Barbara Šoba Šparl1 Mikrobiološka diagnostika okužb s paraziti pri popotnikih Microbiological Diagnosis of Parasitic Infections in Travelers IZVLEČEK KLJUČNE BESEDE: paraziti, mikrobiološka diagnostika, popotniki, neposredne metode, posredne metode Popotniki, ki po vrnitvi iz držav tropskega pasu in držav v razvoju poiščejo medicinsko pomoč, so pogosto okuženi s paraziti. Napredek v laboratorijskih tehnikah v zadnjih nekaj desetletjih je močno prispeval k izboljšanju in deloma tudi predrugačenju diagnostike parazitskih bolezni. Uporaba hitrih antigenskih testov tako omogoča zanesljivo diagno- stiko malarije tudi na endemičnih področjih, kjer pogosto ni dostopa do elektrike, labo- ratorijske opreme in ustrezno izobraženega laboratorijskega osebja, molekularne metode pa zagotavljajo občutljivo in specifično zaznavo parazitskih nukleinskih kislin, sočasno pa tudi virusnih, bakterijskih in glivnih povzročiteljev okužb. Žal se je zaradi prednosti, ki jih ponujajo sodobnejši diagnostični testi, začelo izgubljati znanje o morfologiji para- zitov, kar lahko vodi v napačno diagnozo in posledično negativno vpliva na oskrbo bolni- kov in javno zdravje. Nove diagnostične metode niso na voljo za vse parazitske povzročitelje okužb in morda niso primerne za vse kužnine, zato je zelo pomembo, da tudi nova gene- racija parazitologov pridobi in neguje znanje o morfoloških značilnostih parazitov. Zgolj kombinacija klasičnih in sodobnih parazitoloških tehnik zagotovi optimalno diagnosti- ko parazitskih okužb. ABSTRACT KEY WORDS: parasites, microbiological diagnosis, travelers, direct methods, indirect methods Travelers who seek medical attention after returning from the tropics and developing countries are often infected with parasites. Advances in laboratory techniques in recent decades have contributed significantly to improving and, to some extent, modifying the diagnosis of parasitic diseases. The use of rapid antigen tests allows reliable diagnosis of malaria even in endemic areas, where there is often no access to electricity, no labo- ratory equipment, and no appropriately trained laboratory personnel, while molecular methods ensure sensitive and specific detection of parasitic nucleic acids, which can be detected simultaneously with viral, bacterial, and fungal pathogens. Unfortunately, due to the advantages of modern diagnostic tests, knowledge of parasite morphology has gra- dually been lost, which can lead to misdiagnosis and consequently has a negative impact on patient care and public health. New diagnostic methods are not available for all 1 Doc. znan. sod. dr. Barbara Šoba Šparl, univ. dipl. mikrobiol., Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Zaloška cesta 4, 1000 Ljubljana; barbara.soba@mf.uni-lj.si 125Med Razgl. 2023; 62 Suppl 2: 125–34 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 125 Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo (LAB PRZ IMI) Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani. ODVZEM IN PRENOS VZORCEV Uspešna laboratorijska diagnostika para- zitskih povzročiteljev okužb se začne z ustreznim odvzemom kliničnih vzorcev in njihovim prenosom v laboratorij. Če vzorec ni pravilno odvzet in prenešen, ni zagotovljeno, da bomo prisotno okužbo potrdili. Pri tem je izredno pomembna komunikacija med naročnikom preiskave in diagnostičnim laboratorijem. Še posebej je to pomembno za tiste preiskave, pri katerih odvzem, prenos in diagnostični postopki niso običajni in je zato nujno, da je naroč- nik obveščen o pravilnem odvzemu in pre- nosu kužnine, laboratorij pa na naročeno preiskavo pripravljen (npr. priprava ustrez- nih gojišč). Za usmeritev laboratorijske diagnostike v parazitološkem laboratoriju so poleg zahtevane preiskave in osnovnih podatkov o kužnini (vrsta kužnine, datum in čas odvzema) ter bolniku pomembni tudi podatki o bolnikovih kliničnih znakih in simptomih, morebitnih zdravilih, dom- nevni diagnozi, njegovem imunskem sta- nju in o zgodovini njegovih potovanj ter bivanj (4). Kužnino odvzamemo v natančno ozna- čeno čisto embalažo z zamaškom, ki dobro tesni, da vsebina ne izteče oz. se ne izsuši. Z vsako kužnino delamo previdno, saj je prav vsaka lahko vir okužbe, večina kužnin pa je tudi neponovljivih (npr. pri kirurških posegih ali pa je njihov pomen drugačen ob različnih časih odvzema) (5, 6). 126 Barbara Šoba Šparl Mikrobiološka diagnostika okužb s paraziti pri popotnikih UVOD Parazitske okužbe so pomemben vzrok obolevnosti pri popotnikih. Do 30 % popot- nikov, ki po vrnitvi iz držav tropskega pasu in držav v razvoju poiščejo medicinsko pomoč, je diagnosticiranih z okužbo s pra- živalmi, helminti ali členonožci (1, 2). Zaradi izredne vrstne raznolikosti parazi- tov in njihovih zapletenih življenjskih kro- gov ter zemljepisnih posebnosti lahko diagnostika parazitskih okužb v neende- mičnih področjih, kamor se ljudje vrnejo s potovanj, predstavlja precejšen izziv. Nekatere parazitske okužbe se lahko klini- čno izrazijo šele mesece po vrnitvi, tako da je simptome in znake okužbe včasih težko povezati z okužbo na potovanju. Za ustrez- no obvladovanje parazitskih okužb je pomembno poznavanje življenjskih kro- gov parazitov, ustrezen odvzem in prenos vzorcev, ustrezna diagnostika, poznavanje odpornosti na zdravila in upoštevanje dej- stva, da je klinična slika parazitskih okužb pri imunsko naivnih popotnikih lahko dru- gačna kot pri prebivalcih endemičnih podro- čij (3). V mikrobiološki diagnostiki parazit- skih okužb uporabljamo tako neposredne kot posredne diagnostične metode. V nada- ljevanju prispevka jih bomo opisali in navedli njihove prednosti ter pomanjklji- vosti. Opredelili bomo vzorce, primerne za parazitološko preiskavo, in predstavili nji- hov pravilen odvzem ter prenos v mikro- biološki laboratorij. V tabeli 1 so predstav- ljeni pogosti povzročitelji parazitskih okužb pri popotnikih, primerni diagnostični vzor- ci in diagnostične metode, ki jih uporab- ljamo v Laboratoriju za parazitologijo parasitic pathogens and may not be suitable for all diagnostic specimens. Therefore, it is very important that the new generation of parasitologists acquires and maintains know- ledge of the morphological characteristics of parasites. Only the combination of classi- cal and modern parasitological techniques ensures an optimal diagnosis of parasitic infections. 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 126 127Med Razgl. 2023; 62 Suppl 2: NEPOSREDNE DIAGNOSTIČNE METODE Med neposredne diagnostične metode sodi- jo pregled kužnin in ugotavljanje prisotnosti parazitov s svetlobnim mikroskopom, kar še vedno ostaja temelj parazitološke dia- gnostike, dokazovanje prisotnosti parazit- skih antigenov z antigenskimi testi in molekularne metode za dokazovanje para- zitskih nukleinskih kislin. V nekaterih pri- merih lahko parazite v kužnini opazujemo in prepoznamo že s prostim očesom ali s povečevalnim steklom (4, 7, 8). Z mikroskopskim pregledom nativnih preparatov kužnine ali preparatov kužnine, obarvanih z različnimi barvili, lahko naj- demo vegetativne oblike praživali, njihove ciste ali oociste, odrasle helminte, njihova jajčeca ali ličinke ter različne razvojne obli- ke členonožcev (5, 7). Prednost mikroskopskega pregleda nativnih preparatov kužnine ali pregleda preparata z dodatkom Lugolove raztopine joda, ki jo v parazitološkem laboratoriju uporabljamo pri pregledu blata, je predvsem v tem, da na ta način v kužnini opazimo sko- raj vse prisotne parazite. Govorimo o t. i. catch-all diagnostični metodi. Mikroskopski pregled lahko izvede le zelo izkušeno in usposobljeno laboratorijsko osebje. Slabost mikroskopskega pregleda je nekoliko slab- ša občutljivost, ki jo lahko do neke mere izboljšamo s pregledom več kužnin istega bolnika, s postopki koncentriranja morebi- tnih parazitov v kužnini, s trajnim barva- njem razmazov kužnine ali materiala, ki ga dobimo po koncentriranju, ali z namnožit- vijo parazitov v/na gojišču pred mikroskop- skim pregledom. (7). Prednost antigenskih testov, s katerimi v kužnini z uporabo monoklonskih proti- teles dokazujemo parazitske antigene, je enostavna in hitra izvedba, enostavno vred- notenje njihovih rezultatov in sprejemljiva cena. Antigene dokazujemo s hitrimi imuno- kromatografskimi testi, z neposrednimi imunofluorescenčnimi testi ali z encimsko- -imunskimi testi. Antigenski testi imajo običajno višjo občutljivost kot običajni mikroskopski pregled. Glavna slabost anti- genskih testov je predvsem v tem, da lahko z njimi v kužnini sočasno ugotovimo pri- sotnost le enega ali največ dveh parazitov. Če je to edina metoda, ki jo uporabljamo, lahko pravega povzročitelja spregledamo (4). Prisotnost parazitov v kužnini lahko neposredno dokazujemo tudi z molekular- nimi metodami. Te imajo visoko specifičnost in omogočajo ločevanje med morfološko podobnimi vrstami parazitov, ki jih na osno- vi mikroskopskega pregleda ne moremo razlikovati med seboj ali pa je razlikovanje oteženo (npr. razlikovanje med nepatoge- no Entamoeba dispar in patogeno Entamoeba histolytica, razlikovanje med jajčeci Taenia saginata in Taenia solium). Poleg tega je prednost molekularnih metod v tem, da jih lahko uporabimo tudi takrat, ko kužnina ni bila pravilno shranjena in prenešena, saj je DNA obstojna. Njihova občutljivost je viso- ka in zato omogoča dokazovanje parazitov, tudi če jih je v kužnini malo (npr. pri asimptomatskih posameznikih). Enega izmed ključnih korakov molekularnih pre- iskav predstavlja osamitev DNA, predvsem iz kužnin z odpornimi oblikami parazita (ciste, oociste, jajčeca). Te so izredno trpežne, zato je sprostitev nukleinske kisline iz njih težavna, kar lahko močno vpliva na občut- ljivost molekularne preiskave. Žal postop- ki osamitve DNA predvsem v takšnih pri- merih še niso standardizirani. Molekularne preiskave imajo za zdaj še vedno visoko ceno. Njihova uporaba je smiselna v sin- dromski diagnostiki, ko s hkratno verižno reakcijo s polimerazo (angl. polymerase chain reaction, PCR) poleg parazitskih pre- poznavamo tudi virusne, bakterijske in gliv- ne povzročitelje okužb osrednjega živčnega sistema, dihal, črevesa in spolno prenoslji- vih okužb (4, 6, 9). Za zdaj še nobena od novejših diagno- stičnih metod ne more nadomestiti mikro- skopskega pregleda. Kakovost mikroskopske 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 127 128 Barbara Šoba Šparl Mikrobiološka diagnostika okužb s paraziti pri popotnikih Tabela 1. Pogosti povzročitelji parazitskih okužb pri popotnikih, primerni diagnostični vzorci in diagnosti- čne metode, ki jih uporabljamo v Laboratoriju za parazitologijo Inštituta za mikrobiologijo in imunologijo (LAB PRZ IMI) za prepoznavo okužb. DIF – neposredni imunofluorescenčni test (angl. direct immuno- fluorescence test), PCR – verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction), UV – ultravi- joličen, ELISA – encimsko-imunski test (angl. enzyme linked immunosorbent assay), IgG – imunoglobulini G, WB – prenos western (angl. western blot), CLIA – kemiluminiscenčni test (angl. chemiluminescent immu- noassay), IgM – imunoglobulini M, IHA – posredni hemaglutinacijski test (angl. indirect hemagglutination test). Paraziti Primeren diagnostični vzorec Diagnostična metoda LAB PRZ IMI Praživali Balantitium coli blato (trikrat) pregled s svetlobnim mikroskopom Cryptosporidium spp. blato (trikrat) DIF, PCR v realnem času Cyclospora cayetanensis blato (trikrat ali več) pregled s svetlobnim mikroskopom po barvanju s safraninom in metilenskim modrilom, pregled z UV-mikroskopom Cystoisospora belli blato (trikrat) pregled s svetlobnim mikroskopom, pregled s svetlobnim mikroskopom po barvanju s safraninom in metilenskim modrilom, pregled z UV-mikroskopom Entamoeba histolytica blato (trikrat ali več) pregled s svetlobnim mikroskopom, (črevesna ameboza) PCR v realnem času punktat abscesa PCR v realnem času (zunajčrevesna ameboza) serum (zunajčrevesna ameboza) ELISA IgG Giardia duodenalis blato (trikrat) pregled s svetlobnim mikroskopom, DIF, PCR v realnem času sok dvanajstnika pregled s svetlobnim mikroskopom, PCR v realnem času Leishmania spp. biopt kožne razjede pregled s svetlobnim mikroskopom (kožna lišmanioza) po barvanju z barvilom po Giemsi, PCR v realnem času punktat kostnega mozga, aspirat pregled s svetlobnim mikroskopom po barvanju vranice (visceralna lišmanioza) z barvilom po Giemsi, PCR v realnem času serum (visceralna lišmanioza) WB IgG Plasmodium spp. polna kri pregled goste kaplje krvi in tankega krvnega razmaza s svetlobnim mikroskopom po barvanju z barvilom po Giemsi, PCR v realnem času, (hitri antigenski test) Toxoplasma gondii serum CLIA IgG, IgM punktat bezgavke PCR v realnem času Trypanosoma brucei polna kri pregled goste kaplje krvi in tankega krvnega razmaza s svetlobnim mikroskopom po barvanju z barvilom po Giemsi možgansko-hrbtenjačna tekočina pregled s svetlobnim mikroskopom Trypanosoma cruzi polna kri pregled goste kaplje krvi in tankega krvnega razmaza s svetlobnim mikroskopom po barvanju z barvilom po Giemsi serum ELISA IgG 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 128 129Med Razgl. 2023; 62 Suppl 2: Paraziti Primeren diagnostični vzorec Diagnostična metoda LAB PRZ IMI Helminti Ancylostoma brasiliense / (klinična diagnostika) / in druge živalske kavljaste gliste Črevesni helminti (Ascaris blato (trikrat) pregled s svetlobnim mikroskopom lumbricoides, Capillaria philippinensis, Clonorchis sinensis, Dibothriocephalus latus, Dipylidium caninum, Echinostoma spp., Fasciolopsis buski, Heterophyes heterophyes, Hymenolepis spp., kavljaste gliste, Metagonimus yokogawai, Opisthorchis viverrini, Paragonimus westermani, Taenia saginata, Trichostrongylus spp., Trichuris trichiura) Echinococcus spp. serum ELISA IgG aspirat ciste pregled s svetlobnim mikroskopom, (PCR) Fasciola hepatica blato (trikrat) pregled s svetlobnim mikroskopom serum WB IgG Filarije (Loa loa, polna kri (Loa loa, pregled goste kaplje krvi in tankega krvnega Wuchereria bancrofti, Wuchereria bancrofti) razmaza s svetlobnim mikroskopom po barvanju Onchocerca volvulus) z barvilom po Giemsi, (PCR v realnem času) biopt kože/kožnega nodula mikroskopski pregled, (Onchocerca volvulus) (PCR v realnem času) Schistosoma spp. blato (trikrat) pregled s svetlobnim mikroskopom urin serum IHA, WB IgG Strongyloides stercoralis blato (trikrat ali več) pregled s svetlobnim mikroskopom, kultivacija, PCR v realnem času sputum pregled s svetlobnim mikroskopom, PCR v realnem času serum ELISA IgG Taenia solium blato (trikrat) (tenioza) pregled s svetlobnim mikroskopom serum (cisticerkoza) WB IgG Toxocara spp. serum ELISA, WB IgG Trichinella spiralis serum ELISA, WB IgG biopt mišice pregled s svetlobnim mikroskopom Členonožci Muhe (Dermatobia biopt kože makroskopski pregled, hominis, Cordylobia pregled s svetlobnim mikroskopom anthropophaga) Sarcoptes scabiei skarifikat kože pregled s svetlobnim mikroskopom Tunga penetrans biopt kože pregled s svetlobnim mikroskopom 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 129 diagnostike morajo na visoki ravni vzdrže- vati predvsem referenčni parazitološki laboratoriji, ki v diagnostično obravnavo prejemajo kužnine, odvzete popotnikom, priseljencem, pribežnikom in bolnikom z imunsko pomanjkljivostjo, ki lahko obo- levajo za nekaterimi redkimi parazitoza- mi in okužbami, ki pri nas niso endemične (8, 10). Blato Za mikroskopski pregled blata na prisotnost parazitov (praživali, helminti) je priporoč- ljiv pregled vsaj treh vzorcev, odvzetih v različnih dneh, najbolje vsak drugi dan. Paraziti oz. njihove razvojne oblike se v blatu namreč ne izločajo stalno, zato z večkratnim odvzemom blata v različnih dneh poveča- mo občutljivost preiskave. Npr. pri več kot dveh tretjinah asimptomatskih bolnikov s kronično okužbo z glisto Strongyloides ster- coralis je v gramu iztrebka manj kot 25 ličink parazita (11). Pri mikroskopskem pregledu enega samega vzorca blata zgrešimo do 70 % takšnih primerov; diagnostična občut- ljivost mikroskopskega pregleda se približa 100 % šele ob pregledu sedmih zaporednih vzorcev blata (12). Če ima bolnik drisko in je blato tekoče, je od parazitskih okužb najbolj verjetna okuž- ba s praživalmi. Ob hudih driskah so le-te lahko v blatu prisotne le v obliki trofozoi- tov (npr. pri okužbi z Entamoeba histolyti- ca), ki zunaj gostitelja hitro propadejo, zato je pomembno, da mikroskopski pregled izvedemo čim prej, najkasneje v 30 minu- tah po odvzemu. V tem primeru blato do pregleda hranimo pri sobni temperaturi; shranjevanje v hladilniku trofozoite uniči. Kadar prenos vzorcev blata v parazitološki laboratorij v tem času ni mogoč, blato od- vzamemo v posodice, ki so polnjene s kon- zervansom. Konzervans vzdržuje parazite v blatu (omogoči ohranitev njihove mor- fologije in prepreči nadaljnji razvoj jajčec ter ličink helmintov). Blato lahko v poso- dici s konzervansom hranimo pri 2–8 °C ali na sobni temperaturi še en do dva dneva po zadnjem odvzemu (4). Pred pripravo preparata za mikrosko- piranje vzorec blata pregledamo makro- skopsko na morebitno prisotnost nekaterih odraslih glist in odrivkov trakulj ter preve- rimo njegovo konsistenco, barvo, prisotnost krvi in sluzi. Običajno mikroskopskemu preparatu dodamo Lugolovo raztopino joda, ki se veže z glikogenom v celicah parazitov, zaradi česar se celice obarvajo rjavkasto in so pod mikroskopom bolje vidne. Če želi- mo opazovati še gibljive trofozoite praživali, moramo pregledati nativni preparat svežega iztrebka brez konzervansa. Občutljivost preiskave blata na parazite povečamo s postopki koncentriranja morebitnih para- zitov v blatu, bodisi s sedimentacijskimi postopki bodisi z naplavljanjem. Trajno barvanje razmazov (npr. s trikromom, žele- zovim hematoksilinom in s klorazol črnim), pripravljenih iz vzorcev blata, poveča občutljivost preiskave blata na praživali. Uporabljamo lahko tudi barvanja, ki so namenjena proti kislinam odpornim kok- cidijem (npr. prilagojeno barvanje po Kinyounu, prilagojeno barvanje po Ziehl- -Neelsenu, barvanje s safraninom in meti- lenskim modrilom, prilagojeno barvanje s trikromom ipd.) (4). Pri parazitozah, pri katerih je število parazitov v črevesu nizko in posledično prisotnost vegetativnih oblik parazitov v blatu minimalna (ličinke, trofozoiti; npr. Strongyloides stercoralis, kavljaste gliste, Trichostrongylus spp. in nekatere praživali), lahko izvedemo kultivacijo, tj. namnožitev parazitov v/na posebnih gojiščih. Za kulti- vacijo mora biti blato sveže odvzeto in brez dodanega konzervansa (4). Slabost kultivacije je precejšnja dolgotrajnost njene izvedbe. Odsotnost ličink ali trofozoitov parazita po kultivaciji sicer ne izključuje okužbe, je pa pri negativnih rezultatih verjetnost okužbe majhna, seveda če je bil vzorec hitro in pravilno prenesen v labo- ratorij (4, 7). 130 Barbara Šoba Šparl Mikrobiološka diagnostika okužb s paraziti pri popotnikih 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 130 V molekularni diagnostiki črevesnih parazitoz se najpogosteje uporabljajo testi za dokazovanje okužb s praživalmi Giardia duo- denalis, Cryptosporidium spp. in Entamoeba histolytica. V LAB PRZ IMI poleg teh testov izvajamo tudi molekularno testiranje na glisto Strongyloides stercoralis, ki služi za potrditev diagnoze strongiloidoze kot alter- nativni test ali pa v kombinaciji s klasičnimi parazitološkimi tehnikami (mikroskopski pregled, kultivacija na agarskem gojišču), ne pa kot presejalni test. Za molekularno dia- gnostiko blato hranimo do 24 ur pri tem- peraturi 2–8°C in ga odvzamemo v posodico brez konzervansa. Nekateri konzervansi lahko namreč povzročijo fragmentacijo ali poškodujejo DNA parazita, zaradi česar so možni lažno negativni rezultati moleku- larne preiskave (7). Po zaključenem zdravljenju se blato bolnika pregleda s klasičnimi parazitolo- škimi metodami; pri okužbi s praživalmi tri do štiri tedne po zdravljenju, pri okužbi s helminti pa pet do šest tednov po zaključ- ku zdravljenja (7). Kri V krvi iščemo praživali Plasmodium spp., Leishmania spp., Trypanosoma spp. in ličin- ke filarij, t. i. mikrofilarije. Kri odvzamemo po običajnem postopku za odvzem venske krvi v epruveto z antikoagulantom etilen- diamintetraocetno kislino (angl. ethylene- diaminetetraacetic acid, EDTA). Tako odvzeta kri je primerna za mikroskopski pregled, hitre antigenske teste in molekularne pre- iskave. Krvne preparate moramo pripravi- ti v eni uri po odvzemu krvi. Ob sumu na malarijo s tem ohranimo granulacije zno- traj eritrocitov in morfologijo malarijskih parazitov, kar je ključno za določanje vrste Plasmodium spp. Za vsakega bolnika pri- pravimo tako tanek krvni razmaz kot tudi gosto kapljo krvi. Občutljivost mikroskop- skega pregleda goste kaplje krvi je v pri- merjavi s pregledom tankega krvnega razmaza višja. Krvne preparate obarvamo z barvilom po Giemsi, ki je barvilo izbire za prikaz vseh krvnih parazitov (7). Bolniku moramo ob sumu na malarijo odvzeti kri pred začetkom zdravljenja, naj- bolje ob napadu mrzlice, nato pa jo pre- gledujemo vsakih šest do osem ur tri dni oz. do prvega pozitivnega rezultata. V pri- meru slednjega vzorce krvi pregledujemo še 24, 48 in 72 ur po uvedbi ustreznih zdra- vil. Preden se izda negativen izvid, se pri- poroča natančen pregled vsaj 200–300 vidnih polj obarvane goste kaplje krvi in tankega krvnega razmaza pri 1000-kratni povečavi. Ob okužbi z vrsto Plasmodium fal- ciparum določimo tudi parazitemijo, ki jo običajno izrazimo kot delež s paraziti oku- ženih eritrocitov (7, 13). Pri afriški tripanosomozi so tripoma- stigoti v krvi bolnika v največjem številu prisotni v obdobjih vročine. Kri lahko cen- trifugiramo in s tem morebitne tripoma- stigote koncentriramo. Preden jih najdemo, je pogosto treba mikroskopsko pregledati več vzorcev krvi. Kri pregledujemo tudi med zdravljenjem in en do dva meseca po zdrav- ljenju. Pri južnoameriški tripanosomozi so tripomastigoti v krvi prisotni predvsem v akutni stopnji okužbe, v kronični stopnji pa so redki. Pri odvzemu krvi za mikro- biološko diagnostiko visceralne lišmanio- ze moramo upoštevati, da je amastigotov v krvi več ponoči kot podnevi. Periodičnost pojavljanja v krvi je značilna tudi za mikro- filarije nekaterih vrst filarij. Nočna perio- dičnost je tako značilna za mikrofilarije vrst Wuchereria bancrofti, Brugia malayi in Brugia timori, mikrofilarije Loa loa pa v krvi najdemo podnevi. Občutljivost mikroskop- ske diagnostike povečamo s postopki kon- centriranja mikrofilarij v krvi (7). Z dobrimi hitrimi antigenskimi testi, ki predstavljajo pomemben napredek v dia- gnostiki malarije, zanesljivo zaznamo že 100–200 parazitov na μl krvi, kar je pri- merljivo z občutljivostjo dobro izvedenega mikroskopskega pregleda. Hitri testi so pri- merni za uporabo v urgentnih ambulantah 131Med Razgl. 2023; 62 Suppl 2: 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 131 razvitega in nerazvitega sveta in za samo- pregledovanje popotnikov, ki potujejo v odmaknjene predele sveta, saj je njihova izvedba preprosta in hitra, njihova cena nizka, enostavna je interpretacija njihovih rezultatov, prednost pa je tudi obstojnost pri visokih temperaturah (13). V LAB PRZ IMI diagnosticiramo okuž- be s plazmodiji in lišmanijami tudi z mole- kularnimi metodami, v raziskovalne namene pa jih uporabljamo za ugotavljanje DNA filarij. Seč Z mikroskopskim pregledom nativnega preparata usedline seča iščemo jajčeca krvne- ga metljaja Schistosoma haematobium. Preden se le-ta v seču začnejo izločati, lahko od okuž- be mine do tri mesece. Ker je pri blagih okužbah jajčec v seču malo, je potreben pre- gled več vzorcev seča. Največ jajčec se v seču izloča med poldnevom in tretjo uro popoldan, zato je seč najprimerneje odvzeti v tem delu dneva. Lahko se zbira tudi celo- dnevni seč. Za oceno uspešnosti zdravlje- nja je treba seč pregledovati še eno leto po zaključenem zdravljenju (7). V usedlini seča najdemo tudi trofo- zoitne oblike spolno prenosljivega bičkar- ja Trichomonas vaginalis. V LAB PRZ IMI trihomonozo dokazujemo z molekularnimi testi. Vzorci iz dihal V nativnih preparatih vzorcev iz dihal lahko z mikroskopskim pregledom najde- mo ličinke glist Ascaris lumbricoides in Strongyloides stercoralis, jajčeca metljaja Paragonimus westermani in kaveljčke trakulje Echinococcus spp. Tahizoite Toxoplasma gon- dii iščemo v mikroskopskih preparatih, obarvanih z barvilom po Giemsi, ali pa nji- hovo prisotnost v vzorcu potrdimo z mole- kularnimi metodami (5). Vzorce iz dihal odvzamemo v sterilno posodico z navojem in jih v najkrajšem mož- nem času prenesemo v laboratorij. Če takoj- šen prenos ni možen, jih hranimo pri tem- peraturi 2–8 °C do največ 24 ur (7). Punktati in biopti organov in tkiv Punktate in biopte organov in tkiv pregle- dujemo, predvsem če sumimo na okužbo z lišmanijami, tripanosomami in Toxoplasma gondii, včasih pa lahko v teh kužninah naj- demo ličinke gliste Strongyloides stercoralis. Razmaze kužnine navadno obarvamo z bar- vilom po Giemsi in jih pregledamo pri 1000-kratni povečavi (5, 7). Za diagnostiko toksoplazmoze, lišmanioze in strongiloi- doze imamo v LAB PRZ IMI na voljo tudi molekularne teste. Ob sumu na zunaj- črevesno amebozo in ehinokokozo pregle- dujemo punktate ognojkov in cist. Material mikroskopiramo ali pa uporabimo mole- kularne metode. Z mikroskopskim pregle- dom lahko v bioptu mišic najdemo ličinke gliste Trichinella spp. (7). Punktate in biopte odvzamemo v ste- rilno epruveto oz. posodico z navojem in jih v najkrajšem možnem času pošljemo v labo- ratorij. Če takojšen prenos vzorcev ni možen, jih hranimo pri temperaturi 2–8 °C do največ 24 ur (7). Koža Za parazitološko diagnostiko so primerni biopt, aspirat ali postržek kožne spremembe (razjeda, izpuščaj, nodul itd.). V kužnini iščemo amastigote lišmanij, filarije in mikrofilarije, ličinke gliste Strongyloides stercoralis ter členonožce – parazitske ličin- ke nekaterih tropskih muh, pršice vrste Sarcoptes scabiei in bolhe vrste Tunga pene- trans. Običajno iz kužnine pripravimo nativne mikroskopske preparate ali pa raz- maze obarvamo z barvilom po Giemsi (5, 7). V LAB PRZ IMI lahko kožno lišmaniozo in prisotnost ličink Strongyloides stercoralis diagnosticiramo tudi z molekularnimi testi. Slednje uporabljamo tudi v raziskovalne namene za ugotavljanje DNA filarij in mikrofilarij. 132 Barbara Šoba Šparl Mikrobiološka diagnostika okužb s paraziti pri popotnikih 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 132 Pri sumu na kožno lišmaniozo je naj- primernejša kužnina biopt z roba kožne spremembe. Najbolje je odvzeti več biop- tov s punch biopsijo. Rano je treba pred od- vzemom očistiti s 70-% alkoholom. Biopt odložimo v sterilno posodico z navojem. Vzorcu dodamo nekaj kapljic sterilne fizio- loške raztopine, da se ne izsuši, ali pa ga odložimo na sterilno gazo, navlaženo s ste- rilno fiziološko raztopino (7). POSREDNE DIAGNOSTIČNE METODE Parazitske okužbe lahko dokazujemo tudi posredno z ugotavljanjem značilnih proti- teles v bolnikovem serumu, ki nastanejo kot imunski odziv na prisotnost patogena v gostitelju. Za serološke preiskave odvza- memo 2–3 ml krvi iz periferne vene v epru- veto za vakuumski odvzem brez antikoagu- lanta in jo v največ štirih urah pošljemo v laboratorij. Če prenos v tem času ni možen, jo shranimo pri temperaturi 2–8°C in jo naj- kasneje v 24 urah pošljemo v laboratorij (7). V LAB PRZ IMI s serološkimi testi ugotavljamo prisotnost specifičnih proti- teles, in sicer IgG, IgM in IgA proti praži- vali Toxoplasma gondii in IgG proti praživalim E. histolytica, Leishmania spp. in Trypanosoma cruzi ter proti helmintom Trichinella spiralis, Toxocara spp., S. stercoralis, Echinococcus spp., Schistosoma spp., Fasciola spp. in T. solium, če sumimo na (nevro)cisti- cerkozo. Prisotnost značilnih IgG v bolnikovem serumu sicer kaže na okužbo s parazitom, ne pove pa, kdaj je do okužbe prišlo, zato mora klinični zdravnik presoditi, ali klini- čna slika ustreza mikrobiološkemu izvidu. Po uspešnem zdravljenju parazitske okuž- be lahko IgG vztrajajo še več let, zato na podlagi seroloških testov večinoma ne moremo spremljati uspešnosti zdravlje- nja. Pri nekaterih kroničnih okužbah, ko se ličinke parazita naselijo v tkivih ali orga- nih in tam poapnijo (npr. Echinococcus gra- nulosus, Taenia solium, Toxocara spp., Trichinella spiralis), ali pa ko je bolnik imun- sko zelo oslabljen zaradi bolezni ali imuno- supresivne terapije, je lahko humoralni odziv na parazitsko okužbo tako šibek, da ga s serološkimi testi ne zaznamo in so rezultati lažno negativni. Podobno je tvor- ba IgG šibka pri črevesni amebozi in kožni lišmaniozi, zato je serološko testiranje na Entamoeba histolytica in Leishmania spp. smiselno pri sumu na zunajčrevesno ame- bozo in visceralno lišmaniozo. Serološki testi imajo slabšo občutljivost tudi pri bol- nikih z akutno okužbo, npr. pri popotnikih, ki so se vrnili s potovanja. Zlasti takrat, ko za potrjevanje pozitivnih rezultatov prese- jalnih testov ni na voljo potrditvenega testiranja (npr. pri Strongyloides stercoralis), se moramo zavedati, da je lahko pozitiven rezultat posledica navzkrižne reaktivno- sti, predvsem s protitelesi proti drugim parazitom, s katerimi je (bil) bolnik okužen. Pri interpretaciji rezultatov seroloških testov je zato vedno treba upoštevati bol- nikovo klinično sliko in anamnezo (14). ZAKLJUČEK Mikrobiološka diagnostika parazitskih okužb še dandanes največkrat temelji na neposredni preiskavi kužnine. Parazitološki diagnostični laboratoriji morajo ohranjati svoje znanje o morfoloških značilnostih parazitov, saj lahko le tako zagotavljajo pra- vilno prepoznavo parazita ob pregledu kuž- nine s svetlobnim mikroskopom. Svetlobno mikroskopijo lahko dopolnjujejo modernej- ši antigenski in molekularni testi in pred- vsem v primeru parazitoz, ki jih povzroča- jo tkivni paraziti, tudi posredni serološki testi. Dobra komunikacija med kliničnim zdravnikom in parazitološkim laboratorijem zagotavlja ustrezen odvzem in prenos kuž- nin, kar je eden izmed predpogojev za učin- kovito obvladovanje parazitskih bolezni. 133Med Razgl. 2023; 62 Suppl 2: 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 133 134 Barbara Šoba Šparl Mikrobiološka diagnostika okužb s paraziti pri popotnikih LITERATURA 1. Boggild AK, Yohanna S, Keystone JS, et al. Prospective analysis of parasitic infections in Canadian travelers and immigrants. J Travel Med. 2006; 13 (3): 138–44. 2. Leder K, Torresi J, Libman MD, et al. Geosentinel surveillance of illness in returned travelers, 2007–2011. Ann Intern Med. 2013; 158 (6): 456–68. 3. Showler AJ, Wilson ME, Kain KC, et al. Parasitic diseases in travelers: A focus on therapy. Expert Rev Anti Infect Ther. 2014; 12 (4): 497–521. 4. Šoba B. Laboratorijska diagnostika parazitov v blatu. Med Razgl. 2013; 52 (Suppl 5): 61–8. 5. Logar J, Šoba B. Laboratorijska diagnostika parazitskih bolezni pri popotnikih. Med Razgl. 2004; 43 (Suppl 2): 65–8. 6. Ružić-Sabljić E. Praktikum iz mikrobiologije za študente farmacije. 2nd ed. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Katedra za mikrobiologijo in imunologijo; 2016. p. 32–3. 7. Garcia LS. Diagnostic medical parasitology. 6th ed. Washington: ASM Press; 2016. p. 7–194, 1184–93. 8. Potters I, Bottieau E, Yansouni CP, et al. The case for parasitological stool microscopy. Clin Microbiol Infect. 2022; 28 (10): 1310–2. 9. Cvitković Špik V, Pirš M, Seme K. Osnove mikrobiološke laboratorijske diagnostike za študente dentalne medicine. 1st electronic ed. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Katedra za mikrobiologijo in imunologijo; 2020. p. 91. 10. Bradbury RS, Sapp SGH, Potters I, et al. Where have all the diagnostic morphological parasitologists gone? J Clin Microbiol. 2022; 60 (11): e0098622. 11. Siddiqui AA, Berk SL. Diagnosis of strongyloides stercoralis infection. Clin Infect Dis. 2001; 33 (7): 1040–7. 12. Krolewiecki A, Nutman TB. Strongyloidiasis: A neglected tropical disease. Infect Dis Clin North Am. 2019; 33 (1): 135–51. 13. Šoba B, Kotar T, Biasizzo H, et al. Laboratorijska diagnostika malarije. Med Razgl. 2013; 52 (Suppl 5): 135–41. 14. Skvarč M. Serološke preiskave pri popotnikih s sumom na parazitsko obolenje. Med Razgl. 2013; 52 (Suppl 5): 123–8. 7 potovalna medicina 2023_Mr10_2.qxd 8.5.2023 8:47 Page 134