224 Farmacija • Načini vezave makromolekulpri pripravi dostavnih sistemov za biološka zdravila
■ Proteus 79/5 • Januar 2017
Načini vezave makromolekul pri pripravi dostavnih sistemov za biološka zdravila
Tina Maver, Dragica Maja Smrke, Karin Stana Kleinschek, Uroš Maver
V zadnjem času znanstveniki vse več pozornosti namenjajo mehanizmom in pomenu interakcij med biološkimi zdravilnimi sistemi in dostavnimi sistemi zanje. Neslutene možnosti prepoznavanja in interakcij med molekulami so se pokazale šele ob številnih teoretičnih študijah na področju zvijanja proteinov (Dobson, 2003) in delovanja bioloških makromolekul v različnih organskih sistemih (Wildman, Thai, Lei, Ott, Wolf--Watz, Fenn, Pozharski, Wilson, Petsko, Karplus, Hübner, Kern, 2007).
Sistemi za dostavo bioloških zdravilnih učinkovin so zanimivi iz več razlogov. Kljub dovoljšni majhnosti za ustrezni prenos po telesu zaradi svoje izjemno velike površine omogočajo sestavljanje dovolj velikega števila bioloških molekul in tako lahko služijo kot akceptorji. Nabor materialov, ki se uporabljajo za jedra dostavnih sistemov, je izredno velik in vedno več je kliničnih študij, ki tudi potrjujejo njihovo netoksičnost in bio-kompatibilnost. Tako lahko danes izberemo jedra s posebnimi optičnimi, elektronskimi ali magnetnimi lastnostmi, ki zelo pripomorejo pri uspešnosti dostave. Da pa omenjeno lahko izkoristimo za učinkovito molekularno prepoznavo in ciljanje, moramo previdno snovati površinsko funkcionalizacijo, kar je mogoče zgolj ob dobrem poznavanju organske kemije (You, Chompoosor, Rotello, 2007).
Najbolj pogosto uporabljene funkcionalne skupine na površini dostavnih sistemov so hidroksilna, oksietilna, fenilna, karboksil-na, aminska, dialkilna, fosfonatna in estr-ska skupina. McNamee in sodelavci (2007) so preiskovali vpliv nekaterih funkcionalnih
skupin iz omenjenih skupin na adhezivnost ob stiku z rakavo celico. Želeli so namreč ugotoviti, katera od preiskovanih skupin bi bila najbolj primerna za pripenjanje bioloških zdravilnih učinkovin na dostavni sistem in katero skupino naj ima biološka učinkovina/površina dostavnega sistema, da se bo ta združba najbolj učinkovito približala površini rakave celice. Ugotovili so, da je pri preučevanem tipu rakavih celic najbolje prijemala karboksilna skupina, is česar so sklepali, da je površina rakave celice, ki se pojavlja pri melanomih, bolj pozitivno nabita. Iz tega sledi, da prihaja na površini celic, ki imajo izpostavljene bolj pozitivne skupine, do prevelikega izražanja molekul/recep-torjev (Lee, MacKay, Frechet, Szoka, 2005). Funkcionalne skupine za površinsko funkci-onalizacijo dostavnih sistemov se v grobem delijo na kovalentne in nekovalentne zaradi same narave vezi, ki je enkrat reverzibilna in drugič ireverzibilna, ter zaradi razdalj, na katerih delujejo sile, ki vzpostavljajo omenjene vezi.
Kovalentna vezava
Kovalentna vezava bioloških zdravilnih učinkovin je bila prvič uporabljena za izdelavo dostavnih sistemov, ko so zaradi kratkih razpolovnih časov in posledično neustrezne biološke uporabnosti samega zdravila farmacevtski tehnologi začeli izdelovati predzdravila. Ta sama po sebi nimajo oziroma imajo le majhen farmakološki učinek in se šele med presnovo v organizmu pretvorijo v aktivno obliko, torej v zdravilo. Prva predzdravila so bila sestavljena iz kombinacije sintetskega polimera (pogosto so to bili različni derivati polietilenoksida - PEO) in
Načini vezave makromolekul pri pripravi dostavnih sistemov za biološka zdravila • Farmacija 225
Slika 1: Shematski prikaz delovanja predzdravila: ob dodatku sintetskega polimera biološki makromolekuli lahko slednja vstopa v celico. Znotraj celice pride do encimske razgradnje predzdravila v zdravila. Avtorica: Tina Maver.
biološke učinkovine (slika 1). Predzdravilo ima takšne lastnosti, da se v prebavni cevi bolje absorbira kot aktivna oblika učinkovine, velikokrat pa se z njihovo uporabo zmanjša tudi učinek prvega prehoda, torej izgube zaradi metabolizma v jetrih.
V sintezi predzdravil obstaja zelo širok nabor kemijskih vezi, ki jih lahko uporabimo za kovalentno vezavo različnih bioloških makromolekul na površino dostavnih sistemov. Odvisno od namena vezave največ uporabljajo amidno, estrsko in etrsko vez
za povečanje stabilnosti ter sulfatno, hemi-sukcinatno in aminometilbenzoatno vez za povečanje vodotopnosti (tabela 1). Kovalentno vezavo s pridom uporabljamo
Tabela 1: Kemijske vezi, ki se uporabljajo pri pripravi predzdravil. Razlikujejo se po svoji stabilnosti v fizioloških tekočinah in svoji občutljivosti za encime v telesu.
226 Farmacija • Načini vezave makromolekulpri pripravi dostavnih sistemov za biološka zdravila
■ Proteus 79/5 • Januar 2017
Slika 2: Shematski prikaz strukture dendrimerov (a, c) in b) vezave bioloških makromolekul (zdravilne učinkovine in liganda za ciljanje) na dendrimer. Avtor: Uroš Maver.
predvsem v primeru dostavnih sistemov na osnovi dendrimerov - sinteznih polimerov nanovelikosti, s homogeno in drevesu podobno razvejeno strukturo. Neomejene sin-tezne možnosti dendrimerov omogočajo pripenjanje velikega števila različnih bioloških makromolekul naenkrat (slika 2). S kovalentno vezavo bioloških učinkovin posredujemo dostavnemu sistemu nekaj posebnih lastnosti, ki jih drugi tipi vezi ne omogočajo. Dostavni sistem tako dobi možnost ciljanja, poveča pa se tudi stabilnost nanj pripete biološke makromolekule (Gillies, Frechet, 2005), ki se lahko v primeru drugih, nekovalentnih povezav nenadzorovano sprosti, kar vodi do izgube učinkovine in včasih celo do toksičnih učinkov (McNa-mee, Aso, Yamamoto, Fukumori, Ichikawa, Higashitani, 2007).
Glavne namene kovalentne vezave bioloških
zdravilnih učinkovin na nosilni dostavni sistem lahko razdelimo v tri glavne skupine: povečevanje topnosti zelo hidrofobnih pro-teinskih molekul, povečanje stabilnosti proti proteolitični razgradnji in povečanje prehoda čez intestinalni epitelij (Peppas, Ka-vimandana, 2006). Dostavni sistemi, ki jih preiskujejo v te namene, vključujejo vse od različnih polimernih delcev, nanoemulzij, liposomov, kletk, proteinskih in nuklein-skih molekul do različnih vrst anorganskih nanodelcev (Dileo, Banerjee, Whitmore, Nayak, Falo, Huang, 2003).
Nekovalentna vezava
V bioloških sistemih so nekovalentne povezave običajno temelj za molekulsko pre-znavanje. Pod molekulskim prepoznavanjem razumemo tvorbo šibkih nekovalentnih vezi, kot so vodikove vezi in hidrofobne ali
Načini vezave makromolekul pri pripravi dostavnih sistemov za biološka zdravila • Farmacija 227
elektrostatske interakcije med vsaj dvema molekulama (slika 3), ki vodijo do specifičnega prepoznavanja in povezovanja sodelujočih molekul. Primeri takega prepoznavanja so kompleksi encim-substrat, povezave protitelo-antigen, povezave receptor-ligand in drugi. Ob dobrem poznavanju teh interakcij v naravnih procesih lahko sodelujoče funkcionalne enote vgradimo v različne dostavne sisteme in tako posnemamo naravno
molekulsko prepoznavanje, kar ima številne prednosti.
Na potek molekulskega prepoznavanja vplivata molekulska zgradba, še posebej položaj atomov in funkcionalnih skupin v molekuli, ter termodinamika vezavne interakcije (kinetične in ravnotežne vezavne konstante). Izbrane nekovalentne povezave, ki jih želimo vgraditi v dostavni sistem, lahko računalniško modeliramo z različnimi termo-dinamskimi modeli. V primeru interakcije receptor-ligand lahko tako določimo recimo afiniteto liganda do receptorja in selektivnost njune vezave. Ravnotežna konstanta disociacije predstavlja običajni parameter za izražanje moči kovalentne interakcije, ki jo določimo ob upoštevanju termodinamike interakcije (Bayer, Peppas, 2008).
k») , t
*
• I

d>.
° «p
^ j r.-
o
NH

/
V
Slika 3: Biološko makromolekulo lahko na površino dostavnega sistema nekovalentno vežemo na različne načine, a) s hidrofobno interakcijo, b) elektrostatsko, c) s specifičn o afin itetn o interakcijo (na prim er b iotin-av id in), d) s koordinativno vezjo. Avtor: Tina Maver, delno povzeto po:
http://grad. md.chula.ac. th/english %20old/index. php?option=com_content&view=article&id=ll:internation al-vjorkshop-&catid=18:international-workshop&Item id= 8
228 Farmacija • Načini vezave makromolekulpri pripravi dostavnih sistemov za biološka zdravila
■ Proteus 79/5 • Januar 2017
Slika 4: a) Aktivno mesto encima a-kimotripsin je pozitivno) nabito in zaradi izpostavljenih pozitivno) nabitih skupin na dostavnem sistemu prihaja do odboja. Posledično ne pride do vezave aktivnega mesta encima z dostavnim sistemom. b) Na površju dostavnega sistema so negativno nabite molekule in aktivno mesto encima se zaradi privlaka elektrostatskih sil veže na dostavni sistem. Avtor: Tina Maver.
a) Elektrostatska vezava/ionska vez
Elektrostatsko vezavo lahko zelo dobro uporabimo za nadzorovano sproščanje v dostavnem sistemu vezane učinkovine na specifičnem mestu v celici, saj za razliko od mehanizmov in procesov na molekulski ravni, ki jih še ne poznamo dobro, zelo dobro poznamo sestavo telesnih tekočin na vseh mestih v telesu.
Elektrostatska vezava je vrsta kemijske vezi, pri kateri se z elektrostatskim privlakom povežeta največkrat kovina (kovinski atom/
ion) in neki nekovinski ion. Vez se tvori s privlačnimi silami dveh nasprotno nabitih ionov. Običajno je kovinski ion že vezan na neki molekuli kot njen prostetični del in ima tako pozitivni naboj. S tem privlači že obstoječe nekovinske anione, ki so na primer deli zdravilne učinkovine. Na sliki 4 je prikazano, kako lahko na podlagi poznavanja zgradbe molekulskih struktur in s pomočjo elektrostatskih vezi vplivamo na selektivno vezavo ustrezno pripravljenega dostavnega sistema na želeno tarčno mesto v telesu.
Slika 5: LEVO: Nosilec poli(pirol)-NTA, ki ima proste skupine, ki služijo kot ligandi pri koordinacijski vezavi. SREDINA: Ob dodatku centralnega iona (Cu(U)) se ta veže na nosilec; v nasprotni smeri se ob dodatku EDTA, ki je močnejši ligand, ion odcepi z nosilca in se veže v EDTA. DESNO: ob dodatkuproteina s histidini bogato verigo = (histidinski rep (His-tag Protein)), se ta veže v koordinativno vez (protein je imobiliziran). Ob dodatku imidazola, ki ima večjo afiniteto do vezave v koordinativno vez s Cu(II), imidazol izpodrine vezani protein, ki se tako odcepi (Kruppa, Knig, 2006).
Avtor: Michael Kruppa in Burkhard Knig, revija Chemical reviews (pridobljeno dovoljenje).
OH,
OH HO

cuan
EDTA
His-tag Protein
CO
Protein
o=c	0= _
<-
_Imidazol _a^nv_
vOfc- ,	~CUttt"
Načini vezave makromolekul pri pripravi dostavnih sistemov za biološka zdravila • Farmacija 229
b) Koordinativna vez
Po definiciji gre pri tej vezavi za produkt, pri katerem nevtralne molekule ali anioni (imenovani ligandi) tvorijo vezi s centralnim (navadno) kovinskim atomom (ali ionom) s tako imenovano koordinativno kova-lentno vezjo fangl. coordinate covalent bond). Posebnost te vezave je, da je ligand dajalec celotnega elektronskega para, medtem ko je centralni ion prejemnik elektronskega para. Atoma ostaneta skupaj, ker skupni elektronski par privlačita jedri obeh atomov. Običajno centralni ion obdaja več ligandov. Ta vezava nam omogoča na eni strani zelo trdno in stabilno zgradbo dostavnega sistema, na drugi strani pa lahko vez zelo preprosto razcepimo (kar pride v poštev za nadomeščanje nekega vezanega liganda ali za nadzorovano odpuščanje vezane učinkovine), in sicer bodisi s spremembo pH ali pa z dodatkom specifičnih ligandov, ki imajo večjo afiniteto do centralnega atoma kot poprej vezani ligandi oziroma molekule učinkovine. Tovrstni mehanizem lahko poteka tudi na tarčnem mestu, kjer lahko koordinativni kompleks razpade, ker morda na tem mestu obstaja tak centralni atom, do katerega imajo na naš dostavni sistem vezani ligan-di (biološke makromolekule) večjo afiniteto (Kruppa, Knig, 2006).
Zaključek
Širok nabor informacij o posameznih sestavnih delih dostavnega sistema, o tarčnem mestu ter o transportni poti zdravila po telesu je pogoj za pravilni izbor načina vezave zdravilne učinkovine na dostavni sistem, ki omogoči ciljano zdravljenje in maksimalni učinek zdravljenja. Pri tem so še posebej pomembne interakcije med posameznimi deli sistema kot tudi tiste s tarčnim mestom. Tako lahko zaključimo, da je za razvoj področja priprave bioloških zdravil dobro poznavanje interakcij ključnega pomena.
Literatura:
Dobson, C. M, 2003: Protein folding and misfolding. Nature, 426: 18-25.
Wildman, K. H, Thai, V., Lei, M, Ott, M, Wolf-Watz, M., Fenn, T., Pozharski, E., Wilson, M. A., Petsko, G. A., Karplus, M., Hubner, C. G., Kern, D., 2007: Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature, 450: 838-844. You, C.-C, Chompoosor, A, Rotello, V. M., 2007: The biomacromolecule-nanoparticle interface. NanoToday, 2 (3): 34-43.
Lee, C. C., MacKay, J. A., Frechet, J. M. J., Szoka, F. C., 2005: Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology, 23 (12): 1517-1526. Gillies, E. R., Frechet, J. M. J., 2005: Dendrimers and dendritic polymers in drug delivery. Drug Discovery Today, 10: 35-43.
McNamee, C. E., Aso, Y., Yamamoto, S., Fukumori, Y., Ichikawa, H., Higashitani, K., 2007: Chemical Groups that Adhere to the Surfaces of Living Malignant Cells. Pharmaceutical Research, 24 (12): 2370-2380. Peppas, N. A., Kavimandana, N. J., 2006: Nanoscale analysis of protein and peptide absorption: Insulin absorption using complexation andpH-sensitive hydrogels as delivery vehicles. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 29: 183-197.
Dileo, J., Banerjee, R., Whitmore, M., Nayak, J., Falo, L., Huang, L., 2003: LPD mediated antigen delivery to antigen presenting cells results in enhanced anti-tumor immune responses. Molecular Therapy, 7: 640-648. Bayer, C. L., Peppas, N. A., 2008: Advances in recognitive, conductive and responsive delivery systems. Journal of Controlled Release, 132: 216-221. Kruppa, M., Knig, B., 2006: Reversible coordinative bonds in molecular recognition. Chemical reviews, 106 (9): 3520-3560.