96
Zdrav Var 2007; 46: 96-102
METODA ZA DOLO^ANJE VPLIVOV NANODELCEV (TiO2) NA CELICE IN TKIVA V STRUPENOSTNEM TESTU IN VIVO
ASSESSING THE EFFECTS OF NANOPARTICLES (TiO2) ON CELLS AND TISSUES BY THE IN VIVO TOXICITY TEST
Damjana Drobne1, @iva Pipan1, Vladka Le{er1, Janez Valant1, Nina Gunde-Cimerman1,
Maja Rem{kar2
Prispelo: 2. 4. 2007 – Sprejeto: 20. 6. 2007
Izvirni znanstveni ~lanek UDK 539.2
Izvle~ek
Vsaka nova tehnologija prina{a mnoga tveganja. Z nara{~anjem prisotnosti nanomaterialov v komercialnih proizvodih je nujno potrebno ovrednotiti ceno okolja in negativnih vplivov na organizme, pa~ glede na prednosti, ki jih prina{ajo nanomateriali. Informacije o varnosti in mo‘nem tveganju zaradi prisotnosti nanodelcev so nujno potrebne. Do danes je bilo narejenih le malo toksikolo{kih {tudij glede vpliva nanomaterialov. Proizvodnja, kjer so prisotni tudi nanomateriali, se razvija brez regulative na podro~ju varnosti.
V na{i raziskavi smo uporabili ‘e obstoje~i test za kovine in pesticide s kopenskimi raki enakono‘ci Porcellio scaber (Isopoda, Crustacea), ki smo ga priredili za nanodelce. Kopenski raki so primerni testni organizmi, saj lahko analiziramo bioozna~evalce na razli~nih ravneh. Rod Porcellio je prilagojen na kopensko ‘ivljenje in ‘ivi tudi v Sloveniji. Hrani se predvsem z odmrlim listjem, lubjem in lesom. V tej {tudiji smo analizirali le en bioozna~evalec, ki je povezan z integriteto celi~ne membrane. Uporabili smo uveljavljeni test z dvojnim fluorescentnim barvanjem (barvanje z akridin oran‘nim (N,N,N’,N’-tetrametilakridin-3,6-diamin) in etidijevim bromidom (3,8-diamino-5-etil-6-fenilfenantridinijev bromid)). Zna~ilnosti testiranih nanodelcev smo dolo~ali z visokolo~ljivostnim presevnim elektronskim mikroskopom (TEM). Ugotavljali smo u~inke nanodelcev s pomo~jo prehranjevalnega testa in ugotovili, da nanodelci vplivajo na integriteto membrane. Iz tega lahko sklepamo, da so tovrstni testi primerni tudi kot izhodi{~e za testiranje u~inkov nanodelcev za nadaljnje raziskave. Nova spoznanja na podro~ju medsebojnega vplivanja med nanodelci in biolo{kimi sistemi bodo pokazala, kak{ni naj bodo u~inkoviti testi strupenosti za nanodelce.
Klju~ne besede: titanov dioksid, nanodelci, bioozna~evalci, mikroskopija
Original scientific article UDC 539.2
Abstract
Ever y new technology poses new risks. With the increasing presence of nanomaterials in commercial products, a growing debate is emerging on whether the environmental and social costs of nanotechnology outweigh its many benefits. Information about the safety and potential hazards of nano-sized particles is urgently needed. To date, only a few studies have investigated the toxicological effects of nanomaterials, and no clear guidelines exist on how to quantify these effects. This study was undertaken to investigate nanoparticles using the test with the terrestrial isopod Porcellio scaber (Isopoda, Crustacea) devised for soluble chemicals. Terrestrial isopods have been recognised as suitable organisms for (eco) toxicity studies. Porcellio scaber is well adapted to terrestrial life and lives also in Slovenija. Toxicity tests with terrestrial isopods are generally used to assess biomarkers at
1Univerza v Ljubljani, Biotehni{ka fakulteta, Ve~na pot 111, 1000 Ljubljana 2In{titut Jo‘ef  Stefan, Jamova 39,1000 Ljubljana Kontaktni naslov: e-po{ta: ziva.pipan@bf.uni-lj.si
Drobne  D. et al. Metoda za dolo~anje vplivov nanodelcev (TiO2) na celice in tkiva vstrupenostnem testu in vivo
97
various levels of biological organisation. In the present study we analysed only one biomarker related to the integrity of the plasma membrane. We used fluorescent staining witn acridine orange/ethidium bromide. Conventional trans-mission electron microscopy (TEM) was used to characterise the nanoparticles tested. We determined the effect of TiOs nanoparticles when consumed with food. The results shovved that nanoparticles affected the integrity of plasma membrane. Conventional toxicity studies have thus proved to be a good starting point for assessing the effects of nanoparticles. Further studies of interaction betvveen nanoparticles and biological systems will be needed to de-velop new and more suitable methods for toxicity testing.
Key words: titanium dioxide, nanoparticles, biomarkers, microscopy
Uvod
Proizvedeni nanodelci imajo edinstvene električne, termalne in mehanske lastnosti, ki jih koristno uporabljamo v komercialne, medicinske in okoljske namene (1). Lastnosti nanodelcev se bistveno razlikujejo od lastnosti večjih delcev. Teoretično je mogoče nanodelce izdelati iz skoraj vseh kemikalij, večina trenutno narejenih nanodelcev pa je iz prehodnih elementov, silicija, ogljika (nanocevke, fulereni) in kovinskih oksidov (cinkov oksid, titanov oksid). Ob proizvodnji nastajajo tudi različni nanodelci, ki so proizvedeni nenamensko: stranski produkt pri industrijski proizvodnji (mletje, varjenje, brušenje, gradbeništvo, tehnologije pršil), izgorevanje biomase in fosilnih goriv ter izpuh iz motorjev z notranjim izgorevanjem, še posebej dieselskih motorji. Različni nanodelci nastajajo tudi v naravi ob eroziji, izbruhu vulkanov in požarih (delci prsti, prah, pepel, katran). Najdemo jih tudi v živih organizmih vse od nastanka življenja (biogen magnetit, feritin in drugi). Naravni in tehnološko proizvedeni nanodelci se bistveno razlikujejo. Naravni so zelo razpršeni, kemijsko kompleksni in so v tekočini ali zraku, sintetizirani so manj razpršeni, imajo natančno določene lastnosti in so večinoma trdni (2).
Danes se nanodelci uporabljajo v številnih proizvodih, kot so kozmetika, hrana, pralna sredstva, zdravila, tekstil, zaščitne odbojne prevleke idr. Zaradi širitve nanotehnologije se bistveno povečuje izpostavljenost ljudi v poklicnem in življenjskem okolju, povečalo pa se je že tudi obremenjevanje okolja. Trenutno informacij o tveganju za človeka in okolje zaradi izpostavitve nanodelcem skoraj ni. V zadnjem času se vse bolj pogosto vprašujejo o potencialni nevarnosti nanodelcev za človeka in okolje in to raziskujejo. Različne študije so pokazale, da prehajajo nanomateriali v telo po različnih poteh: preko dihal, prebavil in kože (3). Delci, veliki 70 nm, prodrejo v pljučne mešičke,
velikosti 50 nm prodrejo v celice, veliki 30 nm prodrejo v celično jedro, ni pa podatkov o potovanju delcev, ki so manjši kot 20 nm. Še vedno ne vemo natančno kam delci v organizmu gredo in kako se razporejajo v tkivih in celicah. Prav tako ne vemo, kako s svojo prisotnostjo vplivajo na delovanje celic, organov in celotnega organizma.
Titanov dioksid je uporaben predvsem kot beli pigment (za beljenje) in zaščita učinkovin pred svetlobo. Vse pogosteje ga uporabljajo v kozmetiki, kot so sončne kreme, pudri, senčila, v tekstilni industriji, farmaciji in drugod (zaščitne odbojne prevleke, razne barve in zaščitna premazna sredstva) (2).
Opredelitev problema
Povečanje razmerja med površino in volumnom delca povzroči povečanje površinske energije delca in s tem večjo biološko aktivnost. Interakcije nanodelcev s tekočinami, celicami in tkivi so najverjetneje drugačne od interakcij z večjimi delci iste kemijske zgradbe. Kvarni učinki nanodelcev najbrž nastanejo na različne načine. Strupenost nanodelcev je verjetno povezana s fizikalno-kemijskimi lastnostmi, kot so velikost delca, oblika, aglomeracija, kristalna struktura, kemijska zgradba, velikost površine, kemijske lastnosti površine, naboj na površini in poroznost. Številna vprašanja o učinkih nanodelcev na organizme, ki so domnevno bistveno drugačni od učinkov velikih delcev, so spodbudila nastanek nove veje toksikologije -nanotoksikologijo (4).
Zaradi slabega poznavanja in razumevanja interakcij med nanodelci in proizvodi nanotehnologij se proizvodnja nanodelcev in nanomaterialov razvija povsem brez predpisov na področju varnosti za človeka in okolje.
V tem trenutku nujno potrebujemo enostavne in zanesljive metode preizkušanja, ki bodo omogočile hitro
98
Zdrav Var 2007; 46
in zanesljivo dolo~anje interakcij med celico, tkivi in organizmom ter proizvodi nanotehnologij. Najverjetneje je smiselno, da se najprej ugotovi, ali so obstoje~i testi strupenosti za druge kemikalije primerni tudi za nanodelce in nanomateriale.
Namen raziskave
Namen raziskave je bil ugotoviti, ali povzro~ijo nanodelci TiO2 po{kodbe in spremembe plazmaleme ‘leznih celic. Zato smo kot odziv v testu strupenosti analizirali ravno integriteto plazmaleme. V in vivo testu s kopenskimi raki smo testne organizme hranili s hrano, ki smo ji dodali nanodelce titanovega dioksida (TiO2). Za ta namen smo uporabili uveljavljeni test z dvojnim fluorescentnim barvanjem (barvanje z akridin oran‘nim in etidijevim bromidom), ki se pogosto uporablja za oceno stanja celic (5). Zna~ilnost testiranih nanodelcev smo dolo~ali z visokolo~ljivostnim presevnim elektronskim mikroskopom (200kV, Jeol 2010F, TEM).
Materiali in metode
V na{i {tudiji smo uporabili dobro poznan test strupenosti s kopenskimi raki enakono‘ci vrste Porcellio scaber (Isopoda, Crustacea) (Slika 1). Kopenski raki enakono‘ci so se izkazali kot ustrezen organizem v
(eko)toksikolo{kih {tudijah (6). V testu strupenosti z raki enakono‘ci lahko analiziramo bioozna~evalce na razli~nih ravneh biolo{ke organizacije. V na{i {tudiji predstavljamo analize le enega bioozna~evalca. Kot biolo{ki kazalec delovanja nanodelcev (bioozna~evalec) smo analizirali integriteto celi~ne membrane s fluorescentnim barvanjem akridin oran‘ in etidijev bromid. Metoda temelji na razli~nosti integritete membrane. Akridin oran‘ prehaja preko nepo{kodovane in tudi preko po{kodovane plazmaleme. Barvilo, ki se ve‘e na dvojno vija~nico DNK, vidimo kot fluorescentno zeleno, ob vezavi na enojno RNK pa kot fluorescentno rde~e. Etidijev bromid prehaja le preko celic s po{kodovano membrano, po vezavi na DNK ga vidimo kot fluorescentno rde~e (McGahon, 1995). Nepo{kodovane in apoptoti~ne celice imajo zeleno jedro (ni tako izrazito vidno, ker je ‘e sama ‘leza pod fluorescenco zelene barve), celice s po{kodovano membrano (nekroti~ne) pa imajo jedro obarvano rde~e do oran‘no.
Za testiranje strupenosti smo uporabili titanove (TiO2, Sigma-Aldrich) nanodelce velikosti 15 nm. Naredili smo suspenzije nanodelcev v vodi in z njo namazali spodnjo stran posu{enih listov leske (Corylus avellana). Poskusni pogoji so prikazani na Sliki 2. S tako pripravljenimi listi leske smo ‘ivali hranili 14 dni. Med poskusom smo analizirali tudi druge parametre, npr. te‘o ‘ivali, koli~ino zau‘ite hrane, koli~ino iztrebkov
Slika 1.   Prikaz poskusnih pogojev. Petrijevke s ~istimi (neonesna‘enimi) listi (kontrola) in listi, na katerih je
bil nanos nanodelcev 100 µg/g TiO2, v katerih so bile ‘ivali 14 dni. Figure 1. Testing conditions. Petri dishes containing clean leaves (controls) and petris containing leaves
covered with TiO2 nanoparticles (100 µg/g), in which animals were kept for 14 days.
Drobne  D. et al. Metoda za dolo~anje vplivov nanodelcev (TiO2) na celice in tkiva vstrupenostnem testu in vivo
99
Slika 2.    Shematski prikaz raka enakono‘ca Porcellio scaber (velikost ‘ivali 1 cm). Figure 2. Schematic of Porcellio scaber (1 cm in size).
(7). Kontrolne ‘ivali so bile prav tako 14 dni v petrijevkah, le da so imele samo liste leske brez suspenzije nanodelcev. Po koncu poskusa smo prebavne ‘leze nekaj ‘ivali testirali z metodo barvanje z akridin oran‘nim in etidijevim bromidom, ‘leze drugih ‘ivali pa pripravili po standardnem postopku za pripravo vzorcev za elektronsko mikroskopijo (fiksiranje po fiksativu modificirani Karnovsky: 1 % glutaraldehid, 0,4 % formadlehid, 0,1M kakodilatni pufer, sekundarna fiksacija z osmijevim tetroksidom, dehidracija in vklaplanje v smolo Agar100) in pregledali s presevnim elektronskim mikroskopom (Philips CM 100).
Rezultati
Preskus akridin oran‘ in etidijev bromid
Z barvanjem akridin oran‘ in etidijevim bromidom smo ugotovili razlike med skupino ‘ivali, hranjeno s TiO2 in kontrolno skupino. [tirinajstdnevno hranjenje rakov enakono‘cev s hrano, ki vsebuje 100 µg/g TiO2, ko ‘ivali pojedo 5 µg TiO2 / g sve‘e telesne te‘e / dan (Slika 2), vpliva na integriteto celi~ne membrane. S poskusom z akridin oran‘nim in etidijevim bromidom smo ugotovili, da se spremeni integriteta celi~ne mem-
brane v celicah prebavnih ‘lez, ~e so ‘ivali jedle TiO2. Na sliki 3a so jedra obarvano zeleno, podobno kot ‘leza, kar nakazuje, da po{kodb ni bilo. Na sliki 3b pa so zaradi destabilizirane membrane vidna rde~e do oran‘no obarvana jedra (Slika 3a, b).
Opazovanje nanodelcev
Presevna elektronska mikroskopija (TEM) se je zaradi visokih pove~av in lo~ljivosti tudi v na{i {tudiji izkazala kot primerna za opazovanje velikosti in oblike nanodelcev, s katerimi smo ‘ivali hranili (Slika 4).
Razprava
In vivo strupenostni test s kopenskim rakom enakono‘cem vrste Porcellio scaber se je izkazal primeren za analiziranje u~inka 15 nm velikih nanodelcev TiO2, ~e je bil ta dodan hrani. Test je primeren, ker nam da razli~ne tipe toksikolo{kih podatkov na razli~nih ravneh biolo{ke organizacije. To pomeni, da hkrati spremljamo spremembe na celicah, tkivu in celotnem organizmu. Dolo~imo koncentracije, ki imajo u~inek za dolo~en del populacije (ECx),in koncentracije, ki nimajo opaznega u~inka (NOEC). Ti
100
Zdrav Var 2007; 46
Slika 3 a, b. Prebavna ‘leza raka enakono‘ca Porcellio scaber. Zgornja slika: @leza kontolne ‘ivali. Z AO/EB barvanjem se jedra kontrolne ‘ivali niso obarvala. Spodnja slika: @leza ‘ivali, hranjene z nanodelci TiO2. Obarvana jedra z metodo AO/EB se vidijo kot enekomerno velike svetle pike. (pove~ava 400x, svetlobni mikroskop, Axio imager, Zeiss).
Figures 3 a and b. Digestive gland of Porcellio scaber. The upper figure shows the gland of the control animal : nuclei remained unstained. The lower figure shows the gland of the animal fed with TiO2 nanoparticles. The AO/EB stained nuclei appear as bright points, equal in size (magnification x400, light microscope, Axio imager, Zeiss).
Drobne  D. et al. Metoda za dolo~anje vplivov nanodelcev (TiO2) na celice in tkiva vstrupenostnem testu in vivo
101
Slika 4. Presevna elektronska mikrografija nanodelcev TiO2 povpre~ne velikosti 15 nm (merilo 40 nm in 10 nm), (200 keV, Jeol 2010 F, presevni elektronski mikroskop na poljsko emisijo).
Figure 4. Transmission electron micrography of 15-nm TiO2 nanoparticles (scale 40 nm and 10 nm) (200 keV, Jeol 2010 F, field-emission transmission electron microscope).
podatki so klju~nega pomena pri oceni potencialne nevarnosti razli~nih ksenobiotikov. Dobljeni rezultati predstavljajo izhodi{~e za oblikovanje testnega postopka za razli~ne nanodelce. Podatkov o dovoljenih/mejnih koncentracijah nanodelcev ni, zato so v tej fazi primerne primerjalne {tudije stupenosti nanodelcev in drugih kemikalij. Na ta na~in je mogo~e umestiti potencialne u~inke nanodelcev. Kopenski raki enakono‘ci so primeren organizem za tovrstne primerjalne {tudije iz ve~ razlogov. Eden pomembnej{ih je ta, da ‘e obstaja
veliko toksikolo{kih podatkov za druge kemikalije (kovine, pesticide), s katerimi je mogo~e primerjati rezulate testov strupenosti nanodelcev in nanomaterialov in tako umestititi njihove potencialne kvarne u~inke na seznam z drugimi nevarnimi kemikalijami. Pri nanodelcih in nanomaterialih pa {e vedno ostaja odprto vpra{anje, kako ugotoviti njihove zna~ilnosti, ki so povezane z u~inkom. Pri drugih kemikalijah je to brez dvoma koncentracija. Pri nanodelcih in nanomaterialih pa je med pomembnej{imi velikost.
102
Zdrav Var 2007; 46
Ob testiranju nanodelcev TiO2 so ugotovili, da se z vi{anjem koncentracije zni‘a rast bakterij E. coli in B. subtilis. Koncentracija nanodelcev 5000 ppm je zmanj{ala rast E. coli za 72 %. B. subtilis je bil bolj ob~utljiv, saj se je rast ‘e pri koncentraciji 1000 ppm zman{ala za 75 %, pri 2000 ppm pa za 99 % (10). Nanodelce TiO2 so dodali tudi vodi, v kateri je bila populacija Daphnie magne. LC50, kjer je bila smrtnost 50 %, je bila dose‘ena pri koncentraciji 5,5 ppm pri filtriranih nandelcih. Ob soniciranju delcev je bila najvi{ja smrtnost pri koncentraciji 350 ppm (8). Na podlagi na{ih rezultatov in podatkov iz literature zaklju~ujemo, da so tradicionalne toksikolo{ke {tudijske metode dobro izhodi{~e za testiranje u~inkov nanodelcev. Toda zaradi njihovih edinstvenih lastnosti bodo potrebne nove metode za dolo~anje mehanizmov delovanja in kvarnih u~inkov (9).
Perspektive
Zaradi za{~ite okolja in za{~ite ~loveka pred nanodelci je potrebno razviti razli~ne tipe zanesljivih testov strupenosti. Poleg in vitro {tudij, ki pomagajo razvozlati osnovne mehanizme delovanja nanodelcev, pa so nujno potrebne tudi in vivo toksikolo{ke {tudije na modelnih organizmih iz razli~nih okolij (vodno in kopensko), in na organizmih, ki sprejemajo nanodelce na razli~ne na~ine (z vodo, hrano, dihanjem itd.) in na organizmih, ki so predstavniki razli~nih prehranjevalnih ravni (2).
Za izhodi{~e pri tovrstnih {tudijah je smiselno izbrati ‘e uveljavljene teste strupenosti za vodotope kemikalije. [ele nadaljnje raziskave in nova spoznanja
na podro~ju interakcij med nanodelci in biolo{kimi sistemi bodo pokazala, kak{ni naj bodo u~inkoviti testi strupenosti za nanodelce.
Literatura
1.    Dreher KL. Health and environmental impact of nanotechnology: Toxicological assessment of manufactured nanoparticles. Toxicol Sci 2004; 77(1): 3-5.
2.    Oberdorster G, Oberdorster E, Oberdorster J. Nanotoxicology. An emerging discipline evolving from studies of ultrafine par-ticles. Environ Health Perspect 2005; 113 (7): 823-39.
3.    Kreyling WG, Semmler M, Erbe F, Mayer P. et al. Translocation of ultrafine insoluble iridium particles from lung epithelium to extrapulmonary organs is size depent but ven/ low. J Toxicol Environ Health A 2002; 65(20): 1513-30.
4.    Donaldson K, Stone V, Tran CL, Kreyling W, Born PJA. Nanotoxicology Occup Environ Med 2004; 61(9): 727-8.
5.    Leite M, Quinta-Costa M, Leite PS, Guimaraes JE. Critical evaluation of techniques to detect and measure celi death -study in a model of UV radiation of the leukaemic celi line HL60. Anal Celi Pathol 1999; 19(3-4): 139-51.
6.    Drobne D. Terrestrial isopods - A good choice for toxicity test-ing of pollutants in the terrestrial environment. Environ Toxicol Chem 1997; 16(6): 1159-64.
7.    Drobne D, Hopkin SR The toxicity of zine to terrestrial isopods in a standard laboratory test. Ecotoxicol Environ Saf 1995; 31(1): 1-6.
8.    Lovern SB, Klaper R. Daphnia magna mortality when exposed to titanium dioxide and fullerene (C60) nanoparticles. Environ Toxicol Chem 2006; 25(4): 1132-37.
9.    Nel A, Xia T, Madler L, Li N. Toxic potential of materials at the nanolevel Science 2006; 311(5761): 622-7.
10.  Admas LK, Lyon DY, Alvarez PJJ. Comparative eco-toxicity of nanoscale Ti02, Si02 and ZnO vvater susupension). VVater Res 2006; 40(19): 3527-32.