ZAKLJUČNO POROČILO O REZULTATIH OPRAVLJENEGA RAZISKOVALNEGA DELA NA PROJEKTU V OKVIRU CILJNEGA RAZISKOVALNEGA PROGRAMA (CRP) »KONKURENČNOST SLOVENIJE 2006 - 2013«
I. Predstavitev osnovnih podatkov raziskovalnega projekta
1. Naziv težišča v okviru CRP:
Povezovanje ukrepov za doseganje trajnostnega razvoja
2. Šifra projekta:
V4-0320
3 ■ Naslov proj ekta:
Uvedba in validacija metod določanja ostankov nekaterih veterinarskih zdravil v živilih živalskega izvora	_
3. Naslov projekta
3.1. Naslov projekta v slovenskem jeziku:
Uvedba in validacija metod določanja ostankov nekaterih veterinarskih zdravil v živilih živalskega izvora
3.2. Naslov projekta v angleškem jeziku:
Introduction and vahdation of some methods for the detection of certain veterinary drugs in food of animal origin
4. Ključne besede projekta
4.1. Ključne besede projekta v slovenskem jeziku:
Veterinarska zdravila, živila živalskega izvora, ostanki, validacija, LC-MS/MS, mikrobiološka metoda
4.2. Ključne besede projekta v angleškem jeziku:
Veterinary drugs, food of animal origin, residues, vahdation, LC-MS/MS, microbiological methods
5. Naziv nosilne raziskovalne organizacije:
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007	Stran 1 od 12
Univerza v Ljubljani (Veterinarska fakulteta)
5.1. Seznam sodelujočih raziskovalnih organizacij (R0):
6. Sofinancer/sofinancegi:
Ministrstvo za kmetijstvo, gozdarstvo in prehrano
7. Šifra ter ime in priimek vodje projekta:
8110
Dr. Ksenija Šinigoj Gačnik
Datum:	.
Podpis vodje projekta: Dr. Ksenija Šinigoj Gačnik
r

s\	in žigizvajalca:	^
Obrazec ARRS-RI-CRP-2P-2007
Stran 2 od 12
II. Vsebinska struktura zaključnega poročila o rezultatih raziskovalnega projekta v okviru CRP
1. Cilji projekta:
1.1. Ali so bili cilji projekta doseženi? X a) v celoti
b)	delno
c)	ne
Če b) in c), ie potrebna utemeljitev.
1.2. Ali so se cilji projekta med raziskavo spremenili? X a) da b) ne
Če so seje potrebna utemeljitev:
Določanje nitroimidazolovvjacih
Odločili smo se za validacijo HPLC-DAD metode l<ot kvantitativne metode in ne LC-IVIS/MS metode, ker smo imeli težave pri dokončni postavitvi kromatografskih pogojev za LC-IVIS/MS. Kvantitativno vrednotenje nameravamo izvajati z metodo HPLC-DAD.
Določanje polietrskih antibiotikov z LC-MS/MS
Poleg najavljenih lasalocida, monensina, salinomicina in narasina smo v postopek vključili še maduramicin.
Presejalna mikrobiološka metoda ugotavljanja tetraciklinov v mleku
Namesto validacije v mesu smo opravili validacijo v mleku, ker se srečujemo
predvsem s pozitivnimi vzorci mleka, ki vsebujejo tetracikline.
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007	Stran 3 od 12
2. Vsebinsko poročilo o realizaciji predloženega programa dela^;
Določanje polietrskih antibiotikov z LC-MS/MS
Uvedli smo LC-MS/MS metodo za določanje polietrskih ionofomih antibiotikov v jajcih in jetrih. Kromatografska ločba in MS/MS detekcija sta za vzorce jajc in jeter enaki, različna sta postopka ekstrakcije in čiščenja ekstraktov. V metodo smo vključili poleg salinomicina, monensina, lasalocina in narasina tudi maduramicin, ki ga rejci prav tako uporabljajo za preprečevanje kokcidioze in spada med poHetrske antibiotike. Kot interni standard uporabljamo nigericin.
Kromatografsko ločbo omenjenih substanc smo poskušali doseči z uporabo različnih kolon (dve proizvajalca Phenomenex: Luna Cig, 2,5 |xm, 100 x 2 mm I.D. ter Luna Ci8, 5 \xm, 150 X 3 mm I.D. in eno proizvajalca Waters: Xterra Cig, 5 \im, 100 x 2.1 mm). Najboljšo ločbo smo dosegli z uporabo Waters-ove kolone Xterra Cig 5 p.m 100 x 2.1 mm LD.
Mobilna faza je acetonitril in voda z dodatkom 0,1 % mravljične kisline. Ločba poteka 20 minut pri pretoku 0,3 mL/min. Injekcijski volumen je 10 ^L. Kromatografijo začnemo s 100 % vodne faze, po 7 minutah preidemo na 100 % organske faze in pri 16 minutah ponovno vzpostavmo začetno stanje.
Osnovni pogoji na masnem detektoiju so: ionizacija ESI+, kapilarna napetost 3,2 kV, temperatura izvora 120 ° C, desolvacijska temperatura 350 ° C, plin na stožcu 100 L/uro, desolvacijski plin 800 L/uro, CID plin je argon 3,2 x 10"^ barr. Mase in ostah pogoji so podani v Tabeli 1.
Tabela 1:
Analit	Rt	Prekurzor	Hčerinski ion	Napetost	Kohzijska
		(m/z)	(m/z)	na stožcu (V)	energija (eV)
Salinomicin-Na	11,34	773	431	60	52
		773	531	60	46
Monensin-Na	11,38	693	675	60	40
		693	461	60	55
Narasin-Na	11,69	787	431	60	52
		787	531	60	46
Maduramcin-NH4	11,90	934	629	28	28
		934	647	28	22
Nigericin-Na	12,21	747	729	50	55
interni standard					
Lasalocid-Na	12,96	613	377	60	40
		613	595	60	30
Za ekstrakcijo in čiščenje vzorcev smo želeli vpeljati hitro metodo z minimalno porabo organskih topil, zato smo se odločili, da bomo sledili postopku, ki ga uporabljajo v Centrabiem referenčnem laboratoriju za ostanke veterinarski zdravil v Berlinu (EU
^ Potrebno je napisati vsebinsko raziskovalno poročilo, kjer mora biti na kratko predstavljen program dela z raziskovalno hipotezo in metodološko-teoretičen opis raziskovanja pri njenem preveijanju ali zavračanju vključno s pridobljenimi rezultati projekta.
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007
Stran 4 od 12
Reference Laboratory for Residue of Veterinary Drugs). Omenjeni postopek smo prilagodili opremljenosti našega laboratorija in uvedli nekatere spremembe. Postopek čiščenja za jajca
Odtehtamo 2 g jajc in dodamo interni standard (nigericin-Na). Kokcidiostatike iz jajc ekstrahiramo s 5 mL acetonitrila. Uporabljamo električni stresalnik, ekstrakcija pa poteka 15 minut pri sobni temperaturi. Ekstrakt od vzorca ločimo s pomočjo centrifugiranja (10 min, 3000 rpm). Ekstrakt posušimo pod tokom dušika do suhega. Suhi ostanek raztopimo v deionizirani vodi (5 mL) in ga očistimo z uporabo 60 mg polimeme Strata-X SPE kolone (Strata-X, 33 |j.m. Polymeric Reversed Phase 60 mg/3 mL, Phenomenex). Pred uporabo kolono pripravimo s 3 mL metanola in nato še s 3 mL deionizirane vode, šele nato na kolono nanesemo vodno raztopino. Kolono speremo s 3 mL vode in jo nato posušimo do suhega s pomočjo vakuuma. Kokcidiostatike eluiramo iz kolone z metanolom (5 mL). Eluat posušimo pod tokom dušika do siihega in ostanek raztopimo v 0,5 mL mešanice acetonitrila in vode (50/50). Postopek čiščenja za jetra
Odtehtamo 2 g jeter in dodamo interni standard (nigericin-Na). Dodamo še 4 mL acetonitrila in vzorec homogeniziramo z Ultra-turraxom (1 min). Sledi centrifiigiranje (10 min, 3000 rpm, 4 ° C). Ekstrakt prelijemo v drugo epruveto, ostanku pa ponovno dodamo 2 mL acetonitrila in 15 min stresamo s stresalnikom. Ponovno centrifiigiramo in oddekantirana ekstrakta združimo. Dodamo 0,5 mL raztopine polietilenglikolov in ekstrakt posušimo pod tokom dušika do 0,5 mL. Ostanku dodamo 5 mL deionizirane vode in nadaljujemo s čiščenjem na polimemi Strata-X koloni enako kot pri jajcih. Koncentracijo kokcidiostatikov v vzorcu določimo s pomočjo umeritvene krivulje v matriksu. Pri umeritvenih krivuljah za jajca so korelacijski koeficienti (r) za vse testirane polietrske antibiotike večji od 0,99 v koncentracijskem območju od 1 do 80 fig/kg. Meje zaznav metode za vzorce jajc so 10 ^ig/kg za lasalocid, 5 jxg/kg za maduramicin in 3 ^g/kg za salinomicin, narasin in monensin. Meje zaznav za vzorce jeter pa so za lasalocid, monensin, salinomicin in narasin 10 p.g/kg, za maduramicin pa 25 ^g/kg. Meje vrednotenj metode za vzorce jajc pa 20 ^ig/kg za lasalocid, 10 |ag/kg za maduramicin in 5 )ig/kg za salinomicin, narasin in monensin. Meje vrednotenj za vzorce jeter so za lasalocid, monensin, salinomicin in narasin 20 |J.g/kg, za maduramicin pa 50 jig/kg. Izkoristki ekstrakcij so različni za različne polietrske antibiotike in se giblje med 50 in 80 % pri vzorcih jajc. Pri vzorcih jeter so doseženi izkoristki nekoliko slabši, okoH 40 % za vse testirane polietrske antibiotike.
Pravilnost postopka smo preverili s sodelovanjem v medlaboratorijski preiskovalni shemi (FAPAS, Proficiency Test 0286 in Proficiency Test 02103), saj za tovrstne substance nimamo certificiranih referenčnih materialov. Na žalost matriks ni bil jajce oz. jetra ampak meso pri obeh medlaboratorijskih shemah, tako da dobljeni rezultati za našo metodo služijo predvsem preveijanju glede pravilnosti identifikacije posameznega analita in principa vrednotenja. Rezultati so bili dobri, saj smo v obeh primerih izmed petih možnosti pravilno identificirali prisotne analite; v vzorcu 0286 lasalocid in salinomicin, v vzorcu 02103 pa narasin in nikarbazin. V vzorcu 0286 smo identificirah salinomicin v koncentraciji 29 ^g/kg (prava vsebnost 31,6 ^ig/kg) z z-skorom - 0,4 in lasalocid. Zaradi bimodelne porazdelitve rezultatov pri lasalocidu, nimamo podatkov o pravi vsebnosti le-tega. V vzorcu 02103 pa smo identificirah narasin v koncentraciji 46 ^g/kg (prava vsebnost 56,6 ^ig/kg) z z-skorom -0,9 in nicarbazin v koncentraciji 200 |ag/kg (prava vsebnost 203 |ig/kg) z z-skorom -0,1.
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007	Stran 5 od 12
Določanje nitroimidazolov v jačih
Nitroimidazole določamo v našem laboratoriju s HPLC-DAD metodo. Odločili smo se za validacijo že obstoječe metode in za vpeljavo potrditvene metode na LC-MS/MS. Glede priprave vzorcev, ekstrakcije analitov iz vzorcev in čiščenja ekstraktov, smo sledili članku Sams-a s sodelavci ( Sams in sod. Analyst, 1998), kroraatografsko ločbo pa smo optimizirali. Vpeljava LC-MS/MS
Preverili smo ali je postopek čiščenja, ki ga uporabljamo za določanje nitroimidazolov s HPLC-DAD metodo, primeren tudi za potrditveno metodo z LC-MS/MS in ugotovili da je. Uvedli smo LC-MS/MS metodo za potrditev nitroimidazolov v jajcih. Najboljšo kromatografsko ločbo smo dosegli z uporabo kolone Waters (Xterra Cis, 5 j.im 100 x 2.1mm LD.). Kot mobibio fazo smo uporabljali acetonitril in deionizirano vodo z 0,1 % mravljične kisline. Pretok je 0,3 mL/min, injekcijski volumen 10 \iL. Detekcija poteka z masnim spektrometrom pod sledečimi pogoji: ionizacija ESI+, kapilarna napetost 4,0 kV, temperatura izvora 120 ° C, desolvacijska temperatura 350 ° C, plin na stožcu 100 L/uro, desolvacijski plin 800 L/uro, CID plin je argon 3,2 x 10"^ barr. Kot interni standard uporabljamo dimetridazol-d3 in ronidazol-d3.
Mase so sledeče: za dimetridazol (DMZ) je prekursor 142, dva hčerinska iona pa 96 in 81, za ronidazol (RNZ) 201 in 140 ter 110, za metronidazol (MNZ) 172 ter 128 in 82, za hidroksimetronidazol (MNZ-OH) 188 in 144 ter 126, za hidroksidimetridazol (DMZ-OH), ki je skupen metabolit DMZ in RNZ, 158 ter 140 in 110, za dimetridazol-d3 je perkursor 145 in hčerinski ion 99 ter za ronidazol~d3 204 in hčerinski ion 143. Validacija HPLC-DAD metode
Kratek opis postopka priprave vzorcev: ekstrakcija z acetonitrilom, čiščenje ekstrakta na koloni polnjeni z močnim kationskim izmenjevalcem, koncentriranje na 0,4 mL pod tokom dušika. Kromatografska ločba poteka na C-18 analitski koloni Synergi 4 Hydro-RP 80A (Phenomenex, 4|am, 250 x 4,6 mm LD.) uporabljena predkolona je polnjena s C-18 pobiilom (Phenomenex, 4,0 x 3,0 mm I.D.). Mobilna faza je mešanica acetonitrila z acetatnim pufrom pH 4,3. Pretok mobihie faze je 1 mL/min, injekcijski volumen vzorca je 100 \iL.
Parametri dobljeni pri validaciji so
Umeritvene krivulje standardnih raztopin so v območju od 6,25 ng/mL do 150 ng/mL linearne s korekcijskimi koeficienti 0,99995 za MNZ-OH, 0,99999 za DMZ-OH, 0,99999 za MNZ, 0,99999 za RNZ in 0,99997 za DMZ.
Umeritvene krivulje v matriksu v koncentracijskem območju od 2 do 12 p.g/kg so linearne s korelacijskhni koeficienti 0,9998 za MNZ-OH, 0,9989 za DMZ-OH, 0,9962 za MNZ, 0,9988 za RNZ in 0,9943 za DMZ.
Vahdacijo smo opraviH po zahtevah Evropske direktive 2002/657/EC na treh koncentracijskih nivojih, z uporabo metode s standardnimi dodatki 2, 4 in 6 \ig/k§, posameznega nitroimidazola v jajcu. Dobljene podatke smo obdelali z uporabo statistične metode opisane v ISO 5725-2:1994.
Izkoristki postopka, standardne deviacije ponovljivosti (s) in standardne deviacije obnovljivosti (Sw), meje ponovljivosti (r) in meje znotraj laboratorijske obnovljivosti (Rw) So prikazane v tabelah od 2 do 4 za posamezni koncentracijski nivo. Merilne negotovosti pri konc. 2 \xg/kg so ±1,4 \xg/k$ za MNZ-OH, ±0,8 ^g/kg za DMZ-OH, ±0,6 |ag/kg za MNZ, ±1,1 \ig/kg za RNZ in ±0,6 ^g/kg za DMZ.
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007	Stran 6 od 12
Tabela 2: Validaciiski parametri za koncentracijo 2 i^g/kg						
Nitroimidazol	Izkoristek %	s	r	Sw	Rw	
MNZ-OH	58,97	0,08	0,22	0,23	0,62	
DMZ-OH	62,83	0,11	0,31	0,15	0,41	
MNZ	67,33	0,11	0,31	0,14	0,39	
RNZ	59,87	0,11	0,31	0,12	0,33	
DMZ	61,33	0,11	0,29	0,18	0,50	
Tabela 3: Validaciiski parametri za koncentracijo 4 |ag/kg						
Nitroimidazol	Izkoristek %	s	r	Sw	Rw	
MNZ-OH	65,67	0,36	0,99	0,70	1,94	
DMZ-OH	62,77	0,13	0,36	0,15	0,41	
MNZ	72,17	0,19	0,54	0,25	0,69	
RNZ	67,80	0,35	0,97	0,45	1,25	
DMZ	53,77	0,27	0,74	0,31	0,85	
Tabela 4: Validaciiski parametri za koncentracijo 6 |ag/kg						
Nitroimidazol	Izkoristek %	s	r	Sw	Rw	
MNZ-OH	55,33	0,20	0,54	0,30	0,85	
DMZ-OH	58,17	0,18	0,49	0,43	1,21	
MNZ	63,50	0,16	0,45	0,61	1,68	
RNZ	61,70	0,47	1,29	0,55	1,51	
DMZ	50,53	0,29	0,80	0,49	1,35	
Pravilnost postopka smo preverili s sodelovanjem v medlaboratorijski preiskovalni shemi (FAPAS, Proficiency Test 0296), saj za tovrstne substance nimamo certificiranih referenčnih materialov. Identificirati in kvantitativno določiti je bilo potrebno nitroimidazole (DMZ, RNZ, MNZ in metabolita DMZ-OH in MNZ-OH) v vzorcu jajc. Vpelj ana metoda seje izkazala kot primerna za pravilno identifikacij o prisotnih nitroimidazolov, kvantitativno pa smo vsebnost ovrednotili z metodo HPLC-DAD. V vzorcu smo identificirali DMZ v koncentraciji 2,1 |ig/kg (prava vsebnost 2,64 ^g/kg) z z-skorom - 0,9, RNZ v koncentraciji 15,7 |xg/kg (prava vsebnost 13,9 M-g^g) 2 z-skorom 0,6 in njun metabolit DMZ-OH v koncentraciji 15,8 i^g/kg (prava vsebnost 14,7 M-g/kg) z z-skorom 0,3.						
Literatura: Sams MJ, Strutt PR, Barnes KA, Damant AP, Rose MD (1998) Determination of dimetridazole, ronidazole and their common metabolite in poultry muscle and eggs by high performance liquid chromatography with UV detection and confirmatory analysis by atmospheric pressure chemical ionisation mass spectrometry. Analyst, 123, 2545-2549.						
Presejalna mikrobiološka metoda ugotavljanja tetraciklinov v mleku						
Na podlagi literatumih podatkov, informacij o registriranih in najpogosteje uporabljanih antibiotikih pri nas ter poskusov v našem laboratoriju smo izbrali reprezentativne predstavnike skupine tetraciklinov: tetraciklin, oksitetraciklin in klortetraciklin. Določili						
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007
Stran 7 od 12
smo občutljive in rezistentne seve bakterij, ki se pri nas uporabljajo za mikrobiološko presejalno metodo ugotavljanja antibiotikov v živilih živalskega izvora. Najobčutljivejši mikroorganizem na tetracikline je Bacillus cereus ATCC 11778, rezistentni pa so Kocuria rhizophilla ATCC 9341, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 m Escherichia coli ATCC 10536. Optimizirali smo tudi pripravo gojišč. Izbrali smo Antibiotic agar No. 1 in 2, s pH 6 in 8, proizvajalca Merck, uvedli postopek priprave testnih sevov mikroorganizmov in kontrolo rasti.
Nadalje smo s poskusi ugotavljali vpliv pH-ja analiziranega vzorca, priprave vzorca in matriksa samega na velikost con zavirane rasti mikroorganizmov. Lažne pozitivne rezultate smo preprečiU s segrevanjem vzorca na 80 ° C za 5 minut. Testirah smo odzivnost metode pri MRL-vrednosti, to je pri koncentraciji 100 |ag/L, klortetraciklina, tetraciklina in oksitetraciklina v mleku (10 ponovitev). Pri vseh treh tetraciklinih in pri vseh vzorcih smo lahko izmerili velikosti con zavrtja rasti mikroorganizmov, vrednosti RSD so znašale za tetraciklin 2,0 %, za klortetraciklin 7,7 % in za oksitetraciklin 5,3 %. Ugotovih smo, da za klortetraciklin dosežemo bistveno manjšo mejo zaznave od ostalih tetraciklinov in sicer 20 |xg/L z vrednostjo RSD 3,0 %.
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007	Stran 8 od 12
3. Izkoriščanje dobljenih rezultatov:
3.1, Kakšen je potencialni pomen^ rezultatov vašega raziskovalnega projekta za:
a) odkritje novih znanstvenih spoznanj; X b) izpopolnitev oziroma razširitev metodološkega instrumentarij a;
c)	razvoj svojega temeljnega raziskovanja;
d)	razvoj drugih temeljnih znanosti;
X e) razvoj novih tehnologij in drugih razvojnih raziskav.
3.2. Označite s katerimi družbeno-ekonomskimi cilji (po metodologiji OECD-ja) sovpadajo rezultati vašega raziskovalnega projekta:
X a) razvoj kmetijstva, gozdarstva in ribolova - Vključuje RR, ki je v osnovi namenjen razvoju in podpori teh dejavnosti;
b)	pospeševanje industrijskega razvoja - vključuje RR, ki v osnovi podpira razvoj industrije, vključno s proizvodnjo, gradbeništvom, prodajo na debelo in drobno, restavracijami in hoteli, bančništvom, zavarovalnicami in drugimi gospodarskimi dejavnostmi;
c)	proizvodnja in racionalna izraba energije - vključuje RR-dejavnosti, ki so v fimkciji dobave, proizvodnje, hranjenja in distribucije vseh oblik energije. V to skupino je treba vključiti tudi RR vodnih virov in nuklearne energije;
d)	razvoj infrastrukture - Ta skupina vključuje dve podskupini:
•	transport in telekomunikacije - Vključen je RR, ki je usmeijen v izboljšavo in povečanje varnosti prometnih sistemov, vključno z varnostjo v prometu;
•	prostorsko planiranje mest in podeželja - Vključen je RR, ki se nanaša na skupno načrtovanje mest in podeželja, boljše pogoje bivanja in izboljšave v okolju;
e)	nadzor in skrb za okolje - Vključuje RR, ki je usmeijen v ohranjevanje fizičnega okolja. Zajema onesnaževanje zraka, voda, zemlje in spodnjih slojev, onesnaženje zaradi hrupa, odlaganja trdnih odpadkov in sevanja. Razdeljen je v dve skupini:
X f) zdravstveno varstvo (z izjemo onesnaževanja) - Vključuje RR - programe, ki so usmerjeni v varstvo in izboljšanje človekovega zdravja;
g)	družbeni razvoj in storitve - Vključuje RR, ki se nanaša na družbene in kulturne probleme;
h)	splošni napredek znanja - Ta skupina zajema RR, ki prispeva k splošnemu napredku znanja in ga ne moremo pripisati določenim ciljem;
i)	obramba - Vključuje RR, ki se v osnovi izvaja v vojaške namene, ne glede na njegovo vsebino, ali na možnost posredne civilne uporabe. Vključuje tudi varstvo (obrambo) pred naravnimi nesrečami.
Označite lahko več odgovorov. Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007	Stran 9 od 12
3.3. Kateri so neposredni rezultati vašega raziskovalnega projekta glede na zgoraj označen potencialni pomen in razvojne cilje?
Z vpeljanimi postopki določanja polietrskih antibiotikov v jajcih in jetrih smo omogočili izvajanje monitoringa na le-te z uporabo okolju bolj prijaznih kemikalij, volumni uporabljenih organskih topil so manjši, kar vse vpliva na zmanjšanje onesnaževanja okolja. Poleg tega postopek omogoča obdelavo večjega števila vzorcev istočasno in s tem lahko hitreje opravljamo preiskave za potrebe nadzora ostankov veterinarsko-medicinskih pripravkov v živilih živalskega izvora. Istočasno pa so meje zaznav nižje, s tem smo povečali sposobnost ugotovitve nizkih količin ostankov pohetrskih antibiotikov predvsem v jajcih in tako lahko pozitivno vplivamo na zagotavljanje zdravstvene neoporečnosti zadevnih živil. Postopek je sedaj pripravljen za validacijo.
Z validacijo HPLC-DAD postopka določanja nitroimidazolov v jajcih po Odločbi 2002/657/EC smo izpobiili zahteve za izvajanje tovrstnih preiskav, postopek je pripravljen za akreditacijo. Istočasno smo tudi vpeljaU potrditveno metodo na LC-MS/MS, saj je potrditev z masno detekcijo za substance iz Aneksa IV Evropske direktive 2377/90, kamor so uvrščeni nitroimidazoH, nujna in predpisana z Odločbo 2002/657/EC. Validiraii smo mikrobiološko presejalno preiskavo določanja tetraciklinov v mleku in tako izpolnili zahteve za izvajanje tovrstnih preiskav za potrebe monitoringa nad ostanki veterinarsko-medicinskih pripravkov v živilih.
Z vpeljanimi metodami je izboljšan nadzor nad ostanki zadevnih substanc v živilih in s tem na neoporečnost živil živalskega izvora. _
3.4. Kakšni so lahko dolgoročni rezultati vašega raziskovalnega projekta glede na zgoraj označen potencialni pomen in razvojne cilje?
Z omenjenimi postopki bomo lažje izpolnjevali zahteve postavljene za opravljanje preiskav za potrebe monitoringa nad veterinarsko-medicinskimi pripravki v živilih živalskega izvora. Postopki so tudi uporabni pri študijah kopičenja in izločanja zadevnih učinkovin v različnih tkivih pri živalih, katerim smo učinkovino aplicirali. Metode lahko tudi uporabljamo za študije obstojnosti ostankov v tkivih teh živah.
3.5. Kje obstaja veijetnost, da bodo vaša znanstvena spoznanja deležna zaznavnega odziva?
X a) v domačih znanstvenih krogih; X b) v mednarodnih znanstvenih krogih; X c) pri domačih uporabnikih;
d) pri mednarodnih uporabnikih.
3.6. Kdo (poleg soFmanceqev) že izraža interes po vaših spoznanjih oziroma rezultatih?
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007	Stran 10 od 12
3.7. Število diplomantov, magistrov in doktoijev, ki so zaključili študij z vključenostjo v raziskovalni projekt?_
4. Sodelovanje z tujimi partnerji:
4.1. Navedite število in obliko formalnega raziskovalnega sodelovanja s tujimi raziskovalnimi institucijami.
4.2. Kakšni so rezultati tovrstnega sodelovanja?
5. Bibliografski rezultati^:
Za vodjo projekta in ostale raziskovalce v projektni skupini priložite bibliografske izpise za obdobje zadnjih treh let iz COBISS-a) oz. za medicinske vede iz Inštituta za biomedicinsko informatiko. Na bibliografskih izpisih označite tista dela, ki so nastala v okviru pričujočega projekta.
Bibliografijo raziskovalcev si lahko natisnete sami iz spletne stiam:http:/www.izum.si/
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007	Stran 11 od 12
6. Druge reference'^ vodje projekta in ostalih raziskovalcev, ki izhajajo iz
raziskovalnega projekta:____
Postopek Določanje nitroimidazolov s HPLC-DAD je bil v letu 2007 presojan s strani Slovenske akreditacije in je trenutno v postopku pridobitve fleksibilne akreditacije za krvno plazmo. S tem so postavljeni pogoji za širitev akreditacije tudi na jajca.
Navedite tudi druge raziskovalne rezultate iz obdobja financiranja vašega projekta, ki niso zajeti v bibliografske izpise, zlasti pa tiste, ki se nanašajo na prenos znanja in tehnologije.
Navedite tudi podatke o vseh javnih in drugih predstavitvah projekta in njegovih rezultatov vključno s predstavitvami, ki so bile organizirane izključno za naročnika/naročnike projekta.
Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP-2007	Stran 12 od 12
V4-0320
Uvedba in validacija metod določanja ostankov nekaterih veterinarskih zdravil v živilih živalskega izvora
Določanje polietrskih antibiotikov z LC-MS/MS
Uvedli smo LC-MS/MS metodo določanja polietrskih antibiotikov salinomicina, monensina, lasalocina, narasina in dodatno maduramicina za jajca in jetra. Ekstrakcijo in čiščenje ekstraktov, smo povzeli po postopku, ki ga uporabljajo v CRL v Berlinu (EU Reference Laboratory for Residue of Veterinary Drugs), ter jo nekoliko modificirali. Kot interni standard smo uporabili nigericin. Spojine smo iz vzorca ekstrahirali z acetonitrilom in ekstrakt očistili na polimemi Strata-X SPE koloni. Kromatografsko ločbo smo izvedli na Waters-ovi koloni Xterra Cig 5 [im 100 x 2.1 mm LD., z uporabo gradientne mobilne faze sestavljene iz acetonitrila in vode z 0,1 % mravljične kisline. Meritve so potekale na masnem spektrometru z elektrosprej pozitivno ionizacijo. Pri vsaki spojini smo merili dva karakteristična ionska prehoda. Vsebnosti smo določali z umeritvenimi krivuljami v matriksu, ki so bile vse linearne (r > 0,99) v območju od 1 do 80 f^g/kg. Meje zaznav in vrednotenj za jajca so bile 10 in 20 |ig/kg za lasalocid, 5 in 10 |ag/kg za maduramicin in 3 ter 5 |ag/kg za salinomicin, narasin in monensin, za jetra pa za lasalocid, monensin, salinomicin in narasin 10 ter 20 }ig/kg, za maduramicin pa 25 ter 50 [ig/kg. Izkoristki so se gibali med 50 in 80 % pri jajcih, za jetra pa okoli 40 %. Pravilnost postopka smo preverili s sodelovanjem v medlaboratorijski preiskovalni shemi FAP AS. Določanje nitrolmidazolov v jacih
Validirali smo postopek določanja nitroimidazolov (dimetridazola - DMZ, ronidazola - RNZ, metronidazola - MNZ, hidroksidimetridazola ~ DMZOH in hidroksimetronidazola -MNZOH) v jajcih s HPLC-DAD metodo po zahtevah Evropske direktive 2002/657/EC na treh koncentracijskih nivojih (2, 4 in 6 f^g/kg). Dobljene podatke smo obdelali z uporabo statistične metode po ISO 5725-2:1994. Ekstrakcijo in čiščenje smo izvedh po članku Sams-a s sodelavci ( Sams in sod. 1998, Analyst, 123, 2545-2549.) ter optimizirali kromatografsko ločbo. Analite smo ekstrahirali iz vzorca z acetonitrilom, očistilili ekstrakt na koloni z močnim kationskim izmenjevalcem Strata 8B in uparili eluat na manjši volumen. Za kromatografsko ločbo smo uporabili analitsko kolono Synergi 4 Hydro-RP 80A, mobilna faza je bila mešanica acetonitrila in acetatnega pufra. Umeritvene krivulje standardnih raztopin in umeritvene krivulje v matriksu so bile vse linearne (r > 0,99) v območju od 2 do 12 lag/kg . Merilne negotovosti pri konc. 2 |Xg/kg so bile od ±0,6 do ±1,4 M-g/kg, izkoristki metode od 50,5 do 72,2 %. Za potrditev smo uvedli LC-MS/MS metodo na analitski koloni Waters (Xterra Cig, 5 )im 100 x 2.1mm I.D.), z mobilno fazo acetonitril in deionizirano vodo z 0,1 % mravljične kisline. Potrditev je potekala na masnem spektrometru z elektrosprej pozitivno ionizacijo. Kot interna standarda smo uporabili dimetridazol-d3 in ronidazol-d3. Pravilnost postopka smo preverili s sodelovanjem v medlaboratorijski preiskovalni shemi FAP AS.
Presejalna mikrobiološka metoda ugotavljanja tetraciklinov v mleku
Validirali smo metod s tetraciklinom, oksitetraciklinom in klortetraciklinom. Testirali smo odzivnost metode pri MRL-vrednosti, to je pri koncentraciji 100 \ig/L v mleku. Pri vseh treh tetraciklinih smo pri tej koncentraciji lahko izmerili zavorne cone rasti mikroorganizmov, vrednosti RSD so za tetraciklm 2,0 %, za klortetraciklin 7,7 % in za oksitetraciklin 5,3 %. Klortetraciklin doseže bistveno manjšo mejo zaznave od ostalih tetraciklinov in sicer 20 |xg/L z vrednostjo RSD 3,0 %.
V4-0320
Introduction and validation of some methods for the detection of certain veterinary drugs in food of animal origin
Determination of polyether antibiotics by liquid chromatography-tandem mass spectrometry
A liquid chromatography in combination with tandem mass spectrometry (MS-MS) method for determination of polyether antibitics salinomycin, monensin, lasalocid, narasin and maduramicin for eggs and liver was introduced. The extraction and clean up followed the procedure used in EU Reference Laboratory for Residue of Veterinary Drugs in Berlin, with some modifications. The used internal standard was nigericin. After the extraction with acetonitrile clean up on polymer Strata-X SPE cartridge followed. Chromatography was performed on Waters analytical column Xterra Cig 5 \im 100 x 2.1 mm I.D., the mobil phase was acetonitrile and water with 0.1 % formic acid, using gradient mode. Measurements were done with electrospray ionization MS-MS in positive ion mode optimized for the five compounds, monitoring two characteristic mass transitions simultaneously for each analyte. Quantification was done using calibration curves in matrix, all were linear (r > 0,99) from 1 to 80 i^g/kg. Limits of detection aad of quantification for eggs were 10 and 20 i^g/kg for lasalocid, 5 and 10 |ag/kg for maduramicin and 3 and 5 for salinomycin, narasin and monensin, for liver were for lasalocid, monensin, salinomycin and narasin 10 and 20 |ig/kg, for madiiramicin 25 and 50 i^g/kg. Recoveries ranged fi'om 50 to 80 % for eggs, and for liver around 40 %. Trueness of the procedure was checked by participation in the proficiency ring testFAPAS.
Determination of nitroimidazoles in eggs
The HPLC-DAD method for nitroimidazoles (dimetridazole - DMZ, ronidazole - RNZ, metronidazole - MNZ, hidroksidimetridazole - DMZOH and hidroksimetronidazole -MNZOH) determination in eggs was validated following Commission Decision 2002/657/EC at three concentration levels (2, 4 in 6 |ig/kg). The achieved data were calculated using the statistical tools ISO 5725-2:1994. Extraction and clean up followed the article of Sams with CO workers (Sams and all. 1998, Analyst, 123, 2545-2549.) and the chromathography separation was optimised. Analytes were extracted with acetonitrile, clean up was done on a cation-exchange cartridge Strata SB, and evaporation followed. Analytical colunrn Synergi 4 |j. Hydro-RP 80A was used for chromatographic separation with acetonitrile and acetic buffer as mobile phase. All calibration curves of standard solutions and in matrix were linear (r > 0,99) in conc. range fi:om 2 do 12 |ag/kg in eggs. Measurement uncertainty at 2 |ig/kg were from ±0,6 to ±1,4 jag/kg, recoveries fi-om 50.53 to 72.17 %. For confirmation liquid chromatography with electrospray ionization MS-MS in positive ion mode on analytical column Waters (Xterra Cig, 5 jam 100 x 2.1mm LD.), using acetonitrile and water with 0.1 % formic acid as mobile phase was developed. The conditions were optimized for the five compounds, monitoring two characteristic mass transitions simultaneously for each analyte. As internal standards dimetridazole-d3 and ronidazol-d3 were used. Trueness of the procedure was checked by participation in the proficiency ring test FAP AS. Microbiological screening assay for tetracyclines determination in milk The method was validated with tetracycline, Oxytetracycline and Chlortetracycline. The method was tested at MRL-level, at 100 [ag/L in milk. For all tested tetracyclines the inhibition zones could be measured with RSD for tetracycline being 2.0 %, for Chlortetracycline 7.7 % and for Oxytetracycline 5.3 %. Essential lower detection limit was observed for Chlortetracycline in milk, 20 )j.g/L with RSD 3.0 %.