Ekološke analize in monitoring Praktični pouk iz bioloških analiz za program naravovarstveni tehnik Naslov: Ekološke analize in monitoring Podnaslov: Praktični pouk iz bioloških analiz za program naravovarstveni tehnik Avtorice: Alenka Sedlar Špehar, Mateja Okleščen, Alenka Mavrič Čefarin, Urška Kleč, Natalija Horvat, Marija Drešček Besedilo je uredila: Natalija Horvat Strokovni pregled: Mojca Strgar, Rozalka Mohorič Jezikovni pregled: Center RS za poklicno izobraževanje Slike: Alenka Sedlar Špehar, Alenka Mavrič-Čefarin, Urška Kleč, splet Oblikovanje: Silveco d.o.o. Založnik: Center RS za poklicno izobraževanje Elektronska izdaja Ljubljana 2024 Publikacija je v elektronski obliki dostopna na spletni strani Centra RS za poklicno izobraževanje www.cpi.si Nosilec avtorskih pravic: Center RS za poklicno izobraževanje Delovni zvezek je nastal v okviru izvajanja ukrepa Podnebni cilji v vzgoji in izobraževanju, ki ga financira Ministrstvo za okolje, podnebje in energijo, s sredstvi Sklada za podnebne spremembe. Publikacija je brezplačna. CIP COBISS ID 184174595 Kataložni zapis o publikaciji (CIP) pripravili v Narodni in univerzitetni knjižnici v Ljubljani COBISS.SI-ID 184174595 ISBN 978-961-7139-41-9 (PDF) Praktični pouk iz bioloških analiz 3 KAZALO VSEBINE 1 UVOD ......................................................................................................................................... 5 2 MIKROBIOLOŠKI KAZALNIKI ..................................................................................................... 6 2.1 Priprava laboratorijskega inventarja ..............................................................................9 Sterilizacija laboratorijskega inventarja ........................................................................................................................ 9 2.2 Priprava hranilnih podlag za mikroorganizme ............................................................... 10 Priprava različnih gojišč .............................................................................................................................................. 11 2.3 Bris z različnih površin .................................................................................................. 15 Bris z različnih površin ................................................................................................................................................ 17 2.4 Razmaz do posameznih kolonij ..................................................................................... 19 Razmaz do posameznih kolonij .................................................................................................................................. 20 2.5 Določevanje celokupnega števila mikroorganizmov iz vodnih vzorcev .......................... 22 Določevanje celokupnega števila mikroorganizmov iz vodnih vzorcev ..................................................................... 23 2.6 Določevanje koliformnih organizmov ........................................................................... 26 Določevanje koliformnih organizmov ........................................................................................................................ 27 2.7 Določevanje prisotnosti E. coli ...................................................................................... 28 Določevanje prisotnosti E. coli ................................................................................................................................... 29 2.8 Določevanje mikrobiološke kvalitete zraka ................................................................... 31 Določevanje mikrobiološke kvalitete zraka ................................................................................................................ 32 2.9 Izolacija gliv iz tal ......................................................................................................... 33 Izolacija gliv iz tal ........................................................................................................................................................ 34 3 RASTLINSKI KAZALNIKI ............................................................................................................ 36 3.1 Vzorčenje onesnaženosti zraka preko epifitskih lišajev ................................................. 36 Določanje indeksa zračne čistosti (Indey of Athmospheric Purity – IAP) .................................................................. 38 3.2 Vzorčenje fitobentosa .................................................................................................. 42 Določanje ekološkega stanja vodotoka s kremenastimi algami ................................................................................. 42 3.3 Vzorčenje makrofitov ................................................................................................... 44 Določanje ekološkega stanja vodotoka z makrofiti .................................................................................................... 45 3.4 Vzorčenje višje razvitih rastlin ...................................................................................... 49 Določevanje biotske pestrosti na travnikih ................................................................................................................ 49 Določevanje pokrovnosti posameznih vrst na izbrani površini ................................................................................. 55 Določevanje gostote posameznih vrst ....................................................................................................................... 59 3.5 Vzorčenje gozda ........................................................................................................... 61 Popis osnovnih podatkov vzorčnega mesta gozdne inventure .................................................................................. 62 Popis znakov, ki so vezani na odmrlo maso ............................................................................................................... 66 4 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 4. ŽIVALSKI.KAZALNIKI ................................................................................................................ 69 4.1 Spremljanje stanja ptic okoli nas .................................................................................. 69 Spremljanje stanja ptic okoli nas ................................................................................................................................ 69 4.2 Vzorčenje dvoživk ......................................................................................................... 72 Analiza mresta ............................................................................................................................................................ 74 Analiza juvenilnih in odraslih dvoživk ......................................................................................................................... 77 4.3 Vzorčenje bentoških nevretenčarjev ............................................................................. 80 Vzorčenje bentoških nevretenčarjev z mrežo ............................................................................................................ 80 Vzorčenje bentoških nevretenčarjev s pastmi ........................................................................................................... 85 4.4 Vzorčenje talne favne ................................................................................................... 87 Vzorčenje talne favne ................................................................................................................................................. 87 Določevanje talne favne v substratu z lijakom ........................................................................................................... 90 5 TUJERODNE VRSTE .................................................................................................................. 93 Popis tujerodnih vrst ................................................................................................................................................. 94 5.1 Herbarij ........................................................................................................................ 96 Izdelava herbarija ....................................................................................................................................................... 96 6 LITERATURA ............................................................................................................................. 98 7 PRILOGE ................................................................................................................................... 99 8 VIRI SLIK ................................................................................................................................ 101 Praktični pouk iz bioloških analiz 5 1 UVOD Ekološki kazalniki kvalitete okolja nam podajo zanimive informacije o tem, kako močno vplivamo na okolje. Ta vpliv je pogosto uničujoč. Z monitoringom lahko izboljšamo stanje v okolju. Najbolj proučevan sistem je vodni sistem. Ščiti ga Direktiva o določitvi okvira za ukrepe Skupnosti na področju vodne politike – na kratko Vodna direktiva, ki narekuje izvajanje biološkega monitoringa. VODNA DIREKTIVA – zakonodajni dokument na ravni EU BENTOŠKI FITOBENTOS, FITOPLANKTON RIBE NEVRETENČARJI MAKROFITI Slika 1: Spremljanje bioloških parametrov po Vodni direktivi Kopenske ekosisteme varujemo s pravnimi akti. Eden takih je Direktiva o varovanju habitatov ter prosto živečih živalskih in rastlinskih vrst – na kratko Habitatna direktiva. HABITATNA DIREKTIVA – zakonodajni dokument na ravni EU VRSTE V SLOV. VRSTE V EU- INTERESU HABITATNI TIPI HABITATI INTERESU Slika 2: Spremljanje stanja organizmov in habitatov na račun Habitatne direktive 6 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 2 MIKROBIOLOŠKI KAZALNIKI V mikrobiološkem laboratoriju delamo z živimi organizmi ali z njihovimi produkti. Zato moramo ravnati tako, da zaščitimo sebe, druge in okolje. Temu rečemo varnostni ukrepi. Ukrepi so odvisni od rokovanja s kužnimi povzročitelji bolezni. Tabela 1: Razvrstitev kužnih povzročiteljev bolezni po stopnjah nevarnosti, ki ga je razpisala Evropska skupnost Stopnja nevarnosti Opis mikroorganizmov, s katerimi rokujemo Primer mikroorganizmov 1 Mikroorganizmi ne povzročajo bolezni pri človeku. Laktobacili Mikroorganizmi povzročajo bolezen pri človeku, zato rokovanje z njimi 2 lahko predstavlja nevarnost. Širjenje v okolje pa ni nevarno, saj obstajata E. coli učinkovita preventiva in zdravljenje. 3 Mikroorganizmi povzročajo hudo bolezensko stanje pri človeku. Možno je širjenje v okolje. Običajno obstajata preventiva in zdravljenje. Salmonela 4 Mikroorganizmi povzročajo hudo bolezensko stanje, rokovanje z njimi predstavlja resno nevarnost za delavca. Učinkovitega zdravljenja še ni. Brucella Pri svojem delu se moramo držati principa biološke varnosti. Tako pred začetkom dela najprej preverimo, ali smo ustrezno zaščiteni. Tabela 2: Bariere biološke varnosti Obvezna uporaba osebne zaščitne opreme: - oprana in zlikana bela halja Primarna bariera - speti lasje - po potrebi zaščita za oči, obraz ali roke - uporaba varnostne komore (npr. laminarij) Izvajanje dela v posebnem laboratoriju, ki je ločen od ostalega dela stavbe tako, da Sekundarna bariera ne prihaja do izmenjave zraka. Poskrbimo za čisto in pospravljeno delovno površino. Uporabljamo le robustno pohištvo. Terciarna bariera Zgradba mora imeti ustrezno ventilacijo preko prezračevalnega filtra. Šele ko smo prepričani, da smo poskrbeli za varnost, lahko začnemo z delom. Ker se med delom lahko pripetijo nesreče, postopamo po naslednjem protokolu. 1. Takoj obvestimo vodjo laboratorija in svoje sodelavce. 2. Razlito mikrobno kulturo polijemo z razkužilom, pokrijemo z robčkom in po 30 min delovanja odvržemo vse v varni zabojnik. 3. Kontaminirano mesto očistimo in razkužimo. 4. Umijemo si roke in nadaljujemo z delom. V primeru, da nam mikrobna kultura brizgne v oko, temeljito speremo. Če se zbodemo ali urežemo, pustimo, da kri kratek čas teče, nato umijemo rano z milom, razkužimo z etanolom in sterilno obvežemo. O incidentu vedno napišemo zapisnik. Delo v mikrobiološkem laboratoriju zahteva aseptično tehniko. Vse mikrobiološke preiskave, od odvzema vzorca in do končne identifikacije mikrobov, morajo biti opravljene aseptično. Praktični pouk iz bioloških analiz 7 To pomeni, da s kužnino ali kulturami mikroorganizmov delamo tako, da: - onemogočimo dostop nezaželenim mikroorganizmom, ki bi kontaminirali naše kulture in zaradi katerih bi bili rezultati poskusov napačni; - pazimo, da mikroorganizmov ne razširjamo, kajti utegnili bi okužiti sebe ali druge. Material, ki ga uporabljamo pri mikrobiološkem delu, mora biti sterilen. To pomeni, da moramo odstraniti vse vegetativne in žive oblike celic. To lahko naredimo na več načinov, odvisno od lastnosti materialov. NAČINI STERILIZACIJE • Toplotna sterilizacija Slika 3: Aseptično delo običajno poteka ob gorilniku Gre za proces, kjer s pomočjo povišane temperature uničimo celice in spore. znotraj rumenega območja1 Zelo primerna je za stekleni in kovinski material. Poznamo več postopkov. » Vlažna sterilizacija poteka v avtoklavu, kjer z vodno paro pod pritiskom 1,2 atm pri 121 °C za 15-20 min uničimo vse mikroorganizme. » Suha sterilizacija poteka v sterilizatorju pri 160 °C za 3 ure ali pri 170°C za 2 uri ali pri 180 °C za 1 uro. » Tindalizacija je tridnevni postopek, kjer material zapremo v ekonom loncu in vsebino 3-krat segrevamo 30 min pri 100 °C s 24-urnim presledkom. » Obžiganje cepilnih zank do zažaritve pred uporabo skrajša postopek sterilizacije. Včasih spatulo namočimo v etanol in nato potegnemo skozi plamen, da zgorijo razkužilo in celice. Slika 4: Pri obžiganju moramo imeti močan plin2 • Sterilizacija s filtracijo Gre za postopek steriliziranja tekočin, občutljivih na temperaturo. Običajno to počnemo pri manjšem volumnu antibiotikov, vitaminov in drugih dodatkov. - Filtracija skozi 0,45µm pore zadrži večji del mikroorganizmov. - Filtracija skozi 0,22 µm pore zadrži vse bakterije, praživali in glive. 1 Sanders, 2012 2 Ike, 2011 8 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING Slika 5: Filter papir se zelo hitro zamaši ali pa strga3 • Sterilizacija s sevanjem Primerna je pri razkuževanju prostora, redkeje za sterilizacijo inventarja. Poznamo ionizirajoče in neionizirajoče sevanje. » Ionizirajoče sevanje Uporaba gama žarkov je primerna za sterilizacijo plastike, brizge, gumijastih rokavic, hrane … Tovrstno elektromagnetno sevanje namreč prodre globoko v material. » Neionizirajoče sevanje Uporaba UV svetlobe je primerna za razkuževanje prostorov in laminarijev. Tovrstno elektromagnetno sevanje vpliva le na številčnost mikroorganizmov na površini materiala. • Sterilizacija s plini Je skrajni primer, ko ni možno drugače sterilizirati prostorov in materialov. » Etilenoksid uporabljamo v posebni komori pri 50-60 °C, saj je nevaren za zdravje. Uporabljamo ga le za toplotno neodporne materiale. » Formaldehid uporabljamo v bolnišnicah za sterilizacijo toplotno neodpornih materialov. Tudi tukaj potrebujemo posebno komoro, ki zagotavlja neprodušnost, temperaturo 60-75 °C in 80-100 % vlažnost. Poznamo tudi druge načine uničevanja mikroorganizmov, kot sta pasterizacija in razkuževanje. • Pasterizacija Gre za uničevanje patogenih organizmov. - Dolgotrajna pasterizacija poteka 30 min pri 62–65 °C. - Kratkotrajna pasterizacija poteka 15-45 sekund pri 72–75 °C. - Trenutna pasterizacija poteka 5-15 sekund pri 85 °C. • Razkuževanje Gre za odstranjevanje oziroma zmanjševanje števila mikroorganizmov na neki površini. Pri tem lahko uporabljamo bakteriocide, bakteriostatike ali bakteriolitike. 3 Whatman, 2006 Praktični pouk iz bioloških analiz 9 2.1 Priprava laboratorijskega inventarja PRAKTIČNA VAJA Sterilizacija laboratorijskega inventarja MATERIAL IN PRIPOMOČKI - vatirane palčke, - steklene čaše, - 100-mililitrske bučke, - epruvete, - fiziološko raztopino, - steklene palčke. METODA DELA • Vatirano palčko trdno zavijte v alu folijo, nakar vse palčke postavite v večjo čašo in avtoklavirajte ( eno na dijaka). • Steklene čaše pokrijte z alu folijo in jih sterilizirajte s suho toploto ( dve na dijaka). • Pri 100-mililitrski bučki s pokrovom vrhnji del ovijte z alu folijo in jo sterilizirajte s suho toploto ( eno na dijaka). • Pri epruvetah s pokrovom preverite trdnost pokrovov. Ti ne smejo sami pasti z epruvete, če jo obrnemo na glavo, in hkrati ne smejo biti preveč čvrsto zataknjeni. Epruvete zložite v večjo čašo, pokrijte z alu folijo in avtoklavirajte ( pet na dijaka). • Pripravite fiziološko raztopino tako, da 9 g NaCl raztopite v 1 l destilirane vode. Raztopino zaprete v stekleno steklenico in avtoklavirajte ( 250 ml na dijaka). • Stekleno palčko zavijte v alu folijo tako kot vatirane palčke in avtoklavirajte ( eno na dijaka). NALOGE 1. Navedite laboratorijske pripomočke, ki so primerni za: • avtoklaviranje, • suho sterilizacijo, • filtriranje, • obžiganje. 2. Zakaj je potrebno določen laboratorijski material sterilizirati? 3. Kakšna je razlika med pasterizacijo in sterilizacijo? 4. Kdaj uporabljamo razkuževanje? 10 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 2.2 Priprava hranilnih podlag za mikroorganizme Za gojenje mikroorganizmov v laboratorijih potrebujemo hranilne podlage ali substrate, iz katerih mikroorganizmi črpajo hranilne snovi in vodo. Gojišča lahko uporabimo tudi za shranjevanje in transport. Pred uporabo morajo biti sterilna. Za gojenje bakterij uporabljamo po konsistenci različne hranilne podlage. Tako poznamo: tekoča gojišča, poltrda gojišča, trda gojišča. - Tekoča gojišča ne vsebujejo sredstva za strjevanje gojišč. Pogosto jih uporabljamo pri redčitveni tehniki ali pri hitrem namnoževanju mikroorganizmov. - Poltrda gojišča vsebujejo nižji delež agar agarja ali želatine. Pogosto imamo pripravljena poševna gojišča v epruvetah, primernih za shranjevanje kultur. - Trda gojišča vsebujejo približno 20 g agar agarja na 1 l gojišča. Trda gojišča so primerna za raziskovalne naloge, namnoževanje mikroorganizmov, transport ali shrambo. Sestava gojišča je odvisna od vrste, ki jo želimo namnoževati. Tako ločimo gojišča na: • naravna: nestandardizirano gojišče (mleko, korenje, riž, krompir …), • sintetična: umetni substrati imajo zmesi različnih hranil, ki omogočajo rast in razmnoževanje mikroorganizmov v umetnih pogojih. Glede na uporabo in način delovanja uporabljamo različne tipe gojišč: minimalna, obogatena, selektivna in diferencialna gojišča. • Minimalna gojišča vsebujejo le najnujnejše sestavine za rast večine heterotrofnih mikroorganizmov. Vir ogljika je saharid (mono-, di-), ostalo pa so anorganske soli. • Obogatena gojišča vsebujejo snovi, ki spodbujajo rast določenih vrst. Tako lahko dodamo kri, serum, ostanke izločkov ali živalska tkiva. • Selektivna gojišča onemogočajo rast enim vrstam in spodbujajo rast drugih. Tako lahko npr. kot vir ogljika dodamo celulozo. • Diferencialna gojišča vsebujejo snovi / reagente, ki omogočajo ločevanje različnih vrst med seboj, npr. glede na obarvanost kolonij. Praktični pouk iz bioloških analiz 11 PRAKTIČNA VAJA Priprava različnih gojišč MATERIAL IN PRIPOMOČKI - dehidrirana gojišča in destilirana voda - žlička - erlenmajerica - steklena palčka in oprijemalne škarje/klešče - trinožno stojalo s keramično mrežico - epruveta s pokrovom v stojalu za epruvete - krpa - Durhmanova cevka - vata in alu folija - sterilne petri plošče METODA DELA 1. PRIPRAVA HRANILNE PODLAGE • Sterilne petri plošče označite z osnovnimi podatki: vrsta gojišča, razred, ime raziskovalca, datum priprave. Slika 6: Petri ploščo označimo z osnovnimi podatki • Nato stehtajte dehidrirano gojišče, ga dajte v erlenmajerico s širokim vratom in dodajte ustrezno količino destilirane vode (23 g HA …1000 ml dH O). 2 • Gojišče sterilizirajte: Na zmernem ognju naj vre 10 min, pri tem konstantno mešajte. Paziti morate, da se gojišče ne zapeni ali pa da ne uide iz erlenmajerice. • Ob prižganem gorilniku postavite gojišče in počakajte, da se ohladi na 40 °C. 12 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING • Gojišče razlijte v petri plošče aseptično ob plamenu gorilnika in ga s krožnimi gibi enakomerno porazdelite. Slika 7: V petri plošče nalijemo do 15 ml gojišča • Ko se gojišče strdi, petri plošče zavijte v alu folijo in shranite v hladilnik. Slika 8: Gojišča morajo biti shranjena tako, da so obrnjena na glavo 2. PRIPRAVA BRILLA ZELENEGA BUJONA • Najprej izberite prave epruvete s pokrovom, ki so dovolj tesno oprijeti. Epruvete označite (BB, 3.nt, 18. 2.). • Stehtajte ustrezno količino dehidriranega gojišča, ga dajte v erlenmajerico s širokim vratom in dodajte ustrezno količino destilirane vode (40 g BB …1000 ml dH2O). Dodajte magnetno mešalo in gojišče na topli magnetni plošči mešajte 5 minut. • S polavtomatsko pipeto prenesite v vsako epruveto 4,5 ml gojišča. Previdno dodajte Durhmanovo cevko, ki naj bo obrnjena z odprtino navzdol. Pomagajte si s stekleno palčko. Če cevka s silo prileti v dno epruvete, se lahko poškoduje. • Epruvete s pokrovom prenesite v večjo čašo in jih nato avtoklavirajte. Slika 9: Gojišče Brilla zeleni bujon Praktični pouk iz bioloških analiz 13 3. PRIPRAVA YGC AGARJA • Stehtajte dehidrirano gojišče, ga dajte v erlenmajerico s širokim vratom in dodajte ustrezno količino destilirane vode (40 g YGC …1000 ml dH2O). • Iz vate pripravite zamašek, ga namestite na erlenmajerico in pokrijte z alu folijo. • Gojišče avtoklavirajte. • Naslednjič gojišče segrejete (45–50 °C), da se utekočini in nato aseptično razlijte v sterilne petri plošče. • Ko se gojišče strdi, označite plošče z osnovnimi podatki (YGC, 3.nt, ASŠ, 18. 2.). • Gojišče pripravite za shrambo v hladilniku. Slika 10: Preden razlijemo gojišče, moramo vrat erlenmajerice ali steklene posode ožgati4 4. PRIPRAVA PCA AGARJA • Stehtajte dehidrirano gojišče, ga dajte v erlenmajerico s širokim vratom in dodajte ustrezno količino destilirane vode (23,5 g PCA …1000 ml dH O). 2 • Gojišče segrejete do vrelišča in raztopite mešanico. • Iz vate pripravite zamašek, ga namestite na erlenmajerico in pokrijte z alu folijo. • Gojišče avtoklavirajte. • Naslednjič gojišče segrejete, da se utekočini (45–50°C) in nato aseptično razlijte v sterilne petri plošče. • Ko se gojišče strdi, označite plošče z osnovnimi podatki (PCA, 3.nt, ASŠ, 18. 2.). • Gojišče pripravite za shrambo v hladilniku. 3 Crawford, 2016 14 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING NALOGE 1. Na shematski način narišite potek priprave agarja. 2. Aseptično delo preverimo tako, da pripravljena gojišča inkubiramo pri sobni temperaturi za 48 h. Kako uspešni ste bili pri svojem delu? 3. Kje vse se lahko zgodijo napake pri aseptičnem delu? 4. Kaj naredimo s kontaminiranimi gojišči? 5. Kako bi pripravili 1,4 l fiziološke raztopine? 6. Raziščite, katera snov je to in zakaj se jo uporablja: - pepton, - agar agar, - kvasni ekstrakt, - mesni ekstrakt. 7. Zapišite sestavo štirih različnih dehidriranih gojišč in način priprave po navodilih proizvajalca. Tabela 3: Glavne značilnosti najbolj uporabljenih hranilnih podlag HA BB YGC PCA polno ime glede na uporabo, gre za … konsistenca sestava način priprave Praktični pouk iz bioloških analiz 15 2.3 Bris z različnih površin Večino okolij naseljujejo mikroorganizmi in vsaka vrsta ima določene fiziološke in morfološke značilnosti. Te karakteristike lahko popišemo le, če kultiviramo mikroorganizme na gojiščih. Ena od tehnik izolacije mikroorganizmov je bris s površine. Na vajah si bomo pogledali biotsko raznovrstnost na naši koži. Tako lahko izberemo odvzem vzorca z: - dlani, kjer preverjamo čistost in razkuženost rok, - pod prstani, verižicami in zapestnicami, kjer preverjamo higieno nakita, - pod pazduho, kjer preverjamo, kako pot vpliva na prisotnost mikroorganizmov, - brade ali lasišča, kjer preverjamo higieno … Bris lahko izvedemo tudi na različnih površinah: - na laboratorijskih mizah, kjer preverjamo razkuženost delovne površine, - na denarju, kjer preverjamo mikrobiološko onesnaženost, - ali na kakšnih drugih zanimivih površinah. Slika 11: Odtis otroške dlani prikazuje biotsko pestrost na njej5 Slika 12: Prepoznavanje bakterij in gliv temelji na morfoloških značilnosti na gojiščih6 Na gojišču bo zrasla mikrobiološka kultura. To so mikroorganizmi, ki rastejo v gojišču ali na njem. Lahko je mešana ali čista. V čisti kulturi je samo ena vrsta mikroorganizmov, v mešani pa več različnih vrst mikroorganizmov (pestrost mikroorganizmov). Za določanje morfoloških značilnosti je nujno potrebno mikroorganizme najprej izolirati, da dobimo čisto kulturo, kjer so kolonije (skupek celic kot potomk ene same celice) lepo ločene. Za opis morfoloških značilnosti uporabljamo trdna gojišča, ker je rast v kolonijah primerna za opazovanje in opisovanje. Kriteriji določevanja morfoloških značilnosti kolonij mikroorganizmov so: pigmentiranost, prosojnost, oblika, robovi, profil, tekstura oz. površina, ustroj, vonj. 5 Fessenden, 2015 6 Reynolds, 2020 16 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING Pigmentiranost oziroma obarvanost kolonij Prosojnost neprosojne polprosojne prosojne Velikost točka majhna kolonija srednja kolonija velika kolonija Oblika okrogla nepravilna nitasta rizoidna točkovna Robovi celi valoviti krpasti nazobčani nitasti ovalni Profil raven dvignjen konveksen kraterski izbokel Tekstura oziroma površina suha gladka viskozna sluzasta Ustroj krhke kolonije mazave kolonije sluzaste kolonije trde kolonije Vonj se določuje le, če je kultura čista in če ta kultura ne proizvaja spor. Praktični pouk iz bioloških analiz 17 PRAKTIČNA VAJA Bris z različnih površin MATERIAL IN PRIPOMOČKI - sterilna hranljiva trda gojišča - sterilna vatirana palčka in sterilna fiziološka raztopina - gorilnik METODA DELA 1. Bris s kože 2. Bris s površine - Ob prižganem gorilniku namočite vatirano palčko v - Ob prižganem gorilniku namočite vatirano palčko v sterilno fiziološko raztopino. sterilno fiziološko raztopino. - Z vatirano palčko večkrat podrgnite po koži. - Z vatirano palčko večkrat podrgnite po željeni površini. - Ob gorilniku nanesite vzorec z vatirane palčke na sterilno gojišče po zik-zak metodi. - Inokulirano (nacepljeno) gojišče označite in zavijte v folijo. - Na folijo zabeležite osnovne podatke: BRIS, 3.nt, datum. - Sledi inkubacija mikroorganizmov na 22 °C za 48 h. - Petrijevke po inkubaciji shranite v hladilniku do nadaljnjega dela, ko pregledate čistost kulture in morfološke značilnosti izbrane kolonije ter izpolnite spodnje tabele. - Odsluženo gojišče zavijte v alu folijo, avtoklavirajte in nato zavrzite. REZULTATI Preden se lotite izpolnjevanja tabel si postavite hipoteze, ki jih boste poskušali z eksperimentom potrditi. - Kdo v razredu bo imel najbolj mikrobiološko umazano mesto na koži? - Kdo v razredu bo imel največjo mikrobiološko pestrost na dlaneh? - Katera površina bo najbolj mikrobiološko kontaminirana? 18 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI V spodnje tabele vnesite naslednje podatke: • morfološke značilnosti kolonij brisa kože in izbrane površine, • rezultate različnih vzorcev brisov kože in površine od vseh dijakov. Mesto odvzema brisa je . Tabela 4: Morfološke značilnosti kolonij brisa kože Karakteristike Popis 1. kolonije Popis 2. kolonije … pigmentiranost prosojnost velikost oblika rob profil tekstura ustroj številčnost Tabela 5: Primerjava različnih vzorcev brisa kože Vzorec Biotska pestrost Številčnost kolonij med prsti podpazduha lasje Mesto odvzema brisa je . Tabela 6: Morfološke značilnosti kolonij brisa z izbrane površine Karakteristike Popis 1. kolonije Popis 2. kolonije … pigmentiranost prosojnost velikost oblika rob profil tekstura ustroj številčnost Praktični pouk iz bioloških analiz 19 REZULTATI Tabela 7: Primerjava različnih vzorcev brisa s površine Vzorec Biotska pestrost Številčnost kolonij laboratorijska miza umivalnik denar NALOGE 1. Kaj pomeni mešana/čista kultura? 2. Kaj je to aseptično delo in kako poteka? 3. Metodo dela narišite na shematski način. 4. Ali lahko primerjamo številčnost kolonij z različnih plošč? 5. Kaj vpliva na pestrost mikroorganizmov? 6. Zakaj neprestano razkuževanje rok ni dobro za našo kožo in mikrobno floro? 7. Kaj izloča koža, da prepreči vdor nezaželenim mikroorganizmom? 2.4 Razmaz do posameznih kolonij Če želimo določiti vrste mikroorganizmov iz danega vzorca, moramo najprej pridobiti čisto kulturo. Šele potem lahko uporabljamo identifikacijska gojišča, ki so nam v pomoč pri določanju organizmov do vrste natančno. Gre za tako imenovane API teste. 20 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING Slika 13: API testi vsebujejo različna dehidrirana gojišča, ki nam pomagajo pri identifikaciji mikroorganizmov7 PRAKTIČNA VAJA Razmaz do posameznih kolonij MATERIAL IN PRIPOMOČKI - eza–cepilna zanka - gojišče z brisi z različnih površin - sterilna gojišča METODA DELA • Prižgite gorilnik in nastavite močan plamen. • Petrijevko z brisom z različnih površin odpirajte le, če je nujno in vedno proti plamenu (20 cm od ognja). • Izberite eno izmed kolonij na plošči z mešano kulturo in jo izolirajte v čisti kulturi tako, da jo redko cepite na svežo ploščo do posameznih kolonij. • Posamezne kolonije dobite, če kulturo zasejete tako, da jo »redčite« na trdem gojišču v petrijevki. • Kulturo s sterilno ezo nanesite na majhno površino ob robu sterilnega gojišča (1/8 gojišča). Vsako naslednjo serijo potez, označenih s številkami, začnete z ohlajeno sterilno zanko. Potek nanosa prikazuje slika spodaj. • Drugič potegnite po gojišču tako, da zajamete prvi nanos in ga raznesete do ¼ gojišča. • Postopek še enkrat ponovite tako, da tretjič zajamete drugi nanos in ga raznesete na preostali del gojišča. Slika 14: Prikaz izolacije čiste kulture z redčenjem Slika 15: Prikaz več zaporednih razredčitev • Na drugo gojišče poskusite razredčiti štirikrat ter na tretje gojišče petkrat kot prikazuje Slika 15. 7 Aryal, 2019 Praktični pouk iz bioloških analiz 21 • Ustrezno označene petrijevke inkubirajte na 22 oC za 48 ur. • Prihodnjič preverite čistost kulture in morfološke značilnosti izbrane kolonije. • Po končanem delu gojišča zavijte v alu folijo, jih avtoklavirajte in zavrzite. • Pod rezultate narišite debeline kolonij, ki so nastale po inkubaciji. REZULTATI Nacepila se je kolonija iz: . Njene morfološke značilnosti so bile: Dobili smo čisto/mešano kulturo. Slika 16: Razmaz do posameznih kolonij s cepilno zanko 22 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING NALOGE 1. Na spletu raziščite, kaj so to API testi in iz česa so sestavljeni. 2. Opišite postopek sterilizacije cepilne zanke. 3. Ali smo delo (redčitev do posameznih kolonij) opravili aseptično? Kako to preverite? 4. Pri kateri metodi smo prišli do posameznih kolonij (pri 3-kratnem, 4-kratnem ali 5-kratnem redčenju)? 5. Od česa je odvisno, kako hitro bomo prišli do posameznih kolonij? 6. Ali so vse kolonije z enakimi lastnostmi? Odgovor utemeljite. 7. Na kaj nakazuje kolonija, ki ni na črti, ki ste jo opravili s cepilno zanko? 8. Kaj bi naredili, če kultura še vedno ni/ ne bi bila čista? 2.5 Določevanje celokupnega števila mikroorganizmov iz vodnih vzorcev V vzorcih (voda, zemlja …) je lahko zelo veliko ali zelo malo bakterij. Kadar predvidevamo, da bo bakterij veliko, moramo vzorec pred nanosom na gojišče redčiti. Če je rast posameznih kolonij pregosta ali pa kolonije prerastejo celotno gojišče, takih kolonij ne moremo popisati. V mikrobiologiji po navadi uporabljamo 10-kratne razredčitve. Pripravimo redčitev vzorca vse do 10-7, 10-8 in 10-9 redčitve. Na gojišče damo 1 ml razredčine iz vsake redčitvene epruvete in po inkubaciji preštejemo kolonije. Slika 17: Redčenje vzorca v fiziološki raztopini Praktični pouk iz bioloških analiz 23 Tabela 8: Določitev števila bakterij s štetjem na ploščah Končna redčenja na ploščah 1. plošča 2. plošča 3. plošča Št. kolonij Št. kolonij Št. kolonij 10-7 210 187 223 10-8 17 25 19 10-9 3 1 2 Iz dobljenih rezultatov najprej izračunamo povprečje za vsako razredčino posebej: - za razredčino 10-7: vsota vseh kolonij/število paralelk = 620/3 = 207 * 107 CFU/ml, - za razredčino 10-8: vsota vseh kolonij/število paralelk = 61/3 = 20,3 * 108 CFU/ml, - za razredčino 10-9: vsota vseh kolonij/število paralelk = 6/3 = 2 * 109 CFU/ml. - CFU (colony forming units) CFU/ml je enota, ki jo izračunamo: št. kolonij x faktor redčitve / volumen inokuluma (ml) Izračunamo povprečje vseh razredčin: vsota vseh razredčin/št.razredčin = (207 * 107 + 203 * 107 + 200 * 107)/3 = 203 * 107 CFU/ml. PRAKTIČNA VAJA Določevanje celokupnega števila mikroorganizmov iz vodnih vzorcev MATERIAL IN PRIPOMOČKI - sterilne epruvete s pokrovom na stojalu - sterilna fiziološka raztopina - polavtomatska pipeta s sterilnimi nastavki (tipsi) - spatula v čaši z etanolom - sterilna gojišča METODA DELA • V stojalo si pripravite sterilne epruvete s pokrovom tako, da jih označite s številkami od 1 do 6. • Na spodnji strani petri plošče si z alkoholnim flomastrom označite redčitev, temperaturo inkubacije, datum, razred, kratico raziskovalca in ime vzorca. • Prižgite gorilnik na močno jakost. • Ob plamenu gorilnika prenesite 9 ml sterilne fiziološke raztopine s polavtomatsko pipeto z nastavki v epruvete. • Nato prenesite 1 ml vzorca vode v prvo epruveto in premešajte. S pomočjo pipete premešajte razredčino, tako da dvakrat napolnite in izpraznite pipeto. Z isto pipeto odpipetirajte 1 ml razredčine iz prve epruvete ter prenesite v naslednjo in tako nadaljujete do konca. • Glede na to, koliko mikroorganizmov pričakujemo v začetnem vzorcu, prenesite 1 ml razredčine na sterilno gojišče ( 3 gojišča, 3 različne razredčine). Delajte v dveh paralelkah. • Vzamite spatulo iz etanola in previdno potegnite čez plamen. Ob gorilniku počakajte, da plamen na spatuli ugasne, nato 20 sek razmazujete razredčino po gojišču. Zaključite tako, da spatulo odložite v etanol. 24 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING • Inokulirana gojišča preverite, če imajo pravilno označeno vrednost razredčine in ime vzorca. V alu folijo zavijte gojišča tako, da je vsaka paralelka zavita posebej. Nanj zapišite osnovne podatke (ime gojišča, razred, vzorec, temperatura inkubacije) in vsako paralelko inkubirajte pri svoji temperaturi: 22 in 37 °C za 24 oziroma 48 ur. • Po končani inkubaciji popišite morfološke značilnosti kulture, preštejte število kolonij in izračunajte, koliko mikroorganizmov je v 1 ml začetnega vzorca (št. kolonij x razredčitev = CFU/ml). Rezultate vpišite v spodnje tabele. • Odslužena gojišča avtoklavirajte in zavrzite. REZULTATI Tabela 9: Osnovni podatki vzorca vode za določevanje celokupnega števila Datum vzorčenja vode Vzorčevalec Kraj vzorčenja Mesto zajema Način konzerviranja Čas, ki je pretekel od vzorčenja do laboratorijskih vaj Tabela 10: Morfološke značilnosti mikroorganizmov, inkubiranih pri 22 °C Karakteristike Popis 1. kolonije Popis 2. kolonije … pigmentiranost prosojnost velikost oblika rob profil tekstura ustroj številčnost Izračun indeksa biotske pestrosti Praktični pouk iz bioloških analiz 25 Tabela 11: Morfološke značilnosti mikroorganizmov, inkubiranih pri 37 °C Karakteristike Popis 1. kolonije Popis 2. kolonije … pigmentiranost prosojnost velikost oblika rob profil tekstura ustroj številčnost Izračun indeksa biotske pestrosti NALOGE 1. Naravovarstveni tehniki so pripravili redčitev vzorca. Kolikokrat je bil vzorec razredčen v 2., 3. in 4. epruveti? 2. Naravovarstveni tehniki so pripravili redčitev vzorca. Kolikokrat je bil vzorec razredčen v 2., 3. in 4. epruveti? 26 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 3. Določite število bakterij v začetnem vzorcu z gojitveno metodo, če smo dobili naslednji rezultat. Končna redčenja na ploščah 1. plošča 2. plošča 3. plošča Št. kolonij Št. kolonij Št. kolonij 10-6 301 257 273 10-7 26 27 32 10-8 4 2 2 4. Iz vzorca smo prenesli 1 ml na gojišče, razmazali in inkubirali. Izračunajte začetno koncentracijo bakterij iz petih paralelk: 150, 203, 167, 209 in 197 kolonij. 5. Zakaj pri nanosu vzorca na gojišče na paralelkah ne dobimo enakega števila kolonij? 6. Spoznali smo indirektno metodo. Zakaj ji tako pravimo? 7. Zakaj moramo inkubirati vzorce razredčin pri dveh različnih temperaturah? 8. Kateri vzorec vode ima največje število mikroorganizmov in zakaj? 9. Zakaj ne dobimo identičnih vrednosti, čeprav delamo paralelke? 2.6 Določevanje koliformnih organizmov Za določanje kakovosti pitne vode se najpogosteje ugotavlja prisotnost indikatorskih bakterij, ti. koliformnih bakterij, ki jih prištevamo v družino enterobakterij. To so po Gramu negativne paličaste bakterije, ki fermentirajo laktozo do kisline in plina (CO ). 2 Slika 18: Podskupine koliformnih bakterij Praktični pouk iz bioloških analiz 27 Prisotnost koliformnih bakterij v vodi kaže na onesnaženje s fekalnimi odplakami, ki so najpogosteje vir patogenih mikroorganizmov. V blatu bolnih ljudi in živali so prisotni povzročitelji črevesnih nalezljivih bolezni (kolera, tifus …). Koliformne bakterije so primeren indikator tudi zato, ker v vodi preživijo dlje časa kot drugi patogeni mikroorganizmi. Če v vodi ne najdemo koliformnih bakterij, lahko predpostavimo, da v vodi verjetno ni ostalih patogenih bakterij. Za ugotavljanje koliformnih mikroorganizmov v vodi se uporabljajo različna tekoča in trdna gojišča (Brilliant Green Bile Broth, Coliform Agar, MacConkey Agar, VRB Agar …), ki ustrezajo koliformnim bakterijam. Pri 30 °C razkrajajo laktozo in proizvajajo CO . 2 PRAKTIČNA VAJA Določevanje koliformnih organizmov MATERIAL IN PRIPOMOČKI - vzorec vode - sterilni briljant zeleni bujon - polavtomatska pipeta s sterilnimi nastavki METODA DELA • Vzorec vode premešajte. • Ob gorilniku prenesite 1 ml vzorca v sterilen briljant zeleni bujon z Durchmanovo cevko. • Na epruveto zapišite osnovne podatke: ime vzorca, razred, datum. • Vzorce inkubirajte pri 37 °C za 24 ur. • Po inkubaciji zabeležite spremembo v barvi gojišča in prisotnosti plina v Durchmanovi cevki. • Po končanem delu gojišče avtoklavirajte in pomijte laboratorijske pripomočke. • Rezultate vaje vpišite v spodnji tabeli. REZULTATI Tabela 12: Osnovni podatki vzorca vode za določevanje koliformnih organizmov Datum vzorčenja vode Vzorčevalec Kraj vzorčenja Mesto zajema Raba vode Način konzerviranja Čas, ki je pretekel od vzorčenja do laboratorijskih vaj Prisotnost koliformov 28 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Tabela 13: Primerjava koliformnih organizmov iz različnih vzorcev vode Lokacija Rast (+/-) Prisotnost plina (+/-) reka čistilna naprava NALOGE 1.. Katere organizme ste pričakovali na selektivnem gojišču glede na lokacijo nabranega vzorca vode? 2. Ali je vzorec vode pokazal pozitivne rezultate in kako so se ti odražali? 3. Kateri izmed danih vzorcev je vseboval koliforme? 4. Kaj je vzrok za prisotnost koliformov v vašem vzorcu vode? 5. Ali ste uporabili kvalitativno ali kvantitativno metodo? Odgovor utemeljite. 6. Na kaj ste morali paziti pri delu? 2.7 Določevanje prisotnosti E. coli Fekalno onesnaženje lahko dokazujemo s prisotnostjo bakterij indikatorjev fekalnega onesnaženja. Najpomembnejši indikatorji fekalnega onesnaženja so bakterije E. coli in enterokoki. Prisotnost E. coli in enterokokov v vodi zanesljivo kaže na fekalno onesnaženje. Bakterije so tudi indikatorji za učinkovitosti postopkov čiščenja in dezinfekcije pitne vode. Praktični pouk iz bioloških analiz 29 Priporočena gojišča za identifikacijo so: E. coli Direct Agar, VRBD Agar, VRB Agar, Brilliant Green Bile Broth . Slika 19: VRB agar kolonije E.coli obarva vijolično, roza kolonije so Salmonella, prozorne kolonije pa Yersinia ali Shigella PRAKTIČNA VAJA Določevanje prisotnosti E. coli MATERIAL IN PRIPOMOČKI - dehidrirano gojišče vrb in destilirana voda - erlenmajerica s stekleno palčko - oprijemalne klešče - kuhinjska krpa - trinožno stojalo s keramično mrežico - sterilne petri plošče - polavtomatska pipeta s sterilnimi nastavki in odlagalnik - alu folija METODA DELA • Sterilne petri plošče označite z osnovnimi podatki: ime gojišča, razred, datum, ime vzorca, kratica laboranta. • Nato stehtajte dehidrirano gojišče, ga dajte v erlenmajerico s širokim vratom in dodajte ustrezno količino destilirane vode (41,5 g VRB ….. 1000 ml dH O). 2 • Gojišče naj zavre na gorilniku, vendar ne sme vreti več kot 2 min. Nato ga ob prižganem gorilniku pustite, da se ohladi na 40-45 °C. • Ob odprtem gorilniku premešajte vzorec vode in odpipetirajte 1 ml vzorca v sterilno petri ploščo. • Ko je gojišče dovolj ohlajeno, prilijte inokulum (15 ml ) in z nežnimi krožnimi gibi zmešajte vzorec in gojišče med seboj. 30 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING • Ko se gojišče strdi, ga zavijte v alu folijo in zapišite osnovne podatke: ime gojišča, vzorec, razred, datum. • Nacepljene plošče inkubirajte pri 37 °C za 24–48 ur. • Popišite morfološke značilnosti kolonij. • Opravite primerjavo pestrosti mikroorganizmov med različnimi vodnimi vzorci. • Gojišča, ki jih ne potrebujete več, avtoklavirajte in zavrzite. REZULTATI Tabela 14: Morfološke značilnosti mikroorganizmov po inkubaciji na VRB agarju Karakteristike E. coli Salmonella drugi MO pigmentiranost prosojnost velikost oblika rob profil tekstura ustroj številčnost Tabela 15: Primerjava pestrosti mikroorganizmov na VRB agarju v odvisnosti od vzorca vode Karakteristike E. coli- število Salmonella- število število drugih MO reka bajer čistilna naprava NALOGE 1. Zapišite osnovne podatke uporabljenega gojišča: - polno ime gojišča, - glede na uporabo gre za …, - konsistenca gojišča, - sestava gojišča, - priprava gojišča. Praktični pouk iz bioloških analiz 31 2. Ali je prisotnost E. coli glede na izbran vzorec vode potrjena? 3. Kje bi potrdili največjo število E. coli glede na uporabljene vzorce vode? 4. Ali so na izbranem gojišču zrasli nepatogeni mikroorganizmi? Odgovor utemeljite. 5. Tokrat ste delali z nevarnimi mikroorganizmi. Kakšne bolezenske znake bi lahko razvili, če bi bili nepazljivi? 6. Opišite varstvene ukrepe pri izvajanju mikrobioloških analiz. 2.8 Določevanje mikrobiološke kvalitete zraka Zrak ima lahko vlogo rezervoarja za mikroorganizme (bakterije, glive in virusi). Zato je v nadzorovanih okoljih (operacijske sobe, sobe s hudo obolelimi osebami …) nujno potrebno mikrobiološko spremljanje. Na ta način določimo kakovost zraka in prepoznavamo kritične situacije. Slika 20: V zraku pogosto najdemo plesni, ki so nevarne za naša dihala Namen današnje vaje je oceniti stopnjo mikrobne kontaminacije v različnih prostorih na šoli. Uporabili bomo pasivno metodo vzorčenja. 32 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING PRAKTIČNA VAJA Določevanje mikrobiološke kvalitete zraka MATERIAL IN PRIPOMOČKI - sterilna osnovna trda gojišča METODA DELA • Izberite si različna vzorčna mesta (toalete, hodniki, učilnice, knjižnica, vrt …). V izbranih prostorih boste nastavili dve gojišči (dve paralelki). • Sterilna gojišča postavite na odmaknjeno mesto, kjer ne bo prišlo do motnje eksperimenta. • Gojišče odprete tako, da pokrov naslonite na spodnji del petri plošče. • Po 20 min gojišče previdno zaprete in pripravite za inkubacijo na 22 °C za 48 ur. Ne pozabite zapisati osnovnih podatkov na petri ploščo in alu folijo. • Popišite morfološke značilnosti kulture in izračunajte povprečje iz paralelnih vzorcev istih vzorčnih prostorov. • Izvedite primerjavo med vzorci zraka v različnih okoljih. • Po popisu rezultatov gojišča avtoklavirajte in odvrzite. REZULTATI Tabela 16: Osnovni podatki zračnega vzorca Datum vzorčenja vode Vzorčevalec Mesto vzorčenja Raba/namen prostora Pogostost rabe Čas izpostavitve Čas inkubacije Prezračevanje prostora Tabela 17: Morfološke značilnosti mikroorganizmov po inkubaciji Karakteristike Popis 1. kolonije Popis 2. kolonije … pigmentiranost prosojnost velikost oblika rob profil tekstura ustroj številčnost Praktični pouk iz bioloških analiz 33 REZULTATI Tabela 18: Primerjava vsebnosti mikroorganizmov iz različnih zračnih prostorov Vzorčno mesto Št. kolonij bakterij Št. kolonij plesni Biotska pestrost toaleta učilnica knjižnica NALOGE 1. Kateri mikroorganizmi se nahajajo v zaprtih prostorih (zrak)? 2. Kaj pomeni kvaliteten zrak? 3. Kako mikroorganizmi vplivajo na naše dihalne poti? 4. Kateri prostor je glede na izbrane vzorčne prostore vseboval največ mikroorganizmov? 5. Zakaj prihaja do razlik v številčnosti kolonij? 6. Zakaj prihaja do razlik v pestrosti kolonij? 7. Navedite različne ukrepe zmanjševanja števila mikroorganizmov v zaprtih prostorih. 2.9 Izolacija gliv iz tal Glive so evkariontski organizmi, ki imajo lahko enocelično obliko (kvasovke) ali filamentozno obliko (micelij). V naravi so pomembni • dekompozitorji, ki vračajo hranila v takšno obliko, da so ponovno dostopna za rastlinski in bakterijski svet, • simbionti, ki prispevajo mikroelemente za boljšo rast in • paraziti, ki regulirajo številčnost drugih osebkov. Številčnost in raznolikost gliv napovedujeta rodovitnost in zdravstveno stanje tal. Izolacija gliv iz okolja poteka s pomočjo selektivnega gojišča. Gre za gojišče, ki vsebuje antibiotik za zaviranje rasti bakterij. Pri delu z glivami se moramo zavedati produkcije prašnih spor, ki se z lahkoto prenašajo po zraku. Zato petri plošče s plesnimi odpiramo skrajno previdno. 34 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING PRAKTIČNA VAJA Izolacija gliv iz tal MATERIAL IN PRIPOMOČKI - sterilna terilnica s pestilom - sterilizirana fiziološka raztopina - sterilne bučke s pokrovom - sterilna žlička, ovita v alu folijo - sterilno gojišče za kultiviranje gliv - spatula v čaši z etanolom - polavtomatska pipeta s sterilnimi nastavki in odlagalnikom - različni vzorci tal METODA DELA • Na spodnjo stran petri plošče s selektivnim gojiščem zapišite osnovne podatke. • Ob odprtem gorilniku prenesite eno žličko vzorca tal v sterilno terilnico in vzorec homogenizirajte. • 0,1 g homogeniziranega vzorca prenesite v sterilno bučko in dopolnite s sterilno fiziološko raztopino do znaka (100 ml). Zamašite in stresajte 15-30 min. • Aseptično prenesite 0,1 ml vzorca na sterilno gojišče tako, da ne zajamete trdnih delcev. • Spatulo potegnite čez plamen in počakajte, da plamen ugasne in se spatula ohladi. Nato 20 sek. razmazujete vzorec po gojišču. • Nacepljeno gojišče pripravite na inkubacijo pri 25 °C za 48 ur. • Popišite morfološke značilnosti kulture. • Kontaminirane plošče avtoklavirajte in odvržite v odpad. REZULTATI Tabela 19: Osnovni podatki vzorca tal Datum vzorčenja Vzorčevalec Mesto vzorčenja Raba prostora Čas transporta Praktični pouk iz bioloških analiz 35 REZULTATI Tabela 20: Morfološke značilnosti gliv po inkubaciji na selektivnem agarju Karakteristike pigmentiranost prosojnost velikost oblika rob profil tekstura ustroj številčnost NALOGE 1. Zakaj smo uporabili gojišče, ki vsebuje antibiotik? 2. Od česa je odvisna biotska pestrost tal? 3. V katerem vzorcu tal je bila biotska pestrost največja? 36 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 3 RASTLINSKI KAZALNIKI Terenske meritve so drugačno delo kot delo v laboratoriju. Predvsem nam grozijo drugačne nevarnosti: - nevarne rastline: ubranimo se z dolgimi hlačami, - nevarne živali: uporaba repelentov je zelo zaželena, ko pa pridemo domov, se moramo nujno pregledali, da se nas ni prijel kakšen klop, - zdrsi in zvini: obutev mora biti primerna terenskim vajam, z narebrenimi podplati in zaščito nad gležnjem (pohodni čevelj), - sončarica in dehidracija: če je vreme sončno, je pomembno, da veliko pijemo in se predhodno zaščitimo pred sončnim sevanjem s sončno kremo in klobukom, - terenska umazanija: pri zagnanem delu se pogosto tudi umažemo z blatom, prstjo, vodo … zato nam rezervna oblačila pridejo prav, še posebej, če pademo v vodo. Na terenu bodimo pozorni na okolico in spremljajmo dogajanje okoli sebe. Če bomo mirni, bomo lahko dobili obisk srnjačka, fazana ali kakšne druge divje živali. Če bomo pozorno gledali, kje hodimo, ne bomo poteptali orhideje, modre stožke ali tavžentrože. Glavno vodilo je, da naravo pustimo takšno, kot smo jo dobili, preden smo stopili vanjo. To ne velja v primeru, ko tam najdemo odpadke. Te je zaželeno pobrati in odnesti s seboj. Smeti morda res niso naše, je pa naš planet. 3.1 Vzorčenje onesnaženosti zraka preko epifitskih lišajev Struktura lišajev nam poda koristne informacije o kvaliteti zraka. Njihova vrstna sestava v okolju je odvisna od koncentracije žveplovega dioksida, dušikovih oksidov in drugih onesnaževal v zraku. Na podlagi tega lahko izračunamo indeks zračne čistosti–IAP. Lišaj kot organizem • Organizem je sestavljen iz enocelične zelene alge ali cianobakterije ter glive, ki živita v sožitju ali simbiozi. • V primerjavi z rastlino nima pravih tkiv in organov. Nima korenin, listnih rež in zaščitne kutikule. Njegovo telo imenujemo steljka. Vodo, hranila ter zrak privzema skozi celotno površino steljke. • Je epifit, saj raste na drugih rastlinah, deblih in vejah dreves in grmov oz. epilit, ko raste na zemlji in skalah. SKORJA ENOCELIČNE ALGE SREDICA HIFE SKORJA RIZINE–struktura,pritrjevanje Slika 21: Struktura lišaja8 8 https://www.123rf.com/photo_137074051_lichen-fungus-cross-section-slide-under-the-microscope-view-for-education-biology-.html Praktični pouk iz bioloških analiz 37 Bolj kot je površina steljke zrasla s površino, manjši del steljke je izpostavljen okoliškemu zraku in onesnažilom – manjša je občutljivost na zračna onesnažila. Manj kot je površina steljke zrasla s površino, večji del steljke je izpostavljen okoliškemu zraku in onesnažilom – večja je občutljivost na zračna onesnažila. SKORJASTI Ločevanje od Razraslost Površina steljke, ki je v stiku rastne podlage steljke z zrakom in onesnažili ZAHTEVNO MAJHNA LISTASTI GRMIČASTI ENOSTAVNO VELIKA Slika 22: Lišaji imajo 3 tipične rastne oblike Lišaji kot bioindikatorji • Steljka lišajev je občutljiva na koncentracije plinskih onesnažil v zraku, predvsem na koncentracije žveplovega dioksida (SO ) in dušikovih oksidov (NO ). Ti nastanejo pri izgorevanju fosilnih goriv v prometu in industriji. 2 x Večja kot je koncentracija žveplovega dioksida (SO ) in dušikovih oksidov (NO ) v zraku, bolj so prisotni 2 x lišaji s preprostimi steljkami, oz. lišajev sploh ni, kar imenujemo LIŠAJSKA PRAZNINA. • V steljki lišaja se kopičijo tudi prašni delci in težke kovine. Njihovo koncentracijo lahko določamo z analiznimi metodami v laboratoriju. V bioindikatorjih se Spremembe lahko snovi kopičijo, bioindikatorja so kar ni vidno navzven vidne - REAKCIJSKI - AKUMULACIJSKI BIOINDIKATOR. BIOINDIKATOR. 38 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING PRAKTIČNA VAJA Določanje indeksa zračne čistosti (Indey of Athmospheric Purity – IAP) MATERIAL IN PRIPOMOČKI - povečevalno steklo - Določevalni ključ epifitskih lišajev Slovenije - SiiT - telefon s fotoaparatom - pisalo, popisni list in podloga za pisanje - vrečka in nož - kreda - meter - kovinska vzorčna mreža oz. ravnilo Slika 23: Ravnilo, velikosti 10 cm x 10 cm ter mreža velikosti 20 cm x 50 cm, ki jo narišemo s kredo na drevo9 METODA DELA • Na posamezni lokaciji si izberite 6 dreves iste vrste. Izberite listavce, vendar ne tujerodnih vrst. Drevesa naj bodo po območju enakomerno razporejena in naj bodo približno enake višine. V nižinah je najprimernejši hrast, v gorskem pasu bukev in jelka, v subalpinskem pa smreka in macesen. • Za popis se izbere stran, ki je najbolj obrasla z lišaji. Če je drevo poraslo z mahovi, se vzorčno mesto postavi tako, da je znotraj mreže prisotnega čim manj mahu. • S pomočjo določevalnega ključa določite vrste dreves in tipe steljk lišajev, ki rastejo na njih. Naredite tudi herbarij lišajev. V prilogi 2 je ovitek zbirke. • Vzorčna mreža ima velikost 20 cm x 50 cm ter je razdeljena na 10 manjših kvadratov, velikosti 10 cm x 10 cm. Lahko je kovinska, ki jo pritrdite na drevo, ali pa jo narišite na drevo s kredo. 9 Rudolf, 2014 Praktični pouk iz bioloških analiz 39 • Vzorčno mrežo boste postavili na 3 različne višine: - višina1 1–0,5 m višine debla, - višina 2 0,5–2,5 m višine debla, - višina 3 od 2,5 m višine in na vejah. Slika 24: Shema opazovanja lišajev na 3 višinah • Grobo oceno številčnosti in pokrovnosti boste naredili z opazovanjem enega kvadrata velikosti 10 cm x 10 cm. Če rezultati v drugih kvadratih mreže odstopajo, vpišite povprečno stanje pokrovnosti in številčnosti. • V vsakem kvadratu, velikosti 10 cm x 10 cm, določite pokrovnost in številčnost lišajev po spodaj napisanih kriterijih. Določite jih posebej za skorjaste, listaste in grmičaste lišaje. Rezultate popisa lišajev beležite v terenski list. (Glejte naprej.) Tabela 21: Ocena številčnosti in pokrovnosti epifitskih lišajev Številčnost – določamo število steljk posameznega tipa Pokrovnost – določamo površino steljk posameznega tipa lišajev v kvadratu lišajev v kvadratu 0 Ni lišajev. 0 Ni lišajev. 1 Posamezen tip steljke pokriva do 10 % opazovane 1 1 do 5 steljk površine. 2 5 do 10 steljk 2 Posamezen tip steljke pokriva od 10 % do 50 % opazovane površine. 3 nad 10 steljk 3 Posamezen tip steljke pokriva nad 50 % opazovane površine. 40 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING • Izračunajte indeks IAP za posamezno drevo – seštejte vse vrednosti številčnosti in pokrovnosti za vse 3 tipe steljk na treh višinah. • Nato izračunajte povprečje za vseh 6 dreves. Seštejte vse indekse IAP posameznih dreves in jih delite s 6. • Na podlagi povprečne vrednosti indeksa IAP določite lišajski pas po spodnji tabeli. Tabela 22: IAP vrednost lišajskega pasu Vrednost indeksa Razred Lišajski pas (od A do E) Prisotnost posameznih tipov lišajev Koncentracije SO in NO 2 x 0 5 LIŠAJSKA PRAZNINA E ni lišajev. visoka 1–13,5 4 OBMOČJE BORBE D skorjasti 13,6-27 3 OBMOČJE BORBE C skorjasti in listasti 27,1–40,5 2 OBMOČJE BORBE skorjasti, listasti in malo B grmičastih 40,6–54,0 1 ČISTA CONA skorjasti, listasti, grmičasti, nizka A zelo številni in lepo razviti REZULTATI Tabela 23: Osnovni podatki mesta vzorčenja Nadmorska višina Koordinate Datum Popisovalec Ocena okolice POPISNI LIST: DOLOČANJE INDEKSA ZRAČNE ČISTOSTI - IAP Vrsta drevesa 1. Katere vrste lišajev ste določili na drevesih z ravnilom 10 x 10 cm? skorjasti listasti grmičasti Praktični pouk iz bioloških analiz 41 REZULTATI 2. Določite vrednost indeksa zračne čistosti. Pomagajte si s tabelo 21 in mrežo 20 x 50. Tabela 24: Rezultati popisa lišajev in izračun indeksa zračne čistosti OPIS STANJA LIŠAJEV Številka drevesa 1 2 3 4 5 6 v Višina na drevesu Tip lišaje 0-0,5 m 0,5-1,5 m 1,5-2 m 0-0,5 m 0,5-1,5 m 1,5-2 m 0-0,5 m 0,5-1,5 m 1,5-2 m 0-0,5 m 0,5-1,5 m 1,5-2 m 0-0,5 m 0,5-1,5 m 1,5-2 m 0-0,5 m 0,5-1,5 m 1,5-2 m številčnost TIAS ORJ pokrovnost SK številčnost TI TASLIS pokrovnost številčnost TI pokrovnost GRMIČAS INDEKS IAP za posamezno drevo Povprečje Povprečje Povprečje Povprečje Povprečje Povprečje (Sešteje vse vpisane vrednosti za posamezno drevo.) INDEKS IAP (povprečje) LIŠAJSKI PAS (od A do E) NALOGE 1. Pojasnite, kaj vam pove določen lišajski pas o koncentracijah žveplovega dioksida in dušikovih oksidov v okolju, v katerem ste vzorčili? 2. Koliko je vaše mesto vzorčenja oddaljeno od: - hitre ceste, avtoceste: km, - večjih industrijskih obratov: km. 3. Ali se rezultat sklada s stanjem v okolju? 4. Kako bi izboljšali vrednost indeksa? 42 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 3.2 Vzorčenje fitobentosa Fitobentos so alge, ki so pritrjene na rečno, jezersko dno ali drugo podlago. Kot bioindikatorje ekološkega stanja vode vrednotimo zgolj KREMENASTE ALGE ali DIATOMEJE. Te so običajno zgrajene iz celične stene, ki vsebuje kremen, in so sestavljene iz dveh delov: celična stena in kremenasta lupinica iz dveh delov. Celična stena vsebuje zgornji del kremen. Kremenasta kremenaste lupinice lupinica je iz 2 delov. spodnji del kremenaste lupinice Slika 25: Zgradba fitobentosa10 Izbira kremenastih alg za bioindikatorje je uporabna predvsem zaradi naslednjih lastnosti. • Obstaja veliko število vrst, ki se pogosto pojavljajo v vodnih telesih in so dovolj pogoste za določanje. • Imajo raznolike lupinice, ki jih lahko vrstno določamo z določevalnimi ključi. • Kratka življenjska doba - z njimi spremljamo razmere v krajšem časovnem obdobju. PRAKTIČNA VAJA Določanje ekološkega stanja vodotoka s kremenastimi algami MATERIAL IN PRIPOMOČKI - zobna ščetka - plastična epruvetka s pokrovom - fiolce - krovno in objektno steklo - plastična kapalka - mikroskop METODA DELA • Vzorčno mesto izberite tako, da vsebuje čim več različnih mikrohabitatov. • Vpišite podatke o vzorčenju in vzorčnem mestu, določite organoleptične lastnosti vode, izmerite fizikalno-kemijske parametre v vodi in rezultate zapišite v terenski popisni list. • Vzorce naberite tako, da podrgnete po podlagi s ščetko, nožem ali žličko in vsebino shranite v fiolce. Zraven dodajte tudi nekaj vzorčne vode. • Razdelite se v tri skupine, kjer bo prva skupina vzorčila s kamnov (iz različnih globin), druga z naplavnega lesa, tretja pa iz rastlin. • Nabrani material v laboratoriju dobro pretresite. • Pripravite nativni preparat in vsebino preglejte z mikroskopom s 400-kratno povečavo. • V vsakem vzorcu preglejte vsaj 200 lupinic. Različne vrste kremenastih alg narišite in ste pri tem pozorni na podrobnosti (vzorci na kremenastih lupinicah). Poskušajte jih določiti z določevalnim ključem. 10 https://slideplayer.com/slide/4171360/ Praktični pouk iz bioloških analiz 43 REZULTATI POPISNI LIST: DOLOČANJE EKOLOŠKEGA STANJA VODOTOKA S KREMENASTIMI ALGAMI Tabela 25: Osnovni podatki vzorčnega mesta za izvedbo analiz fitobentosa popisovalec ime vodotoka datum in ura vzorčenja mesto vzorčenja koordinate mesta vzorčenja najbližje naselje dolžina odseka trenutni vodostaj nizek srednji visok kalnost bistra srednje kalna močno kalna struga regulirana naravna vidnost dna da ne globina vodnega telesa 1–10 cm - % (v preseku) 10–30 cm - % 30–60 cm - % nad 60 cm - % hitrost vodnega toka 1–10 cm/s - % (skozi celoten presek) 10–30 cm/s - % 30–60 cm/s - % nad 60 cm/s - % Kakšen mikrohabitat bo zajet kamenje v vzorcu? lesni ostanki rastline drugo Tabela 26: Rezultati kemijsko-fizikalnega stanja vode, kjer vzorčimo fitobentos temperatura zraka (°C) temperatura vode (°C) električna prevodnost (µS/cm) pH-vrednost koncentracija nitratov (mg/l) koncentracija fosfatov (mg/l) Slike vsaj 10 kremenastih alg (400-kratna povečava). Primerki naj bodo čim bolj raznoliki. 44 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING NALOGE 1. Kako pogosto se izvaja vzorčenje fitobentosa v Sloveniji? 2. Kdaj je najprimernejši čas vzorčenja fitobentosa? 3. Od česa je odvisna dolžina vzorčnega mesta? 4. Ali bomo dobili podobne rezultate fitobentosa iz istega vodnega telesa, kljub temu da smo vzorčili z različnih podlag? Odgovor utemeljite. 5. Opišite postopek, kako pridemo do velike povečave na mikroskopu. 3.3 Vzorčenje makrofitov Makrofiti • so vodne rastline, ki jih opazimo s prostim očesom. V to skupino sodijo semenke, praprotnice, makroskopske alge in mahovi. • Nahajajo se v vseh tipih sladkih vod: reke, jezera, ribniki, kanali. • Vloga v ekosistemih: - predstavljajo življenjski prostor različnim organizmom (nevretenčarji, ribe, ptice), - utrjujejo rečne bregove in struge, - obogatijo okolje s hranili (prevzemajo jih iz sedimenta in jih vračajo v okolje s svojim propadanjem), - povečujejo samočistilno sposobnost vode, - bogatijo vodo s kisikom. Praktični pouk iz bioloških analiz 45 PRITRJENI NADVODNI MAKROFITI Korenike in korenine so zakoreninjene na dnu, steblo in listi večinoma nad vodo. Zgradba kopenskih rastlin z določenimi prilagoditvami. Primeri: navadni trst, širokolistni rogoz, loček PROSTOPLAVAJOČI MAKROFITI imajo le prosto plavajoče liste na površini ali v vodnem stolpcu in korenine, ki niso zasidrane v substrat. Primer: vodna leča, vodna solata PRITRJENI PLAVAJOČI MAKROFITI Korenike in korenine imajo v vodi, steblo in listi plavajo na vodni površini. Prilagoditve: plavajoči listi so povoščeni, izgubijo oporna PODVODNI MAKROFITI tkiva – upogibajoče steblo, listne reže na zgornji strani. so ukoreninjene rastline pod vodo. Primeri: lokvanj, rumeni blatnik, kolenčasti dristavec Prilagoditve: izgubijo oporna tkiva, brez kutikule, z manj ali brez listnih rež, kloroplasti v povrhnjici (čim bližje površini). Primer: vodna kuga, klasasti rmanec, alga Chara in Nitella Slika 26: Rastne oblike makrofitov11 Makrofiti kot bioindikatorji so eni od številnih bioloških elementov, s katerimi določamo ekološko stanje vode. • Odzivajo se na lokalne spremembe okolja. • Živijo več let – z njimi spremljamo razmere v daljšem časovnem obdobju. • So pokazatelj za evtrofikacijo, zakisanje, hidromorfološke spremembe … PRAKTIČNA VAJA Določanje ekološkega stanja vodotoka z makrofiti MATERIAL IN PRIPOMOČKI - teleskopska palica s kavljem (grablje) - nožek - ročna lopa (10-kratna povečava) - določevalni ključi - mobilni aparat – telefon - kadičke - čaše - Vernierjevi senzorji (termometer, konduktometer) - kovček za določanje kemijskih parametrov v vodi (koncentracije nitratov, fosfatov, pH-vrednost) 11 Root Rive 46 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING METODA DELA • Na terenu določite transekte v dolžini 10 m. • Določite organoleptične lastnosti vode, izmerite fizikalno-kemijske parametre v vodi in rezultate zapišite v terenski popisni list. • Makrofite s pomočjo določevalnih ključev popišite na obrežju, v vodi – opazujte njihovo raznovrstnost. Pri tem si pomagajte z grabljami, teleskopsko palico s kavljem in pazite, da jih ne poškodujete. • Prek popisanih makrofitov določite ekološko stanje vodotoka – kakovostni razred. Slika 27: Določevalni ključ makrofitov12 12 Artač, 2011 Praktični pouk iz bioloških analiz 47 REZULTATI POPISNI LIST: DOLOČANJE EKOLOŠKEGA STANJA VODOTOKA Z MAKROFITI Tabela 27: Osnovni podatki vzorčnega mesta za vzorčenje makrofitov popisovalec datum in čas ime vodotoka skupno število vseh številka transekta, za transektov vzorčenje koordinate na sredini vzorčenega transekta dolžina vzorčnega transekta trenutni vodostaj nizek srednji visok kalnost bistra srednje kalna močno kalna strmina brega nad vodo položen srednje strm zelo strm pravokoten - utrjen osončenost popolnoma osončen delno osončen popolnoma osončen spremembe brega - brez sprememb - les - kamen oz. kamniti bloki - beton - izpusti, cevi rastline obrežnega pasu - gozd - močvirska vegetacija (trstišča) - pionirske lesnate rastline (vrbe, topoli, jelše) - zelnate rastline (visoke in nizke zeli) - tujerodne rastline - drugo: izraba tal za obrežnim pasom - gozd - mokrišča - mozaik košenih travnikov/pašnikov/mokrišč - obdelovalne površine, posamezne hiše - strnjeno urbano naselje (hiše, tovarne) Tabela 28: Rezultati kemijsko-fizikalnega stanja vode, kjer vzorčimo makrofite temperatura zraka (°C) temperatura vode (°C) električna prevodnost (µS/cm) pH-vrednost koncentracija nitratov (mg/l) koncentracija fosfatov (mg/l) 48 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Tabela 29: Popis makrofitov na vzorčni ploskvi Vrsta rastline Kakovostni razred Vrsta rastline Kakovostni razred (od A do E) (od A do E) Najbolj pogosto določen razred kakovosti: NALOGE 1. Na kaj morate biti pozorni na terenu pri vzorčenju makrofitov? 2. Obrazložite, ali se ekološko stanje vodnega telesa sklada s kemijskimi rezultati. 3. Kako bi še podrobneje določili ekološko stanje vodnega telesa? 4. Kateri kakovostni razred ste določili na podlagi makrofitov? Praktični pouk iz bioloških analiz 49 3.4 Vzorčenje višje razvitih rastlin Travnik je ekosistem, ki mu podobo dajejo trave in cvetlice. Prisotne so tudi številne živalske vrste, predvsem metulji in druge žuželke. Vrstno bogati travniki so za ohranjanje narave zelo pomembni, saj na njih najdemo tudi nekatere redke in ogrožene rastlinske in živalske vrste. Nekatere vrste na površini travnika prevladujejo in je njihova gostota večja, nekatere vrste pa se na travniku pojavljajo posamično in izginejo s travnika, takoj ko spremenimo način upravljanja. Prisotnost pozitivnih indikatorskih vrst (npr. orhideje) nam kaže, da je način upravljanja s travnikom primeren. Negativne indikatorske vrste (npr. navadni regrat, plazeča detelja, enoletna suholetnica) pa nas opozarjajo na neprimerno upravljanje travnika zaradi prekomernega gnojenja, opuščanja rabe travnika … PRAKTIČNA VAJA Določevanje biotske pestrosti na travnikih Biotska pestrost predstavlja številčnost in spremenljivost vseh življenjskih oblik na nekem območju. Nanjo vpliva mnogo dejavnikov. Izražamo jo s številom vrst na območju in s številom organizmov posamezne vrste. Večja je pestrost, bolj je ekosistem stabilen. Glavni namen vaje je spoznavanje biodiverzitete in razlik v biodiverziteti med različnimi tipi travišč in primerjava različnih travnatih habitatov ter uporaba različnih metod vzorčenja. MATERIAL IN PRIPOMOČKI - določevalni ključ: • Mala flora Slovenije • Slikovni rastlinski ključ • Rastlinski vodnik • Kaj neki tu cveti • PlantNet Plant Identification - pisalo in popisni list - primerna oblačila in obutev - telefon s fotoaparatom - lupa - karton, lepilni trak, meter, škarje za izdelavo okvirja dimenzije 50 x 50 cm PREDEN SE LOTITE DELA, JE POTREBNO VEDETI … - Rastline popisujete na mestu, ne da jih odtrgate. - Posebej morate biti pozorni na zaščitene vrste, ki jih nikoli ne trgate ali kakorkoli poškodujete. Lahko jih skicirate ali jih fotografirate za arhiv. - Pazite! Vse kukavičevke oziroma divje orhideje so zavarovane. - Vrstno bogata travišča so v Sloveniji varovana kot območja Natura 2000. Pogosto so del zavarovanih območij, najvrednejši deli travišč pa so zaščiteni kot naravne vrednote. Mnoge travniške vrste so uvrščene na rdeči seznam ogroženih vrst. - Če niso zaščitene, rastline lahko naberete in izdelate herbarij. 50 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING - Kadar izvajate popis rastlin na nekem območju, morate zajeti vse oz. čim večje število vrst, ki se nahajajo na obravnavanem območju. - Pri tem lahko obravnavano območje razdelite z diagonalo in določite vse rastline ob njej. Druga možnost je, da izberete nekaj naključnih kvadratov (po 1 m2) in v njih določite vse rastline. Na obravnavanem kvadratu preštejete število osebkov iste vrste ter ocenite biodiverziteto. Postopek lahko ponovite v različnih ekosistemih, ki jih potem primerjate med seboj. METODA DELA • Na spletni strani https://www.naravovarstveni-atlas.si/web/profile.aspx?id=NV@ZRSVNJ si izdelajte in natisnite DOF posnetek, na katerem bo označena površina (npr. gnojen travnik, travniški sadovnjak …), ki jo boste preučili. • Sprehodite se čez opazovano površino ali ob njej in na DOF posnetku označite različne strukture (vidni posegi človeka) opazovane površine, ki jih opazite na ali ob njej. Mejice, dominantna drevesa, nasipi, ceste, potoki, nekošeni pasovi travnika, travniški sadovnjaki, kamniti zidovi, skale … močno vplivajo na biotsko pestrost. Na posnetku si to tudi označite in dodajte legendo kot kaže spodnja slika. Slika 28: Habitatno kartiranje13 • Opazovano površino npr. gojeni travnik tudi fotografirajte. • Popis rastlin boste izvedli na treh različnih lokacijah opazovane površine. • Okvir, ki ste ga izdelali iz kartona (50 x 50 cm), previdno postavite na naključno izbrano površino npr. travnika. Okvir položite tako, da ne poškodujete rastlin. • Popišite rastline znotraj okvirja do taksonomske stopnje, ki jo z razpoložljivo literaturo (slikovni ključ, aplikacije) in znanjem še lahko zanesljivo določite. Predstavnike posamezne vrste tudi preštejte. • Rastline lahko fotografirate ali naberete in herbarijsko posušite. Rastline, ki jih niste mogli določiti, lahko naberete in s pomočjo domače ali tuje literature skušate določiti v šoli. 13 Škornik, 2019 Praktični pouk iz bioloških analiz 51 • Skicirajte opazovano površino npr. gojeni travnik, na kateri označite popisne ploskve (I., II., III.) Slika 29: Skica opazovane površine z vzorčnimi ploskvami14 • Popišite travniške rastline in število primerkov, ki pripadajo posamezni vrsti, na prvi vzorčni ploskvi in podatke vnesite v spodnjo tabelo. • Postopek ponovite še na drugih dveh lokacijah. • Izračunajte ekološko gostoto. Izračun ekološke gostote populacije je izražen s številom osebkov, ki živijo na enoti površine. - gostota na 1 m2 za popisno polje 50 x 50 cm = št. vseh osebkov x 4/m2 - gostota na 1 ha = št. vseh osebkov x 4 x 10000/ha - povprečna gostota = /m2 Stopnja biodiverzitete: • visoka: več kot 50 rastlinskih vrst/m2 • nizka: bistveno manj kot 50 rastlinskih vrst/m2 REZULTATI POPISNI LIST ZA VZORČENJE RASTLIN NA IZBRANI POVRŠINI Tabela 30: Popisni list za vzorčenje višje razvitih rastlin Datum opazovanja Ura opazovanja Člani delovne skupine (ime in priimek) Nadmorska višina Temperatura zraka Vreme Tip travnika 14 Škornik, 2019 52 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI DOF posnetek z označeno opazovano površino z okolico Fotografija opazovane površine Skica opazovane površine z označenimi popisnimi ploskvami Praktični pouk iz bioloških analiz 53 REZULTATI Tabela 31: Prva vzorčna ploskev popisa višje razvitih rastlin na opazovani površini Zap. št. Rastlina Št. osebkov na 0,25 m2 1. Slovensko ime Strokovno ime 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. skupno število osebkov Tabela 32: Druga vzorčna ploskev popisa višje razvitih rastlin na opazovani površini Zap. št. Rastlina Št. osebkov na 0,25 m2 1. Slovensko ime Strokovno ime 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. skupno število osebkov Tabela 33: Tretja vzorčna ploskev popisa višje razvitih rastlin na opazovani površini Zap. št. Rastlina Št. osebkov na 0,25 m2 1. Slovensko ime Strokovno ime 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. skupno število osebkov Izračun ekološke gostote populacij 54 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING NALOGE 1. Raziščite značilnosti naslednjih travišč in navedite po en primer. naravna travišča polnaravna travišča gnojena/obogatena travišča 2. Kakšna je razlika med naslednjimi travišči? ekstenzivna suha in polsuha travišča na karbonatnih ali visokodebelni sadovnjaki silikatnih kamninah mokrotni in vlažni travniki nižinsko ekstenzivno gojeni travniki 3. V Sloveniji travišča prekrivajo okrog 30 % površine in predstavljajo vir enega najvišjih deležev biodiverzitete pri nas. Naštejte še druge ekosistemske funkcije travnika. 4. Na katerem delu travnika se zdi biotska pestrost največja? 5. Zakaj se pojavlja vrstna raznolikost na različnih predelih travnika? 6. Kaj se zgodi s travnikom, ki se ga ne kosi in na njem ne pase živine? Ali je to za ohranjanje biotske pestrosti travnika pozitivno? Obrazložite. 7. Ali se vam zdi obravnavani travnik naravovarstveno (za ohranjanje biotske pestrosti) pomemben? 8. Kateri so razlogi za visoko oz. nizko stopnjo biodiverzitete opazovanega travnika? 9. Naštejte, zakaj so travišča eno izmed najbolj ogroženih življenjskih okolij z največjim upadom biotske raznovrstnosti? 10. Na kakšen način bi gospodarili s travnikom, da bi ohranili rastline in živali, ki na njem bivajo? Praktični pouk iz bioloških analiz 55 PRAKTIČNA VAJA Določevanje pokrovnosti posameznih vrst na izbrani površini Namen vaje je praktično spoznati slučajno sistematično vzorčenje trpotca (regrata), ocenitev pokrovnosti trpotca (regrata) na izbrani površini (npr. travniku) in uporaba ter izdelava denzometra. MATERIAL IN PRIPOMOČKI - volna - utež (matica) - rolica toaletnega papirja - lepilni trak - popisni list - ... METODA DELA Izdelava denzometra 1. Na eni strani rolice iz volne naredite križ in pritrdite z lepilnim trakom. 2. Na drugi strani rolice na volno obesite utež in pritrdite na rolico z lepilnim trakom. Slika 30: Prikaz zgornjega in spodnjega dela denzometra 56 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING MERITVE • Izberite si površino (travnik), kjer zagotovo raste trpotec (regrat ali marjetica). • Vzorčili boste na treh različnih lokacijah izbrane površine. • Naključno izberite začetno točko na parceli, kjer boste začeli šteti. To bo ničelna točka To. • Sistematično vzorčenje boste nadaljevali tako, da boste v ravni liniji vzorčili podvzorce na vsake tri korake. Slika 31: Slučajno sistematično vzorčenje • Vzorčite tako, da denzometer postavite predse in pazite, da je utež točno na sečišču vrvic, ki sta na zgornji strani cevi, ko pogledate podse. Legenda utež volna zgornjega križa Slika 32: Primer slike, vidne z denzometrom • Na vsaki točki preštejete, koliko predelov vidnega polja prekrivajo izbrane rastline. Rezultate si zapišite v tabelo. • S pomočjo dobljenih rezultatov izračunajte pokrovnost izbrane rastline. pokrovnost rastline = . 100 % Praktični pouk iz bioloških analiz 57 REZULTATI Tabela 34: Osnovni podatki pokrovnosti izbrane rastlinske vrste Ime in priimek vzorčevalca Datum Vreme Velikost opazovanega rastišča Opis rastišča Nadmorska višina Koordinate Fotografija denzometra DOF posnetek z označenim travnikom in koordinatami lokacije Fotografija lokacije in vzorčevalca v akciji 58 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Tabela 35: Delež pokritosti tal z izbrano vrsto T T T T T T T T T T Povprečje o 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pokrovnosti 1. vzorčno mesto izbrana vrsta druge vrste brez vegetacije 2. vzorčno mesto izbrana vrsta druge vrste brez vegetacije 3. vzorčno mesto izbrana vrsta druge vrste brez vegetacije Izračun povprečne vrednosti pokrovnosti izbrane vrste NALOGE 1. Izračunajte velikost vzorčne ploskve. 2. Narišite grafični prikaz, kako se delež pokrovnosti izbrane vrste spreminja z oddaljevanjem od ničelne točke. 3. Kaj vpliva na rast izbrane rastline? 4. Kakšne so značilnosti rastišča izbrane rastline? Poiščite na spletu. 5. Kako bi povečali številčnost izbrane rastline? 6. S katerimi nevarnimi in nezaželenimi organizmi bi lahko prišli v stik na izbrani lokaciji? 7. Kakšni sta primerna obleka in obutev za tovrstno vzorčenje? Navedite zaščitno opremo za travniško vzorčenje. Praktični pouk iz bioloških analiz 59 PRAKTIČNA VAJA Določevanje gostote posameznih vrst Gostota rastlin in njihova neenakomerna porazdelitev sta odraz konkurence. Ko govorimo o gostoti, imamo v mislih število osebkov na neko površino. Včasih je težko določiti posamezne organizme (jagoda z viticami). Zato večkrat ovrednotimo gostoto kot preštete enote na neko površino. Z njo opisujemo odnos med rastlinami in zasedenostjo prostora. Z gostoto ocenjujemo stabilnost populacije in napovedujemo trend. MATERIAL IN PRIPOMOČKI - vzorčna mreža 1 x 1 m z 0,1 x 0,1 m velikimi odprtinami - vrv METODA DELA • Če mreže še nimate, jo lahko naredite s štirimi palicami, ki jih zbijete skupaj, nanje pa povlečete vrv v mrežo 10 x 10 cm. • Na terenu povlečete vrv v dolžini 10 metrov. Transekt naj sledi plastnicam ali pa naj bo pravokotno na plastnice. V nadaljevanju boste preverili, ali ima to kakšen vpliv. • Začetna točka vzorčenja je na začetku vrvi, kamor postavite leseno mrežo 1 x 1 m ter popišete število posameznih izbranih osebkov (marjetice, regrat, trpotci, zlata rozga …). Podatke zabeležite. • Nato mrežo premaknite po transektu za 3 m in vajo ponovite. • Po opravljenih meritvah ponovno premaknite mrežo za 3 m in vajo ponovite. • Izračunajte gostoto. • Rezultate primerjajte med seboj. REZULTATI Tabela 36: Osnovni podatki gostote izbrane rastlinske vrste Ime in priimek vzorčevalca Datum Vreme Velikost opazovanega rastišča Opis rastišča Nadmorska višina Koordinate 60 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Izračun gostote Slika 33: Popis osebkov na vzorčni ploskvi za določitev gostote Izračun gostote Slika 34: Popis osebkov na vzorčni ploskvi za določitev gostote Praktični pouk iz bioloških analiz 61 REZULTATI Izračun gostote Slika 35: Popis osebkov na vzorčni ploskvi za določitev gostote NALOGE 1. Kaj se dogaja z gostoto? 2. Kakšna je povprečna vrednost izmerjene gostote? 3. Ali lahko povprečno vrednost posplošimo za celotno območje, odgovor obrazložite. 4. Od česa je odvisna gostota izbrane vrste? 3.5 Vzorčenje gozda Pri vajah bomo tudi mi izvedli del gozdne inventure. Dolgoročno bomo lahko spremljali vpliv podnebnih sprememb in človekovega delovanja na izbranem območju. 62 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING PRAKTIČNA VAJA Popis osnovnih podatkov vzorčnega mesta gozdne inventure MATERIAL IN PRIPOMOČKI - meter METODA DELA • Gozdno inventuro pričnite s popisom osnovnih podatkov na izbrani lokaciji. • Ko opravite vpogled v gozd, se osredotočite na popis znakov, ki so povezani s posameznim drevesom. Naključno sistematično izberite 10 dreves in popišite lastnosti. Podatke zabeležite v tabelo (Glejte naprej.) • Izračunajte povprečje obsega dreves in določite razvojno fazo gozda. REZULTATI Tabela 37: Osnovni podatki vzorčnega mesta gozdne inventure15 Lokacija Ime in priimek popisovalca Datum Vreme GPS-koordinate 1. Ura Vidljivost a. normalna b. poslabšana Podatki o gozdu Lastništvo Relief 1- državno 1- ravnina 2 - zasebno 2 - vrh hriba, greben 3 - neznano 3 - dno kotanje 4 - lokalne skupnosti 4 - pobočje 2. 5 - konveksni prelom pobočja * podatkovna zbirka Zavoda za gozdove Slovenije 6 - konkavni prelom pobočja 7 - jarek Skalovitost in kamnitost Skalovitost je delež površine, ki ga zavzemajo Kamnitost je delež površine, ki ga zavzema skale – kos matične kamnine večji kot kamenje – kos matične kamnine manjši kot 30cm*30cm*30cm. 30cm*30cm*30cm. 1 - brez skal 1 - brez kamnov 2 - posamične skale < 5 % 2 - posamični kamni < 5 % 3 - majhna skalovitost: 5-26 % 3 - majhna kamnitost: 5-26 % 4 - srednja skalovitost: 26–50 % 4 - srednja kamnitost: 26 – 50 % 3. 5 - velika skalovitost: 51 – 76 % 5 - velika kamnitost: 5 –76 % 6 - izjemna skalovitost > 76 % 6 - izjemna kamnitost > 76 % 15 Kovač in sod., 2014 Praktični pouk iz bioloških analiz 63 REZULTATI Slojevitost sestoja 1 in 2 - prebiralna - združba 3 – enakomerna (visoki gozd) 4 in 5 – raznodobna 6 – dvoslojna 7 – panjevec 8 – grmičast gozd 4. Razvojna faza gozda 1 – mladovje – obseg manj kot 31 cm 2 – tanjši drogovnjak – 31 cm < obseg < 62 cm Debeljak – 100 dreves/ ha 3 – močnejši drigovnjak – 62 cm < obseg < 94 cm * Na kateri višini se meri 4 – tanjši debeljak – 94 cm < obseg < 126 cm obseg gozda? 5 – srednji debeljak – 126 cm < obseg < 157 cm 6 – močnejši debeljak- obseg več kot 157 cm 5. Bodi pozoren, kako meriš obseg drevesa. 6. 64 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Mešanost sestoja * Mešanost sestoja je opredeljena kot pokrovnost iglavcev oz. listavcev v strehi sestoja. iglavci – Pigl > 75 % iglavci z listavci – 50% < Pigl < 75 % listavci z iglavci – 25 % < Pigl < 50 % listavci - Pigl < 25 % 7. Socialni položaj drevesa 1 – nadvladajoče drevo; izjemno razvita krošnja, močno nad sestojno streho 2 – vladajoče drevo; dobro razvita krošnja, v vrhu sestojne strehe 3 – sovladajoče drevo; nekoliko slabše razvita krošnja, spodnji del sestojne strehe 4 – potisnjeno in obvladovano drevo – utesnjeno z več strani, porinjeno v spodnji del sestojne strehe 5 – podstojno drevo – pogosto brez možnosti socialnega vzpona in odmrlo prej kot ostala drevesa 8. Praktični pouk iz bioloških analiz 65 REZULTATI Tabela 38: Popis značilnosti 10 dreves na naključno izbrani točki gozda Vrste Obseg Približna starost Socialni položaj (obseg = cm / 1,5 cm ) drevesa Osutost, porumenelost 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Izračun povprečja obsega 10 dreves: Razvojna faza gozda je (Glejte 6. točko.) Kaj se bo zgodilo s tem gozdom v prihodnosti? (Pogovor o trajnostni tehtnici: sonaravno gospodarjenje z gozdom/posekom in vprašanje dobička) NALOGE Oglejte si film: Ugriznimo znanost – Gozdna inventura: https://4d.rtvslo.si/arhiv/ugriznimo-znanost/174595305 in odgovorite na vprašanja. 1. Koliko dreves imamo v Sloveniji (skupaj bukve, smreke, jelke, hrast)? 2. V katerih letih se je izvedla moderna inventura gozda (4-krat)? 3. Kako smo določili vzorčne ploskve in koliko jih je? Koliko jih leži v gozdu in so bile na koncu dejansko vzorčene? Koliko od njih je nedostopnih - kje ležijo in kaj storiti v tem primeru? 4. Kako smo iz rezultatov vzorčenja prišli do rezultatov za celotno Slovenijo? 5. Kaj vse morajo popisati tisti, ki izvajajo monitoring? Naštejte posamezne kategorije. 6. Na kaj bodo rezultati vplivali? 66 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING PRAKTIČNA VAJA Popis znakov, ki so vezani na odmrlo maso V gozdu mora biti vedno vsaj 5 % odmrle biomase. V to skupino uvrščamo: - ležeče odmrlo drevo, - štrleče odmrlo drevo – sušico, - panj ali štor … Štor se meri, če je srednji premer večji kot 10 cm in njegova višina večja kot 20 cm. MATERIAL IN PRIPOMOČKI - meter - štori dreves METODA DELA • V naravi najdite 3 štore in jih izmerite po principu kot kaže spodnja slika. Slika 36: Meritve panja za izračun odmrle biomase16 • Rezultate meritev vpišite v spodnjo tabelo. • Najdite tudi posekano ali padlo deblo. Fotografirajte ga in na posnetku označite: skorjo, živo lubje, beljavo, črnjavo, stržen, braniko in letnico. Pri označbi si pomagajte s Sliko 37. • Deblu izmerite osnovne meritve in ocenite starost debla. 16 Kovač in sod., 2014 Praktični pouk iz bioloških analiz 67 Mlajši deli lesa so BELI, zato jih imenujemo BELJAVA. Deli so mokri, saj se po njih pretaka voda z anorganskimi snovmi. Starejši deli so TEMNEJŠI, zato jim pravimo ČRNJAVA. Ne prevajajo več snovi, temveč le dajejo oporo. Po navadi vsebujejo tudi OBRAMBNE SNOVI, ki so temnejše obarvane. BRANIKA je pas lesa, ki priraste v eni vegetacijski dobi (v enem letu). Najbolj nov je les, ki leži tik pod lubjem. Spomladi, ko je rast bujnejša, nastaja redkejši les, ki je bolj svetel. Pozno poleti in jeseni se rast ustavi, takrat je les bolj gost in temnejše barve - to vidimo kot značilno črto, ki loči braniko od branike – LETNICA. Branike so različno široke. Tako vemo, katero leto je bilo sušno (ožje branike) in v katerem je bilo vode dovolj (širše branike). Slika 37: Prečni prerez debla z označenimi deli17 REZULTATI Tabela 39: Meritve panja za izračun odmrle biomase 1. panj 2. panj 3. panj srednji premer srednja višina 17 Kovač in sod., 2014 68 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Tabela 40: Osnovne meritve debla in določitev starosti Premer debla je cm Obseg debla je cm Starost debla - po letnicah: - po izračunu: obseg na 1,3m (v cm) /1,5 cm = Na deblu najdite tudi: - 1. rojstni dan drevesa. To je na drevesu. - braniko drevesa, ki nakazuje vašo starost. To je na drevesu. - braniko, ki nakazuje abrahama. To je na drevesu. - leto, ko se je začela 2. svetovna vojna. To je na drevesu. NALOGE 1. Oglejte si filma o podnebnih spremembah v gozdu; https://4d.rtvslo.si/arhiv/dokumentarni-filmi-in-oddaje-izobrazevalni-program/174685900 2. V dnevnik zapišite povzetke videnega. 3. Kako se kažejo podnebne spremembe v slov. gozdovih? Naštejte jih in obrazložite. 4. Navedite ukrepe/odzive. 5. Obrazložite, kakšno je sonaravno gospodarjenje z gozdom. Praktični pouk iz bioloških analiz 69 4 ŽIVALSKI KAZALNIKI 4.1 Spremljanje stanja ptic okoli nas Ptice so naravni regulatorji škodljivcev. Njihovo ohranjanje je bistveno za ohranjanje ekosistemskih storitev narave. Hkrati so tudi pokazateljice ekološkega stanja okolja. V zimskem času se pogosto ugotavlja število najpogostejših vrtnih ptic v naši bližini z metodo neposrednega štetja. PRAKTIČNA VAJA Spremljanje stanja ptic okoli nas MATERIAL IN PRIPOMOČKI - opazovalni karton - mobilni telefon - beležka - fotoaparat, spektiv - nevpadljiva obleka - daljnogled METODA DELA • Popis ptic boste izvedli v dveh korakih. o V prvem tednu pred glavnim opazovanjem boste izbirali pravi čas vzorčenja in lokacijo ter poskušali določiti prevladujoče vrste. Pri tem lahko vrste fotografirate ali skicirate. To bodo vaše začetne ptice. o V drugem tednu boste izvedli glavno opazovanje. (Glejte časovnico DOPPS-a.) • Najprimernejši čas opazovanja je v intervalu prvih treh ur po sončnem vzhodu in zvečer (tudi čas najintenzivnejšega oglašanja). • Vaši gibi pri opazovanju naj bodo umirjeni in počasni. • Okolico opazujete vsaj pol ure in si zabeležite vse ptice, ki jih opazite. • Na vzorčnem mestu bodite pozorni na: o barvo: barva na posameznih delih telesa, vzorci – glava, rep, peruti, o velikost: za primerjavo vzamete vam znano ptico npr. velikost kosa, o obliko telesa in kljuna, o vedenje ptice: se premika po tleh ali v krošnji, poskakuje, kako leti, je sama ali v jati. • Pri identifikaciji ptice si pomagajte s skico ali fotografijo. 70 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING • Pri popisu ptic si lahko pomagate tudi: - z letakom za opazovanje: https://www.ptice.si/wp-content/uploads/2016/01/ptice_okoli_nas_letak_splosen.pdf, - z določevalnim kotičkom: https://www.ptice.si/ptice-in-ljudje/opazovanje-ptic/dolocevalni-koticek/, - s koristnimi nasveti: https://www.ptice.si/wp-content/uploads/2014/03/brosure_2016_ptice_ slovenije_mali_prirocnik.pdf. • Ptice določamo tudi po petju in oglašanju, pri čemer si lahko pomagate s posnetki. Ključ za določanje vrtnih ptic po oglašanju • V rezultate prilepite zemljevid, kjer naj bodo označena mesta vzorčevalca in lokacija spremljanja. Ne pozabite na merilo zemljevida in legendo. • Podatke o popisu ptic vnesite na spodnji obrazec, lahko pa jih vnesete tudi v spletni obrazec, ki ga najdete na: https://www.ptice.si/oznaka/ptice-okoli-doma/ • Tri najpogosteje opažene ptice podrobneje opišite v tabeli. REZULTATI Posnetek zemljevida vzorčne ploskve za popis ptic Praktični pouk iz bioloških analiz 71 REZULTATI Tabela 41: Primerjava prvega in drugega popisa ptic 1. teden opazovanja 2. teden opazovanja datum opazovanja ura: lokacija (kraj/ npr. krmilnica pred hišo) habitatni tip vrsta ptic/število skupaj vseh ptic Tabela 42: Podrobnejši popis opazovanih lastnosti ptic Opazovane vrste ptic Vrsta Vrsta Vrsta čas opazovanja barva velikost: v primerjavi s kosom oblika telesa oblika kljuna vedenje ptice način oglašanja 72 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 4.2 Vzorčenje dvoživk Dvoživke so pomembni ekološki kazalniki stanja okolja, saj so zelo občutljive na okoljske spremembe, so dobro poznane in splošno razširjene. S poznavanjem njihovih bioloških in ekoloških značilnosti lažje izvedemo populacijski monitoring ali monitoring razširjenosti. Na podlagi dobljenih rezultatov lahko sklepamo o varstvenih usmeritvah. NALOGE 1. Za varstvo dvoživk danes uporabljamo usmeritveno ograjo proti podhodu. Navedite značilnosti take gradnje. Usmeritvena ograja Podhod 2. Dvoživke delimo na dve skupini, navedite njihove značilnosti. Repate dvoživke Nerepate dvoživke prisotnost repa telo okončine gibanje oploditev 3. Katere dvoživke smo dolžni spremljati po Habitatni direktivi? 4. S pomočjo določevalnega ključa na spletni strani: https://www.lifeamphicon.eu/wp-content/ uploads/2020/12/E.3-Dolocevalni-kljuc-dvozivk-Slovenije.pdf določite do vrste natančno osebke v spodnji tabeli. Praktični pouk iz bioloških analiz 73 Tabela 43: Vrste dvoživk https://www.ckff.si/projekti/interreg/dvozivke_salamandra_salamandra.php (24.10.2023) 74 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING PRAKTIČNA VAJA Analiza mresta Štetje in analiza mresta dvoživk je splošno uporabljena tehnika za določitev prisotnosti vrst ter za spremljanje velikosti in razmnoževalnega trenda populacij dvoživk. Pri tem je zelo pomembno, da to izvajamo v času, ko je večina mresta odloženega in so je še dovolj svež, da je določitev vrste zanesljiva. MATERIAL IN PRIPOMOČKI - različne mreže na držalih - banjice - škornji in rezervne obleke METODA DELA • Poiščite vodonosnik (mlaka, kal, mrtvica …) in preglejte različne mikrohabitate. Pri tem izmerite osnovne parametre in jih vpišite v tabelo. • Če najdete mrest, ga z mrežo ulovite in postavite v banjico, v nasprotnem primeru pa poiščite drug vodonosnik. • S pomočjo določevalnega ključa določite do vrste natančno, rezultate pa zabeležite med rezultate. • Poskusite določiti starost mresta glede na razvitost ploda, nato pa osebke vrnite nazaj v vodo. Sveži Stari Zelo stari 1-7 dni 7-14 dni 14-21 dni Slika 38: Določevanje starosti mresta glede na razvitost ploda18 18 Bizjak Mali, 2016 Praktični pouk iz bioloških analiz 75 REZULTATI Tabela 44: Osnovni podatki vzorčnega mesta mresta Datum in čas vzorčenja Vzorčevalec Vreme T zraka Način vzorčenja: • transekt T vode • točke Območje popisa GPS-koordinate Dolžina vzorčnega mesta Lokacija: Tip substrata: Brežina: • mlaka • skale • naravna • tolmun • beton • umetna • depresija • veliki kamni • izvir • prod • kolesnica • gramoz Povprečna globina vodnega telesa • mrtvica • pesek • ribnik • mulj • bajer • glina • Opis najdišča • prevladujoči rastlinski taksoni v 5-metrskem pasu od najdišča • vir onesnaženja in grožnje Fizikalno-kemijski parametri vode pH el. prevodnost raztopljen kisik nitrat 76 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Tabela 45: Številčnost posameznega mresta na vzorčnem mestu19 Posnetek mresta Vrsta Številčnost Starost mresta krastače dolge vrvice (6 m) 10–12000 jajčec marec-junij urhi manjši skupki 15–30 jajc april-avgust česnovke nitasti mrest nepravilno nameščenih jajčec marec-april prave žabe večja kepa jajčec rege majhna kepica do 100 jajc april-junij 19 Bizjak Mali, 2016 Praktični pouk iz bioloških analiz 77 PRAKTIČNA VAJA Analiza juvenilnih in odraslih dvoživk V času selitve dvoživk na obremenjenih mestih postavljamo varovalne ograje. S tem preprečimo povoz žab. Prav na teh mestih se izvaja popis dvoživk in hkrati tudi varno selitev na drugo stran cestišča. MATERIAL IN PRIPOMOČKI - mreža - fotoaparat (mobilni telefon) - ključ za določanje (mrest, vrste) - beli pladnji - vzorčni lončki - viscor kovček za analizo vode METODA DELA • Popis se izvede v razmnoževalnem obdobju – zgodaj spomladi. • Na izbrani lokaciji opravite popis dvoživk. Izvedete popolno štetje osebkov z neselektivno metodo: neposredno štetje. • Dvoživke ulovite z mrežo, jih narišite v zvezek, popišite in izpustite nazaj v naravo. Pri tem poskušate čim manj vznemirjati živali. Zelo pomembno je, da se dvoživke dotikate z vlažnimi rokami. • Ko najdete primerke, poskušajte ugotoviti, ali gre za mlad ali star osebek, za dupleks (parček) ali posamezni osebek. Prav tako bodite potrpežljivi in poskušajte ujeti zvoke oglašanja. • Na isti lokaciji izvedite tudi lov s pastmi tako, da na znani lokaciji prekinete selitveno pot s pastjo. Naslednji dan obvezno poglejte ulov. 78 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Tabela 46: Osnovni podatki vzorčnega mesta vzorčenja dvoživk Datum in čas vzorčenja Vzorčevalec Vreme T zraka Način vzorčenja: • transekt T vode • točke Območje popisa GPS-koordinate Velikost vzorčnega mesta Habitat Opis najdišča • prevladujoči rastlinski taksoni v 5-metrskem pasu od najdišča • vir onesnaženja in grožnje Praktični pouk iz bioloških analiz 79 REZULTATI - Skice najdenih primerkov vrsta starost oglašanje številčnost vrsta starost oglašanje številčnost NALOGE 1. V literaturi preglejte vzorčne lokacije habitata laške žabe ali nižinskega, hribskega urha ter velikega pupka. 2. Kakšna je bila gostota dvoživk na hektar izbranega območja? 80 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 4.3 Vzorčenje bentoških nevretenčarjev Bentoški nevretenčarji so biološki kazalniki kvalitete vode. Metoda temelji na različni občutljivosti vodnih nevretenčarjev na onesnaženje in na različni pestrosti njihovih združb. Prav tako kakovost vode kaže tudi pestrost drugih vodnih živali in rastlin, vendar se največkrat zanašamo prav na bioindikatorske vrste, saj so te najbolj občutljive na spremembe kakovosti vode. Biološka analiza vode je zanesljiva metoda, ki ne pokaže samo trenutnih rezultatov kakovosti, kot na primer kemijska analiza vode. Priporočljivo je, da izvajamo obe analizi hkrati, da dobimo čim bolj natančne rezultate. PRAKTIČNA VAJA Vzorčenje bentoških nevretenčarjev z mrežo MATERIAL IN PRIPOMOČKI - določevalni ključi - mreža za vodne nevretenčarje - kadičke - lupe - posodice s pokrovom - etanol (za spravilo organizmov v učilnici, za kasnejšo analizo) METODA DELA • Na izbranem vzorčnem mestu izmerite dva transekta v dolžini 100 m. • S pomočjo mreže vzorčite znotraj transekta tako, da preiščete čim več mikrohabitatov. To počnete tako, da greste proti toku. • Nabrane vzorce prenesite v bele banjice. • Iz banjice organizme sortirajte tako, da je vsaka vrsta v svoji embalaži. • S pomočjo določevalnega ključa popišite in preštejte vse bentoške nevretenčarje. • V rezultate zabeležite opravljene meritve. • Izračunajte saprobni indeks vodnega telesa. • Določite obremenjenost izbranega vodnega telesa. • Po končani vaji nevretenčarje izpustite v naravo. REZULTATI Posnetek zemljevida vzorčne ploskve bentoških nevretenčarjev Praktični pouk iz bioloških analiz 81 REZULTATI Tabela 47: Osnovni podatki vzorčnega mesta vzorčenja bentoških nevretenčarjev z mrežo Datum in čas vzorčenja Vzorčevalec Vreme T zraka Način vzorčenja: • transekt T vode • točke Območje popisa GPS-koordinate Velikost vzorčnega mesta Habitat Opis najdišča • prevladujoči rastlinski taksoni v 5-metrskem pasu od najdišča • vir onesnaženja in grožnje 82 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Tabela 48: Popis bentoških nevretenčarjev s pomočjo mreže20 Skupine Število na prvi lokaciji Število na drugi lokaciji 1. skupina: najobčutljivejša skupina na onesnaževanje ličinke vrbnic ličinke enodnevnic 2.skupina: zmerno občutljiva na onesnaženje školjke polži potočni raki mladoletnice potočne postranice ličinke kačjih pastirjev 20 Pintarest in Kakšna je voda v mojem okolju? Praktični pouk iz bioloških analiz 83 REZULTATI Skupine Število na prvi lokaciji Število na drugi lokaciji 3.skupina: tolerantna na onesnaženje ličinke komarja pijavke vodni osliček ličinka trzače 4.skupina: najodpornejša na onesnaženje polž mlakar tubifeksi ličinke kalnice 84 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI Tabela 49: Izračun saprobnega indeksa bentoških nevretenčarjev, ulovljenih z mrežo Najdene živali Število živali Faktor Zmnožek ličinke vrbnic x 1,3 = sploščene in velike ličinke enodnevnic x 1,5 = okrogle in majhne ličinke enodnevnic x 2,0 = ličinke mladoletnic s hiškami x 1,5 = ličinke mladoletnic brez hišk x 1,8 = ličinke kačjih pastirjev x 2,0 = postranice x 2,0 = vodni oslički x 2,7 = pijavke x 2,5 = rdeče ličinke komarjev x 3,3 = rdeči maloščetinci x 3,5 = ličinke muh trepetavk x 4,0 = SKUPAJ = SKUPAJ = Izračun saprobnega indeksa bentoških nevretenčarjev po obrazcu: Vsoto stolpca Zmnožek delite z vsoto stolpca Število živali. Vrednost saprobnega indeksa je Tabela 50: Preglednica obremenjenosti vodnega ekosistema za saprobni indeks 1,0-1,4 1,5-2,2 2,3-2,6 2,7-3,1 3,2-4,0 neobremenjen zmerno obremenjen kritično obremenjen močno obremenjen prekomerno obremenjen Obremenjenost raziskovanega vodnega telesa za saprobni indeks je . Praktični pouk iz bioloških analiz 85 PRAKTIČNA VAJA Vzorčenje bentoških nevretenčarjev s pastmi MATERIAL IN PRIPOMOČKI - določevalni ključi - plastične vrečke za pomaranče in različni prodniki - laks - kadičke - lupe - posodice s pokrovom - etanol (za spravilo organizmov v učilnici, za kasnejšo analizo) METODA DELA • V plastično vrečko za pomaranče dajte substrat (samo kamenje, kombinacija kamenje in les ali samo les). • Vrečko na kraju dogajanja splahnete z vodo in nato položite v vodonosnik/vodotok na varno mesto (pazite na premočan vodni tok, sabotažo …). Vrečke ne pozabite zavezati z laksom. • Po 3 tednih vrečko prenesite v vedro in v laboratorij. • Organizme iz vedra sortirajte tako, da je vsaka vrsta v svoji embalaži. • S pomočjo določevalnega ključa popišite in preštejte vse bentoške nevretenčarje. • Vzorec dobro raziščite in dobljene osebke označite v spodnji tabeli. • Za posamezno skupino preštejte pestrost taksonov in pomnožite z nosilno vrednostjo taksonov (x 4, x 3, x 2 ali x 1). • Vse štiri vrednosti seštejte in dobite indeks onesnaženosti vode. • Po končani vaji nevretenčarje izpustite v naravo. REZULTATI Posnetek zemljevida vzorčne ploskve bentoških nevretenčarjev 86 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING PRAKTIČNA VAJA REZULTATI Tabela 51: Osnovni podatki vzorčnega mesta postavitve pasti za bentoške nevretenčarje Datum postavitve Datum odvzema Vzorčevalec Območje vzorčenja GPS-koordinate Temperatura vode Lastnosti struge Substrat Obrežna vegetacija Tabela 52: Prisotnost taksonov v pasti za bentoške nevretenčarje 1. skupina 2. skupina 3. skupina 4. skupina vrbnica kačji pastir pijavka vodni črvi enodnevnica postranica vrtinčar kalnice desnosučni polži školjka vodni osliček levosučni polži potočni rak rdeči maloščetinci trepetalke mladoletnica trzače Vsota taksonov Vsota taksonov Vsota taksonov Vsota taksonov X 4 X 3 X 2 X 1 Tabela 53: Preglednica onesnaženosti vodnega ekosistema 23 ali več 17-22 11-16 5-10 0-4 neobremenjen zmerno obremenjen kritično obremenjen močno obremenjen prekomerno obremenjen Stopnja onesnaženosti izbranega vodnega telesa je . NALOGE 1. Ali bomo dobili enak rezultat, če bentoške nevretenčarje lovimo z mrežo ali s pastmi? Odgovor utemeljite. 2. Kaj menite, ali substrat v pasti vpliva na biotsko pestrost? Odgovor utemeljite. Praktični pouk iz bioloških analiz 87 4.4 Vzorčenje talne favne Vedno bolj se zavedamo, da je pestrost talne favne v prehranjevalnih spletih pomembna. Velika pestrost povečuje rodovitnost tal, omogoča lažje in hitrejše kroženje geokemijskih snovi in ohranja samočistilno sposobnost tal. Tabela 54: Vpliv lastnosti tal na talno favno Značilnost tal Organizmi Primer organizma 1. Visoka gostota Mikroskopske dimenzije, burniranje okončin, Alge, glive, protozoji, bakterije, krtice, medvedi, zmožnost spreminjanja debeline telesa, močni podzemni črvi, ličinke žuželk, melipede sekalci, zaokrožena oblika črvičastega telesa 2. Grudasta struktura Močne in prožne prevleke telesa (zaščita pred Hrošči, klopi, mravlje poškodbami) 3. Pomankanje svetlobe v Zmanjšanje vidnih organov, izginotje Moli, krtne podgane, mikroorganizmi skoraj vseh obzorjih pigmentacije (barve) pri nekaterih rastlinah in živalih 4. Vdolbine, napolnjene s plini Prisotnost goste, za vodo neprepustne in Talne žuželke in raztopinami plinske lupine - kutikule 5. Pomankanje kisika, presežek Dihanje kože (uporaba zraka, raztopljenega v Deževniki, ličinke žuželk, in drugi nevretenčarji ogljikovega dioksida vodi) 6. Veliko število mrtvih Razvoj saprofagije - prehrana z razpadlimi Deževniki, bakterije, glive organizmov ostanki Določevanje talne favne s pastmi je: • primerno za nevretenčarje, ki lazijo po površini, • učinkovitost lova je povečana z vabo – gnilo meso v vabi, • boljše je, če v past damo fiksirno tekočino (NaCl, etanol). PRAKTIČNA VAJA Vzorčenje talne favne MATERIAL IN PRIPOMOČKI - ustrezno velika posoda, lonček - vrhnja zaščita na posodi – pred dežjem - orodje za izkop – manjša motika - fiksativ (kis) METODA DELA • Pripravili boste Barberjeve talne pasti, ki so primerne za organizme, ki lezejo po površini tal. • V posodo dodajte atraktant in konzervans (kis, vino, etanol … gnilo meso, salamo ...). • Izberite si primerno lokacijo in posodo zakopljite v tla. Nanjo postavite zaščito pred plenilci ali dežjem, kot kaže Slika 39. 88 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING Slika 39: Barberjeva talna past • Po 24 urah pregledajte pasti. Organizme poskusite določiti s pomočjo lupe ali mikroskopa. • Narišite skice organizmov in zabeležite njihovo številčnost. REZULTATI Tabela 55: Osnovne lastnosti območja talnih pasti Datum in čas vzorčenja Vzorčevalec Vreme T zraka Čas izpostavljenosti Območje GPS-koordinate Habitat - Posnetek zemljevida lokacije talnih pasti Praktični pouk iz bioloških analiz 89 REZULTATI - Skice organizmov in njihova številčnost NALOGE 1. Zakaj je pomembno, da postavimo nad talnimi pastmi še streho? 2. Zakaj je pomembno, da v past postavimo konzervans? 3. Zakaj je pomembno, kakšen atraktant bomo uporabili? 90 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING PRAKTIČNA VAJA Določevanje talne favne v substratu z lijakom Organski substrat na tleh skriva v sebi ogromno različnih vrst: od producentov, potrošnikov do razkrojevalcev. Določene organizme na terenu težko opazimo, saj moramo uporabiti lupo ali mikroskop. Nabiranje tovrstnih vzorcev si bomo pogledali z današnjo vajo. MATERIAL IN PRIPOMOČKI - gaza - lij - kovinska mrežica - 10-centimetrska cev s sponko - čaša z etanolom - svetilka - alu folija - vzorec zemlje METODA DELA • Najboljši vzorec tal je iz O horizonta. Globje kot greste, manj bo talnih organizmov. Zato naberite humusno zemljo. • Vzorec tal zavežite v gazo. • Gazo postavite na mrežico, ki je v liju. Lij pripnete na stojalo s prižemo. Tullgrenov suhi lijak Bermannov mikro lijak - Pod lijem postavite čašo z etanolom. - Na lij namestite cev s sponko. - V lij nalijte fiziološko tekočino tako, da se dotika gaze. • Nad gazo postavite svetilko, ki jo ovijete z alu folijo. Tako bo toplota usmerjena v vaš vzorec. • Po enem tednu preglejte, kaj se je ujelo v čaši oziroma v cevi. Praktični pouk iz bioloških analiz 91 • Pod mikroskopom ali lupo poiščite talne organizme in jih narišite ali fotografirajte. Slika 40: Talni organizmi pod mikroskopom • Z določevalnimi ključi poskusite določiti organizme čim bolj natančno. REZULTATI Tabela 56: Osnovne lastnosti tal Datum in čas vzorčenja Vzorčevalec Vreme T zraka Način vzorčenja: • transekt • točke Območje popisa GPS-koordinate Velikost vzorčnega mesta - Posnetek zemljevida vzorčnega mesta 92 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING REZULTATI - Fotografije ali slike talnih organizmov NALOGE 1. Na spletu poiščite, kateri organizmi živijo v tleh. 2. Zgoraj navedene organizme razvrstite med stalne in začasne prebivalce tal. 3. Skozi čas so se talne živali prilagodile na lastnosti tal. Navedite nekaj prilagoditev. Praktični pouk iz bioloških analiz 93 5 TUJERODNE VRSTE Ocenjuje se, da postane invazivnih približno en odstotek tujerodnih vrst, ki jih je človek hote ali nehote prinesel na neko območje. Na slikah je prikazanih nekaj invazivnih vrst. japonski dresnik (Fallopia japonica) žlezava nedotika (Impatiens glandulifera) orjaška in kanadska zlata rozga pelinolistna žvrklja, ambrozija (Solidago gigantea in Solidago canadensis) (Ambrosia artemisiifolia) Slika 41: Invazivne vrste21 21 www.tujerodne-vrste.info https://zrsvn-varstvonarave.si/odstranjevanje-invativnih-tujerodnih-vrst-na-bobovku-pri-kranju/ 94 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING PRAKTIČNA VAJA Popis tujerodnih vrst MATERIAL IN PRIPOMOČKI - določevalni ključ na https://www.tujerodne-vrste.info - rokavice - meter METODA DELA • Na izbrani lokaciji popišite tujerodne vrste in jih zabeležite v tabelo. • Izberite si štiri merilna mesta tako, da uporabite sistematično vzorčenje. Na lokacijah ovrednotite lastnosti po Kriteriju ocenjevanja vdora tujerodnih vrst (Glejte tabelo spodaj.). REZULTATI Tabela 57: Osnovni podatki o izbrani lokaciji Ime in priimek popisovalca Datum popisa Koordinate lokacije in nadmorska višina Opišite ekosistem, kjer boste izvajali popis invazivnih vrst. Tabela 58: Kriterij ocenjevanja vdora tujerodnih vrst A 0: opažena v okolici KRITERIJ OCENJEVANJA ŠTEVILČNOSTI POJAVLJANJA 1: posamič, verjetno prehodno ali le gojeno INVAZIVNIH VRST 2: raztreseno, verjetno ustaljeno 3: mestoma množično (vsaj z nekaj deset primerki, pri trajnicah primerki različne starosti) 4: splošno razširjeno in množično B MAJHEN SESTOJ – le posamične rastline (rdeči poganjki) OCENA VELIKOSTI SESTOJA SREDNJE VELIK SESTOJ – nekaj m2 velik sestoj ZELO VELIK SESTOJ – več kot 100 m2 C 0: brez vpliva KRITERIJ OCENJEVANJA VPLIVA INVAZIVNIH VRST 1: vpliv invazivnih vrst rastline zanemarljiv NA AVTOHTONE VRSTE RASTLIN NA POSAMEZNEM POPISNEM MESTU 2: vpliv zmerno opazen pri pogostosti pojavljanja, velikosti rastlin … 3: spremembe zelo vidne –celi sestoji rastlin D 1. rastline zdrave, brez pegavosti, brez sušečih se listov, brez znakov ZDRAVSTVENO STANJE objedanja 2. pegavost, sušeči se listi 3. objedanje Praktični pouk iz bioloških analiz 95 REZULTATI Tabela 59: Popis tujerodnih vrst na izbrani lokaciji Mesto 1 Mesto 2 Mesto 3 Mesto 4 Koordinate Koordinate Koordinate Koordinate a. b. c. d. a. b. c. d. a. b. c. d. a. b. c. d. japonski dresnik žlezava nedotika zlata rozga ambrozija NALOGE 1. Kaj so tujerodne vrste? 2. Na kakšen način so prišle v okolje? 3. Kaj so invazivne vrste? 4. Obkrožite in dopolnite, kaj je značilno za invazivne vrste rastlin? • Imajo MALO/VELIKO semen oz. plodov. • Semena se po zraku POČASI/HITRO razširjajo. • So za rast zelo rastline: . 5. Naštejte vzroke, zakaj so invazivne vrste problematične? 6. Kako vemo, da je določena vrsta invazivna? 7. Navedite nekaj metod zatiranja rastlinskih, živalskih in glivnih tujerodnih vrst. 8. Ali je smiselno zatiranje vseh tujerodnih vrst v naravi? 96 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 5.1 Herbarij Iz opazovanih rastlin na travniku lahko izdelate tudi svojo knjigo rastlin oz. herbarij. Herbarij je urejena in s podatki opremljena zbirka stisnjenih in posušenih rastlin ali delov rastlin. Strokovnjaki, kot so botaniki in klimatologi, z njihovo pomočjo opazujejo spremembe v rasti in razvoju rastlin skozi čas. PRAKTIČNA VAJA Izdelava herbarija MATERIAL IN PRIPOMOČKI - določevalni ključ - vrečka za shranjevanje nabranih rastlin - lopatka za lažje izkopavanje rastlin s koreninami - zvezek in svinčnik - pregibne herbarijske pole (risalni listi, ki jih prepogneš po sredini, da dobiš velikost A3) - bele etikete - dve trdi platnici in trak - časopisni papir METODA DELA • Naberite 20 rastlin in jih pripravite za izdelavo herbarija. • Na teren se odpravite v suhem in sončnem vremenu, saj se bodo takrat nabrane rastline hitreje posušile, cvetovi pa bodo najlepše odprti. • Naberite le zdrave in nepoškodovane rastline s podzemnimi deli vred (koreninami, gomolji, čebulicami) in naj ne bodo večje od herbarijske pole. • Rastline se hrani v vrečke. • Rastline določite na terenu ali pa v učilnici, pri čemer si po potrebi pomagate z laboratorijsko lupo. • Rastline doma vložite med plasti časopisnega papirja in obtežite s težjimi predmeti (knjigami), da preprečite nastanek plesni ter zgladite nagubane liste. • K vsaki rastlini dodajte listek s podatki o rastlini – herbarijsko etiketo. (Glejte Sliko 42.) • Časopisni papir med rastlinami menjajte vsakih nekaj dni, dokler rastline niso suhe. • Posušene rastline vstavite v pregibno herbarijsko polo. Za lažje sušenje čebulic jih vzdolžno prerežite na pol. • Herbarij s posušenimi rastlinami hranite v suhem prostoru. Praktični pouk iz bioloških analiz 97 ZNANSTVENO IME: Ranunculus bulbosus SLOVENSKO IME: gomoljasta zlatica LOKACIJA: SLO, Haloze, Leskovec RASTIŠČE: suh travnik DATUM: 9. 5. 2018 NABRAL IN DOLOČIL: Arnika Travniška Slika 42: Herbarijski primerek22 22 S. Gračner 98 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING 6 LITERATURA Artač, S. 2011. Biologija – Praktikum za terensko delo. Mohorjeva založba. Celovec, str. 40. Aryal, S. 2019. API (Analytical Profile Index) 20E Test – Procedure, Uses and Interpretation. Microbiology Info.com. https://microbiologyinfo.com/api-20e-test/ (21. 2. 2021). Bacterial Colony Morphologies! PathElective. https://www.pathelective.com/micromeded/bacterial-colony-morphologies (19. 2. 2021). Basic Morphology. Canada’s Arctic publiched by nonnow. http://www.arctic.uoguelph.ca/cpl/organisms/plants/terrestrial/lichens/basicmorph.htm (12. 2. 2021). Bizjak Mali, L. 2016. Gradivo za vaje pri predmetu biologija dvoživk. Izbirni predmet za študente 2. bolonjske stopnje. Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani. https://repozitorij.uni-lj.si/Dokument.php?lang=slv&id=107800 (1. 2. 2021). Božič, M., Predin, R., Trehtar, M. 2018 Mikrobiologija. Delovni zvezek za mikrobiološke vaje. DZS. Ljubljana Brand. 2006. Whatman 6886-2512 GD/X 25 Syringe Filter. Amazon publihed by Brand. https://www.amazon.com/Whatman-6886-2512-Syringe-Filter-Micron/dp/B000FN0NJA (12. 2. 2021). Crawford, K in sod. 2016. Basic Practical Microbiology. A Manual published by Microbiology Society. https://microbiologyonline.org/file/fa3f7a18b16eef6c8eb80069a17c4bcc.pdf (19. 2. 2021). Fessenden, M. 2015. Here’s What HAppens When You Culture the Bacteria on an Eight – Year – Old’s Hand: Lots of cooties grow. Smart News. https://www.smithsonianmag.com/smart-news/what-happens-when-you-culture-bacteria-eight-year-olds-hand-180955528/ (21. 2. 2021). Ike. 2011. Interga: Modern Bunsen burners, vol. 1. Studylab publiched by Ike. https://studylib.net/doc/18231667/modern-bunsen-burners (12. 2. 2021). Kakšna je voda v mojem okolju? Ključ za hitro določevanje stopnje onesnaženosti vode. Pedagoška fakulteta, Univerza v Ljubljani. http://www.pef.uni-lj.si/narteh/narspi/pages/popoldne/popoldne3.html (1. 2. 2021). Kovač, M. in sod. 2014. Monitoring gozdov in gozdnih ekosistemov – priročnik za terensko snemanje podatkov. Gozdarski inštitut Slovenije, Založba Silva Slovenika, 2014. http://eprints.gozdis.si/566/1/prirocnik_24.11.14varovan1.pdfKova%C4%8D.pdf (2. 2. 2021). Les Animaux du sol. Svtweb publiched by Candusso. http://www.svtweb.net/cred/segpa/animaux_sol.htm (1. 2. 2021). Lichen, Fungus, cross section slide under the microscope view for education biology. 123RF published by Puntasit Choksawatdikorn. https:// www.123rf.com/photo_137074051_lichen-fungus-cross-section-slide-under-the-microscope-view-for-education-biology-.html (12. 2. 2021). Life to Grasslands. Life Ohranjanje in upravljanje suhih travišč v Vzhodni Sloveniji. Haloze. Slika Visokodebelni sadovnjak v Dobrni. https://www.lifetograsslands.si/fotogalerija/haloze/ , http://www.lifetograsslands.si/wp-content/uploads/2017/10/Program-delavnic-na-temo- suhih-travi%C5%A1%C4%8D-%E2%80%93-za-tretje-triletje-osnovnih-%C5%A1ol.pdf (2.2.2021) Oblike bakterij in sterilizacija. 2009. Portal za izobraževanje iz zdravstvene nege. https://www.zdravstvena.info/vsznj/oblike-bakterij-in-sterilizacija-koki- bacili-spiralne-bakterije-sterilizacia-fizikalna-sterilizacija-kemicna-sterilizacija/ (12. 2. 2021). Pintarest: Enviromental Education: Macroinvertebrate identification key.. Uploaded by Coal Creek Watershed Coalition. https://www.pinterest.com/pin/376683956306794070/ (1. 2. 2021). Reynolds, J. 2020. Bacterial Colony Morfology. BiologyLibreText. https://bio.libretexts.org/Learning_Objects/Laboratory_Experiments/Microbiology_ Labs/Microbiology_Labs_I/08%3A_Bacterial_Colony_Morphology (19. 2. 2021). Root River and Wimmer Wetland Earthcacher. Geocaching published by Hoppe2findyou. https://www.geocaching.com/geocache/GC1CDJZ_root-river- and-wimmer-wetland-earthcache?guid=4ee15246-5a6a-41a2-bc7b-c751d90a94d1 (12. 2. 2021). Rudolf, B. 2014. Spremembe v lišajski flori na Goriškem in preizkušanje interaktivnega določevalnega ključa. Diplomsko delo. https://www2.ung.si/~library/diplome/OKOLJE/145Rudolf.pdf (2.2.2021) Sanders, E.R. 2012. Aseptic Laboratoriy TEchniques: Plant Methods. Jove Jurnal: Biology. https://www.jove.com/t/3064/aseptic-laboratory-techniques-plating-methods (12. 2. 2021). Škornik, S. 2019. Kazalniki za spremljanje dogajanja naravovarstvenih ciljev na vrstno bogastvo suhih travišč v Sloveniji. Mednarodna konferenca – Izzivi in priložnosti multifunkcijskega upravljanja travišč. Life to Grasslands publiched by Škornik. http://www.lifetograsslands.si/wp-content/uploads/2018/07/Skornik_-presentation.pdf (2. 2. 2021). The Microbial World – Presentation transcript. SlidPlayer published by Sage Maul. https://slideplayer.com/slide/4171360/ (2. 2. 2021). University of Wisconsin – Extension in cooperation with the Wisconsin Dept. Of Natural REsources. Vall, de Tim. Microscope Diagram Labeled, Unlabeled and Blank, Parts of a Microscope. Tim’s Printtables published by Tim van de Vall. https://www.timvandevall.com/microscope-diagram-parts-of-a-microscope/ (12. 2. 2021). Vovk Krože, A. in sod..2021. Delovni zvezek za poletno šolo. Ekoremediacije v jugovzhodni Sloveniji. https://www.rc-nm.si/wp-content/uploads/2017/02/JVS-DELOVNI-ZVEZEK.pdf Praktični pouk iz bioloških analiz 99 7 PRILOGE Priloga 1: Mejne vrednosti mikroorganizmov v različnih vzorcih voda Vzorec Mikroorganizem Število celic totalne kolifomne bakterije 0/100 ml vzorca pitna voda iz vodovoda fekalne kolifomne bakterije 0/100 ml vzorca E. coli 0/100 ml vzorca totalne kolifomne bakterije 0/100 ml vzorca fekalne kolifomne bakterije 0/100 ml vzorca ustekleničena pitna voda E. coli 0/100 ml vzorca preštete mikrobne kolonije pri inkubaciji 22 °C 100/ml preštete mikrobne kolonije pri inkubaciji 37 °C 20/ml totalne kolifomne bakterije <10/100 ml vzorca kopalni bazeni E. coli 0/100 ml vzorca preštete mikrobne kolonije pri inkubaciji 37 °C <100/ml totalne kolifomne bakterije <10 000/100 ml vzorca kopalna voda na plaži (morje, reke, jezera) fekalne kolifomne bakterije <2 000/100 ml vzorca E. coli <500/100 ml vzorca 100 EKOLOŠKE ANALIZE IN MONITORING Priloga 2: Ovitek lišajskega herbarija Lišajski herbarij Ime vrste: Tip steljke: Lokacija najdbe: Substrat: Habitatni tip: Raziskovalec: Leto najdbe: Praktični pouk iz bioloških analiz 101 8 VIRI SLIK Whatman, 2006. Syringe Filter Collection. Superior performance and choice. GE Healthcare Life Sciences. Printtables publiched by Fisher Scientific. https://beta-static.fishersci.com/content/dam/fishersci/en_US/documents/programs/scientific/brochures-and-catalogs/brochures/ge-healthcare- whatman-syringe-filter-collection-brochure.pdf (8. 10. 2023). https://www.ckff.si/projekti/interreg/dvozivke_salamandra_salamandra.php (24.10.2023) https://www.gov.si/zbirke/seznami/seznam-invazivnih-tujerodnih-vrst-rastlin-in-zivali/zlezava-nedotika-lat-impatiens-glandulifera/ https://www.tujerodne-vrste.info/vrste/ https://zrsvn-varstvonarave.si/odstranjevanje-invativnih-tujerodnih-vrst-na-bobovku-pri-kranju/ Document Outline 1 Uvod 2 Mikrobiološki kazalniki 2.1 Priprava laboratorijskega inventarja Sterilizacija laboratorijskega inventarja 2.2 Priprava hranilnih podlag za mikroorganizme Priprava različnih gojišč 2.3 Bris z različnih površin Bris z različnih površin 2.4 Razmaz do posameznih kolonij Razmaz do posameznih kolonij 2.5 Določevanje celokupnega števila mikroorganizmov iz vodnih vzorcev Določevanje celokupnega števila mikroorganizmov iz vodnih vzorcev 2.6 Določevanje koliformnih organizmov Določevanje koliformnih organizmov 2.7 Določevanje prisotnosti E. coli Določevanje prisotnosti E. coli 2.8 Določevanje mikrobiološke kvalitete zraka Določevanje mikrobiološke kvalitete zraka 2.9 Izolacija gliv iz tal Izolacija gliv iz tal 3 Rastlinski kazalniki 3.1 Vzorčenje onesnaženosti zraka preko epifitskih lišajev Določanje indeksa zračne čistosti (Indey of Athmospheric Purity – IAP) 3.2 Vzorčenje fitobentosa Določanje ekološkega stanja vodotoka s kremenastimi algami 3.3 Vzorčenje makrofitov Določanje ekološkega stanja vodotoka z makrofiti 3.4 Vzorčenje višje razvitih rastlin Določevanje biotske pestrosti na travnikih Določevanje pokrovnosti posameznih vrst na izbrani površini Določevanje gostote posameznih vrst 3.5 Vzorčenje gozda Popis osnovnih podatkov vzorčnega mesta gozdne inventure Popis znakov, ki so vezani na odmrlo maso 4 Živalski kazalniki 4.1 Spremljanje stanja ptic okoli nas Spremljanje stanja ptic okoli nas 4.2 Vzorčenje dvoživk Analiza mresta Analiza juvenilnih in odraslih dvoživk 4.3 Vzorčenje bentoških nevretenčarjev Vzorčenje bentoških nevretenčarjev s pastmi 4.4 Vzorčenje talne favne Vzorčenje talne favne Določevanje talne favne v substratu z lijakom 5 Tujerodne vrste Popis tujerodnih vrst 5.1 Herbarij 6 Literatura 7 Priloge 8 Viri slik