STROKOVNi ČLANEK Sodobni pristop za diagnosticiranje prirojenih motenj delovanja trombocitov Modern approach to diagnosis of inherited platelet function disorders Majda Benedik DoLničar,1 Tina Benedejčič,2 Lidija Kitanovski,1 Janez Jazbec,1 Alenka Trampuš Bakija3 1 Klinični oddelek za otroško hematologijo in onkologijo, Pediatrična klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana 2 Lekarna UKC Ljubljana, Univerzitetni klinični center Ljubljana 3 Služba za specialno laboratorijsko diagnostiko, Pediatrična klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana Korespondenca/ Correspondence: Alenka Trampuš Bakija e: alenka.trampus@ guest.arnes.si Ključne besede: trombociti; prirojene motnje delovanja trombocitov; diagnosticiranje; priporočila Key words: platelets; inherited disorders; diagnostics; recommendations Citirajte kot/Cite as: Zdrav Vestn. 2016; 85: 553-65 Prispelo: 19. avg. 2015, Sprejeto: 4. nov. 2016 Izvleček Prirojene motnje delovanja trombocitov (PMDT) oz. trombocitopatije so zelo raznolika skupina bolezni. Ker pri marsikaterem bolniku s čezmernimi kožnimi in sluzničnimi krvavitvami motnja ni opredeljena, je njihova pogostnost verjetno podcenjena. Tu predstavljamo priporočila, ki temeljijo na sistematičnem pregledu znanstvene in strokovne literature in opisujejo vlogo trombocitov v procesu strjevanja ter najpogostejše prirojene motnje delovanja trombocitov. Podan je diagnostični algoritem za klinično in stopenjsko laboratorijsko obravnavo bolnikov s PMDT. Abstract Inherited platelet function disorders (IPFD) comprise a heterogeneous group of diseases. Their real frequency is probably underestimated as in many patients with excessive subcutaneous and mucosal bleedings the disorder has not been recognized. The presented diagnostic recommendations are based on a systematic review of the scientific literature and describe the role of platelets in the clotting process and the most common congenital disorders of platelet function. A diagnostic algorithm for clinical and laboratory stepwise management of patients with IPFD is presented. Uvod Motnje v primarni hemostazi vodijo do prepočasnega strjevanja krvi in s tem do krvavitev. Primerno število normalno delujočih trombocitov je poleg von Willebrandovega faktorja (vWF) in žilne stene ključno za normalno primarno he-mostazo. Trombociti so citoplazemski delci me-gakariocitov. Nimajo svoje DNK, temveč le informacijsko mRNA (ta izhaja iz me-gakariocitov) in translacijski aparat, kar omogoča tvorbo proteinov. Neaktivirani trombociti so diskoidne oblike in merijo 2-3 ^m. Kljub preprostemu videzu v krvnem razmazu ima trombocit kom- pleksno strukturo, ki vsebuje 4 področja: periferno, sol-gel, organelno in notranje membransko. Zunanje membrane perifernega področja trombocitov so bogate s površinskimi glikoproteinskimi (GP) receptorji, ki se med aktivacijo konfor-macijsko spremenijo in povezujejo z ligandi (Tabela 1). Področje sol-gel vsebuje citoskelet, ki se krči ob sproščanju kalcija iz notranjih membranskih sistemov endoplazmatskega retikuluma. V organelnem področju najdemo zrnca alfa in gosta zrnca (delta), ki shranjujejo snovi, pomembne za delovanje trombocitov (1). Sodobni pristop za diagnosticiranje prirojenih motenj delovanja trombocitov 553 srce iN ožiLJE Tabela 1: GLavne skupine membranskih receptorjev trombocitov in njihova vLoga. Glikoproteinski (GP) receptor CD oznaka Funkcija/ligand GPIIb/llla OD 41/61 receptor za fibrinogen, VWF, fibronektin, vitronektin in trombospondin GPIa/lla - receptor za koLagen GPib/iX/v CD 42a-d receptor za netopni VWF GPvi - receptor za koLagen V fizioloških okoliščinah trombociti krožijo v krvi. Ob poškodbi žilne stene ali ob spremembi strižnih sil v toku krvi se trombociti aktivirajo, kar privede do tvorbe strdka. Proces od pretvorbe neaktivnih trombocitov do nastanka trom-bocitnega strdka poteka preko več faz: adhezija trombocitov, agregacija trombocitov in izločanje substanc iz trombo-citnih zrnc. Tako je omogočena nadaljnja mobilizacija trombocitov in izločanje snovi, ki spodbudijo obnovo endotela in žilne stene ter zagotovljena površina za procese sekundarne hemostaze. Motnje delovanja trombocitov so bolezni strjevanja krvi, pri katerih se zmanjša funkcija trombocitov, čeprav je njihovo število lahko normalno. Motnja enake vrste je lahko različno močno izražena. Prevalenca prirojenih motenj delovanja trombocitov ni znana (2). Najpogostejše so motnje prenosa signalov v trombocitih in izločanja substanc iz trombocitov (3,4). Klinično se te motnje lahko izrazijo tudi kot obilna menstruacijska krvavitev. Von Willebrandova bolezen (VWB), ki je v populaciji zastopana v približno 1 %, je vzrok menoragiji v 9-20 % (5-7). Za nastanek menoragije pa je v enakem ali še večjem odstotku, vzrok PMDT (6,8-11). V Sloveniji je v Nacionalni register prirojenih motenj strjevanja krvi, ki obsega celotno populacijo bolnikov ne glede na starost, vključenih 21 oseb (7 z Glanzmannovo trombastenijo, 2 s trom-bocitopatijo Hermansky-Pudlak, 2 z av-tosomno dominantno trombocitopenijo s pridruženo motnjo delovanja trombocitov, 10 pa s trombocitno disfunkcijo, ki ni jasneje opredeljena). Laboratorijsko prepoznavanje PMDT je kompleksno, slabo standardizirano in časovno zahtevno. Ker so klinični znaki pri teh boleznih zelo raznoliki, nekatere od teh bolezni pa izjemno redke, je njihova opredelitev pogosto težavna. PMDT je lahko tudi del sindroma. Nove presejalne in potrditvene laboratorijske tehnike so dostopne le v specializiranih laboratorijih v terciarnih ustanovah in zahtevajo posebna znanja. Rezultate je potrebno interpretirati v skladu s kliničnimi informacijami o bolniku. Opredelitev motnje je pomembna za zdravljenje teh bolnikov. Prirojene motnje delovanja trombocitov 1. PMDT z normalnim številom trombocitov V to skupino uvrščamo Glanzman-novo trombastenijo (12,13), nenormalnosti receptorja (P2Yi2) za ADP (14,15), aspirinu podobne motnje (angl. Aspirin-like defects) (16), motnje skladiščenja substanc (angl. "storage-pool" disease) v gostih trombocitnih zrncih (sindrom 554 Zdrav vestn | oktober 2016 | letnik 85 STRoKovrn članek Hermansky-Pudlak (17,18), sindrom Chediak-Higashi (17,19-21), in Grisellijev sindrom (17)), motnje skladiščenja substanc v zrncih alfa (sindrom ARC (angl. arthrogryposis, renal tubular acidosis, cholestasis) (17,22)) in motnje izločanja substanc iz zrnc trombocitov. Slednje predstavljajo največjo heterogeno skupino PMDT. Natančen mehanizem pri posameznih motnjah izločanja še ni znan. Ti bolniki imajo krvavitve lahke stopnje (23). 2. PMDT z znižanim ali variabilnim številom trombocitov V to skupino uvrščamo sindrom Bernard-Soulier (24-26), trombocitni tip von Willebrandove bolezni (27,28), na kromosom X vezano mikrotrom-bocitopenijo s sindromom Wiscott-Al-drich (29,30), na kromosom X vezano makrotrombocitopenijo (31), avtoso-mno dominantno trombocitopenijo z normalno velikostjo trombocitov, povezano z mutacijo v MYH9 (angl. myosin heavy chain) genu (32,33), trombocito-penijo z obojestransko odsotno koželj-nico in/ali podlahtnico, strukturnimi nepravilnostmi srca in okvarami ledvic (sindrom TAR) (34), družinsko motnjo trombocitov z nagnjenostjo k razvoju mieloidne maligne bolezni (35) ter nekatere druge. Obravnava bolnika s sumom na motnjo strjevanja krvi 1. Anamneza in klinična slika Skrbna osebna in družinska anamneza o pojavljanju krvavitev je pomemben del obravnave bolnika z možno PMDT. Pri diferencialni diagnozi je potrebno pomisliti na druge motnje strjevanja krvi, predvsem na von Willebrandovo bolezen lahke stopnje. V anamnezi se moramo vedno pozanimati tudi o pojavljanju ekcema, okužb, o družinskih primerih mielodisplazije ali akutne mieloidne levkemije. Ob kliničnem pregledu pa je potrebno poleg ocene krvavitev preveriti tudi možne znake sindromov, kot so motnje sluha, dismorfizem srca, obraza ali kosti, prizadetost oči, duševno zaostalost in motnje pigmentacije kože ter las. Pri otrocih je anamnestična obravnava glede pojavljanja krvavitev še toliko težja, ker otroci pogosto še nimajo dovolj izzivov za mehanizem strjevanja krvi, da bi se motnja klinično izrazila. Dodatno težavo pri obravnavi predstavlja tudi prekrivanje simptomov krvavitev pri zdravih osebah s simptomi pri osebah, ki imajo lahko stopnjo motnje strjevanja krvi. V veliko pomoč za dobro anamnezo predvsem še neizkušenim zdravnikom so vprašalniki za odkrivanje motenj strjevanja krvi. V Sloveniji je bil za otroke leta 2014 predstavljen in objavljen dvostopenjski vprašalnik (36). Za opredelitev prirojene motnje strjevanja krvi priporoča Mednarodno združenje za trombozo in hemostazo (The International Society on Thrombosis and Haemostasis, ISTH) uporabo toč-kovalnega vprašalnika ISTH - bleeding assesment tool, dostopnega na med-mrežju (https://www.isth.org/resource/ resmgr/ssc/isth-ssc_bleeding_asses-sment.pdf) (37), vendar za odkrivanje prirojenih motenj delovanja trombocitov ta še ni bil v zadostni meri ovrednoten (38). Skrajšani obliki ovrednotenega vprašalnika za VWB tip 1 za odrasle in otroke (dostopno na http://www.path. queensu.ca/ labs/lillicrap/bq.htm) je objavil Bowman s sodelavci (39,40). Vprašalniki se nanašajo na 14 simptomov, ki se točkujejo od -1 do 4 oz. od 0 do 4 glede na njihovo stopnjo. Opisana so tudi minimalna merila, ki opredelijo krvavitve kot motnjo strjevanja krvi. Sodobni pristop za diagnosticiranje prirojenih motenj delovanja trombocitov 555 SRCE iN OŽiLJE Pri PMDT se pojavljajo značilni simptomi krvavitev: modrice brez jasnega vzroka ali zelo obsežne modrice, epistaksa (predvsem, če traja več kot 10 minut in povzroča slabokrvnost ali terja sprejem v bolnišnico), menoragija, krvavitev v ustni votlini, čezmerna krvavitev ob porodu, po invazivnih postopkih in po izdrtju stalnega zoba. Pri težki PMDT se krvavitve pojavljajo že od otroške dobe naprej, pogosto že v obdobju novorojenčka. PMDT lahke stopnje se izrazijo šele kasneje v življenju, ob in po operaciji, po poškodbi ali izdrtju zoba (41). 2. Laboratorijske preiskave Če po klinični oceni obstaja jasna verjetnost, da ima preiskovana oseba motnjo strjevanja krvi, je potrebno najprej narediti naslednje teste (42-44): • Hemogram in ocena velikosti ter oblike trombocitov v razmazu periferne krvi. • Presejalni testi strjevanja krvi: aktiviran parcialni tromboplastinski čas (APTČ), protrombinski čas (PČ), trombinski čas (TČ), fibrinogen. Kadar je podaljšan le APTČ, naredimo še presejalni test za izključitev inhibitorjev. APTČ določimo v mešanici z normalno plazmo v razmerju 1:1 takoj in čez 2 uri. Pri podaljšanem PČ določamo aktivnosti faktorjev strjevanja krvi ekstrinzičnega sistema. • Presejalni test delovanja trombocitov in VWF: zapiralni čas - kol/ADP, kol/ EPI (45). Pri trombocitopatijah in VWB lahke stopnje je rezultat zapiralnega časa lahko normalen. Ob značilnih kožnih in sluzničnih krvavitvah naredimo že ob prvem testiranju teste za odkrivanje VWB. • Presejalni testi za VWB:VWF:antigen, VWF:aktivnost, FVIII:aktivnost. Za opredelitev tipa VWB se naredijo še testi: sposobnost vezave VWF na kolagen (VWF:CB), multimerična sestava VWF, RIPA (angl. ristocetin platelet agglutination) test, pretočna citometri-ja (za tip 2B) in test vezave FVIII na VWF (za tip 2N). Če so rezultati zgoraj navedenih testov v normalnem območju, nadaljujemo diagnosticiranje za odkrivanje PMDT v treh stopnjah (46,47). I. Testi prve stopnje: • Ocena števila, velikosti in morfologije trombocitov v razmazu periferne krvi ter sprememb v drugih krvnih celicah, kot so npr. stomatociti in vključki v nevtrofilcih. • Pretočna citometrija na mirujočih trombocitih s protitelesi proti an-tigenu CD41 (GP Ilb/IIIa) in CD61 (GPIIIa) za odkrivanje bolnikov z Glanzmannovo trombastenijo ter protiteles proti antigenu CD42b (GPIb) in CD42a (GPIX) za odkrivanje bolnikov sindroma Bernard --Soulier in trombocitnega tipa vWB. Trombocitopenija preiskave ne moti. • Testi agregometrije (48-51) Z njimi ocenjujemo in vitro aktivacijo trombocitov kot posledico odgovora na različne agoniste. Priporočila za odvzem in transport krvi za teste agregacije trombocitov so opisana v Tabeli 2. Ker je možna tudi pridobljena motnja delovanja trombocitov zaradi uživanja zdravil in pripravkov iz rastlin (Priloga 1), je anamneza o prejemanju kakršnih koli učinkovin v zadnjih dneh pred ocenjevanjem funkcije trombocitov izredno pomembna. Bolnik tudi ne sme jemati nesteroidnih protivnetnih zdravil 10 do 14 dni pred odvzemom krvi za oceno delovanja trombocitov. Teste je smiselno ponoviti najprej po enem me- 556 Zdrav Vestn | oktober 2016 | Letnik 85 STROKOVNi ČLANEK Tabela 2: Agregometrija, Lumiagregometrija in RIPA test: priporočila za odvzem in transport krvi (42,48). Odvzem Rokovanje z vzorcem in transport Preiskovanec mora biti tešč, spočit oz. umirjen. Na dan odvzema ne sme kaditi aLi piti kave. Potrebno je odvzeti anamnezo o jemanju zdravil (glej Prilogo 1). Odvzem krvi mora izvesti oseba z izkušnjami, na standardiziran način brez poškodbe, iz vene v komolčni jami (minimalno zažemanje vene). Uporabimo iglo debeline 19-21G z vakuumskim sistemom ali s plastično brizgalko (metuljčki so primerni, če kri prosto teče). Vrsta epruvete: z dodatkom citrata (Na-citrat 0,11M, svetlo moder zamašek). Odvzem mora biti narejen pred jemanjem krvi v epruvete druge vrste (druge barve zamaški) oz. se pri odvzemih vedno najprej odvzame kri za (lumi)agregometrijo. Pred odvzemom krvi za agregometrijo je potrebno 3-5 ml krvi zavreči ali pa uporabiti za druge teste hemostaze, pri katerih je odvzem krvi z Na-citratom. Minimalna količina krvi za agregometrijo je 4,5 ml (testov v tem primeru ni možno ponoviti z višjimi koncentracijami agonistov), optimalna količina pa je v vseh starostih 2-krat 4,5 ml; epruveta mora biti napolnjena optimalno do oznake. Po odvzemu je potrebno epruveto 6-krat obrniti, da se prepreči nastanek strdkov krvi (če se strdki v epruveti pojavijo, jo je potrebno zavreči). Vzorci krvi morajo biti med transportom na sobni temperaturi (20-25 °C); epruvet se kasneje ne sme stresati, obračati. Priporočeni čas od odvzema krvi, transporta in do začetka analize je 30 minut do 2 uri, ne sme pa biti daljši od 4 ur. secu. Več bolnikov s PMDT ima lahko znižano število trombocitov, zato zmerno znižano število trombocitov ne sme izključiti nadaljnjega testiranja. Priporočajo, da laboratoriji izdelajo lastne referenčne vrednosti za teste PMDT in da kontrolirajo vsako novo serijo reagenta (52). Test svetlobne agregometrije v plazmi, bogati s trombociti. Ocenijo se odgovori na adrenalin (epinefrin), ADP, kolagen, arahidonsko kislino in ristocetin v različnih koncentracijah (RIPA) (48). Z dodajanjem agonista aktiviramo trombocite, kar povzroči, da se ti med seboj povežejo v agregate. Primarnemu (reverzibilnemu) valu agregacije sledi sproščanje nukleotidov in sekundarni (ireverzibilni) val agregacije. Pri tem merimo količino svetlobe, ki preseva skozi plazmo. Prepustnost za svetlobo se postopno zveča. Preiskava je nezanesljiva pri številu trombocitov pod 140 x io9/L (42). V primerih, ko je iz- vedba kljub trombocitopeniji nujna, se je potrebno z laboratorijem dogovoriti za prilagojeno izvedbo testa z normalno kontrolo. Za otroke, mlajše od 1 leta, ni izdelanih referenčnih vrednosti. Test lumiagregometrije trombocitov v plazmi, bogati s trombociti. Ocenijo se motnje skladiščenja substanc in izločanja ATP iz gostih granul. Ob sumu, da ima preiskovanec zelo verjetno motnjo delovanja trombocitov, ki pa še ni opredeljena, odredimo še lumiagregometri-jo (49). Pri lumiagregometriji dodamo plazmi s trombociti še luciferin luciferazo. Ko po aktivaciji z agonistom pride do ireverzibilne faze agregacije, se iz gostih zrnc sprosti ATP. Pri reakciji se tvori ke-miluminiscenca, ki jo merimo hkrati z optično agregacijo trombocitov. Poleg prej omenjenih agonistov uporabimo tudi trombin, ki je močan agonist in povzroči popolno izločanje substanc iz zrnc. Kadar je sproščanje ATP s trom- Sodobni pristop za diagnosticiranje prirojenih motenj delovanja trombocitov 553 SRCE iN OŽiLJE Tabela 3: Agregacija trombocitov in sproščanja ATP z metodo merjenja Luminiscence pri nekaterih prirojenih in pridobljenih motnjah delovanja trombocitov. Opisani so značilni odzivi, ki pa se med bolniki z isto boleznijo Lahko nekoliko razlikujejo (42). Agregacija trombocitov Sproščanje ATP iz trombocitov > A > in ti Agonisti !ž 10 ■d n •E £ 4— C C