ZDRAV VESTN 2006; 75: 629–34 Strokovni prispevek/Professional article KLINIČNI POMEN MUTACIJE V617F JAK2 GENA PRI KRONIČNIH MIELOPROLIFERATIVNIH BOLEZNIH – PRVE IZKUŠNJE CLINICAL MEANING OF JAK2 V617F MUTATION IN CHRONIC MYELOPROLIFERATIVE DISORDERS – THE FIRST EXPERIENCE Joško Vučković1, 2, Tadej Pajič4, Rajko Kušec3, Mateja Grat1, Marjan Lorbek1, Dinko Rogulj2, Rok Pavlič1, Ivan Žuran1 1 Splošna bolnišnica Celje, Oblakova 5, 3000 Celje 2 Splošna bolnišnica Brežice, Černelčeva 8, 8000 Brežice 3 Klinična bolnišnica Merkur, 41000 Zagreb 4 Klinični oddelek za hematologijo, Klinični center, Zaloška 7, 1525 Ljubljana Prispelo 2006-05-18, sprejeto 2006-09-11; ZDRAV VESTN 2006; 75: 629–34 Ključne besede kronične mieloproliferativne bolezni; esencialna trombocitoza; policitemija vera; mielofibroza; V617F mutacija JAK2 Izvleček Izhodišča Pridobljeno mutacijo V617F v genu JAK2 so ugotovili pri večini bolnikov s pravo policitemijo (PP) in pri približno polovici bolnikov z esencialno trombocitemijo (ET) in kronično idiopatsko mielofibrozo (KIMF). To je prvi označevalec za ločevanje reaktivnih motenj krvne slike od omenjenih kroničnih mieloproliferativnih bolezni (KMPB). Začetne raziskave so pokazale, da bi lahko na osnovi mutacije JAK2 razdelili bolnike z ET v dve različni skupini, pri čemer bi skupina s prisotno mutacijo imela nekatere klinične in laboratorijske značilnosti PP. Metode Mutacije V617F smo določali z načinom alelno-specifične verižne reakcije s polimerazo DNK vzorcev 53 bolnikov s KMPB (35 ET, 12 PP in 6 KIMF). Ugotavljali smo razlike v kliničnih in laboratorijskih značilnostih med bolniki z ET in prisotno ali odsotno mutacijo. Rezultati Mutacija V617F je bila prisotna pri 12 od 12 bolnikov s PP (100 %), pri 15 od 35 z ET (43 %) in pri 2 od 6 (33 %) z KIMF. Bolniki z ET, ki so bili za mutacijo pozitivni, so imeli večjo koncentracijo Hb in manjše število trombocitov že ob diagnozi. Pri teh bolnikih je povprečna koncentracija Hb v obdobju spremljanja (35 mesecev) naraščala in pri 2 bolnikih se je bolezen preobrazila v očitno PP. Nasprotno je pri bolnikih brez mutacije koncentracija Hb ostala enaka oz. se je celo rahlo zmanjšala v obdobju spremljanja (42 mesecev). Pri številu levkocitov, pojavnostjo splenomegalije, potrebe po antiproliferativnih zdravilih in prisotnostjo z boleznijo povezanih zapletov med za mutacijo pozitivnimi in negativnimi bolniki z ET nismo zaznali statistično pomembnih razlik. Ugotovili smo statistično pomembno razliko v vrednosti koeficienta variacije volumna trombocitov (KVVT), vrednost, izražena v odstotkih, je bila večja pri bolnikih z ET, katerim smo dokazali mutacijo. Avtor za dopisovanje / Corresponding author: Joško Vučković, Splošna bolnišnica Celje, Oblakova 5, 3000 Celje 630 ZDRAV VESTN 2006; 75 Zaključki Delež bolnikov z mutacijo V617F v JAK2, ki smo ga določali z načinom alelno-specifične verižne reakcije pri bolnikih s PP, ET in KIMF, je podoben deležem, ki so bili objavljeni v literaturi. Test se je izkazal za koristnega za ločevanje KMPB od reaktivnih motenj krvne slike. Skupina bolnikov ET, pri katerih obstaja mutacija, ima nekatere podobnosti s PP in lahko bi vsaj pri nekaterih bolnikih šlo za zgodnjo obliko PP. Key words chronic myeloproliferative disorders; essential thrombocythaemia; polycythaemia vera; idiophatic myelofibrosis; V617F mutation of JAK2 Abstract Background An acquired V617F mutation in the JAK2 gene was found to occur in most patients with polycythaemia vera (PV), and about a half of those with essential thrombocythaemia (ET) and chronic idiopathic myelofibrosis (CIMF). It is the first clonal marker that allows differentiation between reactive thrombocytosis and erythrocytosis from some chronic myeloproliferative disorders (CMPD) – ET, PV and CIMF. It has been proposed that the JAK2 status could also divide ET patients in two distinct subgroups, with mutation positive one showing clinical and laboratory features of PV. Patients and methods Allele-specific PCR for JAK2 mutation was done in 53 patients (35 ET, 12 PV and 6 CIMF). In the group of ET patients, some clinical and laboratory features of mutation positive and mutation negative subgroup were compared. Results In general we found V617F mutation in 12/12 (100 %) PV, in 15/35 (43 %) ET and in 2/6 (33 %) CIMF. Mutation positive ET patients had higher haemoglobin (Hb) level and lower platelet counts already at diagnosis. The Hb level had the tendency to increase (observation period 35 months) and 2 patients converted to overt PV. In mutation negative patients the Hb level remained equal or even was slightly decreased after observation period (42 months). Up to now there is no statistical difference in leukocyte count, incidence of splenomegaly, anti- proliferative drugs demand or disease related complications. Platelet distribution width (PDW) was higher in mutation positive group. Conclusions The fraction of V617F mutation positive patients with CMPD in our work is similar to that found by others. We found this test very useful in differentation of some CMPD cases from the reactive states. Mutation positive ET shares some clinical and laboratory features with PV and overt polycythemic transformation in such patients is possible. Uvod Kronične mieloproliferativne bolezni (KMPB) so klonske bolezni, ki izvirajo iz multipotentne matične celice, za katere je značilna čezmerna tvorba ene ali več celičnih vrst ob odsotnosti določenega znanega sprožilnega dejavnika (1). V zadnjih letih so zelo intenzivno iskali molekularni mehanizem nenadzorovane proliferacije pri KMPB in se osredotočili na možne mutacije v genu za tirozin kinazo (TK). Mutacije, ki aktivirajo TK, vplivajo na celično proliferacijo in poti preživetja in jih vedno bolj priznavajo kot osnovni vzrok za nastanek človeškega raka (2). Z diagnostičnega stališča mutacije lahko služijo kot biološki označevalec določenih bolezni in so hkrati dokaz klonskosti. Do nedavnega so bile pri KMPB znane mutacije v TK le bcr/abl fuzije, ki so značilne za kronično mieloično levkemijo (KML) (3). Pogrešali smo specifični molekularni označevalec, podoben bcr/abl, kar je bila pomembna ovira pri diagnosticiranju in razumevanju drugih KMPB (4). Gre predvsem za bolj pogoste KMPB, to so po klasifikaciji Svetovne zdravstvene organizcije (SZO) prava policitemija (PP), esencialne trombocitemije (ET) in kronična idiopatska mielofibroza (KIMF) (5).* Leta 2005 so na kromosomu 9 pri večini bolnikov s PP in približno polovici z ET in KIMF odkrili mutacijo V617F v genu za Janus kinazo 2 (JAK2) (6–10). Do danes te mutacije niso zaznali pri zdravih kontrolnih osebah, pri drugih mieloproliferativnih in mielodisplastičnih motnjah pa je redka (10, 11). Celice z omenjeno mutacijo so hipersenzitivne za citokine in imajo proliferativno prednost. To odkritje je že začelo spreminjati pristop k ugotavljanju in razvrščanju KMPB. Poleg tega ugotavljajo, da imajo bolniki z ET in mutacijo več značilnosti PP (pomembno zvečano koncentracijo Hb, večje število nevtrofilcev, manjše vrednosti eritropoetina in feritina) (12). Teh značilnosti bolniki brez mutacije nimajo, imajo pa večje število trombocitov kot za mutacijo pozitivni bolniki (12, 13). To kaže na možnost, da ET, pri kateri * Mieloproliferativne bolezni so po SZO še: kronična nevtrofilna levkemija, kronična eozinofilna levkemija (in idiopatski hipereozinofilni sindrom), neklasificirana kronična mieloproliferativna bolezen. VUČKOVIĆ J, PAJIČ T ET AL. KLINIČNI POMEN MUTACIJE V617F JAK2 GENA PRI KRONIČNIH MIELOPROLIFERATIVNIH BOLEZNIH 631 obstaja mutacija V617F, in PP tvorita biološki kontinu-SZO (na primer število trombocitov od 400–600, dvomum, stopnjo eritrocitoze in drugih fenotipskih zna-ljiva histologija). kov pa določajo fiziološki ali genetski modifikatorji. V skupini bolnikov z ET (35 bolnikov, 14 moških, 21 V članku predstavljamo rezultate ugotavljanja muta-žensk, mediana starost 55 let) smo želeli preveriti, ali cije V617F JAK2 pri 53 bolnikih s KMPB. Določili smo obstajajo klinične in laboratorijske razlike med skudelež bolnikov s PP, ET in KIMF z mutacijo in posku-pinama glede na dokazano prisotnost mutacije. Lašali ugotoviti nekatere laboratorijske in klinične raz-boratorijske in klinične značilnosti smo primerjali like med skupinama za mutacijo pozitivnih in nega- ob ugotovitvi bolezni retrospektivno iz medicinske tivnih bolnikov z ET. dokumentacije in jih primerjali s tistimi ob zadnjem kontrolnem pregledu. V skupini z ET smo iz celotne krvne slike v času postavitve diagnoze in ob zadnji Bolniki in metode kontroli izračunali srednje vrednosti za koncentra cijo Hb, število levkocitov in trombocitov, povprečniUgotavljali smo prisotnost mutacije V617F JAK2 pri 53 volumen eritrocitov in trombocitov (PPE in PPT) inbolnikih s KMPB (26 moških, 27 žensk, srednja starost koeficiente variacije volumna trombocitov (KVVT). 56 let). Večina bolnikov je ob diagnozi imela ET (35 Srednje vrednosti med skupinama bolnikov z ET smobolnikov), 12 jih je imelo PP in 6 bolnikov je imelo primerjali s Studentovim t-testom. Primerjavo kate- KIMF. V času spremljanja sta se 2 bolnika z ET pre-goričnih spremenljivk (prisotnost splenomegalije, zobrazila v PP, dodatna 2 pa iz PP v KIMF. Ugotavljanje boleznijo povzročenih zapletov in potrebe po antimutacije JAK2 s PCR smo izvajali od julija 2005 do mar-proliferativnih zdravilih) smo izvedli s hi-kvadratnim ca 2006 pri bolnikih, ki jih rutinsko spremljamo v he-in Fischerjevim testom. Merilo za splenomegalijo jematoloških ambulantah in oddelkih SB Celje in SB bila tipljivost vranice vsaj 1 cm pod rebrnim lokomBrežice. Mutacijo V617F smo dokazali z alelno specifičnim Razpr. 1. Značilnosti bolnikov z ET, odvisne od JAK2 V617F mutaciji. PCR na genomski Table 1. Clinical and laboratory characteristics of patients with ET in relation DNK iz periferne on JAK2 V617F mutation. krvi po objavljeni metodi (Baxter, Lan-p vrednost cet 2005) (6). Od de- JAK2 V617F poz. JAK2 V617F neg. p value cembra 2005 smo Število bolnikov 15 20 Number of patients sočasno uporabljali Moški še drugo metodo, ki Male 6 8 ns‡ temelji na restriktiv-Ženske ni razgradnji po-Female 9 12 ns množenih kopij PCR Starost (leta, mediana) 55 57 ns z encimom BsaXI in Age (year, median) jo je zasnoval In Vi-Trajanje bolezni (meseci) 35 42 ns voScribe Techno-Disease duration (months) logies (San Diego, Prisotnost Ph kromosoma 0 2 ns Ca, USA). Po naših Ph chromosome presence Splenomegalija izkušnjah je korela-Splenomegaly 6 3 ns cija med obema me-Antiproliferativno zdravljenjetodama zelo visoka Antiproliferative treatment 7 14 ns (14). Hemoglobin 1* (g/L, povprečna vrednost) 147 139 0,03Diagnozo bolnikov Haemoglobin 1* (g/L, mean value) smo postavili na Hemoglobin 2† 154 134 0,0004 osnovi meril Skupi-Haemoglobin 2† ne za policitemijo Število trombocitov 1* (× 109 /L, povprečna vrednost) Number of thrombocytes 1* (× 109 /L, mean value) 755 1074 0,0025 vero (Policythemia Število trombocitov 2† vera study group, Number of thrombocytes 2† 708 762 ns PPSG) (15). Kasneje Število levkocitov 1* (× 109 /L, povprečna vrednost) smo diagnoze revi-Number of leukocytes 1* (× 109 /L, mean value) 9,6 9,3 ns dirali v skladu z me-Število levkocitov 2† rili SZO (5). Analizo Number of leukocytes 2† 9,5 6,7 0,004 prisotnosti mutacije KVVT§ >= 17 V617F v genu JAK2 Thrombocyte volume variation coefficient 12 8 0,026 smo izvedli večino-PVEŁ 90 91 ns ma pri mlajših bolni-Mean eritrocyte volume kih in pri tistih, kjer * vrednost ob diagnozi / value at diagnosis je obstajal dvom gle-‡ † zadnja registrirana vrednost / last registered value nesignifikantno / insignificant § de izpolnjevanja dia-koeficient variacije volumna trombocitov / thrombocyte volume variation coefficient gnostičnih meril L povprečni volumen eritrocitov / mean eritrocyte volume ZDRAV VESTN 2006; 75 Sl. 1. Število trombocitov pri za mutacijo V617F JAK2 negativni ET (Pl1-) in pozitivni ET (Pl1+). Figure 1. Platelet count in V617F JAK2 mutation negative ET (Pl1-) and positive ET (Pl1+). Sl. 2. Koncentracija hemoglobina pri ET ob diagnozi (Hb1) in po obdobju spremljanja (Hb2) v odvisnosti od prisotnosti V617F JAK2 mutacije (±). Figure 2. Haemoglobin concentration in ET at diagnosis (Hb1) and   !  " # !#!# "#"      .     .     .     .     .     .     .     .     .      .      .      .      .      .      .      .      .      .      .     .      .      .     .     .     .     .     .     .     .     .      .      .      .      .      .      .      .      .      .      .     . after a period of follow-up (Hb2). in/ali longitudinalni premer vranice pri ultrazvočni preiskavi > = 12 cm. Rezultati Mutacija V617F je bila prisotna pri 12 od 12 (100 %) bolnikov s PP, pri 2 od 6 (33 %) s KIMF in pri 15 od 35 (43 %) z ET. Pri dveh bolnikih z ET smo dokazali prisotnost BCR-ABL fuzijskega gena (Ph pozitivna ET). Ko smo jih izločili, je delež bolnikov z mutacijo znašal 45 % (15 od 33). V Razpredelnici 1 predstavljamo klinične in laboratorijske značilnosti bolnikov z ET glede na prisotnost mutacije V617F. Pri razporeditvi po starosti in spolu med pozitivnimi in negativnimi bolniki ni bilo razlik. Povprečno trajanje bolezni pri pozitivnih je bilo 35 mesecev in pri negativnih 42 mesecev. Bolniki z mutacijo so ob času diagnoze imeli večje vrednosti trombocitov (Sl. 1). Skrajna trombocitoza (> 1000 × 10/9/L) je bila ugotovljena pri 10 izmed 20 bolnikov brez mutacije in le pri 2 od 15 z mutacijo. Koncentracija Hb je bila v skupini z mutacijo višja ob obeh pregledih. Statistična razlika je večja, ko med pozitivnimi in negativnimi primerjamo koncentracijo ob zadnji kontroli (Sl. 2). Pri srednji vrednosti levkocitov med obema skupinama ET bolnikov ob času diagnosticiranja ni bilo pomembnejše razlike, ugotovili pa smo jo ob kontroli. Čeprav je bila splenomegalija pogosteje prisotna pri bolnikih z mutacijo (6 od 15 proti 3 od 20), razlika ni bila statistično značilna. PVE in PVT so ob času ugotavljanja diagnoze in ob zadnji kontroli skoraj enaki pri obeh skupinah, medtem ko je KVVT večji pri pozitivni skupini. Razlike v pogostnosti z boleznijo povezanih zapletov kot tudi v potrebi po antiproliferativnih zdravilih ni. VUČKOVIĆ J, PAJIČ T ET AL. KLINIČNI POMEN MUTACIJE V617F JAK2 GENA PRI KRONIČNIH MIELOPROLIFERATIVNIH BOLEZNIH 633 Razpravljanje V našem vzorcu 53 bolnikov s KMPB smo pri 100 % s PP, 45 % Ph negativnih z ET in 33 % s KIMF odkrili mutacijo V617F JAK2. Deleži so zelo podobni že objavljenim (6–13). Čeprav je bil vzorec bolnikov z ET sorazmerno majhen, smo našli pomembne razlike pri nekaterih laboratorijskih kazalcih med bolniki, pozitivnimi in negativnimi za mutacijo. To kaže na možen obstoj dveh različnih tipov ET, kar so predlagali že nekateri drugi raziskovalci (12, 13). Naši bolniki z mutacijo V617F so imeli manjše vrednosti števila trombocitov in večje vrednosti Hb od tistih brez. Medtem ko je bila razlika v trombocitih velika že ob času diagnosticiranja, pa je bila razlika v koncentraciji Hb ob diagnosticiranju le zmerna in je postala bolj izražena kasneje. Tendenca večanja koncentracije Hb pri skupini z mutacijo kaže na podobnost z bolniki s PP in odpira možnost, da gre za zgodnjo fazo PP. Na mehanizem preobrazbe bi lahko vplivali biološki in genet- ski modifikatorji. Homozigotnost za mutacijo V617F bi lahko govorila v prid policitemičnemu tipu, saj jo najdemo pri približno 30 % bolnikov s PP, je pa redka pri bolnikih z ET (6). Razlike v številu levkocitov ob diagnozi, ki jih opisujejo drugi avtorji, nam ni uspelo potrditi verjetno zaradi manjšega vzorca. Razlika, ki se je pojavila v kontrolnem vzorcu, pa ni zanesljiva, ker ni izključen vpliv antiproliferativnega zdravljenja. Podskupina pozitivnih ET ima torej molekularni označevalec, ki zanesljivo kaže na klonski izvor in take primere loči od možnih reaktivnih stanj. Razlike v ostalih parametrih, ki jih opisujejo drugi avtorji, pri nas doslej nismo ugotovili. V do sedaj največji raziskavi so Campbell in sodelavci analizirali klinične in laboratorijske parametre 776 bolnikov z ET (414 pozitivnih in 362 negativnih za mutacijo V617F) in odkrili velike razlike v celotni krvni sliki ter histoloških značilnostih kostnega mozga med obema skupinama (12). Že ob diagnosticiranju so imeli pozitivni bolniki pomembno zvečano koncentaracijo Hb, število levkocitov, celičnost kostnega mozga in zmanjšano število trombocitov, zmanjšano koncentracijo eritropoetina in feritina. Poleg tega so odkrili, da so pozitivni bolniki bolj občutljivi na zdravljenje s hidroksiureo in so potrebovali manjše odmerke. Pri retikulinskem gradusu in morfologiji megakariocitov ni bilo razlik med obema skupinama. Med spremljanjem so bolniki z mutacijo pogosteje preobrazili v PP (12). Povečane incidence venske tromboze pri bolnikih, pozitivnih na JAK2, o kateri poročajo Campbell in sodelavci, drugim raziskovalcem ni uspelo potrditi (13). Skupna incidenca splenomegalije pri ET je v različnih poročilih precej različna (od 3–4 % pa do 35 %), nikomur pa ni uspelo incidence povezati s prisotnostjo mutacije V617F (12, 13). Prav tako prisotnost mutacije ni neodvisni napovednik slabšega preživetja (13). Vsa ta spoznanja so pripeljala do zaključka, da mutacija V617F JAK2 nedvomno razdeli ET v dva podtipa, od katerih za mutacijo pozitivni kaže fenotipsko podobnost PP in da s PP tvori biološki kontinuum, pri katerem je stopnja eritrocitoze verjetno odvisna od fizioloških in genetskih modifikatorjev. Naši rezultati, čeprav na manjšem vzorcu, to potrjujejo. Problematika pri ET negativnih za mutacijo, je nekoliko drugačna. Še vedno pogrešamo molekularni označevalec in razlikovanje od reaktivnih stanj je lahko včasih težavno. Kljub temu bolniki iz te skupine kažejo mnoge klinične in laboratorijske značilnosti mieloproliferativnih motenj. Morfološka analiza megakariocitov, ki je še vedno odločilna pri razlikovanju ET od reaktivne trombocitoze, ni pokazala razlike v morfologiji megakariocitov med ET, pozitivnimi in negativnimi za mutacijo. Campbell in sodelavci niso zaznali pomembnih razlik v deležu razvejanih in oblakastih megakariocitov pri obeh skupinah (12). Prav tako niti mi nismo našli razlike v deležu hiperploidnih megakariocitov s ploidnostjo > 96n (neobjavljeni rezultati). Megakariocitna hiperploidija je po drugi strani po naših izkušnjah pomemben parameter pri ločevanju ET od reaktivnih stanj (16). Zaključki Pridružujemo se mnenju, da ugotavljanje mutacije V617F JAK2 izjemno dobro napoveduje klonalnost bolezni, čeprav klinična uporabnost še ni povsem opredeljena. Zdaj je to prvi označevalec za ločevanje reaktivnih motenj krvne slike od nekaterih KMPB. Pomagala nam je, da je bila bolezen odkrita v nekaterih mejnih primerih, ki se niso popolnoma ujemali z diagnostičnimi merili SZO. Pri naših bolnikih s KMPB smo našli podobne deleže mutacije V617F JAK2 kot jih navajajo prvi članki iz svetovne literature. Ugotovili smo laboratorijske razlike med ET z mutacijo in ET brez mutacije za JAK2-V617F. Prisotnost mutacije V617F JAK2 pri ET veča možnost preobrazbe bolezni v PP. Literatura 1. Spivak JL, Barosi G, Tognoni G, Barbui T, Finazzi G, Marchioli R, et al. Chronic myeloproliferative disorders. In: Broudy VC, Prchal JT, Tricot GJ, eds. Hematology 2003 Education Program Book. San Diego, CA: American Society of Hematology; 2003. p. 200–24. 2. Krause DS, Van Etten RA. Tyrosine kinase as targets for cancer therapy. N Engl J Med 2005; 353: 172–87. 3. Deininger MW, Goldman JM, Melo JV. The molecular biology of chronic myeloid leukemia. Blood 2000; 96: 3343–56. 4. Green AR, Vassiliou GS, Curtin N, Campbell PJ. Management of the myeloproliferative disorders; distinguishing data from dogma. Hematol J 2004; 5 Suppl 3: 126–32. 5. Thiele J, Kvasnicka HM. Chronic myeloproliferative disorders. The new WHO classification. Pathologie 2001; 6: 429–43. 6. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, et al. Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 2005; 365: 1054–61. 7. James C, Ugo V, Le Couedic JP, Staerk J, Delhommeau F, Lacout C, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature 2005; 434: 1144–8. 8. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, Ebert BL, Wernig G, Huntly BJ, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell 2005; 7: 387–97. 9. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, Soon-Siong T, Tiedt R, Passweg JR, et al. A gain-of-function mutation of JAK2 in myeloproliferative disorders. N Engl J Med 2005; 352: 1779–90. 10. Jones AV, Kreil S, Zoi K, Waghorn K, Curtis C, Zhang L, et al. Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Blood 2005; 106(6): 2162–8. ZDRAV VESTN 2006; 75 11. Steensma DP, Dewald GW, Lasho TL, Powell HL, McClure RF, Levine RL, et al. The JAK2 V617F activating tyrosine kinase mutation is an infrequent event in both »atypical« myeloproliferative disorders and myelodysplastic syndromes. Blood 2005; 106(4): 1207–9. 12. Campbell PJ, Scott LM, Buck G, Wheatley K, East CL, Marsden JT, et al. Definition of subtypes of essential thrombocythemia and relatio to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status. Lancet 2005; 366: 1945–53. 13. Wolanskyj AP, Lasho TL, Schwager SM, McClure RF, Wadleigh M, Lee SJ, et al. JAK2 V617F mutation in essential thrombocythemia: clinical association and long-term prognostic relevance. Br J Haematol 2005; 131: 208–13. 14. Pajič T, Vučković J, Gorišek L, Černelč P, Mlakar U. Comparison of the results for the JAK2 V617F mutation detection by two methods; allele specific PCR and restriction digestion assay on polycythemia vera and essential thrombocythemia DNA samples. In: Abstract Book 11th Congress of the European Hematology Association; 2006 June 15-18; Amsterdam, the Netherlands. Haematologica/The Hematology journal; vol. 91; Suppl 1: 404, 2006. 15. Murphy S. Diagnostic criteria and prognosis in polycythemia vera and essential thrombocythemia. Semin Hematol 1999; 36: 9–13. 16. Vučković J, Pavlič R, Grat M, Žuran I, Krive CŠ. Image DNA analysis of bone marrow megakaryocytes in differential diagnosis of thrombocytosis. Zdrav Vestn 2004; 73 Suppl 1: 23–5.