Her–2, imenovan tudi »c-erbB-2« ali »neu«, je
transmembranski glikoprotein iz skupine receptorjev rastnih
faktorjev. Protein je izra`en v nizkih koncentracijah v
mnogih normalnih epitelijih, tudi v duktalnem epiteliju
dojke. V signifikantno ve~ji meri pa je pomno`en pri eni
petini do eni ~etrtini invazivnih karcinomov dojke.
V mnogih raziskavah so dokazali, da je pomno`eni Her-2
neodvisen napovedni dejavnik pre`ivetja posebej pri
bolnicah s karcinomom dojke in z limfogenimi zasevki.
Pomno`eni protein napoveduje dober odziv na
adriamicinsko kemoterapijo, hkrati pa slab odziv na
tamoksifen celo pri bolnicah z izra`enimi estrogenskimi
receptorji. V zadnjem ~asu je postalo dokazovanje
pomno`enega proteina Her-2 metoda za selekcijo tistih
bolnic z metastatskim karcinomom dojke, ki bi bile
primerne za imunoterapijo s humaniziranim protitelesom
proti Her-2 proteinu, trastuzumabom (Herceptin®). O tem,
novej{em zdravljenju nekaterih bolnic, smo v ~asopisu
Onkologija `e pisali (Tanja ^ufer: Novosti v onkologiji
2001;5:75-6 in Bojana Pajk: Kdaj me boste zdravili s
Herceptinom®? 2000;4:79-81). 
Dolo~anje statusa Her-2 je postalo na oddelkih za
patologijo izjemno pomemben segment strokovnega dela.
Ugotavljanje Her-2 pri karcinomu dojke, podobno kot
dolo~anje steroidnih receptorjev, ne nadome{~a, ampak
samo dopolnjuje dokazovanje ostalih tradicionalnih
prognosti~nih znakov, kot so tip tumorja, njegova velikost,
gradus in ugotavljanje zasevkov v bezgavkah.
HER-2 LAHKO DOKAZUJEMO NA VE^ NA^INOV
Pomno`eni protein Her-2 je razen v izjemnih situacijah
neposredna posledica zve~anega {tevila kopij gena Her-2,
ki se iz neznanega razloga pojavijo v genomu. Zdi se, da je
koli~ina pomno`enega proteina Her-2 na membrani
tumorski celic odvisna od {tevila kopij gena Her-2.
Status Her-2 lahko dolo~imo torej na dva na~ina. [tevilo
kopij gena Her-2 lahko analiziramo z metodo fluorescentne
hibridizacije in situ (FISH), mno`ino membranskega
proteina Her-2 pa z imunohistokemijo. Obe metodi sta v
kirur{ki patologiji izjemno prakti~ni, saj lahko za preiskave
uporabljamo tumorsko tkivo iz standardnih parafinskih
blokov.
KAKO JE Z IMUNOHISTOKEMIJO?
Ugotavljanje pomno`enega proteina Her-2 z
imunohistokemijo je bistveno druga~no kot pri drugih
protitelesih, kjer zadostujeta obi~ajna izraza »pozitivno« ali
»negativno«. Pri oceni proteina Her-2 uporabljamo sistem,
ki semikvantitivno upo{teva dve zna~ilnosti barvne reakcije.
Glede na dele` obarvanih celic in glede na intenziteto
membranske reakcije (slika 1) uvrstimo karcinom v eno od
ONKOLOGIJA / problemi in perspektive
Primož Drev, Rastko Golouh
Doloèanje onkogena Her-2 pri karcinomu dojke
14
Slika 1. Invazivni karcinom dojke. Imunohistokemi~na reakcija na
celi~nih membranah, ocenjena kot 3+, dokazuje mo~no pomno`en
protein Her-2.
{tirih skupin: negativna reakcija (0), {ibko pozitivna reakcija
(1+), zmerno pozitivna reakcija (2+) in mo~no pozitivna
reakcija (3+). Reakciji 2+ in 3+ pomenita prekomerno
izra`enost proteina (pozitivno), reakciji 0 in 1+ pa ne
(negativno). 
Imunohistokemi~na reakcija napoveduje pomno`itev gena
Her-2. Negativna imunska reakcija (0 in 1+) skoraj zagotovo
ka`e, da gen ni pomno`en, mo~no pozitivna reakcija (3+)
pa, da ga je ve~. Pri zmerno pozitivnem Her-2 (2+) je
sklepanje o pomno`itvi nezanesljivo.
Ob imunohistokemi~nem dokazovanju pa se pojavljajo
nekatere te`ave. Z vse bolj ob~utljivimi protitelesi in ob
uporabi metod za razkrivanje antigenov najdemo pozitivno
reakcijo tudi na celicah normalnega duktalnega epitela, kjer
je {tevilo kopij gena Her-2 na kromosomu 17
nespremenjeno. O~itno so postale imunohistokemi~ne
metode »preob~utljive« in odkrijejo protein tudi na celicah
brez pomno`enega gena, ob tem pa bo reakcija sorazmerno
intenzivnej{a tudi na tumorskih celicah, ocena pa
previsoka. Patologi `e opa`ajo, da je dele` Her-2
imunohistokemi~no pozitivnih primerov nenavadno visok,
kar lahko vsaj delno pripi{emo taki »napa~no pozitivni«
reakciji.
ALI LAHKO FISH POMAGA PRI NATAN^NEJ[EM
DOLO^ANJE PREKOMERNE EKSPRESIJE
HER-2? 
FISH, hibrid molekularne biologije in
citogenetike, je novej{a metoda
prikazovanja nukleinskih kislin. 
Pri FISH izkoristimo osnovno lastnost
nukleinskih kislin prileganja dveh
komplementarnih enojnih verig. Proces
imenujemo hibridizacija. V praksi
predhodno ozna~imo eno od verig DNK.
Tako ozna~eno verigo DNK imenujemo
sonda. Potem ko komplementarna sonda
prile`e na iskano verigo DNK v jedru,
lahko s primerno detekcijsko metodo
prika`emo nastali hibrid. 
V primerjavi z ostalimi molekularnimi
metodami ima FISH to prednost, da
nukleinskih kislin iz vzorca ne
ekstrahiramo, ampak ostane preiskovano
tkivo ohranjeno. Na poseben na~in
obarvan histolo{ki preparat analiziramo s
fluorescentnim mikroskopom.
Na splo{no velja, da lahko z metodo
FISH prika`emo v jedru lokalizacijo in
{tevilo kopij DNK. Razen pri spolnih
kromosomih pri~akujemo zaradi dvojnih
kromosomov v interfazi v vsakem
obi~ajnem jedru po dva signala iste
DNK. Metodo FISH uporabljamo
najpogosteje za odkrivanje {tirih
osnovnih kromosomskih sprememb –
anevsomije, genskih delecij, translokacij
in pomno`itev. Pri karcinomu dojke nas
zanima zadnja kromosomska
sprememba, to je pomno`itev
specifi~nega gena. 
Gen Her-2 le`i na kromosomu 17 (slika
2). V obi~ajnih celicah najdemo torej po
dva kromosoma 17 in na vsakem od njiju
po en gen Her-2. Teoreti~no bi bilo vsako
{tevilo jedrnih genskih kopij, ki je ve~je
od dve, `e znak pomno`itve. Ker pa je
pri invazivnih karcinomih dojke
anevsomija kromosoma 17 zelo pogosta,
saj so kromosomi pomno`eni po
nekaterih raziskavah v 47% primerov, je
pove~ano {tevilo kopij gena Her-2 lahko
posledica polisomije kromosoma 17, in
ne pomno`itve. ^e ne bi poznali {tevila
kromosomov 17, bi v takem primeru
samo po {tevilu signalov lahko napa~no
ugotovili pomno`itev. To velja {e posebej
takrat, ko je {tevilo kopij gena Her-2 le
malo zvi{ano.
Za natan~nej{o interpretacijo rezultatov uporabljamo zato
dve sondi. Z eno prika`emo {tevilo signalov gena, z drugo
pa {tevilo centromerov kromosoma 17 in s tem {tevilo
kromosomov 17. Lokalizacije genov so v fluorescentnem
mikroskopu obarvane rde~e, centromeri pa zeleno (slika 3).
V analizi vzorca pre{tejemo signale v 60
jedrih tumorskih celic invazivne
komponente tumorja. O pomno`itvi
sklepamo na podlagi razmerja {tevila
signalov gena Her-2 in {tevila signalov
centromera kromosoma 17. ^e je
koli~nik med obema enak ali ve~ji od 2,
govorimo o pomno`itvi Her-2
protoonkogena (slika 4). ^e je koli~nik
manj{i od 2, ni pomno`itve.
FISH je kvanitativna metoda s 100%
specifi~nostjo in 96-98% senzitivnostjo.
Preiskava traja tri dni. 
ALI JE FISH PRAVA KVANTITATIVNA
METODA?
Ne vedno. Kadar je {tevilo pomno`enih
kopij gena Her-2 majhno, je relativno
lahko pre{teti signale genov in
kromosomov. ^e pa {tevilo signalov
prese`e 8 do 10, jih je zaradi prekrivanja
te`je razlo~iti in pre{teti, tako da rezultati
postanejo semikvantitativni. Res pa je, da
{e ne vemo, ali je kvantitativen podatek
klini~no pomemben.
KAK[EN NAJ BO STANDARDEN NA^IN
DOLO^ANJA HER-2?
O tem, ali naj bi imunohistokemijo in 
FISH kombinirali, in ~e, na kak{en na~in, 
{e ni dogovora. Najpogostej{a priporo~ila
so:
• Samo imunohistokemija. Zaradi te`av
z la`no pozitivnimi in la`no
negativnimi rezultati ima tak na~in le
{e malo zagovornikov.
• Imunohistokemija za presejanje vseh
duktalnih karcinomov, FISH uporabimo
za potrditev primerov z
imunohistokemi~nim rezultatom 2+.
• Presejanje z imunohistokemijo, FISH
za dodatno analizo vseh
imunopozitivnih primerov (2+ in 3+).
• FISH pri vseh primerih. Tako obdelavo
zahtevajo ponekod predvsem kliniki.
Na Oddelku za patologijo Onkolo{kega
in{tituta smo oktobra 2001 postavili
laboratorij za molekularno genetiko,
novembra je steklo uvajanje FISH,
januarja 2002 pa standardizacija metode
ONKOLOGIJA / problemi in perspektive
15
Slika 4. Celica invazivnega karcinoma
dojke. Obi~ajno {tevilo zelenih signalov
(2) za centromer kromosoma 17 in
pove~ano {tevilo rde~ih signalov
(najmanj 8) za gen ka`e na o~itno
pomno`itev gena Her-2.
Slika 3. Celica duktalnega epitela dojke
z obi~ajnim {tevilom zelenih signalov (2)
za centromer kromosoma 17 in rde~ih
signalov (2) za gen Her-2. 
Slika 2. Na shemi kromosoma 17 sta
ozna~eni mesti za centromer (zeleno) in
za gen Her-2 (rde~e).
v sodelovanju z In{titutom za patologijo Univerze v Baslu.
S pomladjo 2002 za~enjamo rutinsko ugotavljati
pomno`eni gen z metodo FISH pri vseh karcinomih dojke z
imunohistokemi~no dokazanim zmerno pomno`enim
proteinom Her-2 (2+).
NEKAJ O TEHNIKI
Za dolo~anje pomno`itve protoonkogena Her–2
uporabljamo PathVysion ™ HER-2 DNA PROBE KIT, ki ga
je ameri{ki Urad za `ivila in zdravila januarja 2002 odobril
za izbiro tistih bolnic z metastatskim karcinomom dojke, ki
bi jih lahko zdravili s Herceptinom®. 
Kit vsebuje dve sondi. Prva je s fluorokromom spectrum
orange direktno ozna~ena sonda za Her-2 genski lokus, ki
se prilega na 17q11.2- q12 regijo ~love{kega kromosoma
17. Druga je s fluorokromom spectrum green direktno
ozna~ena alfasatelitna sonda za centromer kromosoma 17,
prilegajo~a na lokus D17Z1 kromosoma 17. 
Vzorec za preiskavo je v formalinu fiksirano in v parafin
vklopljeno tumorsko tkivo. Tanko, 2-4 µm debelo tkivno
rezino naplavimo na objektno stekelce, parafin odtopimo s
ksilolom, tega pa speremo z etanolom. Z encimsko digestijo
razkrijemo DNK in tako omogo~imo dostop sond do ciljne
molekule. 
Preparat ponovno fiksiramo v blagi raztopini formalina,
nato nanesemo sondi. Denaturiranje preiskovane DNK in
sond, ki je bistveni pogoj za hibridizacijo, dose`emo s
kombinacijo kemi~nih (formamid) in fizikalnih (segrevanje)
postopkov. Hibridizacija poteka v hibridizacijski komori pri
temperaturi 37o C vsaj 16 ur. Ostanke nevezanih sond
speremo. Vso jedrno DNK obarvamo z barvilom DAPI.
Detekcija hibridnih molekul temelji na fizikalnem pojavu -
fluorescenci. Posebna barvila - fluorokromi, se ob vplivu
svetlobe dolo~ene valovne dol`ine vzburijo in elektroni
atomov barvila preidejo na vi{jo energetsko raven. Ko se
elektroni vrnejo na osnovno energetsko raven, oddajo
energijo v obliki svetlobe z ve~jo valovno dol`ino, kot je
bila ekscitacijska. Tako emitirano svetlobo nato registriramo. 
V na{em laboratoriju uporabljamo za detekcijo reakcij:
1.Svetlobni mikroskop Olympus BX 51, ki je prirejen za
epifluorescen~no mikroskopiranje.
2.Videokamero (Sensys™ Charge Coupled Device, CCD).
3.Ra~unalnik z operacijskim sistemom Mac OS9, z bazo
podatkov Lab manager, s programom za zajemanje in
obdelavo slike Smart capture 2.0 in IP Lab 3.0 in
programom za oblikovanje poro~il Report layouts,
zdru`enih v programski sistem Quips®, proizvajalca
Applied imaging corporation. 
Ob pregledu preparata izberemo z manj{o pove~avo
primerno podro~je invazivnega karcinoma s celi~nimi jedri,
ki se ne prekrivajo. Vsako izbrano jedro slikamo trikrat. S
prvim posnetkom registiramo sliko, dobljeno s svetlobo, ki
ekscitira barvilo DAPI, z drugim sliko s svetlobo, ki ekscitira
fluorokrom, vezan na sondo za gen Her-2, in s tretjim sliko
s svetlobo, ki ekscitira fluorokrom, vezan na sondo za
centromer kromosoma 17. Z monokromatsko videokamero
dobimo ~rnobele posnetke. Ra~unalni{ki program doda
nato ustrezne barve in sestavi posamezne posnetke v
barvno sliko jedra s signali obeh sond. V kon~ni sliki je
jedro modre barve, signali sonde, hibridizirane na gen
Her-2, so rde~i, signali sonde centromera kromosoma 17 pa
zeleni. 
Ker za razliko od ve~ine histolo{kih, preparati pri metodi
FISH niso trajni, je posebej pomembno shranjevanje
posnetkov v bazo podatkov. 
■
ONKOLOGIJA / problemi in perspektive
16