398 Mikrobiologija • Fitoplazme ali življenje na genskem minimumu
Proteus 76/9-10 • Maj, junij 2014
Fitoplazme ali življenje na genskem minimumu
Marina Dermastia
Prvi dokumentirani dokazi o fitoplazmah segajo v čas kitajskih vladarjev iz dinastije Song, ki so vladali od leta 960 do leta 1279 po našem štetju. Ti so bili veliki ljubitelji cvetja, še posebej radi so imeli potonike. Med njimi so najbolj občudovali tiste z nežno zelenimi cvetovi, ne pa tistih bolj pogostih z rdečimi cvetovi. Novejšega datuma so božične zvezde (Euphorbia pulcherrima), ki so nepogrešljivi sestavni del božičnih cvetličnih aranžmajev. V času prvih poročil o teh rastlinah - po prihodu Spancev v Mehiko - so jih Azteki pod imenom cuetlaxochi-tl uporabljali za različne stvari - iz njihovega soka so pripravljali zdravila proti vročini, iz njihovih ovršnih listov pa rdeče barvilo. Rastlino je zadnji azteški kralj Montezuma kot »darilo bogov« gojil na svojih vrtovih, saj je bila v tistih časih prevelika, da bi jo lahko občudoval v lončkih v notranjih prostorih. Današnja podoba, ki se zelo razlikuje od podobe divjih sorodnikov v Mehiki, je poznana od dvajsetih let 20. stoletja dalje.
Takrat so žlahtnitelji rastlin odkrili novo varieteto božične zvezde, ki je imela veliko cvetov in bila dovolj nizka, da so jo lahko postavili na mizo. Težava je bila, da takih rastlin niso znali dalje vzgajati iz semen. Edini način za proizvodnjo nizkih, gostih božičnih zvezd je bilo cepljenje, s cepiči, pridobljenimi iz nizke rastline. Gojitelji so vedeli, da je skrivnost njihove razrasti skrita v floemskem soku cepiča, razložiti pa jo niso znali.
Zeleno cvetoče potonike in pritlikave božične zvezde so okužene s fitoplazmami
Skrivnost nizko rastočih božičnih zvezd je bila pojasnjena šele v poznih devetdesetih letih prejšnjega stoletja, ko so znanstveniki ugotovili, da so te neobičajno rastoče rastline okužene z zelo posebnimi bakterijami -fitoplazmami. Same fitoplazme pa so bile kot povzročiteljice številnih bolezni rastlin, imenovanih rumenice, prepoznane kakšnih 30 let prej. Glede na podobnost bolezenskih
Divja božična zvezda.
Foto: Tom Turk.
znamenj in odsotnost tipičnih znamenj bakterijskih ali glivnih okužb so bili do takrat raziskovalci prepričani, da rumenice povzročajo virusi.
Fitoplazme, ki spreminjajo rdeče cvetove potonik v zelene in božične zvezde iz velikih razpotegnjenih grmastih vej z redkimi cvetovi v gosto cvetoče nizke grmičke, pa le redko povzročijo nam všečne spremembe na rastlinah. Večinoma povzročajo hude rastlinske bolezni in grozijo številnim pre-hranskim in okrasnim rastlinam po vsem svetu. Ker porušijo normalno delovanje rastlinskih rastnih regulatorjev, to vodi do bolezenskih znamenj, kot sta pritlikavost in metlasta razrast, izraženi v božičnih zvezdah. Na različnih rastlinah pa povzročajo tudi razvoj listom podobnih struktur namesto cvetov, propadanje cvetov in posledično odsotnost pridelka, neolesenevanje, zavrto fotosintezo, kopičenje sladkorjev v listih in drugo.
Mikoplazmam podobni organizmi
Zaradi morfološke podobnosti so ob odkritju fitoplazme poimenovali mikoplazmam podobni organizmi. Obe skupini organizmov sta, kot bakterije, pozitivne po Gramu in brez celične stene, uvrščeni v monofiletski razred Mollicutes. Za razliko od mikopla-
Fitoplazme ali življenje na genskem minimumu • Mikrobiologija 399
Božična zvezda, okužena s
fitoplazmami. Foto: Manca Pirc.
zem, ki so patogeni na živalih in ljudeh, fi-toplazme povzročajo bolezni le na rastlinah. Za zdaj so bili neuspešni vsi poskusi, da bi jih gojili v razmerah in vitro, kar je eden od glavnih razlogov, da je njihovo raziskovanje zelo težavno in vezano na preučevanje okuženih gostiteljev ter da je posledično naše znanje o teh organizmih zelo omejeno. Njihov skrivnostni položaj med prokarionti smo razrešili šele z razvojem in aplikacijami sodobnih molekularnih tehnologij. To je vodilo tudi do uvedbe trivialnega imena »fitoplazma« in končno do opisa novega taksona kot začasno vrsto ali 'Candidatus Phytoplasma'. Znotraj Mollicutes so fitoplaz-me najbolj sorodne rodu Acholeplasma. Njun skupni prednik naj bi se od ostalih moliku-tov ločil že zelo zgodaj. Ločitvi naj bi sledili manjšanje genoma in izguba celične stene. Fitoplazme imajo danes eno najmanjših celic, z enim najmanjših znanih genomov, od 530 do 1350 kb. V njem ni genov za sintezo številnih spojin, vključenih v različne presnovne poti. Vse te snovi morajo fitoplazme dobiti od svojih gostiteljev.
Majhen genom je povezan z gostiteljevim okoljem
Če želimo razumeti prilagoditve fitopla-zemskega genoma in njegovo zmanjševanje,
400 Mikrobiologija • Fitoplazme ali življenje na genskem minimumu
Proteus 76/9-10 • Maj, junij 2014
moramo najprej razumeti okolje fitoplazem-skega gostitelja. Fitoplazme v rastlinah živijo skoraj izključno v soku floema - sistema za transport proizvodov fotosinteze po rastlinskem telesu. Takšno okolje fitoplazmi nudi odlične razmere za življenje in širjenje po gostiteljski rastlini. Fitoplazme so dovolj majhne, da se lahko premikajo skozi sitaste pore, ki povezujejo posamezne prevodne celice v floemu. Po floemu se premikajo pasivno, skupaj s floemskim sokom. Floemski sok je pod visokim hidrostatskim tlakom in je bogat s hranili. Po sestavi se razlikuje glede na rastlinsko vrsto, a vedno vsebuje velike količine ogljikovih hidratov. Najpogostejša je po navadi saharoza, poleg nje pa so v floemskem soku še glukoza, fruktoza, različni oligosaharidi in sladkorni alkoholi, kot sta manitol in sorbitol. V njem so tudi minerali, beljakovine, aminokisline, rastlinski rastni regulatorji citokinini, avksini, abscizinska kislina, giberelini, jasmonati in metilsalicilati ter ATP in majhne RNA. Fitoplazme na neokužene rastline prenašajo žuželčji prenašalci, ki se s hranijo s floem-
Fitoplazme v notranjosti celic madagaskarskega zimzelena (Catharanthus roseus). Slika je posneta s transmisijskim elektronskim mikroskopom.
Foto: Magda Tušek Žntdartč.
skim sokom okuženih rastlin, predvsem so to bolšice in škržatki iz reda Hemiptera. Pri hranjenju sprejmejo iz floemskega soka tudi fitoplazme, ki se nato pomnožujejo v hemo-limfi žuželke. Zanimivo je, da je koncentracija organskih snovi v hemolimfi podobno visoka kot v floemskem soku. Glavni sladkor v hemolimfi je trehaloza, katere koncentracija je v korelaciji s količino saharoze v gostiteljski rastlini. Ko se taka žuželka hrani na zdravi rastlini, prenese fitoplazme v njen floemski sok in rastlina tako postane okužena.
Zaradi minimalne velikosti genoma so fito-plazme najenostavnejše znane samopodvaju-joče se oblike življenja, nekje na meji med celičnimi organizmi in virusi. Omejitev pri hitrosti njihove evolucije predstavlja dejstvo, da imajo gostitelje v dveh kraljestvih organizmov. Iz štirih fitoplazemskih genomov, katerih nukleotidna zaporedja so znana, sklepamo, da so fitoplazme svoje genske pomanjkljivosti nadomestile s horizontalnim prenosom genov iz drugih kraljestev, preurejanjem DNA in rekombinacijo med kro-
Fitoplazma v sitasti pori med dvema celicama floema madagaskarskega zimzelena (Catharanthus roseus). Slika je posneta s transmisijskim elektronskim mikroskopom.
Foto: Magda Tušek Žntdartč.
Fitoplazme ali življenje na genskem minimumu • Mikrobiologija 401
Okuževalni krog fiotoplazme (prirejeno po Christensen s sod, 2005).
mosomom in zunajkromosomskimi elementi - plazmidi. Tako kot pri drugih molikutih je tudi večina znanih genomov fitoplazem organizirana v krožne kromosome. Izjema so fitoplazme is skupine metličavosti jablan, katerih kromosomi so linearni. Od kod ta neobičajna organizacija bakterijskih kromosomov, ni jasno; znanstveniki domnevajo, da naj bi imela virusni izvor. Vključenost različnih virusnih nukleotidnih zaporedij v fitoplazemske genome tudi drugače ni neobičajna. V fitoplazemskih genomih so pogosti plazmidi. Za nekatere seve fitoplazem so že pokazali, da imajo njihovi plazmidi vpliv na prenos s prenašalci. V do sedaj poznanih genomih fitoplazem so našli tudi tako imenovane potencialne mobilne enote, ki imajo velik vpliv na podvojitev posameznih delov genoma in naj bi prispevale h genetski variabilnosti fitoplazem. Pred kratkim so odkrili, da te enote lahko oblikujejo tudi zunaj-kromosomske elemente, ki se pomnožujejo in nato ponovno povežejo v fitoplazemski genom. Pri nekaterih sevih fitoplazem, kot so nekateri sevi 'Ca. P. asteris', naj bi bilo kar 65 do 70 odstotkov beljakovin kodiranih na teh mobilnih enotah. Na drugi strani je takih genov pri fitoplazmi Ca. P. mali', ki povzroča metličavost jablan, le 4 odstotke. Fitoplazme kot obligatni zajedavci nimajo številnih genov, za katere velja, da so nujni
za celično presnovo in jih imajo prosto živeče bakterije. Nimajo genov za sintezo aminokislin, maščobnih kislin in nukleotidov. Vse te snovi mora fitoplazma sprejeti z membranskimi transportnimi procesi. Za razliko od drugih bakterij, pozitivnih po Gramu, imajo fitoplazme tako zelo veliko pomembnih membranskih transporterjev. Izjemno nenavadna je odsotnost beljakovine, za katero velja, da je nujna za celično delitev. Kako se lahko fitoplazemska celica deli brez te beljakovine, za enkrat še ni pojasnjeno. Fi-toplazemski geni kodirajo vse encime, nujne za glikolizo, vendar pa nimajo tistih, ki so nujni za fosforilacijo sladkorjev, ki v gliko-lizo vstopijo.
»Za vse naj bi bil kriv ameriški škržatek«
V Sloveniji v zadnjih letih povzroča največjo gospodarsko škodo fitoplazma, ki nima niti še začasnega znanstvenega imena, tako da jo imenujemo kar povzročiteljica zlate trsne rumenice ali v francoskem izvirniku flave-scence dorée (FDf). FDf je na karantenskem seznamu Evropske unije, kar pomeni, da za njeno zatiranje veljajo posebno stroga pravila. Zlata trsna rumenica se je pojavila v petdesetih letih prejšnjega stoletja v vinogradih zahodne Francije. Bolezen se je pojavila hkrati z ameriškim škržatkom (Scaphoideus titanus Ball), ki so ga skupaj z divjimi trtami, namenjenimi za nove podlage, nenamerno uvozili v Evropo iz Združenih držav Amerike. Sočasnost dogodkov je raziskave te fitoplazemske bolezni upočasnila kar za 50 let, saj so znanstveniki poskušali pojasniti le povezavo med to žuželko in fito-plazmo, kar pa jih je vodilo v slepo ulico. Ameriški škržatek je monofagna vrsta na
402 Mikrobiologija • Fitoplazme ali življenje na genskem minimumu
Proteus 76/9-10 • Maj, junij 2014
vinski trti, kar pomeni, da se hrani izključ-	(Clematis vitalba). Zanimivo je, da sta obe no s floemskim sokom te rastline. Hitro	divji rastlini okuženi z različnimi sevi FDf. širjenje bolezni po južnem delu Evrope in	In kako naj bi FDf prišla z divjih rastlin na njene posledice so nakazovale, da okuženi	vinsko trto? Ta korak je še nejasen, imamo škržatki morda le niso edini vir okužbe. K	pa na zalogi nekaj možnih scenarijev. Doka-postopnemu razvozlavanju uganke so veliko	ze zanje dobivamo z odkrivanjem različnih prispevale tudi molekulske analize sevov fi-	polifagnih žuželk, ki so okužene z različni-toplazme, ki se niso povsem ujemale s pred-	mi sevi FDf. Te naj bi se hranile z okuže-videnim širjenjem prenašalca in pojavom	nim floemskim sokom jelš ali srobotov, zelo bolezni v različnih državah. Znanstveniki	redko in naključno tudi na vinski trti. Ob so začeli upravičeno domnevati, da mora	takih naključnih dogodkih bi lahko prišlo obstajati še dodatni vir okužbe. Raziskave	do prenosa fitoplazme na vinsko trto. Če je je končno pospešilo odkritje, da v Ameriki	v bližini rastline ameriški škržatek, se lahko te fitoplazme ni, kar je bil dokaz, da se je	ob hranjenju okuži. Ker se hrani le na vin-moral ameriški škržatek s FDf okužiti po	ski trti, lahko fitoplazmo razširi na sosednje prihodu v Evropo. Danes imamo kar veliko	rastline v vinogradu. Če je v njem veliko dokazov, da so najpomembnejši naravni vir	škržatkov, pa je širitev bolezni le še vpra-te fitoplazme jelše (Alnus sp.). Po Evropi,	šanje časa. Danes vemo, da je ta čas lahko vključno s Slovenijo, je okuženost jelš s FDf več kot 80-odstotna. V jelšah pa je okužba prikrita, tako da drevesa ne kažejo prav	V!nograd zgsgjen s sorto vinske tte refošk, zelo okužen s nobenih bolezenskih znamenj. Drugi že po-	FDf. Rdečenje listov je značilno za rdeče sorte, pri belih se trjeni vir okužbe s FDf je navadni srobot	pojavlja	Foto: Maja Ravnikar.
Fitoplazme ali življenje na genskem minimumu • Mikrobiologija 403
Značilna znamenja na vinski trti sorte refošk, okuženi s FDf: rdečenje listov, ki se ukrivljajo navzdol, krhkost listov zaradi kopičenja sladkorjev in odganjanje novih poganjkov pozno v rastni sezoni. Foto: Maja Ravnikar.
Vzhodnjaški škržatek (Orientus ishidae Matsumura 1902).
Foto: Maja Ravnikar.
do tri leta, saj je koncentracija fitoplazem v rastlini zelo nizka in je potrebno nekaj časa, da se namnožijo do mere, pri kateri se pojavijo bolezenska znamenja. Nacionalni inštitut za biologijo je s strani Uprave Republike Slovenije za varno hrano, veterinarstvo in varstvo rastlin pri Ministrstvu za kmetijstvo in okolje pooblaščen za molekularno diagnostiko fitoplazem. V okviru tega pooblastila smo leta 2005 zaznali prvi pojav FDf v vinogradu na Koprskem in od takrat dalje sledimo širitvi bolezni, prav tako pa raziskujemo tudi njene vzroke. Našli smo žuželko - vzhodnjaškega škržatka (Orientus ishidae Matsumura 1902), v katerem je delež okužbe zelo velik in bi bil lahko potencialni prenašalec FDf z jelše na trto. Vrsta je novinka v Evropi; prvič so jo opisali v Švici leta 2002, v Sloveniji pa dve leti kasneje. Od takrat je pri nas splošno razširjena.
Poleg vzhodnjaškega škržatka so po Evropi našli še nekaj drugih potencialnih prena-šalcev, vendar za nobenega od njih prenos v naravi še ni bil nedvoumno potrjen. Prav tako se povečuje seznam okuženih rastlin, vendar tudi zanje ni dokazano, do so zares novi viri okužbe.
404 Mikrobiologija • Fitoplazme ali življenje na genskem minimumu
Proteus 76/9-10 • Maj, junij 2014
»Čarovniške metle« niso zdrav okras sadnega drevja
V Sloveniji so kot povzročiteljice bolezni pomembne tudi tri fitoplazme iz skupine metličavosti jablan: 'Ca. P. mali', ki povzroča metličavost jablan, 'Ca. P. pyri', ki povzroča propadanje hrušk, in 'Ca. P. pruno-rum', ki povzroča leptonekrozo koščičarjev ali ESFY (European stone fruit yellows). Predvsem slednja v veliki meri otežuje pridelavo marelic.
Pogled v prihodnost
Po dolgih desetletjih tavanja v temi so nam fitoplazme končno začele odkrivati nekatere od svojih skrivnosti, ki nam bodo pomagale varovati naše kmetijske posevke in drevesa pred boleznimi, ki jih povzročajo. Nedvomno se svet segreva, kar med drugim pomeni tudi širjenje območja žuželk prenašalk kot tudi potencialnih gostiteljskih rastlin na območja, kjer jih še pred kratkim ni bilo. Njihovo širjenje je lahko povezano tudi s širjenjem bolezni. Celo če bi o fitoplazmah vedeli kaj več, že danes ugotavljamo, da tradicionalni ukrepi zaščite, kot sta škropljenje proti prenašalcem in uničevanje okuženih poljščin ali okuženih izvornih rastlin, delujejo zelo omejeno. Različni znanstveniki se tako poslužujejo različnih strategij v boju s fitoplazmami. Nekateri poskušajo vzgojiti odporne rastline, drugi take, ki ne bi bile užitne za žuželke prenašalke. Spet tretji poskušajo okuževati rastline z milimi sevi fito-plazem, ki naj bi rastlino varovali pred bolj agresivnimi. Možni pristop vključuje tudi okužbe z nepatogenimi bakterijami, ki naj bi znotraj žuželke tekmovale s fitoplazma-mi, ali alternativne načine nadzora prena-šalcev. Upanje danes vzbujajo tudi tehnologije določanj nukleotidnih zaporedij z novimi, učinkovitejšimi, hitrejšimi in predvsem cenejšimi določanji nukleotidnih zaporedij in z njimi določitve večjega števila fitopla-zemskih genomov. Z njimi naj bi odkrili nove ključne interakcije med gostiteljskimi beljakovinami in fitoplazemskimi virulenč-
nimi molekulami. S številnimi projekti se v mednarodno mrežo raziskovalcev fitopla-zem uspešno vključujemo tudi raziskovalci Nacionalnega inštituta za biologijo. Prav v mozaik razumevanja delovanja fitoplazem na vinski trti in na sadnem drevju smo prispevali že nekaj pomembnih kamenčkov. Na podlagi novih znanj bomo lahko bolje razumeli te zanimive organizme in tudi oblikovali nove strategije njihovega nadzora.
Viri:
Christensen, N. M., Axelsen, K. B,, Nicolaisen, M., Schulz, A., 2005: Phytoplasmas and their interactions with hosts. Trends in Plant Science, 10: 526-535. Bertaccini, A,, Duduk, B,, 2009: Phytoplasma and phytoplasma diseases: a review of recent research. Phytopathologia Mediterranea, 48: 355-378. Kube, M., Mitrovic, J., Duduk, B., Rabus, R,, Seemuller, E,, 2012: Current View on Phytoplasma Genomes and Encoded Metabolism. The Scientific World Journal: doi:10.1100/2012/185942.
Mehle, N., Ravnikar, M., Seljak, G,, KnapiË, V,, Dermastia, M., 2011: The most widespread phytoplasmas, vectors and measures for disease control in Slovenia. Phytopathogenic Moliicutes, 1 (2): 65-76.
Mehle, N., Seljak, G,, Rupar, M., Ravnikar, M,, Dermastia, M., 2010: The first detection of a phytoplasma from the 16SrV (Elm yellows) group in the mosaic leafhopper Orientus ishidae. New Disease Reports, 22: doi: 10.5197/j.2044-0588.2010.022.011.
Nikolic, P., Mehle, N,, Gruden, K,, Ravnikar, M,, Dermastia, M., 2010: A panel of real-time PCR assays for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Molecular and Cellular Probes, 24: 303-309. Prezelj, N., Nikolic, P., Gruden, K,, Ravnikar, M., Dermastia, M., 2013: Spatiotemporal distribution of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology, 62 (4): 760-766.