zdravljenje raznih bolezni. Kljub velikemu znanstvenemu napredku na tem podrocju pa razvoj industrijske proizvodnje takšnih dostavnih sistemov le pocasi napreduje. Potrebno je še vec klinicnih raziskav in razvoj novih pristopov za izdelavo in vrednotenje dostavnih sistemov in vsadkov iz nanovla-ken. V bližnji prihodnosti pricakujemo uspešnejši prenos izsledkov iz raziskovalnih in razvojnih laboratorijev v proiz­vodnjo in klinicno uporabo. 6 ZAHVALA Avtorji se zahvaljujemo Javni agenciji za raziskovalno de­javnost RS za financno podporo programa P1-0189 in projekta J1-9194. Slika 6: Prikaz izdelave podporne membrane za žilno steno; PDSM (polidimetilsiloksan). Figure 6: Illustrative scheme of preparation method for supportive tubular scaffold membrane; PDSM (polydimethylsiloxane). 7 LITERATURA 1. Barhoum A, Bechelany M, Makhlouf ASH. Handbook of Nanofibers: Springer International Publishing; 2019. 1170 p. 2. Rošic R, Pelipenko J, Kristl J, Kocbek P, Bešter-Rogac M, Baumgartner S. Physical characteristics of poly (vinyl alcohol) solutions in relation to electrospun nanofiber formation. Eur Polym J. 2013;49(2):290-8. 3. Barhoum A, Pal K, Rahier H, Uludag H, Kim IS, Bechelany M. Nanofibers as new-generation materials: From spinning and nano-spinning fabrication techniques to emerging applications. Appl Mater Today. 2019;17:1-35. 4. Pelipenko J, Kocbek P, Kristl J. Critical attributes of nanofibers: Preparation, drug loading, and tissue regeneration. Int J Pharm. 2015;484(1-2):57-74. 5. Szentivanyi A, Chakradeo T, Zernetsch H, Glasmacher B. Electrospun cellular microenvironments: Understanding controlled release and scaffold structure. Adv Drug Del Rev. 2011;63(4):209-20. 6. Pelipenko J, Kocbek P, Govedarica B, Rošic R, Baumgartner S, Kristl J. The topography of electrospun nanofibers and its impact on the growth and mobility of keratinocytes. Eur J Pharm Biopharm. 2013;84(2):401-11. 7. Wei Q, Tao D, Xu Y. Functional Nanofibers and Their Applications -1. Nanofibers: Principles and Manufacture: Woodhead Publishing Limited; 2012. 1-21 p. 8. Kajdic S, Planinšek O, Gašperlin M, Kocbek P. Electrospun nanofibers for customized drug-delivery systems. J Drug Deliv Sci Technol. 2019;51:672-81. 9. Rodriguez IA, McCool JM, Bowlin GL. Functional nanofibers for tissue engineering applications: Woodhead Publishing Limited; 2012. 171-96 p. 10. Zupancic Š, Casula L, Rijavec T, Lapanje A, Luštrik M, Fadda AM, et al. Sustained release of antimicrobials from double-layer nanofiber mats for local treatment of periodontal disease, evaluated using a new micro flow-through apparatus. Journal of Controlled Release. 2019;316:223-35. 11. Yu DG, Li JJ, Williams GR, Zhao M. Electrospun amorphous solid dispersions of poorly water-soluble drugs: A review. Journal of Controlled Release. 2018;292:91-110. 12. Casian T, Borbás E, Ilyés K, Démuth B, Farkas A, Rapi Z, et al. Electrospun amorphous solid dispersions of meloxicam: Influence of polymer type and downstream processing to orodispersible dosage forms. Int J Pharm. 2019;569:118593. 13. Farkas B, Balogh A, Cselkó R, Molnár K, Farkas A, Borbás E, et al. Corona alternating current electrospinning: A combined approach for increasing the productivity of electrospinning. Int J Pharm. 2019;561:219-27. 14. Rošic R, Pelipenko J, Kristl J, Kocbek P, Baumgartner S. Properties, engineering and applications of polymeric nanofibers: Current research and future advances. Chem Biochem Eng Q. 2012;26(4):417-25. 15. Mirtic J, Balažic H, Zupancic Š, Kristl J. Effect of solution composition variables on electrospun alginate nanofibers: Response surface analysis. Polymers. 2019;11(4). 16. Vass P, Szabó E, Domokos A, Hirsch E, Galata D, Farkas B, et al. Scale-up of electrospinning technology: Applications in the pharmaceutical industry. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2020;12(4):e1611. 17. Wei Q, Wei A. Functional nanofibers for drug delivery applications: Woodhead Publishing Limited; 2012. 153-70 p. 18. Zupancic Š, Sinha-Ray S, Sinha-Ray S, Kristl J, Yarin AL. Controlled Release of Ciprofloxacin from Core-Shell Nanofibers with Monolithic or Blended Core. Mol Pharm. 2016;13(4):1393­404. 19. He P, Zhong Q, Ge Y, Guo Z, Tian J, Zhou Y, et al. Dual drug loaded coaxial electrospun PLGA/PVP fiber for guided tissue regeneration under control of infection. Mater Sci Eng, C. 2018;90:549-56. 20. Song W, Seta J, Chen L, Bergum C, Zhou Z, Kanneganti P, et al. Doxycycline-loaded coaxial nanofiber coating of titanium implants enhances osseointegration and inhibits Staphylococcus aureus infection. Biomed Mater. 2017;12(4):045008. 21. Laha A, Sharma CS, Majumdar S. Sustained drug release from multi-layered sequentially crosslinked electrospun gelatin nanofiber mesh. Mater Sci Eng, C. 2017;76:782-6. 22. Krstic M, Radojevic M, Stojanovic D, Radojevic V, Uskokovic P, Ibric S. Formulation and characterization of nanofibers and films with carvedilol prepared by electrospinning and solution casting method. Eur J Pharm Sci. 2017;101:160-6. 23. Nam S, Lee J-J, Lee SY, Jeong JY, Kang W-S, Cho H-J. Angelica gigas Nakai extract-loaded fast-dissolving nanofiber based on poly(vinyl alcohol) and Soluplus for oral cancer therapy. Int J Pharm. 2017;526(1):225-34. 24. Poller B, Strachan C, Broadbent R, Walker GF. A minitablet formulation made from electrospun nanofibers. Eur J Pharm Biopharm. 2017;114:213-20. 25. Lancina MG, 3rd, Shankar RK, Yang H. Chitosan nanofibers for transbuccal insulin delivery. J Biomed Mater Res A. 2017;105(5):1252-9. 26. Singh YP, Dasgupta S, Nayar S, Bhaskar R. Optimization of electrospinning process & parameters for producing defect-free chitosan/polyethylene oxide nanofibers for bone tissue engineering. J Biomater Sci Polym Ed. 2020;31(6):781-803. 27. Sebe I, Szabó B, Nagy ZK, Szabó D, Zsidai L, Kocsis B, et al. Polymer structure and antimicrobial activity of polyvinylpyrrolidone-based iodine nanofibers prepared with high-speed rotary spinning technique. Int J Pharm. 2013;458(1):99-103. 28. Potrc T, Baumgartner S, Roškar R, Planinšek O, Lavric Z, Kristl J, et al. Electrospun polycaprolactone nanofibers as a potential oromucosal delivery system for poorly water-soluble drugs. Eur J Pharm Sci. 2015;75:101-13. 29. Meng J, Agrahari V, Ezoulin MJ, Zhang C, Purohit SS, Molteni A, et al. Tenofovir Containing Thiolated Chitosan Core/Shell Nanofibers: In Vitro and in Vivo Evaluations. Mol Pharm. 2016;13(12):4129-40. 30. Hai T, Wan X, Yu D-G, Wang K, Yang Y, Liu Z-P. Electrospun lipid-coated medicated nanocomposites for an improved drug sustained-release profile. Mater Des. 2019;162:70-9. 31. Kuang G, Zhang Z, Liu S, Zhou D, Lu X, Jing X, et al. Biphasic drug release from electrospun polyblend nanofibers for optimized local cancer treatment. Biomaterials Science. 2018;6(2):324-31. 32. Elashnikov R, Slepicka P, Rimpelova S, Ulbrich P, Švorcík V, Lyutakov O. Temperature-responsive PLLA/PNIPAM nanofibers for switchable release. Mater Sci Eng, C. 2017;72:293-300. 33. Akhgari A, Heshmati Z, Afrasiabi Garekani H, Sadeghi F, Sabbagh A, Sharif Makhmalzadeh B, et al. Indomethacin electrospun nanofibers for colonic drug delivery: In vitro dissolution studies. Colloids Surf B Biointerfaces. 2017;152:29­35. 34. Zupancic Š, Rijavec T, Lapanje A, Petelin M, Kristl J, Kocbek P. Nanofibers with Incorporated Autochthonous Bacteria as Potential Probiotics for Local Treatment of Periodontal Disease. Biomacromolecules. 2018;19(11):4299-306. 35. Zupancic Š, Baumgartner S, Lavric Z, Petelin M, Kristl J. Local delivery of resveratrol using polycaprolactone nanofibers for treatment of periodontal disease. J Drug Deliv Sci Technol. 2015;30:408-16. 36. Da Silva GR, Lima TH, Fernandes-Cunha GM, Oréfice RL, Da Silva-Cunha A, Zhao M, et al. Ocular biocompatibility of dexamethasone acetate loaded poly(e-caprolactone) nanofibers. Eur J Pharm Biopharm. 2019;142:20-30. 37. Balusamy B, Senthamizhan A, Uyar T. 6 -In vivo safety evaluations of electrospun nanofibers for biomedical applications. In: Uyar T, Kny E, editors. Electrospun Materials for Tissue Engineering and Biomedical Applications: Woodhead Publishing; 2017. p. 101-13. 38. Bertoncelj V, Pelipenko J, Kristl J, Jeras M, Cukjati M, Kocbek P. Development and bioevaluation of nanofibers with blood-derived growth factors for dermal wound healing. Eur J Pharm Biopharm. 2014;88(1):64-74. 39. Pelipenko J, Kocbek P, Kristl J. Nanofiber diameter as a critical parameter affecting skin cell response. Eur J Pharm Sci. 2015;66:29-35. 40. Huang S, Fu X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. J Control Release. 2010;142(2):149-59. 41. R Z, P.X M. Poly(alpha-hydroxyl acids)/hydroxyapatite porous composites for bone-tissue engineering. I. Preparation and morphology. J Biomed Mater Res. 1999;44:446-55. 42. Jankovic B, Pelipenko J, Škarabot M, Muševic I, Kristl J. The design trend in tissue-engineering scaffolds based on nanomechanical properties of individual electrospun nanofibers. Int J Pharm. 2013;455(1-2):338-47. 43. Al-Enizi AM, Zagho MM, Elzatahry AA. Polymer-based electrospun nanofibers for biomedical applications. Nanomaterials. 2018;8(4):1-22. 44. De Witte TM, Fratila-Apachitei LE, Zadpoor AA, Peppas NA. Bone tissue engineering via growth factor delivery: from scaffolds to complex matrices. Regen Biomater. 2018;5(4):197­211. 45. Fu L, Yang Z, Gao C, Li H, Yuan Z, Wang F, et al. Advances and prospects in biomimetic multilayered scaffolds for articular cartilage regeneration. Regenerative Biomaterials. 2020;7(6):527-42. 46. Gawel R. FDA Approves Nanofiber Flowable Composite 2015 [cited 2020 28.12.2020]. Available from: https://www.dentistrytoday.com/news/industrynews/item/477­fda-approves-nanofiber-flowable-composite. NANOTERANOSTIKI IN NJIhOV POTENCIAL V PERSONALIZIRANI MEDICINI NANOThERANOSTICS AND ThEIR POTENTIAL IN PERSONALISED MEDICINE AVTORJI / AUThORS: asist. Crt Dragar, mag. farm. prof. dr. Mirjana Gašperlin, mag. farm. izr. prof. dr. Petra Kocbek, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Aškerceva cesta 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E mail: petra.kocbek@ffa.uni lj.si POVZETEK Z uspešnim razvojem številnih nanodostavnih si­stemov za vnos zdravilnih ucinkovin in diagnostikov v zadnjih šestdesetih letih se je uveljavilo tudi po­drocje nanoteranostikov. Ti multifunkcionalni sistemi, ki vsebujejo terapevtsko in diagnosticno kompo­nento, omogocajo bolj ucinkovito in posamezniku prilagojeno zdravljenje ter neinvazivno zgodnjo dia­gnostiko bolezni in/ali spremljanje zdravljenja. Zaradi številnih prednosti predstavljajo nanoteranostiki po­memben korak od pristopa »enega zdravila, ki ustreza vsem« k posamezniku prilagojenemu zdra­vljenju. Kljub bliskovitemu razvoju pa ostajajo dolo-ceni izzivi, s katerimi se bo treba soociti, ce želimo, da bodo nanoteranostiki uspešno prešli iz raziskav v klinicno uporabo. KLJUCNE BESEDE: diagnostika, nanodostavni sistemi, personalizirana medicina, teranostika, zdravljenje ABSTRACT Successful development of numerous nanodelivery systems for drugs and diagnostics in the past 60 years has introduced also the field of nanothera­nostic. These multifunctional systems, which com­bine therapeutic and diagnostic components, en­able more efficient, individually adjusted therapy, and non-invasive and rapid early diagnostics or al­low monitoring of the treatment progress. Due to the number of advantages nanotheranostics repre­sent an important step from the concept of »one medicine fits all« towards patient-tailored therapy. Despite the rapid development of nanotheranostics, there are still some challenges to be addressed in the future, to enable their successful translation from research to clinical practice. KEY WORDS: diagnostics, nanosized drug delivery systems, per­sonalized medicine, theranostics, therapy NANOTERANOSTIKI IN NJIhOV POTENCIAL V PERSONALIZIRANI MEDICINI 1 UVOD Farmacija je visokoinovativno podrocje, za katerega je zna-cilen hiter napredek, o cemer prica podatek, da je ameriška Uprava za hrano in zdravila (Food and Drug Administration, FDA) v zadnjih dveh desetletjih vsako leto odobrila 20 do 25 novih zdravil; to število pa se je v zadnjih letih povzpelo na 40 do 50 (1). Le v letu 2019 je Evropska agencija za zdravila (European Medicines Agency, EMA) odobrila kar 66 novih zdravil, med katerimi jih je 30 vsebovalo nove ucinkovine (2). O hitrem razvoju farmacije pricajo tudi šte­vilne nove farmacevtske oblike in novi dostavni sistemi, ki so bili razviti v zadnjih 70 letih. Nekaj pomembnih mejnikov 2 NANOTEHNOLOGIJA IN RAZVOJ ZDRAVIL Zametke nanotehnologije je na zemljevid znanosti leta 1959 v svojem znamenitem predavanju z naslovom »There's Plenty of Room at the Bottom« postavil Richard Feynman, ki je napovedal, da bomo v prihodnosti izdelovali izdelke vi-soke kompleksnosti – nanoizdelke (5). Danes, šest desetletij pozneje, je nanotehnologija eno izmed kljucnih podrocij na­predka, tako v znanosti nasploh kot v farmaciji. Vse od raziskav in razvoja prvih nanodelcev za dostavo ucinkovin, ki so jih razvili v skupini Petra Paula Speiserja v poznih šestdesetih letih prejšnjega stoletja, pa do danes je bilo razvitih mnogo nanozdravil (6). Pogosto prihaja do zmot­nega enacenja celotne skupine nanozdravil z le eno tehno­na podrocju farmacije med drugim predstavljajo regulatorna odobritev farmacevtskih oblik s podaljšanim sprošcanjem (1952), inhalatorjev (1956), transdermalnih obližev (1979), rekombinantnih inzulinov (1982), mikrosfer (1984), liposo­mov (1995), nanodelcev (2005), tridimenzionalno natisnje­nih zdravil (2015), genskega zdravljenja in digitalnih zdravil (2017) (3). Razvoj farmacije se iz pristopa »enega zdravila, ki ustreza vsem« (»one medicine fits all«) preusmerja v t. i. personali­zirano medicino, ki temelji na pristopu posamezniku prila­gojenega zdravljenja na osnovi genetskih preiskav in od­krivanja bioloških oznacevalcev bolezni. Poleg tega tak pristop zagotavlja spremljanje in napovedovanje terapevt­skih ucinkov z uporabo razlicnih slikovnih tehnik (4). Ob množici inovativnih pristopov personalizirane medicine se poraja vprašanje, kaj sledi. Bi lahko pomemben korak k personalizirani medicini naredili nanoteranostiki? Slika 1: Prednosti nanodostavnih sistemov pred dostavnimi sistemi vecjih velikosti. Figure 1: Advantages of nano drug delivery systems compared to larger drug delivery systems. loško obliko, in sicer z nanodelci, ki so definirani kot delci s premerom v nanometrskem obmocju (7). Velja pa poudariti, da nanozdravila ne temeljijo vedno na nanodelcih, ampak so lahko njihova osnova tudi nanomateriali drugacnih oblik. Nanozdravila predstavljajo zdravila, ki izkorišcajo edinstvene fizikalne, kemijske in biološke lastnosti nanomaterialov in so izdelana s pomocjo nanotehnologije z namenom preprece­vanja, diagnosticiranja ali zdravljenja bolezni (8). Ravno zaradi omenjenih edinstvenih lastnosti izkazujejo nanodostavni si­stemi številne prednosti v primerjavi z dostavnimi sistemi vecjih velikosti (slika 1) in imajo zato velik potencial za upo­rabo na razlicnih podrocjih v biomedicini (9–11). V zadnjem desetletju so izsledki raziskav na podrocju far-macevtske nanotehnologije posegli na številna podrocja biomedicine, kot so dostava ucinkovin v možgane, zdra­vljenje bolezni tretjega sveta (tuberkuloze, malarije, okužb z virusom hIV), regenerativna medicina, zdravljene diabe­tesa, nevrodegenerativnih, avtoimunskih, vnetnih, srcno­žilnih in pljucnih bolezni. Najvec raziskav je trenutno na podrocju uporabe nanodostavnih sistemov za zgodnje od­krivanje in zdravljenje rakavih bolezni. Poleg tega nanodo­stavni sistemi veljajo za obetavne tudi na drugih aktualnih podrocjih, kot so dostava bioloških makromolekul (nuklein­skih kislin, peptidov in proteinov), boj proti bakterijski od­pornosti na antibiotike in nenazadnje razvoj nanoterano­stikov (12, 13). Slika 2: Število objav na temo nanoteranostikov v letih 2009–2020 (vir: podatkovna baza PubMed; iskalni niz: »nanotheranostics«; datum dostopa 22. 12. 2020). Figure 2: The publication record on nanotheranostics in years 2009–2020. The search was performed on 22th of December 2020 with the following query »nanotheranostics« (database: PubMed archive). Kljub hitremu razvoju farmacevtske nanotehnologije pa da­nes na trgu ni veliko nanozdravil. Glavni razlogi, ki ovirajo hitrejši preboj inovativnih nanozdravil na trg, so zapleteni tehnološki postopki, omejena ucinkovitost in vivo ter po­manjkljivo poznavanje njihove varnosti (12). Poleg nacrto­vanja in razvoja novih nanodostavnih sistemov ter tehnologij njihove izdelave je prav proucevanje njihovih lastnosti, s poudarkom na varnosti in ucinkovitosti, kljucnega pomena za njihov prehod iz raziskav v klinicno uporabo. 3 NANOTERANOSTIKI Pogost izziv, s katerim se srecujejo zdravniki v vsakdanji klinicni praksi, so razlike med posameznimi bolniki, kar po­sledicno vodi do razlicnega porazdeljevanja zdravilnih ucin­kovin, razlicne ucinkovitosti zdravljenja in razlicnih neželenih ucinkov. Personalizirana medicina, ki se ukvarja s prilaga­janjem zdravljenja posameznemu bolniku in katere cilj je dostava ustrezne ucinkovine ustreznemu bolniku ob ustrez­nem casu (13), vkljucuje uporabo inovativnih dostavnih si­stemov, med katerimi so tudi nanoteranostiki. Le-ti so zelo aktualni v raziskavah, kar kaže tudi število objav na temo nanoteranostikov v zadnjem desetletju (slika 2). Kot teranosticni pristop se pogosto pojmuje že samo pri­lagajanje zdravljenja na podlagi rezultatov razlicnih diagno­sticnih testov in vitro s podrocja genomike, epigenomike, transkriptomike, proteomike, metabolomike in proucevanja bioloških oznacevalcev. Nanoteranostika gre še korak dlje in poleg zdravljenja omogoca tudi diagnostiko in vivo, ki jo izvajamo pred, med ali po zdravljenju in na podlagi rezul­tatov tudi ustrezno prilagajamo potek zdravljenja bolnika (4, 14, 15). Nanoteranostik tako predstavlja multifunkcio­nalen nanodostavni sistem, v katerem sta združeni dia­gnosticna in terapevtska komponenta (13), zato omogoca socasno zdravljenje in spremljanje dostave ucinkovine, sprošcanja ucinkovine ali ucinkovitosti zdravljenja (4). 3.1 SESTAVA NANOTERANOSTIKOV Osnovna gradnika vsakega nanoteranostika sta terapevt-ska in diagnosticna komponenta, ki sta vgrajeni v ustrezen dostavni sistem ali obdani z ustrezno oblogo (slika 3) (12). Terapevtsko komponento v vecini primerov predstavlja zdravilna ucinkovina, ki je na dostavni sistem vezana (ne)ko­valentno, fizikalno ujeta v ogrodje dostavnega sistema ali pa je kovalentno vezana neposredno na diagnosticno kom­ponento in skupaj z njo vkljucena v ogrodje dostavnega sistema. V organizmu se lahko ucinkovina iz dostavnega sistema sprosti brez ali pod vplivom specificnih dražljajev (npr. ph, temperatura, ionska moc, prisotnost encimov, radiofrekvencno elektromagnetno valovanje, magnetno po­lje) in z vezavo na tarcno mesto sproži farmakološki ucinek (12, 16). Najpogosteje so zdravilne ucinkovine, ki so vgra­jene v nanoteranostike, protitumorne ucinkovine ali nu-kleinske kisline (npr. DNA, siRNA). Za doseganje terapevt­skega ucinka pa lahko izkorišcamo tudi edinstvene lastnosti samega nanoteranostika brez vgrajene ucinkovine (16). Primer takšnega sistema so nanoteranostiki, osnovani na superparamagnetnih nanodelcih železovega oksida (su­perparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPIONs), ki ob izpostavitvi izmenicnemu magnetnemu polju povzrocijo se­grevanje okoliškega tkiva na temperaturo > 43 °C, kar imenujemo magnetna hipertermija. Ta ucinek lahko izko­rišcamo za selektivno unicenje rakavih celic, saj so le-te na povišano temperaturo bolj obcutljive kot zdrave celice (17). Nekateri dostavni sistemi lahko terapevtski ucinek brez dostave ucinkovine sprožijo tudi kot fotosenzibilizatorji v fotodinamicnem zdravljenju, npr. SPIONi, kvantne pike in nanodelci zlata (17, 18). Diagnosticna komponenta omogoca neinvazivno sprem­ljanje mesta nahajanja dostavnega sistema v organizmu. Tako lahko spremljamo bodisi porazdeljevanje dostavnega sistema v organizmu, sprošcanje ucinkovine iz sistema v tarcnem tkivu (kovalentna vezava diagnosticne kompo­nente z ucinkovino) ali ucinkovitost zdravljenja (3, 11). V odvisnosti od izbrane metode vizualizacije se v nanotera­nostikih kot diagnosticne komponente uporabljajo razlicne snovi (preglednica 1) (12, 19). Ker ima vsaka metoda vizualizacije svoje prednosti in po­manjkljivosti, je pogosto smiselno, da v enem sistemu združimo vec razlicnih diagnosticnih komponent in tako izboljšamo diagnostiko z uporabo komplementarnih metod vizualizacije. Tak primer so kombinacije nanodelcev žele­zovega oksida s cianobarvilom (20), nanokapsulami zlata (21), kvantnimi pikami (22), fluoroforom (23) ali radionukli­dom (24). Bistveno pri izboru diagnosticne komponente je, da le-ta omogoca zgodnje odkrivanje bolezni, sprem­ljanje farmakokinetike dostavljene zdravilne ucinkovine ali spremljanje odziva na zdravljenje (15). Tretja komponenta nanoteranostika je dostavni sistem, ka­terega glavna naloga je socasna dostava terapevtske in diagnosticne komponente do ustreznega tarcnega mesta, v ustrezni koncentraciji in ob ustreznem casu. Dostavni si-stem je pomemben tudi za zagotavljanje funkcionalnih sku-pin za vezavo ligandov za ciljano dostavo ali ucinkovine. Opticno aktivne majhne molekule merjenje fluorescence ali bioluminiscence Ultrazvocna kontrastna sredstva (npr. mikromehurcki) sonografija Zlato racunalniška tomografija Preglednica 1: Najpogosteje uporabljane diagnosticne komponente v nanoteranostikih. *PET – pozitronska emisijska tomografija, SPECT – enofotonska emisijska racunalniška tomografija (12, 19). Table 1: The most commonly used diagnostic components in nanotheranostics. *PET – positron emission tomography, SPECT – single-photon emission computed tomography (12, 19). Slika 3: Shematski prikaz nanoteranostika. Figure 3: Schematic representation of nanotheranostic. Poleg tega površinske lastnosti dostavnega sistema mocno vplivajo na stabilnost koloidne disperzije nanoteranostika. Dostavni sistem je lahko z diagnosticnega in terapevtskega vidika inerten ali pa že sam predstavlja diagnosticno in/ali terapevtsko komponento (npr. nanodelci zlata, SPIONi, kvantne pike) (19). Najpogosteje za izdelavo nanoterano­stikov uporabljamo materiale, ki so že dobro raziskani in poznani za izdelavo nanodostavnih sistemov. Tako je pri izdelavi nanoteranostika potrebna le nadgradnja obstoje-cega nanodostavnega sistema z vgradnjo diagnosticne komponente. Med drugim kot gradnike dostavnih sistemov uporabljamo kovinske okside, kovine, zlato, silicijev dioksid, ogljik, polimere, lipide, proteine in peptide (17, 19). Dodati velja še, da lahko ucinkovino oz. terapevtsko komponento vgradimo tudi v oblogo, ki obdaja jedro z diagnosticno komponento (npr. obloga silicijevega dioksida, ki obdaja skupke SPIONov) (25). Pri razvoju nanoteranostika, torej združevanju diagnosticne in terapevtske komponente v en sam (dostavni) sistem, moramo dobro poznati lastnosti posameznih komponent in njuno kompatibilnost. Zgodi se lahko, da se lastnosti komponent zaradi vgradnje v nanoteranostik spremenijo ali celo »izgubijo« (npr. zdravilna ucinkovina ni vec farma­kološko aktivna, zdravilna ucinkovina prepreci ucinek kon­trastnega sredstva) ali pa ob združevanju komponent v en sistem ne dosežemo želenega sinergisticnega ucinka zdra­vljenja in zato razvoj takšnega sistema ni smiseln (19). Poleg tega lahko vkljucevanje kakršnih koli drugih kompo­nent v osnovni dostavni sistem pomembno spremeni nje­govo farmakokinetiko (16). 3.2 RAZDELITEV NANOTERANOSTIKOV Nanoteranostiki se med seboj razlikujejo v številnih lastno­stih, kot so oblika, velikost, sposobnost in nacin ciljanja tarcnega tkiva, vrsta vgrajene diagnosticne komponente in posledicno metoda vizualizacije v organizmu ter nena­zadnje osnovni material, iz katerega je izdelan dostavni si-stem (12). V literaturi najdemo razlicne delitve nanoterano­stikov na osnovi njihove strukture (19), metode vizualizacije sistema (13, 19) in osnovnega materiala za izdelavo do-stavnega sistema (17, 26, 27) (slika 4). 3.3 PREDNOSTI NANOTERANOSTIKOV Zaradi svoje velikosti izkazujejo nanoteranostiki, tako kot drugi nanomateriali, edinstvene fizikalne, kemijske in bio-loške lastnosti (slika 1). Glavni prednosti nanoteranostikov sta ucinkovita diagnostika in zdravljenje bolezni, kar je tudi poglavitni cilj personalizirane medicine. Nanoteranostiki so multifunkcionalni sistemi, ki omogocajo prilagajanje zdravljenja posamezniku (16). Z vkljuceno dia­gnosticno komponento takšni sistemi omogocajo nein­vazivno, hitro in ucinkovito zgodnjo diagnostiko, poleg tega pa s kombinacijo vec razlicnih tehnik vizualizacije omogocajo zaznavo in odkrivanje majhnih tumorskih lezij, ki so za konvencionalne metode vizualizacije nezaznavne (13, 27). Z vidika diagnostike in prilagajanja zdravljenja bolniku je izrednega pomena tudi dejstvo, da nanotera­nostiki omogocajo spremljanje ucinkovitosti zdravljenja hitreje in neodvisno od tradicionalnih izidov zdravljenja, ki se obicajno pokažejo šele po dolocenem casu. Tako lahko na primer z nanoteranostiki na osnovi SPIONov preko magnetnoresonancnega slikanja spremljamo bodisi uspešnost dostave ucinkovine do tarcnega tkiva takoj po aplikaciji (28) ali pa ugotavljamo uspešnost predhodnega zdravljenja socasno z aplikacijo naslednjega odmerka, ki ga na podlagi rezultata diagnostike lahko ustrezno prila­godimo (13). Zaradi velike kapacitete za vgrajevanje ucinkovin, mož­nosti spreminjanja površine nanoteranostikov in pripenja­nja ligandov (ne)posredno na njihovo površino, omogocajo nanoteranostiki socasno dostavo vec razlicnih ucinkovin in diagnosticnih komponent ter vizualizacijo z vec razli-cnimi oz. komplementarnimi metodami (12). Diagnosticna komponenta omogoca spremljanje nahajanja ali porazdeljevanja nanoteranostika pri ciljani dostavi, bodisi s pasivnim ciljanjem (povecana prepustnost tumorskega tkiva za nanodostavne sisteme in povecano zadrževanje v njem; magnetno ciljanje pod vplivom zunanjega ma-gnetnega polja) ali aktivnim ciljanjem (prepoznavanje tar­cnih mest na površini celic in vezava nanje preko specifi-cnih ligandov na površini nanoteranostika) (13, 16). Slika 4: Razlicne razdelitve nanoteranostikov. Figure 4: Different classifications of nanotheranostics. Pomembna prednost pri izdelavi nanoteranostikov je ta, da lahko dolocene vrste nanodelcev, ki jih danes že inten­zivno raziskujejo, uporabimo tudi kot kontrastna sredstva (npr. SPIONe, kvantne pike, nanodelce zlata) ali pa se že sami po sebi (tj. brez da bi vanje vgradili ali nanje vezali ucinkovino) uporabljajo v terapevtske namene (npr. SPIONi za magnetno hipertermijo, kvantne pike v fotodinamicnem zdravljenju) (17, 18, 26). Z uporabo takšnih nanodelcev iz­delamo nanoteranostike brez dodatnega vgrajevanja dia­gnosticne in/ali terapevtske komponente. 3.4 PRIMERI NANOTERANOSTIKOV V RAZISKAVAh Materiali, iz katerih so nanoteranostiki, bistveno vplivajo na njihove lastnosti in posledicno na njihov potencial za uporabo na razlicnih terapevtskih podrocjih. Najbolj razšir­jene so raziskave nanoteranostikov na osnovi SPIONov, ki jih je FDA odobrila kot kontrastno sredstvo za magnetno resonancno slikanje (17, 29). Nanodelci železovega oksida izkazujejo superparamagnetne lastnosti (tj. magnetna od­zivnost v prisotnosti zunanjega magnetnega polja in ma-gnetna neodzivnost v odsotnosti zunanjega magnetnega polja), ce je njihova velikost manjša od 20 nm, in tako omogocajo magnetno vodenje dostavnega sistema do tar­cnega tkiva ter ciljano dostavo razlicnih ucinkovin, genov in fluoroforov (17, 27). Vse navedene vrste aktivnih kom­ponent lahko vgradimo v oblogo nanoteranostika na osnovi SPIONov (npr. oblogo iz silicijevega dioksida) (25). V tera­pevtske namene lahko takšne nanoteranostike uporabimo tudi za doseganje magnetne hipertermije (17). SPIONom lahko nacrtovano spreminjamo površino in tako izboljšamo njihove fizikalno-kemijske in biološke lastnosti ali pa jih združimo z drugimi nanodostavnimi sistemi, kar razširi nji­hovo teranosticno uporabnost. Vgradimo jih lahko na pri­mer v peptidne nanodelce z radioaktivnimi izotopi (31) ali jih združimo s kvantnimi pikami v nanodostavni sistem (26). Kvantne pike so manj pogoste v raziskavah kot SPIONi, saj njihov toksikološki profil ni dovolj jasen in je relativno problematicen (17). Kvantne pike so nanokristali polprevodnih materialov (npr. CdTe/CdSe, InAs/ZnSe, InAs/InP/ZnSe, Cd3P2), katerih opticne lastnosti lahko natancno prilagajamo s spreminja­njem velikosti in sestave delcev (32). Kvantne pike pred­stavljajo diagnosticno komponento, saj ob osvetlitvi s svet­lobo dolocene valovne dolžine fluorescirajo (33). Lahko jih obdamo z ustrezno oblogo, v katero vgradimo ucinkovine, gene ali oboje hkrati oz. jih vgradimo v druge nanodostavne sisteme (34). Tak primer je socasna vgradnja fluorescencne ucinkovine doksorubicina, RNA in kvantnih pik v liposome. Takšen nanoteranosticni sistem omogoca spremljanje nje­gove lokacije in vivo (na osnovi fluorescence kvantnih pik) in socasno spremljanje sprošcanja ucinkovine (na osnovi fluorescence doksorubicina) (35). Za izboljšanje diagnosti-cnih lastnosti sistema lahko vanj poleg kvantnih pik vgra­dimo še SPIONe. Kvantne pike lahko predstavljajo tudi sa­mostojno terapevtsko komponento kot fotosenzibilizatorji v fotodinamicnem zdravljenju (18). V raziskavah pogosto proucujejo tudi nanoteranostike na osnovi nanodelcev zlata. Nanodelci zlata predstavljajo kon­trastno sredstvo za racunalniško tomografijo, površinsko plazmonsko resonanco in fotoakusticno slikanje (17). Za dostavo terapevtskih komponent izkorišcamo površino na­nodelcev zlata, ki je obicajno spremenjena tako, da ima vezane tiolne skupine, kar omogoca vezavo razlicnih zdra­vilnih ucinkovin (tudi genov), ki se nato v celicah izmenjajo z glutationom in tako sprostijo s površine nanodelcev (17, 26). Takšni nanodelci so stabilni, varni, iz telesa jih odstranijo makrofagi ali se izlocijo z urinom in omogocajo nadaljnje spremembe površinskih lastnosti nanodostavnega sistema; njihova slabost pa je predvsem relativno visoka cena (17). Kot terapevtska komponenta nanodelci zlata izkazujejo velik potencial predvsem kot fotosenzibilizatorji v fotodina-micnem zdravljenju in za doseganje hipertermije ob izpo­stavitvi bližnji infrardeci svetlobi (17, 33). Tudi nanodelci silicijevega dioksida se v raziskavah prou-cujejo kot osnova nanoteranostikov. Ti nanodelci izkazujejo veliko kapaciteto za vgradnjo ali vezavo širokega spektra ucinkovin in diagnostikov (17), vanje pa lahko vgradimo tudi druge nanomateriale, npr. SPIONe (25), nanodelce zlata (36) ali kvantne pike (37). Nanodelci silicijevega diok­sida (žargonsko tudi nanodelci silike) se po vnosu v orga­nizem izlocijo iz telesa v relativno kratkem casu preko ledvic in niso reaktivni niti toksicni (17). Podobno kot nanodelci silicijevega dioksida se uporabljajo tudi polimerni nanodelci in polimerni miceli, ki služijo kot dostavni sistemi za razlicne ucinkovine in kontrastna sredstva, npr. SPIONe (38), kvantne pike (26), gadolinij (26), nanodelce zlata (39). Med drugimi nanomateriali, ki jih še proucujejo za pripravo na­noteranostikov, velja omeniti še ogljikove nanocevke, ki omogocajo vgradnjo in dostavo ucinkovin ter jih in vivo lahko zaznamo s fotoakusticnim slikanjem in Ramansko spektroskopijo (17). Kljub navedenemu potencialu za upo­rabo v teranostiki pa je varnost uporabe ogljikovih nanocevk vprašljiva, saj imajo z obliko pogojeno toksicnost in se v organizmu razgrajujejo izredno pocasi, njihovi zaostanki pa lahko vodijo tudi do dolgorocnih poškodb celic (27, 40). 4 SKLEP V casu, ko se obravnava bolnikov vse bolj preusmerja na podrocje personalizirane medicine, potekajo številne razi­skave na podrocju nanoteranostikov. Kjub številnim pred­nostim, ki jih obeta uporaba nanoteranostikov pred tradi­cionalnimi pristopi zdravljenja in diagnostike, ti sistemi danes (še) niso na ustrezni stopnji razvoja za prehod v kli-nicno uporabo. Glavni izziv raziskav ostaja dokazovanje njihove varnosti in biokompatibilnosti, ki sta kljucna vidika za klinicno uporabo nanoteranostikov. Poleg omenjenih raziskav bo v prihodnje izrednega pomena tudi razvoj na­noteranostikov v smeri, da bodo omogocali enostavno in hitro prilagajanje potrebam bolnika. Uporaba nanoterano­stikov ne bo postavila obstojecih medicinskih praks na glavo in pahnila konvencionalnih nacinov zdravljenja ter diagnostike v pozabo, vsekakor pa lahko pomeni pomem­ben korak v smeri personalizirane medicine in tako pripo-more k vecji ucinkovitosti, kakovosti in varnosti zdravlje­nja. 5 LITERATURA 1. Jarvis LM. The new drugs of 2018. Chem Eng News 2019; 3 (97): 32–35. 2. Victoria Rees. Summarising 2019: a year of firsts for the EMA. https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/article/11059 8/summarising-2019-a-year-of-firsts-for-the-ema/. Dostop: 9-4­2021. 3. Zhong H, Chan G, Hu Y, Hu H, Ouyang D. A Comprehensive map of FDA-approved pharmaceutical products. Pharmaceutics. 2018; 10 (4): 263-281. 4. Lammers T, Aime S, Hennink WE, Storm G, Kiessling F. Theranostic nanomedicine. Acc Chem Res. 2011; 44 (10): 1029–1038. 5. Feynman RP. There’s plenty of room at the bottom. Annu Meet Am Phys Soc. 1959. 29; 1–13. 6. Kreuter J. Nanoparticles -a historical perspective. Int J Pharm. 2007; 331 (1): 1–10. 7. The European Commission: Commission recommendation of 18 October 2011 on the definition of nanomaterial (2011/696/EU). Official Journal of the European Union 2011; 275: 38-40. 8. European Medicine Agency (CHMP): Reflection paper on nanotechnology-based medicinal products for human use (EMEA/CHMP/79769/2006). 9. Prijic S, Sersa G. Magnetic nanoparticles as targeted delivery systems in oncology. Radiol Oncol. 2011; 45 (1): 1–16. 10. Kristl J. Vpliv nanotehnologije na razvoj zdravil. Farm Vestn. 2012; 63:67–72. 11. Markides H, Rotherham M, El Haj AJ. Biocompatibility and toxicity of magnetic nanoparticles in regenerative medicine. J Nanomater. 2012; 1–11. 12. Kocbek P. Novosti na podrocju farmacevtske nanotehnologije. Farm Vestn. 2012; 63: 75–81. 13. Mura S, Couvreur P. Nanotheranostics for personalized medicine. Adv Drug Deliv Rev. 2012; 64 (13): 1394–1416. 14. Pene F, Courtine E, Cariou A, Mira J-P. Toward theragnostics. Crit Care Med. 2009; 37 (Supplement): S50–58. 15. Chen X, Wong STC. Chapter 1 -Cancer theranostics: An introduction. In: Chen X, Wong S. Cancer Theranostics. Oxford: Academic Press; 2014: 3–8. 16. Fang C, Zhang M. Nanoparticle-based theragnostics: Integrating diagnostic and therapeutic potentials in nanomedicine. J Controlled Release. 2010; 146 (1): 2–5. 17. Xie J, Lee S, Chen X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv Drug Deliv Rev. 2010; 62 (11): 1064–1079. 18. Bakalova R, Ohba H, Zhelev Z, Ishikawa M, Baba Y. Quantum dots as photosensitizers? Nat Biotechnol. 2004; 22 (11): 1360–1361. 19. Janib SM, Moses AS, MacKay JA. Imaging and drug delivery using theranostic nanoparticles. Adv Drug Deliv Rev. 2010; 62 (11): 1052–1063. 20. Santra S, Kaittanis C, Grimm J, Perez JM. Drug/dye-loaded, multifunctional iron oxide nanoparticles for combined targeted cancer therapy and dual optical/magnetic resonance imaging. Small. 2009; 5 (16): 1862–1868. 21. Bardhan R, Chen W, Perez-Torres C, Bartels M, Huschka RM, Zhao LL, et al. Nanoshells with targeted simultaneous enhancement of magnetic and optical imaging and photothermal therapeutic response. Adv Funct Mater. 2009; 19 (24): 3901–3909. 22. Park J-H, von Maltzahn G, Ruoslahti E, Bhatia SN, Sailor MJ. Micellar hybrid nanoparticles for simultaneous magnetofluorescent imaging and drug delivery. Angew Chem Int Ed Engl. 2008; 47 (38): 7284–7288. 23. Veiseh O, Sun C, Fang C, Bhattarai N, Gunn J, Kievit F, et al. Specific targeting of brain tumors with an optical/magnetic resonance imaging nanoprobe across the blood-brain barrier. Cancer Res. 2009; 69 (15): 6200–6207. 24. Choi J, Park JC, Nah H, Woo S, Oh J, Kim KM, et al. A hybrid nanoparticle probe for dual-modality positron emission tomography and magnetic resonance imaging. Angew Chem Int Ed Engl. 2008; 47 (33): 6259–6262. 25. Kralj S, Drofenik M, Makovec D. Controlled surface functionalization of silica-coated magnetic nanoparticles with terminal amino and carboxyl groups. J Nanoparticle Res. 2010; 13: 2829–2841. 26. Ho JA, Wang L-S, Chuang M-C. Nanotheranostics -a review of recent publications. Int J Nanomedicine. 2012; 7: 4679–4695. 27. Sonali, Viswanadh MK, Singh RP, Agrawal P, Mehata AK, Pawde DM, et al. Nanotheranostics: Emerging strategies for early diagnosis and therapy of brain cancer. Nanotheranostics. 2018; 2 (1): 70–86. 28. Abd Elrahman AA, Mansour FR. Targeted magnetic iron oxide nanoparticles: Preparation, functionalization and biomedical application. J Drug Deliv Sci Technol. 2019; 52: 702–712. 29. Drude N, Tienken L, Mottaghy FM. Theranostic and nanotheranostic probes in nuclear medicine. Methods. 2017; 130: 14–22. 30. Medarova Z, Pham W, Farrar C, Petkova V, Moore A. In vivo imaging of siRNA delivery and silencing in tumors. Nat Med. 2007; 13 (3): 372–377. 31. Lee H-Y, Li Z, Chen K, Hsu AR, Xu C, Xie J, et al. PET/MRI dual-modality tumor imaging using arginine-glycine-aspartic (RGD)-conjugated radiolabeled iron oxide nanoparticles. J Nucl Med Off Publ Soc Nucl Med. 2008; 49 (8): 1371–1379. 32. Ranjbar-Navazi Z, Omidi Y, Eskandani M, Davaran S. Cadmium-free quantum dot-based theranostics. TrAC Trends Anal Chem. 2019; 118: 386–400. 33. Misra R, Kandoi S, Varadaraj S, Vijayalakshmi S, Nanda A, Verma RS. Nanotheranostics: A tactic for cancer stem cells prognosis and management. J Drug Deliv Sci Technol. 2020; 55: 101457. 34. Chen AA, Derfus AM, Khetani SR, Bhatia SN. Quantum dots to monitor RNAi delivery and improve gene silencing. Nucleic Acids Res. 2005; 33 (22): e190. 35. Bagalkot V, Zhang L, Levy-Nissenbaum E, Jon S, Kantoff PW, Langer R, et al. Quantum dot-aptamer conjugates for synchronous cancer imaging, therapy, and sensing of drug delivery based on bi-fluorescence resonance energy transfer. Nano Lett. 2007; 7 (10): 3065–3070. 36. Vivero-Escoto JL, Slowing II, Wu C-W, Lin VS-Y. Photoinduced intracellular controlled release drug delivery in human cells by gold-capped mesoporous silica nanosphere. J Am Chem Soc. 2009; 131 (10): 3462–3463. 37. Koole R, van Schooneveld MM, Hilhorst J, Castermans K, Cormode DP, Strijkers GJ, et al. Paramagnetic lipid-coated silica nanoparticles with a fluorescent quantum dot core: a new contrast agent platform for multimodality imaging. Bioconjug Chem. 2008; 19 (12): 2471–2479. 38. Guthi JS, Yang S-G, Huang G, Li S, Khemtong C, Kessinger CW, et al. MRI-visible micellar nanomedicine for targeted drug delivery to lung cancer cells. Mol Pharm. 2010; 7 (1): 32–40. 39. Umeda Y, Kojima C, Harada A, Horinaka H, Kono K. PEG-Attached PAMAM Dendrimers encapsulating gold nanoparticles: growing gold nanoparticles in the dendrimers for improvement of their photothermal properties. Bioconjug Chem. 2010; 21 (8): 1559–1564. 40. Jain N, Tiwari S. Biomedical application of carbon nanotubes (CNTs) in vulnerable parts of the body and its toxicity study: A state-of-the-art-review. Materials Today: Proceedings. 2021; clanek v tisku – dostopno na: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S221478532 1009925. FILTRIRANJE ZRAKA IN RAZVOJ OBRAZNIh MASK IZ NANOVLAKEN ZA ZAšCITO PRED VIRUSI AIR FILTRATION AND ThE DEVELOPMENT OF NANOFIBER FACE MASKS FOR PROTECTION AGAINST VIRUSES AVTORJI / AUThORS: Maruša Gostiša1, mag. farm. Jurij Gostiša2, mag. str. doc. dr. Mirjam Gosenca Matjaž3, mag. farm. prof. dr. Julijana Kristl3, mag. farm. 1 Lekarna Ljubljana, Komenskega 11, 1000 Ljubljana 2 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za strojništvo, Katedra za energetsko strojništvo, Aškerceva 6, 1000 Ljubljana 3 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko tehnologijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E mail: julijana.kristl@ffa.uni lj.si POVZETEK Onesnaženje zraka z delci in pandemija covid-19 sta povzrocila svetovno potrebo po ucinkovitih ukrepih za zašcito zdravja ljudi. Membranska filtra­cija velja danes za najucinkovitejšo in najzaneslji­vejšo fizikalno metodo za zašcito pred vsemi vrstami delcev iz zraka, ceprav so obrazne maske s filtri z visokim kakovostnim koeficientom in proti­infektivnimi lastnostmi še vedno izziv za proizvajalce mask in potrošnike. Prispevek nudi bralcem osnovni opis za širše razumevanje zašcite dihal, ki zajema vrste delcev v zraku, filtracijske mehanizme in testi­ranje ucinkovitosti filtrov ter vrste obraznih mask in njihovo stopnjo zašcite. Nato se ozremo v bližnjo prihodnost, kjer je najvec zanimanja za razvoj novih filtrov in obraznih mask za odstranjevanje virusov, kar je možno doseci predvsem z nanotehnološkimi pristopi. KLJUCNE BESEDE: delci v zraku, nanotehnologija, obrazna maska, ucinkovitost filtriranja delcev, virus ABSTRACT Air-particle pollution and the covid-19 pandemic have resulted in a huge global need for specific and effective measures to protect human health. Mem­brane filtration is now considered the most efficient and reliable physical method against air pollutants, although face masks with filters with high quality factors and antiinfective properties are still a chal­lenge for mask manufacturers and consumers. here we provide a basic description for a broader understanding of respiratory protection, covering types of particles in the air, filtration mechanisms and testing of the filter effectiveness, along with the types of face masks and offered protection perfor­mance. We then look into the near future, where the greatest interest is for the development of new filters and face masks to remove viruses, which can be achieved above all through nanotechnological ap­proaches. KEY WORDS: face mask, nanotechnology, particle filtration effi­ciency, particulate matter, virus 1 UVOD Narašcanje svetovne populacije in razvoj družbe neizogibno povecujeta obseg industrije in migracij, kar vodi v vecjo onesnaženost zraka s plini in delci, ki predstavljajo veliko nevarnost za zdravje (1). Delci v zraku fizikalno predstavljajo aerosol, ki je opredeljen kot disperzni sistem inertnih in bio-loških trdnih in tekocih delcev razlicnih velikosti. Po najno­vejšem porocilu Svetovne zdravstvene organizacije (WhO) živi danes 91 % svetovnega prebivalstva v krajih, kjer ka­kovost zraka ne dosega njenih smernic (2). Raziskava o kakovosti zraka v Pekingu januarja 2013 je pokazala, da predstavljajo mikroorganizmi med vdihanimi delci v velikosti od 2,5 do 10 µm vec kot 80-odstotni delež (3). Med njimi so najpogostejše bakterijske in glivne vrste, ki so odgovorne za razlicne alergije ter širjenje dihalnih in drugih bolezni. število znanstvenih objav in védenje o atmosferskih delcih (particulate matter, PM) se je strmo povecevalo v zadnjih dveh desetletjih, skokovito pa ob izbruhu bolezni covid-19 leta 2020, ki jo povzroca virus SARS-CoV-2 (4). Vedno vec je dostopnih podatkov o kakovosti zraka, številne znan­stvene raziskave pa potrjujejo vpliv aerosolov na zdravje ljudi (4). Medtem ko so fizikalno-kemijske lastnosti anor­ganskih onesnaževal že relativno dobro raziskali, pa vemo o mikroorganizmih v zraku bistveno manj, še najmanj pa o virusih. Raziskovalci ugotavljajo, da vsi zelo majhni delci cloveku niso nevarni, ce le ne pridejo v organizem v preve­likem številu. Topni in razgradljivi delci se po vdihu pocasi izlocijo, medtem ko je pri težko topnih (npr. kovinski oksidi, azbest) in bioloških delcih situacija precej bolj zapletena. Virusi so mnogo manjši kot številni drugi delci v zraku, zato zahteva njihovo odstranjevanje poseben pristop (slika 1). FILTRIRANJE ZRAKA IN RAZVOJ OBRAZNIh MASK IZ NANOVLAKEN ZA ZAšCITO PRED VIRUSI Slika 1: Relativna primerjava velikosti virusa z drugimi vrstami delcev v zraku; PM -atmosferski delci (prirejeno po 4). Figure 1: Relative comparison size of a virus with other particle types in air; PM -particulate matter (adapted from 4). Znanih je nekaj vec kot 5.000 virusnih vrst, ki lahko okužijo vse vrste organizmov, od arhej in bakterij do gliv, rastlin in živali in ljudi. Virus SARS-CoV-2 je okrogle oblike s preme­rom 60 do 140 nm in negativnim nabojem na površini. Notranjost virusne kroglice izpolnjuje predvsem RNA, ki je virusni genom, obdan z zašcitno lipidno-beljakovinsko ovoj­nico, iz katere štrlijo »izrastki« proteina S, ki predstavljajo vezavno regijo, preko katere se virus veže na dolocene re-ceptorje v membrani gostiteljskih celic. Virusi se razmno­žujejo le v živih celicah, ker sami nimajo mehanizmov za lastno reprodukcijo. Mnogo virusov povzroca nalezljive bo­lezni, saj s svojim delovanjem negativno vplivajo na gosti­teljske celice (5, 6). Virusi se prenašajo preko dotikalnih površin in z vnosom v dihala preko rok ter s kapljicnim prenosom, pri cemer delež respiratornih kapljic, ki nastajajo med govorjenjem, kihanjem in kašljanjem, vsebuje viruse (6). Respiratorne kapljice s premeri nad 20 µm se odstranijo iz zraka zaradi gravitacije tako, da padejo na tla ali se prilepijo na površine in ne po­tujejo dlje kot 1 do 2 m, manjše kapljice pa lahko ostanejo v zraku mnogo daljši cas, tudi do vec ur. V procesu trkov z drugimi delci in molekulami zraka privzamejo njegovo termicno energijo, ki jim omogoci nakljucno gibanje v razli-cnih smereh. Na tak nacin vecajo obmocje, po katerem se gibljejo. K širitvi okuženega zraka prispevajo tudi zracni to-kovi v prostoru in termika, pri kateri se toplejši zrak dviga. Ko tak zrak z okuženimi kapljicami vdihnemo, aerosoli po­tujejo vzdolž dihalne poti. Kje se ustavijo, je odvisno pred­vsem od njihove velikosti in gostote. Delci, vecji od 10 µm, se obicajno odložijo že na zacetku dihalne poti, delci, manjši od 1 µm, pa prispejo do pljucnih mešickov (slika 2) (7). Z zmanjševanjem velikosti kapljic zaradi izhlapevanja vode, odvisno od relativne vlage in temperature, se po­daljšuje trajanje njihovega lebdenja v zraku (8). Kako se torej zašcititi pred tem? Dokazano je, da je uporaba fizicnih ovir, kot so zašcitne maske za dihala, ucinkovit pristop za zmanjšanje širjenja bakterijskih in tudi virusnih infekcij z iz­dihanimi kapljicami, predvsem kadar jih posamezniki upo­rabljajo v zaprtih prostorih in je razdalja med njimi majhna (9). Kot odziv na izbruh virusa SARS-CoV-2 se je uporaba obraznih mask mocno povecala (8). Danes je na voljo malo podatkov o zmogljivosti tkanin in drugih membran, ki jih uporabljajo za izdelavo obraznih zašcitnih mask, zlasti o njihovi ucinkovitosti filtriranja delcev z velikostjo od nekaj 10 nm do 1 µm (2, 9, 10). Pogosto so maske sestavljene iz vec razlicnih slojev net-kanih materialov, pri cemer ima vsak sloj doloceno lastnost in funkcijo. Skozi medicinsko obrazno masko zrak vstopa in izstopa. Zunanji sloj (obicajno moder ali crn) je nepre­mocljiv in odbija tekocino. Srednji sloj preprecuje delcem ali patogenom nad doloceno velikostjo prodiranje v katero koli smer. Sloj najbližje koži ujame vdihane delce z zunanje strani, z notranje pa izdihane kapljice. Vec slojev skupaj ucinkovito šciti tako uporabnika kot okolico s filtriranjem delcev in patogenov. Ideja in namen medicinskih mask za obraz je filtriranje zraka in s tem preprecevanje prenosa vseh vrst kapljic in delcev v pljuca, vkljucno bakterij in viru­sov. Dobri filtri so tisti, ki ucinkovito odstranjujejo delce vseh velikosti, povzrocijo na filtru nizek padec zracnega tlaka, imajo visoko mehansko trdnost, so lahki in udobni za nošenje ter tudi poceni (2, 9). 2 MEHANIZMI FILTRIRANJA ZRACNIH DELCEV IN OMEJITVE ZA VIRUSE Filtre za filtracijo delcev iz zraka sestavljajo tkanine ali drugi vlaknasti materiali, ki s svojo strukturo in lastnostmi ovirajo prehod delcev skoznje. V zadnjem casu so predmet razi­skav predvsem filtrirne vrece (fabric filter) in vlaknaste mem­brane (9, 11). Osnova filtrirnih vrec temelji na filtriranju del­cev po nacelu velikosti (size-exclusion principle). V primerjavi z njimi lahko vlaknaste membrane, ki so pripra­vljene iz nakljucno razporejenih vlaken eno na drugo, uja­mejo delce tudi po drugih mehanizmih, predvsem preko elektrostaticnega naboja. Na ucinkovitost odstranjevanja delcev iz zraka vplivajo lastnosti delcev samih, kot so ke­mijska sestava delcev, velikost in oblika, ter hitrost pretoka zraka in lastnost površine, kamor se delci odlagajo. V splošnem velja, da ucinkovitost filtra narašca z narašcanjem mase cistega filtra, se pa zmanjšuje z narašcanjem hitrosti gibanja zraka (11). Filtrirne vrece vecinoma uporabljajo v velikih industrijskih obratih za izlocanje trdnih delcev iz plinov. Vlaknasti filtri so namenjeni uporabi v delavnem okolju, skozi katerega pre­haja zrak. Za razliko od filtrirnih vrec prihaja pri slednjih do nalaganja delcev vzdolž celotne debeline filtra in ne le na površini. Kateri mehanizmi nastopajo pri odstranjevanju delcev iz zraka, prikazuje slika 3 (12). Do prestrezanja pride, ko se delec, ki potuje s tokom zraka, zaleti v vlakno in tam naloži. Verjetnost, da se delec zaleti v vlakno filtra, se veca z vecanjem premera delca (slika 4) (12). Zaradi vpliva inercije oz. vztrajnostnih sil delca, se le­ta ne giblje po tokovnici zraka, temvec v svoji smeri gibanja, dokler se ne zaleti ob vlakno in se na njem deponira. Vpliv mehanizma inercije se veca s povecevanjem mase in hi-trosti delca. V primeru tipicne hitrosti zraka pri filtraciji po­stane mehanizem inercije prevladujoc za delce s premerom, vecjim od 1 µm. Difuzija delcev je posledica Brownovega gibanja molekul zraka. Zelo majhni delci, ki potujejo z zra-cnim tokom, so ob gibanju skozi vlakna podvrženi trkanju z molekulami zraka, kar povzroci nakljucno spreminjanje smeri in je lahko razlog, da se delec zaleti ob vlakno in na njem deponira. Ucinek tega mehanizma se povecuje z manjšanjem velikosti delcev in zmanjševanjem hitrosti gi­banja zraka. Tako se skoraj vsi nanodelci s premerom < 100 nm v filtru naložijo z difuzijo (11, 12). V dolocenih primerih lahko poleg navedenih mehanizmov na zadrževanje delcev vplivajo še elektrostaticne interakcije, Slika 2: Nalaganje delcev iz zraka vzdolž dihalne poti glede na velikost; PMx – velikost delcev (prirejeno po 7). Figure 2: Deposition of air particles along the airway according to size; PMx – particule size (adapted after 7). Slika 3: Mehanizmi zadrževanja delcev na filtru v odvisnosti od njihovega premera (prirejeno po 12). Figure 3: Mechanisms of particle retention on a filter depending on their diameter (adapted after 12). Slika 4: Osnovni mehanizmi filtriranja delcev iz zraka na filtru, nalaganje v pljucih ter prevladujoc mehanizem pri doloceni velikosti delca (12). Figure 4: Basic mechanisms of air particle filtration at filters, deposition in the lungs, and the predominant mechanism at a certain particle size (12). ki povzrocijo, da se delec in vlakno z nasprotnim nabojem privlacita (slika 4). Ce je nabit samo delec ali samo vlakno, pa za medsebojni privlak zadostuje že, da je nenabit ele­ment polariziran. Zbiranje delcev na vlaknu zaradi elektro­staticne sile se z vecanjem hitrosti zraka zmanjšuje. Ker elektrostaticna polja povecajo ucinkovitost filtracije brez povecanja upora zracnemu toku in hkrati ne povecajo padca tlaka, so taki filtrirni sistemi še posebej energetsko ucinkoviti. Po daljši uporabi lahko nastopi sencenje nabojev, kar zmanjša sposobnost elektrostaticnih interakcij. Mehanizmi filtracije si sledijo od vecjih k manjšim delcem: sedimentacija, inercijski trki, prestrezanje, difuzija in na­zadnje elektrostaticni privlak (12). Za delce s premerom vec kot 10 µm prevladuje sedimentacija zaradi gravitacije, od 1 do 10 µm prevladujeta prestrezanje in inercija, pri ae­rosolih velikosti do 100 nm prevladujeta mehanizma pre­strezanja in difuzije, za še manjše delce pa je možno ucin­kovito prestrezanje le z elektrostaticnim privlakom. Slednji je še posebej ucinkovit pri nizkih hitrostih zraka, ki so zna-cilne za dihanje skozi obrazne maske. Ucinkovitost naštetih mehanizmov filtracije je odvisna pred­vsem od velikosti delcev, hitrosti pretoka zraka in gostote vlaken. Zanimivo je, da so pri preverjanju ucinkovitosti fil­tracije nanodelcev dokazali, da obstaja med 100 in 500 nm »interakcijsko okno«, v katerem ucinkovitost filtracije opazno pade (slika 3). Tu je skupni ucinek difuzije in pre­strezanja najmanjši, torej je tudi odstotek delcev, ki se v filtru zadržijo, najmanjši (2). Ta ugotovitev ima velik vpliv na filtriranje virusov in nanodelcev samih, tudi ce so agregirani ali hidratirani. Pomembno je natancno poznavanje fizikalnih nacel filtracije, saj relativna ucinkovitost filtrov za zadrževanje virusov ni popolnoma znana, še zlasti odstranjevanje v ob-mocju njihovih velikosti (13). 3 STANDARDI IN NORMATIVI ZA ZRACNE FILTRE IN OBRAZNE MASKE 3.1 ZAKONODAJA ZRACNIh FILTROV PRI SPLOšNEM PREZRACEVANJU Mednarodna organizacija za standardizacijo (ISO) je po­stavila svetovni standard ISO 16890 za klasifikacijske in preizkusne postopke za dolocitev glavnih znacilnosti zra-cnih filtrov v splošnih prezracevalnih sistemih (7). Ameriška agencija za okolje, Svetovna zdravstvena organizacija in Evropska unija so prvic skupaj dolocile tri razrede delcev v zraku z velikostjo med 0,3 µm in 10 µm (preglednica 1). Standard ISO 16890 temelji na tem, kje se delci iz zraka, ki ga dihamo, odložijo vzdolž dihalne poti. Zracne filtre po tem standardu vrednotijo v laboratoriju glede na njihovo zmožnost odstranjevanja delcev iz zraka, kar podaja ucin­kovitost filtracije (7). Zaradi škodljivosti, dolgotrajnosti lebdenja v zraku in po­gostosti potrebujejo najvec pozornosti delci, ki so manjši ali enaki 1 µm. Najlažji in najmanjši delci so najštevilcnejši in najnevarnejši, ostanejo v zraku najdlje, ker lebdijo, in se širijo skupaj z gibajocim se zrakom. Ti delci po vdihu pro-drejo najgloblje v pljuca. Delci z velikostjo 1 µm prispevajo k skupni masi zraka le nekaj odstotkov, k skupnemu številu vseh delcev pa vec kot 90 %. Za izboljšanje kakovosti zraka v zaprtih prostorih in preprecevanje okužb so ucin­koviti filtri v medicinskih maskah za obraz. Standard ISO 16890 podaja ucinkovitost filtracije za PM1, PM2,5 in PM10, torej pokriva mikrometrsko podrocje, kamor sodijo po ve­likosti bakterije in glive, virusi in nanodelci pa v tem stan­dardu niso omenjeni (7). 3.2 STANDARDI IN ZAhTEVE ZA MEDICINSKE MASKE ZA OBRAZ Pri dihanju, govorjenju, kašljanju, kihanju in podobno na­stanejo manjše ali vecje kapljice, vecinoma velikosti med 0,5 µm in 12 µm, ki pa se na zraku hitro sušijo in manjšajo (10). Zahteve za medicinske maske za obraz ureja evropska zakonodaja v standardu EN 14683:2019+AC:2019: Me-dicinske maske za obraz (14). V splošnih zahtevah je na­vedeno, da so medicinske maske za obraz medicinski pri­pomocki, obicajno sestavljeni iz filtrirne plasti, ki je namešcena, vezana oz. oblikovana med plastmi tkanine. Medicinske maske med namensko uporabo ne smejo raz­pasti, se razcepiti ali raztrgati. Pri izbiri filtrskih in slojnih materialov je pomembna mikrobna cistost. Maske morajo biti narejene iz materialov, ki omogocajo prileganje preko nosu, ust in brade uporabnika ter morajo zagotoviti tesno prileganje ob straneh. Lahko so razlicnih oblik in imajo do-datne elemente, ki zašcitijo uporabnika pred brizganjem in kapljicami. Zahteve za delovanje respiratornih mask so do-datno opredeljene v standardu EN 149:2001+A1:2009: Pripomocki za zašcito dihal (15). Funkcionalne zahteve za medicinske maske vkljucujejo podpoglavja za naslednje preizkuse: • Splošno velja, da je vse preizkuse treba izvesti na koncnih izdelkih ali vzorcih, odvzetih iz serije koncnih izdelkov. • Ucinkovitost bakterijske filtracije (bacterial filtration effi­ciency, BFE) – medicinske maske za obraz morajo ustre­zati minimalni vrednosti BFE za doloceno vrsto mask. • Zracnost (breathability) – medicinske maske za obraz morajo ustrezati minimalni vrednosti zracnosti (tlacna ra­zlika) za doloceno vrsto maske. • Odpornost proti prodiranju tekocine – medicinske maske za obraz morajo po preizkusu na odpornost proti prodi­ranju tekocine ustrezati najmanjši vrednosti, ki je nave-dena za tip maske IIR. • Mikrobna obremenitev (bioburden) – medicinske maske morajo biti skladne s standardom (= 30 CFU/g). • Biokompatibilnost medicinskih mask za obraz kot povr­šinskih pripomockov z omejenim stikom mora biti doka­zana in dokumentirana v skladu s standardom. V preglednici 2 so predstavljene vrste medicinskih mask za obraz po standardu EN 14683:2019. Maske so razvrš-cene v tri kategorije, tip I, tip II in tip IIR, glede na ucinkovi­tost filtracije bakterij z zahtevanimi vrednostmi za posa­mezno razvrstitev (14). Poimenovanje mask na trgu in v medijih je razlicno (npr. zašcitne, medicinske, kirurške, obrazne), kar pogosto pov­zroca zmedo. Priporocljivo je, da pred odlocitvijo za nakup Preglednica 1: Velikostni razredi delcev v zraku, njihova standardna oznaka, obmocje filtriranja, primeri delcev in mesto nalaganja vzdolž dihalne poti po standardu ISO 16890. Table 1: Air particle size classes, their standard designation, filtration area, particle examples and place of loading in the lungs according to ISO 16890 standard. = 10 µm PM10 0,3 = x = 10 prašni delci, bakterije, glive, mikro-in nanodelci, virusi centralni dihalni sistem (nos in grlo) = 2,5 µm PM2,5 0,3 = x = 2,5 manjši delci, bakterije, glive, mikro-in nanodelci, virusi periferni dihalni sistem (sapnik, bronhialne cevi) = 1 µm PM1 0,3 = x = 1 virusi, delci, nastajajoci pri nepopolnem izgorevanju, nanodelci pljucni mešicki, lahko tudi v krvni obtok Preglednica 2: Funkcionalne zahteve za medicinske maske za obraz razlicnih vrst (14). Table 2: Functional requirements for medical face masks of different types (14). Ucinkovitost filtracije bakterij ( % ) = 95 = 98 = 98 Tlacna razlika (Pa/cm2 ) < 29,4 < 29,4 < 49,0 Odpornost na prodiranje tekocin (kPa) Ni zahtevano Ni zahtevano = 16,0 Mikrobna obremenitev (CFU/g) = 30 = 30 = 30 a Medicinske maske za obraz tipa I smejo uporabljati samo pacienti in druge osebe za zmanjšanje tveganja za širjenje okužb, zlasti v epidemicnih ali pandemicnih razmerah. Maske tipa I niso namenjene zdravstvenim delavcem v operacijski dvorani ali v drugih zdravstvenih okoljih s podobnimi zahtevami, pac pa se v ta namen uporabljajo maske tipov II in IIR. Obrazne maske tipa IIR so odporne tudi na prodiranje tekocine; CFU/g – (colony foming units/g) je enota za ocenitev števila živih bakterij, ki tvorijo kolonije v 1 g vzorca. maske poišcemo podatek o njeni ucinkovitosti filtracije in tlacni razliki ali še bolje njen kakovostni kolicnik (podpoglavje 3.4.5). Razlicne vrste obraznih mask se razlikujejo po iz­gledu in izvedbi ter obicajno zagotavljajo razlicno zašcito (slika 5). Medicinske maske za obraz zagotavljajo zašcito pred vdihavanjem zracnih patogenov mikrometrskih veli­kosti, veliko slabše pa virusov. Le obrazne maske, ki ustre­zajo navedenim funkcionalnim zahtevam, spadajo med osebno zašcitno opremo, ki potencialno zagotovi zašcito pred virusnimi okužbami oz. zmanjšajo širjenje virusov SARS-CoV-2 v svetu (16). 3.3 STANDARDI IN ZAhTEVE ZA RESPIRATORNE MASKE Zahteve za respiratorne maske (respirators) ureja evropski predpis s standardom EN 149:2001+A1:2009: Pripomocki za zašcito dihal (15). V skladu s tem standardom so maske razvršcene v tri razrede glede na njihovo ucinkovitost: FFP1, FFP2 in FFP3 (filtering face piece) (slika 5). Bistvena razlika med medicinskimi maskami za obraz in respirator-nimi maskami je v velikosti odfiltriranih delcev, in sicer prve odfiltrirajo delce = 3 µm, respiratorne maske pa = 0,3 µm (16, 17). Slednje imajo izpopolnjeno filtrirno površino na sredini in odprtine za izdihan zrak ob straneh ter se tesno prilegajo obrazu. Za uporabnika so bolj neudobne kot me-dicinske maske, otežujejo dihanje in pospešujejo znojenje. Respiratorne maske se po oznacevanju in filtracijskih pa-rametrih razlikujejo po posameznih regulatornih podrocjih. Maske FFP1 predstavljajo prvi razred mask z najnižjo filtrirno ucinkovitostjo, vecinoma jih uporabljamo za delo v prašnem okolju. Maske FFP2 uporabljamo za zašcito pred vdihava­njem v industrijskih obratih in kot zašcito pred virusom gripe, SARS-a in bakterijskimi sevi kuge ter tuberkuloze. Maske FFP3 imajo najvecjo filtrirno sposobnost in omogo-cajo odstranitev 99 % zelo majhnih delcev (11). Na sliki 5 so prikazane zahteve za posamezne vrste medicin­skih in respiratornih mask z oznakami za razlicne trge: kitajski, ameriški in evropski. Usklajeno poimenovanje zaenkrat ne obstaja kakor tudi ne zahtevane enotne vrednosti parametrov. Na vseh trgih najdemo zašcitne maske treh vrst, a so poime­novanje in standardne vrednosti razlicne. Vedno raste ucin­kovitost filtracije od prve do tretje kategorije. Med geografskimi podrocji je najvecje odstopanje pri respiratornih maskah, tako po poimenovanju kot ucinkovitosti filtracije. Le maske z visoko ucinkovitostjo filtracije tudi izredno majhnih delcev bodo pri­spevale k izboljšanju kakovosti vdihanega zraka. Ob pozna­vanju mehanizmov filtracije lahko zakljucimo, da sedanji me-dicinski pripomocki za filtracijo zraka dobro zašcitijo pred mikrometrskimi aerosoli, manj pa pred nanodelci in virusi. 3.4 TESTIRANJE KAKOVOSTI FILTROV IN MASK Glavni preizkusi, ki jih uporabljamo za oceno ucinkovitosti obraznih mask, so filtracija, zracnost in dihalna odpornost (filtration, breathability, breathing resistance) (11, 15, 17). Pri medicinskih maskah za obraz morajo testirati materiale za izdelavo, medtem ko pri respiratornih maskah opravijo preizkuse na izdelanih maskah. Preizkuse izvajajo pri defi­niranih pogojih (temperatura, relativna vlaga in pretok zraka) (18). Na ucinkovitost filtra pri locevanju delcev iz zracnega toka vplivajo sestava in oblika delcev, pretok in vrsta filtrirne površine. Znani so razlicni preizkusi, s katerimi dokažemo ucinkovitost filtracije (10, 16, 17). Glede na vrsto in velikost delcev poznamo ucinkovitost filtracije delcev (particulate filtration efficiency, PFE), ucinkovitost bakterijske filtracije (BFE) in ucinkovitost virusne filtracije (virus filtration effi­ciency, VFE). številne znanstvene raziskave kažejo, da se anorganski in biološki delci ujamejo s podobnimi mehanizmi (18). Sama ucinkovitost filtracije se veca z vecanjem mase filtra in manjša z vecanjem hitrosti gibanja zraka (18). Tako za izvedbo preizkusov kot omejevanje okužb je po­membno poznati relativno vlažnost okolja, ki razlicno vpliva na preživetje mikroorganizmov. Mehanizem, na katerem temelji ta odnos, ni znan, zlasti ne za viruse. S tradicional­nimi pristopi na osnovi celicnih kultur so raziskali ucinke relativne vlage na sposobnost preživetja bakterij in virusov tako v aerosolih kot v mirujocih kapljicah. Rezultati so po­kazali, da je sposobnost preživetja bakterij na splošno manjša z nižanjem relativne vlage. Virusi relativno dobro ohranijo biološko aktivnost pri nizki (pod 33 %) in visoki vlagi (nad 80 %), medtem ko se njihova aktivnost zmanjša pri vmesnih vrednostih (19). Najpogostejši preizkusi za vrednotenje filtrov so navedeni spodaj. 3.4.1 Ucinkovitost filtracije delcev Standard ucinkovitosti filtracije delcev (PFE) predstavlja frakcijo delcev, ki jih filter ali maska zadrži pri konstantni hi­trosti pretoka zraka. Za kvantitativno opredelitev ucinkovi­tosti filtracije materialov za maske uporabljajo 0,1-mikro­metrske polistirenske delce ali delce natrijevega klorida dolocenih velikosti pri hitrostih zracnega toka 0,5 do 25 cm/s. S števcem delcev preštejejo tiste delce, ki sipajo svetlobo v obmocju velikosti 0,1 do 5,0 µm. Ucinkovitost filtracije delcev, EPM, izracunamo kot razmerje delcev pred in po filtriranju skladno z enacbo: kjer c0 (µg/m3) in c1 (µg/m3) predstavljata masno koncen­tracijo ali povprecno število delcev pred in po uporabi zra-cnega filtra (14–18). 3.4.2 Ucinkovitost filtracije bakterij Medicinskim maskam dolocijo ucinkovitost filtracije bakterij po standardu EN 14683:2019 (15). Za simulacijo bakterij­ Slika 5: Zahteve za posamezne vrste mask za obraz za trg Evrope, Združenih držav Amerike ali Kitajske in njihova ucinkovitost filtracije; X – brez zahtev (14). Figure 5: Requirements for individual types of face masks for the European, United States or Chinese market and their particle filtration efficiency; X – no requirements (14). Preglednica 3: Parametri in lastnosti obraznih mask. Table 3: Parameters and properties of face masks. ske okužbe uporabljajo aerosol Staphylococcus aureus. Nadzorovano crpajo suspenzijo bakterijske kulture s 5 × 105 CFU/ml skozi razpršilec s stalnim pretokom in tlakom zraka. Višji odstotek ucinkovitosti filtracije oznacuje višjo raven zašcite za pacienta in zdravstveno osebje pred bo­leznimi, ki se prenašajo z aerosoli (18). 3.4.3 Ucinkovitost filtracije virusov Ucinkovitost filtracije virusov ni standardna metoda, vendar jo sedaj uporabljajo proizvajalci mask. Za preizkus upora­bljajo enak postopek in nastavitve, kot jih priporoca stan­dard EN 14683 za ucinkovitost filtracije bakterij, s to razliko, da uporabijo virusni aerosol in ne bakterijskega. Virusni aerosol so v zraku razpršene kapljice vode, ki vsebujejo vi-ruse in ne posameznih delov virusa (17). 3.4.4 Padec tlaka na filtru Poleg ucinkovitosti filtracije je izredno pomembna tudi dobra permeabilnost filtra za zrak. To opredelimo kot ra­zliko tlaka (med dovodnim in odvodnim tlakom zraka v napravi, ki tehnicno posnema nošenje maske) (13, 16). Padec tlaka se povecuje z vecanjem debeline filtra ali z manjšanjem njegove prepustnosti (20). Merilo dihalnega upora ocenijo po standardu EN 149:2009 (14), predstavlja pa znacilen parameter, ki ga je treba oceniti in navesti na izdelku. 3.4.5 Kakovostni kolicnik S kakovostnim kolicnikom (quality factor, QF) ovrednotimo celotno lastnost filtracijskih materialov, kjer za izracun upo­števamo eksperimentalne podatke: E predstavlja ucinko­vitost odstranjevanja delcev, .P pa padec tlaka zaradi fil­tra: Višji kakovostni kolicnik je povezan tudi z boljšim filtrira­njem. Definicija QF pokaže vecjo ucinkovitost filtracije pri manjšem padcu tlaka. Ce povecamo kolicino vlaken v filtru oz. maski, se zmanjša velikost por (prosta pot za zrak in delce) in izboljša ucinkovitost odstranjevanja, a žal hkrati poveca zracni upor. Posledicno je izredno pomem­bno, da najdemo ravnovesje med ucinkovitostjo odstra­njevanja delcev in zracnim uporom. Za vecji QF je možno tehnološko optimirati razmerje med površino in debelino vlaken ter prostor med njimi, da cim manj ovira pretok zraka. 4 FILTRI IN MASKE V RAZVOJU Pomanjkljivost konvencionalnih obraznih mask je vezana na nezadostno zadrževanje delcev = PM1, velik padec tlaka ter visoko osnovno maso (2, 10, 11, 15, 20). El-Atab in sod. porocajo, da obrazna maska N95 zagotavlja visoko raven zašcite pred bakterijami, a je ucinkovitost filtracije za delce, manjše od 300 nm, le približno 85-odstotna. Ker znaša premer virusa, ki povzroca bolezen covid-19 65 do 125 nm, širina por v filtru pa približno 300 nm, obstaja po­treba po razvoju ucinkovitejših mask (21). Poleg navedenih parametrov je pomemben vidik dobre zašcitne maske, ki ga je vredno upoštevati pri razvoju, nabavi ali uporabi vseh vrst obraznih mask, udobno nošenje (22). Ugotovili so, da je udobnost maske oz. njena nosljivost neposredno odvisna od sposobnosti maske za prepustnost vodne pare in zraka ter ucinkovit prenos toplote (10, 18). Ocenjujejo, da je treba razviti filtre z nižjo porabo energije za premagovanje upora maske, hkrati pa doseci visoko ucinkovitost filtriranja. Do-kazano je, da višja ucinkovitost mask dobro korelira z zmanjšanjem premera vlaken, kar dosežejo z razlicnimi nanotehnološkimi pristopi, ki še niso v celoti izkorišceni, kot ugotavljajo znanstveniki. Nanomateriale lahko upora­bimo za izboljšanje filtracijskih sposobnosti in zracnosti z namenom, da izboljšamo kakovost mask (18). K celovitemu udobju prispevajo tudi povecanje prostora med masko, nosom in ustnicami, zadostna prožnost ušesne zanke in masa maske. Med procesom filtracije prehaja skozi masko zrak, ki je to-pel, vlažen in poln mikroorganizmov, zato obstaja velika verjetnost za razrast bakterij in plesni v njih. Za zmanjšanje števila mikroorganizmov so priceli v vlakna vgrajevati snovi s protimikrobnim delovanjem (22). Za izboljšanje filtracije razvijajo in preizkušajo nove materiale in nove tehnologije. 4.1 MATERIALI ZA PRIPRAVO FILTROV IN ZAšCITNIh MASK Glede na izvor razdelimo polimerne materiale v tri skupine: naravne, sintezne in biotehnološke (23). Naravni materiali, vkljucno s polisaharidi, kot so celuloza, škrob in hitozan, in beljakovinski materiali, kot so kolagen, elastin in svila, so idealni biološko razgradljivi polimeri. Celuloza je naravni material, ki omogoca le mehansko zajetje delcev, ker sama po sebi ne poseduje elektrostaticnega naboja. Nasprotno hitozan, kolagen, elastin in svila posedujejo naboj in lahko dosežejo zajetje delcev tudi z elektrostaticnim mehanizmom (24, 25). Tovrstni naravni materiali so sorazmerno težko predvidljivi, imajo šibke mehanske lastnosti in nizko ob-stojnost v vlažnem okolju. V izogib navedenim pomanjklji­vostim naravne materiale obicajno spremenijo s fizikalnimi, kemicnimi in encimskimi reakcijami (26). V praksi so danes bolj zastopani sintezni polimerni materiali, kot so polipro­pilen, polikaprolakton, polivinil alkohol, polimlecna kislina, kopolimer mlecne in glikolne kisline in drugi (27). Med nove materiale, ki ustrezajo postopku elektrostatskega sukanja, sodijo tudi poliviniliden fluorid, poliakrilonitril, polikarbonat in acetilceluloza. Proucujejo tudi kompozitno sestavo, kot je npr. hitozan/polivinil alkohol, ki zaradi zmernega elektro­staticnega naboja izkazujejo boljšo ucinkovitost (27, 28). Filtri iz acetilceluloznih nanovlaken z razlicnimi povprecnimi premeri izkazujejo boljše rezultate kot komercialni filtri. Na tržišcu najdemo kemijsko enake polimere razlicnih mo-lekulskih mas in substitucijskih stopenj, zato jih je vredno raziskati. Larsen in sod. so proucevali polipropilen (PP) treh razlicnih vrst in poiskali tisto, ki izkazuje najboljšo fil­tracijsko ucinkovitost na primeru mask N95 (29). Navedeni materiali, ki jih uporabljajo za izdelavo filtrov za obrazne maske, omogocajo pripravo vlaken razlicnih pre­merov (10 do 50 µm) (30, 31). Ker so debelina teh vlaken in pore med njimi relativno velike, so vlakna ustrezna za prestrezanje bakterij, za prestrezanje virusov in drugih sub-mikronskih delcev pa ne. Rešitev predstavljajo tehnologije, s katerimi pripravimo na osnovi teh vlaken dodatno plast ultratankih vlaken z mnogo manjšimi vmesnimi prostori, ki zgolj malenkostno spremenijo upor zraka v filtru. Zaradi vseh lastnosti, ki jih želimo doseci pri izdelavi obraznih mask, je smiselno uporabiti vec slojev iz razlicnih materialov, ki omogocijo zajetje delcev tako zaradi mehanske pregrade kot tudi elektrostaticnega naboja, in hkrati zadostiti prica­kovanjem potrošnikov; koncept je predstavljen na sliki 6 (16). Pri izboru materialov in postopkov ne smemo prezreti usmerjenosti v alternativno (zeleno) tehnologijo, ki je pri­jaznejša do okolja z vidika varstva okolja v primerjavi s funkcijsko enakimi tehnologijami, ki prevladujejo v današnji praksi. Z vidika polimerov in topil izbiramo med tistimi, ki so biološko razgradljivi in topni v okolju prijaznih topilih, iz­delane maske pa je možno reciklirati (2, 32). 4.2 IZDELAVA ZRACNIh FILTROV IZ NANOVLAKEN Z METODO ELEKTROSTATSKEGA SUKANJA Najpogostejši postopek za izdelavo ultratankih polimernih vlaken (nanovlaken) je elektrostatsko sukanje raztopine po­limera ali kombinacije polimerov (30). Z besedo nanovlakna imenujemo zelo tanka in dolga vlakna, s premerom manj kot 1000 nm in veliko specificno površino. Elektrostatsko sukanje je metoda za izdelavo membran z vlakni razlicnih premerov, morfologij, polarnosti in poroznosti. Nanovlakna omogocajo nastanek mehkih in prožnih membran z dobrimi mehanskimi lastnostmi, kot sta natezna trdnost in elasti-cnost (33–35). Osnovne komponente elektrostatskega sukanja so viso­konapetostni vir energije, crpalka z brizgo, šoba ter zbiralo. Proces sukanja se pricne, ko vzpostavimo vir elektricne napetosti med šobo in zbiralom. Nato se v raztopini poli­mera ustvari elektricni naboj, ki povzroci, da sfericna ka­pljica, ki nastane na izstopu šobe, spremeni svojo obliko v Taylorjev stožec. Slednji nastane zaradi prisotnosti naraš-cajocih odbojnih sil med istovrstnimi naboji na površini ka­ Slika 6: Primer filtracije skozi dvoslojno obrazno masko, ki vkljucuje razlicne mehanizme filtracije (16). Figure 6: Example of a two-layer face mask filtration approach involving different filtration mechanisms (16). pljice in privlacnih sil med nasprotno nabitim zbiralom. Ko sila elektricne napetosti preseže silo površinske napetosti kapljice, se z vrha Taylorjevega stožca tvori curek, ki potuje proti zbiralu. Na tej poti topilo odpareva, curek se tanjša ter se pricne vrtinciti, kar je posledica skupnega vpliva elektricnega polja in odboja med površinskimi naboji. Na zbiralu se naberejo suha in izredno lahka nanovlakna, ure­jena nakljucno. Na morfologijo elektrosukanih nanovlaken vplivajo razlicni dejavniki, še posebej vrsta in koncentracija polimera v raztopini, topilo, elektricna napetost, hitrost toka raztopine skozi šobo, razdalja med šobo in zbiralom, last-nosti raztopine (polarnost, površinska napetost, elektricna prevodnost) ter vpliv okolja, kjer se izvaja elektrostatsko sukanje (temperatura, relativna vlažnost, premikanje zraka) (34). Z ozavešcanjem o varovanju okolja se hkrati razvija elek­trostatsko sukanje polimernih talin, torej tehnologija brez uporabe topil, ki sicer pogosto predstavljajo probleme (tok-sicnost topil, zaostanek topil v vlaknih in med njimi). V lite-raturi omenjajo kot primerne polimere, ki jih lahko uspešno oblikujemo v filtre preko talin, polietilen, polipropilen, poli­kaprolakton, poliuretan, polimlecno kislino in druge (31,2). Ucinkovitost filtracije delcev in padec tlaka sta najpo­membnejša parametra zracnih filtrov. Raziskave so poka­zale, da so filtri iz nanovlaken bolj ucinkoviti za filtriranje aerosolov zaradi njihove vecje specificne površine kot filtri iz mikrovlaken, ker prvi zagotavljajo boljši stik med delci v zraku in vlakni (32). Za pripravo vlaken v nanometrskem obmocju so razvili pristop samosestavljanja molekul s spe­cificno molekularno zasnovo, ki omogoca ustrezno struk­turno ureditev (princip »LEGO«) (36). Torej že s skrbno iz­branim materialom in tehnološkim postopkom lahko pripravimo filtre in obrazne maske, ki zadostijo vsem pred­pisanim standardom za odstranjevanje delcev iz zraka (37). Velik napredek je pricakovati tudi na podrocju od­stranjevanja virusov in nanodelcev, saj raziskovalci inten­zivno raziskujejo v smeri izbora in vgrajevanja varnih aktiv­nih sestavin. 4.3 MEMBRANE IZ NANOVLAKEN ZA VGRAJEVANJE V OBRAZNE MASKE IN UCINKOVITO ZADRžEVANJE MIKROBOV Velikost virusov redko presega 100 nm, kar je razlog za njihovo neucinkovito zadrževanje na filtrih. Da bi zagotovili ustrezno zadrževanje virusov, bi bila smiselna izdelava filtrov z velikostjo por 10 do 100 nm in z vgrajeno ucinkovino, ki izkazuje protimikrobno ali protivirusno delovanje (2, 10, 28, 38). Natancno bi bilo treba dolociti debelino vlaken in por z vrsticno elektronsko mikroskopijo, mehansko trdnost (Youngov modul), protiinfektivno ucinkovitost, sposobnost adsorpcije virusov ter protivirusno delovanje nanovlaken (38–40). V literaturi najdemo clanke, v katerih opisujejo razvoj kom­pozitnih nanovlaken s protimikrobnimi ali protivirusnimi ucinkovinami, ki so jih izdelali z metodo elektrostatskega sukanja ter jim dolocili ucinkovitost filtracije, tlacni padec in kakovostni kolicnik (2, 13, 27, 28, 38, 40, 41). Dokazali so, da so vlakna z manjšim premerom privedla do vecjega mehanskega zajema z difuzijo in prestrezanjem predvsem zaradi velike specificne površine nanovlaken. Za zajema­njem aerosolov velikosti delcev pod 100 nm, ki simulira koronavirus in nanoaerosolna onesnaževala, je difuzija po­stala pomemben mehanizem. Elektrostaticni zajem že sam po sebi nekoliko izboljša zajem, prisotnost številnih tankih nanovlaken pa ga še poveca. Kot aktivne spojine v nanovlaknih proucujejo delce cinko­vega, titanovega, magnezijevega, aluminijevega ali bakro­vega oksida, srebra in zlata ter protimikrobno delovanje dokazujejo s preizkusi inhibicije rasti na celicnih gojišcih. Za nanodelce srebra in zlata so dokazali, da izkazujejo protivirusno delovanje proti razlicnim vrstam virusov: virusu influence, hIV-1, virusu herpesa simpleksa tipa 1 (hSV-1) in virusu hepatitisa B (hBV) (14). Slednje kaže na smiselnost vgrajevanja kovinskih ionov v materiale za izdelavo mem-bran za obrazne maske (2, 13, 28). V vecini drugih clankov izdelanim filtrom niso dolocili in definirali velikosti njihovih por ter s preizkusi dolocili njiho­vega protivirusnega delovanja, zato težko sklepamo o nji­hovi ucinkovitosti za odstranjevanje virusov. Ravno zato bi bilo treba razviti metode in preizkuse za dolocitev vezave virusov na filtre. Smiseln bi bil razvoj metode, s katero bi lahko kvalitativno in kvantitativno dolocili, ali se je virus zadržal na filtrih in v kakšnem obsegu. Ena izmed možnosti je razvoj metode, s katero bi lahko dolocili, ali se virus veže na vlakna filtra in ali vgrajene protivirusne ucinkovine sploh ucinkujejo nanje. Druga možnost pa je merilna teh­nika po analogiji kot za druge delce, ki bi omogocala do-locitev, koliko virusov je prešlo filter in se na njem ni zadr­žalo. S tem bi omogocili razvoj standardnih metod in posledicno omogocili lažje interpretiranje rezultatov razi­skav. Nedavna pandemija in spodbujene številne raziskave po vsem svetu so pokazale potrebo po razvoju ustreznejših mask, na osnovi inovativnih materialov in nanotehnoloških postopkov. Pricakujemo lahko razvojni prehod od sedanjih relativno enostavnih do naprednih zašcitnih mask. Nekateri napredni filtri z odlicnim kakovostnim kolicnikom imajo tudi posebne lastnosti, kot so toplotna stabilnost, antibakterijske lastnosti, so samocistilni, negorljivi in biološko razgradljivi. Dodatno najdemo v literaturi prve filtre za filtriranje zraka in ucinkovito odstranjevanje delcev PM 0,1 (42). 5 ZAKLJUCEK V zadnjih letih narašca prizadevanje za razvoj naprednih strategij za odstranjevanje aerosolov v vdihanem zraku. Z uvajanjem elektrostatskega sukanja v proces izdelave na­novlaken je možno izdelati elektricno nabite, ultralahke filtre. Membrane iz nanovlaken s svojimi lastnostmi omo­gocajo reševanje prenekaterih omejitev, ki jih predstavlja uporaba konvencionalnih materialov. Izdelava membran iz nanovlaken omogoca nadzor velikosti por, premera vlaken in s tem doseganje velike specificne površine in hkrati za­gotavlja vse mehanizme filtracije. Take membrane znatno izboljšajo ucinkovitost filtriranja virusov in drugih submi­kronskih delcev v zraku, pri tem pa le malo vplivajo na pre­tok zraka (majhen padec tlaka). Ce povzamemo, je le upo­raba ustrezne maske ucinkovito sredstvo za zašcito delovnega okolja in posameznika pred virusi in drugimi kontaminanti. Pri izbiri maske moramo biti previdni, da iz­beremo ustrezno za dolocen namen uporabe. Ob prihod­njih pandemijah, povezanih z dihali, pricakujemo dostop­nost ucinkovitejših obraznih mask. Danes opažamo potrebo za razvoj filtrov s kombiniranim mehanizmom odstranjevanja virusov s filtriranjem aero­solov ter vkljucevanjem spojin s protivirusnim delovanjem. Ne glede na to se je treba še vedno zavedati vseh dejav­nikov, ki vplivajo na ustreznost filtrov. Kljucnega pomena pri vlaknastih filtrih je njihova sposobnost za ucinkovito odstranjevanje virusov iz zraka, nizek upor zracnega toka ter sposobnost prenosa toplote in vodne pare. Poseben poudarek je treba nameniti udobnosti mask, ker ne­udobne obrazne maske pri uporabnikih povzrocajo nela­godje in povecajo verjetnost, da jih ne uporabljajo v skladu z navodili. V prihodnosti lahko pricakujemo vecje poeno­tenje izrazov in standardnih vrednosti za enake vrste zra-cnih filtrov in mask na svetovnem nivoju. S tem bi znacilno olajšali njihovo prepoznavnost, osebno uporabo, sveto­vanje v lekarnah in zdravstvenih ustanovah, pa tudi trgo­vanje. 6 VIRI 1. Fuzzi S, Baltensperger U, Carslaw K, Decesari S, Denier van der Gon H, et al. Particulate matter, air quality and climate: lessons learned and future needs. Atmos. Chem. Phys., 2015, 15, 8217–8299. 2. Lv Dan, et al. Ecofriendly electrospun membranes loaded with visible-light-responding nanoparticles for multifunctional usages: highly efficient air filtration, dye scavenging, and bactericidal activity. ACS Applied Materials & Interfaces, 2019, 11.13: 12880-12889. 3. Cao C, Jiang W, Wang B, Fang J, Lang J,Tian G, Jiang J, Zhu TF. Inhalable Microorganisms in Beijing’s PM2.5 and PM10 Pollutants during a Severe Smog Event. Environ. Sci. Technol. 2014; 48 (3): 1499–507. 4. Slika 1-Primerjeva velikosti razlicnih delcev in snovi: Dostop (april 2020) https://smartairfilters.com/en/blog/comparison­mask-standards-rating-effectiveness/ 5. Tomašic T. Korona virus SARS-CoV-2 in bolezen covid-19. Farm. Vestn. 2020; 71 (2): 107-111. 6. Morawska, L.; Cao, J. Airborne Transmission of SARS-Cov-2: The World Should Face the Reality. Environ. Int. 2020, 139, 105730. 7. ISO 16890: Air Filters for General Ventilation 2016; ISO Geneva, Switzerland, 2016. https://www.scribd.com/document/415141099/ISO-16890­Pocket-Guide-english-final 8. Kutter JS, Spronken MI, Fraaij PL, Fouchier RA, Herfst S. Transmission Routes of Respiratory Viruses Among Humans. Curr. Opin. Virol. 2018; 28, 142-51. 9. Maedler L., Friedlander S. K.: Transport of Nanoparticles in Gases: Overview and Recent Advances. Aerosol and Air Quality Research, 2007; 7 (3): 304-42. 10. Chua MH, Cheng W, Goh SS, Kong J, Li B, Lim JYC, et al. Face Masks in the New COVID-19 Normal: Materials,Testing, and Perspectives. AAAS Research, 2020 Article ID 7286735 11. Liu H, Cao C, Huang J, Chen Z, Chen G, Lai Y. Progress on particulate matter filtration technology: basic concepts, advanced materials, and performances. Nanoscale. 2020; 2(2):437-453. 12. Colbeck I, Lazaridis M. Filtration Mechanisms. In Aerosol Science: Technology and Applications, 1st ed.; Colbeck, I. Lazaridis, M., Eds.; John Wiley & Sons: New York, 2014; pp 89-118. 13. Leung W W F, Sun Q. Electrostatic Charged Nanofiber Filter for Filtering Airborne Novel Coronavirus (COVID-19) and Nano-Aerosols. Sep. Purif. Technol. 2020, 250, 116886. 14. European Standards. UNE EN 14683:2019+AC: 2019. Medical Face Masks -Requirements and Test Methods (2019) https://www. en-standard.eu/ 15. EN 149:2001+A1:2009: Respiratory Protective Devices. Filtering Half Masks to Protect against Particles. Requirements, Testing, Marking. https://www.en-standard.eu/bs-en-149­2001-a1-2009-respiratory-protective-devices. 16. Konda A, Prakash A, Moss GA, Schmoldt M, Grant GD, Guha S. Correction to aerosol filtration efficiency of common fabrics used in respiratory cloth masks. ACS Nano, 2020; 14 (5): 6339–47. 17. European Medicines Agency. Alofisel product information. https:// www.ema.europa.eu/en/documents/product­information/alofisel-epar-product-informationen.pdf 18. Lee Shu-An, Dong-Chir Hwang, He-Yi Li, Chieh-Fu Tsai, Chun-Wan Chen, Jen-Kun Chen. Particle size-selective assessment of protection of European standard FFP respirators and surgical masks against particles-tested with human subjects. J Healthcare Eng. 2016, 2016:8572493. 19. Lin K, Marr LC. Humidity-dependent decay of viruses, but not bacteria, in aerosols and droplets follows disinfection kinetics. Environ. Sci. Technol. 2020; 54 (2): 1024-1032. 20. Anja Pogacnik Krajnc A, Pirker L, Gradišar Centa U, Gradišek A, Mekjavic IB, Godnic M, Cebašek M, Bregant T, Remškar M. Size-and time-dependent particle removal efficiency of face masks and improvised respiratory protection equipment used during the COVID-19 pandemic. Sensors 2021; 21: 1567. 21. El-Atab N, Qaiser N, Badghaish H, Shaikh SF, Hussain MM. Flexible nanoporous template for the design and development of reusable anti-COVID-19 hydrophobic face masks. ACS Nano 2020, 14 (6), 7659-7665. 22. WANG, Na, et al. Electret nanofibrous membrane with enhanced filtration performance and wearing comfortability for face mask. Journal of colloid and interface science, 2018, 530: 695-703. 23. Armenrano I, Barbanera M, Carota E, Crognale S, Marconi M, Rossi S, Rubino G, Scungio M, Taborri J, Calabro G. Polymer materials for respiratory protection: processing, end use, and Testing Methods. ` ACS Appl. Polym. Mater 2021; 3 (2): 531– 548. 24. Stefens B. Evaluating the sensitivity of the mass-based particle removal calculations for HVAC filters in ISO 16890 to assumptions for aerosol distributions. Atmosphere 2018; 9:85. 25. Zhu M, Xiong R, Huang C. Bio-based and photocrosslinked electrospun antibacterial nanofibrous membranes for air filtration. Carbohydr Polym. 2019 Feb 1;205:55-62. 26. Junter, G.-A.; Lebrun, L. Cellulose-Based Virus-Retentive Filters: A Review. Rev. Environ. Sci. Bio/Technol. 2017, 16 (3), 455-489. 27. Bortolassi AC, Guerra VG, Aguiar ML, Soussan L, Cornu D, Miele P, Bechelany M. Composites Based on Nanoparticle and PAN Electrospun Nanofiber Membranes for Air Filtration and Bacterial Removal. Nanomaterials (Basel). 2019 Dec 6;9(12):1740. doi: 10.3390/nano9121740 28. Li, Y.; Yin, X.; Si, Y.; Yu, J.; Ding, B. All-Polymer Hybrid Electret Fibers for High-Efficiency and Low-Resistance Filter Media. Chem. Eng. J. 2020, 398, 125626. 29. Larsen SG, Cheng Y, Daemen LL, Lamichhane NT, Hensley KD, Hong K et al. Polymer, Additives, and Processing Effects on N95 Filter Performance. ACS Appl. Polym. Mater. 2021, 3, 2, 1022–1031. 30. Barhoum A, et al. Nanofibers as new-generation materials: From spinning and nano-spinning fabrication techniques to emerging applications. Applied Materials Today, 2019, 17: 1-35. 31. Noushini A, Samali B, Vessalas Ki. Effect of polyvinyl alcohol (PVA) fibre on dynamic and material properties of fibre reinforced concrete. Construction and Building Materials, 2013, 49: 374-383. 32. Lv D, Zhu M, Jiang Z, Jiang S, Zhang Q, Xiong R, Huang C. Green electrospun nanofibers and their application in air filtration. Macromol. Mater. Eng. 2018, 303, 1800336. 33. Rosic R, Kocbek P, Pelipenko J, Kristl J, Baumgartner S. Nanofibers and their biomedical use. .Acta Pharm 2013; 63: Issue: 3, 295-304. 34. Pelipenko J, Kocbek J, Kristl J. Critical attributes of nanofibers: Preparation, drug loading, and tissue regeneration. Int J Pharm, 2015; 484: 57–74. 35. Jankovic B, Pelipenko J, Škarabot M, Muševic I, Kristl J. The design trend in tissue-engineering scaffolds based on nanomechanical properties of individual electrospun nanofibers. Int J Pharm 2013; 455 (1–2), 338-347. 36. Singh KV, Ravi KS, Sun W, Tan CS. Transparent nanofibrous mesh self-assembled from molecular LEGOs for high efficiency air filtration with new functionalities. Small 2016, DOI: 10.1002/smll.201601924 37. Jiajia, et al. Electrospun nanofibers: new concepts, materials, and applications. Accounts of chemical research, 2017, 50.8: 1976-1987. 38. Zhou J, Hu Z, Zabihi F, Chen Z, Zhu M. Progress and perspective of antiviral protective material. Advanced Fiber Materials , 2020, 2 (3), 123–139. https://doi.org/10.1007/s42765-020-00047-7 39. Zhua M, Huaa D, Zhongc M, Zhanga L, Wanga F, Gaod B, et al. Antibacterial and Effective Air Filtration Membranes by “Green” Electrospinning and Citric Acid Crosslinking. Colloid and Interface Science Communications 2018; 23 (3): 52-58. 40. Wang B, Wang Q, Wang Y, Di J, Miao S, Yu J. Flexible multifunctional porous nanofibrous membranes for high-efficiency air filtration. ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11, 43409-43415. 41. Zhou J, Hu Z, Zabihi F, Chen Z, Zhu M. Progress and perspective of antiviral protective material. Advanced Fiber Materials , 2020, 2 (3), 123–139. 42. Chen R, Gan Z, et al. Thermoplastic Polyurethane Nanofiber Membrane Based Air Filters for Efficient Removal of Ultrafine Particulate Matter PM0.1. ACS Appl. Nano Mater. 2021, 4 (1), 182–189. PROFILAKTICNA CEPIVA NA OSNOVI INFORMACIJSKE RNA PROTI NALEZLJIVIM BOLEZNIM PROPhYLACTIC MESSENGER RNA-BASED VACCINES AGAINST INFECTIOUS DISEASES AVTORJA / AUThORS: Ana Vencelj izr. prof. dr. Tomaž Bratkovic, mag. farm. Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za farmacevtsko biologijo, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana NASLOV ZA DOPISOVANJE / CORRESPONDENCE: E mail: tomaz.bratkovic@ffa.uni lj.si PREGLEDNI ZNANSTVENI CLANKI 1 UVOD Cepiva (vakcine) so praviloma profilakticna zdravila, s ka­terimi preprecujemo nalezljive bolezni, a razvijajo tudi te­rapevtske vakcine za zdravljenje (kronicnih) virusnih okužb POVZETEK Cepiva na osnovi informacijske RNA (mRNA) predstavljajo izjemno obetavno platformo cepiv, saj omogocajo hiter odziv na grožnje novih pato­genov. Temeljijo na vnosu genskega zapisa za enega ali vec antigenov povzrocitelja nalezljive bolezni neposredno v celice vakcinirane osebe. Na podlagi genske informacije transfecirane celice prehodno izrazijo proteinski antigen in ga pred­stavijo na svoji površini v obliki peptidov, vezanih na poglavitni kompleks tkivne skladnosti. Tako predstavljene jih zaznajo limfociti T. Ce usmerimo antigen na celicno membrano ali v zunajcelicni prostor, pride tudi do robustnega humoralnega imunskega odziva. V zadnjem desetletju beležimo precejšen napredek na podrocjih encimske sin-teze mRNA, razumevanja imunomodulatornih lastnosti same eksogene mRNA in dostavnih si­stemov mRNA-cepiv ter doseganja ucinkovite transfekcije in translacije in vivo, kar je omogocilo nedavno odobritev prvih tovrstnih cepiv v Evropski uniji in ZDA. V prispevku predstavljamo mehan­izme delovanj, nacin proizvodnje in dosedanje kli­nicne izkušnje s profilakticnimi mRNA-cepivi proti nalezljivim boleznim. KLJUCNE BESEDE: cepivo, klinicne raziskave, mehanizem delovanja, mRNA ABSTRACT Messenger RNA (mRNA) vaccines are an extremely promising vaccine platform, as they allow for im­mediate response to new pathogen threats. mRNA vaccines are based on introducing genetic infor­mation for one or more antigens of a pathogen di­rectly into cells of a vaccinated individual. The trans-fected cells use this genetic information to transiently express the encoded protein antigen and display it on the cell surface in the form of antigenic peptides bound to major histocompati­bility complex, thereby activating T lymphocytes. If the encoded intact antigen is directed to the cell surface or the extracellular space, robust humoral response is also observed. In the last decade, im­portant progress has been made in the areas of enzymatic mRNA synthesis, understanding im­munomodulatory properties of exogenous mRNA as well as materials for mRNA delivery, and opti­mizing transfection and in vivo translation efficiency, leading to approval of first mRNA-based vaccines in the European Union and United States. here, we review the mechanisms of actions, production technologies and current clinical experience with prophylactic mRNA vaccines against infectious dis­eases. KEY WORDS: clinical trials, mechanism of action, mRNA, vaccine PROFILAKTICNA CEPIVA NA OSNOVI INFORMACIJSKE RNA PROTI NALEZLJIVIM BOLEZNIM in rakavih bolezni. V clanku se osredotocamo izkljucno na profilakticna cepiva na osnovi informacijske RNA (mRNA). Ta relativno nova platforma je zelo obetavna, saj omogoca izjemno hiter odziv na grozece epidemije virus-nih bolezni, kot se je izkazalo v aktualnem primeru covid­19 – vsega deset mesecev po tem, ko je Svetovna zdrav­stvena organizacija razglasila pandemijo, sta prejeli pogojno dovoljenje za promet v EU in ZDA že dve cepivi na osnovi mRNA, še 14 takih cepiv proti covid-19 pa tre­nutno po svetu vrednotijo v klinicnih raziskavah (1). mRNA-cepiva so privlacna tudi, ker dobro posnemajo proces naravne okužbe z vidika procesiranja in predsta­vljanja virusnih antigenov (za razliko od konvencionalnih inaktiviranih ali proteinskih vakcin), kar je kljucnega po­mena za proženje tako humoralnega kot celicnega imun­skega odziva (2). Leta 1989 so prvic porocali o uspešnem izražanju mo-delnega proteina luciferaze po transfekciji evkariontskih celic z mRNA, pripravljeno s transkripcijo in vitro (3). Leto kasneje je ista raziskovalna skupina potrdila tudi izražanje vec porocevalskih genov po vnosu pripadajocih mRNA v mišje skeletne mišicne celice in vivo (4). Od takrat je teh­nologija terapevtikov na osnovi nukleinskih kislin mocno napredovala: kopicilo se je znanje o potrebnih regulatornih elementih, ki vplivajo na biološko razpolovno dobo mRNA v celicah in na nivo izražanja kodiranega proteina, struk­turnih modifikacijah, ki uravnavajo imunomodulatorne last-nosti eksogene mRNA, ter dostavnih sistemih. V zadnjem desetletju so številni raziskovalci pokazali, da vnos pri­merno izbranega genskega zapisa za proteinski antigen patogena intradermalno, subkutano ali intramuskularno izzove oblikovanje imunskega spomina, ki živali zašciti pred okužbo, cemur je sledilo tudi vrednotenje varnosti in imunogenosti mRNA-cepiv na cloveških prostovoljcih (2, 5). 2 KAJ SO CEPIVA NA OSNOVI mRNA IN KAKO DELUJEJO? Najenostavnejša mRNA-cepiva kot ucinkovino vsebujejo mRNA, ki nosi zgolj genski zapis za proteinski antigen pa-togena. Zaradi kemijske in encimske nestabilnosti molekul RNA ter za doseganje ucinkovitejše dostave v celice mRNA obicajno vgradijo v lipidne nanodelce, redkeje nanodelce iz kationskih polimerov, ali tvorijo komplekse s pozitivno nabitimi proteini, kakršen je protamin (podpoglavje 3.3). mRNA sintetizirajo encimsko v procesu transkripcije in vitro na osnovi lineariziranega plazmida, ki nosi genski zapis za antigen pod nadzorom bakteriofagnega promotorja (T7, T3 ali SP6) (2, 5). Minimalne strukturne zahteve za mRNA so predstavljene na sliki 1A. Transkript posnema zrelo mRNA, kakršna se nahaja v citosolu evkariontskih celic, in je sestavljen iz bralnega okvirja (kodirajoce regije), ki ga obdajata neprevedeni regiji (untranslated regions, UTR), na 5'-koncu mRNA je prisotna kapa iz 7-metilgvanozina, povezanega s prvim nukleotidom prek 5'-trifosfatne sku-pine, na 3'-koncu pa rep iz 100 do 250 adenozinskih ostankov. Ti regulatorni nekodirajoci elementi šcitijo mRNA pred razgradnjo z nukleazami in so kljucni za proces tran­slacije (sinteze kodiranega proteina). Encimska sinteza mRNA je izjemno ucinkovita (porocajo o donosih, višjih od 2 g mRNA/L), neodvisna od nukleotidnega zaporedja in njen obseg je mogoce razmeroma enostavno povecati (2). Nacin proizvodnje, ki za razliko od konvencionalnih vakcin na proteinski osnovi (atenuiranih, inaktiviranih in rekombi­nantnih proteinskih cepiv) ali virusnih vektorskih cepiv ne zahteva uporabe celicnih kultur ali jajc, omogoca hitro in cenovno ugodno pripravo ucinkovine ter zagotavlja od­sotnost vsakršnih kontaminantov, kot so virusi ali proteini ekspresijskega sistema. Po transkripciji in vitro matricno DNA razgradijo z DNazo, mRNA pa kromatografsko pre-cistijo, da odstranijo encime, proste nukleotide, fragmente DNA in nepopolno sintetizirano RNA. Sledi še sterilizacija s filtracijo in vgradnja v ustrezen dostavni sistem (2, 5). Poleg t. i. konvencionalnih mRNA-cepiv nekatera podjetja razvijajo tudi samopomnožujoca mRNA-cepiva (slika 1B, preglednica 1) (2, 6). Ta so osnovana na genomu alfavirusov in so kot taka pravzaprav vektorska cepiva, ki jih proizva­jamo s transkripcijo in vitro ali pomnoževanjem in pakira­njem v virusne delce s pomocjo posebnih pakirnih celicnih linij, ki izražajo alfavirusne strukturne proteine. Pri nacrto­vanju samopomnožujocih mRNA-cepiv iz genoma alfavi­rusov odstranijo gene za strukturne proteine in jih nado­mestijo z zapisom za želeni antigen, ohranijo pa regulatorne elemente (5'-kapo, 5'-in 3'-cis elemente (CSE) in poli(A)­rep) ter gene za nestrukturne proteine nsP1-4, ki tvorijo replikazni kompleks (od RNA odvisno RNA-polimerazo, RNA-dependent RNA polymerase, RdRP). Po vstopu v celico se tako najprej tvori RdRp, ki ustvari kopije virusnega vektorja, kar omogoca uporabo bistveno nižjih odmerkov cepiva in daljše izražanje antigena. Ribonukleinske kisline so izrazito nestabilne molekule, kar zelo zaplete in posledicno podraži logistiko (shranjevanje, transport in organizacijo) cepljenja s cepivi na osnovi mRNA. Osnovni razlog kemijske nestabilnosti RNA je nu-kleofilna narava hidroksilne skupine na položaju 2' riboze (ta je v sicer strukturno sorodni molekuli DNA odsotna), ki – zlasti v alkalnem okolju, ko se deprotonira – napade fos­forjev atom v sosednji fosfodiestrski vezi. Proces poteka predvsem na izpostavljenih 2'-hidroksilnih skupinah ne­strukturirane (tj. enoverižne) RNA. Posledica je cepitev estr­ske vezi in nastanek 2',3'-ciklicnega fosfatnega interme­diata, ki hidrolizira do 2'-ali 3'-fosfata (7). Dolgorocno kemijsko stabilnost RNA v splošnem zagotavljamo s shra­njevanjem RNA pri ekstremno nizkih temperaturah in nev­tralnem ph ali z liofilizacijo. Izpopolnjene formulacije mRNA­cepiv lahko pomembno prispevajo k vecji stabilnosti mRNA in ji hkrati nudijo zašcito pred hidrolizo z RNazami in vivo (8). Slika 1: Mocno poenostavljena struktura mRNA za vnos genskega zapisa za proteinski antigen (prirejeno po (6)). A. Splošni funkcijski elementi zrele evkariontske mRNA: 5'-kapa (7-metilgvanozin, m7G), 5'-neprevedena regija (5'-UTR), bralni okvir, ki ga omejujeta zacetni in zakljucni kodon, 3'-UTR in 3'-poliadenozinski (poli(A)) rep. B. Primerjava konvencionalnih in samopomnožujocih mRNA-cepiv. Prva nosijo le zapis za antigen, druga (osnovana na alfavirusnem vektorju) pa tudi gene za proteine nsP1-4, ki skupaj tvorijo replikazni kompleks, ki v celicah ustvarja kopije virusnega vektorja. CSE – cis-regulatorni element, RdRp – od RNA odvisna RNA-polimeraza. Sliko smo pripravili z BioRenderjem. Figure 1: A simplified depiction of mRNA for delivery of genetic information encoding a protein antigen (adapted from (6)). A. General functional elements of mature eukaryotic mRNA: 5' cap (7-methyl guanosine, m7G), 5' untranslated region (UTR), open reading frame flanked by start and stop codons, 3' UTR and polyadenosine (poly(A)) tail. B. Comparison of conventional and self-amplifying mRNA vaccines. The former only encode an antigen, whereas the latter (based on alphavirus) in addition harbour genes encoding proteins nsP1-4 which form the replicase complex responsible for amplifying the viral vector. CSE – cis-acting element, RdRp – RNA-dependent RNA polymerase. Graphics made with BioRender. Preglednica 1: Nekatere prednosti in pomanjkljivosti/slabosti konvencionalnih in samopomnožujocih mRNA-cepiv (povzeto po (9)). Table 1: Advantages and disadvantages of conventional and self-amplifying mRNA vaccines (adopted from (9)). Platforma Prednosti Pomanjkljivosti/slabosti Konvencionalna in samopomnožujoca mRNA-cepiva -encimska sinteza, ne uporabljamo jajc ali celicnih kultur za proizvodnjo -možnost hitre in obsežne proizvodnje -cepiva neinfektivna, ne prihaja do integracije v genom prejemne celice, razgradnja mRNA z endogenimi celicnimi mehanizmi -izražanje in situ: nativen proteinski antigen -aktivacija mehanizmov prirojene imunosti okrepi humoralno in celicno imunost -nestabilnost RNA -v nekaterih primerih opažena nižja imunogenost pri ljudeh v primerjavi s poskusnimi živalmi (prenosljivost rezultatov; poglavje 4), nova tehnologija -vnetni proces zaradi sprošcanja IFN tipa I -težave, povezane z ucinkovito dostavo v celice -mRNA krajša v primerjavi s samopomnožujoco mRNA -možna vgradnja spremenjenih nukleozidov -neposredno izražanje antigena iz mRNA -imunski odziv proti vektorju ni prisoten -potrebni višji odmerki -izražanje antigena casovno krajše -morebitna toksicnost spremenjenih nukleotidov, nova tehnologija -višja cena in zapletena logistika cepljenja v primerjavi s »klasicnimi« (inaktiviranimi ali oslabljenimi) cepivi Samopomnožujoca mRNA-cepiva -mocnejše in casovno daljše izražanje antigena -potrebni nižji odmerki -intrinzicno adjuvantno delovanje -apoptoza transfeciranih celic vodi do okrepljenega prevzema proteinskih antigenov s strani APC in predstavljanja antigenov z MhC I -možnost dostave vec antigenov z enim vektorjem -vnetni proces zaradi pomnoževanja vektorja -mRNA daljša v primerjavi s konvencionalnimi mRNA (težavnejša proizvodnja) -morebitna toksicnost proteinov nsP -možen imunski odziv proti vektorju APC – antigen predstavitvena celica, IFN – interferon, MHC – poglavitni kompleks tkivne skladnosti 2.1 PREVZEM mRNA IN SPROšCANJE IZ ENDOSOMOV RNA so velike in na racun fosfatnih skupin v sladkorno­fosfatnem ogrodju izrazito negativno nabite molekule, kar otežuje njihovo ucinkovito dostavo v celice. Z mRNA-cepivi lahko transfeciramo antigen predstavitvene celice, zlasti dendriticne celice, ex vivo ali pa vakcino injiciramo nepo­sredno, najveckrat v mišicno tkivo (2). Transfekcija dendri­ticnih celic ex vivo in njihova avtologna infuzija je oblika ce­licnega zdravljenja, ki jo razvijajo za boj proti rakavim boleznim, zato je v prispevku ne obravnavamo podrobno. mRNA-cepiva najveckrat formulirajo v obliki nanodelcev (premera približno 100 nm) iz kationskih lipidov (2, 5). Ce­licna površina je namrec negativno nabita; kationski lipidi tako omogocijo ne le nevtralizacijo negativnih nabojev na mRNA, temvec so kljucnega pomena tudi za tvorbo elek­trostatskih interakcij med celicno površino in nanodelci ter za kasnejše sprošcanje iz endosomov. Kationskim lipidom so praviloma dodani še naravni fosfolipidi, ki pomagajo pri tvorbi lipidnega dvosloja, holesterol kot stabilizator mem-bran in na lipide vezan polietilenglikol (PEG) za izboljšanje koloidne stabilnosti nanodelcev (lipopleksov; podpoglavje 3.3) (5). Raziskave na živalih so pokazale, da sistemska aplikacija lipopleksov vodi do kopicenja mRNA v hepatocitih (na racun vezave na apolipoprotein E in posledicne recep­torsko posredovane endocitoze) (10), medtem ko subku­tana, intradermalna in intramuskularna aplikacija zagota­vljajo lokalno in nekoliko daljše izražanje kodiranih proteinov, kar je ugodno z vidika proženja imunskih odzivov (11, 12). Lipopleksi vstopajo v celice v zapletenem procesu endo­citoze, pri cemer pride do uvihanja celicne membrane, ki se odcepi in tvori endosomske vezikle. Ti zorijo in se zlivajo z lizosomi, ki dostavljajo presnovne hidroliticne encime, zato mora mRNA še pravocasno zapustiti endosome in vstopiti v citosol, s cimer se izogne razgradnji (5). Ni povsem jasno, kakšen je mehanizem sprošcanja mRNA iz endo­somov, a verjetno zajema zlitje membrane lipopleksa in endosoma, zato sestava lipidnih komponent dostavnega sistema pogojuje ucinkovitost transfekcije. mRNA sama po sebi deluje imunostimulatorno, saj aktivira številne endosomske (TLR7 in TLR8) in citosolne receptorje (RIG-I in MDA-5) prirojene imunosti, kar vodi do sprošcanja interferonov tipa I (IFN-I) in nekaterih drugih vnetnih citoki­nov (2, 13). Po eni strani je to dobrodošlo, saj aktivira an­tigen predstavitvene celice in okrepi imunski odziv proti kodiranemu antigenu, a interferonska signalizacija nespe­cificno zavre tvorbo proteinov v celicah, kar oslabi proces izražanja antigena. Nekatera cepiva na osnovi mRNA zato vsebujejo spremenjene nukleozide, ki so manj imunosti­mulatorni (podpoglavje 3.1). Samopomnoževalna mRNA­cepiva, ki se namnožujejo v celicah, seveda vsebujejo le obicajne nukleotide, hkrati pa se med pomnoževanjem tvori dvoverižna struktura RNA, ki je izrazito imunostimula­torna, zato imajo mocan adjuvantni ucinek (2). Proteini, ki tvorijo replikazni kompleks, za organizem predstavljajo neoantigene, zato lahko pride do imunskega odziva proti samemu vektorju, kar utegne voditi do manj ucinkovitega imunskega odziva pri nadaljnjih cepljenjih z enako plat-formo, saj bi predhodno senzitizirani citotoksicni limfociti unicili transfecirane celice, še preden bi te izdelale proteinski antigen cepiva. 2.2 TRANSLACIJA mRNA se ne prenese v celicno jedro (kot to velja za gensko informacijo DNA-vektorskih cepiv) in v citosolu vstopa ne­posredno v ribosome, ki na osnovi predstavljenega nu-kleotidnega zaporedja sintetizirajo polipeptidno verigo an-tigena. Ceprav v celice vnašamo tujo gensko informacijo, veljajo cepiva na osnovi mRNA z vidika insercijske muta­geneze za nadvse varna, torej ni nikakršne možnosti za in-tegracijo v genom. Antigen se zaradi takojšnjega zacetka translacije tvori izjemno hitro in ker je sintetiziran in situ, je polipeptidna veriga pravilno zvita, protein je deležen vseh ustreznih posttranslacijskih modifikacij in je usmerjen na ustrezno mesto v celici (npr. v celicno membrano) (2). mRNA ima razmeroma kratko življenjsko dobo in se sca-soma razgradi, zato je izražanje antigena prehodne na-rave. 2.3 PROCESIRANJE IN PREDSTAVLJANJE ANTIGENA mRNA-cepiva z izražanjem antigena neposredno v trans-fecirani celici posnemajo proces virusne okužbe (2). Mišicne celice izdelajo kodiran virusni membranski protein in ga iz­razijo na svoji površini, kjer ga zaznajo limfociti B (slika 2). Del nastalega antigena celice razgradijo s specializiranimi proteaznimi kompleksi v citosolu, imenovanimi proteasomi. Nastali peptidi se prenesejo v lumen endoplazemskega retikuluma, kjer se vežejo na poglavitni kompleks tkivne skladnosti I (MhC I), od tam pa z vezikularnim transportom potujejo prek Golgijevega aparata na celicno površino. An-tigenske peptide, vezane na MhC I, prepoznajo citotoksicni limfociti T (CD8+). mRNA prvenstveno vstopa v antigen predstavitvene celice (dendriticne celice in makrofage), ki so sposobne tudi alternativnega procesiranja antigenov (slika 2), pri cemer antigenske peptide izrazijo na MhC II. V tej obliki antigen zaznajo T-celice pomagalke (CD4+), ki uravnavajo aktivacijo in diferenciacijo limfocitov B in cito­toksicnih limfocitov T. Upoštevajoc še imunomodulatorno delovanje same sintezne mRNA so mRNA-cepiva spos­obna izzvati širok spekter imunskih odzivov. 3 POMEMBNEJŠE INOVACIJE NA PODROCJU mRNA-CEPIV Poglavitne težave, ki so ovirale klinicni razvoj mRNA-cepiv, so nestabilnost RNA, neucinkovita dostava mRNA v celice in dejstvo, da transfekcija z eksogeno RNA lahko izzove vnetne procese. Optimizacija procesov formulacije, zlasti vgradnja mRNA v lipidne nanodelce, nudi zašcito RNA pred zunanjimi vplivi in omogoca ucinkovito dostavo v celice, medtem ko z optimizacijo strukture mRNA lahko odlocilno vplivamo na njeno zaznavanje s celicnimi receptorji prirojene imunosti in izboljšamo ucinkovitost translacije in vivo. 3.1 OPTIMIZACIJA STRUKTURE mRNA Endogena mRNA v jedru evkariontskih celic doživi po­sttranskripcijske modifikacije, kot sta pripenjanje 5'-kape in 3'-poli(A)-repa. Pri transkripciji in vitro je ta funkcionalna Slika 2: Procesiranje in predstavljanje antigenov po vstopu sintezne mRNA v celice (prirejeno po (14)). Zgoraj: Mišicne celice na površini izražajo nativne membranske virusne proteine, ki jih prepoznajo limfociti B, in pripadajoce antigenske peptide (nastale pri razgradnji s proteasomom), vezane na poglavitni kompleks tkivne skladnosti I (MHC I), ki jih prepoznajo citotoksicni limfociti T (CD8+). Spodaj: Antigen predstavitvene celice (APC) procesirajo proteinske antigene na enak nacin (ni prikazano), hkrati pa jih delno razgradijo tudi v endosomskih veziklih. Antigenski peptidi se nato vežejo na MHC II in z vezikularnim transportom potujejo v celicno membrano, kjer jih prepoznajo T-celice pomagalke (CD4+). BCR – B-celicni receptor, ER – endoplazemski retikulum, GA – Golgijev aparat, TCR – T-celicni receptor. Sliko smo pripravili z BioRenderjem. Figure 2: Antigen processing and presentation after synthetic mRNA entry into cells (adapted from (14)). Upper panel: Muscle cells display native viral membrane proteins on their surface, allowing antigen recognition by B lymphocytes. A fraction of synthesized antigens is degraded in the cytosol by proteasomes and the resulting antigenic peptides are displayed on cell surface bound to type I major histocompatibility complex (MHC I), allowing recognition by cytotoxic lymphocytes T (CD8+). Lower panel: In addition to mechanisms of antigen processing described above (not shown) specialized antigen presenting cells also degrade proteins in endosomal vesicles. The antigenic peptides are bound to MHC II and transferred to cell surface via vesicular transport, where they are recognized by helper T cells (CD4+). BCR – B cell receptor, ER – endoplasmic reticulum, GA – Golgi apparatus, TCR – T cell receptor. Graphics made with BioRender. elementa zrele mRNA potrebno dodati naknadno (2, 5). Kapo na 5'-konec sinteznih transkriptov dodajo encimsko (tj. z uporabo rekombinantnega encimskega kompleksa virusa vakcinije) ali pa že med transkripcijo uporabijo ana-loge kape (anti-reverse cap analogue, ARCA; slika 3), pri katerih je 3'-hidroksilna skupina 7-metilgvanozina metili­rana, kar zagotavlja pravilno orientacijo kape (15). Tudi poli(A)-rep je mogoce dodati po zakljuceni transkripciji z rekombinantnim encimom poli(A)polimerazo iz bakterije E. coli, a je bolj ekonomicna uporaba matricne DNA z zapisom za dolgo zaporedje adenozinov, tako nastala mRNA pa ima tudi bolje definirano dolžino poli(A)-repa. Optimizacija kodirajocega zaporedja je smiselna z vidika uporabe pogostejših alternativnih kodonov za isti aminoki­slinski ostanek in odstranitev višjih struktur mRNA (kot po­sledice lokalnega zvitja, npr. tvorbe zank ali lasnic), kar pri­pomore k ucinkovitosti procesa translacije (2, 5). 5'-UTR je vpletena v iniciacijo translacije, 3'-UTR pa uravnava sta­bilnost mRNA in obseg izražanja proteina. Pomembni de­javniki, ki dolocajo funkcionalnost neprevedenih regij, so nukleotidno zaporedje, dolžina in sekundarna struktura (2, 5), zato je racionalno nacrtovanje teh funkcionalnih ele­mentov nemogoce. Praviloma uporabijo neprevedene regije genov, za katere je znano, da povecajo stabilnost in okrepijo izražanje mRNA. Orlandini von Niessen in sodelavci (17) so pripravili knjižnico 3'-UTR dolgoživih mRNA in s poro-cevalskim celicnim testom izbrali vec funkcijskih elementov, ki so omogocali do trikrat višjo produkcijo kodiranih pro-teinov in vivo v primerjavi s konvencionalno 3'-UTR iz clo­veškega gena za ß-globin. Optimizacija izražanja antigena je v vakciniranih miših pricakovano izzvala tudi mocnejši imunski odziv. Pomemben napredek pri optimizaciji delovanja mRNA-ce­piv je tudi zmanjševanje imunostimulatornih lastnosti sin-tezne mRNA. Znano je, da dolocena, zlasti z uridinom bo­gata nukleotidna zaporedja v RNA aktivirajo t. i. vzorcno prepoznavne receptorje TLR7 in TLR8 (18, 19), zato z za­menjavo uridinov za njegove analoge, ki se sicer naravno pojavljajo v RNA kot posledica posttranskripcijskih modifi­kacij (kot sta psevdouridin ali N1-metilpsevdouridin), lahko mocno omejijo vnetne procese po vakcinaciji z mRNA in omogocijo boljše izražanje antigena. 3.2 OPTIMIZACIJA PROIZVODNJE mRNA Uvedba 5'-kape in 3'-poli(A)-repa med postopkom tran­skripcije in vitro (podpoglavje 3.1) je stroškovno ucinkovita, Slika 3: Transkripcija in vitro z uporabo standardnega analoga 7-metilgvanozinske kape (levo) in analoga ARCA (anti-reverse cap analogue; desno), katerega 3'-hidroksilna skupina je metilirana (povzeto po (16)). Ce pri encimski sintezi uporabijo dinukleotid m7GpppG, približno polovica transkriptov nosi 5'-kapo v napacni orientaciji. Nanje se iniciacijski dejavnik translacije eIF-4E ne veže, zato je translacija in vivo bistveno manj ucinkovita. Ce uporabijo dinukleotid ARCA (m7GmpppG), nastanejo le transkripti s 5'-kapo ustrezne orientacije in ucinkovitost translacije je visoka. Figure 3: In vitro transcription using the standard 7-methylguanosine cap analogue (left) and the anti-reverse cap analogue (ARCA; right) with 3' hydroxyl group methylated (adopted from (16)). If the standard dinucleotide m7GpppG is used in enzymatic synthesis, about a half of transcripts harbours the 5' cap in reverse orientation. As the translation initiation factor eIF-4E does not bind reverse capped products, the in vivo translation is fairly inefficient. On the other hand, the use of ARCA dinucleotide (m7GmpppG) leads to a single correctly capped product, significantly increasing the extent of translation. ker ne zahteva locenih encimskih reakcij z vmesno izolacijo in cišcenjem RNA s precipitacijo. Tako so izgube med pro-cesom proizvodnje ucinkovine manjše. Koncno cišcenje sintezne mRNA s hPLC je potrebno za odstranitev necistot, ki izhajajo iz encimske sinteze; zlasti je problematicna dvo­verižna RNA, ki aktivira receptorja TLR3 in RIG-I. Cišcenje s hPLC ima omejeno kapaciteto, zato so Baiersdorfer in sodelavci razvili alternativen nacin cišcenja, ki je osnovan na selektivni adsorpciji dvoverižne RNA na celulozo (20). Metoda je enostavna, cenovno zelo ugodna in ucinkovita primerljivo s hPLC. 3.3 OPTIMIZACIJA DOSTAVNIh SISTEMOV ZA mRNA Ustrezna formulacija mRNA je osrednjega pomena tako za ucinkovito dostavo in vivo kot za zagotavljanje stabil­nosti cepiva, obenem pa mora biti dostavni sistem bio-kompatibilen in netoksicen. Verjetno najvecji napredek pri razvoju mRNA-cepiv beležimo ravno na podrocju razvoja dostavnih sistemov (21), a so podrobnosti (kvantitativna sestava in nacin formulacije) poslovna skrivnost proizva­jalcev cepiv. V obeh odobrenih mRNA-cepivih proti SARS­CoV-2 (preglednica 2) je mRNA, ki kodira virusni protein S, vgrajena v lipidne nanodelce, ki vsebujejo kationske li­pide (ALC-0315 (((4-hidroksibutil)azandiil)bis(heksan-6,1­diil)bis(2-heksildekanoat); Comirnaty (Pfizer/BioNTech)) ali SM-102 (heptadekan-9-il 8-((2-hidroksietil)(6-okso-6-(de­ciloksi)heksil); COVID-19 Vaccine Moderna (Moderna)), ob tem pa še PEGilirane lipide (ALC-0159 (2-[PEG-2000]­N,N-ditetradecilacetamid; Comirnaty) ali PEG2000 DMG (1,2-dimiristoil-rac-glicero-3-metoksiPEG-2000; COVID­19 Vaccine Moderna)) ter DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoholin) in holesterol. Nekatera od mRNA-cepiv, ki so do sedaj dosegla fazo predklinicnega in zgodnjega kli­nicnega razvoja, so slonela tudi na uporabi protamina, amfipaticnih peptidov, ki prehajajo lipidne membrane, ali kationskih polimerov (npr. polietilenimina, PEI) (21). Ker je PEI razmeroma citotoksicen, ga zamenjujejo za acilirane analoge (npr. funkcionalizirane s stearinsko kislino), ki iz­kazujejo boljši varnostni profil (npr. (22)). Zelo obetaven dostavni sistem predstavljajo tudi oligo(karbonat-b-a­amino estri), t. i. CART (charge-altering releasable tran­sporters). Ti kot kationski polimeri sprva tvorijo nekova­lentne komplekse z mRNA, ki ucinkovito vstopajo v celice, ob spontani razgradnji do nevtralnih amidov v endosomih pa izgubijo pozitiven naboj in tako olajšajo sprošcanje mRNA v citosol (23). 4 KLINICNE IZKUŠNJE S CEPIVI NA OSNOVI mRNA Cepiva na osnovi mRNA niso popolna novost, saj prva klinicna raziskava s konvencionalnim mRNA-cepivom sega v leto 2013, že pred tem pa so cloveškim prostovoljcem injicirali tudi samopomnožujoco alfavirusno RNA, pakirano v virusne delce (preglednica 2). Dosegljiva porocila klinicnih raziskav potrjujejo varnost takšnih profilakticnih vakcin, vendar pa imunogenosti, ki so jo potrdili v predklinicnih raziskavah, niso vselej opazili tudi pri cloveških prosto­voljcih. V klinicnih raziskavah prve faze, v katerih so vred­notili varnost in imunogenost mRNA-cepiv s spremenjenimi nukleotidi, formuliranih v obliki lipidnih nanodelcev, proti virusu gripe sevov h10N8 (NCT03076385) in h7N9 (NCT03345043) (24), so v nasprotju s poskusi na živalih (miših, dihurjih in makakih) po cepljenju ljudi zabeležili raz­meroma šibko in kratkotrajno imunost. Zanimiva so tudi opažanja iz klinicne raziskave prve faze, v kateri so vred­notili imunogenost mRNA-cepiva z nespremenjenimi nu-kleotidi v kompleksu s protaminom proti steklini (NCT02241135) (25). Cepivo je po intradermalnem injici­ranju uspešno zašcitilo miši pred okužbo ter izzvalo mocan in dolgotrajen imunski odziv pri prašicih (26). Cloveškim prostovoljcem so cepivo injicirali intramuskularno ali intra-dermalno, bodisi z uporabo brizg in igel ali z brezigelnim injektorjem. Nepricakovano so le prostovoljci, vakcinirani z brezigelnim injektorjem, razvili nevtralizirajoca protitelesa, a je bil imunski odziv razmeroma variabilen in je izzvenel po enem letu (25). Ta opažanja nakazujejo, da obstajajo pomembne medvrstne razlike v imunogenosti mRNA-ce­piv, ki so verjetno posledica razlik v zaznavanju eksogene mRNA ali komponent dostavnih sistemov z receptorji ne­specificne imunosti, ob tem pa velja veliko pozornost v klinicnih raziskavah posvetiti ne le višini odmerka in ca-sovnim intervalom med ponovljenimi cepljenji, temvec tudi nacinu aplikacije. Najvec podatkov o ucinkovitosti in varnosti mRNA-cepiv so seveda zbrali za obe pogojno že odobreni cepivi proti virusu SARS-CoV-2. Obsežni klinicni raziskavi tretje faze sta zajeli tudi starejše odrasle, ljudi z raznolikim genetskim ozadjem (etnicno poreklo) in bolnike z boleznimi, ki so znan dejavnik tveganja za hujši potek covid-19 (astma, kronicne pljucne bolezni, indeks telesne mase = 30, sladkorna bo­lezen, hipertenzija). Ucinkovitost cepiv (zašcita pred co­vid-19) je ocenjena na visokih 95 % (95-odstotni interval zaupanja: 90,0–97,9; Comirnaty (Pfizer/BioNTech) (27)) oz. 94,1 % (95-odstotni interval zaupanja: 89,3–96,8; COVID­19 mRNA Vaccine (Moderna) (28)). Tudi ce je pri cepljenih posameznikih prišlo do okužbe s SARS-CoV-2, je bolezen potekala v blagi obliki. Med zdravimi prostovoljci in kroni-cnimi bolniki bistvenih razlik v ucinkovitosti cepiv niso opa­zili, podobno velja za razlicne starostne skupine. Reakto­genost je bila nekoliko bolj izražena pri mlajših udeležencih klinicne raziskave, neželeni ucinki so bili pretežno blagi in so hitro izzveneli. Najpogosteje so porocali o bolecinah na mestu vnosa cepiva, utrujenosti, glavobolu, bolecinah v mišicah ali sklepih in pireksiji. Pri redkih prostovoljcih (4/21.720 (NCT04368728); 3/15.210 (NCT04470427)), ki so prejeli cepivo (in pri enem udeležencu iz skupine, ki je prejela placebo (1/15.210 (NCT04470427)) se je pojavila prehodna paraliza obraznega živca (Bellova pareza), po zacetku množicnega cepljenja pa porocajo o sicer izjemno redkih alergijskih reakcijah. Pri tem velja izpostaviti, da aler­gijske bolezni dihal in kože, anafilaksija po pikih žuželk, hrani ali zdravilih niso kontraindikacije za cepljenje s tema cepivoma (29). Cepijo se lahko tudi imunokompromitirani posamezniki in bolniki, ki prejemajo imunosupresivna zdra­vila, a je ucinkovitost cepljenja pri teh verjetno nižja. Pregled dosedanjih klinicnih vrednotenj profilakticnih cepiv na osnovi mRNA proti nalezljivim boleznim je zbran v pre­glednici 2. Vecina raziskav zajema uporabo mRNA, ki po cepljenju izzovejo nastajanje enega ali vec (gliko)proteinskih antigenov virusnih patogenov in s tem sprožijo aktivno imunizacijo proti povzrocitelju nalezljive bolezni. Nasprotno v eni manjši klinicni raziskavi prve faze vrednotijo varnost, farmakokinetiko in farmakodinamiko mRNA, ki kodira nev­tralizacijsko monoklonsko protitelo (ChKV-24), usmerjeno proti virusu cikungunje. V tem primeru ne govorimo o ce­pivu, temvec posegajo po drugacni terapevtski strategiji, t. i. pasivni imunizaciji. Preglednica 2: Pregled klinicnih raziskav profilakticnih mRNA-cepiv proti nalezljivim boleznim (vir: clinicaltrials.gov). Table 2: Clinical trials of prophylactic mRNA vaccines for infectious diseases (source: clinicaltrials.gov). hIV-1 AVx101, alfavirusna RNA, ki kodira protein Gag virusa hIV­1, pakirana v virusne delce 105–108 virusnih delcev, s. c., en odmerek, primerjava s placebom 2004 96 AlphaVax zakljucena faza I (NCT00097838) (30) CMV AVx601, alfavirusna RNA, ki kodira glikoprotein gB in fuzijski protein pp65/IE1 CMV, pakirana v virusne delce 2 × 107 ali 2 × 108 virusnih delcev,s. c. ali i. m.,trije odmerki, razporejeni na tedne 0, 8 in 24, primerjava s placebom 2007 40 AlphaVax zakljucena faza I (NCT00439803) (31, 32) Virus stekline mRNA CV7201, ki kodira glikoprotein RABV-G, kompleksirana z bazicnim proteinom protaminom 80–640 µg, i. m. ali i. d., odmerki razporejeni na dneve 0-7-28, 0-28 ali 0-28-56 Virus stekline 2014 72 CureVac nekodirajoca RNA CV8102 kot adjuvant (agonist receptorjev TLR 7/8 in aktivator signalne poti RIG I), kompleksirana z majhnim kationskim peptidom CR12C 25–250 µg, i. m., samostojno ali v kombinaciji z inaktiviranim cepivom (Rabipur), odmerka razporejena na dneva 0 in 21 zakljucena faza I (NCT02238756) (33) 2016 90 Moderna Virus zika mRNA-1325, ni podatka o formulaciji ni podatka o odmerjanju, primerjava s placebom zakljucena faza I/II (NCT03014089) CMV mRNA-1647* ali mRNA-1443, vgrajena v lipidne nanodelce 30–300 µg, odmerki razporejeni na mesece 0, 2 in 6, primerjava s placebom 2017 181 Moderna zakljucena faza I (NCT03382405) Virusa hMPV in PIV3 mRNA-1653 (dve razlicni mRNA), ki kodirata proteina paramiksovirusov, vgrajeni v lipidne nanodelce ni podatka o odmerjanju (dve roki: odrasli in otroci; primerjava s placebom) 2019 114 Moderna v teku (poteka novacenje prostovoljcev) faza Ib (NCT04144348) Virus cikungunje mRNA-1944, ki kodira protitelo (ChKV-24), usmerjeno proti virusu cikungunje (pasivna imunizacija), vgrajena v lipidne nanodelce narašcajoci odmerki, i. v. (infuzija), primerjava s placebom 2019 39 Moderna v teku faza I (NCT03829384) SARS-CoV-2 mRNA BNT162b2 (in druge), ki kodirajo protein Sp ali RBD, vgrajene v lipidne nanodelce 10–100 µg, i. m., odmerki razporejeni na dneva 0 in 21, primerjava s placebom 2020/2021 144 456 120 160 960 43998 4644 (otroci, 5-12 let) 4000 (nosecnice 18 let in vec) Pfizer/ BioNTech v teku v teku v teku v teku v teku v teku (poteka novacenje prostovoljcev) v teku (poteka novacenje prostovoljcev) v teku (poteka novacenje prostovoljk) pogojna odobritev COMIRNATY faza I (NCT04523571) faza I/II (NCT04380701) (34) faza I/II (NCT04537949) faza I/II (NCT04588480) (35) faza II (NCT04649021) faza II/III (NCT04368728) (27) faza I/II/III (NCT04816643) faza II-III (NCT04754594) faza I (NCT04283461) (36, 37) faza IIa (NCT04405076) faza III (NCT04470427) (28) faza II/III (NCT04649151) faza II/III (NCT04796896) SARS-CoV-2 mRNA CVnCoV, ki kodira protein Sp, vgrajena v lipidne nanodelce 6–12 µg, i. m., odmerka razporejena na dneva 0 in 28 (+180), primerjava s placebom (tudi cepivoma proti hepatitisu A ali pnevmokokom) 2020/2021 280 660 36500 2520 CureVac v teku v teku v teku v teku (poteka novacenje prostovoljcev) faza I (NCT04449276) faza II (NCT04515147) faza IIb/III (NCT04652102) faza III (NCT04674189) CMV – citomegalovirus, hMPV – cloveški metapnevmovirus, i.d. – intradermalno, i.m. – intramuskularno, i.v. – intravensko, PIV3 – virus parainfluence tipa 3, protein Sp – predfuzijska oblika proteina S (spike), RBD – receptor vezavna domena proteina S, s.c. – subkutano, VLP – virusu podobni delci (virus-like particles) 5 SKLEP Cepiva na osnovi mRNA predstavljajo eno najobetavnejših platform, saj zaradi možnosti hitre in obsežne proizvodnje, neodvisne od strukture kodiranega proteinskega antigena, omogocajo izjemno hiter odziv na grožnje novih patogenov in jih je moc razmeroma enostavno prilagajati potencialnim mutacijam, ki spremljajo širitev patogenov v populaciji. Kljub izjemnemu napredku pri razvoju mRNA-cepiv proti infekcij-skim in rakavim boleznim v zadnjih dveh desetletjih ostaja nekaj pomembnih vprašanj odprtih. Tako trenutno ni znano, ali posamezni formati mRNA-cepiv (npr. modifikacije 5'-kape in regulatornih regij mRNA, uporaba spremenjenih nukleozi­dov) sprožajo razlicne vrste imunskih odzivov oz. ali so pri­mernejši za dolocen nabor terapevtskih aplikacij. Kljucnega pomena bo razumevanje imunostimulatornih ucinkov same sintezne mRNA, ki prek indukcije sprošcanja citokinov in ke­mokinov domnevno pomembno vpliva na obseg in kakovost odzivov limfocitov T in B z aktivacijo in novacenjem razlicnih celic imunskega sistema (21). življenjska doba mRNA in vivo ter nivo izražanja antigena (kar pomembno doloca tudi inter-feronski odziv) pomembno vplivata na kinetiko in obseg pred­stavljanja antigenskih peptidov na MhC I in MhC II (21). Re-zultati nedavnih raziskav na živalih nakazujejo, da mRNA-cepiva s spremenjenimi nukleotidi, formulirana v obliki lipidnih nanodelcev, izzovejo mocan odziv folikularnih T-celic pomagalk in limfocitov B v germinalnih centrih bezgavk, kar vodi do robustne tvorbe nevtralizacijskih protiteles (38, 39). Manj je podatkov o tem, kako spremenjeni nukleotidi v mRNA-cepivih vplivajo na odziv citotoksicnih limfocitov T. Znano je, da nespremenjena mRNA izzove robustne odzive citotoksicnih limfocitov T proti tumorskim antigenom (40, 41), a v tovrstnih raziskavah praviloma ne spremljajo humo­ralnega imunskega odziva. V prihodnosti si obetamo tudi nadaljnji napredek v razvoju dostavnih sistemov, s cimer bi npr. selektivno transfecirali posamezne vrste celic in vivo, povecali stabilnost cepiv (omogocili enostavnejše shranje­vanje) in optimizirali njihov imunomodulatorni ucinek. 6 LITERATURA 1. Draft landscape of COVID-19 candidate vaccines [Internet]. WHO; 2021 [cited 2021 May 25]; Available from: https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of­covid-19-candidate-vaccines. 2. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vaccines ­a new era in vaccinology. Nat Rev Drug Discov. 2018 Apr;17(4):261-79. 3. Malone RW, Felgner PL, Verma IM. Cationic liposome-mediated RNA transfection. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Aug;86(16):6077-81. 4. Wolff JA, Malone RW, Williams P, Chong W, Acsadi G, Jani A, et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 1990 Mar 23;247(4949 Pt 1):1465-8. 5. Gomez-Aguado I, Rodriguez-Castejon J, Vicente-Pascual M, Rodriguez-Gascon A, Solinis MA, Del Pozo-Rodriguez A. Nanomedicines to deliver mRNA: state of the art and future perspectives. Nanomaterials (Basel). 2020 Feb 20;10(2). 6. Bloom K, van den Berg F, Arbuthnot P. Self-amplifying RNA vaccines for infectious diseases. Gene Ther. 2020 Oct 22. 7. Mikkola S, Lonnberg T, Lonnberg H. Phosphodiester models for cleavage of nucleic acids. Beilstein J Org Chem. 2018;14:803-37. 8. Crommelin DJA, Anchordoquy TJ, Volkin DB, Jiskoot W, Mastrobattista E. Addressing the cold reality of mRNA vaccine stability. J Pharm Sci. 2021 Mar;110(3):997-1001. 9. Maruggi G, Zhang C, Li J, Ulmer JB, Yu D. mRNA as a transformative technology for vaccine development to control infectious diseases. Mol Ther. 2019 Apr 10;27(4):757-72. 10. Akinc A, Querbes W, De S, Qin J, Frank-Kamenetsky M, Jayaprakash KN, et al. Targeted delivery of RNAi therapeutics with endogenous and exogenous ligand-based mechanisms. Mol Ther. 2010 Jul;18(7):1357-64. 11. Pardi N, Tuyishime S, Muramatsu H, Kariko K, Mui BL, Tam YK, et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015 Nov 10;217:345-51. 12. Bahl K, Senn JJ, Yuzhakov O, Bulychev A, Brito LA, Hassett KJ, et al. Preclinical and clinical demonstration of immunogenicity by mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses. Mol Ther. 2017 Jun 7;25(6):1316-27. 13. Iavarone C, O'Hagan D T, Yu D, Delahaye NF, Ulmer JB. Mechanism of action of mRNA-based vaccines. Expert Rev Vaccines. 2017 Sep;16(9):871-81. 14. Ciaramella G. Shedding light on our prophylactic vaccines’ mechanism of action [Internet]. Moderna; 2017 [cited 2021 May 25]; Available from: https://www.modernatx.com/moderna­blog/shedding-light-our-prophylactic-vaccines-moa. 15. Stepinski J, Waddell C, Stolarski R, Darzynkiewicz E, Rhoads RE. Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7­methyl (3'-deoxy)GpppG. RNA. 2001 Oct;7(10):1486-95. 16. Organic Chemistry > Organic Molecules. > .Biomolecules. > .RNA. > .RNA processing > Capping [Internet]. [cited 2021 May 25]; Available from: https://sites.google.com/site/learnorganicchem/organic­molecules/biomolecules/rna/rna-processing. 17. Orlandini von Niessen AG, Poleganov MA, Rechner C, Plaschke A, Kranz LM, Fesser S, et al. Improving mRNA-Based Therapeutic Gene Delivery by Expression-Augmenting 3' UTRs Identified by Cellular Library Screening. Mol Ther. 2019 Apr 10;27(4):824-36. 18. Diebold SS, Massacrier C, Akira S, Paturel C, Morel Y, Reis e Sousa C. Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides. Eur J Immunol. 2006 Dec;36(12):3256-67. 19. Forsbach A, Samulowitz U, Volp K, Hofmann HP, Noll B, Tluk S, et al. Dual or triple activation of TLR7, TLR8, and/or TLR9 by single-stranded oligoribonucleotides. Nucleic Acid Ther. 2011 Dec;21(6):423-36. 20. Baiersdorfer M, Boros G, Muramatsu H, Mahiny A, Vlatkovic I, Sahin U, et al. A facile method for the removal of dsRNA contaminant from in vitro-transcribed mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2019 Apr 15;15:26-35. 21. Pardi N, Hogan MJ, Weissman D. Recent advances in mRNA vaccine technology. Curr Opin Immunol. 2020 Aug;65:14-20. 22. Zhao M, Li M, Zhang Z, Gong T, Sun X. Induction of HIV-1 gag specific immune responses by cationic micelles mediated delivery of gag mRNA. Drug Deliv. 2016 Sep;23(7):2596-607. 23. McKinlay CJ, Vargas JR, Blake TR, Hardy JW, Kanada M, Contag CH, et al. Charge-altering releasable transporters (CARTs) for the delivery and release of mRNA in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Jan 24;114(4):E448-E56. 24. Feldman RA, Fuhr R, Smolenov I, Mick Ribeiro A, Panther L, Watson M, et al. mRNA vaccines against H10N8 and H7N9 influenza viruses of pandemic potential are immunogenic and well tolerated in healthy adults in phase 1 randomized clinical trials. Vaccine. 2019 May 31;37(25):3326-34. 25. Alberer M, Gnad-Vogt U, Hong HS, Mehr KT, Backert L, Finak G, et al. Safety and immunogenicity of a mRNA rabies vaccine in healthy adults: an open-label, non-randomised, prospective, first-in-human phase 1 clinical trial. Lancet. 2017 Sep 23;390(10101):1511-20. 26. Schnee M, Vogel AB, Voss D, Petsch B, Baumhof P, Kramps T, et al. An mRNA vaccine encoding rabies virus glycoprotein induces protection against lethal infection in mice and correlates of protection in adult and newborn pigs. PLoS Negl Trop Dis. 2016 Jun;10(6):e0004746. 27. Polack FP, Thomas SJ, Kitchin N, Absalon J, Gurtman A, Lockhart S, et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med. 2020 Dec 31;383(27):2603­15. 28. Baden LR, El Sahly HM, Essink B, Kotloff K, Frey S, Novak R, et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2020 Dec 30. 29. Košnik M, Avcin T, Zidarn M. Stališca glede obravnave alergijskih bolezni med covid epidemijo [Internet]. NIJZ; 2021 [cited 2021 May 25]; Available from: https://www.nijz.si/sites/www.nijz.si/files/uploaded/alergoloska_ stalisca_covid_feb_2021.pdf. 30. Wecker M, Gilbert P, Russell N, Hural J, Allen M, Pensiero M, et al. Phase I safety and immunogenicity evaluations of an alphavirus replicon HIV-1 subtype C gag vaccine in healthy HIV­ 1-uninfected adults. Clin Vaccine Immunol. 2012 Oct;19(10):1651-60. 31. Mogler MA, Kamrud KI. RNA-based viral vectors. Expert Rev Vaccines. 2015 Feb;14(2):283-312. 32. Bernstein DI, Reap EA, Katen K, Watson A, Smith K, Norberg P, et al. Randomized, double-blind, Phase 1 trial of an alphavirus replicon vaccine for cytomegalovirus in CMV seronegative adult volunteers. Vaccine. 2009 Dec 11;28(2):484-93. 33. Doener F, Hong HS, Meyer I, Tadjalli-Mehr K, Daehling A, Heidenreich R, et al. RNA-based adjuvant CV8102 enhances the immunogenicity of a licensed rabies vaccine in a first-in­human trial. Vaccine. 2019 Mar 22;37(13):1819-26. 34. Sahin U, Muik A, Derhovanessian E, Vogler I, Kranz LM, Vormehr M, et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and TH1 T cell responses. Nature. 2020 Oct;586(7830):594-9. 35. Mulligan MJ, Lyke KE, Kitchin N, Absalon J, Gurtman A, Lockhart S, et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 2020 Oct;586(7830):589-93. 36. Anderson EJ, Rouphael NG, Widge AT, Jackson LA, Roberts PC, Makhene M, et al. Safety and immunogenicity of SARS­CoV-2 mRNA-1273 vaccine in older adults. N Engl J Med. 2020 Dec 17;383(25):2427-38. 37. Jackson LA, Anderson EJ, Rouphael NG, Roberts PC, Makhene M, Coler RN, et al. An mRNA vaccine against SARS­CoV-2 -Preliminary report. N Engl J Med. 2020 Nov 12;383(20):1920-31. 38. Lindgren G, Ols S, Liang F, Thompson EA, Lin A, Hellgren F, et al. Induction of robust B cell responses after influenza mRNA vaccination is accompanied by circulating hemagglutinin-specific ICOS+ PD-1+ CXCR3+ T follicular helper cells. Front Immunol. 2017;8:1539. 39. Pardi N, Hogan MJ, Naradikian MS, Parkhouse K, Cain DW, Jones L, et al. Nucleoside-modified mRNA vaccines induce potent T follicular helper and germinal center B cell responses. J Exp Med. 2018 Jun 4;215(6):1571-88. 40. Kreiter S, Vormehr M, van de Roemer N, Diken M, Lower M, Diekmann J, et al. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to cancer. Nature. 2015 Apr 30;520(7549):692-6. 41. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC, et al. Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy. Nature. 2016 Jun 16;534(7607):396-401. NAPREDNE KLINICNE STORITVE V LEKARNAh – hITRI TESTI Doc. dr. Nejc Horvat, asist. dr. Urška Nabergoj Makovec, asist. dr. Jasna Omersel hitri testi niso novost, temvec so že vec desetletij prisotni v laboratorijski medicini. Izvajajo se izven medicinskih la-boratorijev kot testiranje ob preiskovancu, t. i. point of care test (POCT), saj omogocajo hitro pridobljen rezultat, ki lahko neposredno vpliva na postavitev diagnoze, napo­ved zdravstvenega izida ali spremljanje zdravljenja. Mnoge pa uporabljamo kot teste za samotestiranje (npr. test no-secnosti, merjenje glukoze z glukometrom). Napredne klinicne storitve v lekarnah, ki ponujajo testiranje ob preiskovancu za presejanje in nadzor bolezni, so raz­širjene predvsem v ZDA, kjer lekarne ponujajo širok nabor možnih testov ob preiskovancu. Rezultati ankete Farma­cevtske skupine Evropske unije (PGEU) so pokazali, da 77 % lekarn izvaja merjenje glukoze v krvi in 73 % merjenje holesterola (1). Skozi primer študije iz Severne Irske je razviden potencial racionalizacije predpisovanja antibiotikov ob podpori upo­rabe hitrih testov za C-reaktivni protein (CRP) in streptokok A (2). Storitev je potekala v petih zunanjih lekarnah, s pod-poro lokalnih zdravnikov, farmacevti so bili deležni izobra­ževanja za izvedbo hitrih testov. Vkljuceni so bili pacienti s simptomi kašlja, prehlada ali gripe. Pacientom s produ­ktivnim kašljem so pomerili CRP v kapilarni krvi. Tisti, ki so imeli visoko koncentracijo CRP (nad 80 mg/L), so bili na­poteni k zdravniku za nadaljnjo obravnavo. Pacientom, ki so imeli vneto grlo, pa so ponudili test za streptokok A. Na podlagi pozitivnega rezultata je farmacevt izdal antibiotik. Od 425 vkljucenih pacientov jih je bilo le 14 pozitivnih na streptokok A in so prejeli antibiotike. Od 286 pacientov s produktivnim kašljem sta le 2 imela CRP nad 80 mg/L. Tema je zdravnik predpisal antibiotike. Med pacienti, ki jih niso napotili k zdravniku, jih je 50 kljub temu odšlo k zdrav­niku. 49 od tega jih je dobilo antibiotike navkljub odsotnosti klinicnih indicev, kar kaže na mocno usidrano navado pred­pisovanja antibiotikov. Glede na enako obdobje v prejšnjem letu se je predpisovanje antibiotikov v povprecju znižalo za kar 45 %. Vsi udeleženci so izkazovali zadovoljstvo s storitvijo in željo, da se jo implementira na nacionalni ravni. Prihranke storitve, v katero je bilo vkljucenih 425 pacientov, so ocenili na pri­bližno Ł 3800, pri cemer so upoštevali tudi stroške opreme, materiala in izobraževanja (2). Vira: 1. PGEU. Annual report 2017: Measuring health outcomes in community pharmacy. Brussels; 2017. 2. Kulwicki BD, Brandt KL, Wolf LM, Weise AJ, Dumkow LE. Impact of an emergency medicine pharmacist on empiric antibiotic prescribing for pneumonia and intra-abdominal infections. Am J Emerg Med. 2019 May;37(5):839-844. doi: 10.1016/j.ajem.2018.07.052. NOVICE IZ SVETA FARMACIJE NANOTEhNOLOGIJA IN CEPIVA PROTI KORONAVIRUSU Izr. prof. dr. Pegi Ahlin Grabnar, mag. farm. Ste vedeli, da ima nanotehnologija zelo pomembno vlogo pri razvoju mRNK-cepiv proti novemu koronavirusu? mRNK-cepiva proizvajalcev BioNTech/Pfizer in Moderne namrec vsebujejo lipidne nanodelce, v katere je vkljucena informacijska ribonukleinska kislina (mRNK), ki predstavlja navodila za izdelavo proteina virusa SARS-CoV-2, ki pov­zroca covid-19. Sama mRNK je sicer zelo nestabilna mo-lekula, ki se hitro razgradi z ribonukleazami, ki so prisotne v zunajcelicnem okolju. Poleg tega, da lipidni nanodelci prispevajo k stabilnosti mRNK, predstavljajo tudi dostavni sistem, ki omogoca, da lahko molekule vstopijo v celice. mRNK je namrec velika molekula z negativnim nabojem, zato je njeno prehajanje membran oteženo. Po intramu­skularni aplikaciji lipidni nanodelci omogocajo sprejem mRNK v celice gostitelja in dostavo v citosol, kjer v riboso­mih pride do translacije sekvence mRNK v protein, ki se sicer nahaja na površini virusa. Lipidni nanodelci imajo pre-mer 60 do 100 nm in vsebujejo štiri glavne sestavine: fos­folipid, holesterol, pegiliran lipid in kationski lipid. Slednji vsebuje amino skupine, ki stopajo v interakcije z anionskimi skupinami mRNK, tako da so lipidi prisotni tudi v notranjosti nanodelcev, za razliko od liposomov, pri katerih je v notra­njosti voda. Trenutna pomanjkljivost mRNK-cepiv je potreba po shranjevanju pri nizkih temperaturah (Moderna: med -15 in -25 °C; BioNTech/Pfizer: med -60 in -90 °C), kar otežuje njihov transport. Njihova prednost pa je zagotovo relativno hiter razvoj, saj mRNK-lipidni nanodelci predsta­vljajo tehnološko platformo, kar pomeni, da proces izdelave novih mRNK-cepiv poteka po enakem postopku. NOVICE IZ SVETA FARMACIJE Vira: 1. Schoenmaker L, Witzigmann D, Kulkarni JA, Verbeke R, Kersten G, Jiskoot W, Crommelin DJA. mRNA-lipid nanoparticle COVID­19 vaccines: Structure and stability. Int J Pharm. 2021 May 15;601:120586. doi: 10.1016/j.ijpharm.2021.120586. 2. Thi TTH, Suys EJA, Lee JS, Nguyen DH, Park KD, Truong NP. Lipid-Based Nanoparticles in the Clinic and Clinical Trials: From Cancer Nanomedicine to COVID-19 Vaccines. Vaccines (Basel). 2021 Apr 8;9(4):359. doi: 10.3390/vaccines9040359. DRUšTVENA NOVICA Clan Slovenskega farmacevtskega društva, zaslužni prof. dr. Franc Kozjek, mag. farm., je bil mnogim generacijam farmacevtov v Sloveniji profesor na Fakulteti za farmacijo v Ljubljani, a nekaterim našim clanom je dobro poznan tudi kot ljubitelj likovne umetnosti in lastnik bogate zbirke slik. Po diplomi na Farmacevtski fakulteti v Zagrebu in doktoratu na Medicinsko-farmacevtski fakulteti v Lyonu je na univer­zitetnem študiju farmacije v Ljubljani uvajal nove vsebine in jih je podprl tudi z ustreznimi ucbeniki. Izredno pišoc tudi po upokojitvi ni pocival. Leta 2019 je tako v samozaložbi izdal knjigo »Od slike do zbirke«. Kot lastnik preko 200 li­kovnih del 150-ih avtorjev vseh ni mogel predstaviti v eni knjigi, zato je letos izdal še nadaljevanje. Tudi v novi knjigi spominov na srecanja z likovnimi umetniki »Od slike do zbirke II« se avtor poglablja v sliko, jo razume in razloži. Vsak opis je zgodba zase. Tista, ki je obogatena z obiskom slikarja, ima še dodatno vrednost. V vsaki cu­timo slikarjevo dušo in njegovo pripoved, kar je avtor spretno prepletel v komentar k posamezni sliki iz zbirke. Izšel je drugi del spominov prof. dr. Franca Kozjeka na @ 200 strani zanimivega branja. Cena 24,99 € Seniorji in študenti 15,00 € _ í ô In.nitiMRM Pot do zdravja Naš cilj so zdravi in srecni ljudje. Smo veledrogerija za prodajo zdravil z najširšo ponudbo izdelkov za humano in veterinarsko medicino v Sloveniji. Odlikujejo nas hitrost, varnost in zanesljivost. Svoje delo opravljamo srcno in predano. Prav zaradi tega nam zaupajo številne lekarne in bolnišnice ter druge zdravstvene in veterinarske ustanove. Zavedamo se, da nam prihodnost ponuja nešteto izzivov. Premagamo jih lahko z nenehnim izpopolnjevanjem. S kakovostnimi storitvami in s široko izbiro zdravil ter drugih izdelkov bomo zaupanje svojih kupcev opravicevali tudi v prihodnje! 01 470 98 00 | www.kemofarmacija.si