Zdravljenje bakterijskih okužb z bakteriofagi Zdravljenje bakterijskih okužb z bakteriofagi Bacteriophage therapy Tomaž Bratkovic, Andrej Preželj Povzetek: Ideja o uporabi bakteriofagov za zdravljenje okužb, povzročenih z bakterijskimi patogeni, je stara že skoraj stoletje. Nerazumevanje biologije bakteriofagov in pomanjkanje nadzorovanih kliničnih raziskav, predvsem pa odkritje antibiotikov, so bakteriofagno terapijo po začetnem zagonu v zahodnih državah pahnile v pozabo. Vse bolj pereč problem odpornosti bakterijskih patogenov proti klinično pomembnim antibiotikom je v zadnjem desetletju obudil zanimanje za bakteriofagna zdravila. Znanje, ki je rezultat sodobnih raziskav, ponuja realno možnost novih terapevtskih pristopov in odpira tudi nekatera povsem nova področja uporabe bakteriofagov. Ključne besede: bakterijske okužbe, bakteriofagi, antibiotiki, encibiotiki Abstract: The use of bacteriophage for combating bacterial infections was proposed almost a century ago. However, after the initial enthusiasm the idea quickly faded in the West with the discovery of antibiotics, accompanied by lack of phage biology understanding and insufficient proof of therapeutic efficacy of bacteriophage medicines due to inappropriately designed clinical trials. Today, as we are faced with accelerating emergence of bacterial resistance to antibiotics, the idea of bacteriophage-based drugs was brought back to life. Knowledge gathered over all these years offers a solid foundation on which to build new therapeutic approaches and develop alternative areas of bacteriophage application Keywords: bacterial infections, bacteriophages, antibiotics, enzybiotics 1 Bakterijski virusi Bakteriofagi (krajše: fagi) so preprosti virusi, ki se razmnožujejo izključno v bakterijskih celicah. Odkril jih je francosko-kanadski mikrobiolog Félix d’Herelle. Pri svojih raziskavah je opazil, da so v nekaterih bakterijskih kolonijah na agarnem gojišču prisotna drobna področja, kjer bakterije ne uspevajo. Pri prenosu takih kolonij v bakterijsko kulturo v tekočem gojišču je že v nekaj urah opazil, da je prišlo do odmrtja vseh bakterij in posledično do zbistritve gojišča. Sklepal je, da je vzrok mikroorganizem, ki se kot zajedalec »hrani« z bakterijami - od tod izhaja tudi ime bakteriofag (grško »tisti, ki jé bakterije«). Enak pojav (naknadno poimenovan Twort-d’Herelle-ov fenomen) je pred d’Herelle-om opisal angleški bakteriolog Frederick Twort, a je delovanje zmotno pripisal za bakterije toksičnemu proteinskem dejavniku (1, 2). Fagi so v naravi prisotni skoraj povsod. Najdemo jih v slanih in sladkih vodah, v prsti, v hrani in tudi v pitni vodi. V prebavnem traktu živali in človeka predstavljajo pomemben del normalne gastrointestinalne flore. Ocenjujejo, da je njihovo celokupno število reda velikosti 1031 kar je približno desetkrat več, kot je velikost celokupne svetovne bakterijske populacije (3, 4) Genetsko so bakteriofagi izjemno heterogena skupina. Pri najmanjših tvorijo genom vsega štirje geni, dedni material največjih pa gradi tudi do štiristo genov. Genska informacija je prisotna bodisi v obliki enoverižne ali dvoverižne RNA oziroma DNA, v linearni ali cikličnimi obliki. Ne glede na morfološko pestrost oblik je vsak virusni delec (virion) zgrajen iz osrednje nukleinske kisline, ki jo obdaja proteinski plašč (3). Praviloma so bakteriofagi glede na gostitelja ne le vrstno, temveč pogosto celo sevno visoko specifični. Primarni dejavnik, ki določa gostiteljsko specifičnost, so površinske strukture na bakterijskih celicah, po svoji naravi proteini ali ogljikovi hidrati. Le-te bakteriofag izkorišča kot receptorje za pritrditev na bakterijo (3, 5) Skladno s heterogenostjo bakteriofagov imajo ti tudi nadvse različne življenjske cikle. V splošnem ločimo liticne (virulentne) in lizogene (temperatne) bakteriofage (slika 1). 2 Zgodovina zdravljenja bakterijskih okužb z bakteriofagi d’Herelle je svoje poskuse iz laboratorija kmalu prenesel na živali Glede na njegova navajanja mu je uspelo močno omejiti epidemijo bakterijskega gastroenteritisa med kokošmi, tako da jim je v hrano dodajal bakteriofage, specifične za bakterijo Salmonella gallinarum. Uspešen naj bi bil tudi pri zajezitvi epidemije hemoragične septikemije pri vodnih bivolih, katerim je bakteriofage, specifične za bakterijo Pasteurella multocida, injiciral intravensko (7). Poskuse je nato nadaljeval še na sebi, članih družine in sodelavcih. Opogumljen z rezultati je d’Herelle poskusil tudi z zdravljenjem okužb pri bolnikih številna poročila pričajo, da je bilo mogoče v dobi pred odkritjem antibiotikov z d’Herelle-ovo metodo odpraviti prej neozdravljive bolezni bakterijskega vzroka, kakršne so bubonska kuga, krvave griže dr. Tomaž Bratkovic, mag. farm., Fakulteta za farmacijo, UL, Aškerceva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija dr. Andrej Preželj, mag. farm., Lek farmacevtska družba d.d., Verovškova 57, 1526 Ljubljana, Slovenija farm vestn 2008; 59 129 Pregledni znanstveni članki - Review Scientific Articles bakteriofagov genom proteinski plašc C^D i vstop bakteriofagovega genoma v gostiteljsko celico J izstop bakteriofagove DNA iz bakterijskega genoma celicna delitev e^j LIZOGENI CIKEL pomnozevanje bakteriofagovega genoma vgraditev bakteriofagove DNAvbakterijsk genom ŁSB liza bakterijske celice in sprostitev bakteriofagov (S) profag sestavljenje novih virusnih delcev Slika 1. Primerjava laicnega (levo) in lizogenega cikla (desno) (prirejeno po 6). Nekateri bakteriofagi so stabilno liticni in svoje DNA ne vgrajujejo v genom gostiteljske bakterije. Bakteriofag po okužbi bakterije izkorišča celične mehanizme za pomnoževanje lastnega genoma in sintezo strukturnih proteinov ovojnice. Nazadnje bakteriofag izzove smrt celice in pomnoženi virusni delci se sprostijo iz lizirane bakterije. Lizogeni bakteriofagi svoj dedni material vgradijo v genom gostiteljske celice (tak latentni bakteriofag imenujemo profag), ki se tako prenaša na vse hčerinske bakterije, nastale z vegetativno delitvijo okužene celice. Ob indukciji profag izstopi iz bakterijskega genoma (občasno »odnese« s seboj tudi del bakterijskega genoma in ga naknadno vgradi v genom nove gostiteljske celice; proces imenujemo transdukcija). Bakteriofag nato vstopi v t. i. litični cikel, pri tem nastajajo novi bakteriofagi. Figure 1. Comparison of lytic (left) and lysogenic cycle (right) (6). Some phages are stably lytic and do not integrate their DNA into hosts’ genomes. Upon infecting the bacterium phage uses the cell’s mechanisms to replicate the viral genome and produce capsid proteins. Multiplied virions are released from bacterium through cell lysis. Lysogenic phages, on the other hand, integrate their genetic material into host cells’ genomes (such dormant phages are called prophages) and are thus transferred to all daughter cells (bacterial clones). Following induction, prophage enters the lytic cycle, forming new virions. Sometimes a lysogenic phage transfers parts of old host genome to newly infected bacteria in a process known as transduction. in kolera (1, 7). Tako imenovana bakteriofagna terapija je postala v dvajsetih letih prejšnjega stoletja zelo popularna, sam d’Herelle pa naj bi si prislužil celo nominacijo za Nobelovo nagrado za medicino (8). Do štiridesetih let prejšnjega stoletja je več farmacevtskih podjetij v Franciji in Združenih državah Amerike tržilo zdravila, ki so vsebovala bakteriofage, vendar pa je splet okoliščin (odkritje betalaktamskih antibiotikov), kot tudi nepoznavanje rokovanja s pripravki botrovalo negativnim odzivom Sveta za farmacijo in kemijo (Council on Pharmacy and Chemistry) uglednega Ameriškega zdravniškega združenja (American Medical Association). Očitki novi tehnologiji so leteli predvsem na pomanjkanje ustrezno izvedenih kliničnih raziskav, ki bi nedvoumno potrjevale učinkovitost bakteriofagnih zdravil (2, 7). V nasprotju z Zahodom se je uporaba bakteriofagov v Vzhodni Evropi ohranila vse do devetdesetih let prejšnjega stoletja. Največja centra bakteriofagne terapije sta aktivna še danes. V Wroclawu deluje Hirszfeldov inštitut za imunologijo in eksperimentalno terapijo, v Tbilisiju pa Eliavin inštitut za bakteriofage, mikrobiologijo in virologijo (slednjega je soustanovil sam d’Herelle). Sovjetski in poljski zdravniki so poročali o 80-90 % uspešnosti v boju s trdovratnimi bakterijskimi patogeni, pogosto odpornimi proti različnim skupinam antibiotikov. Zahodni svet je obdržal znanstveno sporno, politično motivirano odklonilno stališče do bakteriofagne terapije, verjetno tudi zaradi nedostopnosti novejše znanstvene literature in načelnem zavračanju vsega sovjetskega (1, 5, 7). Kot zanimivost naj omeniva, da so še v sedemdesetih letih prejšnjega stoletja pod pokroviteljstvom Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) v Pakistanu potekale klinične raziskave, v okviru katerih so potrdili primerljivo učinkovitost zdravljenja kolere s tetraciklinskimi antibiotiki in visokimi odmerki bakteriofagov, danim per os (7) 130 farm vestn 2008; 59 Zdravljenje bakterijskih okužb z bakteriofagi 3 Sodoben pogled na bakteriofagno terapijo Bakteriofagna terapija, v svojih zacetkih skrajno revolucionarna tehnologija, je bila za tedanji svet pred svojim casom. Takratno znanje s podrocja mikrobiologije in medicine je ni dohajalo, zato je bila njena terapevtska vloga in tržna uveljavitev vnaprej obsojena na neuspeh Poleg tega je ob uvedbi antibiotikov v klinicno prakso sprva kazalo na dokoncno zmago cloveštva nad patogenimi bakterijami in o alternativnih metodah zdravljenja bakterijskih okužb niso razmišljali Danes je potreba po alternativnih zdravljenjih okužb velika. Ena od možnih rešitev je identifikacija novih tarc in razvoj protimikrobnih ucinkovin z novimi mehanizmi delovanja, torej kemoterapevtikov, proti katerim bakterije še niso odporne. Še vedno veliko vlagajo tudi v razvoj zaviralcev bakterijskih proteinov, ki so nosilci odpornosti. Nekatere takšne ucinkovine so že ucinkovita podpora uveljavljenim antibiotikom. Na drugi strani sta napredek v poznavanju biologije bakteriofagov ter razvoj biomedicinskih tehnologij v zadnjem desetletju omogocila ponovno znanstveno ovrednotenje bakteriofagne terapije. Primerjavo lastnosti antibiotikov in bakteriofagov kot protibakterijskih zdravil podaja preglednica 1 Trenutno je v svetu le nekaj deset manjših in srednje velikih biotehnoloških podjetij, ki predstavljajo prvi val razvoja tehnologij za uporabo bakteriofagov v humani in veterinarski medicini, poljedelstvu in prehrambeni industriji (9). V nadaljevanju predstavljava pogled na bakteriofagno terapijo skozi oci sodobne znanosti vkljucno z nekaterimi novimi koncepti in biotehnološkimi pristopi v nacrtovanju protimikrobnih (bakteriofagnih) zdravil prihodnosti. 3.1 Klasična bakteriofagna terapija Eticni standardi biomedicinskih raziskav v današnjem casu so neprimerljivi s tistimi z zacetka 20. stoletja, ko je d’Herelle pricel z uvajanjem bakteriofagne terapije. Takö zavedanje o podrobnem dogajanju med bakteriofagovim življenjskim ciklom in potencialnim imunskim odzivom, ki bi utegnil spremljati vnos bakteriofagov v organizem, vzbuja številne tehtne pomisleke o varnosti bakteriofagnih zdravil. A z današnjim znanjem zagovorniki bakteriofagne terapije lahko kritikom in skeptikom ponudijo sprejemljive rešitve. Osnovna zahteva za zagotovitev varnosti bakteriofaga kot zdravila je, da izberemo vrsto, ki je stabilno liticna in ne prenaša genetskega materiala s transdukcijo med bakterijami (glej tudi sliko 1). Lizogen bakteriofagi niso zgolj manj ucinkoviti, temvec ob njihovi uporabi obstaja tudi nevarnost horizontalnega prenosa antibioticne odpornosti, bakterijskih toksinov in virulentnih dejavnikov. Pri tem se lahko prej nenevarni bakterijski sevi pretvorijo v patogene. Transdukcija je sicer možna tudi pri liticnih bakteriofagih, a je precej manj verjetna (3, 10). Z dolocitvijo nukleotidnega zaporedja fagnega genoma in naknadno bioinformaticno analizo je pred nacrtovano uporabo dolocenega bakteriofaga smiselno preveriti, ali so v genomu prisotni geni, ki kodirajo znane alergene, toksine in virulentne dejavnike (3). Endotoksine, ki izvirajo iz liziranih gostiteljskih celic, v katerih pomnožujejo bakteriofage v bioreaktorjih, je z modernimi separacijskimi tehnikami, kot sta ultracentrifugiranje in ionsko-izmenjevalna kromatografija, mogoce ucinkovito odstraniti (3). Pri sterilizaciji bakteriofagnega zdravila je potrebno izbrati metode, ki zagotavljajo ohranitev infektivnosti bakteriofagov, in validirati pogoje shranjevanja (6). Vsekakor pa je najpomembneje preveriti ucinkovitost bakteriofaga kot bakteriolitika na živalskem modelu bakterijske okužbe, saj se posamezne bakteriofagne vrste v pogojih in vivo obnašajo razlicno (6). Skurnik in sod. (6, 11, 12) so ugotovili, da bakteriofaga PY100 in f Ye03-12, dana mišim per os (v neodvisnih raziskavah), ne zašcitita živali pred naknadno izzvano okužbo z bakterijo Yersinia enterocolitica, ceprav so v kulturah in vitro opazili popolno lizo bakterij. Drugi raziskovalci porocajo o visoki ucinkovitosti svojih bakteriofagov, ki so statisticno znacilno zmanjšali umrljivost pri miših po intraperitonealnem injiciranju v casu do 5 ur po okužbi z virulentnima bakterijama Enterococcus faecium (13) in Staphylococcus aureus (14). Farmakokineticne lastnosti bakteriofagov niso primerljive s klasicnimi ucinkovinami. Praviloma se zadržujejo in pomnožujejo na samem mestu okužbe le v prisotnosti gostiteljske bakterije, kar je s terapevtskega in toksikološkega vidika ugodno, znižuje pa tudi potrebo po veckratnem odmerjanju (1, 7). Po intravenskem dajanju se bakteriofagi razporedijo v vecino organov, kar omogoca njihovo uporabo za razlicne tipe infekcij. Zanimivo je, da se (vsaj nekatere vrste) kljub precejšnji velikosti ucinkovito absorbirajo iz prebavnega trakta in prehajajo celo v urin (4). Iz organizma se pospešeno odstranjujejo, za kar je pretežno odgovoren retikuloendotelijski sistem. Nekateri bakteriofagi so dokazano imunogeni in izzovejo tvorbo nevtralizacijskih protiteles (4). Slednja za uspešnost bakteriofagne terapije naj ne bi bila omejujoc dejavnik, saj je kinetika bakterijske liže veliko hitrejša kot humoralni imunski odziv (1), vendar so poskusi zdravljenja ponovne okužbe z isto vrsto bakteriofaga manj uspešni. O zanimivem odkritju porocajo Merrill in sod. (15). Razvili so metodo za izolacijo razlicic bakteriofagov, ki jih imunski sistem ne prepozna. Mišim so intraperitonealno injicirali enterofag l, ga po dolocenem casu izolirali iz odvzetih vzorcev krvi, pomnožili in vitro v kulturah mutatorske bakterije Escherichia coli in ocišcene ponovno injicirali poskusnim živalim. Po desetih krogih takšne selekcije in vivo (cas pred odvzemom vzorcev krvi so postopoma podaljševali) in pomnoževanja in vitro so uspeli izolirati bakteriofagni klon, na katerega se mišji imunski sistem ni odzival in je bil zato uspešnejši pri odpravljanju ponovno povzrocenih okužb. Rezultat pojasnjujejo z mutacijo antigenskih determinant na bakteriofagni ovojnici Težave pri prakticni uporabi bakteriofagnih zdravil bi zarad gostiteljske specificnosti utegnila povzrocati potreba po hitri in tocni etiološki diagnostiki - identifikaciji vrste in seva patogena. To nekdaj zamudno in pogosto nemogoco nalogo je mogoce premagati s sodobnimi tehnologijami, kakšni sta DNA-mikromreže ali verižna reakcija s polimerazo (PCR) (3). V preteklosti so poskušali doseci širši spekter delovanja bakteriofagnih zdravil s pripravo kombinacije razlicnih bakteriofagov, ki so lizirali vecino sevov nekega patogena, t. i. fagnih koktejlov Po drugi strani so smiselne tudi kombinacije razlicnih bakteriofagov, ki imajo skupnega gostitelja, saj je verjetnost, da bi patogen razvil odpornost proti vsem, zanemarljiva. Pri razvoju potencialnih bakteriofagnih zdravil se bo potrebno omejiti le na tiste patogene, ki predstavljajo najvecje težave in izzive za sodobno zdravljenje (multirezistentne bakterije kot so MRSA (Staphylococcus aureus odporen proti meticilinu), VRE (enterokoki odporni proti vankomicinu) in Pseudomonas aeruginosa). Z vidika regulatornih farm vestn 2008; 59 1311 Pregledni znanstveni članki - Review Scientific Articles Preglednica 1. Primerjava protibakterijskih lastnosti bakteriofagov in antibiotikov (zgornji del tabele) ter nekaterih razvojnih značilnosti obeh vrst zdravil (spodnji del tabele) (prirejeno po 1, 3). Table 1. Comparison of antibacterial properties of phages and antibiotics (upper part) and some specific development issues concerning both types of drugs (lower part of table) (1, 3). Bakteriofagi Antibiotiki Opomba So glede na gostitelja vrstno/sevno specifični, zato je verjetnost sekundarnih okužb manjša. Vplivajo tudi na normalno bakterijsko floro, kar lahko vodi v sekundarne (npr. glivične) okužbe. Hitra mikrobiološka diagnostika je predpogoj za uspešno izbiro protimikrobnega zdravila, kar v primeru visoko specifičnih bakteriofagov lahko obravnavamo tudi kot pomanjkljivost. Se pomnožujejo na mestu okužbe in se sicer hitro odstranijo iz organizma. Telo jih presnavlja in izloča. Ne zadržujejo se samo na mestu okužbe. Teoretično zadostuje en sam odmerek bakteriofagnega zdravila. Po preboleni bolezni fagi hitro zapustijo organizem. Novejše raziskave opravljene na poskusnih živalih in zdravih prostovoljcih niso odkrile resnejših stranskih učinkov pri dajanju bakteriofagnih zdravil številni antibiotiki imajo stranske učinke, npr. so alergogeni, ototoksični, nefrotoksični izzovejo sekundarne okužbe ipd. Litični bakteriofagi bi lahko izzvali septični šok zaradi obsežne lize bakterijskih celic, pri čemer se sprostijo endotoksini. Bakteriofagi sicer so imunogeni, vendar se praviloma še pred pojavom nevtralizacijskih protiteles odstranijo iz organizma. Ob ponovni okužbi je bakteriofagna terapija z isto vrsto bakteriofaga manj učinkovita. Razvoj odpornosti patogene bakterije proti eni vrsti bakteriofaga ne predstavlja nevarnosti, saj ostane bakterija občutljiva na druge bakteriofage. Razvoj odpornosti proti antibiotiku ni omejen na patogene bakterije in se lahko prenaša med različnimi bakterijskimi vrstami Antibiotiki vršijo selekcijski pritisk na širok spekter bakterijskih vrst, tako patogene kot tiste, ki so del normalne flore. Odkrivanje oz. izolacija novih baktreiofagov je relativno hiter (nekaj tedenski) in cenovno ugoden proces. Razvoj novega antibiotika je zamuden in predvsem finančno izjemno zahteven proces (10-12 let). Bakteriofagi so se več kot tri in pol milijarde let razvijali skupaj z gostiteljskimi bakterijami, zato je zelo verjetno, da je mogoče odkriti oz. izolirati »nove« bakteriofage, ki napadajo bakterijske celice, odporne proti določenim vrstam bakteriofagov ali antibiotikov. Pričakovane so težave pri poskusu registracije bakteriofagnih zdravil, posebej pri zmeseh več bakteriofagov z različno specifičnostjo, ki bi učinkovali proti širšemu spektru bakterij (bakteriofagni koktejli), in potrebnih zamenjavah aktivnih bakteriofagov pri nastopu bakterijske odpornosti Smernice/pogoji za registracijo novih antibiotičnih zdravil so dobro definirani. Regulatorni organi (še) ne ponujajo smernic za registracijo bakteriofagnih zdravil. Bakteriofagna zdravila so problematična Zaščita intelektualne lastnine v primeru z vidika intelektualne lastnine in patentne zaščite. antibiotikov in antibiotičnih zdravil načeloma ni sporna. V Vzhodni Evropi je bakteriofagna terapija neprekinjeno v uporabi več kot 80 let, kar onemogoča patentiranje zaradi pomanjkanja novosti (prior art). Patentna zaščita gensko spremenjenih bakteriofagov in terapevtskih pripravkov z bakteriofagi ni sporna. Pripravki z bakteriofagi zahtevajo posebne pogoje shranjevanja za ohranitev infektivnosti bakteriofagov. Antibiotiki so fizikalno-kemijsko stabilni zdravila imajo zato relativno dolg rok uporabe. Nekatere vrste bakteriofagov so občutljive na nizko, druge na visoko temperaturo. Nekatere vrste izkazujejo dobro stabilnost kot liofilizati (> 1 leto pri sobni temperaturi). 132 farm vestn 2008; 59 Zdravljenje bakterijskih okužb z bakteriofagi organov je uporaba variabilnih bakteriofagnih mešanic nesprejemljiva, saj za vsako kombinirano zdravilo zahtevajo ločeno izvedbo kliničnih študij za posamezne učinkovine (10). S tem povezani astronomski stroški razvoja bakteriofagnih zdravil in problematična zaščita intelektualne lastnine vsaj zaenkrat odvračata večja farmacevtska podjetja od vlaganj v razvoj te skupine zdravil. 3.2 Gensko spremenjeni bakteriofagi Baktriofagi imajo kot bakteriolitične učinkovine številne pomanjkljivosti. Razvoj omnipotentnega oz. širokospektralnega bakteriofaga s tehnologijo rekombinantne DNA je le malo verjeten (3). Kljub temu ostaja nakaj upanja za razvoj bakteriofaga, ki bi uspešno prepoznal večino sevov nekega patogena. Določeni bakteriofag namreč svoj genom v gostiteljsko bakterijo vnesejo tako, da s posebnimi encimi vanjo »zvrtajo« luknjo (6). Bakteriofag, ki bi v genomu vseboval zapise za več hidrolaz, ki bi bile sposobne razgraditi različne površinske strukture na bakteriji, bi tako izkazoval širši antibakterijski spekter delovanja. številni kritiki bakteriofagne terapije se bojijo septičnega šoka, ki bi utegnil nastopiti ob sprostitvi endotoksinov pri obsežni bakterijski lizi (pojav je dokumentiran tudi pri uporabi antibiotikov). Poleg tega bi visoka lokalna koncentracija novonastalih bakteriofagov sama lahko sprožila imunsko reakcijo (10). Matsuda in sod. (16) so zato razvil bakteriofag z okvarjenim litičnim sistemom. Bakteriofag je v mišjem modelu sepse okužil bakterije E. coli, se v njih pomnoževal in povzročil bakterijsko smrt, a ni izzval lize. Učinkovitost bakteriofagne terapije je bila celo višja kot pri uporabi betalaktamskega antibiotika. Hagens in Bläsi (17) sta pripravila dve različici gensko spremenjenega nitastega bakteriofaga M13 (vrste, ki sicer ni baktericidna). V genom matičnega bakteriofaga sta vgradila gen za endonukleazo (encim, ki prepozna določena nukleotidna zaporedja in cepi dvoverižno DNA) ali holin (protein, ki z umestitvijo v membrano bakterij v njej tvori pore). Ugotovila sta, da bakteriofaga in vitro delujeta baktericidno, a je sproščanje endotoksinov v gojišče v primerjavi s kulturami, okuženimi z litičnimi bakteriofagi, zanemarljivo majhno. Na podoben način so Westwater in sod. (18) kot dostavni sistem za vnos genov, kodirajočih specifične antibakterijske toksine, uporabili fagmidni sistem M13, a so uspeli učinkovitost protibakterijskega delovanja dokazati tudi in vivo v mišjem modelu bakteriemije. Nenazadnje so gensko spremenjeni bakteriofagi zanimivi tudi z vidika patentne zaščite, kar bi k razvoju bakteriofagnih zdravil utegnilo privabiti podjetja, sposobna v raziskave vložiti več finančnih sredstev. 3.3 Encibiotiki Z izrazom encibiotik (skovanko iz besed »encim« in »antibiotik«) označujemo rekombinantne proteinske produkte bakteriofagnih genov (t. i. lizine), ki sprožijo lizo bakterijske celice. Lizini so hidrolitični encimi (glikozidaze ali amidaze), ki po translokaciji v periplazemski prostor razgrajujejo peptidoglikansko celično steno. Ugotovili so, da encibiotiki delujejo baktericidno tudi z zunaje stran celice (vsaj pri po Gramu pozitivnih bakterijah). žal je litični spekter lizinov ozek, saj je pogojen s prisotnostjo specifičnih ligandov (običajno ogljikovih hidratov; ki predstavljajo vezavne epitope), vezanih na peptidoglikansko mrežo. Lizini so dvodomenski proteini aktivnost obeh domen - encimske (hidrolitične) in vezavne - pa je neodvisna. Tako je mogoče s kombiniranjem različnih domen pripraviti encibiotike z novo specifičnostjo delovanja (19). Encibiotiki so izjemno zanimivi kot protimikrobne učinkovine, saj (vsaj zaenkrat) v laboratorijskih poskusih zaporednih pasaž še niso zaznali razvoja bakterijske odpornosti, niti niso opazili, da bi se nanje imunski sistem poskusnih živali odzval s tvorbo nevtralizacijskih protiteles (19). Fischetti in sod. so dokazali visoko učinkovitost različnih encibiotikov proti različnim vrstam streptokokov in bakteriji Bacillus antracis v pogojih in vitro in in vivo (20-23). Poseben izziv predstavljajo bakterijski biofilmi in metabolno manj aktivne bakterijske celice (24), ki pomembno prispevajo h kroničnemu poteku infekcij in so naravno odporni proti zdravljenju z antibiotiki in bakteriofagnimi terapevtiki. 3.4 Bakteriofagi kot orodje za identifikacijo novih protimikrobnih tarč Bakteriofagi so obligativni znotrajcelični patogeni evbakterij in so kot taki razvili sposobnost izkoriščati gostiteljeve mehanizme za lastno pomnoževanje. To vključuje tudi oviranje številnih bakterijskih presnovnih poti, s čimer se večina energije usmeri v izražanje bakteriofagovih genov in replikacijo bakteriofagovega genoma. Bakteriofagne proteine, ki na različnih nivojih delujejo kot inhibitorji delitve bakterijske celice, je mogoče uporabiti pri identifikaciji in validaciji novih protimikrobnih tarč ali celo pri razvoju presejalnih testov za identifikacijo nizkomolekularnih protimikrobnih spojin s povsem novimi mehanizmi delovanja (25, 26). 3.5 že uveljavljeni bakteriofagni profilaktiki Redki izdelki, ki kot aktivno komponento vsebujejo bakteriofage, so se na nekaterih manj strogo nadzorovanih področjih uveljavili že tudi na Zahodu. V Združenih državah Amerike je od leta 2005 poljedelcem na voljo pesticid za preprečevanje in zatiranje bakterijskih bolezni paradižnika in paprike, povzročenih z bakterijama Xanthomonas campestris pv. vesicatoria in Pseudomonas syringae pv. tomato (27) Isti proizvajalec ponuja živinorejcem tudi pršilo, ki vsebuje bakteriofage, specifične za salmonelo (28). Namenjeno je omejevanju prisotnosti te bakterije na koži goveda, kar zniža verjetnost kontaminacije mesa pri klanju. FDA je v lanskem letu odobrila celo uporabo fagnega koktejla v obliki pršila za zaščito pripravljenih mesnih jedi pred kontaminacijo z nevarno bakterijo Listeria monocytogenes (29). Edini avtorjema poznani primer uradno registriranega bakteriofagnega zdravila je obliž iz biorazgradljivih polimerov, impregniran z različnimi bakteriofagi, ki je bil nedavno v Gruziji odobren za zdravljenje trdovratnih kožnih okužb in okužb odprtih ran (2). 4 Zaključek Napredki na področju biotehnologije, mikrobiologije in infektologije omogočajo ponovno znanstveno ovrednotenje sicer skoraj stoletje stare ideje o uporabi bakteriofagov za preprečevanje in zdravljenje bakterijskih okužb. Bakteriofagna terapija - četudi se nekoč uveljavi farm vestn 2008; 59 1331 Pregledni znanstveni članki - Review Scientific Articles kot del moderne medicine - ne bo nikoli zamenjala uporabe antibiotikov. Slednji ostajajo preveč pomembni, uspešni in potrebni da bi popolnoma opustili njihovo uporabo. Bakteriofagi ponujajo kvečjemu potencialno dopolnitev antibiotičnega arzenala, namenjeno zlasti uničevanju multirezistentnih bakterijskih patogenov, ki predstavljajo naraščajočo grožnjo človekovemu zdravju (5, 19). 5 Literatura 1. Sulakvelidze A, Alavidze Z, Moriss Jr. JG. Bacteriophage therapy. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45(3): 649-659. 2. Stone R. Stalin’ forgotten cure. Science 2002; 298: 728-731 3. Skurnik M, Pajunen M, Kiljunen S. Biotechnological challenges of phage therapy. Biotechnol Lett 2007; 29: 995-1003. 4. Dabrowska K, Switała-Jelen K, Opolski A et al. Bacteriophage penetration in vertebrates. J Appl Microbiol 2005; 98: 7-13. 5. Pirisi A. Phage therapy - advantage over antibiotics? Lancet 2000; 356: 1418. 6. Skurnik M, Strauch E. Phage therapy: facts and fiction. Int J Med Micobiol 2006; 296: 5-14. 7. Summers WC. Bacteriophage therapy. Annu Rev Microbiol 2001 55: 437-451 8. Häusler T. Viruses vs. superbugs. A solution to the antibiotic crisis? Macmillan, 2006. 9. Projan SJ. New (and not so new) antibacterial targets - from where and when will the novel drugs come? Curr Opin Pharmacol 2002; 2: 513-522. 10. Thiel K. Old dogma, new tricks - 21st Century phage therapy. Nat Biotechnol 2004; 22(1): 31-36. 11. Pajunen M, Kiljunen S, Skurnik M. Bacteriophage YeO3-12, specific for Yersinia enterocolitica serotype O:3, is related to coliphages T3 and T7. J Bacteriol 2000; 182: 5114-5120. 12. Pajunen M, Kiljunen SJ, Soderholm ME et al. Complete genomic sequence of the lytic bacteriophage YeO3-12 of Yersinia enterocolitica serotype O:3. J Bacteriol 2001; 183: 1928-1937. 13. Biswas B, Adhya S, Washart P et al. Bacteriophage therapy rescues mice bacteremic from a clinical isolate of vancomycin resistant Enterococcus faecium. Infect Immun 2002; 70: 2004-210. 14. Matsuzaki S, Yasuda M, Nishikawa H et al. Experimental protection of mice against lethal Staphylococcus aureus infection by novel bacteriophage MR11. J Infect Dis 2003; 187: 613-624. 15. Merril Cr, Biswas B, Carlton R et al. Long-circulating bacteriophage as antibacterial agents. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 3188-3192. 16. Matsuda T, Freeman TA, Hilbert DW et al. Lysis-deficient bacteriophage therapy decreases endotoxin and inflammatory mediator release and improves survival in a murine peritonitis model. Surgery 2005; 137(6): 639-646. 17. Hagens S, Blasi U. Genetically modified filamentous phage as bactericidal agents: a pilot study. Lett Appl Microbiol 2003; 37(4): 318-323. 18. Westwater C, kasman LM, Schofield DA et al. Use of genetically engineered phage to deliver antimicrobial agents to bacteria: an alternative therapy for treatment of bacterial infections. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47(4): 1301-1307. 19. Fischetti VA, Nelson D, Schuch R. Reinventing phage therapy: are the parts greater than the sum? Nat Biotechnol 2006; 24(12): 1508-1511 20. Loeffler JM, Nelson D, Fischetti VA. Rapid killing of Streptococcus pneumoniae with a bacteriophage cell wal hydrolase. Science 2001; 294: 2170-2172. 21. Nelson D, Loomis L, Fischetti VA. Prevention and elimination of upper respiratory colonization of mice by group A streptococci by using a bacteriophage lytic enzyme. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 4107-4112. 22. Schuch R, Nelson D, Fischetti VA. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. Nature 2002; 418: 884-889. 23. Loeffler JM, Fischetti VA. Synergistic lethal effect of a combination of phage lytic enzymes with different activities on penicillin-sensitive and -resistant Streptococcus pneumoniae strains. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47(1): 375-377. 24. Lewis K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nat Rev Microbiol 2007; 5(1): 48-56. 25. Liu J, Dehbi M, Moeck G et al. Antimicrobial drug discovery through bacteriophage genomics. Nat Biotechnol 2004; 22(2): 185-191 26. Projan S. Phage-inspired antibiotics? Nat Biotechnol 2004; 22(2) 167-168. 27. OmniLytics obtains landmark EPA registration for bacteriophage usage; revolutionary AgriPhage products approved for use on tomato and pepper crops. Business Wire, February 15, 2006. 28. OmniLytics announces USDA/FSIS allowance of bacteriophage treatment of salmonella on livestock. Business Wire, March 29, 2007. 29. Bren L. Bacteria-eating virus approved as food additive. FDA Consumer 2007; January-February Issue. 134 farm vestn 2008; 59