Pregledni œlanki - Review Articles Pomembnost porfirinov v laboratorijski diagnostiki Importance of porphyrins in laboratory diagnostics Ljuba Krnjak, Milan Skitek POVZETEK: Porfirini so cikliœni tetrapiroli, derivati osnovnega tetrapirol porfina. So vmesni presnovni produkti v biosintezi hema. Sintentizirajo se v vseh celicah sesalcev. Pri zdravem œloveku se v manjĝih koliœinah izloœajo iz organizma z blatom in urinom. Poznamo tri glavne vrste por-firinov: uroporfirin, koproporfirin in protoporfirin. Bolezni, ki se pojavljajo v zvezi z njimi, so dedne ali pridobljene motnje v biosintezi hema. Za boljĝe razumevanje jih razdelimo v eritropoetiœne ali hepatiœne oblike, glede na primarni poloĉaj pomanjkanja encima. Za kliniœni dokaz hepatiœnih porfirij so ponavadi pomembni sekundarni dejavniki kot: zdravila, hormoni, prehrana, alkohol, doloœene halogenske hidrokarbonske meĝanice in poĝkodbe jeter. Pri akutnih hepatiœnih porfirijah je nujno takojĝnje diagnosticiranje in zdravljenje. Kljuœne besede: porfirini, porfirija, porfinurija, porfirinemija. ABSTRACT: Porphyrins are cyclic tetrapyrroles which can be considered as derivatives of the parent tetrapyrrole. They are synthesized in all mammalian cells. They excrete of the health human body in small quantities through excrement and urinous. In humans, there are three major porphyrins: uroporphyrin, coproporphyrin and protopotphyrin. Porphyrias are hereditary or acquired disorders of heme biosynthesis. For practical reasons, they are classified into erythropoietic or hepatic forms according to the primary site of enzyme deficiency. For the clinical manifestation of hepatic porphyrias secondary factors are usually of importance, e.g. drugs, hormones, nutrition, alcohol, certain halogenated hydrocarbon compounds, hepatic lesions. Acute hepatic porphyrias have to give rise to medical emergencies and require intensive care treatment. Key words: porphyrins, porphyrias, porphyuremia, porphyrinemia 1 Uvod Porfirije spadajo v skupino redkih bolezni. Pojavljajo se po vsem svetu. Povezane so s podedovanimi in pridobljenimi motnjami v bios-intezi hema. Primarne ali podedovane bolezni v porfirinskem metabo-lizmu so relativno redke, pogostejĝe so nekatere sekundarne ali pridobljene motnje. Laboratorijska diagnostika porfirinskih bolezni je v osnovi povezana z analitiko porfirinov in porfirinskih intermediatov. Vedno bolj postajajo pomembni analizni postopki, ki omogoœajo spremljanje koncentracij metabolitov, znaœilnih za porfirinske motnje. 2 Zgradba in vrste porfirinov Porfirini so cikliœni tetrapiroli, derivati osnovnega tetrapirol porfina. V derivatih porfina so b-vodikovi atomi popolnoma ali delno substituirani z razliœnimi stranskimi verigami, kot so: alkil, hidroksialkil, vinil, kar-bonil ali karboksilna skupina. Razliœni porfirini so razvrĝœeni glede na vrsto stranskih verig. V skladu s tem razlikujemo naslednje porfirine: protoporfirin, koproporfirin, etioporfirin, mezoporfirin in uroporfirin. Vsi naravni protoporfirini vsebujejo dve razliœni stranski verigi vsakega pirolovega obroœa. Torej so pri dveh razliœnih verigah moĉne ĝtiri izomere. Protoporfirin se v naravi nahaja le kot izomer ĝtevilka IX in ker je opredeljen kot derivat koproporfirina III, se lahko imenuje tudi protoporfirin III. Protoporfirin IX je v obliki hema in hemoglobina, mio-globina in v veœini citokromov. Porfirini kompleksirajo ĝtevilne kovinske ione in tvorijo metaloporfirine. Porfirinogeni, ki so intermediati v sintezi porfirinov predstavljajo porfirine, v katerih sta dva duĝika v pirolnih obroœih in vsi metilenski ogljiki hidrogenirani. Vsi bioloĝki metaloporfiri-ni se na enak naœin sintetizirajo do stopnje protoporfirina IX (1). 3 Biosinteza porfirinov in hema Ime ğporfirinĞ je grĝkega izvora in izhaja iz besede ğporphyraĞ. Raztopine porfirinov so temno rdeœe do ĝkrlatno obarvane. V strukturi tetrapirolovega obroœa so prisotne ĝtevilne konjugirane dvojne vezi. Porfirini in hem se sintetizirajo v vseh celicah sesalcev. Aktivnost bios-inteze je najbolj pomembna v kostnem mozgu in jetrih. Niz reakcij vodi do sinteze hema, ki se zaœne s sukcinil koecimom A in glicinom ter konœa z vkljuœitvijo Fe2+ iona v molekulo protoporfirina IX (Slika 1) (2). Pri sintezi hema sodeluje osem encimov, ĝtirje v mitohondrijih in ĝtirje v citosolu. Predlagana imena encimov so bila objavljena leta 1992 v soglasju s komisijo za nomenklaturo “The International Union of Biochemistry” (Mednarodno zdruĉenje za biokemijo). Sprejeta imena encimov so prepreœila zamenjave z do tedaj uporabljenimi imeni. Imena encimov so navedena v preglednici 2 (3). mag. Ljuba Krnjak, prof. kem. in biol., dr. Milan Skitek, mag.farm., Kliniœni center Ljubljana, Kliniœni inĝtitut za kliniœno kemijo in biokemijo, Njegoĝeva 4, Ljubljana, Slovenija farm vestn 2005; 56 125 Pregledni œlanki - Review Articles Sintaza aminolevulinske kisline EC 2.3.1.36 V prvi reakciji biosinteze hema nastane aminolevulinska kislina (ALA). Sintentizira se v mitohondrijih z encimom sintazo aminolevulinske kisline iz glicina in sukcinil koencima A v prisotnosti pirodoksalfosfata. Aktivnost encima sintaze aminolevulinske kisline uravnava hitrost celotne sinteze hema, vendar je njena aktivnost manjĝa od aktivnosti ostalih encimov sistema (4). Sintaza porfobilinogena EC 4.2.1.24 Drugi encim v biosintezi hema je encim sintaza porfobilinogena, ki katalizira nastanek porfobilinogena iz dveh molekul ALA. ALA nastaja v mitohondrijskem matriksu in se premika v citosol, kjer deluje. Zmanjĝana aktivnost sintaze porfobilinogena je zelo redka motnja. Bolezen se deduje avtosomno recesivno. Pri homozigotih je aktivnost encima zmanjĝana za veœ kot 95 %. V literaturi najdemo opisanih ĝest takĝnih primerov. Oseba, ki je heterozigotna za mutacijo, ne zboli, je zgolj prenaĝalka. Heterozigoti so povezani s prirojenimi porfirinskimi motnjami. Oblike motenj so blage, vœasih nezaznavne (fenotipsko, biokemijsko) ali pa so kliniœno spregledane. Povzroœitelji motenj so lahko zunanji dejavniki, na primer svinec. Laboratorijska ugotovitev o zniĉani aktivnosti sintaze porfobilinogena pokaĉe zviĝano koncentracijo ALA z normalno koncentracijo porfobilinogena (5). Hidroksimetilbilan sintaza EC 4.3.1.8 Tretji encim v biosintezi hema je hidroksimetilbilan sintaza, ki katalizira sintezo ĝtirih molekul porfobilinogena v hidroksimetilbilan (6). Akutna intermitentna porfirija se pojavi pri posamezniku, kjer je aktivnost hidroksimetilbilan sintaze v eritrocitih 50 % ali manj. Bolezen je avto-somno recesivna. Za pojav teh obolenj je potrebna mutacija na obeh alelih genskega lokusa. Incidenca v svetu je pribliĉno 5 do 10 primerov na 100 000 prebivalcev. Veœ kot 90 % posameznikov z muti-ranim genom nikoli ne zboli (7). Uroporfirinogen III sintaza EC 4.2.1.75 Œetrti encim v biosintezi hema je uroporfirinogen III sintaza. Ta katal-izira pretvorbo hidroksimetilbilana v uroporfirinogen. Pri homozigotih je aktivnost encima nizka. Heterozigoti pri tem niso prizadeti. Motnja se izraĉa z moœno fotoobœutljivostjo in temno rdeœo barvo urina v neonatalnem obdobju (8). Zobje in kosti fluorescirajo. Ko bolezen napreduje, zajame ĝe druge dele telesa, na primer prste in nos, ki so izpostavljeni sonœnim ĉarkom. Smrt najpogosteje nastopi ĉe v zgodnjem otroĝtvu. Nastop bolezni v kasnejĝem ĉivljenjskem obdobju vodi v kopiœenje porfirinov, ki ni vedno povezano z znaœilno fotoobœutljivostjo. Pri bolnikih so opazne brazgotine in deformacije rok, prstov, nosu in uĝes. Laboratorijske preiskave pokaĉejo zviĝano izloœanje porfirinov v urinu, tudi do 20-krat veœ kot je normalno. To je redka avtosomno recesivna motnja, ki se pojavlja kot kongenitalna eritropoetiœna porfirija ali Güntherjeva bolezen (4). Uroporfirinogen dekarboksilaza EC 4.1.1.37 V peti stopnji biosinteze hema se uroporfirinogen dekarboksilira v koproporfirinogen. Porfirija kutanea tarda je najbolj prepoznavna por-firija z incidenco 1 primer na 25 000. Pojavlja se kot dedna ali pridobljena bolezen. Porfirija kutanea tarda je avtosomno dominantno dedna bolezen in ima 50 % zmanjĝano aktivnost encima v jetrih in eritrocitih. Nasprotno je pri pridobljeni porfiriji kutanea tarda za 50 % zmanjĝana aktivnost encima le v jetrih, v eritrocitih pa je aktivnost encima normalna. Pri bolnikih se pojavi znaœilna prizadetost koĉe in 126 farm vestn 2005; 56 jeter. Laboratorijski rezultati pokaĉejo zviĝane vrednosti uroporfirinov in koproporfirinov v urinu (9). Hepatoeritropoetiœna porfirija je zelo redka dedna bolezen, pri kateri aktivnost encima ponavadi za 5 do 10 % odstopa od normalne aktivnosti (4). Koproporfirinogen oksidaza EC 1.3.3.3 Koproporfirinogen oksidaza je ĝesti encim, ki sodeluje v biosintezi hema. Nahaja se na notranji strani membrane mitohondrija. Mehanizmi za transport reaktantov in produkta skozi mitohondrijske membrane niso pojasnjeni. Hereditarna koproporfirija je akutna hepatiœna porfirija, ki se izraĉa kot akutna nevroloĝka porfirija ali porfirija s fotoobœutljivostjo ali pa kot oboje hkrati (v pribliĉno 30% primerov). Bolezen se deduje avtosom-no dominantno s prirojeno encimsko okvaro koproporfirinogen oksi-daze. Laboratorijske preiskave pokaĉejo zviĝanje koproporfirina III v blatu in urinu. V akutnih stanjih bolezni so zviĝane vrednosti porfo-bilinogena in ALA v urinu. Bolniki so obœutljivi na sonœno svetlobo zaradi kopiœenja porfirinov v koĉi (10). Protoporfirinogen oksidaza EC 1.3.3.4 Sedmi encim v biosintezi hema je encim protoporfirinogen oksidaza v membrani mitohondrijev. Ta oksidira protoporfirinogen v protoporfirin IX. Protoporfirin IX nastaja z encimsko oksidacijo kot edini porfirin v biosintezi hema. Ostali porfirini nastajajo z neencimsko oksidacijo in predstavljajo ireverzibilno pot v biosintezi hema. Porfirija variegata se lahko pojavi kot akutna nevroloĝka porfirija ali porfirija z moœno fotoobœutljivostjo ali kot oboje hkrati (v pribliĉno 30 % primerov). Bolezen je dominantno dedna. Laboratorijski rezultati pokaĉejo trajno zviĝanje porfirinov in koproporfirinov v blatu. Akutni napadi bolezni so povezani z zviĝanimi vrednostmi ALA, porfobilino-gena, koproporfirinov in uroporfirinov v urinu. Bolniki so moœno obœutljivi na sonœno svetlobo in mehanske poĝkodbe (4). Ferohelataza EC 4.99.1.2 Zadnja faza v biosintezi hema je vgrajevanje Fe2+ v protoporfirin IX. To reakcijo katalizira encim ferohelataza na notranji membrani mito-hondrija. Tako nastane hem. Ferohelataza je specifiœna za Fe2+ in prepreœuje vezavo Fe3+ v molekulo porfirina. Za vezavo tekmujejo kovinski ioni z valenco 2+. Na primer: Zn2+ je v visokih koncentracijah prisoten ob nastajanju rdeœih krvnih celic in neposredno tekmuje z Fe2+ za encimski vstop v protoporfirin IX. Nastali cinkov protoporfirin (ZPP) je posredni pokazatelj razpoloĉljivosti ĉeleza pri dozorevanju eritroblasta. Porast zviĝanih koncentracij ZPP pri razliœnih pridobljenih motnjah je povezan z motnjami v metabolizmu ĉeleza, kar povzroœa pomanjkanje ĉeleza in anemije pri kroniœnih boleznih. Zviĝane koncentracije aluminija pri dializnih bolnikih ali zastrupitev s svincem prav tako povzroœijo zviĝanje ZPP z motnjo v metabolizmu ĉeleza (11). Aktivnost encima ferohelataze pri eritropoetiœni protoporfiriji znaĝa 50 %. Zviĝane so koncentracije protoporfirina v krvi, ĉolœu in blatu. Preseĉek protoporfirina se nalaga v koĉi, posledica je obœutljivost koĉe na sonœno svetlobo ĉe v otroĝtvu. Bolezen preide v kroniœno fazo kot solarni ekcem. Za zdravljenje bolnikov je potrebna primerna zaĝœi-ta pred soncem in ß karoteni, ki zmanjĝujejo fotoobœutljivost (12). Pomembnost porfirinov v laboratorijski diagnostiki 4 Nadzor biosinteze hema V sintezo hema je vkljuœenih osem encimov, ki delujejo v tesni medsebojni povezavi. Genetski material, ki doloœa njihovo sintezo, je nameĝœen na razliœnih kromosomih. Gena za sintazo aminolevulinske kisline in hidroksimetilbilan sintazo kontrolirata sintezo hema. Sintaza aminolevulinske kisline ima dva izoencima: eritroidnega in neeritroidnega. Eritroidni gen je bil izoliran na X kromosomu, neer-itroidni gen pa na kromosomu 3. V neeritroidnih tkivih je za normalno delovanje, na primer mitohondrijskih citohromov, potrebna nizka koncentracija hema. Neeritroidni izoencim se sintetizira na prostih poliri-bosomih v obliki predhodnika. Predhodnik se naprej preoblikuje v zrel encim preko translokacije v mitohondrijih predvsem s cepitvijo N-ter-minalnega konca predhodnika. Dokazano je, da hem inhibira prenos predhodnika sintaze aminolevulinske kisline v mitohondrijih, kar predstavlja pomembno kontrolno toœko, saj se sintaza aminolevulinske kisline v citoplazmi hitro razgrajuje. V nasprotju z drugimi celicami mora razvijajoœi se eritroblast akumulirati visoke koncentracije hema za nastanek hemoglobina. Hidroksimetilbilan sintaza ima tudi dve encimski obliki: eritroidno in neeritroidno, vendar se v nasprotju z sintazo aminolevulinske kisline te oblike razvijejo iz istega gena. Bolj kot sintaza aminolevulinske kisline deluje hidroksimetilbilan sintaza v dozorevajoœem eritrocitu kot kontrola za sintezo hema in omogoœa akumulacijo hema v eritrocitih. Humani gen je sestavljen iz 15 eksonov s preko 10 kilobaznih parov v DNA. Prisotna sta dva promotorja, ki povzroœita dve razliœni obliki sporoœilne mRNA: eritroidne in neeritroidne. Vodilni promotor je aktiven v vseh celicah in inducira transkripcijo daljĝe neeritroidne mRNA, ki povzroœi nastanek izoencima, sestavljenega iz 361 aminokislin. Nevodilni promotor pa je aktiven samo v eritroidnem tkivu in povzroœi nastanek mRNA, ki je krajĝa za sekvenco prvega eksona. Primarna struktura eritroidnega encima je zgrajena iz 344 aminokislin in je iden-tiœna strukturi neeritroidnega izoencima, razen v odsotnosti 17 aminokislin na amino terminalnem koncu. Okvara v prvem eksonu hidroksimetilbilan sintaznega gena lahko povzroœi normalno koncentracijo encima v razvijajoœem eritrocitu in zmanjĝano koncentracijo v drugih tkivih. Pribliĉno 5 % bolnikov z akutno prehodno porfirijo ima normalne koncentracije hidroksimetilbilan sintaze v eritrocitih (13). 5 Motnje v biosintezi porfirinov Izraz ğporfirijaĞ je leta 1911 opisal Günther (14). Porfirinske motnje so bile pred preuœitvijo biosinteze hema opredeljene s kliniœnimi znaœil-nostmi. Porfirije so tudi razvrĝœene glede na vrsto tkiva, to je, ali gre za hepatiœno ali eritropoetiœno tkivo. Na sploĝno porfirinske motnje delimo na primarne ali podedovane in sekundarne ali pridobljene motnje. Pridobljene motnje so veliko pogostejĝe kot podedovana stanja. Laboratorijska podpora pri diagnostiki porfirinskih motenj je v doloœanju zviĝanih porfirinov in porfirinskih intermediatov. Dodatne informacije dobimo z merjenjem aktivnosti posameznega encima, ki sodeluje v biosintezi hema in s testiranjem genske osnove. Danes je molekularna biologija vse bolj uveljavljeno diagnostiœno orodje za preuœevanje porfirij (15). Primarne ali podedovane porfirinske motnje Metabolne abnormalnosti v primarnih porfirinskih motnjah so rezultat podedovanih sprememb v genih, ki kodirajo specifiœne encime v biosintezi hema. Primarne porfirinske motnje lahko razdelimo v dve veœji skupini: 1) nevroloĝke in/ali psihiatriœne oblike porfirij, ki se pogosto pojavljajo v akutnem stanju in 2) oblike, povezane s fotoobœutljivostjo (16, ). Ta razvrstitev je pomembna za diagnostiko bolezni. Simptomi nevroloĝkih porfirij so na primer povezani z zviĝan-jem predhodnikov porfirinov, porfobilinogena in ALA. Simptomi fotoobœutljivosti so povezani z akumulacijo porfirinov. Œe se porfirini poviĝano izloœajo v urinu, gre za porfirinurijo, œe pa je zviĝana njihova koncentracija v eritrocitih gre za porfirinemijo. Znane porfirije so: kon-genitalna eritropoetiœna porfirija (KEP), eritropoetiœna porfirija (EPP), hepatoeritropoetiœna porfirija (HEP), akutna intermitentna porfirija (AIP), hereditarna koproporfirija (HK), porfirija variegata (PV) in porfir-ija kutanea tarda (PKT). Vse te bolezni so podedovane, z izjemo PKT, ki je lahko podedovana ali pridobljena zaradi podedovane in/ali pridobljene okvare encima uroporfirinogen dekarboksilaze. Sekundarne ali pridobljene porfirinske motnje Nastajajo pod vplivom zunanjih dejavnikov kot so: zastrupitve s teĉki-mi kovinami (najbolj pogosta je zastrupitev s svincem), alkoholom, pri anemijah, levkemijah, infekcijah, boleznih jeter in pri Hodgkinovi bolezni. Zviĝano koncentracijo porfirinov zasledimo v urinu in blatu (17). 6 Analizni postopki 6.1 Doloœanje predhodnikov porfirinov Porfobilinogen in ALA sta dobro topna v vodi, se koncentrirata v urinu in ju zato v kliniœnih laboratorijih doloœamo skoraj izkljuœno v urinu. Postopki doloœanja porfobilinogena in ALA najpogosteje temeljijo na barvni reakciji z Ehrlichovim aldehidnim reagentom in kislo raztopino paradimetilaminobenzaldehida (DMAB). Porfobilinogen reagira z Ehrlichovim reagentom, pri œemer nastane obarvan produkt najpogosteje roĉnato rdeœe ali ĝkrlatne barve. Danes uporabljamo veœ razliœnih modifikacij Ehrlichovega reagenta, ki se med seboj razlikujejo po koncentraciji DMAB ter vrsti in koncentraciji kisline. 6.1.1 Doloœanje porfobilinogena v urinu Za meritve porfobilinogena je pomembno, da loœimo med kvalitativnimi presejalnimi testi kot so Watson-Schwartzov (18) in Hoeschev test (19) in kvantitativnimi doloœanji. Presejalni testi so relativno slabo obœutljivi in pogosto laĉno pozitivni, oziroma laĉno negativni. Presejalni testi se v glavnem uporabljajo v primeru nujnih doloœitev, ki pa jih moramo kasneje potrditi s kvantitativno metodo. Referenœne vrednosti porfobilinogena v nakljuœnem vzorcu urina so pod 2,0 mg/L (8,8 µmol/L), v 24-urnem vzorcu pa pod 3,4 mg/d (15 µmol/d). Pri nevroloĝkih ali psihiatriœnih porfirijah zasledimo tudi do 10-kratno zviĝanje vrednosti porfobilinogena v urinu od zgornje referenœne meje. Danes so na trĉiĝœu ĉe dostopni reagenti za porfobilinogen pre-sejalne teste, v katere je vkljuœen anionski izmenjevalec, ki loœi porfo-bilinogen od drugih interferenœnih substanc. Pri tem dobimo bolj zanesljive rezultate. Najpogostejĝa metoda za kvantitativno doloœitev porfobilinogena je postopek z ionskim izmenjevalcem. Bolj obœutljive metode pa so osnovane na HPLC metodi (20). 6.1.2 Doloœanje ALA v urinu Pri odkrivanju akutnih nevroloĝkih porfirij doloœamo ALA skupaj s por-fobilinogenom. Porfobilinogen in ALA sta zviĝana pri akutnih porfirijah, farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles pri tem ALA nekoliko manj. ALA je pomembna ĝe pri ovrednotenju zelo redke porfirije zaradi zmanjĝane aktivnosti porfobilinogen sin-taze. Postopki za doloœanje ALA so podobni tistim za doloœanje por-fobilinogena. Na razpolago imamo postopke z ionskimi izmenjevalci in alternativne fotometriœne metode za hitre teste. Postopki obiœajno zahtevajo dodatno reakcijo z reagentom, kot je acetilaceton, ki konvertira ALA v pirolni derivat, ki nato povzroœi nastanek znaœilne barve z Erlichovim reagentom. Problem interferenc je tu ĝe veœji kakor pri porfobilinogenu. Zviĝane koncentracije ALA povzroœi tako akutna kot kroniœna izpostavljenost etanolu (21) in svincu (17). Pri doloœanju ALA je pomembno tudi shranjevanje vzorca do analize. Urine lahko shranjujemo pri 4oC v temi do 14 dni brez izgub aktivnosti ALA. Medtem ko je porfobilinogen bolj stabilen pri pH vrednosti 8 do 9, je ALA bolj stabilna pri pH vrednosti 3 do 4. Pri bolj kislem pH pa se njena stabilnost zmanjĝa. Referenœna vrednost ALA v nakljuœnem vzorcu urina je pod 4,5 mg/L (34 µmol/L) in v 24-urnem urinu pod 7,5 mg/d (57 µmol/d). 6.2 Doloœanje porfirinov Veœina porfirinskih spojin moœno absorbira pri valovni dolĉini 400 nm, kar imenujemo Soretov pas. Vzbujanje s Soretovim pasom proizvaja karakteristiœno fluorescenco v oranĉno rdeœem obmoœju pri valovni dolĉini 550 do 650 nm. Intenziteta fluorescence je odvisna od pH in je bolj intenzivna v kislih raztopinah. Fluorescenca omogoœa detekcijo porfirinov tudi v nanomolarnih koncentracijah. Kvantitativna metoda za indentifikacijo porfirinov je HPLC s fluorescenœnim detektorjem. Priprava ustreznih kalibratorjev predstavlja problem zaradi nizke topnosti porfirinov, teĉnje po dimerizaciji in tvorbe drugih oblik agregatov v vodnih raztopinah. Nove tehnike, kot so kapilarna elektroforeza (22) in masna spektrometrija (23), bodo imele pomembno vlogo v prihodnosti pri doloœanju porfirinov. 6.2.1 Doloœanje porfirinov v urinu V laboratorijih porfirine v urinu obiœajno doloœajo s presejalnimi testi, ki jim sledijo kvantitativne metode v primeru pozitivnih vzorcev (24). V nekaterih laboratorijih doloœajo porfirine v urinu neposredno s kvantitativno metodo. Referenœne vrednosti so: uroporfirin £3,9 (3,5-5,7) µmol/mol kreatinina ali £37 (32-63) nmol/dan in koproporfirin £22 (19-34) µmol/mol kreatinina ali £221 (195-320) nmol/dan. V literaturi je objavljeno veliko ĝtevilo razliœnih postopkov uporabe HPLC za doloœanje porfirinov v urinu (25). 6.2.2 Doloœanje porfirinov v krvi Koncentracija porfirinov v serumu in plazmi je zelo pomembna pri diagnostiki razliœnih porfirinskih motenj. Referenœna vrednost za celotne porfirine v serumu je pod 15 nmol/L. Najviĝja koncentracija porfirina v polni krvi in eritrocitih je ZPP, ki ga ne najdemo v serumu in plazmi, razen ob prisotnosti hemolize. ZPP nastane v dozorevajoœem eritrocitu, œe je zmanjĝana koncentracija razpoloĉljivega ĉeleza. ZPP v polni krvi se v kliniœnih laboratorijih doloœa s fluorometrijo in z bolj dolgotrajnimi ekstrakcijskimi metodami. Referenœna vrednost ZPP v polni krvi in eritrocitih je 30 do 70 µmol/mol hema. Za doloœanje prostih ali s kovino kompleksiranih protoporfirinov v polni krvi obstajajo razliœni HPLC postopki (26). 6.2.3 Druge tehnike za doloœanje porfirinov v krvi Zviĝano vsebnost porfirinov v eritrocitih lahko doloœamo neposredno z uporabo fluorescenœne mikroskopije v razmazih periferne krvi (27). Ta postopek se uporablja kot presejalni test za odkrivanje eritropoet-iœne porfirije. Vsebnost porfirinov v eritrocitni populaciji prav tako lahko doloœamo s pretoœno citometrijo, saj je porazdelitev florescent-nih eritrocitov drugaœna pri protoporfiriji v primerjavi z normalnimi vzorci (28). 6.2.4 Doloœanje porfirinov v blatu Analiza porfirinov v blatu se uporablja za diferencialno diagnostiko akutnih nevroloĝkih porfirij, œeprav rezultati niso vedno jasni. Najbolj pomebna porfirina v diagnostiki porfirinskih motenj sta koproporfirin in protoporfirin (29). Referenœne vrednosti so: koproporfirin pod 200 µg/dan (<306 nmol/dan) ali <45 nmol/g suhe teĉe in protoporfirin pod 1500 µg/dan (<2670 nmol/d) ali <150 nmol/g suhe teĉe. Doloœanje uroporfirina je laĉje in bolj ustrezno v vzorcih urina, kjer ne poteka razgradnja z bakterijami. V diagnostiœne namene je doloœanje porfirinov v ĉolœu, ki ga dobimo z duodenalno aspiracijo bolj primerno kakor v blatu, pri œemer pa problem predstavlja pridobitev vzorca. V blatu poteka bakterijska razgradnja, kar pogosto lahko privede do napaœne diagnoze porfirinskih motenj. 6.3 Doloœanje encimov, ki sodelujejo v sintezi hema Podedovane porfirinske motnje so povezane z zmanjĝano aktivnostjo (aktivnost je 50 % ali manj) doloœenega encima. Z encimskimi testi farm vestn 2005; 56 Pomembnost porfirinov v laboratorijski diagnostiki Preglednica 1: Pregled encimov v biosintezi porfirinov in hema (3). Table 1: Overview the Enzymes of Porphyrin and Heme Biosynthesis (3). ENCIMI (Ostala imena encimov) Dedne bolezni Zviĝani intermediati 1. Sintaza aminolevulinske kisline Ni (Sintaza aminolevulinske kisline) 2. Sintaza porfobilinogena Porfirije Aminolevulinska kislina (Aminolevulinska dehidraza) (Aminolevulinska dehidrataza) (Aminolevulinska hidrolaza) 3. Hidroksimetilbilan sintaza AIP Porfobilinogen (Porfobilinogen deaminaza) Aminolevulinska kislina (Uroporfirinogen I sintaza) 4. Uroporfirinogen III sintaza KEP (Uroporfirinogen kosintaza) (Uroporfirinogen izomeraza) 5. Uroporfirinogen dekarboksilaza PKT in HEP Uroporfirin, Porfirini 6. Koproporfirinogen oksidaza HK Porfobilinogen, Koproporfirin 7. Protoporfirinogen oksidaza VP Porfobilinogen, Protoporfirin 8. Ferohelataza EPP Protoporfirin (Hem sintaza) (Hem sintetaza) (Protohem feroliaza) Legenda: EPP eritropoetiœna protoporfirija, KEP kongenitalna eritropoetiœna porfirija, AIP akutna intermitentna porfirija, HK hereditarna kopro-porfirija, VP variegate porfirija, PKT porfirija kutanea tarda, HEP hepatoeritropoetiœna porfirija, PKT porfirija kutanea tarda (V oklepajih so uporabljena imena encimov do leta 1992). lahko identificiramo tiste encime, pri katerih obstaja veœje tveganje za podedovane motnje. Tehniœne teĉave, povezane z encimskimi testi bodo delno odpravljene ĝele, ko bomo v kliniœnih laboratorijih zaœeli rutinsko izvajati teste na genski osnovi. Primer je porfirija variegata, ki je povezana z zniĉano aktivnostjo protoporfirinogen oksidaze in fero-helataze. Tako je verjetno zaradi dejstva, da se ti encimi nahajajo v kompleksu v mitohondrijih in nestabilnost enega vpliva tudi na drugega. Z drugimi besedami: doloœitev zniĉanja encimske aktivnosti ĝe ne pomeni, da smo odkrili vzrok zmanjĝanja, saj je to lahko sekundarna posledica podedovanim motnjam (15). Veœina nosilcev okvarjenih encimov, kot sta hidroksimetilbilan sintaza in uroporfirinogen dekar-boksilaza nikoli ne razvijejo bolezni zaradi njihove zniĉane encimske aktivnosti (7). Z razvojem molekularne biologije na podroœju diagnostike monogenskih in poligenskih bolezni, ki se ukvarja z ugotavljanjem mutacij na enem ali obeh alelih genskega lokusa na avtosomnih kromosomih, se izboljĝuje diagnostika in zdravljenje dednih porfirinskih motenj. 7 Sklep Pogostnost porfirij v Sloveniji je pribliĉno enaka kot v ostalih drĉavah po svetu. V zadnjih desetih letih je tehniœni napredek na podroœju molekularne biologije bistveno pripomogel k diagnozi mnogih podedovanih porfirinskih motenj. V svetu se ĉe v mnogih kliniœnih laboratorijih, inĝtitutih in na fakultetah ukvarjajo z molekularno diagnostiko monogenskih in poligenskih bolezni. Laboratorijska diagnostika dednih porfirij z encimsko okvaro ostaja odprto vpraĝanje v prihodnosti. Testiranje pridobljenih porfirinskih motenj se premalo uporablja. Zunanji dejavniki lahko bistveno in funkcionalno spremenijo biosinte-zo hema in lahko sluĉijo kot znaœilni pokazatelji toksiœnih vzrokov obravnavanih bolezni. Za specifiœnega bolnika je kljuœen izbor primernih laboratorijskih testov za vrednotenje porfirinskih bolezni. Posebno mesto zavzemajo nujni primeri akutnih porfirij, pri katerih je potrebna kakovostna in uœinkovita laboratorijska podpora za pravilno diagnozo porfirinskih bolezni in primerno zdravljenje. farm vestn 2005; 56 Pregledni œlanki - Review Articles 8 Literatura 1. Scott T. Eagles M. In: Concise Encyclopedia Biochemistry Second Edition. Berlin-New York 1988: 470-473. 2. Thomas M. Devlin. Biochemistry with clinical correlations. In: William M. Awad, Jr. Iron and heme metabolism, Fifth Edition. New York 2002: 1063-1071. 3. Tipton KF. Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB). Enzyme nomenclature. Recommendations 1992. Supplement: corrections and additions. Eur J Biochem 1994: 1:1-5. 4. Kappas A, Sassa S, Galbraith RA, Nordmann Y. The porphyrias. In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Vale D, eds. The metabolic and molecular bases of inherited disease, 7th edition. New York: McGraw- Hill 1995: 2103-51. 5. Dyer J, Garrick DP, Pye A. Plumboporphyria (ALAD deficiency) in lead work- er: A scenario for potential diagnostic confusion. British Journal of Industrial Medicine 1993; 50:1119-1121. 6. Warren MJ, Scott AI. Tetrapyrrole assembly and modification into the ligands of biologically functional cofactors. Trends Biochem. Sci 1990; 15:486-491. 7. Kushner JP. Laboratory diagnosis of the porphyrias. N. Engl. J. Med 1991;324:1432-1434. 8. Pollock SS, Rosenthal MS. Images in clinical medicine: Diagnosis of por- phyria. N.Engl. J. Med 1994; 330:114. 9. McManus JF, Begley CG, Ratnaike S. Complex pattern of alternative splic- ing in the normal uroporphyrinogen decarboxylase gene: Implications for diagnosis of familial porphyria cutanea tarda. Clin. Chem 1994; 40:1884-1889. 10. Woods JS, Miller HD. Quantitative measurement of porphyrins in biological tissues and evaluation of tissue porphyrins during toxicant exposures. Fundam. Appl. Toxicol 1993; 21:291-297. 11. Zachee P, Boogaerts MA, Lins RL, et al. Erythropoietin, aluminum, and anaemia in patients on haemodialysis. Lancet 1990; 335:1038-1039. 12. Takeda Y, Sawada H, Tashima M, et al. Erythropoietic protoporphyria with- out cutaneous photosensitivity and with ringed sideroblasts in an atomic bomb survivor. Lancet 1996; 347:395-396. 13. Hindmarsh JT. Enzyme heterogeneity in the porphyrias. Clin. Biochem 1990; 23: 371-374. 14. Rimington C. Was Hippocrates the first to describe a case of porphyria? Int. J. Biochem 1993; 25:1351-1352. 15. Schreiber WE. Acute intermittent porphyria laboratory diagnosis by molecu- lar methods. Clin. Lab. Med 1995; 15:943- 956. 16. Tefferi A, Solberg LA, Ellefson RD. Porphyrias: Clinical evaluation and inter- pretation of laboratory tests. Mayo Clin. Proc 1994; 69:289-290. 17. Labbe RF. Lead poisoning mechanisms. Clin. Chem 1990; 36:1870-1871. 18. Watson CJ, Taddeini L, Bossenmaier I. Present status of the Ehrlich alde- hyde reaction for urinary porphobilinogen. Jama 1964; 190:501. 19. Lamon J, With TK, Redeker AG. The Hoesch test: Bedside screening for uri- nary porphobilinogen in patients with suspected porphyria. Clin. Chem 1974; 20:1438-1440. 20. Jamani A, Pudek M, Schreiber WE. Liquid-chromatographic assay of urinary porphobilinogen. Clin. Chem 1989; 35:471-475. 21. Sieg I, Doss MO, Kandels H et al. Effect of alcohol on b-aminolevulinic acid dehydratase and porphyrin metabolism in man. Clin. Chim. Acta 1991; 202:211-218. 22. Wu N, Li, B, Sweedler J. V. Recent developments in porphyrin separations using capillary electrophoresis with native fluorescence detection. J. Liquid Chromatogr 1994; 17:1917-1927. 23. Luo J. Analysis of urinary and faecal porphyrin excretion patterns in human porphyrias by fast atom bombardment mass spectrometry. J. Pharm. Anal 1997;15:1289-1294. 24. Buttery JE, Chamberlain BR, Gee D et al. Total porphyrin and copropor-phyrin and uroporphyrin fractions in urine measured by second-derivative spectroscopy. Clin. Chem 1995; 41:103-106. 25. Zuijderhoudt FM, Koehorst SG, Kluitenberg WE et al. On accuracy and pre- cision of a HPLC method for measurement of urine porphyrin concentrations. Clin Chem Lab Med 2000; 38:227-230. 26. Sato H, Ido K, Kimura K. Simultaneous separation and qucation of free and metal-chelated protoporphyrins in blood by dimensional HPLC. Clin. Chem 1994; 40:1239-1244. 27. Todd DJ, Nesbitt GS, Lavery TD et al. Erythropoietic protoporphyria: The problem of a suitable screening test. Acta Derm. Venereol (Stockh) 1990; 70:347-350. 28. Schleiffenbaum BE, Minder EI, Mohr P et al. Cytofluorometry as a diagnosis of protoporphyria. Gastroenterology 1992; 102:1044-1048. 29. Zuijderhoudt FM, Kamphuis JS, Kluitenberg WE et al. Precision and accu- racy of a HPLC method for measurement of fecal porphyrin concentrations. Clin Chem Lab Med 2002; 40:1036-1039 farm vestn 2005; 56