26 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023)
______________
 
 
VALIDACIJA METODE duRT-qPCR ZA DOLOČANJE VIROIDA 
RAZPOKANOSTI SKORJE AGRUMOV (CBCVd) NA HMELJU Z 
UPORABO mRNA1192 INTERNE KONTROLE 
 
Tanja GUČEK
1
 in Sebastjan RADIŠEK
2
 
 
Izvirni znanstveni članek / Original scientific article 
Prispelo / Received: 15. 10. 2023 
Sprejeto / Accepted: 5. 12. 2023 
 
Izvleček 
Z namenom širjenja obsega akreditacije v Diagnostičnem laboratoriju za varstvo 
rastlin (DL) na Inštitutu za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije (IHPS) za 
diagnostično metodo »duRT-qPCR za določanje viroida CBCVd in interne kontrole 
mRNA1192« (MDL 12) smo izvedli njeno delno validacijo in analizirali analitično 
občutljivost, selektivnost, ponovljivost in obnovljivost. Analizo smo izvedli z uporabo 
dveh kompletov reagentov (SensiFast in AgPATH). Pri analitični občutljivosti smo 
mejo zaznavnosti (LOD) določili pri 5 pg in mejo določljivosti (LOQ) pri 50 pg. V 
okviru testiranja občutljivosti in selektivnosti smo primerjali različne sorte hmelja, 
načine okužbe, kombinacije viroidov in dve metodi izolacije nukleinskih kislin in v 
vseh primerih dobili ustrezne rezultate. Ponovljivost in obnovljivost smo testirali s 
štirimi analitiki v treh dneh, z dvema kompletoma reagentov, na setu 30 vzorcev. 
Skupno smo izvedli 12 analiz in analizirali 360 vzorcev in jih določili s 100 % 
natančnostjo. V primeru SensiFast kompleta smo dobili nižje Cq-vrednosti in ga 
določili kot optimalno izbiro za duRT-qPCR. Dodatno smo z metodo MDL12 izvedli 
tudi analizo vzorcev hmelja in RNA vključenih v med-laboratorijsko testiranje in bili 
100 % uspešni. Z validacijo smo dokazali, da zagotavljamo zanesljive rezultate in da 
je metoda primerna za akreditacijo. Članek predstavlja validacijo diagnostične 
metode, ki prinaša nove ugotovitve na področju izvajanja RT-qPCR tehnike. 
Ključne besede: CBCVd, analitična občutljivost, selektivnost, ponovljivost, 
obnovljivost 
 
 
VALIDATION OF THE RT-qPCR METHOD FOR THE DETECTION OF 
CITRUS BARK CRACKING VIROID (CBCVd) ON HOPS INCLUDING 
mRNA1192 AS INTERNAL CONTROL 
 
Abstract 
In order to expand the scope of accreditation in the Diagnostic Laboratory for Plant 
Protection (DL) at the Slovenian Institute of Hop Research and Brewing (IHPS) for 
the diagnostic method “duRT-qPCR for detection of CBCVd and internal control 
 
1
 Dr., Inštitut za hmeljarstvo in pivovarstvo Slovenije (IHPS), e-naslov: tanja.gucek@ihps.si 
2
 Dr., IHPS, e-naslov: sebastjan.radisek@ihps.si  

Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023) 
______________ 
27 
 
mRNA1192” (MDL 12), we performed its partial validation and analysed the 
analytical sensitivity, selectivity, repeatability and reproducibility. Analyses were 
performed using two sets of reagents (SensiFast and AgPATH). For analytical 
sensitivity, the limit of detection (LOD) was set at 5 pg and the limit of quantification 
(LOQ) at 50 pg RNA. As part of sensitivity and selectivity testing, we compared 
different hop cultivars, infection methods, viroid combinations and two nucleic acid 
isolation methods. In all tests we obtained accurate results. Repeatability and 
reproducibility were tested with four analysts over three days, with two sets of 
reagents, on set of 30 samples. We performed a total of 12 analyses and tested 360 
samples, and determined them with 100 % accuracy. In the case of SensiFast kit, we 
obtained lower Cq values and chose it as the optimal choice for duRT-qPCR. In 
addition, with the MDL 12 method, we also performed an analysis of hop samples 
and RNA included in inter-laboratory testing and were 100 % successful. Through 
validation, we proved that we provide reliable results and that the method is suitable 
for accreditation. The paper presents the validation of the diagnostic method, which 
brings new findings in the field of RT-qPCR method implementation. 
Key words: CBCVd, analytical sensitivity, selectivity, repeatability, reproducibility 
 
 
1 UVOD 
 
Za določanje viroidov so vedno pogosteje v rutinski uporabi metode na osnovi 
določanja nukleinskih kislin, kot je RT-PCR v realnem času (RT-qPCR) (Guček in sod., 
2023). Metoda RT-qPCR je zelo hitra, občutljiva, z manj možnostmi za kontaminacijo 
(brez gela), vendar z omejitvami kot so dragi reagenti, oprema in visoka kakovost 
izolirane RNA (Boonham in sod., 2004). Pomnoževanje produkta vodi do povečanja 
fluorescence, ki jo spremljamo med samim potekom reakcije, zato končna analiza 
na gelu ni potrebna. Zaznavanje pomnoženih PCR produktov je mogoče z uporabo 
nespecifičnih. (npr. SYBR Green I) ali specifičnih metod (npr. TaqMan) (Valasek in 
Repa, 2005). V primeru TaqMan kemije se med začetna oligonukleotida (ZO) na 
tarčno zaporedje komplementarno veže tudi sonda označena s fluorescentnima 
barviloma. Ob podaljševanju verige DNA-polimeraza razgradi sondo, zato se dušilec 
oddalji od poročevalca in poročevalski signal lahko izmerimo (Valasek in Repa, 
2005). Na podoben način specifično zaznavo omogočajo tudi LNA-sonde (ang. 
Locked nucleic acids), ki omogočajo modifikacije posameznih nukleotidov, pri 
čemer se poveča talilna temperatura (T
m
) sonde in specifičnost hibridizacije (Latorra 
in sod., 2003). 
 
Metode na osnovi TaqMan kemije so pogosteje v uporabi za določanje viroidov 
(Boonham in sod., 2004; Botermans in sod., 2013; Luigi in Faggioli, 2011; Monger in 
sod., 2010; Mumford in sod., 2000) kot SYBR Green barvila (Parisi in sod., 2011; Rizza 
in sod., 2009). Uporaba več sond in različnih fluoroforov omogoča z RT-qPCR 
sočasno določanje več viroidov (ang. multiplex RT-qPCR, mRT-qPCR). Tarče za 
mRT-qPCR so lahko enakih velikosti, kar omogoča analizo večjega števila vzorcev, 
krajši čas analize in manjšo porabo reagentov, zaradi manjšega števila analiz (Lin in 
sod., 2013; Mumford in sod., 2000). Osman in sod. (2017) so razvili mRT-qPCR za 

28 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023)
______________
 
 
določanje HSVd (ang. hop stunt viroid), CEVd (ang. citrus exocortis viroid) in CBCVd 
(ang. citrus bark cracking viroid) v agrumih. Na hmelju so Seigner in sod. (2020) 
razvili RT-qPCR za sočasno določanje CBCVd in interne kontrole na osnovi mRNA 
mitohondrijskega gena nad5 (ang. NADH dehydrogenase subunit 5) (ang. duplex RT-
qPCR, duRT-qPCR). Uporaba interne kontrole je pri RT-qPCR ključna, saj nam poda 
informacijo o kvaliteti izolirane RNA in kakovosti reagentov, hkrati pa se lahko 
uporabi tudi za kvantifikacijo tarče (Guček, 2020).  
 
Pred kratkim smo Guček in sod. (2023) razvili RT-qPCR in mRT-qPCR za določanje 
viroidov HSVd, HLVd (ang. hop latent viroid) in CBCVd v hmelju. V okviru raziskave 
smo objavili nove začetne oligonukleotide (ZO) za določanje CBCVd in interne 
kontrole na osnovi endogenov mRNA1192 in mRNA170 odkritih v transkriptomu z 
viroidi okuženega hmelja (Pokorn, 2017). Plod tega dela je tudi razvita metoda duRT-
qPCR za določanje CBCVd z uporabo interne kontrole mRNA1192, ki je v DL v uporabi 
za raziskave že od leta 2018 (interna oznaka MDL 12), vendar še ni bila v celoti 
validirana. ZO so bili testirani in situ in na 35 vzorcih različnih izolatov viroida CBCVd, 
HLVd, HSVd in CEVd. Nespecifično pomnoževanje ni bilo potrjeno. Analitična 
občutljivost, selektivnost, ponovljivost in obnovljivost so bile predhodno že testirane 
za ZO CBCVd (Gucek in sod., 2023). Uporabljeni so bili ZO v kombinaciji z drugimi 
tarčami kot pri duRT-qPCR (MDL 12), kar ima lahko vpliv na rezultate validacije. Z 
MDL 12 smo v zadnjih petih letih v okviru raziskav prav tako testirali več kot 1000 
vzorcev in nespecifičnega pomnoževanja nismo potrdili. Zato smo v okviru ocene 
tveganja odločili, da izvedemo analitično občutljivost, selektivnost, ponovljivost in 
obnovljivost.  
 
Za validacijo metod, ki so v postopku akreditacije po standardu ISO/IEC 17025:2017 
so na voljo EPPO smernice PM 7/98 (5) »Specific requirements for laboratories 
preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity« (EPPO, 2021). Pri vsaki 
diagnostični metodi za določanje rastlinskih škodljivih organizmov je potrebno 
določiti analitično občutljivost, specifičnost, selektivnost, ponovljivost in 
obnovljivost (dodatno lahko tudi robustnost). V postopku akreditacije izbrane 
metode je potrebno izvesti oceno tveganja, identificirati katera merila uspešnosti 
morajo biti ocenjena in v kakšnem obsegu ter določiti obseg validacije (celotna, 
delna, verifikacija). Po izvedbi validacije se oceni ali laboratorij ustreza kriterijem 
določenim v validirani metodi. Če zahteve niso dosežene tudi po modifikaciji 
metode, laboratorij ne sme izvajati metode glede na uveljavljena merila uspešnosti 
(EPPO, 2021). 
 
Z namenom širitve obsega akreditacije po standardu ISO/IEC 17025:2017 smo 
izvedli delno validacijo za diagnostično metodo MDL 12 z namenom, da zagotovimo 
objektivne dokaze, da je DL kompetenten za izvedbo metode MDL 12 in da se 
metoda v prihodnosti lahko vključi v obseg akreditacije.  
 
 
 

Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023) 
______________ 
29 
 
2 MATERIAL IN METODE 
 
Pri pregledu dosedanjih raziskav (Guček, 2020; Guček in sod., 2023) smo zbrali 
podatke o validaciji metode in izvedli oceno tveganja. V okviru analitične 
specifičnosti so bili predhodno začetni oligonukleotidi (ZO) (preglednica 1) (Guček, 
2020; Guček in sod., 2023) že testirani z metodo RT-qPCR in mRT-qPCR. Dodatno 
smo metodo MDL 12 vključili tudi v med-laboratorijsko testiranje vzorcev hmelja in 
RNA (skupno 14 vzorcev), organizirano s strani Nacionalnega referenčnega 
laboratorija iz Češke republike. 
 
2.1 Izolacija nukleinskih kislin 
 
Celokupne nukleinske kisline (TNA) smo iz vzorcev hmelja izolirali z uporabo CTAB 
reagenta kot že predhodno opisano (Kump in Javornik, 1996) z manjšimi 
modifikacijami (Pokorn, 2017). Uporabili smo 100 mg tkiva (listi hmelja), ki smo ga 
homogenizirali v terilnicah v prisotnosti CTAB pufra. Vzorce smo raztopili v 50 μl TE 
pufra (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) in jih shranili pri -20 °C. Da bi preprečili 
vpliv inhibitorjev, smo pred analizo izolirano TNA 10-krat redčili v vodi brez RNaz 
(RNase-free Water, Sigma-Aldrich, ZDA). 
 
V oceno analitične občutljivosti smo vključili tudi vzorce hmelja izolirane s 
komercialno dostopnim kompletom Spectrum
TM
 Plant Total RNA Isolation Kit (SPT, 
Sigma-Aldrich, ZDA), po A-protokolu z manjšimi modifikacijami (Jakše in sod., 
2015). Vzorce listov hmelja (100 mg) smo zdrobili z uporabo terilnice in priloženega 
pufra. Izolirano RNA smo shranili pri -70 °C. Pred analizo smo izolirano RNA 10-krat 
redčili v vodi brez RNaz, da bi preprečili vpliv inhibitorjev. 
 
2.2 duRT-qPCR reakcija 
 
Analizo duRT-qPCR smo izvedli s specifičnimi ZO in sondo za viroid CBCVd in interno 
kontrolo mRNA1192 (preglednica 1). Za analizo smo pripravili 20 in 40 × 
koncentrirano mešanico ZO in sond (20 × PP mRNA1192, 40 x PP CBCVd; ang. 
primer-probe mix). Mešanico smo pripravili iz 100 µM raztopin smernih (F) (4 µL/ 
8µL) in protismernih (R) (4 µL/ 8µL) ZO ter sonde (P) (4 µL/ 8µL), ki smo jim do 100 
µL dodali vodo. Za viroid CBCVd smo uporabili končno koncentracijo 300 nM ZO in 
za sonde 150 nM. Uporabili smo LNA-sonde z reporterskimi barvili (CBCVd s FAM, 
mRNA1192 s HEX) in dušilcem BHQ1 (preglednica 1). Za pozitivno kontrolo reakcije 
duRT-qPCR smo uporabili referenčne vzorce hmelja okuženega s CBCVd in umetno 
sintetizirano cDNA zaporedje (gBlocks) viroida CBCVd (pristopna številka 
KM211546; podatkovna zbirka GenBank, NCBI) (PAC) (Guček in sod., 2023), kot 
negativne kontrole pa zdrave rastline (BVV hmelj) in vodo (NAC, negativna kontrola 
reakcije). Načrtovana zaporedja ZO, sonde in gBlocks nam je sintetiziralo podjetje 
IDT (Integrated DNA Technologies, ZDA). 
 
 
 

30 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023)
______________
 
 
Preglednica 4: Seznam začetnih oligonukleotidov in sond za CBCVd in mRNA1192 za MDL 
12. 
 
ZO/sonda* Zaporedje 5`-3`** 
Dolžina 
produkta [bp] 
Barvilo Dušilec Vir 
CBCVdq-F6 GAGGGAACATACCTG
AAGAGGGA 
88 
 
FAM 
 
BHQ1 
 
Guček 
in sod., 
2023 CBCVdq-R6 GGTGCTGGACGCCAG 
CBCVdq-P1 CCGGG+GAAATC+TCT
TCA+GACTC+GTC 
mRNA1192_F1 GGTAGCAACACCCTT
CTTCTACTT 
96 HEX 
 
BHQ1 
 
Guček 
in sod., 
2023 mRNA1192_R1S ACCCGACTTTCCTCTA
CTTTG 
mRNA1192_PL CACAAAC+TCAACC+T
CTT+AGCACTTG 
*F, smerni ZO; R, protismerni ZO; P, sonda 
**modificirani nukleotidi pri LNA-sondah so označeni s + (pred nukleotidom) 
 
Reakcijo duRT-qPCR smo izvedli z dvema kompletoma reagentov SensiFAST
TM
 
Probe No-ROX Kit (Bioline, Meridian Bioscience) v kombinaciji z MultiScribe Reverse 
Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, TFS) in AgPath-ID
TM
 One Step RT-PCR 
(TFS).  
 
Preglednica 5: Sestava reakcijske mešanice in programi pomnoževanja duRT-qPCR s 
kompletom reagentov SensiFast (Bioline) in AgPATH (TFS). 
 
SensiFast 
 
AgPATH  
Komponenta* V [µL] Komponenta* V [µL] 
H
2
O  1,65 H
2
O  1,35 
2x Pufer 5 2x Pufer 5 
40 x PP CBCVd 0,5 40 x PP CBCVd 0,5 
20x PP mRNA1192 0,75 20x PP mRNA1192 0,75 
RT-encim 0,1 RT-encim 0,4 
vzorec (TNA/RNA) 2 vzorec (TNA/RNA) 2 
Volumen reakcije 10 Volumen reakcije 10 
    
Program pomnoževanja    
45 °C 10 min  47 °C 10 min  
95 °C 2 min   95 °C 5 min   
95 °C 15 s   40 ciklov  95 °C 15 s   40 ciklov  
60 °C 30 s  60 °C 30 s  
*H
2
O, sterilna voda brez nukleaz iz kompleta reagentov, Pufer, mešanica reagentov za qPCR 
iz kompleta reagentov; PP, mešanica ZO in sonde; RT-encim, encim reverzna transkriptaza iz 
kompleta reagentov, v primeru uporabe kompleta SensiFAST
TM 
je bil uporabljen encim 
MultiScribe Reverse Transcriptase 

Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023) 
______________ 
31 
 
Sestava reakcijske mešanice in program pomnoževanja (preglednica 2) sta bila 
podana za vsak komplet reagentov ločeno. Vzorce smo analizirali z reakcijami v 
enem koraku, v dveh tehničnih ponovitvah na ploščah za 96 vzorcev z detekcijskim 
sistemom LightCycler96 (Roche) in programom LightCycler96 Software 1.1.0.1320. 
 
2.3 Validacija metode  
 
2.3.1 Analitična občutljivost in selektivnost 
 
Določanje analitične občutljivosti in selektivnosti smo izvedli hkrati na istem setu 
vzorcev z dvema kompletoma reagentov (SensiFast in AgPATH). Analitično 
občutljivost za duRT-qPCR smo določili iz serije redčitev (10
0
 do 10
-10
) šestih vzorcev 
okuženih s CBCVd. Za analizo smo izbrali vzorce odvzete v okviru sistematičnih 
pregledov hmeljišč iz okuženih rastlin (CBCVd in HLVd) sort Aurora, Bobek, Celeia, 
ter biolistično okuženega hmelja (CBCVd, sorta Celeia), na katerih smo izvedli dva 
načina izolacije nukleinskih kislin (CTAB in SPT). V analizo smo vključili tudi umetno 
sintetizirano zaporedje viroida CBCVd (gBlocks). Program na detekcijskem sistemu 
LightCycler96 nam je samodejno izrisal standardno krivuljo serije redčitev, iz katere 
smo dobili podatke o vrednosti naklona krivulje in o koeficientu linearne regresije 
(R
2
). Učinkovitost pomnoževanja vzorcev v reakciji duRT-qPCR smo določili s 
pomočjo vrednosti naklona umeritvene krivulje (enačba 1), kjer E pomeni 
učinkovitost pomnoževanja, ki je 100 %, če je naklon -3,32 in E= 1. Iz R
2
 smo ugotovili, 
kako dobro se vrednosti meritev prilegajo krivulji linearne regresije, če je R
2
= 1, to 
pomeni 100 % prileganje (Pfaffl, 2001). 
 
       (1) 
 
Dodatno smo za analizo občutljivosti, glede na rezultate serije redčitev šestih 
vzorcev, testirali osem vzorcev pri minimalni redčitvi (10
-4
 in 10
-5
). Pri čemer 
minimalna redčitev pomeni zadnjo oziroma najmanjšo redčitev, pri kateri še dobimo 
pozitiven rezultat. V analizo smo vključili vzorce z različnimi kombinacijami viroidov 
(CBCVd, CBCVd+HLVd, CBCVd+HSVd) in različnim načinom okužbe (naravno, 
mehansko, biolistično). V primeru kombinacije CBCVd in HSVd smo vzorec pripravili 
sami iz RNA ekstraktov (razmerje 1:1). Na osnovi serije redčitev in testiranja vzorcev 
pri minimalni redčitvi smo določili mejo detekcije (LOD), to je bila redčitev oziroma 
koncentracija, pri kateri smo v več kot 50 % izvedenih poskusov še lahko določili 
viroid (Boben, 2006). Koncentracijo, pri kateri smo lahko viroide zaznali v 100 % 
poskusov, smo določili kot mejo kvantifikacije (LOQ, ang. Limit of quantification) 
glede na rezultate testiranja vzorcev pri minimalni redčitvi. LOD in LOQ smo definirali 
kot število molekul viroida v vzorcu, ki smo jih izračunali glede na koncentracijo po 
Olmos in sod. (2005). Na osnovi vseh rezultatov analize občutljivosti smo določili 
mejno vrednost. Izračunali smo jo iz povprečja zadnje pozitivne Cq-vrednosti 
(najvišji Cq), ki smo ji dodali 0,5 cikla (Dreo, 2013). Iz mejne vrednosti smo lahko 

32 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023)
______________
 
 
določili občutljivost reakcij, ki smo jo primerjali z RT-qPCR za določanje viroida 
CBCVd (rezultati predhodnih raziskav; Guček, 2020).  
 
2.3.2 Ponovljivost in obnovljivost 
 
Za validacijo ponovljivosti in obnovljivosti smo duRT-qPCR analizo izvedli s štirimi 
analitiki (AN1-4), dvema kompletoma reagentov (SensiFast in AgPATH) v treh dneh. 
Analizo smo izvedli v treh ločenih dneh z namenom določitve vpliva različnih 
časovnih točk na ponovljivost testiranja. Za set sedmih vzorcev hmelja (CBCVd, 
CBCVd+HLVd, BVV) smo izvedli izolacijo nukleinskih kislin s CTAB reagentom za 
vsakega analitika. Za vsak vzorec smo z duRT-qPCR testirali dve redčitvi vzorcev 
(10
-1
 in 10
-3
) in dve tehnični ponovitvi ter skupno analizirali 30 vzorcev na analitika 
na komplet reagentov.  
 
Za ponovljivost in obnovljivost smo izvedli 12 ločenih analiz v treh dneh s štirimi 
analitiki (preglednica 3). V okviru ponovljivosti smo vzorce testirali v istem dnevu 
(1. dan) v dveh ločenih reakcijah, od tega smo na eni plošči vzorce ponovili dvakrat, 
torej tri analize za en komplet reagentov v enem dnevu z dvema analitikoma in enim 
inštrumentom. Poleg rezultatov ponovljivosti smo za analizo obnovljivosti testirali 
vzorce še v dveh ločenih dnevih, skupaj torej dvanajst analiz. Vsi analitiki niso izvedli 
enakega števila analiz, ker smo se zaradi velikega števila vzorcev omejili na izvedbo 
iste analize v enem dnevu z enim kompletom reagentov samo z enim analitikom. 
Analizo smo ovrednotili z izračunom koeficienta variance (CV [%]= (SD/Cq)*100) iz 
povprečja standardnih deviacij (SD) in Cq-vrednosti, glede na Osman in sod. (2017). 
 
Preglednica 6: Seznam analitikov (AN1-4) za testiranje ponovljivosti in obnovljivosti glede na 
dan duRT-qPCR analize in komplet reagentov (SensiFast in AgPATH). 
 
Komplet reagentov/ dan 1. dan* 2. dan 3. dan 
SensiFast AN1, 2x AN2 AN1, AN3 AN4 
AgPATH 2x AN1, AN2 AN3, AN4 AN2 
*2x, testiranje istega seta vzorcev v 2 ponovitvah 
 
2.4 Med-laboratorijska primerjava 
 
V validacijo metode MDL 12 smo vključili tudi vzorce hmelja in RNA vključene v med-
laboratorijsko testiranje organizirano s strani NRL iz Češke republike. V testiranje je 
bilo vključeno 6 vzorcev liofiliziranega hmelja in 8 vzorcev RNA ekstraktov. V okviru 
med-laboratorijske primerjave smo v vzorcih določali prisotnost viroida CBCVd z 
akreditirano metodo RT-PCR (MDL 10), metodo duRT-qPCR (MDL 12) in metodo 
mRT-qPCR (MDL 13). Iz vzorcev liofiliziranega hmelja smo izvedli izolacijo 
nukleinskih kislin s CTAB reagentom kot že predhodno opisano (Kump in Javornik, 
1996) z manjšimi modifikacijami (Pokorn, 2017) v dveh ponovitvah na vzorec. Za 
duRT-qPCR analizo smo vse vzorce redčili 10-krat, da bi se izognili inhibiciji qPCR 
reakcije. Analizo smo izvedli z uporabo SensiFast kompleta reagentov v dveh 
tehničnih ponovitvah. 

Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023) 
______________ 
33 
 
3 REZULTATI IN RAZPRAVA 
 
3.1 Analitična občutljivost in selektivnost 
 
Pri testiranju analitične občutljivosti in selektivnosti smo z obema kompletoma 
reagentov dobili primerljive rezultate. Učinkovitost pomnoževanja (E) standardne 
krivulje za gBlocks vzorec je bila za SensiFast komplet reagentov 99 % (slika 1), za 
AgPATH kit pa 118 %, kar ustreza sprejemljivim vrednostim za sočasno določanje 
več tarč (80 do 120 %) (preglednica 4). Pri sočasnem določanju več tarč je namreč 
sprejemljiva nižja/višja E kot pri RT-qPCR (90-110 %) (Broeders in sod., 2014). 
 
 
 
Slika 3: Standardna krivulja za duRT-qPCR s kompletom SensiFast za vzorec gBlocks CBCVd. 
Za krivuljo viroida CBCVd so podani naklon, učinkovitost pomnoževanja (E), napaka, R
2
 in Y. 
 
Pri analizi vzorcev umetno sintetiziranega linearnega zaporedja gBlocks smo pri 
obeh kompletih reagentov viroid CBCVd določili do redčitve 10
-7
. Vse rezultate smo 
primerjali z RT-qPCR za CBCVd (Guček, 2020) in potrdili, da se občutljivost pri 
sočasnem določanju dveh tarč (CBCVd, mRNA1192) zmanjša 10-krat (preglednica 
4). 
 
Mejo detekcije oziroma zadnjo pozitivno redčitev, pri kateri v več kot 50 % izvedenih 
poskusov dobimo pozitiven signal, smo za duRT-qPCR določili iz RNA ekstraktov 
hmelja okuženega s CBCVd na seriji redčitev petih vzorcev (preglednica 5). Ker je v 
primeru gBlocks vzorca umetno sintetizirano cDNA zaporedje viroida CBCVd in ne 
nativne RNA rezultatov, za LOD in LOQ rezultatov gBlocks nismo upoštevali. Glede 
na serijo redčitev smo dobili pri RNA pozitivne rezultate za vse vzorce do redčitve 
10
-5 
kar je 5 pg RNA, kar smo določili kot LOD (preglednica 5). Mejo kvantifikacije 
(LOQ) oziroma zadnjo pozitivno redčitev, pri kateri v 100% izvedenih poskusov 
dobimo pozitiven signal, smo določili pri redčitvi 10
-4
, kar je 50 pg RNA. Pri testiranju 
osmih vzorcev pri minimalni redčitvi (10
-5
 in 10
-4
) smo namreč pozitivne signale v 
primeru vseh vzorcev dobili samo pri redčitvi10
-4
. Občutljivost vzorcev RNA izolirane 
iz hmelja smo primerjali tudi z metodo RT-qPCR in enako kot pri gBlocks dobili 10-
krat nižjo LOD, medtem ko se LOQ ni spremenila (preglednica 5). LOD smo definirali 
kot število molekul viroida v vzorcu, ki smo jih izračunali glede na koncentracijo po 
Olmos in sod. (2005). V primeru mRNA1192 smo z obema kompletoma reagentov 
določili LOD in LOQ do enake redčitve kot za CBCVd. Na osnovi rezultatov serij 

34 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023)
______________
 
 
redčitev smo določili mejno vrednost (Cq
cut off
). Izračunali smo jo iz povprečja zadnje 
pozitivne Cq-vrednosti (najvišji Cq), ki smo ji dodali 0,5 cikla (Dreo, 2013) in jo za 
CBCVd določili pri 31,2 za SensiFast in pri 33,7 za AgPATH komplet reagentov 
(preglednica 5). Pri AgPATH smo pri vseh vzorcih dobili višje Cq-vrednosti kot pri 
SensiFast kompletu, zato je posledično višja tudi mejna vrednost. 
 
Preglednica 7: Določitev občutljivosti duRT-qPCR za sočasno določanje CBCVd in mRNA1192 
s SensiFast in AgPATH kompletom reagentov in RT-qPCR za določanje CBCVd in v vzorcih 
gBlocks CBCVd. Za vzorce je podana redčitev, Cq-vrednost, naklon, R
2
 in učinkovitost 
pomnoževanja standardne krivulje (E). 
 
  
CBCVd   
Reakcija* Reagent redčitev Cq naklon R
2
 E (%) 
duRT-qPCR  SensiFast 10
-7
 30,67 -3,35 0,96 99 
duRT-qPCR AgPATH 10
-7
 31,49 -2,95 0,96 118 
RT-qPCR SensiFast 10
-8
 34,44 -3,40 0,98 97 
* RT-qPCR, pomnožitev CBCVd s SensiFast kompletom reagentov (Guček, 2020); duRT-qPCR, 
pomnožitev CBCVd in mRNA1192 s SensiFast kompletom reagentov, duRT-qPCR AgPATH, 
pomnožitev CBCVd in mRNA1192 z AgPATH kompletom reagentov; vzorec gBlocks, umetno 
sintetizitano zaporedje cDNA CBCVd viroida; redčitev, zadnja redčitev, pri kateri še dobimo 
pozitiven signal; Cq, zadnja Cq-vrednost, pri kateri še dobimo pozitiven rezultat; naklon, 
vrednost naklona standardne krivulje; R
2
, kvadratni koeficient linearne regresije; E, 
učinkovitost pomnoževanja izražena v odstotkih. 
 
V okviru občutljivosti smo hkrati testirali tudi selektivnost metode in viroid CBCVd 
uspešno določili ne glede na kombinacijo viroidov (samo CBCVd, CBCVd+HLVd, 
CBCVd+HSVd), način okužbe (mehansko, naravno, biolistično), sorto (Celeia, Bobek, 
Aurora) ali način izolacije (CTAB, SPT).  
 
Preglednica 8: Določitev občutljivosti reakcij RT-qPCR za določanje CBCVd in duRT-qPCR za 
sočasno določanje CBCVd in mRNA1192 v vzorcih RNA izolirane iz hmelja okuženega s 
CBCVd z metodo CTAB in SPT. Za vzorce je podana LOD, LOQ, koncentracija, število molekul 
in mejna vrednost (Cq
cut off
). 
 
 
 CBCVd    
Reakcija* Reagent LOD LOQ Konc. Št. molekul Cq
cut off
  
duRT-qPCR  SensiFast 10
-5
 10
-4
 5 pg 9*10
7 
31,2  
duRT-qPCR AgPATH 10
-5
 10
-4
 5 pg 9*10
7
 33,7  
RT-qPCR SensiFast 10
-6
 10
-6
 0,5 pg 9*10
6
 34,1  
*LOD, meja detekcije oziroma zadnja pozitivna redčitev, pri kateri v več kot 50 % izvedenih 
poskusov dobimo pozitiven signal; LOQ, meja kvantifikacije oziroma zadnja pozitivna redčitev 
pri kateri v 100% izvedenih poskusov dobimo pozitiven signal; konc, koncentracija, ki jo še 
lahko določimo in je enaka LOD; št. molekul, število molekul pri dani koncentraciji; Cq
cut off
, 
mejna vrednost, nad katero so vzorci negativni. 

Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023) 
______________ 
35 
 
S primerjavo obeh metod izolacij (CTAB, SPT) smo dobili enake LOD in LOQ, kar 
pomeni, da metoda izolacije RNA na rezultate občutljivosti ni imela vpliva. Glede na 
to, da smo v analizo vključili različne kombinacije viroidov, smo hkrati izvedli tudi 
dodatno analizo specifičnosti in ponovno potrdili, da so ZO v kombinaciji z LNA 
sondami specifični, ker nespecifičnega pomnoževanja pri testiranju občutljivosti 
nismo zaznali. 
 
3.2 Ponovljivost in obnovljivost 
 
Rezultati analize ponovljivosti in obnovljivosti metode duRT-qPCR so bili primerljivi 
v enakih in različnih časovnih točkah, med analitiki in kompleti reagentov. Skupno 
smo izvedli 12 analiz na 360 vzorcih. Pri vseh analizah smo dobili ustrezne rezultate 
in vse vzorce določili s 100 % natančnostjo. V primeru AgPATH kompleta reagentov 
smo dobili glede na SensiFast komplet višje Cq-vrednosti pri testiranju istih vzorcev. 
Prav tako smo v primeru uporabe AgPATH kompleta reagentov v vzorcih zdravega 
hmelja in negativnih kontrolah pri testiranju ponovljivosti dobili smo Cq-vrednosti 
okrog 34, kar je nad mejno vrednostjo Cq
cut off
, zato smo vzorce potrdili kot negativne.  
 
Vzorce, testirane v okviru ponovljivosti in obnovljivosti, smo analizirali z izračunom 
koeficienta variance (CV [%]) glede na Osman in sod. (2017). CV vrednosti za 
SensiFast in AgPATH komplet reagentov so bile zelo primerljive in ustrezne glede na 
predhodne raziskave (Osman in sod., 2017), zato smo kot primer v preglednici 6 
podali samo rezultate za SensiFast. V povprečju smo za vse analitike za SensiFast 
komplet reagentov dobili CV od 0,39 do 2,34 % (preglednica 6). V primeru AgPATH 
kompleta reagentov smo dobili primerljive povprečne CV vrednosti od 0,31 do 2,85 % 
(rezultati niso prikazani). Med CV vrednostmi za viroid CBCVd ali interno kontrolo 
mRNA1192 ni bilo razlik. Glede na večjo stabilnost interne kontrole v vzorcih smo 
pričakovali nižje vrednosti CV za mRNA1192. Najmanjša varianca je bila pri 
ponovitvah istega analitika na isti ploščici v eni reakciji za viroid CBCVd (AN2). 
Najvišjo varianco smo dobili pri primerjavi vseh analitikov v skupno šestih analizah 
na posamezen komplet reagentov. Rezultati so pričakovani, saj isti analitik znotraj 
iste analize naredi manjšo napako kot pa štirje različni analitiki v različnih časovnih 
točkah, če jih primerjamo med seboj. Prav tako je varianca večja, ker smo primerjali 
vzorce, ki so jih analitiki sami izolirali, kar pomeni, da je zaradi variabilnosti med 
izolacijo lahko prišlo do večjih odstopanj pri Cq-vrednostih. Med različnimi 
časovnimi okvirji analiz izvedenih v treh dneh je bila CV vrednost med 0,86 in 1,34 % 
za SensiFast komplet in med 0,35 in 0,94 % za AgPATH komplet. Na rezultate 
ponovljivosti prav tako ni imela vpliva kombinacija viroidov (CBCVd, CBCVd+HLVd) 
ali redčitev vzorcev. Iz rezultatov nizkih CV vrednosti lahko sklepamo, da je metoda 
zelo ponovljiva in obnovljiva tako med različnimi analitiki, kot tudi v različnih 
časovnih okvirjih (preglednica 6). 
 
 
 
 

36 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023)
______________
 
 
Preglednica 9: Določitev koeficienta variance CV [%] za ponovljivost in obnovljivost duRT-
qPCR reakcije pri uporabi SensiFast kompleta reagentov. Podan je CV izračunan za CBCVd in 
mRNA1192 med vsemi analitiki, za analitika 1 in 2, prvi dan in drugi dan izvajanja analiz. 
 
 
CV[%] CBCVd* 
 
CV[%] mRNA1192 
Vzorec vsi AN AN1 AN2 1. dan 2. dan 
 
vsi AN AN1 AN2 1. dan 2. dan 
CBCVd+ 0,91 1,55 0,03 0,57 0,81 
 
1,15 1,27 0,11 1,30 1,09 
CBCVd+ 1,51 1,41 0,09 0,20 1,54 
 
1,01 0,60 0,39 0,39 0,81 
CBCVd+ 1,10 0,84 0,21 0,21 0,51 
 
0,65 0,33 0,70 0,60 1,21 
CBCVd+ 1,17 1,09 0,20 1,16 0,93 
 
0,95 0,57 0,53 0,84 0,22 
CBCVd+HLVd 1,91 1,21 0,30 0,87 0,23 
 
2,30 0,07 3,88 2,94 2,81 
CBCVd+HLVd 2,37 1,07 0,52 1,20 0,07 
 
1,17 0,36 0,33 0,68 0,62 
CBCVd+HLVd 1,76 1,75 0,08 0,23 1,15 
 
1,07 0,62 0,07 1,08 0,29 
CBCVd+HLVd 2,45 0,92 0,05 2,12 2,19 
 
0,53 0,62 0,20 0,62 0,25 
PIC1= CBCVd 7,67 2,80 0,13 0,55 5,82 
 
4,58 2,43 0,07 0,42 4,94 
NIC1= BVV - - - - - 
 
3,32 0,07 0,74 0,66 2,01 
PAC1= CBCVd 1,60 1,67 1,64 1,34 0,69 
 
2,09 0,82 5,02 3,85 0,74 
PAC2=gBlocks CBCVd 3,32 0,88 1,02 0,99 0,18 
 - - - - - 
NAC1= BVV - - - - - 
 
0,63 0,18 0,37 0,33 1,10 
POVPREČJE CV [%] 2,34 1,38 0,39 0,86 1,28 
 
1,62 0,66 1,03 1,14 1,34 
*CV, koeficient variance; AN, analitik; PIC1, pozitivna kontrola izolacije; NIC1, negativna 
kontrola izolacije; BVV, vzorec hmelja brez virusov in viroidov; PAC1, pozitivna kontrola 
amplifikacije; PAC2, pozitivna kontrola amplifikacije umetno sintetizirano zaporedje viroida 
CBCVd; NAC1= negativna kontrola amplifikacije 
 
3.3 Med-laboratorijska primerjava 
 
Rezultati med-laboratorijske primerjave so podani v preglednici 7. V primeru 
liofiliziranega rastlinskega tkiva (Plant) smo CBCVd potrdili pri dveh od šestih 
vzorcev, v primeru RNA ekstraktov (RNA) pa pri dveh od osmih vzorcev. Rezultati so 
bili primerljivi tako z metodo RT-PCR (MDL 10) in mRT-qPCR (MDL 13). Glede na 
analizo rezultatov organizatorja med-laboratorijske primerjave smo bili pri določitvi 
viroida CBCVd 100 % uspešni. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023) 
______________ 
37 
 
Preglednica 10: Rezultati duRT-qPCR za vzorce med-laboratorijske primerjave. Podane so Cq-
vrednosti za CBCVd in mRNA1192. Vzorci, v katerih je CBCVd prisoten, so obarvani sivo. 
 
*PAC, pozitivna kontrola amplifikacije; BVV, vzorec hmelja brez virusov in viroidov; NAC, 
negativna kontrola kvantifikacije; Cq-vrednost, povprečje dveh tehničnih ponovitev 
 
4 ZAKLJUČEK 
 
Zagotavljanje zanesljivosti rezultatov je ključnega pomena pri analizi prisotnosti 
patogenov v rastlinskih vzorcih. Nepravilna določitev rezultata lahko povzroči 
negativne posledice, ki se lahko kažejo v neizvajanju ustreznih ukrepov in posledično 
gospodarski škodi. V primeru rastlinske diagnostike je zato ključna uporaba 
zanesljivih, občutljivih, neselektivnih in ponovljivih metod, ki so hkrati hitre in 
cenovno ugodne. V primeru vzpostavitve sistema kakovosti v skladu s standardom 
ISO/IEC 17025:2017 in pridobitve akreditacije se upoštevajo in sproti odpravljajo vsa 
tveganja, ki bi lahko povzročila nepravilne rezultate analiz. Pri vpeljavi metode v 
sistem kakovosti in obseg akreditacije je validacija metode ključnega pomena. 
Validacija namreč zagotavlja objektivne dokaze, da je laboratorij kompetenten za 
izvedbo validirane metode v skladu z določenimi merili uspešnosti. Dodatno je za 
ohranjanje kompetentnosti pomembno tudi sodelovanje v med-laboratorijskih 
primerjavah.  
 
Z delno validacijo diagnostične metode za sočasno določanje viroida CBCVd in 
interne kontrole mRNA1192 z duRT-qPCR smo določili analitično občutljivost (LOD 
pri 5 pg in LOQ pri 50 pg RNA), selektivnost (različne sorte, načini okužbe, izolacije, 
kombinacije viroidov), ponovljivost in obnovljivosti (12 analiz, 360 vzorcev, 100 % 
natančnost). Pri validaciji smo boljše rezultate, tako pri določanju občutljivosti, kot 
tudi ponovljivosti in obnovljivosti, dobili pri uporabi SensiFast kompleta reagentov, 
Vzorec* Cq CBCVd Cq mRNA1192 Rezultat CBCVd 
2023 Plant 1 - 17,82 ni prisoten 
2023 Plant 2 10,54 17,14 prisoten 
2023 Plant 3 - 17,71 ni prisoten 
2023 Plant 4 10,06 17,43 prisoten 
2023 Plant 5 - 17,44 ni prisoten 
2023 Plant 6 - 17,36 ni prisoten 
2023 RNA1 - 24,97 ni prisoten 
2023 RNA2 - 24,72 ni prisoten 
2023 RNA3 14,64 25,19 prisoten 
2023 RNA4 - 24,84 ni prisoten 
2023 RNA 5 - 24,88 ni prisoten 
2023 RNA 6 - 24,49 ni prisoten 
2023 RNA 7 14,66 25,19 prisoten 
2023 RNA 8 - 24,59 ni prisoten 
PAC hmelj CBCVd 13,36 15,19 prisoten 
PAC gBlocks CBCVd 9,99 - prisoten 
BVV - 19,34 ni prisoten 
NAC - - ni prisoten 

38 Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023)
______________
 
 
ki predstavlja optimalno izbiro za določanje viroida CBCVd in interne kontrole 
mRNA1192. AgPATH komplet reagentov predstavlja alternativo vendar se priporoča 
uporaba samo v primeru, ko uporaba SensiFast kompleta reagentov res ni mogoča 
(npr. dobava…). Validacijo smo izvedli z AgPATH kompletom zaradi testiranja 
najboljše možne alternative, ki pa naj ne bo optimalna izbira. 
 
Metoda MDL 12 glede na trenutno akreditirano metodo RT-PCR za določanje viroida 
CBCVd (MDL 10), omogoča določanje viroida CBCVd z večjo občutljivostjo, manj 
možnostmi za kontaminacijo (ni agaroznega gela), hkrati pa omogoča tudi 
kvantifikacijo. Metoda duRT-qPCR je v DL v uporabi od leta 2018 in se uporablja 
predvsem za raziskovalne namene v okviru epidemioloških študij CBCVd (analize 
vode, tal, hmelj in ostale rastline). V tem obdobju je bila MDL 12 vključena tudi v med-
laboratorijska testiranja. Kot zadnjega smo izvedli v oktobru 2023 z NRL iz Češke 
Republike, kjer smo dobili enake rezultate, kot pri uporabi že akreditirane metode RT-
PCR in mRT-qPCR in bili 100 % uspešni. Glede na vse izvedene analize in rezultate 
validacije z duRT-qPCR za določanje viroida CBCVd in interne kontrole mRNA1192 
(MDL 12) lahko sklepamo, da je metoda ustrezno validirana in primerna za tudi za 
uporabo pri analizah uradnih vzorcev, kjer se zahtevajo akreditirane metode. 
 
Zahvala. Avtorji se za finančno podporo zahvaljujemo Javni agenciji za 
znanstvenoraziskovalno in inovacijsko dejavnost Republike Slovenije (podoktorski 
projekt št. Z4-4557; raziskovalni program P4-0077) in Upravi za varno hrano, 
veterinarstvo in varstvo rastlin RS (Program strokovnih nalog zdravstvenega varstva 
rastlin na IHPS). Zahvala za uspešno tehnično izvedbo gre osebju DL: Mariji Grašinar 
Ašenberger, Silviji Žgajner in Maji Dobrajc. 
 
5 VIRI 
 
Boben J. 2006. Kvalitativno in kvantitativno določanje rastlinskih virusov z verižno reakcijo s 
polimerazo v realnem času. doktorska disertacija, Ljubljana, Univerza v Ljubljani, 
Biotehniška fakulteta: 122 str. 
Boonham N., Pérez L.G., Mendez M.S., Peralta E.L., Blockley A., Walsh K., Barker I., Mumford 
R.A. 2004. Development of a real-time RT-PCR assay for the detection of potato spindle 
tuber viroid. Journal of Virological Methods, 116: 139-146 
Botermans M., van de Vossenberg B.T., Verhoeven J.T., Roenhorst J.W., Hooftman M., Dekter 
R., Meekes E.T. 2013. Development and validation of a real-time RT-PCR assay for 
generic detection of pospiviroids. Journal of Virological Methods, 187: 43-50 
Broeders, S., I. Huber, L. Grohmann, G. Berben, I. Taverniers, M. Mazzara, N. Roosens, and D. 
Morisset. 2014. “Guidelines for Validation of Qualitative Real-Time PCR Methods.” 
Trends in Food Science and Technology 37 (2): 115–26. 
https://doi.org/10.1016/j.tifs.2014.03.008. 
Dreo, T. 2013. “Determination of LOD and Cycle Cut-off in Real-Time PCR Detecting Culturable 
and Non-Culturable Target Organisms.” In EPPO Workshop on Setting Ct Cut-off Values 
for Real-Time PCR, 11th-12th November 2013, 19. 
EPPO. PM 7/98 (5). 2015. Specific requirements for laboratories preparing accreditation for 
a plant pest diagnostic activity. Bulletion OEPP/EPPO Bulletin; 51 (3): 468-498. 

Hmeljarski bilten / Hop Bulletin 30 (2023) 
______________ 
39 
 
Guček, T. 2020. Biologija viroida razpokanosti skorje agrumov (CBCVd) in razvoj metod za 
določanje viroidov v hmelju : doktorska disertacija = Biology of citrus bark cracking viroid 
(CBCVd) and development of methods for detection of viroids in hop : doctoral 
dissertation.  Ljubljana: [T. Guček], XIV, 139 str., [33] str. pril., ilustr. 
https://repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php?id=121584. 
Guček, T., Jakše, J., Radišek, S. 2023. Optimization and validation of singleplex and multiplex 
RT-qPCR for detection of citrus bark cracking viroid (CBCVd), hop latent viroid (HLVd), 
and hop stunt viroid (HSVd) in hops (Humulus lupulus L.). Plant Disease, 10.1094/PDIS-
11-22-2606-RE 
Jakše J., Radišek S., Pokorn T., Matoušek J., Javornik B. 2015. Deep-sequencing revealed 
Citrus bark cracking viroid (CBCVd) as a highly aggressive pathogen on hop. Plant 
Pathology, 64: 831-842 
Kump B., Javornik B. 1996. Evaluation of genetic variability among common buckwheat 
(Fagopyrum esculentum Moench) populations by RAPD markers. Plant Science, 114: 
149-158 
Latorra D., Arar K., Michael Hurley J. 2003. Design considerations and effects of LNA in PCR 
primers. Molecular and Cellular Probes, 17: 253-259 
Lin L., Li R., Bateman M., Mock R., Kinard G. 2013. Development of a multiplex TaqMan real-
time RT-PCR assay for simultaneous detection of Asian prunus viruses, plum bark 
necrosis stem pitting associated virus, and peach latent mosaic viroid. European Journal 
of Plant Pathology, 137: 797-804 
Luigi M., Faggioli F. 2011. Development of quantitative real-time RT-PCR for the detection and 
quantification of Peach latent mosaic viroid. European Journal of Plant Pathology, 130: 
109-116 
Monger W., Tomlinson J., Booonham N., Marn M.V., Plesko I.M., Molinero-Demilly V., Tassus 
X., Meekes E., Toonen M., Papayiannis L., Perez-Egusquiza Z., Mehle N., Jansen C., 
Nielsen S.L. 2010. Development and inter-laboratory evaluation of real-time PCR assays 
for the detection of pospiviroids. Journal of Virological Methods, 169: 207-210 
Mumford R.A., Walsh K., Boonham N. 2000. A comparison of molecular methods for the 
routine detection of viroids. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin, 30: 431-435 
Olmos A., Bertolini E., Gil M., Cambra M. 2005. Real-time assay for quantitative detection of 
non-persistently transmitted Plum pox virus RNA targets in single aphids. Journal of 
Virological Methods, 128: 151-155 
Osman F., Dang T., Bodaghi S., Vidalakis G. 2017. One-step multiplex RT-qPCR detects three 
citrus viroids from different genera in a wide range of hosts. Journal of Virological 
Methods, 245: 40-52 
Parisi O., Lepoivre P., Jijakli M. 2011. Development of a Quick Quantitative Real-Time PCR for 
the In Vivo Detection and Quantification of Peach latent mosaic viroid. Plant Disease, 
95: 137-142 
Pfaffl M.W. 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. 
Nucleic Acids Research, 29: e45, doi: 10.1093/nar/29.9.e45: 22 str. 
Pokorn T. 2017. Identifikacija potencialnih tarč viroidnih malih RNA (vd-sRNA) v hmelju 
(Humulus lupulus L.), doktorska disertacija, Ljubljana, Biotehniška fakulteta: 159 str. 
Rizza S., Nobile G., Tessitori M., Catara A., Conte E. 2009. Real time RT-PCR assay for 
quantitative detection of Citrus viroid III in plant tissues. Plant Pathology, 58: 181-185 
Seigner L., Liebrecht M., Keckel L., Einberger K., Absmeier C. 2020. Real‑time RT‑PCR detection 
of Citrus bark cracking viroid (CBCVd) in hops including an mRNA‑based internal positive 
control. Journal of Plant Diseases and Protection, doi: 10.1007/s41348-020-00317-x: 5 
str. 
Valasek M.A., Repa J.J. 2005. The power of real-time PCR. Advances in Physiology Education, 
29: 151-159