ZAKLJUČNO POROČILO O REZULTATIH OPRAVLJENEGA RAZISKOVALNEGA DELA NA PROJEKTU V OKVIRU CILJNEGA RAZISKOVALNEGA PROGRAMA (CRP) »KONKURENČNOST SLOVENIJE 2006 - 2013« I. Predstavitev osnovnih podatkov raziskovalnega projekta 1. Naziv težišča v okviru CRP: 5.3.1 Povezovanje ukrepov za doseganje trajnostnega razvoja/ Trajnostno kmetijstvo, gozdarstvo in vama hrana/ posebni proizvodi in podpora sledljivosti 2. Šifra projekta: V4-0315 3. Naslov projekta: Razvoj biomarkeijev in multifunkcionalnega biosenzoija za sledenje virov kontaminacije v živilstvu 3. Naslov projekta 3.1. Naslov projekta v slovenskem jeziku: Razvoj biomarkeijev in multifunkcionalnega biosenzorja za sledenje virov kontaminacije v živilstvu 3.2. Naslov projekta v angleškem jeziku: 4. Ključne besede projekta 4.1. Ključne besede projekta v slovenskem jeziku: Listeria, Campylobacter, biomarker, površinska plazmonska resonanca, biosenzor 4.2. Ključne besede projekta v angleškem jeziku: Listeria, Campylobacter, Biomarker, Surface Plasmon Resonance, biosensor Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 11 od 12 5. sFaziv nosilne raziskovalne organizacije: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta 5.1. Seznam sodelujočih raziskovalnih organizacij (RO): 1027/ Institut za varovanje zdravja RS, Ljubljana 6. Sofmancer/sofinancerji: MKGP 7. Šifra ter ime in priimek vodje projekta: 07030 Sonja Smole Možina Datum: 10.10.2008 Podpis vodje projekta: Prof. dr. Sonja Smole Možina Prof.dr, Andreja Kocijančič rektorica ^pis in žig izvajalca: Po pooblastilu: prbf.dr. Franc Štampar -DEKAN- Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 11 od 12 Naslov projekta: Razvoj biomarkerjev in multifunkdonalnega biosenzorja za sledenje virov kontaminacije v živUstvu (V4-0315) Povzetek: Cilja projekta sta bila analiza tarčnih sekvenc in razvoj molekularnih markeijev za odkrivanje kontaminacije z mikroorganizmi ali njihovimi produkti ter razvoj detektoija na osnovi tehnologije resonance površinskih plazmonov (SPR) za hkratno izvedbo preiskave prisotnosti različnih kontaminentov v preiskovanih vzorcih. V okviru analize molekularno genetskih markeijev smo preučevali in razširili znanje o različnih tarčnih zaporedjih bakterijskih rodov Campylobacter, Listeria, Staphylococcus in Yersinia, bodisi genov, povezanih s patogenostjo (npr. gena/em5 S. aureus ali gena ail Y. enterocolitica), ali z bakterijsko odpornostjo (npr. mutacije genov antibiotske odpornosti in efluksa pri bakterijah Campylobacter). Delo je potekalo v sodelovanju BF in IVZ in omogoča boljšo izkoriščenost obstoječe opreme za molekularno diagnostiko obeh RO. Drugi del projekta je vključeval razvoj novega multifunkcionabiega SPR biosenzoija za detekcijo več analitov (mikotoksinov) v tekočih vzorcih (voda, živila). Izdelan je bil aparat, ki omogoča megenje več (10) biomolekulamih interakcij sočasno, obdelavo in shranjevanje meritev v uporabniku prijaznem programskem okolju, s spodnjo mejo detekcije (LOD) 1*10"^ spremembe lomnega količnika tekočega medija. Izdelane so bile tudi tehnične rešitve za pripravo kompleksnih detekcijskih površin -mikrotekočinski sistem za mestno specifično uvajanje unobilizacijskih reagentov in vzorcev na SPR detekcijsko površino. Vzporedno so bile izvedene raziskave in optimiziracije metode detekcije mikotoksinov na principu imunološkega testa na komercialnem SPR sistemu. Title of the project: Development of biomarkers and a multifunctional biosensor for detection of contaminants in food (V4-0315) Abstract: The aim of the project was the analysis of target sequences for a development of the appropriate molecular markers for detection of microbial contaminants or their products and also a development of a biosensor on the basis of surface plasmon resonance technology (SPR) for simultaneous detection of different contaminants in food or other environmental samples. In the frame of studies of molecular-genetic markers we included and improved the knowledge about different target sequences of bacterial food-borne pathogens Campylobacter, Listeria, Staphylococcus and Yersinia. The genes involved in pathogenicity (i.Q.femB in S. aureus or ail in Y. enterocoliticd), as well as the genes involved in bacterid resistance (antibiotic resistance and efflux in Campylobacter) were included. A cooperation of both involved RO was established and enable better applicability of current equipment for microbial molecular diagnostics (PCR and Real-time PCR cyclers) in both mstitutions (research and analytical laboratories). The second part of the project included a development of a new SPR biosensor configuration for detection of multiple analytes (mycotoxins) in liquid samples (water, food products and others). A new SPR detector was built for simouitaneous detection of up to 10 biomolecular interactions, with signal processing and storage userfriendly software and limit of detection 1*10"^ refractive index change in liquid media. Technical solutions were made for preparation of complex detection surfaces - a microfluidic system for site-specific introduction of immobilization reagents and samples on SPR detection surfaces. In addition research and optimization of methods for detection of mycotoxins based on immunoassay principle was done with the commercial SPR system. II. Vsebinska struktura zaključnega poročila o rezultatih raziskovalnega projekta v okviru CRP 1. Cilji projekta: 1.1. Ali so bili cilji projekta doseženi? a) v celoti S b) delno c) ne Će b) in c), je potrebna utemeljitev. Pri razvoju multifunkcionalne konfiguracije detektorja na principu resonance površinskih plazmonov {Surface Piazmon Resonance - SPR), smo v projektu naleteli na tehnične težave glede zagotavljanja primerne občutljivosti aparata za merjenje medmolekulskih interakcij {primerna 2D resolucija prikaza detekcijske površine in občutljivost na spremembo lomnega količnika (An). Optimizacija sistema je zato zahtevala dodatne tehnične posege in daljši čas dela, kot je bil predviden {večkratna sprememba v konfiguraciji aparata, optimizacija optičnega sistema in programske opreme za obdelavo podatkov). Zato je prišlo do zakasnitve v izdelavi tehničnega dela aparata do primernih merilnih lastnosti (avgust 2008). Zato dve aktivnosti, vezani na tehnično usposobljenost aparata, še nista bili izvedeni: -razvoj novih detekcijskih SPR površin na osnovi bimetalov za višjo občutljivost merjenja, -izdelava proteinskih biočipov - aplikacija izbranih vezavnih biomolekul (protiteles), selektivnih za preučevane biomolekularne markerje. 1.2. Ali so se cilji projekta med raziskavo spremenili? ^ a) da 3 b) ne v Ce so se, je potrebna utemeljitev: Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 11 od 3 2, Vsebinsko poročilo o realizaciji predloženega programa dela^: Temeljni cilji v projel(tu so bili naslednji: 1. Analiza tarčnih sekvenc in s tem razvoj molekularnih markeijev za odkrivanje kontaminacije z mikrobnimi agensi (Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni/coli, itd.), ali njihovimi produkti; 2. Razvoj hitrih, biomolekulamih testov - detektorja na osnovi tehnologije SPRM z vgrajenimi ustreznimi biomolekulami, selektivnimi na izbrane proteinske markerje. Izdelki bi uporabniku omogočali hkratno izvedbo kompleksne preiskave prisotnosti različnih kontaminentov v preiskovanih vzorcih. Skladno s postavljenimi temeljnimi cilji projekta so biie v razdobju od 01.10.2006 do 30.09.2008 opravljene sledeče aktivnosti: i Študij tarčnih sekvenc in biomarkerskih molekul patogenih mikroorganizmov, prenosljivih s hrano (Listeria monocytogene, Campylobacter jejuni, Staphylococcus aureus. Yersinia enterocolitica): V prvem delu smo uvedli glavne metodološke pristope, ki so bili predvideni za izvedbo prve stopnje projekta in so bili sledeči: 1. Teoretični izbor ciljnih sekvenc za izbor optimalnih oligonukleotidnih začetnikov iz literaturnih virov in lastnih predhodnih rezultatov o fenotipskih in genotipskih lastnostih tarčnih mikroorganizmov - patogenih bakterij, ki se prenašajo s hrano; 2. Obdelava izbranih sekvenc z računalniškim programom Primer Express (Applied Biosystem); 3. Preverjanje specifičnosti pomnožka z računalniško obdelavo in izvedbo RT-PCR: Preveijali smo specifičnost pomnožkov s programom Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) s primerjavo z znanimi sekvencami v dosegljivih bazah podatkov. Pripravili smo relativne standardne krivulje z izbranimi oligonukleotidnimi začetniki ter analizo morebitnega spajanja v paru preko analize talilne krivulje. Praktično smo preverili teoretične rezultate z izvedbo PCR v realnem času na večjem številu izolatov, pri čemer smo uporabili seve patogenih mikroorganizmov iz lastne zbirke. Pri tem smo se najprej osredotočili na bakterije vrste Salmonella enterica, Listeria monocytogenes in Bacillus cereus (pri slednjem je bil cilj raziskave karakterizacija sinteze emetičnega toksina, kot osnova za nadaljnje raziskave molekularno-genetskih osnov sinteze toksina, ki je vzrok zastrupitev s hrano). Delo smo nadaljevali z obema glavnima tarčnima organizmoma (Listeria, Campyiobacter) na preučevanju uporabnosti barvil etidijevega mono-azida (EMA) in propidijevega monoazida (PMA) za zmanjšanje lažno pozitivnih rezultatov detekcije signala PCR iz mrtvih bakterijskih celic. Barvilo EIVIA naj bi selektivno vstopalo le v celice s poškodovano celično membrano, vendar se je izkazalo, da vpliva tudi na rast bakterij Listeria in Campylobacter, zato je ta reagent slab indikator živih oz. mriivih celic. Barvilo PMA je dalo boljše rezultate, kar je razvidno iz primerjalnih analiz z drugimi metodami (klasično kuitivacijsko tehniko oz. določanjem CFU ali fluorescentnim mikroskopiranjem-neposrednim štetjem bakterijskih celic), vendar le z nekaterimi testnimi organizmi. Zato smo preučevali vzroke in nadaljnje možnosti izboljšanja tehnike, ki vključuje tudi delovanje efluksnih črpaik bakterijske ovojnice, ki jih preučujemo pri bakterijah Campylobacter. Rezultati dela o kvantitativni detekciji bakterij In karakterizaciji efluksnih črpalk so bili septembra 2007 predstavljeni z dvema predavanjema na 3. Slovenskem kongresu o hrani in prehrani. Metodiko molekularne identifikacije bakterij Camypiobacter smo uporabili pri karakterizaciji izolatov iz vzorcev vode in piščančjega mesa. Delo je bilo s predavanjema predstavljeno na domačem in mednarodnem kongresu, v letu 2007 pa sta bila z rezultati molekularne detekcije in karakterizacije objavljena tudi dva originalna znanstvena članka v vodilnih revijah na področju živilske mikrobiologije. V nadaljevanju smo vpeljali delo na biomarkerskih molekulah bakterij vrst Staphylococcus aureus in Yersinia enterocolitica. Bakterije S. aureus lahko tvorijo različne enterotoksine (poznanih je 19). Izbrali smo sekvence genov sea, seb, sec in sad, ki so v živilih najpogosteje odgovorni za tvorbo enterotoksinov. Kot markersko sekvenco za določanje bakterij S. aureus smo izbrali gen femB površinskega proteina B. V praktičnem delu smo optimizirali reakcije PCR v realnem času (določitev koncentracije oligonukleotidnih začetnikov in koncentracije MgCI2) in razmere encimskih reakcij prilagodili univerzalnemu programu pomnoževanja DNK. ^ Potrebno je napisati vsebinsko raziskovalno poročilo, kjer mora biti na kratko predstavljen program dela z raziskovalno hipotezo in metodološko-teoretičen opis raziskovanja pri njenem preverjanju ali zavračanju vključno s pridobljenimi rezultati projekta. Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 11 od 4 Delo je potekalo v sodelovanju s sodelujočo RO, Institutom za varovanje zdravja (IVZ RS), kjer so vpeljane tudi referenčne metode izolacije omenjenih patogenih bakterij Iz živil in detekcije tvorbe stafilokoknih enterotoksinov (test RPLA). V nadaljevanju smo s klasično mikrobiološko metodo določanja stafiiokokov v živilih (SIST EN ISO 6888-1:1999/A1:2003) preiskali 40 vzorcev živil ter izolate identificirali in jih shranili. S PCR v realnem času smo ugotovili, da je 20 % vzorcev vsebovalo bakterije vrste S. aureus, ki ne tvorijo enterotoksinov a, b, c in d. Kombinacija standardne mikrobiološke metode določanja in kvantifikacije bakterij vrste S. aureus v živilih in PCR v realnem času za določanje najbolj pogostih stafilokoknih enterotoksinov omogoča preiskovanje večjega števila vzorcev ter njihovo karakterizacijo in vrednotenje. Sočasno so na sodelujoči RO uvedli metode odkrivanja patogenih sevov V. enterocolitica na osnovi kombiniranega postopka klasične in metode POR z odkrivanjem gena ail z zapisom proteina, povezanega s patogenostjo teh bakterij za človeka. Testirali so različne načine priprave tarčne DNK, različne mešanice PCR ter patogene in nepatogene seve Y. er}terocolitica. Primerjava rezultatov molekularnih analiz s klasičnimi fenotipskimi analizami je pokazala, da se rezultati biotipizacije in serotipizacije ujemajo z določitvijo ail gena, povezanega s patogenostjo sevov Y. enterocolitica. Opisano delo je bilo opravljeno v okviru razvoja metodologije dela, ki vključuje uporabo metode PCR in PCR v realnem času, kar je bi^ prvi cilj tega projekta - razvoj znanja o biomarkerskih molekulah, kar bi omogočilo boljšo izkoriščenost aparatov PCR, ki so del opreme Laboratorija za živilsko mikrobiologijo, BF, prijavitelja tega projekta, in IVZ, sodelujoče raziskovalne organizacije tega projekta. Drugi del projekta pa je bii vezan na razvoj t.i. SPR aparature in s tem v zvezi tudi na detekcijo glivnih toksinov. Zato smo poleg bakterijskih patogenih kultur preučevali tudi rast in tvorbo ohratoksina A pri plesnih Penicillium verrucosum in Aspergillus westerdijkiae ter aflatoxina B1 in 82 pri plesni Aspergillus flavus. Ohratoksine in aflatoxine tvori več vrst plesni rodu Penicillium in Aspergillus. Kemijsko so sorodne spojine, ki jim je osnova izokumarinska molekula, povezana z L-feni!alaninom. V živilih se izmed vseh ohratoksinov največkrat pojavlja ohratoksin A, ki ga tvorijo predvsem plesni vrste Penicillium verrucosum ter aflatoxina B1 in B2 ki ju tvori A. flavus. V praktičnem delu smo zato določili vpliv okoljskih dejavnikov na rast plesni vrste Penicillium verrucosum in vzporedno na rast štirih drugih sevov Penicillium. Med okoljskimi dejavniki smo spreminjali temperaturo (med 10 in 25 «C), vodno aktivnost (med 0,900 in 0,999), vrednost pH (med 4,6 in 6,5) ter vrsto gojišča (tekoče in trdno gojišče, kruhov analog). Izračunali smo relativne hitrosti rasti pri izbranih okoljskih parametrih in v enakih razmerah spremljali tvorbo ohratoksina A pri rasti plesni vrste Penicillium verrucosum (gojišče YES, pH 4,5 in 6,5, aw 0,90 in 0,99 in T10 in 25 ""C. Vzorciii smo vsakih sedem dni, skupno do 42 oz. 56 dni. Ohratoksin A smo določali spektrofluorimetrično (metoda v razvoju na Katedri za biotehnologijo), katere občutljivost je 34,2 ng mM. Plesni vrste P. verrucosum so tvorile OTA na gojišču YES z aw 0,90 in pH 4,5 po 35 dneh inkubacije pri 25 "C, tvorbo OTA na gojišču YES z aw 0,90 in pH 6,5 pri 25 °C pa smo določili šele po 56 dneh. Pri temperaturi 10 ®C in ostalih okoljskih parametrih OTA nismo določili oz. so bile koncentracije pod mejo občutljivosti metode. Rezultati so pokazali, da ima temperatura največji vpliv na tvorbo OTA, za določitev vpliva aw in pH bi bilo potrebnih več raziskav. Preverili smo tudi vpliv nekaterih rastlinskih ekstraktov na rast plesni A. flavus in A. westerdijkiae ter produkcijo mikotoksinov (aflatoxin BI, 82 ter ohratoxin A). Koncentracijo mikotoksinov smo v tem primeru določali s pomočjo encimsko imunskega testa (ELISA). Rastlinski ekstrakti niso vplivali na rast plesni, so pa v nekaterih primerih inhibirali produkcijo mikotoksinov. Drugi del projekta je vključeval razvoj detektorja na osnovi tehnologije SPRM z vgrajenimi ustreznimi biomolekulami, selektivnimi na izbrane proteinske markerje. Izdelki bi uporabniku omogočali hkratno izvedbo kompleksne preiskave prisotnosti različnih kontaminentov v preiskovanih vzorcih. Program dela je skladno s temeljnimi cilji v projektu vključeval: -razvoj in izdelavo detektorja (biosenzorja) na osnovi tehnologije resonance površinskih plazmonov (Suri^ace plazmon resonance), ki bi omogočal sočasno detekcijo več analitov - biomarkerjev; - sklapljanje tehnoloških pristopov in konfiguracije SPR, ki bi omogočala sočasno zajemanje podatkov iz celotne detekcijske površine senzorja (prikaz detekcijske površine), primernih mikropretočnih sistemov za izdelavo proteinskih čipov ter aplikacijo izbranih biomolekul, selektivnih na preučevane biomarkerje - na osnovi tega izdelava multifunkcionalnega analitskega sistema. -razvoj in izdelavo mikropretočnih sistemov za pripravo proteinskih biočipov na SPR detektorju, ter Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 11 od 5 kontroliran vnos vzorcev čez detekcijsko površino. ~~ ~ "— -razvoj novih detekcijskih površin na osnovi bimetaiov, ki bi omogočale višjo občutljivost meijenja. -pripravo proteinskih biočipov za detekcijo izbranih molekularnih markerjev (mikotoksinov), izdelavo metode merjenja ter določitev merilnih lastnosti. -detekcijo izbranih analitov s komercialnim SPR sistemom (Biacore) ter primenavo merilnih lastnosti z izdelanim detektorjem. Glede na zastavljeni cilj v projektu je delo na projektu potekalo v sklopih: 1. Razvoj in izdelava aparata na principu resonance površinskih plazmonov (SPR) v konfiguraciji, ki bi omogočala sočasno zajemanje in podatkov iz celotne detekcijske površine senzoija - ti. SPR mikroskopija: Poslužili smo se osnovne strukture v laboratoriju predhodno že izdelanega SPR detektorja v klasični (Kretchmanovi) konfiguraciji, ki je bil v projektu v več stopnjah predelan za doseganje 2D prikaza detekcijske površine, z resolucijo, primemo za prikaz in merjenje biomoiekulamih interakcijskih mest na detekcijski površini, organizirani v obliki biočipa: V obdobju 1.1.-31.3.2007 je bila izdelana konfiguracija SPR mikroskopa s konstantnim vpadnim kotom analitske svetlobe. Aparat je bil povezan na prenosni računalnik in v komercialnem programskem okolju VisionAssistant omogočal 2D prikaz detekcijske površine. Pri preverjanju merilnih lastnosti na standardnih raztopinah z definiranim lomnim količnikom medija je resolucija prikaza detekcijske površine znašala lOOMm, spodnja meja detekcije na spremembe lomnega količnika (An) pa je znašala >10-3, in ni zadoščala potrebam analiz biomolekulskih interakcij (protitelo - mikotoksin); minimalna potrebna spodnja meja detekcije <10-''An. 2a izboljšanje občutljivosti aparata so bili v obdobju 1,4. - 31.12.2007 izvedeni dodatni tehnični posegi na inštrumentu: izboljšan izvor svetiobe, ki zagotavlja monokromatske pogoje z nizko stopnjo divergence analitske svetlobe (zamenjava laserske diode z HeNe laserjem), filtracija nultega reda difrakcijskega minimuma - (montaža filtra), interferenčna filtracija signala na principu (IWach-Zhender) interferometriie (slika 1). Slika 1: SPRI senzor prototip (levo), prikaz nadgrajene staikture (desno). Označena sta sklopa elementov za izboljšanje kakovosti optičnega signala; ftliracija nultega reda difrakcijskega minimuma - levo, interferenčna filtracija - desno. Tehnični poseg je pripomogel k izboljšanju resolucije prikaza detekcijske površine, ni pa izboljšal občutljivosti detektorja. Poleg tega se je povečala občutljivost na mehanske vibracije v okolju, pojav interferenčnih območij v projekciji, ter občutljivost na spremembe svetlobe v okolici (Slika 2). Slika 2: 2D slika detekcijske površine pred -levo in po filtraciji šuma -sredina (razdalja med kanali SOOfjm). 2D slika celotne detekcijske površine; prikaz 10 kanalov -desno._ Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 11 od 6 Zaradi teh težav in potrebne večje občutljivosti detektorja smo v zadnjem obdobju projeltta temu posvetili več pozornosti in v detekcijskem sistemu s spremembo geometrije analitske svetlobe dosegli izboljšavo občutljivosti aparata na ICt^Gn ter izvedli opredelitev merilnih lastnosti aparata (Slika 2a). average SD =0.28'^ LOD= 0.8x10-' 1,3S30900 1^331903 1,3332900 1,3333900 1,333<900 1.333S900 15336900 1,3337900 refradns Index « 506 500 A \\ /T \\\ —^fe 30 t(s) Slika 2a: Občutljivost detektorja (levo), prikaz meritev občutljivosti (desr)o), vrednosti standardov od 1*10^ do 6*1(H An). V sistemu je bila z dodatkom cilindrične leče (pred detekcijsko površino) analitska svetloba fokusirana na detekcijsko površino v obliki črte, ki prečka mikropretočne kanale (slika 3). Slika 3: SPRI senzor- nadgradnja optičnega sistema; stmktura - levo, slika senzorja - sredina, svetloba fokusirana na detekcijsko površino v obliki črte preko 10 kanalov (desno) Resonančna stanja v posameznih ločenih mikropretočnih kanalih so bila v projekciji svetlobe opažena kot območja z nižjo intenziteto, ki so glede na lomni količnik merjenega tekočega vzorca spreminjala položaj (sprememba vpadnega kota ki ustrezajo resonančnlm pogojem in posledično vertikalen pomik temnega območja v projekciji - slika 4). Slika 4: Prikaz projekcije signalov v 10 kanalih! temno območje sovpada z resonančnlm stanjem, metanol (levo), premik resonančnega stanja po dodatku vode v 1, 3, 5, 7, 9 kanal (desno). Zaradi uvedenega posega In spremenjenega načina detekcije resonančnega stanja smo izdelali računalniški program v programskem okolju Labview, ki omogoča komunikacijo med prenosnim računalnikom ter svetlobnim detektorjem (CCD), s kontroliranim zajemanjem, obdelavo in shranjevanjem videopodatkov. V ta namen je bil izdelan programski algoritem, ki omogoča (uporabniku prijazen) kontinuiran prikaz signala v posameznih kanalih mikropretočnega sistema (1.4.-31.7. 2008). Izdelani program omogoča filtracijo šuma (povprečenje signalov) z možnostjo optimizacije nastavitve obdelave podatkov v posameznih kanalih mikropretočnega sistema (slika 5). _ Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 11 od 7 jB»-- SÜka 5: Prikaz izdelanega programsiiega o/fo/ya za SPR deteidor, nadzorno okolje (levo), programska siiema (desno). Izdelana konfiguracija aparata SPR zadošča pogojem za sočasna meijenja več biomolekularnih interakcij. Ob odstranitvi dodanih cilindričnih leč, prav tako aparat omogoča tudi 2D prikaz detekcijske površine, ki pa med potekom merjenja interakcij zaradi spremenjenega pristopa merjenja ni možen. 2. Razvoj in izdelava mikropretočnega sistema za pripravo proteinskih biočipov; -Izdelan je bil preprost mikrotekočinski sistem za kontroliran vnos reagentov/vzorcev na detekcijsko površino, ki zagotavlja pogoje za pripravo proteinskega biočipa (1.1-31.12.2007). Mikrotekočinski sistem je bil pripravljen s pomočjo tehnike fotolitograflje za pripravo kalupov ter tehnike odlivanja elastomerov (sintetični polimer polldimetilsiloksan PDMS) na pripravljene kalupe. Izdelan je bil 10 kanalni mikropretočni sistem, z vzporednimi neodvisnimi mikrokanali na površini 8x8mm (širina kanala 200|jm), ter primemo ohišje za vpenjanje mikrotekočinskega sistema na detekcijsko površino. Z uporabo grafičnega programskega okolja in inkjet tiskanja na acetatne prosojnice so bile izdelane maske za izvedbo fotopostopka v okvim fotolitograflje (slika). Pri izdelavi mask so bile upoštevane dimenzije ki omogočajo mehansko obdeiavo ter sklapljanje cevi tekočinskega sistema povezanega z črpalko ter ventili SPR aparata. Pri izdelavi kalupov smo kot substrat za jedkanje preverili možnost uporabe "pertinax" plošč, ki se uporabljajo v elektrotehniki in ugotovili, da ne zagotavljajo dovoljšnje globine odlitka mikrokanalov (10-30|j) ter posledično mašenje mikropretočnega sistema ob mehanski namestitvi. Problem smo odpravili z izvedbo fotolitografskega postopka na bakreni pločevini ter zagotovili globino mikrokanalov ca. 250|jm ki zadošča potrebam pretoka tekočin (slika 6). Slika 6; PDMS odlitek mikrokanalov (levo), mikrotekočinski sistem in detekcijska površina (sredina), kalup mikrotekočinskega sistema (desno). Vzporedna organizacija mikrokanalov v pripravljenem mikrotekočinskem sistemu omogoča pogoje za kontroliran mestnospecifičen vnos reagentov/vzorcev čez detekcijsko površino ter pripravo proteinskih biočipov. Simetričnost izdelave vpenjala mikotekočinskega sistema pa omogoča namestitev mikrotekočinskega sistema v dveh položajih ki sta med seboj lahko zasukana 90°. Možnost zasuka mikrotekočinskega sistema pa omogoča možnost vodenja tekočih vzorcev (do 10) pravokotno čez 10 vrst biomolekul ki so imobllizirane v progah čez detekcijsko površino ter posledično do 100 interakcijskih mest. 3. Detekcija preučevanih analltov s komercialnim SPR sistemom: V projektnem obdobju 1.4.-31.12 2007 smo izvajali eksperimente izdelave in optimizacije metode detekcije mikotksinov (afiatoksin BI (AFB1)) na komercialnem aparatu Biacore T100 (Infrastrukturni center za površinsko plazmonsko resonanco). Pri oblikovanju metode detekcije smo preverili tri pristope detekcije na principu imunološke detekcije s protitelesi (monoklonska protitelesa specifična za mikotoksln BI, B2), optimizirali pogoje za imobilizacijo biomolekul (visoka gostota nanosa) ter regeneracijo detekcijske povšine: -Pri "direktni detekciji" mikotoksina z imobilizacijo protiteles (anti AFB1) na detekcijsko površino ter merjenju Obrazec ARRS-RI-CRP-ZP/2008 Stran 11 od 8 interakcije z AFB1 v vodni fazi so rezultati pol