Oznaka poročila: ARRS-RPROJ-ZP-2013/76 ZAKLJUČNO POROČILO RAZISKOVALNEGA PROJEKTA A. PODATKI O RAZISKOVALNEM PROJEKTU 1.Osnovni podatki o raziskovalnem projektu Šifra projekta Jl-2017 Naslov projekta Epitelijska celična adhezijska molekula (EpCAM) - tarča tumorske terapije: struktura, proteolitično procesiranje in interakcija z drugimi proteini Vodja projekta 3422 Brigita Lenarčič Tip projekta J Temeljni projekt Obseg raziskovalnih ur 4173 Cenovni razred C Trajanje projekta 05.2009 - 04.2012 Nosilna raziskovalna organizacija 103 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Raziskovalne organizacije -soizvajalke Raziskovalno področje po šifrantu ARRS 1 NARAVOSLOVJE 1.05 Biokemija in molekularna biologija Družbenoekonomski cilj 07. Zdravje 2.Raziskovalno področje po šifrantu FOS1 Šifra 1.06 -Veda 1 Naravoslovne vede - Področje 1.06 Biologija B. REZULTATI IN DOSEŽKI RAZISKOVALNEGA PROJEKTA 3.Povzetek raziskovalnega projekta2 SLO Epitelijska celična adhezijska molekula (EpCAM) je transmembranski glikoprotein, ki je vključen v adhezijske povezave celica-celica in signaliziranje. V okviru raziskovalnega projekta smo celovito okarakterizirali EpCAM s strukturnega vidika. Osrednji rezultat predstavlja kristalna struktura dimera zunajceličnega cela EpCAM, kar predstavlja polovico tetramerne adhezijske entoe (le-ta je trans-dimer dveh cis-dimerov s sosednjih celic). Izračunali smo tudi model tetramerne adhezijske enote, ki je podprt z eksperimentalnimi opažanji. Strukturno karakterizacijo smo razširili na transmembranski del, ki smo ga podrobneje preučili s pomočjo simulacije molekulske dinamike. Rezultati jasno kažejo, da tudi transmembranska heliksa dveh monomerov EpCAM tvorita dimer, ki tako dodatno prispeva k stabilizaciji dimera zunajceličnega dela ter vpliva na interakcije z drugimi transmembranskimi proteini ter posredno tudi z znotrajceličnimi proteini preko omejevanja mobilnosti in dostopnosti kratkega znotrajceličnega repa. Naši rezultati kažejo, da znotrajcelični del EpCAM neposredno interagira z nemišičnim alfa-aktininom-1 in -4. Ta interakcija je pomembna za sidranje EpCAM na aktinski citoskelet kar omogočoa vzpostavitev stabilnih medceličnih povezav ter hkrati predstavlja dodaten mehanizem regulacije signalne aktivnosti EpCAM. Preko sodelovanja s skupino prof. Plückthuna (Institut za biokemijo, Univerza v Zürichu, Švica) smo začeli tudi z aplikativno strukturno karakterizacijo EpCAM v kompleksu z anti-EpCAM DARPini (dizajnirani proteini, osnovani na ankirinskih ponovitvah), ki jih je možno pripraviti v obliki nosilnih molekul za določene funkcionalne skupine (npr. toksine); takšni konstrukti s končnim namenom uporabe kot terapevtiki so že v predkliničnem testiranju. Povzeto, s podrobno strukturno karakterizacijo EpCAM smo bistveno prispevali k poznavanju medceličnih adhezijskim molekul ter hkrati ponudili dobro osnovo za načrtovanje/izboljšanje na EpCAM osnovanih diagnostičnih in terapevtskih orodij. ANG Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is a transmembrane glycoprotein involved in cell-cell adhesion and signalling. In the course of the research project we have thoroughly characterized EpCAM from the structural point of view. Our main result is the crystal structure of dimeric part of extracellular part of EpCAM which represents a half of a tetrameric adhesion unit (trans-dimer of two cis-dimers from neighouring cells). Also, we have calculated a model of the tetrameric adhesion unit which is supported by experimental observations. Structural characterization was further extended to involve the transmembrane part which was studied in detail using simulation of molecular dynamics. The results clearly show that also the two transmembrane helices of two EpCAM molecules form a dimer which additionally stabilizes the extracellular dimer and influences interactions with other transmembrane proteins and indirectly also with intracellular proteins via restricting mobility and accessibility of the short intracellular tail. Additionally, our results show that short intracellular part of EpCAM directly interacts with non-muscle alpha-actinin-1 and -4. This interaction is important for anchoring EpCAM to actin cytoskeleton which is essential for stable cell-cell adhesion contacts as well as provides an additional mechanism for regulation of EpCAM signalling activity. Througth collaboration with group of Prof. Plückthun (Institute of Biochemistry, University of Zürich, Switzerland) we have also started applied structural characterization of EpCAM in complex with anti-EpCAM DARPins (designed ankyrin repeat proteins) which can be produced to carry an additional functional group (e.g. toxin); such constructs with the final aim to be used as therapeutics are already in preclinical phase trials. To sum up, with the detailed structural characterization of EpCAM we have substantially contributed to the knowledge on cell-cell adhesion molecules and also provided a firm and exciting foundation for developing/enchancement of EpCAM-based diagnostic and therapeutic tools. 4.Poročilo o realizaciji predloženega programa dela na raziskovalnem projektu3 Glavni dosežek v okviru raziskovalnega projekta je kristalna struktura zunajceličnega dela epitelijske celične adhezijske molekule (EpCAM). Kristalno strukturo smo iz posnetih difrakcijskih podatkov, posnetih do ločljivosti 1,86 Ä, izračunali preko faziranja na osnovi anomalnega signala žvepla (S-SAD); podatke smo posneli na Odseku za biomolekularno strukturno kemijo Univerze na Dunaju (Department for Biomolecular Structural Chemistry, Max F. Perutz Laboratories, University of Vienna). Določili smo strukturo funkcionalnega cis-dimera zunajceličnega dela EpCAM, ki nastane s povezavo dveh monomerov na isti celici, kar predstavlja polovico adhezijske enote. Gre za strukturo trojne mutante EpCAM, pri kateri so trije asparaginski ostanki, vključeni v pritrditev olgjikohitratnih verih (N-glikozilacija), zamenjani z glutamatnimi aminokislinskimi ostanki, kar ne vpliva na samo zvitje/strukturo polipeptidnega dela zunajceličnega dela EpCAM, hkrati pa je zaradi višje homogenosti vzorca bila mogoča rešitev strukture z boljšo ločljivosto. Ta struktura je pomembna iz več razlogov: (1) pojasnjuje vlogo posameznih domen v EpCAM, (2) predstavlja eno izmed redkih znanih struktur celotnega dela adhezijske molekule, (3) je pomembna za načrtovanje diagnostičnih in/ali terapevtskih protiteles in drugih molekul, ki prepoznajo EpCAM. S pomočjo modeliranja in umestitve (docking) na podlagi znanih podatkov (stiki domen v adhezijski enoti) smo pripravili smiseln model tetramerne adhezijske enote, sestavljene iz dveh cis-dimerov zunajceličnih delov EpCAM. Model smo želeli dodatno potrditi s podatki eksperimentov kartiranja interagirajočih regij, tudi pri pogojih molekulskega nagnetenja (molecular crowding), a zaradi šibke interakcije dimer-dimer to ni bilo mogoče. Predvidevamo, da je za stabilnejšo interakcijo pomembna prisotnost transmembranskega dela, zaradi katerega bi lahko prišlo do spremembe v konfomaciji nekaterih regij zunajceličnega dela, ki so vključene v nastanek tetramera. Ugotovili smo, da proteolitska cepitev EpCAM s strani nekaterih katepsinov (mesto cepitve se nahaja v okviru tiroglobulinske domene zunajceličnega dela) razrahlja povezavo med monomeroma v dimeru, kar vodi v razpad slednjega. Do tega pride tako pride tako pri glikozilirani in neglikozilirani (mutirani) obliki EpCAM. Opažen proces je lahko odigra pomembno vlogo pri regulaciji adhezijske in/ali signalne vloge EpCAM tako pri zarodnih celicah kot v tumorskem tkivu. Dela na domeni zunajceličnega dela EpCAM, ki nima cisteinskih ostankov, smo ustavili, saj domene ni možno pripraviti v bakterijskem ekspresijskem sistemu v zadostnih količinah, ki bi omogočale nadaljnje delo. Začetna predvidevanja, da je pri izražanju te domene kot ločenega dela EpCAM izpostavljena hidrobona regija, preko katere pride do agregacije izraženega proteina, je kasneje potrdila struktura celotnega zunajceličnega dela EpCAM. Strukturno karakterizacijo smo razširili na transmembranski (TM) del. Pri EpCAM ta del predstavlja enojen transmembranski heliks. Bližina C-koncev polipeptidne verige v cis-dimeru zunajceličnega dela nakazuje na možnost, da je v dimerizacijo vpleten tudi TM del. To smo pokazali s pomočjo računalniških simulacij (molekulska dinamika) dveh alfa-vijačnih z aminokislinskim zaporedjem, ustrezajočim TM delu EpCAM, umeščenima v ustrezno okolje (lipidni dvosloj iz 1-palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfoholina, obdan z molekulami vode). Na osnovi rezultatov utemeljeno sklepamo, da transmembranska heliksa EpCAM spontano tvorita dimer, kar je pomembno tako z vidika nadaljnjih raziskav v smislu celične adhezije kot tudi signalne vloge EpCAM. Tretji del molekule EpCAM (topološko gledano) je kratek znotrajcelični del (26 aminokislinskih ostankov). Zaradi razgradnje med izražanjem, do katere je prišlo ob številnih preizkušenih pogojih (temperatura, sev E. coli, fuzijski partnerji), nam tega dela ni uspelo pripraviti v rekombinantni obliki. Namesto tega smo uporabili kemično sintetiziran peptid, katerega aminokislinsko zaporedje ustreza citosolnemu delu EpCAM. Ugotovili smo, da nima urejene strukture, na kar sklepamo na osnovi rezultatov cirkularnega dikroizma in jedrske magnetne resonance. V okviru karakterizacije tega dela EpCAM smo pripravili tudi dve obliki človeškega alfa-aktinina in sicer nemišični obliki 1 in 4. Dokazali smo, da citosolni del EpCAM interagira s tema oblikama alfa-aktinina, kar je v skladu z objavljenimi podatki o kolokalizaciji EpCAM in aktinskega citoskeleta, katerega del predstavljata omenjena alfa-aktinina. Povezava med znotrajceličnim delom EpCAM in alfa-aktininom je pomembna za sidranje adhezijskih enot EpCAM na citoskelet, kar zagotavlja stabilnost teh povezav. V okviru iskanja interakcijskih parnerjev EpCAM nismo identificirali nobenega dodatnega interakcijskega partnerja, kar razlagamo z nizko količino proteinov, ki interagirajo z EpCAM (razen alfa-aktinina) v celicah, ki smo jih uporabljali pri raziskavah (Caco-2, HEK293, HT-29, Capan-1). Hkrati je možno, da gre za šibke interakcije prehodne narave, ki jih je z uporabljenimi metodami izredno težko detektirati. Raziskave smo tako omejili na že omenjen nemišični alfa-aktinin-1 in -4. V okviru sodelovanja z Institutom za biokemijo Univerze v Zürichu (UZH) smo začeli s strukturno karakterizacijo kompleksov med EpCAM in proteini z ankirinskimi ponovitvami - DARPini ("designed ankyrin repeat proteins"). DARPine, ki se specifično vežejo na zunajcelični del EpCAM, so razvili v omenjenem laboratoriju, v katerem je bil tri mesece na delovnem obisku Miha Pavšič. V omenjenem laboratoriju je pripravil nove bakulovirusne konstrukte, ki omogočajo pripravo rekombinantnega EpCAM v večji obliki in višje kvalitete, kar bo v veliko pomoč pri nadaljnjih raziskavah. V okviru obiska so bili tudi pripravljeni kompleksi med zunajceličnim delom EpCAM in različnimi anti-EpCAM DARPini. Te raziskave (določitev kristalne strukture kompleksa med EpCAM in enim ali več DARPinov) so še vedno v teku, rezultati pa so pomembni za nadaljnje raziskave v smislu uporabe DARPinov v terapevtske namene (študije, ki jih izvajajo na UZH, so v fazi predkliničnih testiranj). S.Ocena stopnje realizacije programa dela na raziskovalnem projektu in zastavljenih raziskovalnih ciljev4 Ocenjujemo, da smo program dela, ki se nanaša na strukturno karakterizacijo EpCAM, v celoti izpolnili. V okviru tega predstavlja glavni dosežen cilj kristalna struktura funkcionalnega dimera EpCAM, ki smo jo dopolnili s podrobnejšo strukturno karakterizacijo transmembranskega dela. Pomemben rezultat predstavlja ravno struktura dimera, saj predstavlja pomemben prispevek k razumevanju delovanja adhezijskih molekul. V smislu proučevanja interakcij z drugimi proteini smo se omejili na citoskeletni protein alfa-aktinin in sicer na nemišični obliki -1 in -2 ter dokazali direktno interakcijo med EpCAM in obema oblikama omenjenega proteina. Drugih interakcij s citosolnimi in transmembranskimi proteini nismo identificirali, kar pripisujemo nizki količini teh proteinov v celicah oz. na njihovi površini, ki so pod mejo detekcije oz. možnostjo nedvoumne identifikacije z uporabljenimi metodami. K proučevanju interakcij lahko prištevamo tudi karakterizacijo anti-EpCAM DARPinov, ki smo jih proučevali v sodelovanju z raziskovalno skupino iz tujine in predstavljajo tako inovativen pristop k izkoriščanju terapevtskega potenciala EpCAM kot tudi potencialno orodje za študij makromolekulskih komplekov in procesov, v katere je vključen EpCAM. Povzeto, dosegli smo glavne cilje raziskovalnega projekta, ki predstavljajo dobro osnovo za prihodnje bazične in aplikativne raziskave. 6.Utemeljitev morebitnih sprememb programa raziskovalnega projekta oziroma sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine5 V letu 2011 smo v projektni skupini izvedli zamenjavo dr. Marka Novinca z doc. dr. Gregorjem Gunčarjem. Razlog zamenjave je bila pridobitev podoktorskega projekta dr. Marka Novinca (Z1-4077). 7.Najpomembnejši znanstveni rezultati projektne skupine6 Znanstveni dosežek 1. COBISS ID 30187781 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Sestavljanje sarkomernih filamentov preko intermolekularnih povezav beta struktur ANG Terminal assembly of sarcomeric filaments by intermolecular [beta]-sheet formation Opis SLO V tem delu so predstavljeni načini asociacije sarkomernih filamentov z ne-filamentoznimi proteini, ki so na splošno poznani kot zelo dinamični proteini, predvsem v smislu časovne razporeditve in prostorske lokalizacije. Ti povezovalni proteini vodijo do nastanka dinamičnega interaktoma saj povezujejo velike strukturne filamentozne sisteme s širokim spektrom signalnih molekul preko sidranja. Proteinska povezovanja gredo preko intermolekularnih beta-ploskovnih povezav. ANG In this work is explained how sarcomeric filaments are associated with nonfilamentous proteins which are highly dynamic in terms of their temporal distribution and spatial localization. These components lead to dynamic interactomes and link largely structural filament system to a broad range of signaling molecules (via anchoring). Protein-protein interactions are mediated via intermolecular beta-sheets. Objavljeno v Elsevier Trends Journals; TiBS; 2009; Vol. 34, no. 1; str. 33-39; Impact Factor: 11.572;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 3.643; A': 1; WoS: CQ; Avtorji / Authors: Pinotsis Nikos, Abrusci Patrizia, Djinovic Carugo Kristina, Wilmanns Matthias Tipologija 1.02 Pregledni znanstveni članek 2. COBISS ID 516155161 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Odprta oblika tandemskih kalponin homolognih domen regulira afiniteto do F-aktina ANG Opening of tandem calponin homology domains regulates their affinity for F-actin Opis SLO Članek obravnava konformacijsko spremembo tandemskih CH-domen človeškega alfa-aktinina ob vezavi na F-aktin. V tem smislu pomembno prispeva k razumevanju mehanizma vezave alfa-aktinina v aktinski citoskelet ter s tem povezanimi konformacijskimi spremembami, ki vodijo do izpostavitve oz. preoblikovanja dostopne površine alfa-aktinina, kar lahko vpliva na vezavo drugih proteinov. ANG The paper describes conformational changes of tandem CH domains of human alpha-actinin which are needed for its binding to F-actin. This is an important contribution to the understanding of the mechanism of binding of alpha-actinin to actin cytoskeleton since the conformational changes lead to exposure and/or changes in the accessible surface of alpha-actinin which in turn affects the binding other proteins. Objavljeno v Nature Publishing Group; Nature structural & molecular biology; 2010; Vol. 17, issue 5; str. 614-616; Impact Factor: 13.685;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 3.337; A'': 1;A': 1; WoS: CQ, DA, DR; Avtorji / Authors: Galkin Vitold E., Orlova Albina, Salmazo Anita, Djinovic Carugo Kristina, Egelman Edward H. Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 3. COBISS ID 35560453 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Ekspresija, kristalizacija in difrakcijska analiza ektodomene človeške epitelijske celične adhezijske molekule ANG Expression, crystallization and preliminary x-ray characterization of the human epithelial cell-adhesion molecule ectodomain Opis SLO V tem delu smo predstavili preliminarne kristalografske analize zunajceličnega dela človeške epitelijske adhezijske molekule (EpCAM). Kot glikoprotein je regulatorno vključen v vrsto razvojnih procesov kot celična migracija, proliferacija in diferenciacija in se je nedavno uveljavil kot tarča protitumorske terapije. Strukturne študije EpCAM molekule so izjemno zanimive za širšo akademsko skupnost. Določitev osnovnih kristalnih parametrov (prostorska skupina, dimenzije in koti osnovne celice) so nedvoumno odlična osnova za določitev 3D strukture proteina. In this work we report the preliminary crystallographic analysis of the extracellular portion of human epithelial cell adhesion molecule, EpCAM. This glycoprotein helps to regulate an array of developmental processes ANG including cell migration, cell proliferation and differentiation, and has emerged as a target for anticancer therapies. Structural studies of this molecule are of great interest to the wider academic community. We determined the spacegroup, unit cell dimensions, and contents of the asymmetric unit, are an excellent introduction for solving the 3D structure of the protein. Objavljeno v International Union of Crystallography; Acta crystallographica; 2011; Vol. F67, no. 11; str. 1363-1366; Impact Factor: 0.506;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 2.267; WoS: CO, CQ, DA, FI; Avtorji / Authors: Pavšič Miha, Lenarčič Brigita Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek S.Najpomembnejši družbeno-ekonomski rezultati projektne skupine7 Družbeno-ekonomski dosežek 1. COBISS ID 30531589 Vir: COBISS.SI Naslov SLO EpCAM kot član naddružine proteinov s tiroglobulinsko domeno tipa-1 ANG EpCAM as a member of the thyroglobulin type-1 domain superfamily Opis SLO Smo ena redkih raziskovalnih skupin, ki se ukvarja z EpCAM proteinom na molekularnem nivoju in na razpolago imamo celoten EpCAM protein, kot tudi posamezne domene. Predstavitev našega raziskovalnega dela na ugledni univerzi v Groningenu je bila osnova za vzpostavitev sodelovanja z ugledno skupino prof. Giepmansom. ANG We are one of the rare research groups that perform research with EpCAM at the molecular level. We can work with entire EpCAM molecule as well as with the individual domains. Presentation of our research at the prestigious University of Groningen has been the basis for establishing cooperation with a group of prof. Giepmans. Šifra B.04 Vabljeno predavanje Objavljeno v 2009; Avtorji / Authors: Pavšič Miha Tipologija 3.14 Predavanje na tuji univerzi 2. COBISS ID 34956293 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Tiropini, več kot samo inhibitorji ANG Thyropins - more than inhibitors Opis SLO Univerza v Zurichu, Inštitut za Biokemijo, Zurich Na osnovi predavanja o tiroglobulinskih domenah tipa 1 in njihovi različni vlogi v številnih proteinih z različno arhitekturno razporeditvijo domen in funkcijo smo vzpostavili sodelovanje z izjemno raziskovalno skupino prof. A. Plueckthuna iz Univerze v Zurichu. Glede na to, da smo uspeli rešiti 3D strukturo EpCAMa nam bo omenjeno sodelovanje omogočilo dostop do knjižnice proteinov t.i. DARPinov (Designed Ankyrin Repeat Proteins), ki se specifično vežejo na EpCAM molekulo. DARPini so nova generacija proteinskih terapevtikov, ki predstavljajo odličen nadomestek monoklonskih protiteles. ANG University of Zurich, Institute for Biochemistry, Zurich On the basis of our lecture where we presented different roles of thyroglobulin type 1 domains in proteins that are structurally and functionally unrelated we established a collaboration with an exceptional research group of prof. A. Plueckthun from the University of Zurich. The fact that we solved the crystal structure of EpCAM enabled us the access to the library of DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins), proteins that can specifically bind to EpCAM. DARPins are new generation of protein therapeutics that represents an excellent substitute for monoclonal antibodies. Šifra B.04 Vabljeno predavanje Objavljeno v 2011; Avtorji / Authors: Lenarčič Brigita Tipologija 3.14 Predavanje na tuji univerzi 3. COBISS ID 35457797 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Kristalna struktura človeške celične adhezijske molekule ANG Crystal structure of human epithelial cell adhesion molecule Opis SLO Na predavanju smo predstavili kristalno strukturo dimera zunajceličnega dela EpCAM, modela dimera transmembranskega heliksa in tetramerne adhezijske enote ter predpostavljen model adhezijske mreže, ki lahko nastane s cis-povezavami tetramernih enot. S tem smo osvetlili funkcijo EpCAM kot eno izmed redkih adhezijskih molekul z znano trodimenzionalno strukturo. ANG The determined crystal structure of extracellular part of EpCAM dimer was presented along with the models of transmembrane helix dimer and tetrameric adhesion unit. Additionally, the proposed model of adhesion network formed by cis-interactions of adjacent adhesion units was presented to highlight the adhesion function of EpCAM, one of the rare adhesion molecules with determined threedimensional structure. Šifra B.03 Referat na mednarodni znanstveni konferenci Objavljeno v Zavod za zdravstveno varstvo; Abstract book; 2011; Str. 55; Avtorji / Authors: Pavšič Miha, Gunčar Gregor, Djinovic Carugo Kristina, Lenarčič Brigita Tipologija 1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci 4. COBISS ID 36596485 Vir: vpis v poročilo Naslov SLO Dekoriranje EpCAM z DARPini ANG Decorating EpCAM with DARPins Opis SLO V okviru predavanja smo predstavili prve skupne rezultate sodelave s skupino prof. Plückthuna in sicer 3D modeli kompleksov EpCAM in DARPinov, podprti z eksperimentalnimi opažanji. ANG In the lecture we presented first joint results of collaboration with the group of Prof. Plückthun. 3D models of complexes of EpCAM and DARPins supported with experimental results were discussed. Šifra B.04 Vabljeno predavanje Objavljeno v 2012; Avtorji / Authors: Pavšič Miha Tipologija 3.14 Predavanje na tuji univerzi 9.Drugi pomembni rezultati projetne skupine8 V okviru sodelave s skupino prof. Plückthuna (Institut za biokemijo, Univerza v Zürichu, Švica) je dr. Miha Pavšič kot gostujoči znanstveni sodelavec tri mesece (24. 9.-24. 12. 2012) delal na pripravi in strukturni karakterizaciji EpCAM v kompleksu z anti-EpCAM DARPini. V tem času je rezultate raziskovalnega dela tega projekta predstavil v obliki predavanja na omenjenem institutu. lO.Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine9 10.1.Pomen za razvoj znanosti10 SLO Cilj projekta je pridobitev strukturnih in funkcijskih podatkov, ki bodo omogočili razvoj novega pristopa k terapiji in preprečevanju raka na osnovi EpCAM. Izražanje adhezijske molekule epitelijskih celic (EpCAM) je povečano pri številnih karcinomih, pred kratkim pa je bila molekula EpCAM identificirana tudi kot marker izvornih celic raka (CD 326), ki direktno vpliva na celični cikel. Zato predstavlja molekula obetavno tarčo za razvoj terapevtikov za zdravljenje pacientov z rakom. Do sedaj je bilo razvitih že več imunoterapij na osnovi EpCAM, ki pa niso dale želenih rezultatov v kliničnih testiranjih. Menimo, da bi lahko učinek terapije bistveno izboljšali s kombinacijo imunoterapije in terapevtikov, ki bi zrahljali tumorsko tkivo in tako olajšali celicam imunskega sistema dostop do izvornih celic raka. Osredotočili se bomo na študije EpCAM na molekulskem nivoju, tako da bomo na strukturnem nivoju razložili mehanizme dimerizacije/oligomerizacije EpCAM ter njegove interakcije z aktinskim citoskeletom preko a-aktinina. Ti rezultati bodo odprli popolnoma nove možnosti za razvoj terapevtikov (inhibitorjev), ki bodo interferirali z vezavnimi mesti EpCAM ter tako prekinili signaliziranje preko EpCAM, ki je ključno za razvoj tumorjev. Prav tako bomo podrobneje preučili interaktom EpCAM, tako da bomo identificirali do sedaj neznane interakcijske partnerje, ki se vežejo na različne module EpCAM. Naš pristop je izrazito interdisciplinaren in poznavanje strukturno-funkcijskih lastnosti EpCAM interactoma predstavlja inovativen pristop na tem zelo kompetitivnem področju. ANG The goal of this project is to generate functional and structural data that will allow the development of a novel EpCAM-based approach for cancer therapy and prevention. Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is up-regulated in a variety of carcinomas and has recently been identified as a cancer stem cell marker (CD 326) with a direct impact on the cell cycle. This qualifies EpCAM as a promising target for design of drugs used to treat cancer patients. So far, several immunotherapies have been developed, yet with limited success in clinical trials. We believe that the therapeutic effect can be prominently improved by combining immunotherapy with agents that will debulk the tumor tissue and thereby improve the accessibility of cancer stem cells to the immune system. Our contribution in this respect will be oriented at studying EpCAM at the molecular level by revealing the mechanisms of EpCAM dimerization/oligomerization and its interaction with the actin cytoskeleton via a-actinin on the structural level. This will open completely new perspectives for the design of novel therapeutic agents (inhibitors) that will interfere with binding sites to prevent the EpCAM signaling pathways critical for tumor development. Furthermore we will expand our knowledge of the EpCAM interactome by searching for novel binding partners that bind to different modules of EpCAM. We will also investigate the importance of proteolytic processing of EpCAM for tumor progression. Results obtained at the molecular level will be validated for their biological effects using different cultured tumor cells. Our approach is highly interdisciplinary and knowledge of the structural-functional characteristics of EpCAM interactome represents an innovative approach in this highly competitive area. 10.2.Pomen za razvoj Slovenij« SLO Poleg svojega neposrednega vpliva na znanost bo projekt tudi posredno vplival na družbo v Sloveniji. Spodbudil bo namreč naše sodelovanje z vodilnimi svetovnimi raziskovalnimi skupinami na področju raziskav raka, prav tako pa se bodo vzpostavile nove sodelave z nekaterimi slovenskimi skupinami na področju proizvodnje protiteles in majhnih organskih molekul ter s kliničnimi raziskovalci. To bo bistveno prispevalo k razvoju Katedre za biokemijo na UL FKKT kot samostojne in strokovne raziskovalne skupine. Razvoj skupine pa se bo odražal v povečani kvaliteti znanja, ki se bo prenašalo na študente naše fakultete, tako v smislu predstavljanja kvalitetnih raziskovalnih dosežkov iz prve roke kakor tudi priložnosti za študente, da v prihodnosti sodelujejo pri kvalitetnem in sodobnem raziskovalnem delu. ANG Besides its direct impact on the general knowledge of the science, the project itself will also have an indirect impact on Slovene society. It will sprout new collaborations with some of the leading scientists in the area of cancer research. In the same time the results of our work will also be a basis for further novel collaborations with Slovenian research groups specializing in the production of antibodies or small-molecule compounds targeting EpCAM as well as collaboration with clinical researchers. All together will greatly contribute to the development of the Chair of Biochemistry at the UL FCCT as a competent and independent research group. This will in turn be reflected in the quality of education passed on to the students of our faculty, in the sense of both being able to present them with first-hand quality research as well as offer the students an opportunity to become involved in high-quality research in the future. ll.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni Cilj F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin Zastavljen cilj o da o ne Rezultat 1 d Uporaba rezultatov 1 d F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.03 Večja usposobljenost raziskovalno-razvojnega osebja Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.04 Dvig tehnološke ravni Zastavljen cilj o da o ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d F.05 Sposobnost za začetek novega tehnološkega razvoja Zastavljen cilj o da o ne Rezultat I d Uporaba rezultatov d F.06 Razvoj novega izdelka Zastavljen cilj o DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.07 Izboljšanje obstoječega izdelka Zastavljen cilj o da o ne Rezultat Uporaba rezultatov F.08 Razvoj in izdelava prototipa Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov 1 d F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.10 Izboljšanje obstoječega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.11 Razvoj nove storitve Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.12 Izboljšanje obstoječe storitve Zastavljen cilj o da o ne Rezultat Uporaba rezultatov d F.13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj o da o ne Rezultat I d Uporaba rezultatov d F.17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.19 Znanje, ki vodi k ustanovitvi novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.20 Ustanovitev novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj o da o ne Rezultat Uporaba rezultatov F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj o da o ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d F.22 Izboljšanje obstoječih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.23 Razvoj novih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.24 Izboljšanje obstoječih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj O da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.25 Razvoj novih organizacijskih in upravljavskih rešitev 1 Zastavljen cilj O da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.26 Izboljšanje obstoječih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj O da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.27 Prispevek k ohranjanju/varovanje naravne in kulturne dediščine Zastavljen cilj O da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.28 Priprava/organizacija razstave Zastavljen cilj o da o ne Rezultat Uporaba rezultatov d F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete Zastavljen cilj O da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.30 Strokovna ocena stanja Zastavljen cilj O da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj O da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov d F.32 Mednarodni patent Zastavljen cilj o da o ne Rezultat Uporaba rezultatov d F.33 Patent v Sloveniji Zastavljen cilj O da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov 1 d F.34 Svetovalna dejavnost Zastavljen cilj o da o ne Rezultat d Uporaba rezultatov 1 d F.35 Drugo Zastavljen cilj o da o ne Rezultat I d Uporaba rezultatov 1 d Komentar 12.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01 Razvoj visokošolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja O O O o G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja o o o o G.01.03. Drugo: o o o o G.02 Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu o o o o G.02.02. Širitev obstoječih trgov o o o o G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje o o o o G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije o o o o G.02.05. Razširitev področja dejavnosti o o o o G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost o o o o G.02.07. Večji delež izvoza o o o o G.02.08. Povečanje dobička o o o o G.02.09. Nova delovna mesta o o o o G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih o o o o G.02.11. Nov investicijski zagon o o o o G.02.12. Drugo: o o o o G.03 Tehnološki razvoj G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti o o o o G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti o o o o G.03.03. Uvajanje novih tehnologij o o o o G.03.04. Drugo: O o o o G.04 Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja o o o o G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja o o o o G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave o o o o G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti o o o o G.04.05. Razvoj civilne družbe o o o o G.04.06. Drugo: o o o o G.05. Ohranjanje in razvoj nacionalne naravne in kulturne dediščine in identitete o o o o G.06. Varovanje okolja in trajnostni razvoj o o o o G.07 Razvoj družbene infrastrukture G.07.01. Informacijsko-komunikacijska infrastruktura o o o o G.07.02. Prometna infrastruktura o o o o G.07.03. Energetska infrastruktura o o o o G.07.04. Drugo: o o o o G.08. Varovanje zdravja in razvoj zdravstvenega varstva o o o o G.09. Drugo: o o o o Komentar 13.Pomen raziskovanja za sofinancerje12 Sofinancer 1. Naziv Naslov Vrednost sofinanciranja za celotno obdobje trajanja projekta je znašala: EUR Odstotek od utemeljenih stroškov projekta: % Najpomembnejši rezultati raziskovanja za sofinancerja Šifra 1. 2. 3. 4. 5. Komentar Ocena 14.Izjemni dosežek v letu 201213 14.1. Izjemni znanstveni dosežek Izjemni dosežek v okviru raziskovalnega projekta je določena kristalna struktura zunajceličnega dela epitelijske celične adhezijske molekule (EpCAM). Gre za eno izmed redkih znanih struktur celotnih adhezijskih molekul. Dodatno vrednost predstavlja dejstvo, da je EpCAM označevalec izvornih celic. S podrobno strukturno karakterizacijo EpCAM smo bistveno prispevali k poznavanju medceličnih adhezijskim molekul ter hkrati ponudili dobro osnovo za načrtovanje/izboljšanje na EpCAM osnovanih diagnostičnih in terapevtskih orodij. 14.2. Izjemni družbeno-ekonomski dosežek C. IZJAVE Podpisani izjavljam/o, da: • so vsi podatki, ki jih navajamo v poročilu, resnični in točni • se strinjamo z obdelavo podatkov v skladu z zakonodajo o varstvu osebnih podatkov za potrebe ocenjevanja ter obdelavo teh podatkov za evidence ARRS • so vsi podatki v obrazcu v elektronski obliki identični podatkom v obrazcu v pisni obliki • so z vsebino zaključnega poročila seznanjeni in se strinjajo vsi soizvajalci projekta Podpisi: zastopnik oz. pooblaščena oseba i vodja raziskovalnega projekta: raziskovalne organizacije: i Univerza v Ljubljani, Fakulteta za Brigita Lenarčič kemijo in kemijsko tehnologijo ŽIG Kraj in datum: Ljubljana |13.3.2013 Oznaka prijave: ARRS-RPROJ-ZP-2013/76 1 Opredelite raziskovalno področje po klasifikaciji FOS 2007 (Fields of Science). Prevajalna tabela med raziskovalnimi področji po klasifikaciji ARRS ter po klasifikaciji FOS 2007 (Fields of Science) s kategorijami WOS (Web of Science) kot podpodročji je dostopna na spletni strani agencije (http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/sifranti/preslik-vpp-fos-wos.asp). Nazaj 2 Napišite povzetek raziskovalnega projekta (največ 3.000 znakov v slovenskem in angleškem jeziku) Nazaj 3 Napišite kratko vsebinsko poročilo, kjer boste predstavili raziskovalno hipotezo in opis raziskovanja. Navedite ključne ugotovitve, znanstvena spoznanja, rezultate in učinke raziskovalnega projekta in njihovo uporabo ter sodelovanje s tujimi partnerji. Največ 12.000 znakov vključno s presledki (približno dve strani, velikost pisave 11). Nazaj 4 Realizacija raziskovalne hipoteze. Največ 3.000 znakov vključno s presledki (približno pol strani, velikost pisave 11) Nazaj 5 V primeru bistvenih odstopanj in sprememb od predvidenega programa raziskovalnega projekta, kot je bil zapisan v predlogu raziskovalnega projekta oziroma v primeru sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine v zadnjem letu izvajanja projekta, napišite obrazložitev. V primeru, da sprememb ni bilo, to navedite. Največ 6.000 znakov vključno s presledki (približno ena stran, velikost pisave 11). Nazaj 6 Navedite znanstvene dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Raziskovalni dosežek iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Nazaj 7 Navedite družbeno-ekonomske dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Družbeno-ekonomski rezultat iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Družbeno-ekonomski dosežek je po svoji strukturi drugačen kot znanstveni dosežek. Povzetek znanstvenega dosežka je praviloma povzetek bibliografske enote (članka, knjige), v kateri je dosežek objavljen. Povzetek družbeno-ekonomskega dosežka praviloma ni povzetek bibliografske enote, ki ta dosežek dokumentira, ker je dosežek sklop več rezultatov raziskovanja, ki je lahko dokumentiran v različnih bibliografskih enotah. COBISS ID zato ni enoznačen, izjemoma pa ga lahko tudi ni (npr. prehod mlajših sodelavcev v gospodarstvo na pomembnih raziskovalnih nalogah, ali ustanovitev podjetja kot rezultat projekta _ - v obeh primerih ni COBISS ID). Nazaj 8 Navedite rezultate raziskovalnega projekta iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) v primeru, da katerega od rezultatov ni mogoče navesti v točkah 7 in 8 (npr. ker se ga v sistemu COBISS ne vodi). Največ 2.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 9 Pomen raziskovalnih rezultatov za razvoj znanosti in za razvoj Slovenije bo objavljen na spletni strani: http://sicris.izum.si/ za posamezen projekt, ki je predmet poročanja Nazaj 10 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 11 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 12 Rubrike izpolnite / prepišite skladno z obrazcem "izjava sofinancerja" http://www.arrs.gov.si/sl/progproj/rproj/gradivo/, ki ga mora izpolniti sofinancer. Podpisan obrazec "Izjava sofinancerja" pridobi in hrani nosilna raziskovalna organizacija - izvajalka projekta. Nazaj 13 Navedite en izjemni znanstveni dosežek in/ali en izjemni družbeno-ekonomski dosežek raziskovalnega projekta v letu 2012 (največ 1000 znakov, vključno s presledki). Za dosežek pripravite diapozitiv, ki vsebuje sliko ali drugo slikovno gradivo v zvezi z izjemnim dosežkom (velikost pisave najmanj 16, približno pol strani) in opis izjemnega dosežka (velikost pisave 12, približno pol strani). Diapozitiv/-a priložite kot priponko/-i k temu poročilu. Vzorec diapozitiva je objavljen na spletni strani ARRS http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/, predstavitve dosežkov za pretekla leta pa so objavljena na spletni strani http://www.arrs.gov.si/sl/analize/dosez/. Nazaj Obrazec: ARRS-RPROJ-ZP/2013 v1.00 D8-56-AA-64-21-F0-2D-3D-1F-45-01-C4-9E-9D-B4-6B-0E-90-49-B4 ._ o ■55 -C M 9 .0 18|S ll|l| ra Ü i O- N ^