Povzetek Rakasta pretvorba celice je odvisna od skupnega delovanja mutagenih snovi – iniciatorjev in nemutagenih snovi – promotorjev. Skupaj prizadenejo ekspresijo genov ({e posebno je pomembna ekspresija regulatornih genov), stimulirajo celi~no proliferacijo in spodbujajo delitev tistih celic, ki imajo po{kodovano DNA. Med bolj znanimi snovmi, ki povzro~ajo nastanek raka, so karcinogeni dejavniki kemi~nega izvora, razni virusi in razli~ne vrste sevanja, kot sta UV-svetloba in ionizirajo~e sevanje. V nastanek raka sta vpleteni predvsem dve skupini genov, in sicer protoonkogeni in tumorski supresorski geni. Prvi so med procesom karcinogeneze spodbujeni k ~im ve~ji ekspresiji, medtem ko so drugi spremenjeni tako, da je njihova ekspresija zmanj{ana ali da je njihov produkt funkcionalno neaktiven. Na sam proces karcinogeneze vplivajo tudi drugi dejavniki, ki ne povzro~ajo sprememb v nukleotidnem zaporedju DNA in jih imenujemo epigenetski dejavniki. Uvod Prve korake k razumevanju karcinogeneze predstavljajo opa`anja kirurga Percivala Potta iz sredine 18. stoletja. Opisal je povezavo med {tevilom bolnikov z rakom skrotuma in kroni~no izpostavljenostjo sajam iz dimnikov pri dimnikarjih. Na potrditev tovrstnih povezav smo morali ~akati do 50. let prej{njega stoletja, ko so profesionalno izpostavljenost delavcev v tekstilni in usnjarski industriji ter proizvodnji razli~nih barvil in gume povezali s pove~anim {tevilom obolelih za rakom mehurja. Vzroke za nastanek tega raka so pripisali aromati~nim spojinam – aminom, ki so jih s pridom uporabljali v omenjenih industrijskih panogah brez kakr{ne koli za{~ite. Danes, ve~ kot 50 let po teh odkritjih, {e vedno ne poznamo vseh podrobnosti, ki bi razkrivale natan~en potek procesa nastanka raka. Najnovej{e {tudije s tega podro~ja so nedvoumno potrdile obstoj na stotine dejavnikov, ki s svojim delovanjem lahko preusmerijo normalno celico na pot rakaste pretvorbe. Vse te dejavnike, ki so sposobni izzvati nastanek rakaste celice, imenujemo karcinogeni dejavniki. Proces, v katerem se normalna celica preoblikuje v rakasto, pa imenujemo karcinogeneza ali onkogeneza. Karcinogeneza kot ve~stopenjski proces Proces karcinogeneze je dolgotrajen in zapleten. Na splo{no govorimo o treh osnovnih stopnjah, ki vklju~ujejo vrsto razli~nih podstopenj: i) iniciacija, ii) promocija in iii) progresija. Ob predpostavki, da tumor nastaja iz ene same spremenjene celice, je jasno, da je prvi pogoj za kopi~enje in izra`anje nastalih sprememb v celici njihovo dedovanje v naslednjih generacijah celic. Ob tem zapletenem procesu govorimo o dvojni vlogi karcinogenih dejavnikov. Prva vrsta karcinogenih dejavnikov deluje kot mutageni impulz in neposredno spremeni celi~ni genetski zapis. S tem ti dejavniki povzro~ijo mutacije, ki se prena{ajo na naslednje generacije celic. Druga vrsta karcinogenih dejavnikov vpliva na vzorce izra`anja cele vrste genov, ki spremenijo izra`anje nekaterih kriti~nih genov (ter nastanek in delovanje njihovih produktov) brez neposrednega vpliva na zaporedje baznih parov v DNA. Tako delovanje imenujemo epigenetsko delovanje. Tako pri epigenetskih kot pri genetskih spremembah je potrebno, da se novi vzorec »vtisne v na novo zasnovan celi~ni spomin« in se kot tak prenese v naslednje generacije celic. Da bi celica »za`ivela« kot rakasta celica, mora torej nakopi~iti celo vrsto sprememb in si pridobiti lastnosti, ki jo naredijo razmeroma neodvisno od ustaljenih mehanizmov v normalnih celicah. Ker so ti mehanizmi odvisni od vrste celice oz. tkiva, iz katerega celica izhaja, so kombinacije sprememb oz. lastnosti, ki jih mora rakasta celica pridobiti, razli~ne za razli~ne vrste raka. Na splo{no lahko strnemo vse te lastnosti rakastih celic v nekaj kategorij. 1) Samozadostnost za lastno proliferacijo. To pomeni, da so vsi (ali vsaj ve~ina) potrebni signali za podvojevanje regulirani znotraj same celice, neodvisno od okolja in signalov iz okolja. 2) Neodzivnost na signale, ki uravnavajo {tevilo celi~nih delitev. Vsaka celica ima v svojem »spominu« vgrajeno dolo~eno {tevilo celi~nih delitev. To {tevilo je skrbno uravnavano prek razli~nih mehanizmov, ki se aktivirajo z diferenciacijo in s »staranjem« celice. Rakasta celica se preprosto izogne delovanju teh mehanizmov in se nekontrolirano deli. 3) Neodzivnost na signale, ki spro`ajo apoptozo. Ob huj{ih napakah na celi~ni DNA se v normalni celici spro`ijo popravljalni mehanizmi, ki bodisi napako popravijo bodisi celico – ob ve~jih napakah – preusmerijo v programirano celi~no smrt – apoptozo. Celica mora na svoji poti maligne transformacije postati neodzivna na te mehanizme, da bi omogo~ila prenos mutacije in njeno izra`anje v h~erinskih celicah. S tem si rakasta celica pridobi {e eno pomembno lastnost, in to je 4) Genetska nestabilnost. To pomeni, da so rakaste celice mnogo dojemljivej{e za razne spremembe, kar jim omogo~a hitrej{e in bolj{e prilagajanje na vplive iz okolja. 5) Preureditev tvorbe citokinov in izra`anja celi~nih antigenov. S prilagoditvijo tvorbe citokinov in izra`anjem antigenov si celica zagotovi dve stvari hkrati: slab{o prepoznavnost za imunski sistem in s tem imunsko ONKOLOGIJA / pregledi leto X / {t. 2 / december 2006 Srdjan Novakovi} Karcinogeneza – nastanek rakastih celic 99 2_2006_prelom.qxd 11/30/2006 7:47 PM Page 99 neodzivnost ter neposredno delovanje na celice v okolju. Pomembna je njihova produkcija angiogenih dejavnikov, ki omogo~ajo neovaskularizacijo tumorskega tkiva. 6) Zmo`nost prehoda rakastih celic v limfni in krvni obtok. Razvoj o`ilja v tumorju omogo~a tudi raz{iritev bolezni v oddaljene organe – metastaziranje. 7) Pritrditev v drugih organih in ponovna klonalna rast. Glede na procese, ki so vpleteni v nastanek raka, in na ~as, potreben, da se vsi dogodki zgodijo, se je dolgo ~asa govorilo o raku kot o bolezni starostnikov. Danes o raku ne govorimo samo kot o bolezni starostnikov, ampak kot o genski bolezni, ki se izra`a na dva razli~na na~ina. To sta sporadi~ni rak kot posledica somatskih mutacij in dedni rak kot posledica mutacij v spolnih celicah. Ob upo{tevanju kompleksnosti nastanka rakaste celice ter {tevila potrebnih dogodkov, da si celica zagotovi vse spremembe in uspe{no kon~a pot maligne preobrazbe, je jasno, da prek spolnih celic podedovane mutacije, ki destabilizirajo genom, mo~no skraj{ajo proces nastanka raka. Zato je za vse dedne rake zna~ilno, da nastanejo mnogo prej kot sporadi~ni primeri in da so osebe prizadetih dru`in mnogo bolj ogro`ene za razli~ne vrste raka. Karcinogeni dejavniki V grobem lo~imo karcinogene dejavnike na fizikalne, kemi~ne in biolo{ke. Skupna lastnost vseh ne glede na izvor je, da spremenijo celi~no DNA. Spremenijo jo bodisi tako, da izzovejo mutacije (mutageni dejavniki) ali da spremenijo izra`anje genov brez poseganja v strukturo DNA (epigenetski dejavniki). Epigenetski dejavniki se izra`ajo predvsem tako, da celico vzpodbujajo in jo stalno silijo v ekspresijo dolo~enih genov. Med karcinogenezo se spremeni metilacija protoonko genov, tumorskih supresorskih genov ter genov, ki so odgovorni za popravljalne mehanizme DNA v celici. Hipermetilirajo in s tem uti{ajo se tumorski supresorski geni ter geni, odgovorni za popravljanje nastalih napak na DNA. Hipometilirajo in s tem aktivirajo pa se protoonkogeni in geni, odgovorni za tumorsko metastaziranje. Proces metilacije naj bi bil tudi neposredno povezan z nastankom mutacij. Tako naj bi hipermetilacija predpogojevala nastanek to~kovnih mutacij, mutacij zaradi spremembe bralnega okvirja, mutacij z drugim pomenom in delecij. Vse na{tete mutacije pripeljejo do izgube funkcije genov. Nasprotno pa naj bi bila hipometilacija mo`en vzrok za kromosomske mutacije (preureditve in anevploidijo), ki potencirajo izra`anje ponovljenih genov (slika 1, slika 2). Fizikalni karcinogeni dejavniki delujejo na strukturo DNA z razli~nimi visokoenergetskimi delci. Pri tem lahko neposredno po{kodujejo celi~no DNA ter povzro~ijo mutacije ali pa te spro`ijo z delovanjem prostih radikalov, ki so nastali po obsevanju. Vsaka vrsta sevanja je lahko potencialno nevarna za strukturo DNA, vendar med bolj raziskane pri{tevamo UV-svetlobo in ionizirajo~e sevanje. Kemi~ni karcinogeni dejavniki delujejo na dva na~ina: i) tako da z vezavo na nukleotide v DNA destabilizirajo vezi med komplementarnimi nukleotidi ali ii) kot dejavniki, ki se ve`ejo med nukleotidi in povzro~ijo napake pri podvojevanju DNA. Med pomembnej{e karcinogene dejavnike pri{tevamo aflatoksine, heterocikli~ne aromatske amine, benzopirene, N-nitrozamine, katrane in akrilamid. Med biolo{ke karcinogene dejavnike pri{tevamo predvsem razne viruse. Na celi~no DNA delujejo na dva na~ina: i) neposredno povzro~ijo mutacije ob svojem pomno`evanju ali ii) posredno s svojimi promotorji vplivajo na izra`anje dolo~enih genov. Med pomembnej{e viruse, za katere obstajajo dokazi o karcinogenem delovanju, spadajo virus hepatitisa B (hepatocelularni karcinom), Epstein-Barrov virus (Burkittov limfom, nazofaringealni karcinom), humani T- limfocitotropni virus 1 (HTLV-1 – T-celi~na levkemija/limfom odraslih) ter virus humane imunske pomanjkljivosti (HIV – Kaposijev sarkom). ONKOLOGIJA / pregledi leto X / {t. 2 / december 2006 100 Slika 1. Epigenetski dejavniki spreminjajo predvsem metilacijo DNA. Preve~ metilirani geni se ne prepisujejo, medtem ko se premalo metilirani geni prepisujejo prekomerno. Poleg metilacije same DNA lahko delovanje epigenetskih dejavnikov spremeni strukturo kromatina – acetilacija, fosforilacija, metilacija histona. Slika 2. Epigenetski dejavniki so po svojem izvoru prav tako razli~ni kot mutageni dejavniki. Lo~nico med epigenetskim in mutagenim delovanjem lahko potegnemo {ele takrat, ko nastanejo spremembe na DNA – mutacije ali spremenjena ekspresija genov. Veliko je dejavnikov, ki delujejo epigenetsko in tudi mutageno. 2_2006_prelom.qxd 11/30/2006 7:47 PM Page 100 Protoonkogeni in tumorski supresorski geni Gene, ki so neposredno vpleteni v nastanek karcinogeneze, lahko v grobem razdelimo na skupino, ki je odgovorna za celi~no delitev ter podvojevanje DNA, in skupino, ki je odgovorna za preverjanje podvojene DNA ter nadzor celi~nega cikla. Med prve pri{tevamo protoonkogene, ki spadajo med t. i. zgodnje celi~ne gene, med druge pa tumorske supresorske gene. Onkogeni, ki so pravzaprav spremenjeni protoonkogeni, vklju~ujejo gene, ki kodirajo za razli~ne rastne faktorje, receptorje ali signalne prena{alce in jedrne transkripcijske faktorje. V to skupino uvr{~amo ve~ kot 100 razli~nih genov. Med procesom maligne transformacije se navadno spremenijo v promotorskih obmo~jih, kar povzro~i nekontrolirano prepisovanje in nastajanje produkta. Na njihovo stopnjo izra`anja poleg mutacij odlo~ilno vpliva stopnja metilacije. Med onkogene s pomembnim vplivom na nastanek raka uvr{~amo skupini onkogenov ras in myc. Proteini, ki jih kodirajo onkogeni ras, so na celi~nih membranah in so soudele`eni pri prenosu signalov tako za rastne faktorje kot za mitogene dejavnike. V nasprotju s proteini, ki jih kodira ras, so proteini, ki jih kodira myc, jedrni fosfoproteini (c-myc, N-myc in L-myc). Ti so pomembni transkripcijski faktorji za razli~ne gene. V nasprotju s protoonkogeni, ki se med karcinogenezo prekomerno izra`ajo, so tumorski supresorski geni neaktivni. Inaktivirajo se na dva na~ina: tako da je prisotna mutacija v delu, ki kodira strukturne proteine, ali tako da je regulatorna regija hipermetilirana. V obeh primerih je rezultat enak – odsotnost aktivnega proteina, ki bi kontroliral celi~ni cikel in preverjal pravilnost podvojene DNA. V prvem primeru je vzrok neaktiven mutiran protein, v drugem pa blokirana transkripcija gena. Zanimivo je, da se ta dva mehanizma pri tumorskih supresorskih genih velikokrat dopolnjujeta. Tako je pri tistih osebah, ki so podedovale mutacijo v enem alelu tumorskih supresorskih genov, najpogostej{i razlog za neaktivnost drugega alela prav hipermetilacija. Te`ko je re~i, kateri od tumorskih supresorskih genov je najpomembnej{i, kajti vsi so pomembni. Zato se bom omejil le na tiste, ki so najbolj znani in raziskani. Retinoblastomski gen – Rb so prvi~ opisali na za~etku 90. let in predstavlja prototip tumorskega supresorskega gena. Neaktivnost tega gena povzro~i nekontrolirano celi~no delitev (natan~neje prehod v S-fazo celi~nega cikla). p53 se imenuje tudi »varuh genoma« in ima verjetno najpomembnej{o funkcijo med vsemi tumorskimi supresorskimi geni. V nasprotju z Rb, ki so ga dokazali mutiranega ve~inoma pri retinoblastomu, je mutirani p53 povezan z nastankom vsaj polovice znanih malignih bolezni. Tudi vloga p53 je nekoliko druga~na od vloge Rb. Medtem ko predstavlja Rb predvsem kontrolni gen za celi~no delitev, je p53 nekak{na zasilna zavora, ki deluje tako na regulacijo celi~nega cikla kot tudi na aktivacijo apoptoze, kadar popravljalni mehanizmi niso uspe{no opravili svoje naloge (slika 3, slika 4). Poleg Rb in p53 velja omeniti vsaj {e BRCA1 in BRCA2 kot tumorska supresorska gena, povezana z dednim rakom dojke, ter APC in DCC pri karcinomih {irokega ~revesa. Telomere in telomeraza [tevilo celi~nih delitev je v ve~ini normalnih sesalskih celicah strogo omejeno in nadzorovano v sklopu procesov staranja celice. Gre za zapleteno in do danes ne povsem pojasnjeno dogajanje, ki vklju~uje razli~ne vrste genov – od genov, ki kodirajo razli~ne kinaze, inhibitorje kinaz do zgodnjih celi~nih genov, ki so soudele`eni v prenosu signalov v celici. Nesporno pri teh procesih je dejstvo, da se konci kromosomov ob pomno`evanju skraj{ujejo zaradi vezave replikacijskega kompleksa. Da se strukturni geni podvajajo v celoti, skrbijo ponavljajo~e se sekvence na koncih kromosomov, ki jih imenujemo telomere. Njihova ONKOLOGIJA / pregledi leto X / {t. 2 / december 2006 101 Slika 3. Protein p53 ima klju~no vlogo pri preverjanju napak na DNA in kontroli celi~nega cikla. Deluje tudi kot transkripcijski faktor za razli~ne gene. Po grobih ocenah naj bi uravnaval transkripcijo 200 do 400 razli~nih genov. Njegove biolo{ke aktivnosti obsegajo ustavitev celi~nega cikla na prehodu iz G1 v S in na prehodu iz faze G2 v fazo M, spro`enje apoptoze, uravnavanje celi~ne diferenciacije, celi~nega staranja, zaviranja angiogeneze, verjetno pa tudi druge, doslej {e neznane aktivnosti. Slika 4. Proteini Bcl-2 uravnavajo aktivacijo prokaspaz in s tem apoptozo. Sam Bcl-2 in Bcl-XL inhibirata apoptozo tako, da blokirata produkcijo citokroma c, potrebnega za vezavo na regulacijske proteine, ki aktivirajo prokaspaze. Drugi proteini iz skupine Bcl-2 spodbujajo apoptozo bodisi tako, da se ve`ejo na inhibitorne proteine (Bad), ali tako, da (Bax, Bak). 2_2006_prelom.qxd 11/30/2006 7:47 PM Page 101 spodbujajo produkcijo citokroma c in aktivacijo prokaspaz vloga je, da stabilizirajo kromosom in zagotovijo pravilen in popoln prepis DNA. V humanih celicah se sekvenca TTAGGG ponavlja na koncu kromosoma nekje med 1000- do 2000-krat. Za njihovo podalj{evanje je odgovoren encim telomeraza. Gen za telomerazo je v ve~ini normalnih diferenciranih celic uti{an, zato encim ne nastaja. Zaradi tega se po kriti~nem skraj{anju telomer podvojevanje DNA ustavi in celica odmre. Encim telomeraza pa nastaja v rakastih celicah, kjer zagotavlja obnavljanje telomer in posledi~no neskon~no {tevilo celi~nih delitev. Na kratko povzeto – telomere lahko pri nastanku rakaste celice igrajo dvojno vlogo. Po eni strani je njihovo kraj{anje ob delujo~ih mehanizmih za spremljanje kakovosti pomno`ene DNA odlo~ilno za prepre~evanje karcinogeneze, po drugi strani pa je kraj{anje telomer, ko nadzorni mehanizmi za kakovost celi~ne DNA niso aktivni, lahko vzrok za kromosomsko nestabilnost in karcinogenezo. Sklep Karcinogeneza je kompleksen proces, med katerim mora priti do radikalnih sprememb na celi~ni DNA. Pri tem je pomembno, da spremembe nastanejo tako na protoonkogenih kot tudi na tumorskih supresorskih genih. Vse nastale spremembe morajo biti ireverzibilne in se morajo kot take prenesti na naslednjo generacijo celic. Po iniciaciji karcinogenih sprememb {e ne govorimo o rakasti celici, kajti za to je potrebna {e faza promocije, ko se spremenjena celica deli in tako izra`a vse pridobljene nove lastnosti. Natan~nih mehanizmov in povezav o tem, kateri geni morajo biti spremenjeni za razvoj neke vrste raka, {e ne poznamo. Zato so novej{e raziskave usmerjene prav v odkrivanje pomembnih genskih povezav med nastankom raka kot tudi (ali celo predvsem) v to, katere so tiste celice, ki imajo mo`nost nadaljevanja in ponovitve klona v oddaljenih organih. Vsa ta dejstva so podlaga za razumevanje biologije raka ter u~inkovito zdravljenje in preventivo. Viri 1. DeVita TV, Hellman S, Rosenberg AS, editors. Principles and practice of Oncology 7th edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2005. 2. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P, editors. Molecular biology of the cell 4th edition. New York: Garland Science; 2002. 3. Rubin P, editor. Clinical Oncology. A Multidisciplinary Approach for Physicians and Students 7th edition. Philadelphia: W.B Saunders Company; 1993. 4. Karpinets TV, Foy BD. Tumorigenesis: the adaptation of mammalian cells to sustained stress environment by epigenetic alterations and succeeding matched mutations. Carcinogegenis 2005; 26: 1323–34. 5. Kisseljova NP, Kisseljov FL. DNA demethylation and carcinogenesis. Biochem 2005; 70: 743–52. ■ ONKOLOGIJA / pregledi leto X / {t. 2 / december 2006 102 2_2006_prelom.qxd 11/30/2006 7:47 PM Page 102