Oznaka poročila:ARRS-RPROJ-ZP-2014/56 ZAKLJUČNO POROČILO RAZISKOVALNEGA PROJEKTA A. PODATKI O RAZISKOVALNEM PROJEKTU 1.Osnovni podatki o raziskovalnem projektu Šifra projekta J3-3632 Naslov projekta Molekularne lastnosti fuzijske pore Vodja projekta 3702 Robert Zorec Tip projekta J Temeljni projekt Obseg raziskovalnih ur 7560 Cenovni razred C Trajanje projekta 05.2010 - 04.2013 Nosilna raziskovalna organizacija 1683 CELICA, biomedicinski center, d.o.o. Raziskovalne organizacije -soizvajalke Raziskovalno področje po šifrantu ARRS 3 MEDICINA 3.03 Nevrobiologija Družbenoekonomski cilj Medicinske vede - RiR financiran iz drugih virov (ne iz SUF) Raziskovalno področje po šifrantu FOS 3 Medicinske vede 3.05 Druge medicinske vede B. REZULTATI IN DOSEŽKI RAZISKOVALNEGA PROJEKTA 2.Povzetek raziskovalnega projekta1 SLO Na področju nevrobiologije je ključni problem, ki ga je treba rešiti, razumevanje mehanizma signalne transdukcije v kemični sinapsi in mehanizma sproščanja hormonov iz nevroendokrinih celic. Pri obeh procesih igrajo pomembno vlogo sekretorni mešički, v katerih so shranjeni kemični prenašalci in hormoni. Proces sproščanja vsebine mešičkov se imenuje eksocitoza. Zlivanje membrane mešička s plazmalemo se začne z vzpostavitvijo ozkega kanala - fuzijske pore, ki poveže notranjost mešička z zunajceličnim prostorom. Pretekle raziskave kažejo, da mehanizem nastanka fuzijske pore poteka v dveh stopnjah. V prvi stopnji nastane metastabilno stanje ozke fuzijske pore, ki ji sledi druga stopnja, nenadna razširitev. Natančni molekularni mehanizem, ki vodi ta proces, ni znan. Predvsem je pomanjkljivo poznavanje zgradbe fuzijske pore in vloga posameznih proteinov in drugih molekul pri nenadni razširitvi fuzijske pore. V raziskavi smo preverili vlogo nekaterih proteinov in lipidov pri procesu fuzije. Raziskave smo opravili na podganjih laktotrofih z elektrofiziološkimi metodami, konfokalno mikroskopijo, mikroskopijo s strukturiranim osvetljevanjem ter metodami molekularne biologije. Prednost laktotrofov pred živčnimi celicami je izredno pogosta prehodna fuzija, medtem ko je v živčnih celicah preredka, da bi lahko zagotavljala zanesljive eksperimentalne podatke. Po drugi strani pa so v obeh modelih prisotne podobne oblike proteinov, ki sodelujejo pri fuziji. Zlivanje bioloških membran je energetsko zahteven proces, za katerega se najverjetneje pridobi energija z nastankom kompleksa SNARE. Kompleks se začne sestavljati z interakcijo vijačnih domen proteinov na N-koncu in nadaljuje s prepletanjem vijačnih domen proti C-koncu. Rezultati raziskav kažejo, da je nastanek kompleksa SNARE verjetno uravnavan tudi s proteini Sec1/Munc 18 (proteini SM), in sicer prek interakcije s sintaksinom1, ki je eden od proteinov SNARE. Rezultati amperometričnih raziskav so pokazali, da naj bi SM proteini vplivali na stabilnost fuzijske pore. To smo preverili z visoko ločljivimi meritvami membranske kapacitivnosti. Ta metoda nam omogoča neposredno spremljanje lastnosti fuzijske pore tudi pri prehodni fuziji. V raziskavi smo preučili, kako mutacije posameznih proteinov SM vplivajo na sintaksin1 in posredno na nastanek kompleksa SNARE. Spremljali smo, kako posamezne mutacije proteina Munc18-1, ki vplivajo na različne stopnje nastanka kompleksa SNARE, spremenijo lastnosti fuzijske pore. Naši poskusi so osvetlili morebitno vlogo proteinov SM pri regulaciji kinetike in prevodnosti fuzijske pore. S tem smo potrdili, da je sproščanje vsebine mešičkov pri prehodni fuziji lahko regulirano tudi na ravni lastnosti fuzijske pore. Poleg tega smo preverili tudi vlogo nekaterih lipidov in sekundarnega obveščevalca cAMP pri lastnostih elementarne fuzije posameznih mešičkov s plazmalemo. ANG A key problem to be solved in neurobiology is to understand the mechanism of signal transduction in a chemical synapse and the release of hormones from neuroendocrine cells. In both cases, the critical process involves vesicles in which the chemical messengers and hormones are stored. The release of vesicle cargo to the extracellular medium is mediated by exocytosis, the merger of vesicular and plasma membranes, which leads to the formation of a fusion pore, an aqueous channel providing a conduit through which secretory products exit cells. Studies point to a two-stage mechanism of fusion pore formation - an initially metastable narrow fusion pore is followed by a sudden enlargement. However, the molecular mechanisms governing this process are unclear. Specifically, we lack an insight into the nature of the supramolecular structure of the fusion pore and how specific proteins and other fusion pore associated molecules modulate the rapid transition of the fusion pore from a relatively impermeable to a fully permeable state. To understand the fusion pore mechanisms we studied the role of several proteins at the level of a single fusion pore in pituitary lactotrophs by electrophysiological, optical and molecular biology approaches. The advantage of using lactotrophs as a model system over neurones is that the transient fusion pores in lactotrophs exhibit a remarkable robust stability, whereas in neurons this intermediate fusion state is too short to be reliably detected experimentally. SNARE proteins are thought to mediate membrane fusion by forming stable complexes which are initiated at their N-terminal ends and then progress towards the C-terminal membrane anchors (zippering), thereby releasing energy. This process appears to be modulated by SNARE-associated proteins such as Sec1/Munc 18 (SM proteins) via their interaction with specific SNARE partners, such as syntaxin1. Previous amperometric studies indicated that SM proteins may affect the stability of the fusion pore. However, the critical question is to directly monitor the fusion pore properties, which we did by high-resolution membrane capacitance technique. Our results confirm that the interactions between the SM proteins and SNARE complex proteins affect the physiological properties of the transient fusion pore, the intermediate state leading to full fusion. We studied how mutations of the SM proteins, affecting the SNARE protein syntaxin 1 at different stages of SNARE zippering, modulate the single fusion pore properties. We strongly believe that these results provide new direct evidence that transient fusion pore properties are subject to physiological regulation in terms of kinetics and fusion pore diameter by the SM proteins. Additionally, we confirmed that cholesterol, extracellular sphingosine and cAMP likely affect kinetics and fusion pore diameter of fusing secretory vesicles. 3.Poročilo o realizaciji predloženega programa dela na raziskovalnem projektu2 V prvem letu izvajanja raziskovalnega projekta smo v celoti uresničili specifični cilj (i). Optimizirali smo pripravo primarne kulture podganjih laktotrofov, da smo dobili kulturo s čim večjim deležom teh celic. Delež laktotrofov v kulturi smo določili tako, da smo laktotrofe označili s primarnimi protitelesi, ki prepoznajo prolaktin in fluorescentno označenimi sekundarnimi protitelesi, ki prepoznajo primarna protitelesa. Delež fluorescentno označenih celic, smo določili s konfokalnim mikroskopom, in sicer je ta bil ~90 %. Z metodo dvojnega označevanja s specifičnimi protitelesi, ki prepoznajo Munc18-1 in sintaksini smo označili omenjena proteina v podganjih laktotrofih. Nato smo s konfokalnim mikroskopom potrdili, da se Munc18-1 in sintaksini nativno izražata v podganjih laktotrofih. Nadalje smo ugotovili, da se znotrajcelična razporeditev obeh proteinov ujema s sekretornimi mešički, ki so prisotni ob plazmalemi. Sekretorni mešički laktotrofov vsebujejo peptidni hormon - prolaktin. Zato smo izvedli poskuse, v katerih smo z imunocitokemično metodo dvojnega označevanja (s protitelesi, ki prepoznajo prolaktin in Munc18-1 oz. sintaksin1) preverili prekrivanje signala Munc18-1 in sintaksina1 s sekretornimi mešički. Stopnjo kolokalizacije slikovnih elementov dveh fluorescenčno označenih proteinov smo določili z računalniškim programom ColocANA, ki avtomatsko sešteje območje slikovnih elementov nad določeno pražno vrednostjo za vsak posamezen kanal zajemanja slike. Enako naredi še za dele celice, ki so označeni z obema barvama (rdečo in zeleno) ter izračuna število vseh zelenih, rdečih in kolokaliziranih slikovnih elementov (rdečih in zelenih hkrati) v vsaki sliki. Začeli smo z uresničevanjem specifičnih ciljev raziskave (ii), ki vključujejo elektrofiziološko metodo spremljanja membranske kapacitivnosti v majhni krpici membrane. S to metodo lahko določimo lastnosti (kinetiko in prevodnost) fuzijske pore. Omenjeno metodo smo optimizirali, tako da smo ugotovili najprimernejše parametre za ta tip meritev. Elektrofiziološke meritve smo opravili s pomočjo steklene mikropipete (s premerom odprtine približno 1 pm), s katero smo izolirali krpico membrane. Na pipeto smo dovedli sinusno napetost (1591 Hz, 111 mV r.m.s.), medtem ko je bil potencial pipete nastavljen na 0 mV. Merjeni signal smo vodili na fazno občutljivi ojačevalnik (SWAM IIC, Celica, Slovenija), katerega izhoda dajeta Realno (Re) in Imaginarno (Im) komponento sinusnega toka. Fazno občutljivi ojačevalnik loči ortogonalni komponenti, saj je Im komponenta v fazi z napetostjo, Re pa je zamaknjena za n/2. Re komponenta signala med drugim odraža prevodnost plazmaleme, medtem ko je Im komponenta sorazmerna kapacitivnosti plazmaleme. Oba signala smo vzorčili prek A/D pretvornika (National Instruments, ZDA) in dobljene vrednosti zajemali s pomočjo računalniškega programa Cell (Celica, Slovenija) na osebni računalnik. Steklene mikropipete smo pripravili iz borosilikatnih kapilar z notranjim filamentom (Clark Electromedical, Velika Britanija) s pomočjo vlačilca pipet (Palmer Bioscience, Velika Britanija). Pred uporabo smo mikropipete zgladili ob razžarjeni žici in jih obdali s Sylgardom (Midland, USA). Mikropipete smo napolnili z zunajcelično raztopino in jih vstavili v sondo, v kateri je bila Ag/AgCl elektroda. V merilno kamrico smo namestili krovno stekelce s celicami in dodali 200 pl zunajcelične raztopine. Nato smo s pomočjo mikromanipulatorja (Eppendorf, Nemčija) v zunajcelično raztopino potopili mikropipeto in ji izmerili upornost (upornost mikropipet je bila 2-4 MQ). Mikropipeto smo previdno privedli do celice, se je dotaknili in jo s podtlakom zapečatili. Z elektronskim vezjem "C-fast" smo kompenzirali raztreseno kapacitivnost pipete in vhoda sonde. Pravilno nastavitev faznega kota smo med merjenjem s proženjem kalibracijskih pulzov znane amplitude (10 fF) preverjali vsakih deset sekund. Kalibracijski pulz predstavlja dodajanje kapacitivnostnega artefakta v ojačevalniku. Pri pravilni nastavitvi faznega kota se kalibracijski pulzi odražajo le na delu signala Im, ne pa tudi na delu Re. Izvedli smo tudi preliminarne elektrofiziološke meritve kapacitivnosti, s katerimi želimo določiti lastnosti (kinetiko in prevodnost) fuzijske pore v spontanih razmerah. V drugem letu izvajanja raziskovalnega projekta smo v celoti uresničili specifični cilj (ii). Z elektrofiziološko metodo spremljanja membranske kapacitivnosti v majhni krpici membrane smo spremljali lastnosti (kinetiko in prevodnost) fuzijske pore. Uporabili smo optimizirane parametre (optimizacija je potekala lansko leto) in povečali število poskusov, da smo lahko ovrednotili rezultate tretjega specifičnega cilja (vpliv treh različnih mutant Munc18-1 (E466K, R39C in P242S) na lastnosti fuzijske pore). Za celovito potrditev specifičnega cilja (iii) smo v tretjem letu potrdili hipotezo, da je fuzijska pora dinamičen kompleks, ki se lahko pred popolno fuzijo mešička ponavljajoče odpira do diskretnih vrednosti odvisnih od velikosti mešička in regulacije. Potrdili smo, da ima fuzijska pora pomembno regulacijsko vlogo pri uravnavanju sproščanja hormonov in živčnih prenašalcev. Rezultati so pokazali, da na uravnavanje fuzijske pore pomembno vplivajo Munc18-1 in proteini SNARE. Vsaj nekateri vpliva proteina Munc18-1 se nedvomno izrazijo prek kompleksa SNARE, oz. natančneje prek sintaksinal. Poleg vpliva na fuzijsko poro, smo uspeli dokazati tudi pomembno vlogo proteina Munc18-1 pri sidranju mešičkov prek vezi sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2, ki je stabilnejša od vezi sintaksinl-sinaptobrevin2. Munc18-1 pa se veže tudi na kompleks sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2, kar omogoči uravnavanje fuzijske pore. V zadnjem letu smo izvedli dodatne poskuse, ki so potrdili, da je za fuzijo mešičkov s plazmalemo pomembna velikost mešičkov. Nadalje smo nadgradili rezultate prejšnjih let in pokazali, da imajo poleg proteinov pri fuziji mešičkov pomembno vlogo tudi lipidi, kot sta sfingozin in holesterol. Poskuse smo izvedli z metodo, ki smo jo izpopolnili v prvem letu projekta (elektrofiziološke meritve). Pri določanju vloge holesterola smo prvo pokazali, da deplecija holesterola z metilbetaciklodekstrinom rezultira v znižani pojavnosti eksocitoze. Z uporabo specifičnih inhibitorjev endocitoze (Dyngo 4a) smo pokazali, da je omenjeni vpliv na eksocitozo specifičen in ni posledica zmanjšane endocitoze. Vpliv sfingozina, ki deluje tako, da aktivira protein VAMP2 za združevanje kompleksa SNARE, na proces eksocitoze smo preverili elektrofiziološko, del poskusov pa je bil narejen tudi z visokoločljivostno mikroskopijo s strukturirano iluminacijo (SIM). Ti poskusi so prvi tovrstni poskusi. Ugotovili smo, da sfingozin in strukturni homolog fingolimod frekvenco prehodne in popolne fuzije mešičkov s plazmalemo. Pri tem so prešli mešički z večjim premerom v popolno fuzijo, manjši mešički pa so se zlivali s plazemsko membrano prehodno. Rezultati dobljeni z mikroskopijo SIM so pokazali, da je za od sfingozina odvisno eksocitozo, poleg ostalih dejavnikov, pomembna tudi velikost mešičkov. Preverili smo tudi, če na lastnosti fuzije mešičkov s plazmalemo vpliva sekundarni obveščevalec cAMP. Z našimi poskusi smo pokazali, lahko s specifičnimi inhibitorji in aktivatorji sinteze cAMP in analogi cAMP vplivamo na sproščanje hormona prolaktina iz laktotrofov, ki ta hormon sintetizirajo. Z elektrofiziološkimi meritvami kapacitivnosti smo pokazali, da se vpliv cAMP na eksocitozo odraža tudi na ravni posameznega mešička, in sicer prek spremenjenih lastnosti fuzijske pore. cAMP stabilizira fuzijske pore in s tem prehodni tip fuzije in mešičkom prepreči popolno zlitje s plazemsko membrano. Vsi rezultati poskusov so bili objavljeni v revijah z visokimi faktorji vpliva. Poleg tega smo objavili tudi pregledne članke, kjer smo naše izsledke umestili v kontekst že obstoječega znanja in natančno opisali metodo, ki smo jo pri projektu najpogosteje uporabili - visokoločljivostne meritve membranske kapacitivnosti. Opis omenjene metode je bil objavljen v reviji Nature Protocols. 4.Ocena stopnje realizacije programa dela na raziskovalnem projektu in zastavljenih raziskovalnih ciljev3 V sklopu raziskave smo si zastavili tri specifične cilje. V času trajanja projekta smo vse tri specifične cilje realizirali. Poleg realiziranih ciljev, so se tekom raziskave odpirala nova znanstvena vprašanja, kot npr. kakšna je vloga lipidov, sekundarnih prenašalcev (cAMP) ter velikosti mešičkov pri procesu eksocitoze. Tudi na ta dodatna vprašanja smo odgovorili. O uspešni realizaciji zastavljenih ciljev pričajo številni raziskovalni in pregledni članki v revijah z visokim faktorjem vpliva. Prav tako smo poskrbeli za diseminacijo rezultatov na mednarodnih konferencah (predavanja in posterji). Poseben poudarek smo dali tudi na izobraževanju mladih kadrov (mladi raziskovalci in diplomanti), ki smo jih uspešno pritegnili k raziskavam na raziskovalnemu projektu. Ocenjujemo, da smo vse zastavljene cilje, tako znanstvene kot družbeno koristne, presegli. 5.Utemeljitev morebitnih sprememb programa raziskovalnega projekta oziroma sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine4 Pri raziskovalnemu projektu ni prišlo do bistvenih odstopanj in sprememb od predvidenega programa raziskovalnega projekta. Sestava projektne skupine je ostala nespremenjena. 6.Najpomembnejši znanstveni rezultati projektne skupine5 Znanstveni dosežek 1. COBISS ID 30562009 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Dinamika fluktuacij površine membran v neuroendokrinih celicah, ki so posredovane s holesterolom ANG Cholesterol-mediated membrane surface area dynamics in neuroendocrine cells Opis SLO Holesterol je ključni element bioloških membran, vendar njegov vpliv na eksocitozo še ni povsem pojasnjen. Poskusi z metilbetaciklodekstrinom (MCD), ki povzroci deplecijo holesterola v membranah smo pokazali, da deplecija holesterola rezultira v znižanani pojavnosti eksocitoze. Z uporabo specifičnih inhibitorjev endocitoze (Dyngo 4a) smo pokazali, da je omenjeni vpliv MCD na eksocitozo specifičen in ni posledica zmanjšane endocitoze. ANG How cholesterol, a key membrane constituent, affects membrane surface area dynamics in secretory cells is unclear. Using methyl--cyclodextrin (MCD) to deplete cholesterol, we imaged melanotrophs from male Wistar rats in real-time and monitored membrane capacitance (Cm), fluctuations of which reflect exo- and endocytosis. Treatment with MCD reduced cellular cholesterol and caused a dose-dependent attenuation of the Ca2+-evoked increase in Cm (IC50 = 5.3 mM) vs. untreated cells. Cytosol dialysis of MCD enhanced the attenuation of Cm increase (IC50 = 3.3 mM), suggesting cholesterol depletion at intracellular membrane sites was involved in attenuating exocytosis. Acute extracellular application of MCD resulted in an immediate Cm decline, which correlated well with the cellular surface area decrease, indicating the involvement of cholesterol in the regulation of membrane surface area dynamics. This decline in Cm was three-fold slower than MCD-mediated fluorescent cholesterol decay, implying that the exocytosis is the likely physiological means for plasma membrane cholesterol replenishment. MCD had no effect on the specific Cm and the blockade of endocytosis by Dyngo 4a, confirmed by inhibition of dextran uptake, also had no effect on the time-course of MCD-induced Cm decline. Thus acute exposure to MCD evokes a Cm decline linked to the removal of membrane cholesterol, which cannot be compensated for by exocytosis. We propose that the primary contribution of cholesterol to surface area dynamics is via its role in regulated exocytosis. Objavljeno v Elsevier; Biochimica et biophysica acta. Molecular and cell biology of lipids; 2013; Vol. 1831, iss. 7; str. 1228-1238; Impact Factor: 4.134;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 3.263; A': 1; WoS: CQ, DA, DR; Avtorji / Authors: Rituper Boštjan, Chowdhury Haque Helena, Jorgačevski Jernej, Coorssen Jens R., Kreft Marko, Zorec Robert Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 2. COBISS ID 30620889 Vir: COBISS.SI Naslov SLO cAMP stabilizira fuzijske pore podganjih laktotrofov v kulturi ANG cAMP-mediated stabilization of fusion pores in cultured rat pituitary lactotrophs Opis SLO Pomemben intermediat pri eksocitozi predstavlja fuzijska pora. Na eksocitozo, in tudi fuzijsko poro, pomembno vpliva dvig znotrajcelične koncentracije kalcija. Tudi ostali sekundarni obveščevalci, kot npr. cAMP vplivajo na eksocitozo, njihov vpliv na fuzijsko poro pa ni znan. Z našimi poskusi smo pokazali, lahko s specifičnimi inhibitorji in aktivatorji sinteze cAMP in analogi cAMP vplivamo na sproščanje hormona prolaktina iz laktotrofov, ki ta hormon sintetizirajo. Z visokoločljivostnimi meritvami membranske kapacitivnosti pa smo pokazali, da se vpliv cAMP na eksocitozo odraža tudi na ravni posameznega mešička, in sicer prek spremenjenih lastnosti fuzijske pore. cAMP stabilizira fuzijskepore in s tem prehodni tip fuzije in mešičkom prepreči popolno zlitjo s plazemsko membrano. ANG Regulated exocytosis mediates the release of hormones and transmitters. The last step of this process is represented by the merger between the vesicle and the plasma membranes, and the formation of a fusion pore. Once formed, the initially stable and narrow fusion pore may reversibly widen (transient exocytosis) or fully open (full-fusion exocytosis). Exocytosis is typically triggered by an elevation in cytosolic calcium activity. However, other second messengers, such as cAMP, have been reported to modulate secretion. The way in which cAMP influences the transitions between different fusion pore states remains unclear. Here, hormone release studies show that prolactin release from isolated rat lactotrophs stimulated by forskolin, an activator of adenylyl cyclases, and by membrane-permeable cAMP analog (dbcAMP), exhibit a biphasic concentration dependency. Although at lower concentrations (2-10 m forskolin and 2.5-5 mm dbcAMP) these agents stimulate prolactin release, an inhibition is measured at higher concentrations (50 m forskolin and 1015 mm dbcAMP). By using high-resolution capacitance (Cm) measurements, we recorded discrete increases in Cm, which represent elementary exocytic events. An elevation of cAMP leaves the frequency of full-fusion events unchanged while increasing the frequency of transient events. These exhibited a wider fusion pore as measured by increased fusion pore conductance and a prolonged fusion pore dwell time. The probability of observing rhythmic reopening of transient fusion pores was elevated by dbcAMP. In conclusion, cAMP-mediated stabilization of wide fusion pores prevents vesicles from proceeding to the full-fusion stage of exocytosis, which hinders vesicle content discharge at high cAMP concentrations. The Society; The Journal of neuroscience; 2013; Vol. 33, iss. 18; str. 80688078; Impact Factor: 6.908;Srednja vrednost revije / Medium Category Objavljeno v Impact Factor: 3.574; A'': 1;A': 1; WoS: RU; Avtorji / Authors: Costa Calejo Ana-Isabel, Jorgačevski Jernej, Kucka Marek, Kreft Marko, Gongalves Paula P., Stojilkovic Stanko, Zorec Robert Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 3. COBISS ID 30722265 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Velikost mešičkov vpliva na elementarne lastnosti fuzije in na občutlivost mešičkov na sfingozin ANG Vesicle size determines unitary exocytic properties and their sensitivity to sphingosine Opis SLO Poznamo popolno in prehodno eksocitozo, ki sta prevladujoči obliki eksocitoze v melanotrofih in laktotrofih. Sfingozin vpliva na eksocitozo tako, da aktivira protein VAMP2 za združevanje kompleksa SNARE. Ugotovili smo, da sfingozin in strukturni homolog fingolimod povišata raven eksocitoze tako, da povišata frekvenco prehodne in popolne fuzije. Pri tem so prešli mešički z večjim premerom v popolno fuzijo, manjši mešički pa so se zlivali s plazemsko membrano prehodno. Rezultati so pokazali, da je za od sfingozina odvisno eksocitozo, poleg ostalih dejavnikov, pomembna tudi velikost mešičkov. ANG Neuroendocrine cells contain small and large vesicles, but the functional significance of vesicle diameter is unclear. We studied unitary exocytic events of prolactin-containing vesicles in lactotrophs by monitoring discrete steps in membrane capacitance. In the presence of sphingosine, which recruits VAMP2 for SNARE complex formation, the frequency of transient and full fusion events increased. Vesicles with larger diameters proceeded to full fusion, but smaller vesicles remained entrapped in transient exocytosis. The diameter of vesicle dense cores released by full fusion exocytosis into the extracellular space was larger than the diameter of the remaining intracellular vesicles beneath the plasma membrane. Labeling with prolactin- and VAMP2-antibodies revealed a correlation between the diameters of colocalized prolactin- and VAMP2-positive structures. It is proposed that sphingosine-mediated facilitation of regulated exocytosis is not only related to the number of SNARE complexes per vesicle but also depends on the vesicle size, which may determine the transition between transient and full fusion exocytosis. Objavljeno v North-Holland; Molecular and cellular endocrinology; 2013; Vol. 376, iss. 1/2; str. 136-147; Impact Factor: 4.039;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 3.278; WoS: DR, IA; Avtorji / Authors: Flašker Ajda, Jorgačevski Jernej, Costa Calejo Ana-Isabel, Kreft Marko, Zorec Robert Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 4. COBISS ID 28521433 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Vpliv proteina Munc 18-1 na fuzijo mešičkov in lastnosti fuzijske pore ANG Munc 18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties Opis SLO Fuzijska pora je lahko pomemben dejavnik za uravnavanje sproščanja hormonov in živčnih prenašalcov. Domneva se, da je fuzijska pora v začetni fazi ozka in stabilna, pozneje pa se razširi in omogoči popolno zlitje mešička s plazmalemo. Namen raziskave je bil preveriti vpliv proteinov SecI/Munc18 na lastnosti fuzijske pore z lektrofiziološko metodo spremljanja membranske kapacitivnosti v majhni krpici membrane. V izolirane podganje laktotrofe smo vnesli mutante Munc18-1, ki vplivajo na vezavo tega proteina s sintaksinom1 (R39C), proteinom Rab3A (E466K) in proteini Mint (P242S). V primerjavi s celicami, ki so izražale le nativni protein Munc18-1, je Munc18-1 E466K povečal frekvenco fuzijskih dogodkov in podaljšal povprečni odprti čas fuzijske pore. Munc18-1 P242S je podaljšal povprečni odprti čas fuzijske pore. Vse mutante so stabilizirale fuzijsko poro v začetni fazi. Posledica vnosa mutant Munc18-1 je bilo tudi zlivanje večjih mešičkov, ki pa najverjetneje niso bile posledice sestavljene fuzije, kar smo potrdili z mikroskopijo STED. Mikroskopija na atomsko silo je pokazala, da vezava Mun18-1 na t.i. zaprto obliko sintaksina1 prepreči vezavo sintaksina1 na sinaptobrevin2 kar prepreči sidranje mešička. V kolikor je sintaksin1 že vezan na protein SNAP25, Munc18-1 ne prepreči vezave s sinaptobrevinom2. Ena od vlog Munc18-1 je torej zagotavljanje sidranja mešičkov prek vezi sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2, ki je stabilnejša od vezi sintaksin1-sinaptobrevin2. Munc18-1 pa se veže tudi na kompleks sintaksin1-SNAP25-sinaptobrevin2, kar omogoči uravnavanje fuzijske pore. ANG The release of hormones and neurotransmitters, mediated by regulated exocytosis, can be modified by regulation of the fusion pore. The fusion pore is considered stable and narrow initially, eventually leading to the complete merger of the vesicle and the plasma membranes. By using the high- resolution patch -clamp capacitance technique, we studied single vesicles and asked whether the Secl/Muncl8 proteins, interacting with the membrane fusion-mediating SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins, affect fusion pore properties. Muncl8-1 mutants were transfected into lactotrophs to affect the interaction of Muncl8-1 with syntaxinl (Synt1) (R39C), Rab3A (E466K), and Mints (P242S). Compared with wild-type, Muncl8-1 E466K increased the frequency ofthe fusion event. The latter two mutants increased the fusion pore dwell-time. All the mutants stabilized narrow fusion pores and increased the amplitude of fusion events, likely via preferential fusion oflarger vesicIes, since overexpression of Munc18-1 R39C did not affect the ave rage size of vesicIes, as determined by stimulated emission depletion (STED) microscopy. Single-molecule atomic force microscopy experiments revealed that wild-type Munc18-1, but not Munc18-1 R39C, abrogates the interaction between synaptobrevin2 (Syb2) and Synt1 binarytrans-complexes. However, neither form ofMuncl8-1 affected the interaction ofSyb2 with the preformed binary cis-Synt1ASNAP25B complexes. Thisindicates that Munc18-1 performs a proofing function by inhibiting tethering of Syb2-containing ves ici es solely to Synt1 at the plasmalemma andfavoring vesicular tethering to the preformed binary cis-complex of Synt1A-SNAP25B. The association of Muncl8-1 with the ternary SNARE complex leads to tuning of fusion pores via multiple and converging mechanisms involving Muncl8-1 interactions with Synt1A, Rab3A, and Mints. Objavljeno v The Society; The Journal of neuroscience; 2011; Vol. 31, issue 24; str. 9055-9066; Impact Factor: 7.115;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 3.602; A'': 1;A': 1; WoS: RU; Avtorji / Authors: Jorgačevski Jernej, Potokar Maja, Grilc Sonja, Kreft Marko, Zorec Robert Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 5. COBISS ID 30613977 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Visoko ločljivostne meritve membranske kapacitivnosti za spremljanje eksocitoze in endocitoze ANG High-resolution membrane capacitance measurements for the study of exocytosis and endocytosis Opis SLO Za študij eksocitoze in endocitoze so nujne neposredne meritve tega procesa. Eleganten način predstavlja spremljanje membranske kapacitivnosti, ki je sorazmerna s spremembami v površini plazemske membrane. Do sprememb v površini plazemske membrane pride v procesih ekso in endocitoze. V tem članku natančno opišemo protokol za meritve membranske kapacitivnosti. Ta protokol navadno uporabljamo za meritve na izoliranih hipofiznih celicah, se ga pa da enostavno prilagoditi kateremkoli drugemu tipu celic. Časovno potratna je predvsem postavitev sistema, izvajanje meritev pa je po tem, ko operater dobi nekaj izkušenj, hitra in relativno enostavna. ANG In order to understand exocytosis and endocytosis, it is necessary to study these processes directly. An elegant way to do this is by measuring plasma membrane capacitance (Cm), a parameter proportional to cell surface area, the fluctuations of which are due to fusion and fission of secretory and other vesicles. Here we describe protocols that enable high-resolution Cm measurements in macroscopic and microscopic modes. Macroscopic mode, performed in whole-cell configuration, is used for measuring bulk Cm changes in the entire membrane area, and it enables the introduction of exocytosis stimulators or inhibitors into the cytosol through the patch pipette. Microscopic mode, performed in cell-attached configuration, enables measurements of Cm with attofarad resolution and allows characterization of fusion pore properties. Although we usually apply these protocols to primary pituitary cells and astrocytes, they can be adapted and used for other cell types. After initial hardware setup and culture preparation, several Cm measurements can be performed daily. Objavljeno v Nature Pub. Group; Nature protocols; 2013; Vol. 8, no. 6; str. 1169-1183; Impact Factor: 7.960;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 3.089; A': 1; WoS: CO; Avtorji / Authors: Rituper Boštjan, Guček Alenka, Jorgačevski Jernej, Flašker Ajda, Kreft Marko, Zorec Robert Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 7.Najpomembnejši družbeno-ekonomski rezultati projektne skupine6 Družbeno-ekonomski dosežek 1. COBISS ID 784247 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Vpliv lipidov na fuzijsko poro v procesu eksocitoze pri podganjih laktotrofih ANG The role of lipids in fusion pore formation and exocytosis of rat lactotrophs Opis SLO Poznamo dva tipa eksocitoze, popolno in prehodno, prva je prevladujoča oblika v melanotrofih, ki so zato primerni za merjenje celokupne eksocitoze. Sfingolipid sfingozin aktivira protein VAMP2 za združevanje kompleksa SNARE, ki je pomemben v membranski fuziji. Ugotovili smo, da sfingozin, kot tudi njegov strukturni homolog fingolimod povišata eksocitozo, če ju dodamo zunajcelično. Nadalje smo preverili eksocitozo v laktotrofih, kjer je prevladujoč tip prehodna eksocitoza. Eksocitozo smo spremljali tako, da smo merili diskretne spremembe membranske kapacitivnosti, ki je sorazmerna spremembam v površini plazmaleme. V prisotnosti sfingozina se je frekvenca prehodne in popolne fuzije povišala. Mešički z večjim premerom so prešli v popolno fuzijo, medtem ko so manjši mešički ostali ujeti v prehodni eksocitozi. Označevanje s fluorescentnimi protitelesi, ki prepoznajo prolaktin (PRL) je pokazalo, da je bil povprečni premer izločene a nerazgrajene vsebine mešičkov večji kot premer neizločenih mešičkov. S pomočjo protiteles, ki prepoznavajo hormon PRL in VAMP2 smo ugotovili, da je intenziteta signala VAMP2 neodvisna od premera PRL mešičkov, hkrati pa je bila gostota VAMP2 signalov manjša v večjih mešičkih. Rezultati kažejo, da s sfingozinom posredovana uravnavana eksocitoza ni povezana samo s številom kompleksov SNARE na posameznem mešičku, ampak je odvisna tudi od velikosti mešičkov, ki lahko pomembno vplivajo na prehod iz prehodne v popolno eksocitozo. Two types of exocytosis are known, full fusion and transient fusion, first type is dominant form in melanotrophs, which are therefore appropriate cell type for measurements of bulk exocytosis. Sfingolipid sphingosine recruits protein VAMP2 for SNARE complex formation, which is important for membrane fusion. We discovered that sphingosine and its structure homologue fingolimod increased exocytosis, if added extracellularly. We ANG also studied exocytosis in lactotrophs, where transient fusion is dominant mode of exocytosis. We measure exocytosis by monitoring discrete steps in membrane capacitance, which is proportional to the changes in surface area of plasma membrane. In the presence of sphingosine the frequency of transient and full-fusion events increased. Vesi cles with larger diameters proceeded to full fusion, while smaller vesicles remained entrapped in transient exocytosis. Labeling with fluorescent antibodies recognizing prolactin (PRL) showed that the average diameter of secreted, but undegradated vesicle content was larger than diameter of unsecreted vesicles. PRL- and VAMP2-antibodies revealed that the intensity of VAMP2 signal was independent of PRL vesicle diameter. However, the density of VAMP2 signals was reduced in larger vesicles. We propose that sphingosine-mediated facilitation of regulated exocytosis is not only related to the number of SNARE complexes per vesicle but also depends on the vesicle size, which may determine the transition between transient and full-fusion exocytosis. Šifra D.09 Mentorstvo doktorandom Objavljeno v [A. Flašker]; 2013; XI, 66 f.; Avtorji / Authors: Flašker Ajda Tipologija 2.08 Doktorska disertacija 2. COBISS ID 262313984 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Vpliv monomernih GTPaz RAB na mobilnost mešičkov v podganjih astrocitih v kulturi ANG Role of monomeric RAB GTPases in vesicle mobility in cultured rat astrocytes Opis SLO Monomerne GTPaze RAB uravnavajo mobilnost mešičkov in delujejo kot molekulska stikala. Vloga proteinov RAB pri transportu mešičkov v astrocitih, ki so najštevilčnejše celice glije v možganih, je slabo raziskana. Vpliv proteinov RAB smo razisklovali z vnosom plazmidne DNA, ki kodirajo divji tip, dominantno-negativne in dominantno-pozitivne mutacije, ki vplivajo na GTPazno aktivnost proteinov RAB4A in RAB5A. Preverili smo tudi prisotnost in vlogo proteinov GDI1 in GDI2. Naši rezultati so pokazai, da sta RAB4A in RAB5A prisotna na znotrajceličnih strukturah zgodnje in pozne endocitoze. Vnos dominantno-negativnih in dominantno-pozitivnih oblik proteinov RAB v astrocite povzroči navidezno povečanje mešičkov, kar je posebej očitno v primeru vnosa dominantno-pozitivnih oblik proteinov RAB5A. Mutante vplivajo na mobilnost mešičkov, in sicer tako, da mobilnost upočasnijo in zmanjšajo delež mobilnih mešičkov. Pokazali smo, da astrociti izražajo efektorska proteina GDI1 in GDI2. Zmanjšanje izražanja teh dveh proteinov pomembno vpliva na mobilnost mešičkov v podganjih astrocitih. ANG Small monomeric GTPases function as molecular switches and are important for the regulation of the vesicular traffic.The role of RAB proteins in the vesicular traffic of vesicles in astrocytes, which are the most abundant glial cells in the mammalian CNS, is poorly understood. We have studied their role by transfecting astrocytes with the plasmids encoding RAB4A and RAB5A wild type, the dominant negative and the dominant positive forms. We proceeded by testing whether astrocytes express GDI1 or GDI2 proteins and their potential role in teh vesicular mobility. Our results show that RAB4A and RAB5A are present on the sub-cellular structures of the early and late endocytic pathway. Astrocytes expressing the dominant-negative or the dominant positive forms of RAB4A/5A exhibit enlarged vesicles, which is most evident in cells expressing dominant positive forms.The mutants also affect vesicle mobility, which is significantly decreased. We have proven that astrocytes express GDI1 and GDI2. Inhibition of the expression of these two proteins decreases vesicle mobility. Šifra D.09 Mentorstvo doktorandom Objavljeno v V. Lacovich; 2012; 60 f.; Avtorji / Authors: Lacovich Valentina Tipologija 2.08 Doktorska disertacija 3. COBISS ID 35338245 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Elektrofiziološke meritve diskretnih sprememb membranskih kapacitivnosti v astrocitih ANG Electrophysiological measurements of discrete steps in membrane capacitance of astocytes Opis SLO Astrociti s sproščanjem glijotransmiterjev vplivajo na prenosa signala med nevroni. Pomembno vlogo ima regulirana eksocitoza in eden izmed ključnih intermediatov - fuzijska pora. Z neposrednimi meritvami fluktuacij plazmaleme smo spremljali, kakšen je bil mehanizem eksocitoze; ali je bila fuzija prehodna ali popolna. Rezultati so pokazali, da v astrocitih v kulturi več kot 90 % dogodkov predstavlja prehodno fuzijo. V spontanih pogojih prevladujejo dogodki z amplitudami kapacitivnosti mešičkov 0,41 ± 0,06 fF (premer sekretornih mešičkov okoli 100 nm) in s fuzijskimi porami, ki so povprečno odprte 91 ±6 ms. Stimulacija z adenozin trifosfatom (ATP) pomembno vpliva na fiziologijo astrocitov. Rezultati kažejo, da se po stimulaciji astrocitov z ATP (1 mM) poveča frekvenca prehodnih fuzijskih dogodkov, katerih amplituda je v povprečju 0,41 ± 0,01 fF. Poleg teh dogodkov smo opazili tudi skupino dogodkov, ki so imeli povprečje amplitud kapacitivnosti mešičkov 1,50 ± 0,03 fF in predstavljajo populacijo sekretornih mešičkov s premeri okoli 300 nm. Ti mešički imajo daljši povprečni čas odprtja fuzijske pore, v primerjavi z mešički, ki imajo manjši premer (0,27 ± 0,01 s proti 0,16 ±0,01 s). Fuzijska pora se po stimulaciji z ATP razširi, kar omogoča pospešeno sproščanje glijotransmiterjev. ANG Astrocytes have an important role in modulating signal transmission in synapses between neurons, because they release gliotransmitters. Regulated exocytosis represents one of the mechanisms of the release of gliotransmitters and it consists of vesicle fusion with the plasma membrane. Fusion pore formation enables diffusion of gliotransmitters into extracellular space. Subsequently, the fusion pore closes or the vesicle merges with the plasma membrane. In the first case the surface area of the membrane increases transiently and in the second it increases for longer period of time. Direct measurements of plasma membrane fluctuations due to regulated exocytosis in astrocytes has not been performed yet. Surface area alternations can be monitored by applying the high resolution patch clamp technique. Cell-attached mode of membrane capacitance measurements enables monitoring of reversible and irreversible discrete steps in capacitance (parameter linearly dependant on the surface area) and subsequent evaluation of exocytosis types (transient or full fusion). Results showed that transient fusion dominates in astrocytes. It occurs in more than 90% of the cases. The average vesicle capacitance amplitudes are 0,41 ± 0,06 fF (vesicle diameter of 100 nm) and have the fusion pores opened in average for 91 ±6 ms. Stimulation with adenosine triphosphate (ATP) influences the physiology of astrocytes. Results revealed that stimulation with ATP (1 mM) increases the frequency of transient events with average amplitudes of 0,41 ± 0,01 fF. Additionally, it induces secretion of a second population with average amplitudes of vesicle capacitance of 1,50 ± 0,03 fF, representing vesicles with diameters of around 300 nm and prolonged dwell-time (0,16 ± 0,01 before stimulation vs. 0,27 ± 0,01 s after stimulation). After the stimulation with ATP the fusion pore expands, which enables stimulated release of gliotransmitters. Šifra D.10 Pedagoško delo Objavljeno v [A. Guček]; 2011; VIII, 42 f.; Avtorji / Authors: Guček Alenka Tipologija 2.11 Diplomsko delo 4. COBISS ID 29542617 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Nova metoda (platforma) za iskanje biološko aktivnih molekul, za ocenjevanje kakovosti celic za celične terapije in za nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov na podlagi analize mobilnosti znotrajceličnih organelov v povezavi z bolezenskimi stanji ANG Screening methods based on the vesicle mobility Opis SLO Predloženi izum predstavlja platformo, ki vključuje in vitro celične sisteme, metode in standard za manipulacijo in/ali analizo znotrajcelične mobilnosti celičnih organelov, pomembne za razumevanje temeljnih celičnih procesov kot tudi za uporabo celic v medicinske in biotehnološke namene. Novost predloženega izuma je kombinacija pristopov, ki obsegajo: i) metodo spremljanja dinamike znotrajceličnih organelov za iskanje biološko aktivnih substanc (npr. sestavine serumov, cerebrospinalne tekočine ter druge biološko aktivne anorganske ali organske molekule in njihove mešanice), ii) metodo za določanje kakovosti celic za napredne celične terapije in iii) metodo za ocenjevanje in nadzor kakovosti pridelave rekombinantnih proteinov znotraj evkariontskih celic v povezavi z mobilnostjo znotrajceličnih organelov. Ta izum predstavlja tudi podlago za proučevanje učinkov različnih farmacevtskih učinkovin za zdravljenje/modulacijo nekaterih patoloških stanj, ki zadevajo medcelično komunikacijo ter s tem povezano mobilnost in dinamiko znotrajceličnih organelov. ANG The invention relates to a method of screening for a compound useful in the treatment of a disease selected from neurodegenerative diseases and neuro-inflammatory diseases, said method comprising providing a test cell; staining at least one organelle of said test cell; contacting said test cell with a test compound; and recording the path of said stained organelle in said test cell. Suitable compounds are identified from a comparison of the recorded path with a suitable reference. Šifra F.06 Razvoj novega izdelka Objavljeno v Urad RS za intelektualno lastnino; 2011; 14 str.; Avtorji / Authors: Zorec Robert, Stenovec Matjaž, Trkov Saša, Vardjan Nina, Potokar Maja, Kreft Marko, Gabrijel Mateja, Jorgačevski Jernej Tipologija 2.23 Patentna prijava 5. COBISS ID 2814543 Vir: COBISS.SI Naslov SLO Visokoločljivostna fluorescenčna mikroskopija ANG Superresolution microscopy Opis SLO Visokoločljivostna mikroskopija je napredna tehnologija, kjer dosežemo ločljivost, ki je vsaj dvakrat boljša od ločljivosti običajne svetlobne mikroskopije. Organizacija srečanja, ki je spremljal uradni začetek mikroskopije STED v Sloveniji. Eden od ključnih instrumentov visokoločljivostnih mikroskopij predstavlja mikroskop STED, ki ga imamo sedaj tudi v Sloveniji. Mikroskop STED, ki je sestavljen iz najbolj naprednih optičnih, mehanskih in električnih komponent, predstavlja instrument, ki omogoča meritve na meji danosti. Mikroskop STED omogoča vizualizacijo živih celic z ločlivostjo med 35 in 40 nm, v idealnih pogojih pa okoli 30 nm. Znanstveno srečanje z delavnico visokoločljivostne mikroskopije je bilo namenjeno predstavitvi tovrstne mikroskopije. ANG Super resolution microscopy is the cutting edge technology with the resolution that is at list twice better than the resolution of conventional far field microscopy. One of the key instuments of super resolution microscopy is STED technology based instrument, which is now located also in Slovenia. It represents the most advanced technology in the field of optical microscopy, comprised of most advanced optics, mechanics and electronics. It enables observation of living objects at resolution between 35 and 40 nm with the potential to visualize objects beyond these limits. The conference with a workshop of the demonstration of the superresolution microscopy is dedicated to the introduction of this technological novelty. Šifra B.01 Organizator znanstvenega srečanja Objavljeno v Centre of Excellence for Integrated Approaches in Chemistry and Biology of Proteins; 2013; 44 str.; Avtorji / Authors: Zorec Robert, Kreft Marko, Tušar Livija, Turk Dušan Tipologija 2.25 Druge monografije in druga zaključena dela 8.Drugi pomembni rezultati projetne skupine7 9.Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine8 9.1.Pomen za razvoj znanosti9 SLO Hormoni in kemični prenašalci prenašajo informacije med organi oziroma tkivi v človeškem telesu. Sproščanje teh signalnih molekul iz mešičkov regulirajo proteini, ni pa znano v kakšnem vrstnem redu in kateri proteini med seboj reagirajo. Rezultati naše raziskave bodo pomembno doprinesli k boljšemu razumevanju regulacije lastnosti fuzijske pore (pojavnost in premer fuzijske pore) s proteinom Munc18-1. S tem se bo razširilo znanje na področju sproščanja signalnih molekul iz posameznih celic, ki je potrebno za razumevanje prenosa informacij v kemični sinapsi in sproščanja hormonov. ANG Hormones and neurotransmitters are chemical messengers that relay vital instructions through out our entire body. The release of these signalling molecules is regulated by proteins. However, we lack insight into the nature of the interactions between specific proteins, which would enable a better understanding of how specific proteins and other fusion pore associated molecules modulate the release. The results of this study importantly contribute to a better understanding of the fusion pore regulation. Specifically, we provide evidence if/how SNARE-associated protein Munc18-1 affects the kinetics and conductance of the fusion pore. The findings therefore provide new direct evidence toward a better understanding of the single cell release of signaling molecules, which is needed to better understand the mechanism of signal transduction of chemical synapse and of the release of hormones. 9.2.Pomen za razvoj Slovenije10 SLO 1.) Razvoj vsake države je pogojen z razvojem industrije, ki je vezan na ugotovitve bazične znanosti. Rezultati naše raziskave so povečali obstoječe znanje na področju nevrozanosti, iz katerega črpa znanje predvsem farmacevtska industrija, ki je v Sloveniji ena najpomembnejših industrijskih panog. Učinki bazičnih raziskav se v industriji odrazijo z zamikom. 2.) Vsebinska aktualnost projekta se je odrazila tudi s številnimi objavami rezultatov v znanstvenih revijah z visokim faktorjem vpliva in organizacijo mednarodnih srečanj, kar povečuje prepoznavnost tako Ljubljanske univerze, kot tudi Slovenije. 3.) S tem projektom, ki vsebuje pomembno temo raziskovanja, so raziskovalci projektne skupine pridobili tudi na izobraževalnem področju. Da bi lahko tudi v bodoče prispevali k raziskovanju te problematike, so se ustrezno izobrazili tudi mlajši raziskovalci. Raziskovalni projekt je poleg večje prepoznavnosti članov programske skupine v znastvenih krogih, pripomogla tudi k lažjemu navezovanju stikov z mednarodno mrežo raziskovalcev, kar je pomembno za nadaljni razvoj, tako posameznikov kot skupine in tudi države. ANG 1.) National development is tightly related to the industrial progress, which in turn depends on the findings of basic science. As one of the topical fields of research our research contributes to the basic knowledge of neuroscience. This is especially relevant for Slovenia, where pharmaceutical industry is well established. Translation of the basic research to industry is though a relatively slow process. 2.) Highly important theme of our research is mirrored also in several scientific publications with high impact factor and in the organization of international meetings. This has helped to gain visibility of individuals, and the scientific community in Slovenia as well. 3.) Education of personnel benefited by supporting our proposal. To contribute to the global effort, it is imperative to train young researchers to gain competitiveness in fundamental research. Research project has also facilitated the international collaborations. 10.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni F.07 Izboljšanje obstoječega izdelka Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.08 Razvoj in izdelava prototipa Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.10 Izboljšanje obstoječega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.11 Razvoj nove storitve Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.12 Izboljšanje obstoječe storitve Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.19 Znanje, ki vodi k ustanovitvi novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.20 Ustanovitev novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.22 Izboljšanje obstoječih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.23 Razvoj novih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.24 Izboljšanje obstoječih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev 1 Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.25 Razvoj novih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.26 Izboljšanje obstoječih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.27 Prispevek k ohranjanju/varovanje naravne in kulturne dediščine Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.28 Priprava/organizacija razstave Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.30 Strokovna ocena stanja Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.32 Mednarodni patent Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.33 Patent v Sloveniji Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.34 Svetovalna dejavnost Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.35 Drugo Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d Komentar ll.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01 Razvoj visokošolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja O O O o G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja o o o o G.01.03. Drugo: o o o o G.02 Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu o o o o G.02.02. Širitev obstoječih trgov o o o o G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje o o o o G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije o o o o G.02.05. Razširitev področja dejavnosti o o o o G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost o o o o G.02.07. Večji delež izvoza o o o o G.02.08. Povečanje dobička o o o o G.02.09. Nova delovna mesta o o o o G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih o o o o G.02.11. Nov investicijski zagon o o o o G.02.12. Drugo: o o o o G.03 Tehnološki razvoj 1 1 1 1 1 G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti o o o o G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti o o o o G.03.03. Uvajanje novih tehnologij o o o o G.03.04. Drugo: o o o o G.04 Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja o o o o G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja o o o o G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave o o o o G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti o o o o G.04.05. Razvoj civilne družbe o o o o G.04.06. Drugo: o o o o G.05. Ohranjanje in razvoj nacionalne naravne in kulturne dediščine in identitete O O O O G.06. Varovanje okolja in trajnostni razvoj o o o o G.07 Razvoj družbene infrastrukture G.07.01. Informacijsko-komunikacijska infrastruktura o o o o G.07.02. Prometna infrastruktura o o o o G.07.03. Energetska infrastruktura o o o o G.07.04. Drugo: o o o o G.08. Varovanje zdravja in razvoj zdravstvenega varstva o o o o G.09. Drugo: o o o o Komentar 12.Pomen raziskovanja za sofinancerje11 Sofinancer 1. Naziv Naslov Vrednost sofinanciranja za celotno obdobje trajanja projekta je znašala: EUR Odstotek od utemeljenih stroškov projekta: % Najpomembnejši rezultati raziskovanja za sofinancerja Šifra 1. 2. 3. 4. 5. Komentar Ocena 13.Izjemni dosežek v letu 201312 13.1. Izjemni znanstveni dosežek Objava opisa metode, ki smo jo pri projektu najpogosteje uporabili - visokoločljivostne meritve membranske kapacitivnosti v reviji Nature Protocols. 13.2. Izjemni družbeno-ekonomski dosežek Član projektne skupine dr. Jernej Jorgačevski je za svoje doktorsko delo prejel nagradno zlati znak Jožefa Stefana. C. IZJAVE Podpisani izjavljam/o, da: • so vsi podatki, ki jih navajamo v poročilu, resnični in točni • se strinjamo z obdelavo podatkov v skladu z zakonodajo o varstvu osebnih podatkov za potrebe ocenjevanja ter obdelavo teh podatkov za evidence ARRS • so vsi podatki v obrazcu v elektronski obliki identični podatkom v obrazcu v pisni obliki • so z vsebino zaključnega poročila seznanjeni in se strinjajo vsi soizvajalci projekta Podpisi: zastopnik oz. pooblaščena oseba i vodja raziskovalnega projekta: raziskovalne organizacije: CELICA, biomedicinski center, d.o.o. Robert Zorec ZIG Kraj in datum: Ljubljana |4.4.2014 Oznaka prijave: ARRS-RPROJ-ZP-2014/56 1 Napišite povzetek raziskovalnega projekta (največ 3.000 znakov v slovenskem in angleškem jeziku) Nazaj 2 Napišite kratko vsebinsko poročilo, kjer boste predstavili raziskovalno hipotezo in opis raziskovanja. Navedite ključne ugotovitve, znanstvena spoznanja, rezultate in učinke raziskovalnega projekta in njihovo uporabo ter sodelovanje s tujimi partnerji. Največ 12.000 znakov vključno s presledki (približno dve strani, velikost pisave 11). Nazaj 3 Realizacija raziskovalne hipoteze. Največ 3.000 znakov vključno s presledki (približno pol strani, velikost pisave 11) Nazaj 4 V primeru bistvenih odstopanj in sprememb od predvidenega programa raziskovalnega projekta, kot je bil zapisan v predlogu raziskovalnega projekta oziroma v primeru sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine v zadnjem letu izvajanja projekta, napišite obrazložitev. V primeru, da sprememb ni bilo, to navedite. Največ 6.000 znakov vključno s presledki (približno ena stran, velikost pisave 11). Nazaj 5 Navedite znanstvene dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Raziskovalni dosežek iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Nazaj 6 Navedite družbeno-ekonomske dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Družbeno-ekonomski rezultat iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Družbeno-ekonomski dosežek je po svoji strukturi drugačen kot znanstveni dosežek. Povzetek znanstvenega dosežka je praviloma povzetek bibliografske enote (članka, knjige), v kateri je dosežek objavljen. Povzetek družbeno-ekonomskega dosežka praviloma ni povzetek bibliografske enote, ki ta dosežek dokumentira, ker je dosežek sklop več rezultatov raziskovanja, ki je lahko dokumentiran v različnih bibliografskih enotah. COBISS ID zato ni enoznačen, izjemoma pa ga lahko tudi ni (npr. prehod mlajših sodelavcev v gospodarstvo na pomembnih raziskovalnih nalogah, ali ustanovitev podjetja kot rezultat projekta ... - v obeh primerih ni COBISS ID). Nazaj 7 Navedite rezultate raziskovalnega projekta iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) v primeru, da katerega od rezultatov ni mogoče navesti v točkah 6 in 7 (npr. ni voden v sistemu COBISS). Največ 2.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 8 Pomen raziskovalnih rezultatov za razvoj znanosti in za razvoj Slovenije bo objavljen na spletni strani: http://sicris.izum.si/ za posamezen projekt, ki je predmet poročanja Nazaj 9 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 10 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 11 Rubrike izpolnite / prepišite skladno z obrazcem "izjava sofinancerja" http://www.arrs.gov.si/sl/progproj/rproj/gradivo/, ki ga mora izpolniti sofinancer. Podpisan obrazec "Izjava sofinancerja" pridobi in hrani nosilna raziskovalna organizacija - izvajalka projekta. Nazaj 12 Navedite en izjemni znanstveni dosežek in/ali en izjemni družbeno-ekonomski dosežek raziskovalnega projekta v letu 2013 (največ 1000 znakov, vključno s presledki). Za dosežek pripravite diapozitiv, ki vsebuje sliko ali drugo slikovno gradivo v zvezi z izjemnim dosežkom (velikost pisave najmanj 16, približno pol strani) in opis izjemnega dosežka (velikost pisave 12, približno pol strani). Diapozitiv/-a priložite kot priponko/-i k temu poročilu. Vzorec diapozitiva je objavljen na spletni strani ARRS http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/, predstavitve dosežkov za pretekla leta pa so objavljena na spletni strani http://www.arrs.gov.si/sl/analize/dosez/. Nazaj Obrazec: ARRS-RPROJ-ZP/2014 v1.02 D5-83-46-13-CA-52-63-C8-C5-3C-9D-97-7D-59-AD-EE-48-9A-93-22