Lizosomske cisteinske proteinaze, njihovi endogeni zaviralci in rak
Lysosomal Cysteine Proteinases, Their Endogenous Inhibitors and Cancer
Primož Strojan*
Ključne besede
novotvorbe
prognoza
cisteinske proteinaze cisteinske proteinaze inhibitorji lizosomi
Izvleček. Lizosomske cisteinske proteinaze, imenovane tudi cisteinski katepsini, so ubikvitar-ni proteolitični encimi. Najpomembnejša skupina njihovih endogenih zaviralcev tvori naddružino cistatinov, ki jo sestavljajo tri družine: stefini, cistatini in kininogeni. Vpletenost cisteinskih katepsinov in cistatinov v proteolitične procese, ki vodijo v invazijo in zasevanje tumorskih celic, so potrdili rezultati številnih raziskav in vitro in in vivo. Na teh spoznanjih temelji predpostavka o njihovi možni vlogi kazalcev za napoved poteka bolezni in preživetja bolnikov z rakom. V prispevku so opisane biokemične lastnosti lizo-somskih cisteinskih proteinaz in njihovih endogenih zaviralcev, njihova vloga v celici ter pri rasti in zasevanju malignih tumorjev. Podan je podroben pregled kliničnih raziskav, ki obravnavajo napovedni pomen teh novih bioloških kazalcev pri bolnikih z rakom. Rezultati so spodbudni, še posebej v primeru karcinoma dojke, vendar zaenkrat še ne dopuščajo njihove uporabe v vsakodnevni klinični praksi skupaj z že uveljavljenimi napovednimi kazalci.
Key words
neoplasms
prognosis
cysteine proteinases cysteine proteinases inhibitors lysosomes
Abstract. Lysosomal cysteine proteinases, termed also cysteine cathepsins, are ubiquitous proteolytic enzymes. The most important group of their endogenous inhibitors belongs to the cystatin superfamily, which consists of three families: ste-fins, cystatins and kininogens. The involvement of cysteine cathepsins and cystatins in proteolytic processes, leading to invasion and dissemination of tumor cells, has been confirmed by the results of several in vitro and in vivo studies. These findings suggest that they play a role in the prognosis of the course of the disease and survival of cancer patients. The paper describes the biochemical properties of lysosomal cysteine proteinases and their endogenous inhibitors, as well as the role they play in the cell and in malignant tumor growth and dissemination. Cinical studies evaluating these new biological prognostic factors in cancer patients are reviewed. The results are encouraging, particularly for patients with breast cancer, but they are not yet conclusive enough to be applied in the daily clinical practice along with the already established prognostic factors.
Uvod
Vedenje malignih tumorjev značilno opredeljujeta zmožnost invazije tumorskih celic v okol-na tkiva in tvorba zasevkov na različnih mestih v telesu, oddaljenih od primarnega tumorja. Pri tem tumorske celice prehajajo skozi različne tkivne razdelke, ki sestavljajo organizem. Te med seboj ločujeta dve vrsti zunajceličnega matriksa, bazalne membrane in intersticijsko vezivno tkivo. Glavne sestavine teh struktur so različni proteini, predvsem kolagen, adhezivni glikoproteini in proteoglikani (1).
*Asist. dr. Primož Strojan, dr. med., Onkološki Inštitut, Zaloška 2, 1105 Ljubljana.
Razkroj zunajceličnega matriksa in prehajanje tumorskih celic skozenj sta posledica učinkovanja več vrst različnih proteolitičnih encimov. Tvorijo in izločajo jih tumorske in normalne celice v svojo okolico ali na površino citoplazemske membrane. Encime, ki sodelujejo v teh procesih, razvrščamo glede na kemično naravo skupin, odgovornih za katalitično aktivnost, v štiri razrede. Iste celice, ki tvorijo encime, izdelujejo tudi njihove zaviralce (tabela 1) (2).
Tabela 1. Razredi proteinaz, njihovi proteinski zaviralci in pH-obmo~je aktivnosti.
Razred	Predstavniki	pH-območje aktivnosti	Proteinski zaviralci
Serinske proteinaze	elastaza; dejavniki sistema komplementa (C1r, C1s, C3, C5, Fd); himaza; himotripsin; kalikrein; katepsin G; koagulacijski faktorji (VII, IX-XII, trombin); plazmin; tripsin; triptaza; uPA; tPA	7-9	a2-antiplazmin; a2-makroglobulin; PAI (I-IV)
Cisteinske ali tiolne proteinaze	papainske proteinaze (katepsini B, F, H, K,L, O/2, S, U, W); kalpaini; klostripaini; streptokokne cisteinske proteinaze; virusne cisteinske proteinaze; apopaini	3-8	cistatini; kininogeni; stefini; a2-makroglobulin
Aspartatne proteinaze	gastricin; himozin; katepsini (D, E); pepsin; renin	2-7	pepstatin
Metaloproteinaze	kolagenaze; motrilizin; stromelizini (1-3); želatinaze (A, B)	7-9	TIMP (I, II)
uPA, aktivator plazminogena urokinaznega tipa; tPA, aktivator plazminogena tkivnega tipa; PAI, zaviralec aktivatorja plazminogena; TIMP, tkivni zaviralec metaloproteinaz. aCisteinske proteinaze tvorijo naddružino, ki jo sestavlja šest družin.
Prisotnost zaviralcev je neobhodna za nadzorovano delovanje encimskih molekul. Dopolnjuje jo več drugih nadzornih mehanizmov, delujočih znotraj in/ali zunaj celice (slika 1). Le natančno uravnavanje encimske aktivnosti zagotavlja varnost tkivnih struktur pred nezaželeno proteolitično poškodbo (2).
Proteolitična kaskada
Delovanje posameznih encimov in njihovih zaviralcev je v normalnem tkivu povezano in usklajeno v proteolitični kaskadi. Ta sodeluje v številnih fizioloških in bolezenskih procesih: trofoblastnem vsajanju, morfogenezi zarodka, angiogenezi, celjenju ran, patološki invaziji bakterij in parazitov idr. (2). Njena aktivacija je zapleten proces, ki vključuje številne interakcije med encimsko neaktivnimi proencimi, aktivnimi proteinazami različnih razredov in njihovimi zaviralci (3).
V tumorskem tkivu je uravnavanje proteolitične kaskade pomanjkljivo ali napačno. Vzrok temu je modulacija enega ali več mehanizmov, ki uravnavajo sintezo, transport
transkripcija GEN -► mRNA
translacija	- proteoliza
aktivacija: - oksidacija
NEAKTIVEN ENCIM -► AKTIVEN ENCIM
Kontrola encimske aktivacije:
-	inhibitorji
-	glikozaminglikani
-	vezava na: celično membrano
zunajcelični matriks
-	pH
-	Ca++
-	sistem kaskadne aktivacije
Kontrola encimske aktivnosti:
-	postranslacijska modifikacija (fosforilacija glikozilacija)
-	vezikalna sekvestracija
-	vezava na celično membrano
-	tvorba proteinaznih kompleksov
-	vezava s proteoglikani
-	inhibitorji
pH
-	Ca++
-	ATP razgradnja
Slika 1. Mehanizmi, ki sodelujejo pri uravnavanju encimske aktivnosti.
in izločanje v njej sodelujočih encimov in zaviralcev. To vodi do sprememb v njihovi celični porazdelitvi in/ali koncentraciji oz. aktivnosti in do vzpostavitve novih, neobičajnih razmerij med njimi (3).
Ključno vlogo v verigi proteolitičnih dogajanj, ki vodijo v invazijo in zasevanje tumorskih celic, ima serinska proteinaza aktivator plazminogena urokinaznega tipa (uPA). Ta pretvarja proencim plazminogen v fibrinolitični peptid plazmin, ki je zmožen razgradnje večine zunajceličnih proteinov, bodisi neposredno ali posredno preko aktivacije drugih protei-naz (slika 2) (4). Aktivacija neaktivnega prekurzorja uPA v encimsko aktivni uPA je posledica proteolitičnega delovanja lizosomskih cisteinskih proteinaz katepsinov B in L (5, 6). Za aktivacijo obeh katepsinov je v prvi vrsti odgovorna aspartatna proteinaza katepsin D (7),
pro-KATEPSIN D
avtoaktivacija
pro-KATEP-SINA B, L
KATEPSIN D
ir
> KATEPSINA B, L <
avtoaktivacija
pro-uPA
IV
CISTATIN C STEFINA A, B
->uPA <
PAI (tip I-IV)
PLAZMINOGEN
PLAZMIN
pro-KOLAGENAZE
a2 - MAKROGLOBULIN ANTIPLAZMIN
-> KOLAGENAZE <■■
TIMP (tip I, II)
Slika 2. Proteolitična kaskada: aktivacija in uravnavanje. uPA — aktivator plazminogena urokinaznega tipa, PAI — inhibitor aktivatorja plazminogena, TIMP — tkivni inhibitor metaloproteinaz.
ki ji zaradi njene sposobnosti avtoaktivacije v kislem okolju nizkega pH pripisujejo vlogo sprožilca proteolitične kaskade (8). Aktivacija prooblik katepsinov B in L naj bi bila tudi rezultat njunega avtokatalitičnega procesiranja (9, 10). Oba katepsina, B in L, sta zmožna neposredne razgradnje proteinskih gradnikov zunajceličnega matriksa (11, 12).
Lizosomske cisteinske proteinaze
Lizosomske cisteinske proteinaze, imenovane tudi cisteinski katepsini (ime izhaja iz grškega izraza kathepsin, ki pomeni »razgraditi«), uvrščamo v družino papainskih proteinaz. Mednje prištevamo katepsine B, H, L in S ter v zadnjem času odkrite katepsine K, O/2, F, W in U (13). Kot ubikvitarni lizosomski encimi se nahajajo v vseh celicah organizma sesalcev, vendar se njihova koncentracija med posameznimi vrstami celic in tkiv razlikuje: najvišja je v makrofagih oz. v organih, kot so ledvice, vranica in jetra. Vsi imajo na aktivnem mestu kot esencielno katalitično skupino umeščen cistein. Po svoji kemični sestavi so glikoproteini, ki jih z redkimi izjemami razvrščamo v skupino endopeptidaz (14). Sodelujejo v številnih fizioloških procesih:
•	pri znotrajceličnem proteinskem obratu;
•	pri posttranslacijskem preoblikovanju nekaterih biološko pomembnih proteinskih pre-kurzorjev (npr. inzulina in endorfina) in
•	pri nastanku različnih bolezenskih stanj: mišične distrofije, artritisa, emfizema, multiple skleroze in raka (14).
Katepsini se sintetizirajo kot proteinski prekurzorji z Mr 30-50 kDa. Po končani glikozi-laciji in fosforilaciji v Golgijevem aparatu se s posredovanjem receptorjev za manoza-6-fosfatne ostanke na njihovih molekulah transportirajo v endosomske vezikle (15). V kislem pH-okolju znotraj lizosomov se poleg katepsinov nahaja še vrsta drugih hidrolitičnih encimov. Kakovostni in količinski odnosi med ujetimi encimi opredeljujejo proteolitični potencial lizosomskih veziklov (15) in pogojujejo tako razlike med lizosomi celic različnih tkiv kot tudi celic iste vrste, nahajajočih se v različnih okoljih (16).
Med najbolj preučevane lizosomske cisteinske proteinaze pri raku sodijo katepsini B, H in L. Mesto nahajanja gena za katepsin B pri človeku je na kromosomu 8 in za katep-sin L na kromosomu 9, medtem ko to za katepsin H ni poznano (3, 17). Zrele oblike katepsinov B, H, in L se v celici nahajajo v obliki eno- in/ali dvoverižnih molekul z maso, ki znaša do nekaj deset kDa, odvisno od vrste organizma oziroma tkiva (3, 14). Učinkujejo v kislem okolju s pH 6,0; v območju nevtralne ali alkalnih vrednosti pH so slabo aktivni ali neaktivni, odvisno od narave substrata in stopnje zrelosti encima (14). Delujejo na številne proteinske substrate, tudi na sestavine zunajceličnega matriksa (11, 12, 18). Katepsina B in L sta zmožna aktivacije prekurzorske oblike uPA (12, 13) in prekur-zorjev nekaterih kolagenaz (19). Za svojo aktivacijo potrebujejo tiolne reagente in kelatorje (14). Aktivirajo jih tudi pepsin (14), katepsin D (7, 18) in metaloproteinaze (20) ali pa je njihova aktivacija posledica avtokatalitične aktivnosti (9, 10, 18). Nepovratno jih inhibirajo tiol vezujoči reagenti, povratno pa leupeptin in drugi peptidni aldehidi, makro-globulin a2 ter člani naddružine cistatinov, to so stefini, cistatini in kininogeni. Izjema je
katepsin H: v nasprotju s katepsinoma B in L nanj leupeptin nima učinka ali pa je le-ta omejen. Od ostalih katepsinov ga loči tudi velika afiniteta do konkanavalina A, temperaturna stabilnost in zmožnost delovanja bodisi kot endo- ali aminopeptidaza (14). Katepsin L učinkuje na proteinske substrate do 10-krat hitreje od ostalih katepsinov in velja za najučinkovitejšo izmed lizosomskih proteinaz (14). Homolognost aminokislin-skih zaporedij nakazuje skupno evolucijsko poreklo vseh treh katepsinov oz. članov razreda cisteinskih proteinaz (5, 17).
Vpletenost katepsinov B, H, in L v proteolitične procese, ki vodijo v invazijo in zaseva-nje tumorskih celic, so potrdile številne raziskave in vitro in in vivo. Primerjave s celicami normalnih tkiv so v celicah živalskih in človeških tumorjev pokazale:
•	povišano ekspresijo mRNA za posamezne katepsine;
•	razlike v transportu in zorenju katepsinskih molekul in
•	spremenjeno (običajno povišano) koncentracijo in/ali aktivnost katepsinskih molekul (3, 8, 11, 12).
Posledici teh razlik naj bi bili povečana proteolitična zmožnost in spremenjena celična razporeditev katepsinov. V nasprotju z normalnimi celicami, kjer se molekule katepsinov nahajajo prvenstveno v lizosomih, najdemo v tumorju velik delež encimskih molekul na citoplazemski membrani (21,22) in/ali v proobliki v njeni neposredni bližini, zunaj celice (18, 23). Tu so stabilne tudi v aktivni obliki, zahvaljujoč okolju z rahlo alkalnim pH in prisotnosti velikih proteinskih substratov, kot so proteini zunajceličnega matriksa (18,24,25).
Endogeni lizosomski zaviralci cisteinskih proteinaz
Najpomembnejša skupina endogenih zaviralcev lizosomskih cisteinskih proteinaz pripada superdružini cistatinov, ki jo sestavljajo tri družine: stefini, cistatini in kininogeni. Člani teh družin se med seboj razlikujejo po afiniteti in razmerju vezave na molekule katepsinov, ki je pri vseh čvrsta, a reverzibilna in kompetitivna. Trem družinam je bila v zadnjem času priključena še četrta, družina nezaviralnih proteinov, ki vključuje s histidinom bogate glikoproteine in glikoproteine a2HS (tabela 2) (3, 26).
Tabela 2. Zaviralci lizosomskih cisteinskih proteinaz iz superdružine cistatinov pri človeku.
Družina
Predstavniki
Nahajanje
Mr (kDa)
Stefini
Cistatini
Kininogeni
stefina A in B
cistatin C
HMW-kininogen LMW-kininogen
v celici zunaj celice zunaj celice
11 13
88-114 50-68
HMW, vlsokomolekularnl (high molecular weight); LMW, nizkomolekularni (low molecular weight).
V	nasprotju s kininogeni in cistatini, ki so v prvi vrsti zunajcelični zaviralci, najdemo ste-fine predvsem znotraj celic (3,26). Ker so člani naddružine cistatinov vpleteni v mehanizme, odgovorne za nadzor znotraj- in zunajceličnega beljakovinskega razkroja, jim pripisujejo vlogo vsestranskih zaščitnikov celic, tj. pred nezaželeno endo- in eksogeno proteolizo (25).
Poleg navedenih prištevamo k endogenim zaviralcem lizosomskih cisteinskih proteinaz še druge, strukturno bolj oddaljene člane superdružine cistatinov: p21 (produkt onkoge-na c-Ha-ras) (27), p41 (fragment invariantne verige glavnega histokompatibilnostnega kompleksa) in ekvinatoksin (zaviralec, ki ga najdemo v morski veternici) (13). Pomemben zunajcelični zaviralec endopeptidaz vseh štirih razredov je tudi makroglobulin a2 (28).
Stefini
V	družino stefinov uvrščamo pri človeku stefina A in B, pri glodalcih pa njuna analoga, stefin a in stefin p (29). Gena za stefina A in B se nahajata na kromosomu 3q (17,30) in ne vključujeta sekretornih signalnih zaporedij (31). Stefina A in B sta enoverižni negli-kozilirani beljakovini z Mr okoli 11 kDa (26). Stabilna sta v okolju z nevtralnim ali alkalnim pH. Obe sta toplotno stabilni in strukturno precej podobni druga drugi (51 % njune strukture je identične), razlikujeta pa se po svojih imunoloških značilnostih (26, 32). Stefin A se nahaja v visokih koncentracijah predvsem v epitelu in nekaterih celicah limfatič-nega tkiva, kjer naj bi sodeloval v obrambi pred invadirajočimi bakterijami in paraziti oziroma njihovimi (tj. zunanjimi) cisteinskimi proteinazami (29, 33, 34). Nasprotno pa je stefin B med različnimi tkivi razporejen sorazmerno enakomerno, zaradi česar mu pripisujejo vlogo zaščitnika celic pred nenadzorovano aktivnostjo endogenih cisteinskih proteinaz (26, 29, 35). Stefin A zavira delovanje katepsina B mnogo močneje kot stefin B in je hkrati bolj odporen na delovanje katepsina D. Oba stefina učinkoviteje inhibirata delovanje katep-sinov L in H kot katepsina B (26, 36).
Rezultati imunohistokemičnih študij kažejo, da je v tumorskem tkivu mesto nahajanja molekul stefinov spremenjeno. Prisotnost stefinov ugotavljajo tako na površini celic kot tudi v njihovi neposredni okolici, skupaj z molekulami encimov, kar naj bi služilo učinkovitemu nadzoru fokalne proteolize. Pri tem je bila v tkivu različnih vrst tumorjev izmerjena tako znižana kot tudi zvišana ali celo nespremenjena aktivnost oziroma koncentracija zaviralcev kot v okolnem, zdravem tkivu (3). Poleg tega naj bi endogeni zaviralci, po poreklu iz tumorjev, posedovali drugačne zaviralne lastnosti kot tisti iz normalnih tkiv (37). Glede na rezultate opravljenih raziskav se zdi, da je z invazijo in zasevanjem tumorskih celic izmed vseh članov superdružine cistatinov najtesneje povezan stefin A (3).
Cistatini
Cistatini so neglikozilirani enoverižni bazični proteini z Mr 13 kDa. Značilno jih opredeljuje prisotnost dveh disulfidnih vezi, nameščenih na C-koncu molekul. Sekvenčna homolognost med cistatini in stefini znaša kar 30% (26). Družina cistatinov vključuje cista-tina C in S z različicami ter cistatin D; najbolj preučevani zaviralec pri človeku je cistatin C. Gen, ki ga kodira, se nahaja na kromosomu 20 in vključuje signalno zaporedje, ki daje novonastalemu peptidu lastnosti sekretorne molekule (38). V visokih
koncentracijah se nahaja v različnih tkivih in telesnih tekočinah, še posebej v semenski tekočini, cerebrospinalni tekočini in sinovialni tekočini (38). Cistatin C je eden izmed najučinkovitejših zaviralcev lizosomskih cisteinskih proteinaz in njihov fiziološko najpomembnejši zaviralec v zunajceličnem prostoru (26). Spremenjene koncentracije cistatina C so bile izmerjene pri različnih bolezenskih stanjih, zlasti avtoimune narave (39). Serumska koncentracija cistatina C naj bi bila celo bolj občutljiv kazalec zgodnje ledvične okvare kot serumska koncentracija kreatinina in ponekod že izpodriva klasične metode za opredelitev ledvične funkcije (40).
Kininogeni
Kininogeni so enoverižni visokomolekularni plazemski glikoproteini (26). Poznani so trije tipi kininogenov: visokomolekularni ali HMW-kininogen (Mr88-114kDa), nizkomolekularni ali LMW-kininogen (Mr50-68kDa) in podganji T-kininogen (Mr68kDa) (41). Humana HMW-in LMW-kininogena sta produkta istega gena, ki se nahaja na kromosomu 3q (17). Serin-ska proteinaza kalikrein pretvarja zrelo enoverižno molekulo v dvoverižno, z lahko in težko verigo, pri čemer se sprošča kinin. Težki verigi obeh kininogenov sta identični, medtem ko je lahka veriga HMW-kininogena znatno večja kot pri LMW-kininogenu. Obe verigi sta med seboj povezani z disulfidno vezjo. Tako HMW- kot LMW-kininogen sta prisotna v mono-in oligomerni obliki. Zaviralna aktivnost kininogenov je stabilna v območju nevtralne in bazičnih pH vrednosti ter labilna pri pH, nižjem od 4,0 (26, 41). Kininogeni so učinkoviti zunajcelični zaviralci katepsina L ter šibkejši zaviralci katepsina H in še posebej katep-sina B (42). Že dolgo so poznani kot prekursorji vazoaktivnih kininov; aktivno sodelujejo tudi v kaskadni reakciji strjevanja krvi in vnetni reakciji (41).
Klinični pomen lizosomskih cisteinskih proteinaz in njihovih endogenih zaviralcev
V nasprotju z vlogo cisteinskih katepsinov in cistatinov na molekularni in celični ravni je njihov klinični pomen kot kazalcev za napoved preživetja bolnikov z rakom manj dog-nan. Izvedena je bila vrsta kliničnih raziskav, v katerih so poskušali ovrednotiti njihovo napovedno vlogo (tabela 3). Kljub spodbudnim obetom se do sedaj še nobeden izmed katepsinov ali njihovih zaviralcev ni izkazal za prognostično tako zanesljivega, da bi lahko odločilno vplival na izbor vrste in/ali stopnje agresivnosti zdravljenja, in to pri nobeni vrsti raka.
Karcinom dojke
Prva klinična raziskava, ki je poskusila ovrednotiti napovedni pomen lizosomskih cisteinskih proteinaz in njihovih endogenih zaviralcev pri raku, je bila izvedena v Ljubljani leta 1992. Lahova in sodelavci so pomerili aktivnost katepsinov B in L ter celokupno aktivnost njihovih zaviralcev v tumorskem tkivu 50 bolnic s karcinomom dojke. Z dolžino preživetja bolnic je statistično značilno (obratno) korelirala le aktivnost katepsina L in ne tudi katepsina B ali zaviralcev (43). Ista skupina avtorjev je v drugi, podobni študiji kot najbolj zanesljivega znanilca krajšega preživetja bolnic spoznala tri- in večkratno
Tabela 3. Napovedni pomen lizosomskih cisteinskih proteinaz in njihovih endogenih zaviralcev pri raku.
Vrsta raka	Avtor (Ref.)	Vzorec	število	Encim/	Analiza	Napovedna
			bolnikov	zaviralec		vrednost
Karcinom dojke	Lah in sod, 1992 (43)	tkivo	45	KB, KL, ICP	EA	t KL
	Budihna in sod, 1995 (48)	tkivo	62	KB	ELISA	i KB
	Thomssen in sod, 1995 (45)	tkivo	167	KB, KL	ELISA	t KB, t KL
	Lah in sod, 1997(44)	tkivo	60	KB, KL, SA	ELISA	t KB, i SA
		tkivo	60	KB, KL	IHK	t KB
	Foekens in sod, 1998 (47)	tkivo	1500	KB, KL	ELISA	t KB, tKL
	Kuopio in sod, 1998(49)	tkivo	384	SA	IHK	t SA
	Thomssen in sod, 1998(46)	tkivo	103	KL	ELISA	t KL
Krcinom pljuč	Ebert in sod, 1994(50)	tkivo	65	KB	EA	t KB
	Inoue in sod, 1994(54)	tkivo	142	KB	IHK	t KB
	Knoch in sod, 1994(51)	tkivo	69	KB, ICP	EA	t KB, i ICP
	Sukoh in sod, 1994(55)	tkivo	108	KB	IHK	t KB
	Ebert in sod, 1997(56)	tkivo	51	ICP	EA	i ICP
		tkivo	50	SA, SB, CC	ELISA	i SB
	Werle in sod, 1997(52)	tkivo	33	KB	EA	t KB
	Werle in sod, 1997(53)	tkivo	55	KB, KL	EA	
		tkivo	28	KB, KL	ELISA	t KL
Karcinomi glave in	Russo in sod, 1995(60)	tkivo	68	KB, KL	EA	t KB
vratu	Budihna in sod, 1996(57)	tkivo	41	KB, KH, KL, SA, SB	ELISA	t KL, i SA, i SB
	Šmid in sod, 1997 (58)	tkivo	22	KB, SA, SB	ELISA	i SA, i SB
	Strojan, 1998 (59)	tkivo	49	KB, KL, SA, SB, CC	ELISA	i SA, i SB, i CC
Karcinom debelega	Campo in sod, 1994(61)	tkivo	69	KB	IHK	t KB
črevesa in danke	Kos in sod, 1998(62)	serum	325	KB	ELISA	t KB
Karcinom želodca	Plebani in sod, 1995(63)	tkivo	25	KB, KL	ELISA	t KB
Maligni melanom	Kos in sod, 1997(64)	serum	43	KB, KH, KL, SA, CC	ELISA	t KB, t KH
Tumorji CŽS	Strojnik in sod, 1999(65)	tkivo	100	KB, SA	IHK	t KB
CŽS, centralni živčni sistem; KB, katepsin B; KH, katepsin H; KL, katepsin L; SA, stefin A; SB, stefin B; CC, cistatin C; ICP CP, zaviralci cisteinskih proteinaz; EA, encimska aktivnost; ELISA, encimsko-imunski test; IHK, imunohistokemija; T, soodvisnost med visoko aktivnostjo/koncentracijo encima oz. zaviralca in slabšim preživetjem bolnikov; i, soodvisnost med nizko aktivnostjo/koncentracijo encima oz. zaviralca in slabšim preživetjem bolnikov.
znižanje tumorske koncentracije stefina A glede na vrednost, izmerjeno v okolnem, zdravem tkivu dojke. Temu sta sledili povišana aktivnost in povišana koncentracija katepsina B ter - statistično mejno značilno - tudi katepsina L (44). Obratno soodvisnost med dolžino preživetja in tkivno koncentracijo katepsina L so zabeležili Thomssen in sodelavci. V raziskavi, ki je zajela 167 bolnic, se je napovedna moč katepsina L izkazala za primerljivo napovedni moči stanja pazdušnih bezgavk in stopnje diferenciacije tumorskih celic, ki spadata med najpomembnejše napovedne kazalce pri tej vrsti raka (45). Isti avtorji so nedavno poročali, da katepsin L v kombinaciji z zaviralcem aktivatorja plazminogena
tipa 1 omogoča v skupini bolnic z neprizadetimi pazdušnimi bezgavkami zanesljivo razpoznavo posameznic z izjemno dobrimi izgledi za preživtje. Te naj ne bi potrebovale sistemskega adjuvantnega zdravljenja (46). Tudi doslej najobsežnejša raziskava napo-vedne vloge katepsinov nasploh, v katero je bilo vključeno kar 1500 bolnic s karcinomom dojke, potrjuje, da sta povišani tkivni koncentraciji katepsinov B in L zanesljiva znanilca krajšega preživetja bolnic. Kombiniranje obeh njuno napovedno moč še dodatno okrepi (47). Nasprotno pa so Budihna in sodelavci krajše preživetje zabeležili v skupini bolnic z nizko tkivno koncentracijo katepsina B. To je zaenkrat edina raziskava, ki zvišano koncentracijo katepsinov vtumorskem tkivu povezuje z boljšimi izgledi za preživetje (48). Na možen napovedni pomen cistatinov pri karcinomu dojke kaže poleg že omenjene raziskave Lahove in sodelavcev (44) tudi nedavno objavljena študija Kuopioa in sodelavcev. V njej so avtorji imunohistokemično določali stopnjo ekspresije stefina A v parafinskih vzorcih tumorjev 440 bolnic. Bolnice s stefin A-negativnimi tumorji so živele statistično pomembno dlje kot bolnice s stefin A-pozitivnimi tumorji (49).
Karcinom pljuč
Prvo poročilo o možni napovedni vlogi cisteinskih katepsinov pri karcinomu pljuč je bila raziskava Eberta in sodelavcev leta 1994, ki je zajela 65 bolnikov. Krajše preživetje so avtorji zabeležili v skupini z aktivnostjo katepsina B v tumorskem tkivu iznad izbrane razmejitvene vrednosti (50). Tej podobna je raziskava Knocha in sodelavcev, v kateri so poleg aktivnosti katepsina B kot prognostično pomembno spoznali tudi razmerje aktivnosti med katepsinom B in zaviralci cisteinskih proteinaz (51). O obratni soodvisnosti med dolžino preživetja in aktivnostjo katepsina B so poročali tudi Werle in sodelavci, vendar le pri histološki podvrsti ploščatoceličnega karcinoma in deležu katepsina B, aktivnemu pri pH 7,5 (52). Nasprotno pa rezultati druge podobne raziskave iste skupine avtorjev iz istega časovnega obdobja zanikajo napovedno vredost tako aktivnosti kot koncentracije katepsina B (53). Pomembna pomanjkljivost obeh omenjenih raziskav je majhno število vanje vključenih bolnikov, tj. 33 oziroma 28 (52, 53). Istosmiselni so tudi rezultati obeh do sedaj objavljenih imunohistokemičnih študij. V obeh je bilo krajše preživetje bolnikov povezano s povišano ekspresijo katepsina B; v vsako je bilo vključenih več kot 100 bolnikov (54, 55). Možni napovedni pomen zaviralcev cisteinskih proteinaz so preučevali Ebert in sodelavci. Pomembni za napoved preživetja bolnikov sta se izkazali le tkivna koncentracija stefina B in celokupna aktivnost zaviralcev vtumorskem tkivu; obe sta pozitivno korelirali z dolžino preživetja (56).
Karcinomi glave in vratu
Na Onkološkem inštitutu in Univerzitetni kliniki za otorinolaringologijo in cervikofacialno kirurgijo v Ljubljani smo leta 1992 zastavili obsežno raziskavo z namenom oceniti možno napovedno vrednost tkivnih koncentracij katepsinov B, H in L ter zaviralcev stefinov A in B ter cistatina C pri bolnikih s karcinomi glave in vratu. Raziskava je potekala v dveh delih: v prvem (obdobje med 1992-1993, skupina 1) je bilo vanjo vključenih 45 bolnikov (opazovanih 41 bolnikov) in v drugem (obdobje med 1995-1996, skupina 2) 60 bolnikov
(opazovanih 49 bolnikov). Po srednji dobi opazovanja dveh let smo v skupini 1 statistično značilno boljše preživetje zabeležili pri bolnikih s tumorsko koncentracijo stefinov A in B, ki je bila višja od izbrane razmejitvene koncentracije, oziroma pri bolnikih z nižjo koncentracijo katepsina L od izbrane razmejitvene koncentracije (57). Te rezultate, izjema je katepsin L, so potrdili tudi rezultati analize, ki je zajela podskupino 22 bolnikov s kar-cinomom grla (58), in rezultati analize preživetja v skupini 2 (59). Našim opažanjem nasprotujejo rezultati italijanske raziskave, v kateri so avtorji določali aktivnost katepsinov B in L v tumorskem tkivu 68 bolnikov s karcinomom grla. V tej skupini bolnikov je bilo z boljšimi izgledi za preživetje povezano le razmerje aktivnosti katepsina B med tumorskim in normalnim tkivom iznad ena, ne pa tudi katepsina L (60).
Drugi raki
Pri drugih vrstah raka napovedni pomen lizosomskih cisteinskih proteinaz in njihovih endogenih zaviralcev še ni bil preučevan ali pa je bil preučevan v manjšem obsegu.
Campo in sodelavci so v skupini 69 bolnikov s karcinomom debelega črevesa in danke zabeležili obratno soodvisnost med imunohistokemično določeno stopnjo ekspresije katepsina B in dolžino preživetja (61). Podobno ugotavljajo Kos in sodelavci, ki so merili serumsko koncentracijo katepsina B pri 325 bolnikih z isto vrsto raka (62), in Plebani in sodelavci pri bolnikih s karcinomom želodca. Slednji so določali tudi tkivno koncentracijo katepsina L, ki pa ni korelirala s preživetjem. Pomembna pomanjkljivost te raziskave je majhno število vanjo vključenih bolnikov, samo 25 (63).
V Ljubljani so bile napravljene tudi prve raziskave pri bolnikih z melanomom (64) in tumorji centralnega živčnega sistema (65). Daljše preživetje 43 bolnikov s sistemsko razširjeno obliko kožnega melanoma je bilo povezano z nizko serumsko koncentracijo katepsinov B in H, tj. nižjo od izbrane razmejitvene koncentracije. Serumske koncentracije katepsina L, stefina A in cistatina C se niso izkazale kot prognostično pomembne (64). Podobno so bolniki s katepsin B-pozitivnimi tumorji centralnega živčnega sistema živeli statistično značilno dlje kot bolniki s katepsin B-negativnimi tumorji. Tudi v tej raziskavi stopnja ekspresije stefina A ni korelirala s preživetjem bolnikov (65).
Zaključek
Vpletenost lizosomskih cisteinskih proteinaz in njihovih endogenih zaviralcev v procese, ki prispevajo k invazivni rasti in zasevanju malignih tumorjev, potrjujejo rezultati številnih raziskavah in vitro in in vivo. Ugotovljena je bila tudi povezanost med vsebnostjo posameznih encimov in zaviralcev v tumorskem tkivu in/ali serumu in preživetjem bolnikov z različnimi vrstami raka. Rezultati so spodbudni, še posebej v primeru karcinoma dojke, vendar zaenkrat še ne dovoljujejo uporabe teh novih bioloških kazalcev v vsakodnevni klinični praksi. V bodoče bo treba v raziskave vključiti večje število bolnikov in standardizirati postopke za določanje vsebnosti posameznih encimov oz. zaviralcev v bioloških vzorcih. Le tako bodo rezultati tudi verodostojni in primerljivi.
Literatura
1.	Liotta LA, Stetler-Stevenson WG. Tumor invasion and metastasis: an imbalance of positive and negative regulation. Cancer Res 1991; 51: 5054-9.
2.	Twining SS. Regulation of proteolytic activity in tissues. Crit Rev BiochemMolec Biol 1994; 29: 315-85.
3.	Sloane BF, Moin K, Lah TT. Regulation of lysosomal endopeptidases in malignant neoplasia. In: Pret-low TG, Pretlow TP, editors. Biochemical and molecular aspects of selected cancers. Vol 2. New York: Academic Press; 1994. p. 411-72.
4.	Andreasen PA, Kjoller L, Christensen L, Duffy MJ. The urokinase-type plasminogen activator system in cancer metastasis: a review. Int J Cancer 1997; 72: 1-22.
5.	Kobayashi H, Schmitt M, Goretzki L, Chucholowski N, Calvete J, Kramer M, et al. Cathepsin B efficiently activates the soluble and the tumor cell receptor-bound form of the proenzyme urokinase-type plasminogen activator (pro-uPA). J Biol Chem 1991; 266: 5147-52.
6.	Goretzki L, Schmitt M, Mann K, Calvete J, Chucholowski N, Kramer M, et al. Effective activation of the proenzyme form of the urokinase-type plasminogen activator (pro-uPA) by the cysteine protease cat-hepsin L. FEBS Lett 1992; 297: 112-8.
7.	Nishimura Y, Kawabata T, Kato K. Identification of latent procathepsin B and L in microsomal lumen: characterization of enzymatic activation and proteolytic processing in vitro. Arch Biochem Biophys 1988; 261: 64-71.
8.	Rochefort H, Liaudet E, Garcia M. Alteration and role of human cathepsin D in cancer methastasis. Enzyme Protein 1996; 49: 106-16.
9.	Rowan AD, Mason P, Mach L, Mort JS. Rat procathepsin B. Proteolytic processing to the mature form in vitro. J Biol Chem 1992; 267: 15993-9.
10.	Menard R, Carmona E, Takebe S, Dufour E, Plouffe C, Mason P, et al. Autocatalytic processing of recombinant human procathepsin L. Contribution of both intermolecular and unimolecular events in the processing of procathepsin L in vitro. J Biol Chem 1998; 273: 4478-84.
11.	Chauhan SS, Goldstein LJ, Gottesman MM. Expression of cathepsin L in human tumors. Cancer Res 1991; 51: 1478-81.
12.	Berquin IM, Sloane BF. Cathepsin B expression in human tumors. Adv Exp Med Biol 1996; 389: 281-94.
13.	Turk B, Turk V, Turk D. Structural and functional aspects of papaine-like cysteine proteinases and their protein inhibitors. Biol Chem 1997; 378: 141-50.
14.	Agarwal SK. Proteases cathepsins - a view. Biochem Educ 1990; 18: 67-72.
15.	Erickson AH. Biosynthesis of lysosomal endopeptidases. J Cell Biochem 1989; 40: 31-41.
16.	Heuser J. Changes in lysosomal shape and distribution correlated with changes in cytoplasmatic pH. J Cell Biol 1989; 108: 855-64.
17.	Fong D, Man-Ying Chan M, Hsieh WT. Gene mapping of human cathepsins and cystatins. Biomed Bioc-him Acta 1991; 50: 595-8.
18.	Tsushima H, Ueki A, Matsuoka Y, Mihara H, Hopsu-Havu VK. Characterization of a cathepsin-H-like enzyme from a human melanoma cell line. Int J Cancer 1991; 48: 726-32.
19.	Eeckhout Y, Vaes G. Further studies on the activation of procollagenase, the latent prcursor of bone collagenase. Effects of lysosomal cathepsin B, plasmin and kallikrein and spontaneous activation. Biochem J 1977; 36: 1555-63.
20.	Hara K, Kominami E, Katunuma N. Effect of proteinase inhibitors on intracellular processing of cat-hepsin B, H and L in rat macrophages. FEBS Lett 1988; 231: 229-31.
21.	Sloane BF, Rozhin J, Johnson K, Taylor H, Crissman JD, Honn KV. Cathepsin B: association with plasma membrane in metastatic tumors. Proc Natl Acad Sci USA 1986; 83: 2483-7.
22.	Rozhin J, Wade RL, Honn KV, Sloane BF. Membrane-associated cathepsin L: a role in metastasis of melanomas. Biochem Biophys Res Commun 1989; 164: 556-61.
23.	Yamaguchi N, min Chung S, Shiroeda O, Koyama K, Imanishi J. Characterization of cathepsin L-like enzyme secreted from human pancreatic cancer cell line HPC-YP. Cancer Res 1990; 50: 658-63.
24.	Mort JS, Recklies AD. Interrelationship of active and latent secreted human cathepsin B precursor. Bioc-hem J 1986; 233: 57-63.
25.	Mason RW, Gal S, Gottesman MM. The identification of the major excreted protein (MEP) from a transformed mouse fibroblast cell line as a catalytically active precursor form of cathepsin L. Biochem J1987; 248: 449-54.
26.	Turk V, Bode W. The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases. FEBSLett 1991; 285: 213-9.
27.	Hiwasa T, Yokoyama S, Ha JM, Noguchi S, Sakiyama S. c-Ha-ras gene products are potent inhibitors of cathepsin B and L. FEBS Lett 1987; 311: 23-36.
28.	Starkey PM, Fletcher TC, Barrett AJ. Evolution of a2-macroglobulin. Purification and characterisation of protein homologous with human a2-macroglobulin from plaice (Pleuromides platessa) plasma. Biochem J1982; 205: 97-104.
29.	Jarvinen M, Rinne A, Hopsu-Havu VK. Human cystatins in normal and diseased tissues - a review. Acta Histochem 1987; 82: 5-18.
30.	Hsieh W, Fong D, Sloane BF, Golembieski W, Smith DI. Mapping of the gene for human cysteine proteinase inhibitor stefin A, stfl, to chromosome 3cen-q21. Genomics 1991; 9: 207-9.
31.	Kartasova T, Cornelissen BJC, Belt P, van de Putte P. Effects of UV, 4-NQQ and TPA on gene expression in cultured human epidermal keratinocytes. Nucleic Acids Res 1987; 15: 5945-62.
32.	Bobek LA, Levine MJ. Cystatins - inhibitors of cysteine proteinases. Crit Rev Oral Biol Med 1992; 3: 307-32.
33.	Hopsu-Havu VK, Joronen I, Rinne A, Jarvinen M. Production of acid and neutral cysteine-proteinase inhibitors by cultured human skin epithelium cell lines. Arch Dermatol Res 1985; 277: 452-6.
34.	Alavaikko M, Rinne A, Jarvinen M, Jokinen K, Hopsu-Havu VK. Acid cysteine-proteinase inhibitor, a new characteristic of reticulum cells of human lymphoid secondary follicles. Acta Histochem 1985; 77: 1-6.
35.	Kominami E, Bando Y, Wakamatsu N, Katunuma N. Different tissue distribution of two types of thiol proteinase inhibitors from rat liver epidermis. J Biochem (Tokyo) 1984; 96: 1437-42.
36.	Lenaricic B, Dolenc I, Križaj I, Lucovnik P, Turk V. Characterization of human stefin A and B: the low M cysteine proteinase inhibitors. In: Katunuma N, Kominami E, editors. Intracellular proteolysis: mechanism and regulation. Tokyo: Jpn Sci Soc Press; 1989. p. 328-37.
37.	Lah TT, Clifford JL, Helmer KM, Day NA, Moin K, Honn KV, et al. Inhibitory properties of low molecular mass cysteine proteinase inhibitors from human sarcoma. Biochem Biophys Acta 1989; 993:63-73.
38.	Abrahamson M, Olafsson I, Palsdottir A, Ulvsback M, Lundwall A, Jensson O, et al. Structure and expression of the human cystatin C gene. Biochem J1990; 268: 287-94.
39.	Brzin J, Popovic T, Turk V, Borchart U, Machleidt W. Human cystatin, a new protein inhibitor of cysteine proteinases. Biochem Biophys Res Commun 1984; 118: 103-9.
40.	Newman DJ, Thakkar H, Edwards RG, Wilkie M, White T, Grubb AO, et al. Serum cystatin C measured by automated immunoassay: a more sensitive marker of changes in GFR than serum creatinine. Kidney Int 1995; 47: 312-18.
41.	Muller-Esterl W. Kininogens, kinins and kinship. Thrombosis Haemostasis 1989; 61: 2-6.
42.	Muller-Esterl W, Fritz H, Machleidt W, Ritonja A, Brzin J, Kotnik M. et al. Human palsma kininogens are identical with alpha-cysteine proteinase inhibitors. Evidence from immunological, enzymological and sequence data. FEBS Lett 1985; 182: 310-4.
43.	Lah TT, Kokalj-Kunovar M, Štrukelj B, Pungercar J, Barlic-Magajna D, Drobnic-Košorok M, et al. Ste-fins and lysosomal cathepsins B, L and D in human breast carcinoma. Int J Cancer 1992; 50: 36-44.
44.	Lah TT, Kos J, Blejec A, Frkovic-Georgio S, Golouh R, Vrhovec I, et al. The expression of lysosomal proteinases and their inhibitors in breast cancer: possible relationship to prognosis of the disease. Pat-hol Oncol Res 1997; 3: 89-99.
45.	Thomssen C, Schmitt M, Goretzki L, Oppelt P, Pache L, Dettmar P, et al. Prognostic value of the cysteine proteases cathepsin B and cathepsin L in human breast cancer. Clin Cancer Res 1995; 1: 741-6.
46.	Thomssen C, Oppelt P, Janicke F, Ulm K, Harbeck N, Hofler H, et al. Identification of low-risk node-negative breast cancer patients by tumor biological factors PAI-1 and cathepsin L. Anticancer Res 1998; 18: 2173-80.
47.	Foekens JA, Kos J, Peters HA, Krašovec M, Look MP, Cimerman N, et al. Prognostic significance of cathepsins B and L in primary human breast cancer. J Clin Oncol 1998; 16: 1013-21.
48.	Budihna M, Skrk J, Zakotnik B, Gabrijelcic D, Lindtner J. Prognostic value of total cathepsin B in invasive ductal carcinoma of the breast. Eur J Cancer 1995; 31A: 661-4.
49.	Kuopio T, Kankaanranta A, Jalava P, Kronqvist P, Kotkansalo T, Weber E, et al. Cysteine proteinase inhibitor cystatin A in breast cancer. Cancer Res 1998; 58: 432-6.
50.	Ebert W, Knoch H, Werle B, Trefz G, Muley Th, Spiess E. Prognostic value of increased lung tumor tissue cathepsin B. Anticancer Res 1994; 14: 895-900.
51.	Knoch H, Werle B, Ebert W, Speiss E. Imbalance between cathepsin B and cysteine proteinase inhibitors is of prognostic significance in human lung cancer. Int J Oncol 1994; 5: 77-85.
52.	Werle B, Julke B, Lah T, Spiess E, Ebert W. Cathepsin B fraction active at physiological pH of 7.5 is of prognostic significance in squamous cell carcinoma of human lung. Br J Cancer 1997; 75: 1137-43.
53.	Werle B, Julke B, Lah T, Kos J, Spiess E, Ebert W. Cathepsin B and cathepsin L: prognostic factors in human lung cancer? In: Hopsu-Havu VK, Jarvinen M, Kirschke H, editors. Proteolysis in cell functions. Amsterdam: IOS Press; 1997. p. 472-8.
54.	Inoue T, Ishida T, Sugio K, Sugimachi K. Cathepsin B expression and laminin degradation as factors influencing prognosis of surgically treated patients with lung adenocarcinoma. Cancer Res 1994; 54: 6133-6.
55.	Sukoh N, Abe S, Ogura S, Isobe H, Takekawa H, Inoue K. Immunhistochemical study of cathepsin B. Cancer 1994; 74: 46-51.
56.	Ebert E, Werle B, Julke B, Kopitar-Jerala N, Kos J, Lah T, et al. Expression of cysteine protease inhibitors stefin A, stefin B, and cystatin C in human lung tumor tissue. Adv Exp Med Biol 1997; 421:259-65.
57.	Budihna M, Strojan P, Smid L, Skrk J, Vrhovec I, Zupevc A, et al. Prognostic value of cathepsins B, H, L, D and their endogenous inhibitors stefins A and B in head and neck carcinoma. Biol Chem Hoppe-Sey-ler 1996; 377: 385-90.
58.	Smid L, Strojan P, Budihna M, Skrk J, Vrhovec I, Zargi M, et al. Prognostic value of cathepsins B, D and stefins A and B in laryngeal carcinoma. Eur Arch Otorhinolaryngol 1997; 254: 150-3.
59.	Strojan P. Napovednipomen katepsinov in njihovih endogenih inhibitorjev pri bolnikih s karcinomi glave in vratu. Doktorska disertacija. Ljubljana: Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani; 1998.
60.	Russo A, Bazan V, Gebbia N, Pizzolanti G, Tumminello FM, Dardanoni G, et al. Flow cytometric DNA analysis and lysosomal cathepsin B and L in locally advanced laryngeal cancer. Cancer 1995; 76:1757-64.
61.	Campo E, Munoz J, Miquel R, Palacin A, Cardesa A, Sloane BF, et al. Cathepsin B expression in colorectal carcinomas correlates with tumor progression and shortened patient survival. Am J Cancer 1994; 145: 301-9.
62.	Kos J, Nielsen HJ, Krasovec M, Christensen IJ, Cimerman N, Stephens RW, et al. Prognostic value of cathepsin B and carcinoembryonic antigen in sera of patients with colorectal cancer. Clin Cancer Res 1998; 4: 1511-6.
63.	Plebani M, Herszenyi L, Cardin R, Roveroni G, Carraro P, Paoli MD, et al. Cysteine and serine proteases in gastric cancer. Cancer 1995; 76: 367-75.
64.	Kos J, Stabuc B, Schweiger A, Krasovec M, Cimerman N, Kopitar-Jerala, et al. Cathepsins B, H, and L and their inhibitors stefin A and cystatin C in sera of melanoma patients. Clin Cancer Res 1997; 3: 1815-22.
65.	Strojnik T, Kos J, Zidanik B, Golouh R, Lah T. Cathepsin B immunohistochemical staining in tumor and endothelial cells is a new prognostic factor for survival in patients with brain tumors. Clin Cancer Res 1999; 5: 559-67.
Prlspelo 15. 5.1999