Oznaka poročila:ARRS-RPROJ-ZP-2014/88 ZAKLJUČNO POROČILO RAZISKOVALNEGA PROJEKTA A. PODATKI O RAZISKOVALNEM PROJEKTU 1.Osnovni podatki o raziskovalnem projektu Šifra projekta Z1-2190 Naslov projekta Virulentnost bakterij Campylobacter v modelu: okoljski stres -celične linije Vodja projekta 22491 Anja Klančnik Tip projekta Z Podoktorski projekt Obseg raziskovalnih ur 3400 Cenovni razred A Trajanje projekta 06.2013 - 07.2013 Nosilna raziskovalna organizacija 481 Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Raziskovalne organizacije -soizvajalke Raziskovalno področje po šifrantu ARRS 1 NARAVOSLOVJE 1.03 Biologija Družbenoekonomski cilj 07. Zdravje Raziskovalno področje po šifrantu FOS 1 Naravoslovne vede 1.06 Biologija B. REZULTATI IN DOSEŽKI RAZISKOVALNEGA PROJEKTA 2.Povzetek raziskovalnega projekta1 SLO Potrošniki želimo in imamo pravico kupovati in uživati le kakovostno hrano, pri čemer je pomembna mikrobiološka neoporečnost živil v celotni živilsko predelovalno oskrbovalni verigi. Bakterije C. jejuni so vodilni povzročitelji črevesnih okužb ljudi v razvitih državah. Glavni vzrok je kontaminirana hrana. Do kontaminacije mesa pride med zakolom živali, vzrok epidemij sta tudi kontaminirana voda in mleko, saj je infektivna doza zelo nizka. Zaradi naraščajoče odpornosti proti antibiotikom se intenzivno razvijajo nove tehnologije in sredstva za omejevanje kontaminacije s C. jejuni in/ali zdravljenje okužb. Med nova protimikrobna sredstva sodijo tudi naravne rastlinske učinkovine. Delovanje antibiotikov je dobro poznano, delovanje rastlinskih derivatov fenolnih in terpenskih spojin na bakterije Campylobacter pa še dokaj neraziskano. Tekom projekta smo za bakterije Campylobacter opisali kompleksen mehanizem izlivnih sistemov, vključenih v odpornost proti rastlinskim učinkovinam. Učinkovitosti naravnih fenolnih spojin proti bakterijam rodu Campylobacter tako podaja potencialne protimikrobne učinkovine za zagotavljanje varnosti v živilski proizvodno-oskrbovalni verigi in/ali za preprečevanje in zdravljenje mikrobnih okužb. Dokazali smo, da lahko te spojine delujejo tudi kot modulatorji bakterijske odpornosti proti drugim protimikrobnim snovem, zato so še toliko bolj zanimive alternativne protimikrobne snovi. Varnost živil ogroža tudi prilagoditev bakterij na okoljski stres, ki se odrazi v boljši preživelosti in večji virulentnosti patogenih bakterij. Stres pa vpliva tudi na gostiteljske (črevesne) celice in poveča ali zmanjša njihovo občutljivost. Kljub visoki prevalenci bakterij C. jejuni in kampilobakterioz je stresni odziv teh bakterij slabo poznan. Ne vsebujejo mehanizmov prilagoditve drugih bakterij, prenosljivih s hrano, a strese zaznajo, povečajo odpornost s spremembo morfologije, tvorbo VBNC, sintezo proteinov in virulentnih dejavnikov. Tekom projekta smo potrdili vpliv kombiniranega okoljskega stresa in protimikrobnih snovi na različnih fizioloških nivojih mikrobnih celic na modulacijo virulence bakterij rodu Campylobacter ter vpliv izbranega naravnega dodatka na modelne gostiteljske črevesne celice. Ključno vloga stresnega odziva smo potrdili tudi na živalskem modelu mišk preko modulatorne vlogi tvorbe IFNy, ki je znan kot pomemben dejavnik pri patogenezi infekcije in nakazuje vlogo v začetnem imunskem odzivu. Odziv kampilobaktrov je nujen za preživetje v gostitelju ter s tem na njihovo patogenost, kar lahko vpliva tudi na zdravje ljudi in živali. ANG The consumers wish and have right to buy only the food products of high quality. One of the critical points for this is microbiological safety along food production and supply chain. Campylobacter spp. cause food-borne illnesses worldwide due to contaminated food and cross-contamination. Meat contamination is usual during slaughtering, but contaminated water or milk could cause the outbreak due to low infection dose. New antimicrobials are needed to control the prevalence of C. jejuni, and for clinical treatment of campylobacteriosis. Plant derived phenolic and terpen derivates have been recognized as alternative antimicrobials. However, while the target site activities of most antibiotics are well known, the killing mechanisms of these natural plant compounds in Campylobacter spp. remain largely unknown. During the project we demonstrated that complex efflux mechanisms, which are involved in the resistance of C. jejuni to phenolic compounds and extracts of plant phenolics. These findings represent the first comprehensive evaluation of the anti-Campylobacter and modulatory activities of natural phenolics and suggest that alternative compounds can be further developed to control Campylobacter contamination in food production and processing, or as therapeutics for clinical treatment of campylobacteriosis. These compounds can also target efflux pumps and export of antibacterial drugs out of bacterial cells, so that they are even more interesting alternative antimicrobials. The problem concerning food safety is at least partly the consequence of microbial adaptation to environmental stress resulting in the increased survival and virulence properties of pathogenic bacteria. In addition, stress has an impact on increased/reduced sensitivity of the host (intestinal) cells. Despite high incidence, the response of campylobacters is not clear yet. They do not possess the mechanisms of other food-borne pathogens, but they sense and react to stresses with morphology changes, VBNC formation, synthesis of proteins and virulence factors. During the project we determine the combined influence of environmental stress/antimicrobial agent on different levels of microbial physiology and virulence of Campylobacter; and determine the influence of selected additives to the survival of campylobacters in an in vitro cell culture model of and host epithelium. The most pronounced differences were confirm also including in vivo experiments with mice as use models for investigating pathogenesis of experimental campylobacteriosis. InterferonY and interleukin 10 productions thus indicate their roles in the immune response to C. jejuni infection. The study of environmental impact on bacterial virulence reveals that microbial adaptation during stress challenge is crucial not just for pathogen survival out of the host, but also during host-pathogen interactions, and thus for the bacterial pathogenicity. 3.Poročilo o realizaciji predloženega programa dela na raziskovalnem projektu2 Podoktorski projekt je zaradi dveh porodniških dopustov ter dopustov za nego in varstvo otroka potekal med štirimi koledarskimi leti: meseci 1-12 (1.5.2009-22.4.2010), meseci 13-19 (22.5.2011-31.12.2011), meseci 19-22 (1.1.2012-1.4.2012), meseci 22-24 (1.6.201331.7.2013). Tekom podoktorskega projekta je moje raziskovalno delo na patogenih bakterijah Campylobacter, ki se zlahka prenašajo v prehransko verigo človeka, potekalo zelo aktivno na vseh predvidenih področjih, kar je dalo veliko zanimivih rezultatov. Skladno s postavljenimi temeljnimi cilji projekta so bile opravljene sledeče aktivnosti po sklopih. WP1: Raziskava vpliva stresnih razmer na fiziologijo in preživetje mikrobnih celic Ovrednotili smo vpliv okoljskih stresov na preživetje kampilobakterjev (sklop 1.1) ter njihov odgovor na protimikrobne snovi (sklop 1.2) in prehod v odpornejša stanja (sklop 1.3). Z vpeljanimi metodami ugotavljanja živosti z barvilom Live/Dead BacLight, spremljanjem metabolne aktivnosti (npr. znotrajcelična oksidacija, encimska aktivnost), elektronskim mikroskopiranjem in drugimi metodami smo potrdili, da izpostavitev bakterija C. jejuni stradanju, temperaturnemu ali oksidativnemu stresu vpliva na fiziološke in morfološke spremembe celic. Predhodno stradana kultura se na dodatne strese prilagodi s prehodom v stanje VBNC ter zmanjšanim metabolizmom. Vendar pa slednja ne predstavlja spečega stanja celic, kar smo dokazali s povečano odpornostjo stradanih celic na toplotni in peroksidni stres. Za spremljanja vpliva protimikrobnih snovi smo objavili natančnejše in bolj občutljive metode mikrodilucije za kampilobakterje, na osnovi ugotavljanja prisotnosti ATP, metabolne aktivnosti z reagentom INT in pretočno citometrijo ter tako definirali najnižje inhibitorne koncentracije (MIK) [Klančnik in sod., J Food Prot COBISS.SI-ID 3604088; J Microb Methods COBISS.SI-ID 3836536]. Največ pa nam o delovanju izvlečkov povedo kinetika inhibicije rasti ter morfološke spremembe, ki so pokazale prehod celic iz spiralne v druge oblike, vpliv na deljenje, ter nastanek por v celični ovojnici, a ne prehoda v stanje VBNC. Z vpeljavo nove metode testiranja z 'food microdilution' oz. metodo mikrodilucije v modelnih živilih [Klančnik in sod., Int J Food Sci Technol COBISS.SI-ID 3836536] smo dopolnili metodološke nejasnosti v literaturi na tem področju ter tudi ovrednotila njihovo uporabnost v proizvodni verigi za zmanjšanje števila kampilobaktrov v proizvodni verigi živil [Piskernik in sod., Food Control COBISS.SI-ID 3773560]. Preko sodelovanja, vzpostavljenega s prof. dr. Qijing Zhang (Iowa State University, ZDA) sem z metodo naravne transformacije pridobila tri mutante v tarčnih genih cmeB, cmeR in cmeF membranskih izlivnih črpalk, vključenih v odpornost kampilobaktrov. Preko primerjave z divjim tipom ter uporabo inihbitorjev membranskih izlivnih črpalk (PAßN, NMP, CCCP ,Verapamil, Reserpine) sem predstavila pomembne ugotovitve o molekularnih mehanizmih odpornosti ter mehanizmu protimikrobnega delovanja snovi rastlinskega izvora. Kot prvi smo ovrednotili aktivno vlogo izlivnih sistemov CmeABC in CmeDEF na pridobljeno odpornost proti naravnim protimikrobnim učinkovinam [Klančnik in sod., PloS one COBISS.SI-ID 4160120]. Preko sodelovanja s prof. dr. Franz Bucarjem (Karl-Franzens-University Graz, AU) pa sem mehanizme protimikrobnega in potencialno modulatornega delovanja preizkusila tudi na izvlečkih Alpinia katsumadai [Klančnik in sod., J Appl Microbi COBISS.SI-ID 4120696]. Naravni izvleček Alpinia katsumadai smo uspešno uporabili tudi na končnem živilu (mletem mesu), v katerem je inhibiral rast patogenih bakterij [Klančnik in sod., J Sci Food Agric COBISS.SI-ID 4334968]. Vse te objave nakazujejo nujnost poznavanja odziva bakterij na naravne protimikrobne učinkovine ter poznavanja mehanizmov delovanja in mehanizmov, ki prispevajo k odpornosti, tudi v biofilmu bakterij [Smole Možina in sod., Biofilms Bioengi Book, COBISS.SI-ID 4286584]. Iz te osnove smo z namenom razvoja učinkovite in varne strategije za preprečevanje okužb s kampilobaktri raziskave razširili tudi na modulatorno delovanje bioaktivnih učinkovin za učinkovit nadzor patogenih bakterij. Dokazali smo modulatorno aktivnost bakterijske odpornosti čiste bioaktivne učinkovine epigalokatehin galata ter naravnega izvlečka Alpinia katsumadai [Kurinčič in sod., Int J Antim Agents COBISS.SI-ID 4119160; Klančnik in sod., J Appl Microbi COBISS.SI-ID 4120696]. WP2: Raziskava in vitro celičnih modelov za testiranje virulentnosti bakterij Campylobacter Z vključitvijo treh in vitro celičnih modelov Caco-2, Makrofage J774 ter PSI celice (sklop 2.1) smo ovrednotili vpliv okoljskih stresov na njihovo integriteto (sklop 2.2) in virulentnost bakterij C. jejuni (sklop 2.3) ter indukcijo stresnega odgovora (sklop 2.4). Potrdili smo vpliv stresnih razmer na virulentnost bakterij C. jejuni, ne glede na uporabljeno celično linijo. Oksidativni stres je povečal vezavo, vstop ter tudi preživetje bakterij znotraj celic Caco-2 [Klančnik in sod., Res Microbi COBISS.SI-ID 3635064]. Medtem ko so bakterije uspešno vstopile v celice makrofagov, pa pričakovano niso bile spodobne dolgotrajnega preživetja [Šikic Pogačar in sod., Int J Food Microb COBISS.SI-ID 3532920]. Toplotni stres je povečal sposobnost adhezije pri model ptičjih črevesnih celic epitelij (PSI), medtem ko jo je oksidativni stres zmanjšal. Stradanje je negativno vplivalo na vse virulentne sposobnosti. Prav tako nismo dokazali korelacije med prehodom preko polariziranih celic epitelija ter transepitelno električno upornost pri celičnih linijah PSI. Poleg adhezije ter invazivnosti smo predstavili nove metode prehoda kampilobaterjev preko polariziranih epitelnih celic (TER) in transepitelno električno upornost za spremljanje vpliva bakterij na celično integriteto [Šikic Pogačar in sod., Foodborne Pathog Disease COBISS.SI-ID 3737720]. Kratkotrajno stradanje je tudi spodbudilo stresni odgovor bakterij ter prehod celic v stanje VBNC, za katerega smo dokazali da kljub zmanjšanemu metabolizmu povzroči pridobitev navzkrižne odpornosti. Vendar pa smo bakterijam v potencialno kritični obliki za povzročitev bolezni dokazali zmanjšane virulentne aktivnosti ter s tem zmanjšano infektivnost. WP3 in WP 4 Optimizacija in vivo živalskega modela za študij virulentnosti bakterij Camyplobacter ter spremljanje lokalne/ sistemske kampilobakterioze Glede na točko 4.1 smo v sodelovanju z prof. Majo Abram ter Darinko Vučkovic (Univerza na Reki, Hrvaška) optimizirali mišji in vivo model ter ga uporabil pri bakterijah, izpostavljenih stradanju. Ugotovili smo da tudi stradani kampilobakterji lahko povzročilo sistemsko kampilobakteriozo testnih mišk. Vendar pa so bakterije preživele le znotraj jeter in ne v tudi v vranici. Namesto razvoja novega in vitro modela s celicami praživali smo se usmerili na ugotavljanje lokalne in sistemske kampilobaterioze ter profila lokalnih in sistemskih citokinov (toksinov). To nam je omogočilo predvsem odlično sodelovanje s prof. Majo Abram ter Darinko Vučkovic (Univ. Reka, HR), s katerimi smo optimizirali in vivo model mišk Balb/c (H2d), ki smo ga uspešno vključili v del raziskave o spremljanju virulentnosti. Preko bakteriološke analize organov in vivo modela mišk smo spremljali kinetiko prisotnosti kampilobakterjev v jetrih in vranici po 1, 3 in 8 dnevu infekcije s predhodno izpostavljenimi stradanju, kisiku, toplotnemu stresu. Zmanjšano infektivnost kampilobaktrov v stanju VBNC smo potrdili tudi v in vivo živalskemu modelu ter dokazali pomembno vlogo mehanizmov prilagoditve na oksidativni stres pri preživelosti med interakcijo gostitelj-patogen ter s tem vlogo pri patogenezi [Klančnik in sod., Res Microbi COBISS.SI-ID 3635064]. Fiziologijo in virulenco kampilobaktrov smo podrobno raziskali tudi preko primerjave in vitro ter in vivo modelov. Taka primerjava je v literaturi zelo redka, saj se malokrat ekspertize med seboj pokrivajo. Naše znanje, aktivnosti in pridobljeno sodelovanja so nam tako omogočili primerjalno analizo viruentnih dejavnikov (adhezija, invazija, znotrajcelična preživelosti, TER) študiranih na različih celičnih linijah (CaCo2, makrofagai, PSI celice) z lokalne/sistemske kampilobateriozeo preko kolonizacije različnih organov (vranica, jetra) in vivo modela mišk. Kot smo objavili smo infektivnost kampilobakrov na celičnih linijah potrdili tudi v BALB/c modelu mišk. Prilagoditev kampilobaktrov na neugodne stresne pogoje je vključena v njihovo podaljšano preživelost pri interakciji gostitelja in patogena ter s tem v njegovo patogenost. Izpostavitve bakterij predhodnemu subletalnemu stresu, ki izzove stresni odziv celic, lahko torej lahko modulira virulentnost kampilobaktrov, ter tako povečuje tveganje tudi v proizvodnji in pripravi živil. Bakterije smo predhodno izpostavili toplotnemu in kisikovemu stresu ter kombinaciji predstradanja in naknadnega kisikovega stresa ter ugotavljali profil citokinov IL6, IL10, TNFa, ter IFNy v jetrih in plazmi. Tako smo kot prvi nakazali vlogo stresnega odziva bakterij v začetnem imunskem odzivu celic [Klančnik in sod., Foodborne Pathog Disease COBISS.SI-ID 4242296]. Potrdili smo tudi spremembe virulentnosti bakterij C. jejuni kot odgovor na prisotnost naravnih protimikrobnih snovi tako v in vivo modlu mišk ter analizo citokinskega profila. Izvedli smo spremljanja kinetike prisotnosti divjega tipa in mutanta cmeB v odsotnosti oz. prisotnosti rožmarinskega izvlečka Vivox40 v različnih organih mišk (jetra, vranica) preko bakteriološke analize organov. V plazmi okuženih mišk smo določili nastanek sistemskih citokinov (IL6, IL10, IL12, TNFa, IFNy), ter profil primerjali z neokuženimi kontrolnimi miškami [publikacija v nastajanju]. K znanstveni prepoznavnosti stresnega odziva bakterij rodu Campylobacter, njihove interakcije z gostiteljem, ter nujnosti razvoja učinkovitih in varnih alternativnih strategij z uporabo naravnih učinkovin za nadzor patogenih bakterij v živilski industriji sem tekom projekta prispevala preko tudi soavtorstva pri 13 znanstvenih člankih (omenjeni zgoraj v poročilu), preko vabljenih predavanj [COBISS.SI-ID 3579256, COBISS.SI-ID 3579512, COBISS.SIID 4149624] ter številnih sodelav na mednarodnih kongresih z objavljenimi ali znanstvenimi prispevki [COBISS.SI-ID 3777144, COBISS.SI-ID 4088952] ali povzetki znanstvenih prispekov [COBISS.SI-ID 4296568, COBISS.SI-ID 4296056, COBISS.SI-ID 4295800, COBISS.SI-ID 4348536, COBISS.SI-ID 4348024, COBISS.SI-ID 4281464, COBISS.SIID 4091256, COBISS.SI-ID 4202616, COBISS.SI-ID 3951736, COBISS.SI-ID 3964792, COBISS.SI-ID3939192, COBISS.SI-ID 3989368, COBISS.SI-ID 3784056, COBISS.SIID 3821176, COBISS.SI-ID 3812728, COBISS.SI-ID 3705976, COBISS.SI-ID 3704696]. 4.Ocena stopnje realizacije programa dela na raziskovalnem projektu in zastavljenih raziskovalnih ciljev3 Glede na poročilo o realizaciji programa in objavljene rezultate v mednarodnih revijah ter predstavljene na kongresih ocenjujem, da sem v okviru podoktorskega projekta izpolnila cilje, postavljene za obdobje dveh let trajanja projekta. Razumevanje vključenosti in interakcije med mehanizmi odgovora (stresni, odpornost), preživelostjo ter virulentnostjo bakterij je ključno za kvantitativno oceno tveganja v proizvodnji varne hrane. Blagi stres, sproži povečano odpornost kampilobakterjev proti stresom ter modulira virulentnost. V okviru projekta smo podrobno raziskali ter opredelili stresni odgovor kampilobakterjev po izpostavitvi okoljskim stresom (temperatura, kisik, stradanje) ter zaokrožili raziskave na mehanizmu odpornosti celic proti naravni bioktivnim izvlečkom/komponentam. Ker na tem področju metodika ni enotna, smo najprej optimizirali in objavili nekatere metode, s katerimi smo lahko ovrednotili fiziološki odgovor bakterij Campylobacter na prilagoditev ter njihovo sposobnost preživetja v in vitro ter in vivo pogojih. Dokazali smo pomembno vlogo izlivnih sistemov, predvsem glavnih izlivnih črpalkah CmeABC in CmeDEF, na pridobljeno odpornosti proti naravnim protimikrobnim učinkovinam. Pri predlogu učinkovite in varne aletrnativne strategije za preprečevanje bakterijskih okužb s hrano v plantktonskih celicah in biofilmu smo se usmerili na potencialne inhibitorje naravnega izvora, ki bi z modulatornim delovanjem sodelovali pri pridobitvi bakterijske odpornost. Potencialno modulatorno vlogo smo pri bakterijah Campylobacter spp. dokazali pri naravnemu izvlečku Alpinia katsumadai ter čisti fenolni spojini epigalokatehin. Ugotovili smo, da je realnejšo ocena tveganja za zdravje ljudi, nujno protimikrobno aktivnost naravnih izvlečkov ovrednotili tudi na modelih živil ter v realnem živilu. Dokazali smo, da so naravne protimikrobne učinkovine, kot so Alpinia katsumadai ter izvlečki rožmarina potencialno lahko vključeni kot dodatne bioaktivne snovi v novih konzervativnih ali dekonaminacijskih postopkih pri zmanjševanju števila kampilobaktrov v mesni predelovalni industriji. Pri raziskavah virulentnosti bakterij po izpostavitvi stresnim pogojem smo z in vitro modeli celičnih linij dokazali povezanost fizologije kampilobaktrov z njihovo virulentnostjo. Stresni odgovor po izpostavitvi stradanju povzroči prehod obliko VBNC, ki sicer predstavlja spečo stanje, a smo preko zmanjšanega metabolizma in tudi zmanjšane infektivnosti dokazali degeneracijo celic. Ključno vlogo stresnega odgovora smo, z in vivo modelom mišk za študij infektivnosti ter ugotavljanje lokalne/sistemske kampilobaterioze, potrdili tudi pri modulatorni vlogi tvorbe IFNy, ki je znan kot pomemben dejavnik pri patogenezi infekcije in nakazuje vlogo v začetnem imunskem odzivu. Odgovor kampilobaktrov je torej nujen za preživetje v gostitelju ter s tem na njihovo patogenost, kar lahko vpliva tudi na zdravje ljudi in živali. 5.Utemeljitev morebitnih sprememb programa raziskovalnega projekta oziroma sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine4 Glede na zanimive rezultate našega dela na modelnih celičnih linijah in tudi po prenosu na modele mišk smo se odločili, da delo razširimo na ugotavljanje lokalne/sistemske kampilobaterioze ter profila lokalnih/sistemskih citokinov (toksinov) (sklop WP4) in ne na razvoj novega in vitro modela s celicami praživali (kar je bilo predvideno v sklopu WP3). Delno smo razširi tudi WP 1 ter poleg protimikrobne aktivnosti ugotavljali tudi zelo aktualno modulatorno aktivnost naravnih spojin ter izvlečkov. 6.Najpomembnejši znanstveni rezultati projektne skupine5 Znanstveni dosežek 1. COBISS ID 4242296 Vir: COBISS.SI Naslov SLO In vivo modulacija virulentnosti bakterij Campylobacter jejuni na okoljske stresne pogoje ANG In vivo modulation of Campylobacter jejuni virulence in response to environmental stress Opis SLO V študij virulentnosti bakterij z živalskim modelom smo vključili stresne pogoje (stradanje, oksidativni stres, toplotni stres) ter dokazali povezanost fiziologije kampilobaktrov z njihovo virulentnostjo, predvsem pri kampilobaktrih izpostavljenimi stradanju. Zaključimo lahko, da v končni fazi predstavlja VBNC sicer spečo stanje celice, ki pa je tudi degenerativno, saj ima poleg zmanjšanega metabolizma tudi zmanjšano infektivnost. Dodatno težo raziskavam so dali citokinski profili od vseh raziskanih citokinov (IL6, IL10, IL12, TNFa in IFNy) se je kot najbolj zanimiv izkazal IFNy, katerega produkcija je bila povečana kot odziv na pogoje oksidativnega stresa. Tako smo dokazali ključno vloga stresnega odziva tudi pri modulatorni vlogi tvorbe IFNy, ki je znan kot pomemben dejavnik pri patogenezi infekcije in nakazuje vlogo v začetnem imunskem odzivu. Odziv kampilobaktrov je nujen za preživetje v gostitelju ter s tem na njihovo patogenost, kar lahko vpliva tudi na zdravje ljudi in živali. ANG We analyzed in vitro stress responses and the consequent in vivo modulation of Campylobacter pathogenicity as a result of the exposure of the C. jejuni to environmental stress (starvation, oxidative stress, heat shock). In vitro, the influence of starvation and oxidative stress has milder effect than that of heat shock, although all of the stress conditions influenced the survival of C. jejuni. Prestarvation did not contribute to improved survival of C. jejuni cells during oxygen exposure. Changes in bacteria numbers and the levels of several cytokines (IL6, IL10, IL12, TNFa in IFNy) were followed in vivo, in liver homogenates from the mice intravenously infected with either control (untreated) or stressed C. jejuni. The most pronounced differences were in interferonY and interleukin 10 productions, indicating their roles in the immune response to C. jejuni infection. The study of environmental impact on bacterial virulence reveals that microbial adaptation during tresschallenge is crucial not just for pathogen survival out of the host, but also during host-pathogen nteractions, and thus for the bacterial pathogenicity. Objavljeno v Mary Ann Liebert; Foodborne pathogens and disease; 2013; Vol. 10, issue 6; str. 566-572; Impact Factor: 2.283;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 1.468; A': 1; WoS: JY; Avtorji / Authors: Klančnik Anja, Vučkovic Darinka, Plankl Mojca, Abram Maja, Smole Možina Sonja Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 2. COBISS ID 4160120 Vir: vpis v poročilo Naslov SLO Protimikrobna učinkovitost rastlinskih fenolnih izvlečkov in mehanizem efluksa, ki vpliva na odpornost patogenih bakterij rodu Campylobacter ANG Anti-Campylobacter activities and resistance mechanisms of natural phenolic compounds in Campylobacter Opis SLO Naraščajoča prevalenca črevesnih bakterij Campylobacter ter njihova povečana odpornost proti antibiotikom je najverjetneje posledica uporabe antibiotikov v prireji živali. Le ta je v zadnjih letih omejena ali prepovedana, zato so aktualna alternativna protimikrobna sredstva, med katere sodijo tudi rastlinske učinkovine. Delovanje antibiotikov je dobro poznano, delovanje rastlinskih derivatov fenolnih izvlečkov na bakterije Campylobacter pa še dokaj neraziskano. Preko mutantov na genih, ki kodirajo izlivne proteine CmeB in CmeF, ter na genu za transportni protein CmeR, smo prvič za bakterije Campylobacter opisali kompleksen mehanizem izlivnih sistemov, vključenih v odpornost proti rastlinskim učinkovinam. Mehanizem efluksa poteka preko sodelovanja glavne izlivne črpalke CmeABC z CmeDEF. Z vključitvijo kemijskih inhibitorjev izlivnih črpalk PAßN ter NMP smo potrdili potencialno vključenost neznane - tretje izlivne črpalke pri odpornosti kampilobaktrov proti fenolnim komponentam. Obširna raziskava učinkovitosti naravnih fenolnih spojin proti bakterijam rodu Campylobacter tako podaja potencialne učinkovine za zagotavljanje varnosti v živilski proizvodno-oskrbovalni verigi in/ali za preprečevanje in zdravljenje mikrobnih okužb. ANG The increasing prevalence of intestinal bacteria Campylobacter and their increased antibiotic resistance is most likely due to the use of antibiotics in animal production. This is only in recent years restricted or prohibited, so natural phenolic compounds of plant origin can be further developed for potential use in controlling Campylobacter. Multiple mechanisms associated with antibiotic resistance have been identified in Campylobacter spp., while the mechanism involved in the resistance to phenolics is not known. Using mutants that lack the functional genes coding for the CmeB and CmeF efflux pump proteins and the CmeR transcriptional repressor; and EPIs, we demonstrated that complex efflux mechanisms are involved in the resistance of C. jejuni to phenolic compounds and extracts of plant phenolics. Particularly, the CmeABC efflux pump is a significant player in reducing the susceptibility to the phenolics, while CmeDEF plays a modest role in the resistance. Additionally, our results suggest that nonCmeABC and nonCmeDEF efflux systems also contribute to Campylobacter resistance to phenolic compounds. These findings represent the first comprehensive evaluation of the anti-Campylobacter activities of natural phenolics and suggest that alternative compounds can be further developed to control Campylobacter contamination in food production and processing, or as therapeutics for clinical treatment of campylobacteriosis. Objavljeno v Public Library of Science; PloS one; 2012; Vol. 7, no. 12; str. 110, e51800; Impact Factor: 4.092;Srednja vrednost revije / Medium Category Impact Factor: 2.096; A': 1; WoS: CU; Avtorji / Authors: Klančnik Anja, Smole Možina Sonja, Zhang Qijing Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 3. COBISS ID 3737720 Vir: vpis v poročilo Naslov SLO Pritrditev, invazija ter prehod bakterij Campylobacter jejuni v prašičjih črevesnih epitelijskih celicah ANG Attachment, invasion, and translocation of Campylobacter jejuni in pig smallintestinal epithelial cells Opis SLO Članek je bil objavljen v reviji, ki spada med prvih 15 % revij na področju živilstva. Potrdili smo vpliv stresnih razmer na virulentnost bakterij C. jejuni. Predstavili smo nov funkcionalni model črevesnih epitelnih celic (PSI) kot normalnih, nekancerogenih celic tankega črevesa. Toplotni stres je povečal sposobnost adhezije, medtem ko jo je oksidativni stres zmanjšal. Stradanje je negativno vplivalo na vse virulentne sposobnosti. Prav tako nismo dokazali korelacije med prehodom preko polariziranih epitelnih celic ter transepitelno električno upornost. ANG The article was published among top 15 % group of food science & technology journals. We confirmed a direct link between stress response and infectivity of C. jejuni. We also established new functional model of the intestinal epithelium, which accords with the properties of normal, noncarcinogenic small intestinal epithelial cells (PSI). Heat stress increased only adhesion, while oxygen reduced their adhesion. Nutrient limitation reduced all virulence properties. There was no correlation between TER and the translocation capacity. Objavljeno v ŠIKIČ POGAČAR, Maja, KLANČNIK, Anja, SMOLE MOŽINA, Sonja, CENCIČ, Avrelija. Attachment, invasion, and translocation of Campylobacter jejuni in pig small-intestinal epithelial cells. Foodborne pathogens and disease, ISSN 1535-3141, 2010, issue 5, vol. 7, str. 589-595, doi: 10.1089/fpd.2009.0301. Impact Factor: 2,134; JY - food science & technology ; 28/126 ; četrtina: 1 ; x=1.269 ; IFmin: 1.831 ; IFmax: 4.713 Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 4. COBISS ID 3635064 Vir: vpis v poročilo Naslov SLO Stresni odziv ter virulentni potencial bakterij Campylobacter jejuni izpostavljenih stradanju ANG Stress response and pathogenic potential of Campylobacter jejuni cells exposed to starvation Opis SLO V članku, ki je bil objavljen v kakovostni mikrobiološki reviji, smo definirali vpliv okoljskega stresa na bakterijske celice. Zaključek primerjave različnih okoljskih stresov je dokazan močan vpliv stradanja na fiziologijo, prehod v stanje VBNC ter virulentnost kampilobakterjev. Zmanjšana metabolna aktivnost stradanih celic ni pomenila spečega stanja, saj so celice preživele znotraj celičnih linij Caco2 ter povzročile sistemsko kampilobakeriozo tudi v modelu mišk. Tako smo dokazali povezavo med stresnim odgovorom bakterij ter njihovo virulentnostjo. ANG In the article, published in quality microbiological journal, we determined the impact of environmental stresses on bacterial cells. The comparison of different environmental stress conditions showed that starvation severely impaired Campylobacters physiology, VBNC formation and virulence. However, the lower metabolic activity of starved cells was not a dormant state, since they survived within Caco2 enterocites up to 4 days and caused systemic campylobacteriosis also in a mouse model. This indicates the connection between bacterial environmental stress response and their virulence properties. Objavljeno v Research in Microbiology, ISSN 0923-2508. [Print ed.], 2009, issue 5, vol. 160, str. 345-352, doi: 10.1016/j.resmic.2009.05.002. Impact Factor: 2.154; QU - microbiology ; 55/94 ; četrtina: 3 ; x=3.333 ; IFmin: 1.633 ; IFmax: 2.336 Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 7.Najpomembnejši družbeno-ekonomski rezultati projektne skupine6 Družbeno-ekonomski dosežek 1. COBISS ID 4119160 Vir: vpis v poročilo Naslov SLO Epigalokatehin galat je modulator odpornosti bakterij rodu Campylobacter proti makrolidnim antibiotikom ANG Epigallocatechin gallate as a modulator of Campylobacter resistance to macrolide antibiotics Opis SLO Zaradi vse večje odpornosti bakterij Campylobacter jejuni na eritromicin so v zadnjih letih v medicinske namene razvili bolj učinkovite makrolidne antibiotike ter nove tehnologije in sredstva za omejevanje kontaminacije s C. jejuni in/ali zdravljenje okužb. Med nova protimikrobna sredstva sodijo tudi nekatere rastlinske učinkovine, ki lahko delujejo tudi kot modulatorji bakterijske odpornosti proti drugim protimikrobnim snovem. Dokazali smo, da je epigalokatehin galat, glavni polifenol v zelenem čaju, naravni netoskičen inhibitor izlivnih (EPI) črpalk, ki zmanjša odpornost bakterij C. jejuni na makrolidne antibiotike ter tako zmanjša pojavnost visoko odpornih sevov. Z vključitvijo mutantov na genih, ki kodirajo izlivne proteine CmeB in CmeF ter na genu za transportni protein CmeR smo dokazali, da je v odpornost proti makrolidnim antibiotikom vključen mehanizem efluksa kot posledica sodelovanja CmeABC, v vlogi glavne izlivne črpalke, skupaj z CmeDEF. Te izlivne črpalke so tudi potencialne tarče pri razvoju novih terapevtskih strategij pri povrnitvi učinkovitosti makrolidnim antibiotikom odpornih kampilobaktrov. ANG To improve clinical performance of licensed antibiotics and chemotherapeutic agents, it is important to understand the factors in Campylobacter that affect susceptibility to macrolide antibiotics. We demonstrated that EGCG increase Campylobacter spp. Susceptibilities and thus have effects on multidrug efflux systems that might improve the clinical performance of antibiotics. These findings provide an evaluation of a natural phenolic EGCG with modifying activities that can reverse macrolide resistance. Using mutants that lack the functional genes coding for the CmeB and CmeF efflux pump proteins and the CmeR transcriptional repressor, we show that these efflux pumps are potential targets for the development of therapeutic strategies that use a combination of a macrolide with an efflux pump inhibitor (EPI) to restore macrolide efficacy. Šifra F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Objavljeno v KURINČIČ, Marija, KLANČNIK, Anja, SMOLE MOŽINA, Sonja. Epigallocatechin gallate as a modulator of Campylobacter resistance to macrolide antibiotics. International journal of antimicrobial agents, ISSN 0924-8579. [Print ed.], 2012, vol. 40, issue 5, str. 467-471, doi: http://dx.doi.org/10.10167j.ijantimicag.2012.07.015; Impact factor: 4.415; NN - infectious diseases ;A': 1; WoS: NN, QU, TU Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 2. COBISS ID 3752312 Vir: vpis v poročilo Naslov SLO Ugotavljanje protimikrobne aktivnosti rastlinskih izvlečkov z metodami difuzije in dilucije ANG Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts Opis SLO V članku, ki je bil objavljen v kvalitetni mikrobiološki reviji, smo primerjali metode difuzije in dilucije ter predstavili učinkovito ugotavljanje živosti aerobnih mikroorganizmov pri razredčevanju v mikrotiterski ploščici z barvilom INT, ter pri mikroaerofilnih kampilobaktrih z reagentom BacTitterGlo (prisotnost ATP). Rezultati so prikazali po gramunegativne kampilobaktre kot zelo občutljive na prisotnost naravnih izvlečkov, v primeravi z E. coli ali po gramu pozitivnimi salmonelami. Uporaba predstavljene metode ima veliko raziskovalno uporabo, saj lahko ugotovimo protimikrobno učinkovitost rastlinskih izvlečkov pred njihovim prenosom na modele živil. S pomočjo metode smo pregledali tudi večje število fenolnih sestavih ter jih izbrali za nadaljnje delo. ANG The article was published in a quality microbiological journal. We compared disk diffusion, agar dilution, broth microdilution and macrodilution methods. However, we established microdilution method with INT to indicate the viability of aerobic bacteria and with BacTitterGLO (ATP determination) as the only appropriate to indicate the viability for microaerophilic Campylobacter spp.. Gram negative pathogen Campylobacter spp. showed a similar sensitivity to plant extracts as the tested gram positive bacteria, but S. infantis and E. coli were more resistant. With this contribution we presented the fast screening method for MIC determination, which can give comparable results from different studies prior to their in vivo application. Using the method we determined the activity of several phenolic components and selected the most effective one for our future work. Šifra F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Objavljeno v KLANČNIK, Anja, PISKERNIK, Saša, JERŠEK, Barbara, SMOLE MOŽINA, Sonja. Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts. Journal of microbiological methods, ISSN 0167-7012. [Print ed.], 2010, issue 2, vol. 81, str. 121-126, doi: 10.1016/j.mimet.2010.02.004. IMpact factor: 2.018; CO - biochemical research methods ; 41/71 ; četrtina: 3 ; x=3.135 ; IFmin: 1.626 ; IFmax: 2.333; QU - microbiology ; 63/107 ; četrtina: 3 ; x=3.177 ; IFmin: 1.266 ; IFmax: 2.365 Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 3. COBISS ID 3836280 Vir: vpis v poročilo Naslov SLO Znižanje števila bakterij Campylobacter jejuni z naravnimi protimikrobnimi dodatki v živilih (piščančje) meso ANG Reduction of Campylobacter jejuni by natural antimicrobials in chicken meat-related conditions Opis SLO V članku, ki je bil objavljen v kakovostni mikrobiološki in tudi živilski reviji smo definirali protimikrobno delovanje rožmarinskega izvlečka na Campylobacter jejuni pri nizkih temperaturah z oz. brez dodanega pred-zmrzovanja. Dokazan je močan vpliv nizkih temperatur in pred-zamrzovanja na preživelost kampilobaktrov brez ali v kombinaciji z izvlečki. Tudi rezultati v piščančjem modelu živila so pokazali sinergističnost delovanja stresnih razmer ter delovanja rožmarinskega izvlečka. Tako smo dokazali potencialno uporabo novih konezervansov ali dekontaminacijskih postopkov z vključitvijo naravnih protimikrobnih snovi pri zmanjšanju števila kampilobaktrov v mesni predelovalni industriji. ANG The article was published in a quality microbiological and food science and tehcnology journal. We tested the antimicrobial effect of rosemary extracts against Campylobacter jejuni at a low storage temperature with or without shortterm prefreezing. Furthermore, low temperature storage conditions prolonged the survival of C. jejuni in chicken meat juice. The results in chicken meat food model again showed the synergistic effect of freezing and plant extract antimicrobial activity. A better understanding of how bacteria cope with stress conditions on one hand, and adapt to a protective environment on the other, will be critical in designing new intervention strategies for Campylobacter reduction in the poultry meat supply and control methods for food safety management. Šifra F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Objavljeno v PISKERNIK, Saša, KLANČNIK, Anja, TANDRUP RIEDEL, Charlotte, BR0NDSTED, Lone, SMOLE MOŽINA, Sonja. Reduction of Campylobacter jejuni by natural antimicrobials in chicken meat-related conditions. Food control, ISSN 0956-7135. [Print ed.], 2011, vol. 22, issue 5, str. 718-724, doi: 10.1016/j.foodcont.2010.11.002.Impact factor: 2.656; JY -food science & technology ; 15/128 ; četrtina: 1 ;A': 1; WoS: JY; Tipologija 1.01 Izvirni znanstveni članek 8.Drugi pomembni rezultati projetne skupine7 V raziskovalno delo se je preko priprave diplomskega/magisterskega/doktorskega dela vključilo več slovenskih in tujih študentov. Tekom projekta sem vzpostavila povezavo za sodelovanje s prof. dr. Qijing Zhang iz državne univerze Iowa (Združene države Amerike), ki je eden vodilnih raziskovalcev na področju bakterijske genetike, odpornosti na antibiotike in interakcij bakterija-gostitelj; ter s prof. dr. Franz Bucar iz univerze Karl Franz (Graz, Avstrija), ki opravlja raziskave na področju izolacije aktivnih snovi iz zdravilnih rastlin ter njihove modulatorne aktivnosti. Sodelovanje smo nadaljevali tudi z več raziskovalci iz Slovenije in ostalih držav Evropske unije, med drugim z raziskovalci Medicinske fakultete univerze na Reki (Hrvaška), ki so vzpostavili model spremljanja patogeneze mišji model kampilobakterioze. Navezave osebnih pa so že prerasle v plodno mednarodno sodelovanje na bilateralnih projektih (vodja prof. dr. Sonja Smole Možina), kjer je bil narejen opazen napredek in so potekale izmenjave dodiplomskih in podiplomskih študentov ter s tem prenos znanja v naše nacionalne inštitucije ter s tem doprinos k razvoju tega področja: SI-HR (2009-2011) Naravni, biološko aktivni dodatki za zdrava in obstojna živila; SI-ZDA (2011-2012) Vključenost izlivnih črpalk v mehanizem odpornosti ter patogenost bakterij rodu Campylobacter spp. ; SI-AU (2011-2012) Rastlinski naravni produkti kot nove komponente obrambe proti infekcijam z bakterijami Campylobacter - protimikrobna in modulatorna aktivnost ter inhibicija tvorbe biofilma; SI-ZDA (2014-205) Mehanizem delovanja alternativnih naravnih protimikrobnih snovi proti bakterijam Campylobacter jejuni. 9.Pomen raziskovalnih rezultatov projektne skupine8 9.1.Pomen za razvoj znanosti9 SLO C. jejuni je za človeka patogena črevesna bakterija, ki se predvsem s kontaminiranim perutninskim mesom prenaša v prehransko verigo človeka. Čeprav je nesposobna razmnoževanja v živilu, lahko preživi v tolikšnem številu, da povzroča obolenj. Zato smo preko raziskav testirali kakšen je odziv kampilobakterjev med neugodnimi pogoji, katerim so pogosto izpostavljene med živilsko obdelavo in skladiščenjem/hranjenjem ter distribucijo živil. Tako smo prispevali k boljšemu razumevanju preživetja bakterij rodu Campylobacter v proizvodni verigi živil. Prav tako smo preverjali učinkovitost alternativnih snovi, ki se vse bolj uporabljajo med živilsko pridelavo in predelavo. Dodatno zaskrbljenost v živilstvu predstavlja tudi naraščajoča protimikrobna odpornost pri C. jejuni, kar še poveča njihov pomen. Vzporedno smo objavili tudi novo metodo razredčevanja v tekočem gojišču na osnovi merjenja metabolne aktivnosti (reagenta ATP ter INT) ter tako ovrednotili vpliv alternativnega protimikrobnega učinkovanja na bakterijske celice ter prispevali k izboljšani diagnostiki vzorcev. Z vpeljavo metode razredčevanje v modelih živi ter s prenosom na realno živili (piščančje in mleto meso) pa smo realnejše ocenili tveganje za zdravje ljudi in učinkovitost uporabe protimikrobno aktivnih naravnih izvlečkov. Ker je mehanizem delovanja ter mehanizem odpornosti proti alternativnim protimikrobnih snovi kompleksen in pri kampilobakterjih popolnoma neraziskan smo se usmerili tudi na poznavanje njihovega učinka na ravni celice. Prvič smo za bakterije Campylobacter opisali kompleksen mehanizem izlivnih sistemov, vključenih v odpornost proti rastlinskim učinkovinam. Obširna raziskava učinkovitosti naravnih fenolnih spojin proti bakterijam rodu Campylobacter tako podaja potencialne protimikrobne in tudi modulatorne učinkovine za zagotavljanje varnosti v živilski proizvodnoboskrbovalni verigi in/ali za preprečevanje in zdravljenje mikrobnih okužb. Vpliv okoljskih dejavnikov smo testirali tudi na nivoju virulentnosti kampilobakterjev ter s tem poskušali izboljšati oceno tveganja, ki ga le ti predstavljajo za zdravje ljudi. Dokazali smo povezavo med stresnim odgovorom bakterij ter njihovo virulentnostjo, ki je v primeru oksidativnega stresa zaskrbljujoča, saj ne vpliva na zmanjšano živost in celo izboljša virulentne lastnosti kampilobakterjev. Medtem ko so prve ugotovitve o zmanjšani virulentni aktivnosti ter zmožnost infektivnosti celic v odpornejšem stanju VBNC bolj spodbudna za natančno kvantifikacijo mikrobiološkega tveganja (QMRA, angl. quantitative microbial risk assessment). Vpeljali smo tudi nekaj modelov in vitro celičnih linij ter in vivo model mišk, ki bodo uporabni pri natančnejši opredelitvi imunske mehanizme pri infekciji ter kampilobakterioz pri ljudeh . Tako lahko preko boljšega razumevanje virulentnih dejavnikov kampilobatkerja opredelimo nova spoznanja o sistemskih bolezni tega patogena. Tako smo ovrednotili znanja o naravi, regulaciji ter mehanizmu delovanja virulentnih dejavnikov, ki so nujni pri postavljanju novih strategih celovitega obvladovanja varnosti živil ter novih strategij nadzora. ANG Campylobacter jejuni is currently recognized as a leading cause of foodborne illness worldwide, which is usually transmitted by eating and/or handling undercooked meat and other food. Unlike most other bacterial foodborne pathogens, campylobacters are not normally capable of multiplication in food during processing or storage, but they are capable to survive and cause human infection. During food chain they are exposed to variety of stresses. Often they are able to tolerate these stresses, survive in extraintestinal environment. Thus we clarify of Campylobacter spp. survival potential in food production/supply chain. We also tested additives that have can be used in food processing. Additional problem during food chain is also increasing antimicrobial resistance of C. jejunij what gives additional impact on the use of alternative natural antimicrobials. We also established new microdilution method based on metabolic activit (using reagent ATP or INT) measurement as useful and rapid technique also for determining efficiency of plant extract and pure phenolics, and clarified the determination of the impact of natural antimicrobials on bacterial cells and develop better diagnostics of samples. Using establised food microdilution method and real food system (chicken and minced meat) we obtained real risk assessment and efficiecy of natural antimicrobial agents. Since their mechanism of influence is very complex and unknown for campylobacters we focus also on their complex activity on cell level. For the first time we demonstrated that complex efflux mechanisms are involved in the resistance of C. jejuni to phenolic compounds and extracts of plant phenolics. These findings represent the first comprehensive evaluationof the anti-Campylobacter and modulatory activities of natural phenolics and suggest that alternative compounds can be further developed to control Campylobacter contamination in food production and processing, or as therapeutics for clinical treatment of campylobacteriosis. We transfer the environmental impact also on virulence level of campylobacters and thus better increase quantitative microbial risk assessment (QMRA). We determined the connection between bacterial environmental stress response and their virulence properties and oxidative stress seems to make a lot of concern since does not influence campylobacter survival and even increase their virulence properties. However, the reduction in virulence activity of campylobacters and decreased of their capacity for infection in more resistant VBNC state are more encourage for accurate determination of quantitative microbial risk assessment (QMRA). We also introduce several cell lines in vitro and mouse in vivo models, which will allow the additional studies needed to determine the exact mechanism by which campylobacters establish human intestinal infection. According to better understanding of Campylobacter virulence determinants we can determine immune mechanisms of their infection and novel insights into the systemic disease by this pathogen. However, we clarify knowledge on the nature, regulation, and mechanism of action of virulence determinants what is indispensable in formulating new strategies for food safety management and potentially for the development of novel control strategies. 9.2.Pomen za razvoj Slovenije10 SLO V zadnjih letih je skrb za kakovostno in varno hrano postala pomembna tema. Varnost hrane je povezana z dobrimi praksami in zato je skrb za proizvodnjo mikrobiološko neoporečnih živil pomembna smernica državne politike. Pridobljene ugotovitve bodo vplivale na primernejše rokovanju s hrano, pripravo ter shranjevanju živil in zmanjšale pomanjkljivosti v znanju o mikrobiološkem tveganju. Posledično bo to pripomoglo k manjši obolevnosti ljudi / živali zaradi uživanja kontaminirane hrane in zmanjšane porabe zdravil. Prav tako bodo prispevale k načrtovanju proizvodnje varne hrane v živilsko prehranski verigi, še posebno v primarni ter sekundarni proizvodnji ter prenosu znanja v sisteme HACCP ter ISO 22000. Preko milejših postopkov obdelave živil lahko hitro spodbudimo razvoj bolj odpornih mikrobov, ki so sposobni preživeti in tudi povzročiti bolezen pri potrošniku. Vendar lahko s pridobljenim znanjem ter tudi s vključitvijo protimikrobnih sredstev v obliki naravnih rastlinskih izvlečkov, mikrobno rast zavremo, kupcu pa ponudimo nov in prijazen pristop v proizvodnji varnih živil. ANG Food quality and food safety have become an important topic in last years. Food safety is connected with different good practices and thus production of microbiologically safe food is of national importance. Obtained results are important for appropriate food handling (preparation, storage) and thus fill up some gaps of food handlers' knowledge on microbiological hazards. With the help of national health policy this may contribute to better understanding of the consumer about their behavior and attitudes toward food safety. Food safety point of view should be focused on knowledge, constant education and exchange of information. Consequently this will decrease consumption of contaminated food, illness of people / animals and thus also decrease drug consumption. Additionally, new insights will directly contribute to food safety management schemes in food supply chains in particular in primary and secondary production and knowledge transfer into HACCP and ISO 22000 systems. Using mildly processed food products we can increase microbial resistance and their survival and in some cases also cause a disease of consumer. But including obtained knowledge and also natural antimicrobials like plant phenolic extracts with biological activity we can reduce microbial growth and thus represent a new and consumerfriendly concept in safe food supply. 10.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite, katerega od navedenih ciljev ste si zastavili pri projektu, katere konkretne rezultate ste dosegli in v kakšni meri so doseženi rezultati uporabljeni Cilj F.01 Pridobitev novih praktičnih znanj, informacij in veščin Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.02 Pridobitev novih znanstvenih spoznanj Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov zJ F.03 Večja usposobljenost raziskovalno-razvojnega osebja Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.04 Dvig tehnološke ravni Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.05 Sposobnost za začetek novega tehnološkega razvoja Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.06 Razvoj novega izdelka Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.07 Izboljšanje obstoječega izdelka Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.08 Razvoj in izdelava prototipa Zastavljen cilj DA NE Rezultat zJ Uporaba rezultatov zJ F.09 Razvoj novega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.10 Izboljšanje obstoječega tehnološkega procesa oz. tehnologije Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.11 Razvoj nove storitve Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.12 Izboljšanje obstoječe storitve Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.13 Razvoj novih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.14 Izboljšanje obstoječih proizvodnih metod in instrumentov oz. proizvodnih procesov Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.15 Razvoj novega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.16 Izboljšanje obstoječega informacijskega sistema/podatkovnih baz Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.17 Prenos obstoječih tehnologij, znanj, metod in postopkov v prakso Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.18 Posredovanje novih znanj neposrednim uporabnikom (seminarji, forumi, konference) Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.19 Znanje, ki vodi k ustanovitvi novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.20 Ustanovitev novega podjetja ("spin off") Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.21 Razvoj novih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.22 Izboljšanje obstoječih zdravstvenih/diagnostičnih metod/postopkov Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.23 Razvoj novih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.24 Izboljšanje obstoječih sistemskih, normativnih, programskih in metodoloških rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.25 Razvoj novih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat zJ Uporaba rezultatov zJ F.26 Izboljšanje obstoječih organizacijskih in upravljavskih rešitev Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.27 Prispevek k ohranjanju/varovanje naravne in kulturne dediščine Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.28 Priprava/organizacija razstave Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.29 Prispevek k razvoju nacionalne kulturne identitete Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.30 Strokovna ocena stanja Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.31 Razvoj standardov Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.32 Mednarodni patent Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.33 Patent v Sloveniji Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.34 Svetovalna dejavnost 1 Zastavljen cilj O DA O NE Rezultat d Uporaba rezultatov d F.35 Drugo Zastavljen cilj DA NE Rezultat d Uporaba rezultatov d Komentar ll.Samo za aplikativne projekte in podoktorske projekte iz gospodarstva! Označite potencialne vplive oziroma učinke vaših rezultatov na navedena področja Vpliv Ni vpliva Majhen vpliv Srednji vpliv Velik vpliv G.01 Razvoj visokošolskega izobraževanja G.01.01. Razvoj dodiplomskega izobraževanja o o o o G.01.02. Razvoj podiplomskega izobraževanja o o o o G.01.03. Drugo: o o o o G.02 Gospodarski razvoj G.02.01 Razširitev ponudbe novih izdelkov/storitev na trgu o o o o G.02.02. Širitev obstoječih trgov o o o o G.02.03. Znižanje stroškov proizvodnje o o o o G.02.04. Zmanjšanje porabe materialov in energije o o o o G.02.05. Razširitev področja dejavnosti o o o o G.02.06. Večja konkurenčna sposobnost o o o o G.02.07. Večji delež izvoza o o o o G.02.08. Povečanje dobička o o o o G.02.09. Nova delovna mesta o o o o G.02.10. Dvig izobrazbene strukture zaposlenih o o o o G.02.11. Nov investicijski zagon o o o o G.02.12. Drugo: o o o o G.03 Tehnološki razvoj G.03.01. Tehnološka razširitev/posodobitev dejavnosti o o o o G.03.02. Tehnološko prestrukturiranje dejavnosti o o o o G.03.03. Uvajanje novih tehnologij o o o o G.03.04. Drugo: o o o o G.04 Družbeni razvoj G.04.01 Dvig kvalitete življenja o o o o G.04.02. Izboljšanje vodenja in upravljanja o o o o G.04.03. Izboljšanje delovanja administracije in javne uprave o o o o G.04.04. Razvoj socialnih dejavnosti o o o o G.04.05. Razvoj civilne družbe o o o o G.04.06. Drugo: o o o o G.05. Ohranjanje in razvoj nacionalne naravne in kulturne dediščine in identitete O O O O G.06. Varovanje okolja in trajnostni razvoj o o o o G.07 Razvoj družbene infrastrukture G.07.01. Informacijsko-komunikacijska infrastruktura o o o o G.07.02. Prometna infrastruktura o o o o G.07.03. Energetska infrastruktura o o o o G.07.04. Drugo: o o o o G.08. Varovanje zdravja in razvoj zdravstvenega varstva o o o o G.09. Drugo: o o o o Komentar 12.Pomen raziskovanja za sofinancerje11 Sofinancer 1. Naziv Naslov Vrednost sofinanciranja za celotno obdobje trajanja projekta je znašala: EUR Odstotek od utemeljenih stroškov projekta: % Najpomembnejši rezultati raziskovanja za sofinancerja Šifra 1. 2. 3. 4. 5. Komentar Ocena 13.Izjemni dosežek v letu 201312 13.1. Izjemni znanstveni dosežek In vivo modulacija virulentnosti bakterij Campylobacter jejuni na okoljske stresne pogoje KLANČNIK A, VUČKOVIČ D, PLANKL M, ABRAM M, SMOLE MOŽINA S. 2013. In vivo modulation of Campylobacter jejuni virulence in response to environmental stress. Foodborne pathogens and disease,10,6:566-572. Ključno vlogo stresnega odgovora bakterij C. jejuni smo z in vivo modelom mišk za študij infektivnosti ter lokalne/sistemske kampilobaterioze, potrdili pri modulatorni vlogi tvorbe citokina IFNy. Interferon je pomemben dejavnik pri patogenezi infekcije in nakazuje vlogo v začetnem imunskem odzivu po izpostavitvi oksidativnemu stresu. Nasprotno pa povzroči stresni odgovor po izpostavitvi stradanju prehod v fiziološko odporno obliko (živa a nekultivabilna, VBNC), ki pa je degenerativno, saj ima poleg zmanjšanega metabolizma tudi zmanjšano infektivnost. Odgovor kampilobaktrov je torej nujen za preživetje v gostitelju ter s tem na njihovo patogenost, kar lahko vpliva tudi na zdravje ljudi in živali. 13.2. Izjemni družbeno-ekonomski dosežek Odpornost mikroorganizmov SMOLE MOŽINA S, KLANČNIK A, RASPOR P. 2013. Mechanisms of microbial resistance in biofilms. V: SIMÖES, Manuel (ur.), MERGULHÄO, Filipe (ur.). Biofilms in bioengineering, (Microbiology research advances). New York: Nova Science Publishers KLANČNIK, A, VUČKOVIČ, D, ŠIKIČ POGAČAR, M, ABRAM, M, SMOLE MOŽINA, S. Modulation of Campylobacter jejuni pathogenicity as a consequence of environmental stress response. V: CHRO, Aberdeen, UK. FORBES, Ken (ur.) Mehanizmi odpornosti na okoljske stresne pogoje, so odvisni od strategij posameznih mikroorganizmov ali njihovih združb in vplivajo na fiziološko ter genetsko raznolikost plantkonskih celic ter mikrobnih biofilmov. Različni načine preučevanja stresnega odgovora na vseh nivojih v celici v končni fazi omogočijo proizvodnjo varnih izdelkov. Poznavanje mehanizmov odpornosti lahko izboljša biotehnološko aplikacijo in izboljša mikrobiološko varnost med živilsko proizvodno verigo. C. IZJAVE Podpisani izjavljam/o, da: • so vsi podatki, ki jih navajamo v poročilu, resnični in točni • se strinjamo z obdelavo podatkov v skladu z zakonodajo o varstvu osebnih podatkov za potrebe ocenjevanja ter obdelavo teh podatkov za evidence ARRS • so vsi podatki v obrazcu v elektronski obliki identični podatkom v obrazcu v pisni obliki • so z vsebino zaključnega poročila seznanjeni in se strinjajo vsi soizvajalci projekta Podpisi: zastopnik oz. pooblaščena oseba raziskovalne organizacije: in vodja raziskovalnega projekta: Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta Anja Klančnik ŽIG Kraj in datum: Ljubljana Oznaka prijave: ARRS-RPROJ-ZP-2014/88 1 Napišite povzetek raziskovalnega projekta (največ 3.000 znakov v slovenskem in angleškem jeziku) Nazaj 2 Napišite kratko vsebinsko poročilo, kjer boste predstavili raziskovalno hipotezo in opis raziskovanja. Navedite ključne ugotovitve, znanstvena spoznanja, rezultate in učinke raziskovalnega projekta in njihovo uporabo ter sodelovanje s tujimi partnerji. Največ 12.000 znakov vključno s presledki (približno dve strani, velikost pisave 11). Nazaj 3 Realizacija raziskovalne hipoteze. Največ 3.000 znakov vključno s presledki (približno pol strani, velikost pisave 11) Nazaj 4 V primeru bistvenih odstopanj in sprememb od predvidenega programa raziskovalnega projekta, kot je bil zapisan v predlogu raziskovalnega projekta oziroma v primeru sprememb, povečanja ali zmanjšanja sestave projektne skupine v zadnjem letu izvajanja projekta, napišite obrazložitev. V primeru, da sprememb ni bilo, to navedite. Največ 6.000 znakov vključno s presledki (približno ena stran, velikost pisave 11). Nazaj 5 Navedite znanstvene dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Raziskovalni dosežek iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Nazaj 6 Navedite družbeno-ekonomske dosežke, ki so nastali v okviru tega projekta. Družbeno-ekonomski rezultat iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) vpišete tako, da izpolnite COBISS kodo dosežka - sistem nato sam izpolni naslov objave, naziv, IF in srednjo vrednost revije, naziv FOS področja ter podatek, ali je dosežek uvrščen v A'' ali A'. Družbeno-ekonomski dosežek je po svoji strukturi drugačen kot znanstveni dosežek. Povzetek znanstvenega dosežka je praviloma povzetek bibliografske enote (članka, knjige), v kateri je dosežek objavljen. Povzetek družbeno-ekonomskega dosežka praviloma ni povzetek bibliografske enote, ki ta dosežek dokumentira, ker je dosežek sklop več rezultatov raziskovanja, ki je lahko dokumentiran v različnih bibliografskih enotah. COBISS ID zato ni enoznačen, izjemoma pa ga lahko tudi ni (npr. prehod mlajših sodelavcev v gospodarstvo na pomembnih raziskovalnih nalogah, ali ustanovitev podjetja kot rezultat projekta ... - v obeh primerih ni COBISS ID). Nazaj 7 Navedite rezultate raziskovalnega projekta iz obdobja izvajanja projekta (do oddaje zaključnega poročila) v primeru, da katerega od rezultatov ni mogoče navesti v točkah 6 in 7 (npr. ni voden v sistemu COBISS). Največ 2.000 znakov, vključno s presledki. Nazaj 8 Pomen raziskovalnih rezultatov za razvoj znanosti in za razvoj Slovenije bo objavljen na spletni strani: http://sicris.izum.si/ za posamezen projekt, ki je predmet poročanja Nazaj 9 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 10 Največ 4.000 znakov, vključno s presledki Nazaj 11 Rubrike izpolnite / prepišite skladno z obrazcem "izjava sofinancerja" http://www.arrs.gov.si/sl/progproj/rproj/gradivo/, ki ga mora izpolniti sofinancer. Podpisan obrazec "Izjava sofinancerja" pridobi in hrani nosilna raziskovalna organizacija - izvajalka projekta. Nazaj 12 Navedite en izjemni znanstveni dosežek in/ali en izjemni družbeno-ekonomski dosežek raziskovalnega projekta v letu 2013 (največ 1000 znakov, vključno s presledki). Za dosežek pripravite diapozitiv, ki vsebuje sliko ali drugo slikovno gradivo v zvezi z izjemnim dosežkom (velikost pisave najmanj 16, približno pol strani) in opis izjemnega dosežka (velikost pisave 12, približno pol strani). Diapozitiv/-a priložite kot priponko/-i k temu poročilu. Vzorec diapozitiva je objavljen na spletni strani ARRS http://www.arrs.gov.si/sl/gradivo/, predstavitve dosežkov za pretekla leta pa so objavljena na spletni strani http://www.arrs.gov.si/sl/analize/dosez/. Nazaj Obrazec: ARRS-RPROJ-ZP/2014 v1.02 88-63-F4-76-3F-D0-D1-29-34-7B-39-24-90-DE-74-57-2E-5B-94-8D Priloga 1 OKOLJSKI STRESI (STRADANJE, KISIK) STRESNI ODOGOV BAKTERIJ Campylobacter jejuni ZIVOST IN KUTLIVABILNOST VBNC in MORFOLOGIJA METABOLNA AKTIVNOST Stradanje povzroči odpornost na druge strese. Živo a nekultivabilno stanje VBNC. Prehod v kokoidno obliko. Zmanjšana metabolna aktivnost. VIRULENCA i-H u 1 UC.jrjimfthKISIK 1 1 1 h STRATUMS J r ■ m m Tniir pjrtiiil'cctLL-ji I days I STRADANJE: STRESNI ODGOVOR- FIZIOLOGIJA (VBNC), MANJŠA INFEKTIVNOST OKSIDATIVNI STRES: STRESNI ODGOVOR- PRILAGODITEV, VEČJA INFEKTIVNOST Priloga 2