I-155
Strokovni prispevek/Professional article
GENSKA DIAGNOSTIKA HEMOFILIJE A
GENETIC DIAGNOSTICS OF HEMOPHILIA A
Maruša Debeljak1, Majda Benedik-Dolničar2, Lana Strmecki3
1 Laboratorijsko diagnostični oddelki, Pediatrična klinika, Klinični center, Vrazov trg 1, 1525 Ljubljana
2 Služba za onkologijo in hematologijo, Pediatrična klinika, Klinični center, Vrazov trg 1, 1525 Ljubljana
3 Inštitut za biokemijo, Medicinska fakulteta, Vrazov trg 1, 1525 Ljubljana
Prispelo 2004-02-13, sprejeto 2004-03-12; ZDRAV VESTN 2004; 73: Suppl. I: 155–7
Key words: hemophilia A; coagulation factor VIII; intron 22
inversion mutation
Abstract – Background. Hemophilia A is a chromosome
X-linked bleeding disorder due to mutations in the FVIII gene.
There are 163 hemophilia A patients in Slovene registry for
Hemophilia. 74 have severe hemophilia A and 50% of
patients with severe hemophilia A have inversion of intron
22 that is detected using the LD-PCR method. Point muta-
tions are detected by amplification of exons of the factor VIII
gene followed with a direct sequencing technique.
Results. In the Slovene population we managed to determine
a genetic mutation in 67/163 patients, 36/67 have inversion
of intron 22 and another 31/67 have 12 different point muta-
tions in the FVIII gene which cause hemophilia A. Three of
them are so far found only among Slovene patients.
Conclusions. The identification of hemophilia mutations is of
great importance for the timely discovery of the hemophilia
carriers and the pre-natal diagnostics of hemophilia A.
Ključne besede: hemofilija A; koagulacijski faktor VIII; in-
verzijska mutacija introna 22
Izvleček – Izhodišča. Hemofilija A je recesivna dedna bole-
zen, vezana na kromosom X, z motnjo v strjevanju krvi. He-
mofilija A je posledica različnih mutacij v genu za faktor VIII.
V Slovenskem registru je zabeleženih 163 bolnikov s hemofili-
jo A, 74 od teh jih ima težko obliko bolezni. Približno 50 od-
stotkov bolnikov s težko obliko bolezni ima inverzijsko muta-
cijo introna 22, ki jo ugotavljamo s pomnoževanjem dolgih
odsekov DNK. Točkovne mutacije iščemo s pomnoževanjem
različnih eksonskih zaporedij v genu za faktor VIII in nato z
direktnim sekvenciranjem.
Rezultati. V slovenski populaciji smo doslej odkrili gensko mu-
tacijo pri 67/163 bolnikih s hemofilijo A, od tega pri 36/67
inverzijsko mutacijo in še 12 različnih točkovnih mutacij pri
31/67 bolnikih. Tri od dokazanih točkovnih mutacij so bile
opisane samo pri slovenskih bolnikih.
Zaključki. Določitev mutacij pri hemofilikih je zelo pomemb-
na zaradi pravočasnega odkrivanja prenašalk hemofilije in
diagnosticiranja hemofilije A pred rojstvom.
Uvod
Hemofilija A je recesivna dedna bolezen, vezana na kromo-
som X, z motnjo v strjevanju krvi. Pojavlja se pri vseh etničnih
skupinah z enako pogostnostjo, 1–5/10.000 rojenih dečkov
(1). Pri hemofiliji A gre za pomanjkanje, odsotnost ali neaktiv-
nost koagulacijskega faktorja VIII. Glede na aktivnost faktorja
VIII ločimo težko (aktivnost faktorja VIII je nižja od 1% oz.
nižja od 0,01E/ml normalne aktivnosti), srednje težko (1–5%
oz. 0,01–0,05 E/ml) in lahko obliko bolezni (5–30% oz. 0,05–
0,30 E/ml). Znižano koncentracijo faktorja VIII povzročijo raz-
lične mutacije v genu za faktor VIII.
Gen za faktor VIII leži na koncu dolge ročice kromosoma X, na
položaju Xq28. Gen zavzema 186 kb dolgo regijo in je sestav-
ljen iz 26 eksonov, ki nosijo zapis za 9000 bp dolgo mRNK. Ta
se prevede v 2351 aminokislin (2). Posebnost gena za faktor
VIII je, da je v intronu 22 zaporedje za dodatni manjši gen, ki se
imenuje gen A (F8A, int22h-1). Dodatni kopiji tega gena (F8A,
int22h-2 in int22h-3) sta zapisani na telomernem koncu kro-
mosoma X. Od gena za faktor VIII sta oddaljeni 500 kb. Vloga
gena F8A še ni pojasnjena, vendar je gen F8A vpleten v meha-
nizem pogoste inverzijske mutacije pri bolnikih s težko obliko
hemofilije A (3).
Opisane so številne mutacije gena za faktor VIII. Približno 50
odstotkov bolnikov s težko obliko bolezni ima inverzijsko mu-
tacijo introna 22, v katero je vpleten mehanizem homologne
rekombinacije med geni F8A (4). Preostali bolniki imajo naj-
večkrat mutacije gena, ki so značilne za določeno družino. Do
danes je opisanih 830 različnih mutacij v genu za faktor VIII,
od tega je 551 zamenjav enega nukleotida, 108 primerov več-
jih delecij (2–210 kb) in 118 manjših (1–23 bp) delecij, 42
primerov insercij in že prej omenjena inverzija (5).
Materiali in metode
Preiskovanci
V Sloveniji je registriranih s hemofilijo A 163 bolnikov iz 107
rodbin, 74 od vseh skupaj jih ima težko obliko bolezni. Diagno-
za bolezni temelji na značilnih kliničnih znakih bolezni in zmanj-
šani aktivnosti faktorja VIII (FVIII:C) v krvi. Aktivnost določimo
z modificirano metodo APTT (angl. Activated Partial Trombo-
plastin Time, IL TestTM KIT) na avtomatskem koagulometru
ACL 7000 (Instrumentation Laboratory Spa).
ZDRAV VESTN 2004; 73: I-155–7
I-156 ZDRAV VESTN 2004; 73: SUPPL I
Genska diagnostika
Genomsko DNK izoliramo po uveljavljeni metodi iz levkoci-
tov periferne krvi z izsoljevanjem (6) ali iz horionskih resic,
kadar gre za prenatalno diagnostiko (7).
Mutacije gena za FVIII pri preiskovanih bolnikih smo iskali s
kombinacijo več metod.
Pri hemofilikih s težko obliko bolezni najprej iščemo prisot-
nost inverzijske mutacije introna 22. Za ugotavljanje inverzije
uporabljamo metodo pomnoževanja dolgih odsekov DNK
(LD-PCR, angl. Long Distance – Polymerase Chain Reaction),
ki je nadomestila metodo po Southernu. Z metodo LD-PCR
pomnožimo neoamplikon, ki nastane, ko se intronski homo-
log int22h-1 rekombinira z enim od zunajgenskih homologov
(int22h-2 ali int22h-3). Pomnožena regija je dolga 10 kb. Ta
PCR potrebuje precej spremenjene pogoje: 150 ng visoko-
molekularne genomske DNK, DMSO (5–7%), posebno poli-
merazo Expand (Roche Diagnostics) in poleg običajnih nukle-
otidov še 7-deazni-dGTP (Roche Diagnostics). Uporabljamo
oligonukleotidne začetnike po Liu in Sommerju (8). Reakcija
PCR je sestavljena iz 30 obratov s časovno temperaturnim pro-
filom 30 sek 92 °C, 1 min 65 °C in 15 min 68 °C.
Točkovne mutacije iščemo s pomnoževanjem eksonskih za-
poredij (eksoni: 1, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 18, 22, 23, 24, 26) v genu
za faktor VIII in pri tem uporabljamo ustrezne oligonukleoti-
dne začetnike (9). Pomnožene regije direktno sekvenciramo
s kapilarno elektroforezo (Applied Biosystems, PE). S prime-
rjavo zaporedij med zdravimi in bolniki ugotavljamo spremem-
be zaporedja pri bolnikih in ovrednotimo, kakšne so spremem-
be pri bolniku tudi na ravni aminokislin.
Rezultati
Od skupno 163 bolnikov s hemofiljio A jih ima 74 težko obliko
hemofilije A. Skupno smo 67 bolnikom opredelili gensko mu-
tacijo za faktor VIII. V skupini 67 opredeljenih jih ima 48 težko
hemofilijo A; 36/48 inverzijo introna 22, ki je večkrat opisana
kot vroča točka za mutacijo, pri 12/48 pa smo dokazali 7 različ-
nih neinverzijskih mutacij. Pri še 15 od skupaj 74 hemofilikih s
težko obliko hemofilije inverzijske mutacije nismo dokazali,
druge mutacije v eksonih pa še nismo iskali.
Pri 19 bolnikih z lahko oz. srednjo hemofilijo A smo dokazali 5
različnih točkovnih mutacij.
Razpr. 1. Seznam mutacij v genu za faktor VIII pri slovenskih
bolnikih.
Table 1. List of mutations in the factor VIII gene in Slovene
patients.
Mutacija Pozicija v genu Število bolnikov Oblika hemofilije A
Mutation Gene position No. patients
Severity of
hemophilia A
S19R ekson / exon 1 1 težka / severe
S289L ekson / exon 7 3 lahka / mild
R282H ekson / exon 7 2 težka / severe
R336X ekson / exon 8 1 težka / severe
R593C ekson / exon 12 2 lahka / mild
Q602X ekson / exon 12 3 težka / severe
R1966X ekson / exon 18 1 težka / severe
Inverzija
introna 22
Inversion of
intron 22 36 težka / severe
intron 22
R2150H ekson / exon 23 1 srednja / moderate
R2147X ekson / exon 23 3 težka / severe
IVS23+1G→ A intron 23 1 težka / severe
R2209Q ekson / exon 24 3 lahka / mild
R2307Q ekson / exon 26 10 lahka / mild
Med letoma 1989 in 2003 je bilo opravljenih 14 prenatalnih
diagnostik hemofilije A; pol je bilo deklic, pol pa dečkov. Od 7
dečkov so bili 3 zdravi, po odločitvi staršev sta se dva rodila s
hemofilijo, pri dveh pa je bil narejen splav (pri enem zaradi
mukopolisaharidoze tipa 1 ob neznanem statusu hemofilije A;
pri drugem zaradi težke oblike hemofilije A).
Razpravljanje
Mutacije pri hemofiliji A v grobem lahko delimo v dve skupini:
bolniki z inverzijsko mutacijo introna 22 (težka oblika hemofi-
lije A) in bolniki s točkastimi mutacijami v eksonskih zapored-
jih gena za faktor VIII (težke, srednje in lahke oblike hemofili-
je A).
Do inverzijske mutacije introna 22 prihaja večinoma v moških
zarodnih celicah, ker parjenje homolognih kromosomov med
meiozo pri ženskah zavira možnost intrakromosomske inverzi-
je introna 22. Pri moških je kromosom x nehomologen, zato lah-
ko pride pri meiozi do vihanja kromosoma in rekombinacije med
dvema genoma F8A, ki sta na različnih delih kromosoma x (Sl. 1)
(10). V Sloveniji smo večino inverzij introna 22 določili z metodo
po Southernu (11). Inverzije sedaj določamo z metodo LD-PCR,
za katero smo ugotovili, da je prav tako ustrezna. LD-PCR precej
skrajša čas od osamitve DNK do molekularnogenetskega izvi-
da. Za LD-PCR tudi ne potrebujemo radioaktivno označenih nu-
kleotidov, ki so dragi in zdravju škodljivi. Z različnimi kombinaci-
jami primerno izbranih oligonukleotidnih začetnikov, ki nalegajo
v gene int22h-1 in int22h-2 ali int22h-3, že iz vzorca amplifika-
tov ugotovimo, ali gre za bolnika z inverzijo oz. za prenašalko ali
za osebo brez inverzije introna 22.
Točkovne mutacije iščemo s PCR in direktnim sekvenciranjem.
Večina odkritih točkovnih mutacij je v dinukleotidnem zapo-
redju CpG. Visok delež mutacij v zaporedju CpG ni presene-
tljiv, saj ta zaporedja veljajo za najbolj mutagena v človeškem
genomu. Pri sesalcih je citozin v zaporedju CpG pogosto meti-
liran. Deaminacija metiliranega citozina privede do nastanka
timina, ki ga DNK popravljalni mehanizmi ne prepoznajo kot
napako (12). Samo tri mutacije niso v tem zaporedju in vse so
bile doslej odkrite samo pri slovenskih bolnikih (13, 14).
Ko ugotovimo mutacijo, ki je značilna za neko družino, določi-
mo še prenašalke za hemofilijo A. Prenašalkam se v 10. do
12. tednu nosečnosti lahko napravi še prenatalna diagnostika.
Družinam, ki še nimajo določene družinske mutacije, lahko
pri ugotavljanju prenašalk in nato pri prenatalni diagnostiki
pomagamo s posredno gensko analizo, ki sloni na vezanem
dedovanju intronskih polimorfizmov. Te večinoma določamo
z analizo dolžin restrikcijskih fragmentov (RFLP), ki so v intro-
nih med posamezniki zelo variabilne. Analiza je uporabna le,
če je družina informativna za RFLP.
Odkrivanje prenašalk hemofilije je pomembno tudi zato, da
čim bolj zgodaj dokažemo tiste prenašalke, ki imajo tako zelo
znižano koncentracijo strjevalnega faktorja VIII, da pomeni za
njih operacija oziroma težja poškodba enako tveganje kot pri
bolniku z lahko hemofilijo A.
Zaključki
Določitev mutacij pri hemofilikih je zelo pomembna zaradi
pravočasnega odkrivanja prenašalk hemofilije in diagnostici-
I-157
ranja hemofilije pred rojstvom. To diagnostiko nam zanesljivo
omogoča genska diagnostika hemofilije A, zato gre za po-
membno molekularnobiološko preiskavo za slovensko popu-
lacijo.
Zahvala
Za pomoč za zbiranje podatkov o družinah s hemofilijo se zahvalju-
jemo gospe Rajki Bavčer, sodelavki Društva hemofilikov Slovenije.
Literatura
1. Stamatoyannopoulos G, Niehuis AW, Majerus PW, Varmus H. The molecular
basis of blood diseases. 2nd ed. Philadelphia: W.B: Saunders Company, The
Curtis Centre, Independance Squere West, 1994: 890–8.
2. Gitscher J, Wood WI, Goralka TM et al. Characterisation of the human factor
VIII gene. Nature 1984; 312: 326–30.
3. Lakich D, Kazazian HH, Antonarakis SE, Gitschier J. Inversions disrupting
the factor VIII gene are common cause of severe Haemophilia A. Nature
Genetics 1993; 5: 236–41.
4. Antonarakis SE, Rossiter JP, Young M et al. Factor VIII inversions in severe
hemophilia A: results from an international consortium. Blood 1995; 86:
2206–12.
5. HAMSTeRS (angl. Haemophilia A Mutation Search, Test and Resource Site),
http://europium.rpms.ac.uk
6. Miller SA, Dyches DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extrac-
ting DNA from human nucleated cells. Nucl Acids Res 1988; 16: 1215–5.
7. Davies KE. Human genetic diseases. A practical approach. Oxford: IRL Press
Limited, 1987: 245–5.
8. Liu Q, Sommer SS. Subcycling-PCR for multiplex long distance amplification
of regions with high and low GC content application to the inversion hot-
spot in the FVIII gene. Biotechniques 1998; 25: 1022–8.
9. Strmecki L. Iskanje in opredelitev mutacij gena za koagulacijski faktor VIII pri
hemofiliji A. Doktorsko delo. Ljubljana: Medicinska fakulteta, 1998: 95–106.
10. Rossiter JP, Young M, Kimberland ML et al. Factor VIII gene inversions
causing severe hemophilia A originate almost exclusively in male germ cells.
Hum Molec Genet 1994; 3: 1035–9.
11. Strmecki L, Benedik-Dolničar M, Vidan-Jeras B, Komel R. Inversions of the
factor VIII gene in Slovenian patients with severe haemophilia A. Eur J
Haematol 1999; 63: 64–6.
12. Youssoufian H, Kazazian HH, Phillips DG et al. Recurrent mutations in ha-
emophilia A give evidence for CpG mutation hotspots. Nature 1986; 324:
380–2.
13. Strmecki L, Benedik-Dolničar M, Komel R. A novel mutation Q602STOP in
exon 12 of the FVIII gene. Human Heredity 1998; 48: 119–20.
14. Strmecki L, Benedik-Dolničar M, Vouk K, Komel R. Screen of 55 Slove-
nian haemophilia A patients: identification of 2 novel mutations (S-1R
and IVS23+1G›A) and discussion of mutation spectrum. Hum Mutat 1999; 13:
413–3.
DEBELJAK M, BENEDIK-DOLNIČAR M, STRMECKI L. GENSKA DIAGNOSTIKA HEMOFILIJE A