Originalni znanstveni œlanki - Scientific articles
Kvalitativna analiza rastlinskih vrst v zdravilnih œajnih meĝanicah na osnovi restrikcijske analize ITS regij
Qualitative analysis of individual herbal drugs in tea mixtures using restriction analysis of ITS regions
Petra Slanc, Sanja Brus, Borut Ĝtrukelj
Povzetek
Zdravilne œaje uvrĝœamo med najstarejĝe farmacevtske pripravke. Prouœevali smo grenki œaj, ki je sestavljen iz zeli tavĉentroĉe (Centaurii herba), zeli rmana (Millefolii herba), korenine rumenega sviĝœa (Gentianae radix), listov navadnega mrzliœnika (Menyanthidis trifoliatae folium) in listov poprove mete (Menthae piperitae folium) ter œaj s pegastim badljem, ki je sestavljen iz plodu pegastega badlja (Cardui mariae fructus), korenine regrata (Taraxaci radix), plodu navadne kumine (Carvi fructus) in listov poprove mete (Menthae piperitae folium). Razvili smo metodo, s pomoœjo katere je mogoœe identificirati posamezne droge v œajni meĝanici. Metoda je osnovana na pomnoĉitvi odseka jedrne ribosomalne DNA regije imenovane internal transcribed spacers (ITS) in njene restrikcijske analize. Pomnoĉili smo ITS regiji posamezne droge, jima doloœili nukleotidno zaporedje ter na podlagi zaporedij izbrali kombinacijo restrikcijskih endonukleaz, s pomoœjo katerih smo doloœili znaœilen profil posamezne œajne meĝanice.
Kljuœne besede: zdravilni œaji, nrDNA ITS, restrikcijska analiza
Abstract
Herbal teas are one of the oldest and most used traditional preparations. We had studied bitter tea made of Centaurii herba, Millefolii herba, Gentianae radix, Menyanthidis trifoliatae folium, Menthae piperitae folium, and tea with milk thistle made of Cardui mariae fructus, Taraxaci radix, Carvi fructus and Menthae piperitae folium. In order to identify the constituent drugs, a method was established involving amplification of the internal transcribed spacers (ITS) region of nuclear ribosomal DNA on the basis of restriction analysis. ITS regions of individual drugs were amplified and sequenced. Restriction analysis was performed with selected restriction endonucleases to obtain specific profile for each tea.
Key words: herbal tea, nrDNA ITS, restriction analysis
1 Uvod
Uporaba zdravilnih œajev je ena glavnih komponent tradicionalne medicine. Njihova uporaba sega tisoœletja v zgodovino, lahko bi celo trdili, da je stara kot œloveĝtvo. V zadnjih desetletjih njihova uporaba naraĝœa, kar pa je najverjetneje posledica vse veœjega nagibanja prebivalstva razvitega sveta h komplementarnim metodam zdravljenja. Relativna priljubljenost se sicer razlikuje med drĉavami, vendar pa je ocenjeno, da naj bi komplementarna zdravljenja uporabljalo od 20 % pa tja do 50 % populacije (1). Zdravilni œaji so eni najstarejĝih galenskih pripravkov. Zanje je znaœilno, da jih sestavlja posamezna droga ali pa meĝanica drog (2). Meĝanice so pripravljene in situ v lekarnah ali pa industrijsko. Meĝanico zdravilnih œajev sestavljajo razliœne droge, ki pa navadno
pripadajo isti indikacijski skupini. K tem t. i. glavnim drogam so navadno dodane tudi dopolnilne ter pomoĉne droge, ki dopolnjujejo delovanje glavnih drog, izboljĝujejo organoleptiœne lastnosti, kot sta vonj in okus, pa tudi izgled same meĝanice (2). Ĉe dodobra uveljavljeno farmacevtsko pravilo je, da naj bi bili zdravilni œaji sestavljeni iz ne veœ kot sedmih drog. Predvsem v Nemœiji so za zdravilne œaje doloœena tudi pravila, ki zahtevajo, da naj œaj vsebuje vsaj 70 % sestavin, ki spadajo v skupino aktivnih komponent, kljub temu, da razmerja znotraj tega lahko variirajo (2). Poleg uœinkov zdravilnih œajev, njihovih ĉelenih in neĉelenih uœinkov, pa je eden od pomembnejĝih kriterijev tudi njihova kakovost. Kakovost posameznih drog se je in se ĝe vedno preverja na podlagi njihovega videza. Zelo pomemben prvi korak pri zagotavljanju kakovosti je preverjanje ustreznosti droge v smislu pravilne vrste, saj ne gre zanemariti
dr. Petra Slanc, mag. farm., Katedra za farmacevtsko biologijo, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, SI–1000 Ljubljana, Slovenija Sanja Brus, Katedra za farmacevtsko biologijo, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, SI–1000 Ljubljana, Slovenija prof. dr. Borut Ĝtrukelj, mag. farm., Katedra za farmacevtsko biologijo, Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Aĝkerœeva 7, SI–1000 Ljubljana, Slovenija in Odsek za biokemijo in molekularno biologijo, Inĝtitut Joĉef Stefan, Jamova 39, SI-1000 Ljubljana, Slovenija
274 farm vestn 2006; 57
Kvalitativna analiza rastlinskih vrst v zdravilnih œajnih meĝanicah
dejstva, da se lahko uœinkovitost med vrstami tudi znotraj istega rodu, kot tudi drogami iste vrste bistveno razlikuje. Droge tako doloœamo na makroskopskem, mikroskopskem in fitokemijskem nivoju, kakor to doloœa Evropska farmakopeja (2). Doloœanje rastlinskih vrst v novejĝih izdelkih, kjer je navadno nativna struktura rastline uniœena, je tako z vidika vizualizacije droge nemogoœa. Med takĝne izdelke spadajo izdelki, ki vsebujejo zmlete droge, tekoœe ali suhe izvleœke, pa tudi izdelki, ki vsebujejo meĝanico fino zmletih drog (3). V teh primerih je doloœanje vrste droge in njihovih potvorb z uporabo makroskopskih, kot tudi organoleptiœnih metod nemogoœe (3). V takĝnih primerih je edini naœin identifikacije vrste uporaba molekulskih profilov, ki so znaœilni za posamezno vrsto. TLC predstavlja zelo pogosto, hitro in relativno cenovno ugodno metodo, s pomoœjo katere lahko do neke mere doloœimo vrsto rastline. Na razpolago so tudi druge metode, kot so HPLC, MS in GC, vendar pa je pri teh metodah nepogreĝljiva uporaba posameznih standardov. Kljub uporabi standardov pa se v doloœenih primerih izkaĉe, da tudi to ni zadosti za razlikovanje med posameznimi vrstami, saj so si kemijski profili med vrstami istega rodu ali podvrstami lahko na las podobni. Na molekulskem nivoju je vrste moĉno razlikovati tudi s pomoœjo DNA profilov in sicer segmentov znotraj zapisa genov za ribosomalne RNA (rRNA) imenovanih internal transcribed spacers (ITS), vendar pa se teh tehnik do danes v ĝirĝem ĝe ne uporablja (3).
ITS regiji znotraj zapisa za 18S in 28S jedrne ribosomalne DNA (rDNA) se uporabljata pri filogenetskih ĝtudijah (slika 1) (4). Regiji sta vrstno specifiœni. Zaporedja rDNA so zelo ohranjena in se med evkarionti ne razlikujejo dosti. Geni, ki kodirajo posamezne podenote rRNA (18S, 5,8S in 28S) se navadno nahajajo v tandemu, te pa se lahko ponovijo od sto do tisoœkrat v genomu in predstavljajo pribliĉno 10% celotnega genoma (navadni repnjakovec – Arabidopsis thaliana 8%). Ker so rRNA visoko ohranjene jih lahko uporabimo kot sonde za in situ hibridizacijo tudi pri drugih vrstah. Z zaœetniki, ki so sidrani na ohranjenih zapisih 18S in 28S rRNA genov tako relativno lahko pomnoĉimo odsek, ki nosi zapis obeh ITS regiji kot tudi 5,8S rRNA.
Slika 1: Shematski prikaz genskega zapisa za rDNA. Zapis sestavlja NTS regija (nontranscribed spacer), dve ETS regiji (external transcribed spacer), dve ITS regiji (internal transcribed spacer) in geni za 18S rRNA, 5,8S rRNA in 28S rRNA.
Figure 1: Genetic region for rDNA. The region is built of NTS region (nontranscribed spacer), two ETS regions (external transcribed spacer), two ITS regions (internal transcribed spacer) and genes for 18S rRNA, 5,8S rRNA and 28S rRNA.
Slika 2: Genomska DNA izolirana iz posameznih vrst grenkega œaja. Ĉepek 1 C. erythraea (C. tenuiflorum); 2 A. millefolium; 3 M. trifoliata; 4 G. lutea; 5 M. piperita; 6 oznaœevalec velikosti.
Figure 2: Genomic DNA isolated from individual herbal drugs in bitter tea. Lane 1 C. erythraea (C. tenuiflorum); 2 A. millefolium; 3 M. trifoliata; 4 G. lutea; 5 M. piperita; 6 molecular weight marker.
Odseke je moĉno pomnoĉiti tudi iz herbarijskih primerkov, v primerih, ko je DNA ĝe v zadostni meri ohranjena. Poleg tega sta zapisa ITS regiji tudi nekodirajoœa in sta se tekom evolucije spreminjala v takĝni smeri, da je z doloœevanjem njihovega nukleotidnega zaporedja moĉno loœiti posamezno vrsto (4, 5).
V priœujoœem œlanku smo ugotavljali moĉnosti uporabe restrikcijske analize za kvalitativno analizo sestave rastlinskih pripravkov. Analizirali smo sestavo dveh razliœnih œajnih meĝanic, ki vsebujeta naslednje droge: Centaurii herba, Gentianae radix, Menthae piperitae folium, Millefolii herba, Menyanthidis trifoliatae folium ter Cardui mariae fructus, Taraxaci radix, Menthae piperitae folium in Carvi fructus. Z veriĉno reakcijo s polimerazo smo pomnoĉili izbrani odsek rDNA, mu doloœili nukleotidno zaporedje in ga nato razrezali z uporabo kombinacije restrikcijskih endonukleaz (BsmBI, McsI, HaeII, XhoI in BsmI, NaeI, HincII). Fragmente smo z uporabo gelske elektroforeze, loœili po velikosti in dobili profil, znaœilen za posamezno œajno meĝanico. Ugotovili smo, da z dano metodo lahko potrdimo istovetnost rastlinskih vrst, prav tako pa tudi loœimo vrste v kompleksnih rastlinskih pripravkih, kot so œajne meĝanice.
2 Materiali in metode
2.1 Œaji in posamezne droge
Grenki œaj sestavljen iz zeli tavĉentroĉe (Centaurii herba), zeli rmana (Millefolii herba), korenine rumenega sviĝœa (Gentianae radix), listov navadnega mrzliœnika (Menyanthidis trifoliatae folium) in listov poprove mete (Menthae piperitae folium) ter œaj s pegastim badljem, ki je sestavljen iz plodu pegastega badlja (Cardui mariae fructus), korenine regrata (Taraxaci radix), plodu navadne kumine (Carvi fructus) in listov poprove mete (Menthae piperitae folium), kot tudi
farm vestn 2006; 57
Originalni znanstveni œlanki - Scientific articles
posamezne droge iz rastlinskih vrst navadne tavĉentroĉe (Centaurium erythraea L.), navadnega rmana (Achillea millefolium L.), rumenega sviĝœa (Gentiana lutea L.), navadnega mrzliœnika (Menyanthes trifoliata L.), poprove mete (Mentha x piperita L.), pegastega badlja (Silybum marianum L.), navadnega regrata (Taraxacum officinale Weber) in navadne kumine (Carum carvi L.) smo pridobili na prostem trgu. Evidenœni vzorci so shranjeni na Univerzi v Ljubljani, Fakulteti za farmacijo, Katedri za farmacevtsko biologijo.
2.2   Izolacija DNA
50-100 mg œaja ali posamezne droge smo zmleli v fin prah in izolirali DNA s pomoœjo DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Nemœija) po proizvajalœevem protokolu. Kvaliteto in integriteto DNA smo potrdili z 0,8 % agarozno gelsko elektroforezo, 1h na 70 V in jo detektirali z etidijevim bromidom pod UV-luœjo (294 nm).
2.3   Pomnoĉitev ITS regij in doloœitev nukleotidnega zaporedja
ITS regije smo pomnoĉili v 25 µL reakcijskih raztopinah, ki so vsebovale 20 – 50 ng matriœne DNA, 10 pmol posameznega zaœetnika in 12,5 µL PCR-Master Mix (Promega, USA). Zaœetnika ITS_F (5’ AGAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG 3’) in ITS_R (5’ TTTTCCTCCGCTCATTGATATGCTT 3’) smo osnovali na podlagi nukleotidnih zaporedij 18S oziroma 28S genov rRNA navadnega repnjakovca. Pomnoĉevanje smo izvedli v Primus 96 Plus Cycler (MWG Biotech, Germany), po programu: predenaturacija 1 min na 96°C; 35 ciklov 0,5 min na 96 °C, 0,5 min na 55 °C in 0,5 min na 72 °C; sledil je cikel 1 min elongacije na 72 °C. Fragmente smo subklonirali v pGEM T Easy Vector in jim doloœili nukleotidno zaporedje s pomoœjo univerzalnih zaœetnikov prilegajoœih na SP6 oziroma T7 promotor. Uporaba obeh zaœetnikov je omogoœila potrditev zaporedja iz obeh smeri. Dobljena zaporedja smo potrdili z
Slika 3: Genomska DNA izolirana iz posameznih vrst œaja s pegastim badljem. Ĉepek 1 S. marianum; 2 T. officinale; 3 C. carvi; 4 M. piperita, 5 oznaœevalec velikosti.
Figure 3: Genomic DNA isolated from individual herbal drugs in tea with milk thistle. Lane1 S. marianum; 2 T. officinale; 3 C. carvi; 4 M. piperita, 5 molecular weight marker.
uporabo BLAST protokola na National Centre for Biotechnology Information (NCBI) database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
2.4 Restrikcijska analiza
Ustrezne restrikcijske endonukleaze smo izbrali s pomoœjo doloœenih nukleotidnih zaporedij z uporabo WebCutter programa (WebCutter 2.0, http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html). Glede na restrikcijske karte smo izbrali BsmBI, McsI, HaeII, in XhoI (New England BioLabs, England) za grenki œaj ter BsmI, HincII in NaeI (New England BioLabs, England) za œaj s pegastim badljem. Ustreznost kandidatnih restrikcijskih endonukleaz smo preverili z restrikcijo posameznih drog (slika 4, 6). Restrikcijo smo izvedli v NebBuffer IV pufru za grenki œaj in NebBuffer II pufru za œaj s pegastim badljem. Za restrikcijo 100 do 1000 ng DNA smo uporabili 3 enote posamezne restrikcijske endonukleaze ter temperaturo po proizvajalœevem protokolu. Restrikcijo smo izvajali eno uro. V primeru restrikcijske analize DNA izolirane in pomnoĉene iz œajne meĝanice pa smo restrikcijo najprej izvajali dve uri z endonukleazami z niĉjim temperaturnim optimumom, nato pa ĝe dve uri z endonukleazami, ki so zahtevale viĝjo temperaturo. Restrikcijske fragmente smo loœili s pomoœjo 2 % agarozne gelske elektroforeze 1h na 100 V in jih detektirali z uporabo etidijevega bromida pod UV luœjo (294 nm).
3 Rezultati in razprava
DNA smo izolirali iz obeh œajnih meĝanic kot tudi posameznih drog. Kljub temu, da smo DNA izolirali, pa je bila ta relativno zelo razgrajena (slika 2, 3). Vzroke razgrajenosti lahko iĝœemo predvsem zaradi procesiranja drog. Visoke temperature v procesu suĝenja in razliœni
Slika 4: Restrikcijska analiza posameznih drog v œajni meĝanici grenkega œaja. Ĉepek 1 oznaœevalec velikosti; 2 M. trifoliata (XhoI); 3 M. piperita (BsmBI); 4 A. millefolium (MscI); 5 G. lutea (HaeII); 6 C. erythraea (C. tenuiflorum) (HaeII in XhoI); 7 oznaœevalec velikosti.
Figure 4: Restriction analysis of individual herbal drug in bitter tea. Lane 1 molecular weight marker; 2 M. trifoliata (XhoI); 3 M. piperita (BsmBI); 4 A. millefolium (MscI); 5 G. lutea (HaeII); 6 C. erythraea (C. tenuiflorum) (HaeII and XhoI); 7 molecular weight marker.
276 farm vestn 2006; 57
Kvalitativna analiza rastlinskih vrst v zdravilnih œajnih meĝanicah
Slika 5: Restrikcijska analiza grenkega œaja. Ĉepek 1 oznaœevalec velikosti; 2 grenki œaj (BsmBI, MscI, HaeII in XhoI); 3 oznaœevalec velikosti.
Figure 5: Restriction analysis of bitter tea. Lane 1 molecular weight marker; 2 bitter tea (BsmBI, MscI, HaeII and XhoI); 3 molecular weight marker.
Slika 6: Restrikcijska analiza posameznih drog v œajni meĝanici œaja s pegastim badljem. Ĉepek 1 oznaœevalec velikosti; 2 S. marianum (HincII); 3 C. carvi (BsmI); 4 T. officinale (BsmI); 5 M. piperita (BsmI in NaeI); 6 oznaœevalec velikosti.
Figure 6: Restriction analysis of individual herbal drug in tea with milk thistle. Lane 1 molecular weight marker; 2 S. marianum (HincII); 3 C. carvi (BsmI); 4 T. officinale (BsmI); 5 M. piperita (BsmI and NaeI); 6 molecular weight marker.
pogoji shranjevanja imajo za posledico razpad in razgradnjo celic, jeder in genomske DNA. Prav tako smo pri pomnoĉevanju morali zniĉati koncentracijo matriœne DNA na 1,5 ng/mL ali manj (6) in na ta naœin zmanjĝati zaviralne uœinke polifenolov, polisaharidov in drugih sekundarnih metabolitov, ki so v drogah prisotni v zelo visokih koncentracijah. Glede na podatke drugih ĝtudij se po lizi celic
Slika 7: Restrikcijska analiza œaja s pegastim badljem. Ĉepek 1 oznaœevalec velikosti; 2 œaj s pegastim badljem (BsmI, NaeI in HincII); 3 oznaœevalec velikosti.
Figure 7: Restriction analysis of tea with milk thistle. Lane 1 molecular weight marker; 2 tea with milk thistle (BsmI, NaeI and HincII); 3 molecular weight marker.
polifenoli in polisaharidi zelo moœno veĉejo na DNA in poleg njene razgradnje (7) povzroœijo tudi zaviranje polimeraze, s œemer je moteno pomnoĉevanje DNA oziroma druge encimske reakcije, nadaljnje analize izolirane DNA (8).
Nukleotidna zaporedja ITS regij rumenega sviĝœa, navadnega rmana, pegastega badlja, navadnega regrata, navadne kumine in poprove mete so se visoko ujemala z zaporedij iz GeneBank podatkovne zbirke. Nukleotidno zaporedje tavĉentroĉe pa se je ujemalo z drugo vrsto in sicer ozkolistno tavĉentroĉo (Centaurium tenuiflorum), kar je potrdil tudi podrobnejĝi pregled morfoloĝkih znaœilnosti droge. Glede na literaturne podatke so potvorbe tavĉentroĉe sicer zelo redke, navadno z Centaurium pulchellum ali z nekaterimi podvrstami Centaurium erythraea subsp. majus Zeltner (2). Moĉna pa je tudi njihova zamenjava, ĝe posebno, œe so rastline mlade ali nizke rasti. Länger tako predlaga, da naj bi bile za farmakopejsko drogo Centaurii herba primerne vse vrste rodu Centaurium, ki imajo zadostno stopnjo grenkobe (ne manj kot 2000), saj do sedaj ĝe ni bilo zabeleĉeni nobenih neĉelenih uœinkov, ki bi bili posledica zamenjave drog (2). Podatkovno zbirko GeneBank smo tudi dopolnili s celotnim ITS zaporedjem za navadni mrzliœnik (GeneBank accession number DQ276850).
Pred restrikcijskim kartiranjem smo dobljena zaporedja tudi primerjali z zaporedji pridobljenimi za posamezno vrsto iz podatkovne zbirke GeneBank, kajti v doloœenih primerih se lahko zgodi, da pride do doloœenih odstopanj znotraj vrste (9, 10). Variacije smo oznaœili in izbrali restrikcijske endonukleaze na mestih, ki so se ujemala. Glede na izbrane endonukleaze smo izbrali tudi restrikcijski pufer in pogoje restrikcije. Pri uporabi veœjega ĝtevila restrikcijskih endonukleaz le redko lahko zadostimo optimalno delovanje vseh encimov. V primeru grenkega œaja smo izbrali NebBuffer IV, kjer imajo vsi encimi 100 % aktivnost, vendar ne pri enaki temperaturi inkubacije, saj BsmBI zahteva, kar 18 °C viĝjo temperaturo kot ostali encimi. V primeru œaja
farm vestn 2006; 57 277
Originalni znanstveni œlanki - Scientific articles
s pegastim badljem pa NebBuffer II, kjer imata BsmI in HincII 100 % aktivnost, NaeI pa 75 %, poleg tega zahteva BsmI 28 °C viĝjo temperaturo. Kljub ĝtevilnim poskusom, nam tako v popolnosti vseh ITS regij v grenkem œaju ni uspelo povsem razrezati, vendar pa samo dejstvo ne vpliva na konœni rezultat analize. Restrikcijska analiza posameznih drog grenkega œaja je potrdila vse priœakovane fragmente (slika 4). Pri restrikciji navadnega mrzliœnika je opazen fragment, ki ustreza celotni ITS regiji z velikostjo 758 bp, fragment z velikostjo 645 bp in fragment z velikostjo 104 bp; fragmenta poprove mete sta po svoji velikosti enaka 600 bp in 132 bp; fragmenta navadnega rmana 536 bp in 196 bp, na sliki pa je moœ opaziti tudi liso, ki ustreza celotni ITS regiji 742 bp; na sliki sta vidna fragmenta rumenega sviĝœa 268 in 463 bp; fragment tavĉentroĉe 466 bp je prisoten zaradi nepopolne cepitve na podroœju ITS2 regije med fragmentom 322 bp in 144 bp, poleg omenjene lise pa so opazni tudi fragmenti 322 bp, 183 bp, 144 bp, ostali priœakovani fragmenti z velikostjo 49 bp, 19 bp in 15 bp se najverjetneje nahajajo skupaj s preostanki zaœetnikov in morebitnimi dimeri zaœetnikov. Preostanki zaœetnikov so vidni tudi pri vseh ostalih vrstah, kot lise z najmanjĝo velikostjo. Omenjeni fragmenti so dobro vidni tudi na sliki restrikcijske analize œajne meĝanice grenkega œaja z izjemo fragmentov 132 bp, ki pripada poprovi meti in fragmentu 104 bp, ki pripada navadnemu mrzliœniku, zaradi preintenzivne lise nanaĝalnega barvila (slika 5). Prav tako je tudi restrikcijska analiza posameznih drog œaja s pegastim badljem potrdila vse priœakovane fragmente (slika 6). Pri restrikciji pegastega badlja sta vidna fragmenta z velikostjo 602 bp in 142 bp; fragmenta navadne kumine 519 bp in 194 bp; fragmenta navadnega regrata 474 bp in 278 bp; fragmenti poprove mete 328 bp, 213 bp in 137 bp, podobno kot pri tavĉentroĉi pa se fragment 54 bp najverjetneje nahaja skupaj z preseĉnimi zaœetniki, ki jih je moœ opaziti tudi pri navadni kumini. Tudi pri restrikcijski analizi œajne meĝanice œaja s pegastim badljem smo potrdili vse zgoraj omenjene lise (slika 7). Enako kot pri grenkem œaju, pa zaradi preintenzivne lise nanaĝalnega barvila ni moœ opaziti dveh fragmentov in sicer, 142 bp velikega fragmenta pegastega badlja in 137 bp velikega fragmenta poprove mete.
4 Sklep
Na osnovi naĝe ĝtudije lahko sklepamo, da je restrikcijska analiza relativno hitra, kvalitativna metoda, vendar pa smo ugotovili, da je za izdelavo profila potrebno zagotoviti precejĝno koliœino DNA, da je s tem omogoœena vizualizacija vseh fragmentov ter predhodnje
doloœanje nukleotidnega zaporedja posamezne komponente v meĝanici, ĝe posebej v primerih, ko je moĉna lahka potvorba ali pa zamenjava drog. Kljub temu pa je vseeno potrebno izpostaviti dejstvo, da smo razvili metodo, ki omogoœa identifikacijo posamezne vrste na nivoju njihovih molekulskih lastnostih v dveh kompleksnih meĝanicah zdravilnih œajev in ĝe enkrat potrdili uporabnost ITS regij kot molekulskega orodja za potrjevanje istovetnosti vrst.
5 Literatura
1.    Fisher P in Ward A. Complementary medicine in Europe. BMJ 1994; 309:107–111.
2.    Bisset NG, Wichtl M. General part. In: Bisset NG, Wichtl M (eds), 2nd Edition. Herbal Dugs and Phytopharmaceuticals, a Handbook for Practice on a Scientific Basis with References to German Commision E Monographs, Medpharm Stuttgart, (2001): 11-40.
3.    Wills RBH, Bone K, Morgan M. Herbal products: active constituents, modes of action and quality control. Nutr Res Rev 2000; 13: 47-77.
4.   Baldwin BG, Sanderson MJ, Porter JM, Wojciechowski MF, Campbell CS, Donoghue MJ. The ITS Region of Nuclear Ribosomal DNA - a Valuable Source of Evidence On Angiosperm Phylogeny. Ann Mo Bot Gard 1995; 82: 247-277.
5.    Jackson RB, Moore LA, Hoffmann WA, Pockman WT, Linder CR. Ecosystem rooting depth determined with caves and DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 11387-11392.
6.    Slanc P, Ravnikar M, Ĝtrukelj B. Identification of individual herbal drugs in tea mixtures using restriction analysis of ITS DNA and real-time PCR. Pharmazie in press.
7.    John ME. An efficient method for isolation of RNA and DNA from plants containing polyphenols. Nuc Acids Res 1992; 20: 2381.
8.    Pirttilä AM, Hirsikorpi M, Kämäräinen T, Jaakola L, Hohtola A. DAN isolation methods for medicinal and aromatic plants. Plant Mol Biol Reporter 2001; 19: 273a-f.
9.   Campbell CS, Wojciechowski MF, Baldwin BG, Alice LA, Donoghue MJ Persistent nuclear ribosomal DNA sequence polymorphism in the Amelanchier agamic complex (Rosaceae). Mol Biol Evol 1997; 14: 81-90.
10.  Kita Y, Ito M. Nuclear ribosomal ITS sequences and phylogeny in East Asian Aconitum subgenus Aconitum (Ranunculaceae), with special reference to extensive polymorphism in individual plants. Plant System Evol 2000; 225: 1-13.
farm vestn 2006; 57