UDK 678.7                                                                                                                                                                       ISSN 1580-2949
Original scientific article/Izvirni znanstveni članek                                                                                    MTAEC9, 40(4)161(2006)
KARAKTERIZACIJA KOPOLIMEROV SEC IN SEC-MALS ASPARAGINSKE KISLINE IN LAKTIDA
SEC AND SEC-MALS CHARACTERIZATION OF COPOLYMERS OF ASPARTIC ACID AND LACTIDE
Maja Gričar, Erna Žagar, Andrej Kržan, Majda Žigon
Kemijski inštitut, Laboratorij za polimerno kemijo in tehnologijo, Hajdrihova 19, SI-1000 Ljubljana, Slovenija
majda.zigonŽki.si
Prejem rokopisa – received: 2006-02-20; sprejem za objavo - accepted for publication: 2006-07-18
Iz dimera mlečne kisline (LTD) in asparaginske kisline (Asp) smo sintetizirali amfifilne kopolimere poli(sukcinimid-ko-laktid), PLS, različne kemijske sestave (Asp:LTD=l/6 in 1/13) ter določili porazdelitev in povprečja molskih mas. Povprečja molskih mas PLS smo določili z izključitveno kromatografijo v povezavi z detektorjem na sipanje svetlobe pri več kotih (SEC-MALS) po optimizaciji eksperimentalnih pogojev analize. Ločevanje makromolekul je potekalo po mehanizmu ločevanja po velikosti brez sekundarnih mehanizmov, kot so npr. polielektrolitski učinek, asociacija polimera, adsorpcija polimera na polnilo kolone itd. Z dodatkom H3PO4 topilu N,N-dimetilacetamidu smo preprečili disociacijo karboksilnih skupin PLS, z dodatkom LiBr pa polarne in elektrostatske interakcije v verigi kopolimera ter med kopolimerom in polnilom kolone. Absolutna povprečja molskih mas so veliko višja od relativnih, določenih z izključitveno kromatografijo in umeritvijo s polistirenskimi standardi pri enakih eksperimentalnih pogojih kot pri SEC-MALS. Razlike med relativnimi in absolutnimi povprečji molskih mas smo pojasnili z razlikami v kemijski sestavi kopolimerov in PS-standardov ter posledično različnimi konformacijami v raztopini.
Ključne besede: poli(sukcinimid-ko-laktid), SEC-MALS, SEC, povprečja molskih mas, porazdelitev molskih mas
Amphiphilic copolymers of lactic acid dimmer and aspartic acid, poly(succinimide-co-lactide)s - PLS, with different chemical composition (Asp : Lac = 1/6 and 1/13), were synthesized and molar mass averages (MMA) and distributions (MMD) were determined. MMA and MMD of PLS were determined using size exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering photometer (SEC-MALS) under optimized experimental conditions. Molecules were separated according to size exclusion mechanism, whereas the secondary effects such as polyelectrolyte effect, polymer association, adsorption of the polymer to the column packing material, etc., were successfully prevented. We added H3PO4 to N,N-dimethylacetamide in order to suppress dissociation of PLS carboxylic groups, and LiBr to prevent electrostatic interactions between the macromolecular chain and between macromolecules and column packing material. The absolute MMAs were much higher than relative PS equivalents determined under the same experimental conditions as by SEC-MALS. The difference between relative and absolute MMA is discussed in relation to the difference in copolymer and polystyrene composition and conformation in solution.
Key words: poly(succinimide-co-lactide), SEC-MALS, SEC, molar mass averages, molar mass distribution
1 UVOD
Biorazgradljivi polimeri v zadnjem času pridobivajo na pomenu predvsem zato, ker so primerni za uporabo v medicinske namene, saj pri njihovi razgradnji nastajajo človeku neškodljivi produkti. Eden najbolj znanih biorazgradljivih polimerov je poli(mlečna kislina) PLA. Ta se uporablja v medicinske namene zaradi svojih bioresorpcijskih lastnosti in biološke kompatibilnosti s človeškim organizmom. Uporablja se npr. za kontrolirano doziranje farmacevtskih učinkovin, za kostne vstavke, umetna tkiva in resorpcijske šive. Za nekatere namene je PLA preveč hidrofobna in hitrost razpada prenizka. V takih primerih uporabljamo hidrofilne biorazgradljive polimere, katerih tipični predstavniki so poli(asparaginska kislina) PASP, poli(akrilna kislina) PA, itd. PASP razpada mnogo hitreje kot hidrofobna PLA. PASP nastane z odprtjem sukcinimidnih obročev poli(sukcinimida). To obliko sestavljajo hidrofilne asparaginske enote, topne v vodi13. Izkazalo se je, da je za uporabo v medicinske namene zaradi boljše afinitete z različnimi vrstami farmacevtskih učinkovin oziroma tkiv pomembna tako hidrofilna kot tudi hidrofobna narava
materiala4,5. Te lastnosti združujejo amfifilni polimeri, kot so npr. kopolimer asparaginske kisline (Asp) in laktida (LTD), poli(sukcinimid-ko-laktid)6 PLS, kopolimer y-glutaminske kisline in laktida7 itd.
Zaradi statistične narave polimerizacije so polimeri zmesi različno velikih molekul in zato njihovo molsko maso lahko opredelimo le s povprečnimi vrednostmi. Poznanje celotne porazdelitve molskih mas in povprečij le-teh je pomembno za razumevanje biorazgradljivosti in njihovih fizikalnih, reoloških in mehanskih lastnosti8. Izključitvena kromatografija (SEC) omogoča določitev relativnih povprečij in porazdelitev molskih mas. Molekule se ločujejo v koloni z nosilcem z definirano velikostjo por glede na hidrodinamski volumen v izbranem topilu. Izključitvena kromatografija, sklopljena z detektorjem na sipanje svetlobe pri več kotih (SEC-MALS), omogoča določitev absolutnih povprečij in porazdelitev molskih mas910.
PLS je amfifilen polimer, topen v polarnih topilih, kot sta N,N-dimetilformamid (DMF) ali N,N-dimetil-acetamid (DMAc)6'11. Vendar pa se makromolekule na kolonah z zamreženim polistirenskim polnilom in z uporabo polarnih eluentov, kot sta DMF ali DMAc, ne
MATERIALI IN TEHNOLOGIIE 40 (2006) 4
161
M. GRIČAR ET AL.: SEC IN SEC-MALS KARAKTERIZACIJA KOPOLIMEROV ASPARAGINSKE KISLINE IN LAKTIDA
ločujejo le po velikosti, ampak lahko pride med top-ljencem, topljencem in topilom ter med topljencem in polnilom kolone do številnih interakcij (asociacija, adsorpcija polimera na polnilo kolone, hidrofobne interakcije polimera s polnilom kolone) in polielek-trolitskega učinka9-14,16-22. Polielektrolitski učinek je značilen za polimere z ionskimi skupinami pri nizkih koncentracijah analita. Zaradi elektrostatskega odboja med enako nabitimi skupinami zavzame polimer v izbranem topilu bolj raztegnjeno konformacijo. Ker se zato hidrodinamski volumen molekule poveča, se le-ta eluira iz kolone hitreje, kot bi pričakovali glede na njeno molsko maso. Za zaščito nabojev na polimeru in polnilu topilu dodajamo enostavne elektrolite, npr. LiBr11,12,15. Močna tendenca polarnih skupin polimera za tvorbo H-vezi vodi do asociacije molekul polimera in posledično do večjega hidrodinamskega volumna in s tem višjih izmerjenih relativnih molskih mas. Privlačne interakcije med polarnimi skupinami kopolimera in polnila kolone (H-vezi, dipolne interakcije) povzročijo adsorpcijo polimera na polnilo kolone, kar poveča elucijski volumen12,16,18,20,22,23. Med hidrofobnim delom amfifilnega polimera in nepolarnim polnilom kolone lahko pride tudi do hidrofobnih interakcij13,14. Za preprečitev zgoraj omenjenih interakcij topilu dodajamo enostavne elektrolite, kot so npr. LiBr, LiCl, NaBr, ipd.6,12,16-18,20-24.
Namen našega dela je bil določiti absolutna in relativna povprečja molskih mas dveh kopolimerov PLS različne sestave (razmerje monomernih enot Asp : LTD = 1:6 in 1:13) ter z optimizacijo eksperimentalnih pogojev zagotoviti ločevanje makromolekul izključno po hidrodinamskem volumnu. Relativna povprečja molskih mas (MMA) in porazdelitve molskih mas (MMD) smo določili s SEC glede na polistirenske standarde, absolutne vrednostipa s SEC-MALS.
Po navedbah v literaturi so porazdelitev in povprečja poli(sukcinimid-ko-laktid)a do sedaj določali le z relativno SEC in polistirensko umeritvijo z uporabo topila DMAc z dodatkom LiBr relativno na PS-stan-darde6. Kot prvismo absolutna MMAs določiliz uporabo SEC-MALS pri optimalnih eksperimentalnih pogojih za posamezni kopolimer in jih primerjali z relativnimi vrednostmi glede na PS-standarde. V delu podajamo možne razlage za zelo velike razlike med absolutnimi in relativnimi vrednostmi MMA.
H      I      CH        \   V.       VČ      \        /NT<r. /      ,CH3
a        II        I         1 b             N-VČV         C         '         \ ""
HO—CH—C4O—CH—C+NH—UČ/     \e    \\     'w-1 N fO—CH—C+OH Il \       „       Il x          f     V\             A          O \      e          /
CH3 I -CH g
CH,
O /        CH3     \
•.III        !           I *
k -JMO—CH—C+OH
O
O y
O'z
Slika 1: Struktura poli(sukcinimid-ko-laktida)6
Figure 1: The structure of poly(succinimide-co-lactide)6
2 EKSPERIMENTALNI DEL
Materiali
Asparaginska kislina, Asp (98 %, Aldrich), laktid -ciklični dimer mlečne kisline, LTD (98 %, Aldrich), tetrahidrofuran, THF (vsebnost vode < 0,05 %, Merck), N,N-dimetilacetamid, DMAc (vsebnost vode < 0,03 %, 99,8 %, Fluka), LiBr (99,995+ %, Aldrich), H3P04 (85 %, Merck). Vse kemikalije so bile p. a.
Sinteza
V stekleno bučko s tremivratovi, opremljeno z mehanskim mešalom in dovodom argona, smo zatehtali Asp (4,0 g; 0,03 mol) in LTD (10,8 g; 0,08 mol). Bučko smo ovili z aluminijevo folijo, jo prepihali in napolnili z argonom. Reakcijsko zmes smo segrevali4 h pri200 °C. Po 4 h smo znižali temperaturo na 160 °C in tlak do pribl. 200 mbar, da smo odstranili nastajajočo vodo in premaknili ravnotežje v smer nastanka produkta. Z mešanjem smo nadaljevali20 h pri160 °C in znižanem tlaku. Reakcijska raztopina je postala rjava in viskozna. Reakcijo smo ustavili z ohlajanjem reakcijske zmesi. Produkt smo raztopili v 15 mL THF in ga oborili s 600 mL destilirane vode ter pustili 3 dni, da se je v vodi raztopila nezreagirana Asp. Rumenorjav produkt smo sušiliprisobnitemperaturiin znižanem tlaku6 (izkoristek sinteze 76 %).
Sestavo sintetiziranih kopolimerov oziroma razmerje Asp : LTD v PLS-1/6 in PLS-1/13 smo določili s m NMR-spektroskopijo iz razmerja intenzitet resonanc metilenskega protona sukcinimida (h) in metilne skupine PLA (i)6. Struktura kopolimera PLS je prikazana na sliki 1.
Karakterizacija
Analize vzorcev SEC-MALS smo izvajali pri sobni temperaturina tekočinskem kromatografu s črpalko Hewlett Packard 1100 Series, laserskim fotometrom Dawn-DSP s He-Ne laserjem (20 = 633 nm) in interfero-metričnim refraktometrom Optilab-DSP, ki deluje pri isti valovnidolžinikot Dawn-DSP (Wyatt Technology Corp.). Uporabili smo kolono PLgel 3 |om Mixed-E dolžine 30 cm s predkolono ter topilo DMAc z dodatkom LiBr in H3P04 s pretokom 0,8 mL/min. LiBr smo pred uporabo sušili48 h pri200 °C priznižanem tlaku. Topila, ki smo jih uporabili za SEC, smo filtrirali skozi teflonski filter 0,2 |om (Millipore). Injicirali smo 1,0 x IO3 g (koncentracija analita = 1,0 %). Izkoristek eluiranja vzorca iz kolone smo izračunali z upoštevanjem vrednostidn/dc in znane mase injiciranja. Kromatograme smo obdelalis programom Astra 4.50 (Wyatt Technology Corp.).
Analize SEC smo izvajaliprisobnitemperaturina tekočinskem kromatografu Perkin Elmer LC-200 s črpalko Hewlett Packard 1100 Series in diferenčnim refraktometrom (DRI) Agilent 1100 Series. Pogoji analiz
162
MATERIALI IN TEHNOLOGIJE 40 (2006) 4
M. GRIČAR ET AL.: SEC IN SEC-MALS KARAKTERIZACIJA KOPOLIMEROV ASPARAGINSKE KISLINE IN LAKTIDA
posameznih vzorcev so bilienakikot priSEC-MALS. Koncentracija vzorca je bila ca. 1 %, injicirali smo od 20–100 µL. Povprečja molskih mas smo izračunali iz umeritvene krivulje za polistirenske standarde v območju molskih mas 4000 g/mol in 20400 g/mol.
Vrednosti dn/dc za kopolimere smo določili v topilu z optimalno sestavo za posamezni vzorec, določeno s SEC-MALS, z diferenčnim refraktometrom Optilab-DSP (Wyatt Technology, Corp.). Meritve so potekale v DMAc z dodatkom LiBr in H3PO4 (0,01 M – 0,1 M) pri pretoku 0,2 mL/min, 2-mililitrski zanki, valovni dolžini 633 nm in temperaturidetektorja 25 °C. Vrednostidn/dc smo izračunali z uporabo programa DNDC 5.00 (Wyatt Technology, Corp.).
3 REZULTATI IN DISKUSIJA
PrimetodiSEC-MALS uporabljamo zaporedno vezana dva detektorja, laserskifotometer, kimerisipanje svetlobe molekul polimera v raztopini pri več kotih in koncentracijski detektor - diferenčni refraktometer. Zvezo med intenziteto_sipane svetlobe in masnim povprečjem molske mase Mw podaja naslednja enačba910:
kjer je iQ/i0 razmerje intenzitet sipane in vpadne svetlobe, dn/dc inkrement lomnega količnika, no lomni količnik topila, c koncentracija polimera, M molska masa, k valovna dolžina vpadne svetlobe v določenem mediju, r razdalja od molekule, kisipa, do detektorja, e kot sipanja in NA Avogadrovo število.
PLS je topen v polarnih topilih, kot sta DMF ali DMAc. V DMAc je porazdelitev molskih mas vzorca PLS-1/13, izmerjena z diferenčnim refraktometrom, monomodalna oz. ima en vrh, odziv laserskega detektorja pa kaže multimodalno porazdelitev molskih mas (slika 2a). Zato se krivulji kromatograma RI in LS(90°) istega vzorca ne prekrivata. Ker je detektor LS bolj občutljiv za frakcije polimera z visokimi molskimi masami, je krivulja LS(90°) pomaknjena k manjšim elucijskim volumnom v primerjavi s krivuljo RI. Odziv Rl-detektorja je namreč sorazmeren koncentraciji PLS v topilu, odziv laserskega fotometra pa produktu koncentracije in molske mase polimera (c M). Intenzivni vrhovi laserskega detektorja pri nizkih elucijskih volumnih oziroma visokih molskih masah nakazujejo prisotnost asociatov. Asociacijo verig polimera potrjuje 3D-dia-gram (slika 2b), kjer intenziteta LS-signala narašča s padajočim kotom sipanja, kar potrjuje prisotnost zvrsti z visoko molsko maso91016. Do asociacije med verigami polimera najverjetneje pride zaradi H-vezi med estrskimi skupinami laktidnih enot in amidnimi skupinami sukcinimidnih enot kopolimera. Asociacija je lahko tudi posledica elektrostatskih interakcij med dvofunkcional-nimi ionskimi nečistočami, ki nastanejo pri razpadu DMAc1215 in polarnimi skupinami laktidnih in sukcini-
MATERIALI IN TEHNOLOGIJE 40 (2006) 4
midnih enot11,15. Posledica asociacije molekul so večji hidrodinamski volumen polimera in previsoka povprečja molskih mas. Intenziteta LS-signala neasociiranega polimera pri elucijskem volumnu ca. 7 mL je neodvisna od kota sipanja, kar je značilnost manjših makromolekul. Izkoristek elucije vzorca iz kolone 98–100 % dokazuje, da se vzorec na kolonine zadržuje.
Da bi preprečili asociacijo polimera, smo topilu DMAc dodali elektrolit LiBr. LiBr z DMAc tvori kompleks s sestavo Š(DMAc)nLi]+Br–. Zaradi ionskih dipolarnih interakcij se ioni Li+ koordinirajo z negativnimi karbonilnimi kisikovimi atomi amidnih skupin, ioni Br– pa s pozitivnimi dušikovimi atomi amidnih skupin DMAc25. Nastali kompleks interagira s kopolimerom in polnilom kolone in s tem ščiti naboje na verigi kopolimera in polnila kolone16. Dodatek LiBr vpliva tudi na ionsko moč eluenta. Če je ionska moč mobilne faze previsoka, prihaja do hidrofobnih interakcij med laktidnimi enotami kopolimera in nepolarnim polnilom kolone, predvsem pri kopolimeru PLS-1/13 z višjim deležem laktidnih enot13,14. Zato je pri optimizaciji mobilne faze potreben kompromis18. Da bi bila ionska moč eluenta čim nižja, smo zmanjšali koncentracijo LiBr in dodali H3PO4, ki pomakne ravnotežje disociacije karboksilne skupine v smeri nedisociirane oblike. Zaradi razlik v sestavi obeh kopolimerov oz. deležev LTD in Asp smo mobilno fazo optimirali za vsak kopolimer posebej, tako da smo spreminjali koncentracijo elek-
Slika 2: a) SEC-MALS-kromatogram PLS-1/13 v DMAc in porazdelitev molske mase v odvisnosti od elucijskega volumna, — DRI odziv, —- LS (90°) odziv, Mw= 1,63 x 106 g/mol, Mn= 2,67 x 105 g/mol, PDI = 6,1, izkoristek elucije vzorca iz kolone 100 %; b) LS-krivulje PAL-1/13 pri različnih kotih sipanja (3-18) v DMAc Figure 2: a) SEC-MALS chromatogram of PLS-1/13 in DMAc and molar mass vs. elution volume, — DRI response, —- LS response, Mw=1.63 x 106 g/mol, M= 2.67 x 105 g/mol, PDI = 6.1, mass recovery 100 %; b) the LS curves of PLS-1/13 at different scattering angles (marked 3-18) in DMAc.
163
M. GRICAR ET AL.: SEC IN SEC-MALS KARAKTERIZACIJA KOPOLIMEROV ASPARAGINSKE KISLINE IN LAKTIDA
Slika 3: SEC-MALS-kromatogram PLS-1/13 v 0,01 M LiBr, 0,01 M H3PO4/DMAC in porazdelitev molske mase v odvisnosti od elucijske-ga volumna, — DRI odziv, —- LS (90°) odziv, Mw= 4,26 X IO5 g/mol, Mn= 1,04 X 10 g/mol, PDI = 2,4, izkoristek elucije vzorca iz kolone 100 %
Figure 3: SEC-MALS chromatogram of PLS-1/13 in 0.01 M LiBr, 0.01 M H3PO4/DMAC and molar_mass vs. elution volume, — DRI response, —- LS (90°) response, Mw= 4.26 X IO5 g/mol, Mn= 1.04 X 105 g/mol, PDI = 2.4, mass recovery 100 %
Slika 4: SEC-MALS-kromatogram PLS-1/6 v 0,1 M LiBr, 0,1 M H3PO4/DMAC in porazdelitev molske mase v odvisnosti od elucijskega volumna, — RI odziv, — LS (90°) odziv, Mw= 5,42 X 105 g/mol, Mn= 1,73 X 105 g/mol, PDI = 3,1, izkoristek elucije vzorca iz kolone 100 %
Figure 4: SEC-MALS chromatogram of PLS-1/6 in 0.1 IVILiBr, 0.1 M H3PO4/DMAC, — RI response, —- LS (90°) response, Mw= 5.42 X 105 g/mol, Mn= 1.73 X IO5 g/mol, PDI = 3.1, mass recovery 100 %
trolitov v območju od 0,01  M do 0,1  M LiBr in H3PO4/DMAC.
Optimalna sestava mobilne faze za kopolimer PLS-1/13 je bila 0,01 M LiBr in H3P04 v DMAc (slika 3), za kopolimer PLS-1/6, ki ima višji delež aspara-ginskih enot v primerjavi s PLS-1/13, pa je bila 0,1 M
LiBr in H3P04 v DMAc (slika 4). Za preprečitev asociacije kopolimera s H-vezmi in sekundarnih mehanizmov ločevanja je bila za kopolimer PLS-1/6 potrebna višja ionska moč eluenta. Vzorec se ni zadrževal na koloni, saj je bil izkoristek elucije vzorca iz kolone 100 %.
V literaturi je opisana določitev povprečij in porazdelitve molskih mas (MMA in MMD) PLS s konvencionalno SEC s polistirenskimi standardi6, čeprav polistiren zaradi razlik v strukturi v primerjavi s PLS ni najprimernejši standard za določitev MMA in MMD kopolimerov PLS23. Izmerjena MMA vzorcev PLS s podobno sestavo6 so bila malo višja kot MMA naših vzorcev, vendar pa precej nižja od absolutnih vrednosti MMA.
Primerjava relativnih in absolutnih povprečij obeh kopolimerov (tabela 1) je pokazala, da sta relativno masno povprečje (Mw) in relativno številčno povprečje (Mn) vzorcev PLS-1/6 in PLS-1/13 za en do dva reda velikosti manjša kot absolutne vrednosti. Vzrok za tako velike razlike med relativnimi in absolutnimi MMA ne moremo pripisati samo razlikam v kemijski sestavi PS-standardov in PLS-vzorcev, ampak tudi bolj kompaktni konformaciji PLS-kopolimerov v primerjavi s PS-standardienake molske mase. Vzrok je lahko tudi razvejena struktura kopolimera. V nasprotju s termo-dinamsko dobrim topilom, v katerem polimer zavzame konformacijo naključnega klobčiča, zavzame kopolimer PLS v polarnem DMAc, kije boljše topilo za polarne asparaginske enote kot za nepolarne laktidne enote, bolj kompaktno konformacijo (kroglica). Nepolarne laktidne enote molekule so v takem primeru obdane s polarnimi asparaginskimi enotami. Razlika med relativnimi in absolutnimiMAA je večja prikopolimera PLS-1/13 z višjim deležem laktidnih enot zaradi močnih intramole-kulskih interakcij med laktidnimi enotami, kar vodi do bolj kompaktne konformacije kopolimera v raztopini in posledično do manjšega hidrodinamskega volumna in nižjih molskih mas.
Primerjava absolutnih in relativnih povprečij molskih mas kopolimerov PLS dokazuje, da je hidrodinamski volumen PLS v izbranem topilu odvisen ne le od velikosti makromolekul in njihove sestave, ampak tudi od vrste interakcij in njihove intenzitete.
Tabela 1:_Primerjava rezultatov SEC in SEC-MALS za PLS-1/13 v 0,01 M LiBr, 0,01 MJT3PO4/DMAC in PLS-1/6 v 0,1 M LiBr in H3K)4 v DMAc. Mw- masno povprečje molske mase, Mn- številčno povprečje molske mase, Mv/Mn- indeks polidisperznosti (PDI), k - ŠMw ali Mn(absolutna)]/ŠMw ali Mn(relativna)]
Table 1: A comparison of SEC and SEC-MALS resultsjor PLS-1/13 in 0.01 M LiBr, 0.01 M H3PO4/DMAC and PLS-1/6 in 0.1 M LiBr and H3PO4 in DMAc. Mw- weight average molar mass, Mn- number average molar mass, Mv/Mn- polydispersity index (PDI), k - ŠMw or Mn(absolute)]/ ŠMw or Mn(relative)]
Povprečja molskih mas in PDI	PLS-1/13			PLS-1/6		
	SEC-MALS	SEC	k	SEC-MALS	SEC	k
Mw g/mol)	1,04 x 106	9560	109	5,42 x 105	12200	44
Mn(g/mol)	4,26 x 105	6300	68	1,73 x 105	7700	22
MJM„	2,4	1,5	-	3,1	1,9	-
164
MATERIALI IN TEHNOLOGIJE 40 (2006) 4
M. GRIČAR ET AL.: SEC IN SEC-MALS KARAKTERIZACIJA KOPOLIMEROV ASPARAGINSKE KISLINE IN LAKTIDA
4 SKLEPI
Sintetizirali smo kopolimera asparaginske kisline Asp, in laktida LTD, poli(sukcinimid-ko-laktid) z razmerjem komonomerov Asp : LTD = 1/6 in 1/13. Določili smo povprečja in porazdelitve molskih mas z izklju-čitveno kromatografijo v kombinaciji z detektorjem na sipanje svetlobe pri več kotih (SEC-MALS) in z izklju-čitveno kromatografijo (SEC) relativno na polistirenske standarde. Po dostopnih literaturnih podatkih je to prva analiza SEC-MALS PLS-kopolimerov. Za posamezno sestavo kopolimera je bila potrebna optimizacija mobilne faze, da smo dosegli ločitev molekul izključno po velikosti.
S primerjavo absolutnih in relativnih MMA smo ugotovili, da so absolutna MMA za en do dva reda velikosti višja od relativnih vrednosti. To smo pripisali razlikam v kemijski strukturi PS-standardov in PLS-kopolimerov ter bolj kompaktni konformaciji PLS-kopolimerov v topilih zaradi intramolekulskih hidrofobnih interakcij med laktidnimi enotami in razvejenja kopolimera. Razmerje absolutnih in relativnih MMA je bilo zaradi večjega deleža laktidnih enot dosti višje pri PLS-1/13 v primerjavi s PLS-1/6, kar smo pripisali bolj kompaktni konformaciji kroglice zaradi močnih hidrofobnih interakcij8,11.
Čeprav na splošno velja, da imajo rezultati SEC-analiz za posamezne polimere primerjalno vrednost, pa smo na primeru amfifilnih kopolimerov aspara-ginske kisline in laktida pokazali, da so razlike v relativnih molskih masah kopolimerov različne sestave in strukture zelo velike in da lahko vodijo do napačnih sklepov. Temu se lahko izognemo le z uporabo metode SEC-MALS za določitev absolutnih povprečij in porazdelitev molskih mas.
Zahvala
Avtorji se zahvaljujo Ministrstvu za visoko šolstvo, znanost in tehnologijo ter Javni agenciji za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije za finančno podporo (program P2-0145, usposabljanje mlade raziskovalke M. G.).
5 LITERATURA
1 K. Matsubara, T. Nakato, M. Tomida, End Group and Irregular Structure Analysis in Thermally Prepared Sodium Polyaspartate by 1H and 13C NMR Spectroscopy, Macromolecules, 31 (1998), 1466–1472
2 T. Kakuchi, Relationship between Structure and Properties of Poly(aspartic acid)s, Macromolecules, 31 (1998), 2107–2113
3 E. W. Neuse, A. Perlwitz, S. Schmitt, Water soluble polyamides as potential drug cariers, II, Angew. Makromol. Chem., 181 (1990), 153–170
4 M. Balkcom, B. Welt, K. Berger, Notes from the Packaging Laboratory: Polylactic Acid – An Exciting New Packaging Material, University of Florida, Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences
5 A. Sodergard, M. Stolt, Properties of lactic acid based polymers and their correlation with composition, Prog. Polym. Sci., 27 (2002), 1123
MATERIALI IN TEHNOLOGIJE 40 (2006) 4
H. Shinoda, Y. Asou, A. Sutsugu, K. Tanaka, Synthesis and characterization of Amphiphilic Biodegradable Copolymer, Poly(aspartic acid-co-lactic acid), Macromol. Biosci., 3 (2003), 34 H. Liang, C. Chen, S. Chen, A. R. Kulkarni, Y. Chiu, M. Chen, H. Sung, Paclitaxel-loaded poly(?-glutamic acid)-poly(lactide) nano-particles as a target drug delivery system for treatment of liver cancer, Biomaterials, 27 (2006), 2051–2059
A. R. Cooper, Molecular weight averages and distribution functions v Determination of Molecular Weight, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1989, 1–6
P. Kratochvil, Classical light scattering from polymer solutions, Polymer Science Library 5, Elsevier, Amsterdam, 1987 P. J. Wyatt, Light scattering and absolute characterization of macro-molecules, review, Anal. Chim. Acta, 272 (1993), 1–40 M. G. Styring, A.E. Hamielec, Determination of molecular weight distribution by gel permeation chromatography in: Determination of molecular weight, John Wiley&Sons, New York, 1989, 263–300 H. G. Barth, Non size exclusion effects in high performance size exclusion chromatography in: Detection and data analysis in size exclusion chromatography, The Gildden Company, American Chemical Society, Washington, DC, 1987, 29–46 K. Štulik, V. Pacakova, M. Ticha, Review, Some potentials and drawbacks of contemporary size-exclusion chromatography, J. Biochem. Biophys. Meth., 56 (2003), 1–13
I. V. Blagodatskikh, M. V. Sutkevich, N. L. Sitnikova, N. A. Churochkina, T. A. Pryakhina, O. E. Philippova, A. R. Khokhlov, Molecular mass characterization of polymers with strongly interacting groups using gel permeation chromatography-light scattering detection, J. Chromatogr. A, 976 (2002), 155–164 M. L. Dias, E. B. Mano, C. Azuma, Size exclusion behavior of polymers in amide solvents – III. Elution characteristics of acrylic polymers in N,N-dimethylacetamide, Eur. Polym. J., 33 (1997), 559–564
E. Žagar, M. Žigon, Solution properties of carboxylated polyuretanes and related ionomers in polar solvents (DMF and LiBr/DMF), Polymer, 41 (2000), 3513–3521
E. Žagar, M. Žigon, T. Malavašič, Lastnosti razredčenih raztopin poliuretanskih ionomerov, Kovine zlit. tehnol., 30 (1996) 1–2, 91–94 Y. Mukoyama, H. Sugitani, S. Mori, Effects of addition of lithium bromide and phosphoric acid in size exclusion chromatography of polyamide-imide and polyamic acid, J. Appl. Polym. Sci.; Polym. Symp., 52 (1993), 183–191
N. Shimizu, T. Sakata, Elution behavior of polyamic acid and polyamide-imide in size-exclusion chromatography, J. Chromatogr., 588 (1991), 195–200
T. Bikova, A. Treimanis, Problems of MMD analysis of cellulose by SEC using DMA/LiCl: A review, Carbohydr. Polym., 48 (2002), 23–28
P. S. G. Krishnan, S. Veeramani, R. H. Vora, T. Chung, S. Uchi-mura, H. Sugitani, Molecular mass determination of polyamic acid ionic salt by size-exclusion chromatography, J. Chromatogr. A, 977 (2002), 207–212
B. Wittgren, A. Welinder, B. Porsch, Molar mass characterization of cationic methacrylate-ethyl acrylate copolymers using size-exclusion chromatography with on line size-exclusion chromatography with online multi-angle light scattering and refractometric detection, J. Chromatogr. A, 1002 (2003), 101–109
D. R. Scheuing, Size exclusion chromatography of polyelectrolytes in dimethyformamide, J. Appl. Polym. Sci., 29 (1984), 2819–2828 P. L. Dubin, S. Koontz, K. L. Wright, Substrate-Polymer Interactions in Liquid Exclusion Chromatography (GPC) in N,N-Dimethyl-formamide, J. Polym. Sci., 15 (1977), 2047–2057 B. Morgenstern, H.-W. Kammer, Solvation in Cellulose – LiCl-DMAc Solutions, Trends Polym. Sci., 4 (1996) 87–92
165