Nina Čebulj Kadunc Monika C. Žužek LABORATORIJSKE VAJE IN RAČUNALNIŠKE SIMULACIJE V FIZIOLOGIJI 2. del: Fiziologija krvi, krvnega obtoka, dihanja, izločanja in gibanja Učbenik za študente veterinarske medicine LJUBLJANA, 2014 LABORATORIJSKE VAJE IN RAČUNALNIŠKE SIMULACIJE V FIZIOLOGIJI (2. del: Fiziologija krvi, krvnega obtoka, dihanja, izločanja in gibanja) Učbenik za študente veterinarske medicine Avtorici: Nina Čebulj Kadunc, Monika C. Žužek Izdajatelj: Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta Strokovna recenzija: Prof.dr. Martina Klinkon-Ogrinec, dr.vet.med., Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta Prof.dr. Robert Frangež, dr.vet.med., Univerza v Ljubljani, Veterinarska fakulteta Lektorica: prof. Ivanka Šircelj-Žnidaršič CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana 636.1/.9:612(075.8)(0.034.2) ČEBULJ-Kadunc, Nina Laboratorijske vaje in računalniške simulacije v fiziologiji [Elektronski vir] : učbenik za študente veterinarske medicine. Del 2, Fiziologija krvi, krvnega obtoka, dihanja, izločanja in gibanja / Nina Čebulj Kadunc, Monika C. Žužek. - El. knjiga. - Ljubljana : Veterinarska fakulteta, 2014 ISBN 978-961-6199-71-1 (pdf) 1. Žužek, Monika C. 276691712 KAZALO 1 FIZIOLOGIJA KRVI ..................................................................................................................................... 6 1.1 ODVZEM KRVI DOMAČIM ŽIVALIM ............................................................................................... 6 1.1.1 Splošni principi ................................................................................................................................. 6 1.1.2 Dolgotrajnejše jemanje krvi (kaniliranje) ......................................................................................... 6 1.1.3 Odvzem krvi z epruvetami s podtlakom ........................................................................................... 7 1.2 ANTIKOAGULANTI IN KOAGULACIJA KRVI ................................................................................. 7 1.2.1 Priprava antikoagulantov .................................................................................................................. 8 1.2.2 Fizikalni načini preprečevanja koagulacije krvi ................................................................................ 8 1.2.3 Priprava krvne plazme, krvnega seruma in defibrinirane krvi .......................................................... 8 1.2.4 Pomen kalcijevih ionov pri koagulaciji krvi ..................................................................................... 9 1.2.5 Določanje časa koagulacije krvi ..................................................................................................... 10 1.2.6 Določanje časa krvavitve ................................................................................................................. 11 1.3 DOLOČANJE VISKOZNOSTI KRVI IN KRVNE PLAZME (SERUMA) ......................................... 12 1.4 MERJENJE GOSTOTE KRVI IN KRVNE PLAZME (SERUMA) ..................................................... 13 1.4.1 Neposredno merjenje gostote krvi .................................................................................................. 13 1.4.2 Posredno določanje gostote krvi in krvnega seruma (plazme) z raztopino bakrovega sulfata ........ 13 1.5 HEMATOKRIT ..................................................................................................................................... 15 1.5.1 Korekcija hematokrita ..................................................................................................................... 16 1.5.2 Prikaz merjenja hematokrita ........................................................................................................... 17 1.5.3 Določanje hematokrita z metodo po Wintrobeju ............................................................................ 18 1.5.4 Določanje hematokrita z mikrohematokritsko metodo ................................................................... 19 1.6 SEDIMENTACIJA KRVI ..................................................................................................................... 20 1.6.1 Prikaz merjenja sedimentacije ........................................................................................................ 21 1.6.2 Metoda navpične sedimentacije (po Westergreenu) ....................................................................... 22 1.6.3 Metoda poševne sedimentacije ....................................................................................................... 23 1.7 HEMOLIZA IN OSMOTSKA REZISTENCA ERITROCITOV .......................................................... 24 1.7.1 Prikaz hemolize ............................................................................................................................... 24 1.7.2 Določanje osmotske rezistence eritrocitov ...................................................................................... 24 1.8 HEMOGLOBIN ..................................................................................................................................... 27 1.8.1 Določanje koncentracije hemoglobina ............................................................................................ 27 1.8.2 Določanje hemoglobinskega tipa pri ovcah .................................................................................... 30 1.8.3 Nastanek kristalov klorhemina (Teichmanovi kristali) ................................................................... 32 1.9 ŠTETJE KRVNIH CELIC ..................................................................................................................... 33 1.9.1 Štetje krvnih celic z mikroskopom .................................................................................................. 33 1.9.2 Štetje krvnih celic s hematološkimi analizatorji ............................................................................. 38 1.10 ERITROCITNI INDEKSI ................................................................................................................... 39 1.11 KRVNE SKUPINE .............................................................................................................................. 41 1.11.1 Prikaz določanja krvnih skupin sistemov ABO in Rh ................................................................... 42 1.11.2 Določanje krvnih skupin sistema ABO pri človeku ...................................................................... 44 3 1.12 LASTNOSTI KRVNE PLAZME/SERUMA....................................................................................... 45 1.12.1 Pufrska kapaciteta krvne plazme/seruma ...................................................................................... 45 1.12.2 Ločitev beljakovinskih frakcij krvne plazme z obarjanjem .......................................................... 46 2 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA ........................................................................................................ 47 2.1 ŽABJE SRCE KOT MODEL ZA ŠTUDIJ DELOVANJA SRCA ........................................................ 47 2.1.1 Prikaz delovanja srca žabe .............................................................................................................. 47 2.1.2 Lokalizacija srčnega avtomatizma (Stanniusove ligature) .............................................................. 52 2.2 ELEKTROKARDIOGRAFIJA ............................................................................................................. 53 2.2.1 Registracija EKG ............................................................................................................................ 53 2.2.2 Klinična uporaba EKG .................................................................................................................... 57 2.3 KARDIOVASKULARNA DINAMIKA ............................................................................................... 58 2.3.1 Mehanika črpalk ............................................................................................................................. 58 2.3.2 Pretok krvi po žilah ......................................................................................................................... 61 2.3.3 Merjenje hitrosti gibanja krvi .......................................................................................................... 65 2.3.4 Merjenje časa obtoka krvi ............................................................................................................... 66 2.4 SRČNI TONI ......................................................................................................................................... 67 2.4.1 Poslušanje srčnih tonov ................................................................................................................... 67 2.4.2 Fonokardioskopija in fonokardiografija .......................................................................................... 67 2.5 MINUTNI VOLUMEN SRCA .............................................................................................................. 69 2.5.1 Kirurške metode merjenja minutnega volumna srca ....................................................................... 69 2.5.2 Kemične metode merjenja minutnega volumna srca ...................................................................... 69 2.5.3 Dilucijske metode merjenja minutnega volumna srca .................................................................... 70 2.6 PULZ ..................................................................................................................................................... 71 2.6.1 Merjenje pulza pri domačih živalih in pri človeku ......................................................................... 71 2.6.2 Hitrost širjenja pulznega vala .......................................................................................................... 72 2.7 MERJENJE KRVNEGA TLAKA ......................................................................................................... 73 2.7.1 Neposredno merjenje krvnega tlaka v arteriji karotis pri kuncu ......................................................... 73 2.7.2 Natančno merjenje krvnega tlaka .................................................................................................... 75 2.7.3 Posredno merjenje krvnega tlaka .................................................................................................... 75 2.7.4 Vpliv nekaterih dejavnikov na delovanje srca in krvni tlak pri človeku ......................................... 77 2.8 KAPILARNA CIRKULACIJA ............................................................................................................. 80 2.8.1 Opazovanje kapilarne cirkulacije v mezenteriju žabe ..................................................................... 80 3 FIZIOLOGIJA DIHANJA ............................................................................................................................ 81 3.1 DOLOČANJE FREKVENCE DIHANJA ............................................................................................. 81 3.2 MERJENJE PLJUČNIH VOLUMNOV IN KAPACITET .................................................................... 81 3.2.1 Merjenje vitalne kapacitete s spirometrom po Hutchinsonu ........................................................... 83 3.2.2 Merjenje vitalne kapacitete pljuč s suhim spirometrom ( vitalografom) ......................................... 83 3.2.3 Prikaz merjenja pljučnih volumnov in kapacitet ............................................................................. 83 3.3 VLOGA INTRAPLEVRALNEGA TLAKA IN SURFAKTANTA PRI MEHANIZMU PLJUČNE VENTILACIJE ............................................................................................................................................ 85 3.3.1 Prikaz mehanizma pljučne ventilacije z Dondersonovim modelom ............................................... 85 3.3.2 Prikaz dejavnikov, ki vplivajo na dihanje ....................................................................................... 86 4 3.4 NADZOR IN URAVNAVANJE DIHANJA ......................................................................................... 88 3.4.1 Prikaz učinkov različnih načinov dihanja na raven CO2 ................................................................. 88 3.4.2 Vplivi na dihanje pri človeku .......................................................................................................... 90 4 FIZIOLOGIJA LEDVIC ............................................................................................................................... 92 4.1 PRIKAZ GLOMERULNE FILTRACIJE .............................................................................................. 92 4.1.1 Učinek premera žil na glomerulno filtracijo ................................................................................... 93 4.1.2 Učinek tlaka na glomerulno filtracijo ............................................................................................. 94 4.2 PRIKAZ NASTAJANJA KONČNEGA (DEFINITIVNEGA) URINA ................................................ 95 4.2.1 Vpliv koncentracijske razlike na sestavo definitivnega urina ....................................................... 96 4.2.2 Učinek glukoznih nosilcev na reabsorpcijo glukoze ....................................................................... 97 4.2.3 Prikaz učinka hormonov na nastajanje urina .................................................................................. 98 4.3 LASTNOSTI IN SESTAVA KONČNEGA URINA ............................................................................. 99 4.3.1 Odvzem urina .................................................................................................................................. 99 4.3.2 Pregled fizikalnih lastnosti urina ..................................................................................................... 99 4.3.3 Kemične preiskave urina ............................................................................................................... 101 4.3.4 Mikroskopski pregled urina .......................................................................................................... 104 5 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA ......................................................................................................... 107 5.1 KONTRAKCIJE MIŠIC ŽABE........................................................................................................... 107 5.1.1 Enostavna mišična kontrakcija ...................................................................................................... 108 5.1.2 Sestavljena mišična kontrakcija .................................................................................................... 111 5.1.3 Izotonična in izometrična mišična kontrakcija.............................................................................. 114 5.1.4 Elastičnost mišic ........................................................................................................................... 116 5.2 ERGOMETRIJA .................................................................................................................................. 117 5.2.1 Utrujanje prstnih mišic pri človeku ............................................................................................... 117 5.3 FIZIOLOGIJA GIBANJA ................................................................................................................... 118 5.3.1 Mehanski vplivi na potek gibanja ................................................................................................. 118 5.3.2 Ležanje .......................................................................................................................................... 119 5.3.3 Spreminjanje položaja na mestu ................................................................................................... 120 5.3.4 Hoja živali ..................................................................................................................................... 120 LITERATURA ................................................................................................................................................... 129 5 1 FIZIOLOGIJA KRVI Kri je vrsta tkiva, ki v telesu opravlja veliko pomembnih funkcij, predvsem transportno, homeostatsko, termoregulacijsko in obrambno. Zaradi razmeroma lahkega in neškodljivega načina odvzema je kri zelo primerna za opazovanje različnih stanj in sprememb v organizmu. Področje fiziologije, ki proučuje stanja v krvi v zvezi s fiziološkimi spremembami, se imenuje hematologija. Njej sorodna je klinična hematologija, ki na osnovi preiskav krvi pomaga pri diagnosticiranju bolezni ali postavljanju diferencialne diagnoze. Osnovne hematološke preiskave so ugotavljanje števila krvnih celic, hematokritske vrednosti, koncentracije hemoglobina in sedimentacije krvi. Sodobne biokemične analitske metode omogočajo tudi določanje koncentracije številnih organskih snovi, različnih mineralnih snovi, vitaminov, encimov, hormonov, barvil in drugih snovi v krvni plazmi ali serumu. 1.1 ODVZEM KRVI DOMAČIM ŽIVALIM 1.1.1 Splošni principi Živalim običajno jemljemo kri iz površinskih ven. Površina kože, kjer bomo jemali kri, mora biti pred tem očiščena in razkužena, po potrebi pa tudi postrižemo dlako ali odstranimo perje. Nato veno stisnemo ( komprimiramo), da nabrekne, in punktiramo s sterilno iglo. Kri počasi vsesamo z brizgo ali natočimo naravnost v epruveto ali v drugo zbirno posodo. Redkeje kot iz ven jemljemo kri iz arterij. Možno je tudi jemanje krvi iz kapilar oziroma kapilarnih pletežev. Pri malih živalih (npr. laboratorijske živali, majhni psi, mačke) lahko jemljemo kri tudi neposredno iz srca. Domačim živalim običajno jemljemo kri iz naslednjih ven: konju iz v. jugularis, govedu iz v. jugularis, v. coccigice ali v. abdominalis (kravam), prašiču iz v. auricularis, v. cave cranialis ali iz orbitalnega sinusa, psu iz v. cephalice antebrachii (prednja okončina), v. saphene parve (zadnja okončina) in v. jugularis, v narkozi pa tudi iz v. sublingualis, mački iz v. femoralis, kuncu iz v. auricularis, podgani in miši iz v. coccigice, podjezičnega ali orbitalnega žilnega pleteža ter perutnini iz krilne vene ali v. jugularis. 1.1.2 Dolgotrajnejše jemanje krvi (kaniliranje) Pri nekaterih poskusih, predvsem kadar proučujemo dinamične spremembe v krvi v daljšem časovnem obdobju, moramo odvzeti kri večkrat v krajših časovnih presledkih. Ker vsakokraten odvzem krvi kljub vsej previdnosti pomeni za žival stres in poškodbo tkiva, se poskušamo negativnim stranskim učinkom večkratnega jemanja krvi izogniti z vstavitvijo trajnega žilnega katetra ( kanile) v žilo. Najpogosteje vstavimo trajno kanilo v vratno veno ( v. jugularis). Področje, na katerem želimo vstaviti kanilo, najprej obrijemo in razkužimo. Nato žilo komprimiramo in jo prebodemo z ostrim delom žilnega katetra. Iglo odstranimo, kateter pa pustimo v žili in ga prilepimo na kožo ali dlako na vratu. Kateter napolnimo s fiziološko raztopino, ki vsebuje tudi antikoagulant (npr. heparin). 6 01 FIZIOLOGIJA KRVI Pred odvzemom vzorca krvi vsebino katetra in majhno količino krvi zavržemo. Tako preprečimo redčenje vzorca krvi s fiziološko raztopino. Po odvzemu vzorca kateter spet napolnimo s tekočino in ga zapremo z zamaškom. 1.1.3 Odvzem krvi z epruvetami s podtlakom Zaradi nevarnosti okužbe s povzročitelji bolezni, ki se prenašajo s krvjo, so proizvajalci medicinske opreme razvili pripomočke za odvzem krvi, ki zmanjšujejo možnost za neposredni stik jemalca krvi s krvjo pacienta. Ta pripomoček za odvzem krvi je sestavljen iz držala, igle z dvema konicama in epruvete s podtlakom (slika 1.1). Pred odvzemom krvi najprej odstranimo varovalo s kratke igle in jo privijemo v držalo. Nato odvijemo še varovalni tulec z dolge igle. V držalo vstavimo epruveto s podtlakom tako, da ne prebodemo zamaška. Epruveto in držalo primemo in z dolgo iglo punktiramo komprimirano žilo, nato pa epruveto pritisnemo navzgor tako, da spodnja konica igle prebode zamašek. Ker je v epruveti podtlak, prične kri pritekati v epruveto. Ko je epruveta polna, popustimo pritisk na žilo in iglo izvlečemo iz nje. Ker je v epruveti antikoagulant, vsebino premešamo z Slika 1.1: Pribor za jemanje krvi z epruvetami s nekajkratnim obračanjem epruvete. podtlakom 1.2 ANTIKOAGULANTI IN KOAGULACIJA KRVI Za hematološke preiskave potrebujemo večinoma tekočo kri. Strjevanje krvi preprečujemo z dodajanjem snovi, ki jih imenujemo antikoagulanti. Ti delujejo na različne faktorje koagulacije krvi in s tem prekinejo proces koagulacije. Vsi antikoagulanti delujejo le, če kri po odvzemu dobro premešamo. Glede na način delovanja ločimo dve osnovni skupini antikoagulantov. Antikoagulanti prve skupine delujejo tako, da vežejo kalcijeve ione in jih odstranjujejo iz plazme. Sem sodijo npr. citrati, fluoridi, oksalati in helati (natrijeve ali kalijeve soli etilendiaminotetraocetne kisline (EDTA)). Antikoagulanti druge skupine, kamor sodita heparin in hirudin, pa delujejo tako, da preprečujejo pretvorbo protrombina v trombin, delovanje trombina na fibrinogen in pretvorbo fibrinogena v fibrin. Heparin se v organizmu nahaja v krvnih in tkivnih bazofilcih (npr. jeter, pljuč), hirudin pa se nahaja v slini medicinske pijavke ( Hirudo medicinalis). 7 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.2.1 Priprava antikoagulantov  Natrijev citrat: Raztopino pripravimo tako, da 3,8 g trinatrijevega citrata razredčimo z destilirano vodo do 100 ml (3,8 % raztopina). Za preprečevanje koagulacije krvi uporabimo 1 del raztopine na 9 delov krvi. S tem kri nekoliko razredčimo, kar moramo upoštevati pri vrednotenju rezultatov hematoloških preiskav.  ACD raztopina se uporablja kot antikoagulant pri odvzemu ali shranjevanju krvi in eritrocitov za transfuzije. Raztopino pripravimo tako, da zatehtamo 1,37 g dinatrijevega brezvodnega citrata, 0,44 g brezvodne citronske kisline in 1,47 g monohidratne dekstroze ter dopolnimo z destilirano vodo do 100 ml. Raztopino steriliziramo v avtoklavu (15 minut na temperaturi 121 °C). Ob uporabi ga dodajamo krvi v razmerju en del raztopine ACD na štiri dele krvi.  Oksalati so strupeni, zato jih ne smemo dodajati krvi, ki se uporablja za transfuzijo. Kalijev oksalat povzroči krčenje, amonijev pa nabrekanje eritrocitov in levkocitov. Uporabna sta v kombinaciji 0,8 g kalijevega in 1,2 g amonijevega oksalata v 100 ml raztopine. Količina 0,1 ml raztopine zadostuje za 1 ml krvi. Raztopino kalijevega in amonijevega oksalata uporabljamo za pripravo suhega antikoagulanta. Prednost suhih antikoagulantov je v tem, da ne redčijo krvi. Oksalati niso priporočljivi za odvzem vzorcev, namenjenih za določanje neproteinskega dušika.  Soli EDTA lahko uporabljamo kot raztopine (mokri antikoagulanti) ali kot suhe dodatke krvi (suhi antikoagulanti). Najpogosteje se uporabljajo koncentracije 1 do 2 mg za en ml krvi. Če dodamo več kot 2 mg, pride do krčenja eritrocitov, zato so vrednosti MCH in MCHC netočne. V hematologiji poleg natrijevega uporabljamo tudi dikalijev EDTA, ki je zaradi boljše topnosti uporabnejši. Kadar določamo koncentracijo natrija ali kalija v krvi, uporabimo litijevo sol EDTA.  Heparin pogosto uporabljamo kot 1 % raztopino. 0,1 ml te raztopine prepreči koagulacijo 5 ml krvi. V praksi z 1 % raztopino heparina prepiramo brizge, kadar z njimi jemljemo kri. Heparin ne spremeni volumna eritrocitov, tudi če je dodan v prebitku, vpliva pa na morfološke lastnosti levkocitov. 1.2.2 Fizikalni načini preprečevanja koagulacije krvi Čas koagulacije lahko podaljšamo z uporabo silikoniziranega pribora in epruvet za odvzem krvi. Tudi plastične ali s parafinom prevlečene epruvete podaljšajo čas koagulacije. Dodatno podaljšamo čas koagulacije tudi, če epruvete predhodno ohladimo, neposredno po odvzemu pa vzorec krvi postavimo v hladilnik ali s centrifugiranjem na nizki temperaturi ločimo plazmo in celice. 1.2.3 Priprava krvne plazme, krvnega seruma in defibrinirane krvi  Krvna plazma je rumenkasta ali brezbarvna tekočina brez krvnih celic. Vsebuje vodo, pline, beljakovine (albumini, globulini, fibrinogen), različne ogljikove hidrate, lipide, neproteinske dušikove spojine, različne ione, encime, hormone, vitamine in pigmente. Dobimo jo tako, da kri, ki smo ji dodali antikoagulant, centrifugiramo (20 do 30 minut pri 2000 do 3000 obratih na minuto) in s tem ločimo krvne celice, ki se posedejo na dno epruvete, od plazme, ki ostane nad njimi. Nastalo plazmo odstranimo.  Krvni serum je tekočina brez krvnih celic. Dobimo ga tako, da pustimo kri spontano koagulirati. Ko se krvni strdek ( koagulum) skrči ( retrahira) in iztisne serum, slednjega odlijemo. Proces na 8 01 FIZIOLOGIJA KRVI sobni temperaturi traja približno 24 ur, pospešimo pa ga z inkubacijo krvi na 37 °C.  Defibrinirana kri: Če kri ob jemanju mešamo z leseno ali stekleno palčko, se fibrin kot gobasta masa nalaga na palčki. Ob tem so v krvi potekle reakcije koagulacije, zato je nadaljnja koagulacija ostanka krvi – "defibrinirane krvi" nemogoča. S centrifugiranjem iz take krvi dobimo krvni serum. Naloge: 1. Shematično ponazorite pripravo defibrinirane krvi, plazme in krvnega seruma! 2. Napišite glavne značilnosti vseh treh substratov in ponazorite njihovo sestavo! 1.2.4 Pomen kalcijevih ionov pri koagulaciji krvi Kri izven organizma naglo koagulira. Koagulacija krvi je sestavljen proces, ki poteka kot veriga zaporednih biokemičnih reakcij, ki si večinoma sledijo z veliko hitrostjo (kaskadni proces). Pri koagulaciji krvi sodelujejo številne substance – faktorji koagulacije krvi. Imenujemo pa jih po avtorjih, ki so jih odkrili, z generičnimi imeni ali z rimskimi številkami (npr.: IX. – antihemofilični globulin, B – Cristmasov faktor, XII. – kontaktni – Hagemanov faktor). Faktorji sodelujejo pri vseh fazah strjevanja krvi. Osnovne faze koagulacije krvi so:  profaza – sprememba na trombocitih in v krvni plazmi po stiku s tujimi površinami ali steno poškodovanih krvnih žil; ob tem pride do sproščanja trombocitnih faktorjev koagulacije in aktiviranja XII. (kontaktnega, Hagemanovega) faktorja iz plazme;  1. faza – aktivacija tromboplastina (trombokinaze);  2. faza – protrombin se pod vplivom tromboplastina in Ca2+pretvori v trombin;  3. faza – fibrinogen se pod vplivom trombina aktivira in polimerizira v fibrin;  4. faza – spremembe na nastalem krvnem koagulumu (krčenje – retrakcija fibrina pod vplivom kontraktilnega proteina trombastenina iz trombocitov in razgradnja fibrina – fibrinoliza pod vplivom fibrinolitičnega fermenta plazmina). a) Material:  Citratna kri, defibrinirana kri, krvna plazma, krvni serum, heparizirana kri, raztopina CaCl2 s snkc 0,18 mol/L (mkc 20 g/L), epruvete v stojalu in vodna kopel (segreta na 37–39 °C). b) Postopek: 1. Pripravimo in označimo 5 epruvet: v prvo epruveto odpipetiramo 2 ml citratne krvi, v drugo 2 ml defibrinirane krvi, v tretjo 2 ml krvne plazme, v četrto 2 ml krvnega seruma in v peto 2 ml heparizirane krvi. 2. V vsako epruveto dodamo 3 kapljice raztopine CaCl2. 3. Stojalo z epruvetami postavimo v vodno kopel za 20 min. c) Naloge: 1. Shematično prikažite izvedbo vaje! 2. Opišite in razložite rezultate poskusa in jih vnesite v spodnjo tabelo! 9 01 FIZIOLOGIJA KRVI Št. epr. Substrat (ml) Reagent Rezultati in razlaga 1 2 3 4 5 1.2.5 Določanje časa koagulacije krvi Koagulacija krvi traja določen čas, ki je v normalnih fizioloških okoliščinah specifičen za posamezne živalske vrste. Čas koagulacije krvi je čas, ki mine od odvzema krvi do takrat, ko se ta kri strdi sama od sebe. Ta čas se pri različnih postopkih nekoliko razlikuje. Pomemben je za ugotavljanje motenj v strjevanju krvi ( koagulopatij), ki nastopijo ob pomanjkanju nekaterih faktorjev strjevanja krvi. Če pride do njih, se ta čas znatno podaljša. Za določanje časa koagulacije se v praksi uporabljajo različne metode (tabela 1.1), ki temeljijo na opazovanju določene količine krvi in zapisovanju časa nastanka očitnih znamenj njene koagulacije. Tabela 1.1: Časi koagulacije krvi pri živalih, izmerjeni pri različnih metodah Živalska Metoda vrsta na predmetnici po Foniu po Lee-Whitu [min] [min] [min] pes 2–4 2,5 3–5 drobnica – 2,5 – prašič – 3,5 – kunec 2–4 4,5 3–5 kokoš – 4,5 – govedo – 6,5 3–6 konj 7–8 11,5 6–12 človek 4–5 – 5–10  Metoda na predmetnici: Kapljico krvi kanemo iz žile na predmetnico, jo vsakih 15 sekund nagnemo in opazujemo, kdaj bo nehala drseti. Čas odčitamo na uri, ki smo jo sprožili, ko smo kapljico kanili na predmetnico.  Metoda po Foniu: Na urno steklo kanemo direktno iz kanile, zabodene v veno, 10 kapljic krvi. Stekelce postavimo v petrijevko z navlaženim filtrirnim papirjem. Z občasnim nagibanjem ugotovimo, kdaj kri preneha drseti po urnem steklu. Merimo čas od trenutka, ko smo kri kanili na urno stekelce, do trenutka, ko preneha drseti. 10 01 FIZIOLOGIJA KRVI  Metoda po Lee-Whitu: Iz periferne vene odvzamemo kri z brizgo. V vsako od štirih epruvet direktno iz brizge odmerimo po 1 ml krvi. Epruvete postavimo v vodno kopel, segreto na 37–39 °C. Vsakih 20–30 sekund nagnemo dve epruveti do kota 45° in opazujemo, kdaj se kri strdi. Takrat preverimo tudi nastanek krvnega strdka v drugih dveh epruvetah. Merimo čas od trenutka, ko smo kri natočili v epruvete, do trenutka, ko se v vseh štirih epruvetah strdi. Naloge: 1. Shematično prikažite izvedbo metod! 2. Z eno od metod izmerite čas koagulacije krvi pri kuncu! 1.2.6 Določanje časa krvavitve Čas krvavitve je čas, ki je potreben, da preneha kri iztekati iz žile. Na čas krvavitve vplivajo faktorji koagulacije krvi in krčenje krvnih žil. a) Material:  Sterilna igla ali lanceta, filtrirni papir, kunec (v zabojčku) in laboratorijska ura. b) Postopek: 1. Kuncu ostrižemo dlako in z alkoholom in etrom očistimo kožo nad ušesno veno. 2. Z iglo ali lanceto naredimo vbod v veno. 3. Ko se pokaže prva kaplja krvi, sprožimo uro in nato vsakih 30 sekund popivnamo novonastalo kapljo krvi z robom filtrirnega papirja. Konec krvavitve nastopi, ko kri ne pušča več sledi na filtrirnem papirju. c) Naloge: 1. Shematično ponazorite izvedbo postopka! 2. Določite čas krvavitve pri kuncu! 11 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.3 DOLOČANJE VISKOZNOSTI KRVI IN KRVNE PLAZME (SERUMA) Hitrost gibanja tekočin v enakih kapilarah, pod enakim tlakom in na enaki temperaturi je odvisna od notranjega trenja njihovih delcev. Ta pojav imenujemo viskoznost. Viskoznost koloidnih raztopin je znatno večja kot viskoznost pravih raztopin. Viskoznost tekočin lahko ocenimo na osnovi merjenja hitrosti prehoda določene tekočine skozi kapilarno cevko v primerjavi s hitrostjo prehoda destilirane vode. Naprava za merjenje viskoznosti se imenuje viskozimeter, obstaja pa več različnih tipov (npr. kapilarni, rotacijski). Viskoznost krvi je odvisna od števila in velikosti krvnih celic kot tudi od vsebnosti vode in snovi, raztopljenih v plazmi (zlasti beljakovin in fibrinogena), zato se razlikuje glede na vrsto živali (pri mesojedih je večja kot pri rastlinojedih), spol (pri moških osebkih je večja kot pri ženskih), prehrano in fiziološko oziroma patološko stanje organizma (npr. izguba vode iz organizma poveča viskoznost krvi). Vrednost relativne viskoznosti krvi pri domačih živalih (tabela 1.2) znaša 4,3 do 5,9, seruma pa 1,6 do 2,0 (v primerjavi z destilirano vodo, katere viskoznost je 1). a) Material:  Lijak z zoženim iztokom, kri, krvna plazma ali serum, destilirana voda, pipete, stojalo s prižemo in štoparica. Tabela 1.2: Relativna viskoznost krvi in krvnega seruma domačih živali in človeka Vrsta živali Kri Serum konj 4,1 2,04 govedo 4,6 1,87 ovca 4,3 1,61 koza 4,0 1,75 prašič 5,9 1,69 pes 4,7 1,74 človek 4,5 1,80 b) Postopek: 1. V lijak, s prižemo pritrjen na stojalo, odpipetiramo 2 ml destilirane vode in izmerimo čas, ki je potreben, da izteče vsa voda. 2. Postopek ponovimo še s krvjo in krvno plazmo (ali serumom). Pred vsakim merjenjem je treba lijak očistiti in osušiti! 3. Viskoznost preiskovane tekočine izračunamo po spodnji enačbi: Vn = Vv × (tn/tv) (Vn – viskoznost preiskovane tekočine, Vv – viskoznost vode, tn – čas pretoka preiskovane tekočine, tv – čas pretoka vode) c) Naloge: 1. Shematično prikažite izvedbo meritve! 2. Izmerite čas iztekanja vode, krvi in plazme oziroma seruma in ocenite viskoznost posameznih tekočin! 3. Razložite opazovane pojave! 12 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.4 MERJENJE GOSTOTE KRVI IN KRVNE PLAZME (SERUMA) Gostota snovi je razmerje med njeno maso in volumnom (ρ = m/V). Enota je kg/m3 oziroma g/L. Gostota krvi je med 1035 in 1060 g/L in je odvisna od števila eritrocitov, količine hemoglobina in koncentracije elektrolitov in beljakovin v krvni plazmi. Gostota krvnega seruma znaša 1020 do 1027 g/L, gostota eritrocitov pa 1080 do 1090 g/L. 1.4.1 Neposredno merjenje gostote krvi Večjim količinam krvi (krvne plazme ali seruma) lahko izmerimo gostoto neposredno z areometrom ali piknometrom. Pri merjenju gostote z areometrom tega potopimo v stekleno čašo, napolnjeno s krvjo, krvno plazmo ali krvnim serumom (slika 1.2) in na skali neposredno odčitamo vrednot gostote. Kadar merimo gostoto s piknometrom, najprej stehtamo prazen piknometer. Nato ga napolnimo s preiskovano tekočino in zopet stehtamo. Gostoto preiskovane tekočine izračunamo tako, da od vrednosti mase piknometra s preiskovano tekočino odštejemo vrednost mase praznega piknometra, nato maso preiskovane tekočine Slika 1.2: Areometer delimo z njenim volumnom (ρ = m/V). 1.4.2 Posredno določanje gostote krvi in krvnega seruma (plazme) z raztopino bakrovega sulfata Ta metoda določanja gostote krvi temelji na principu, po katerem telo lebdi v tekočini, katere gostota je enaka gostoti telesa, v tekočini z nižjo gostoto potone in v tekočini z višjo gostoto se dvigne na površino. Kapljica krvi v raztopini bakrovega sulfata ne bo razpadla zaradi nastanka bakrovega proteinata na njeni površini. Prednost metode je predvsem v tem, da lahko merimo gostoto majhne količine vzorca. a) Material:  Nasičena raztopina modre galice (CuSO4 × 5 H2O), destilirana voda, citratna kri, epruvete, pipete in kapalke. b) Postopek: 1. Nasičeno raztopino modre galice pripravimo tako, da 2 kg modre galice raztopimo v 2,5 L destilirane vode. Ker je raztopina nasičena, se vsa modra galica ne raztopi. Raztopino najprej filtriramo, nato pa 488 ml nasičene raztopine razredčimo z destilirano vodo do volumna 1 litra. S tem dobimo osnovno raztopino modre galice z gostoto 1100 g/L, ki jo 13 01 FIZIOLOGIJA KRVI preverimo z areometrom in po potrebi korigiramo. 2. V označenih epruvetah po navodilih (gl. tabelo 1.3) pripravimo raztopine modre galice različnih specifičnih tež. 3. V vsako epruveto kanemo kapljico krvi in opazujemo njeno obnašanje 5 do 10 sekund. Rezultat zapišemo v tabelo 1.3. 4. Postopek ponovimo (v istih epruvetah) še s krvnim serumom c) Naloge: 1. Shematično prikažite izvedbo vaje! 2. Na osnovi obnašanja kapljic v posameznih epruvetah določite gostoto krvi in krvne plazme oziroma seruma! Rezultate meritev vnesite v tabelo 1.3! Tabela 1.3: Priprava raztopin modre galice določenih gostot (gostota osnovne raztopine je 1100 g/L) Številka Volumen Volumen Gostota epruvete osnovne vode raztopine Obnašanje kapljice raztopine [ml] [g/L] [ml] 1 1,9 8,1 1020 2 2,1 7,9 1022 3 2,3 7,7 1024 4 2,5 7,5 1026 5 2,7 7,3 1028 6 2,9 7,1 1030 7 3,1 6,9 1032 8 3,3 6,7 1034 9 3,5 6,5 1036 10 3,7 6,3 1038 11 3,9 6,1 1040 12 4,1 5,9 1042 13 4,3 5,7 1044 14 4,5 5,5 1046 15 4,7 5,3 1048 16 4,9 5,1 1050 17 5,1 4,9 1052 18 5,3 4,7 1054 19 5,5 4,5 1056 20 5,7 4,3 1058 21 5,9 4,1 1060 22 6,1 3,9 1062 23 6,3 3,7 1064 24 6,5 3,5 1066 25 6,7 3,3 1068 14 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.5 HEMATOKRIT Hematokrit je volumski odnos med količino krvnih celic in količino krvne plazme in prikazuje delež eritrocitov v krvi. Določamo ga s centrifugiranjem venske krvi, ki smo ji dodali nek antikoagulant. Po centrifugiranju dobimo na dnu hematokritske cevke stolpec eritrocitov, nad tem je sloj levkocitov in trombocitov (debeline 0,5 do 1 mm), nad njim pa krvna plazma. Vrednost hematokrita določimo z računanjem razmerja med celotno višino stolpca krvi in višino stolpca eritrocitov. Postopek lahko poenostavimo z uporabo graduiranih cevčic ali posebnih čitalcev. Delež eritrocitov izražamo glede na celotno kri v odstotkih (% – stari merski sistem) ali v deležu od ena [1/1] po SI. V angloameriški literaturi zasledimo namesto hematokrita tudi izraz PCV ( Packed Cell Volume) . Vrednost hematokrita je odvisna od velikosti in števila eritrocitov v krvi, zato se razlikuje glede na vrsto živali (tabela 1.4), starost, spol, vpliv zunanjih faktorjev in bolezenskih stanj. Padec hematokrita pod fiziološke vrednosti je posledica zmanjšanja števila oziroma velikosti eritrocitov (anemije) zaradi izgube krvi ali motenj v nastajanju eritrocitov. Dvig nad normalne vrednosti pa je posledica povečanja števila eritrocitov (policitemije) oziroma njihove velikosti. Nastane lahko tudi ob dehidraciji živali (zaradi znojenja, bruhanja ali driske) ali zaradi ekscitacij, ki izzovejo izločanje eritrocitov iz vranice (zaradi večjih količin adrenalina). Tabela 1.4: Vrednost hematokrita (povprečje in razpon fizioloških vrednosti) pri domačih živalih Vrsta Povprečje Razpon fizioloških živali [1/1] vrednosti [1/1] govedo – Ž 0,34 0,24–0,43 M 0,35 0,28–0,52 konj 0,4 0,32–0,53 ovca 0,37 0,29–0,45 koza 0,30 0,21–0,42 prašič 0,42 0,34–0,50 pes 0,46 0,35–0,56 mačka 0,37 0,42–0,40 opica 0,42 0,34–0,49 kunec 0,39 0,28–0,46 podgana 0,42 0,37–0,48 kokoš 0,32 0,27–0,51 človek – Ž 0,42 0,37–0,47 M 0,47 0,40–0,54 15 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.5.1 Korekcija hematokrita Pri centrifugiranju krvi v sloju eritrocitov vedno ostane del plazme. Količina te plazme je odvisna od številnih faktorjev, npr. od trajanja in hitrosti centrifugiranja, razlike med metodami (pri mikrohematokritski metodi manjše količine kot pri makrohematokritski), velikosti eritrocitov (čim večji so eritrociti, manj je zaostale plazme) in od vrednosti hematokrita (čim nižje so vrednosti, manj je zaostale plazme). Pri vrednostih hematokrita od 0,13 do 0,20 je zaostale plazme 1,5– 2,5 %, pri vrednostih 0,40 do 0,45 od 4,5–5,5 %, pri vrednostih od 0,60 do 0,65 pa 7–8 %.  Pravi hematokrit venske krvi je izmerjeni hematokrit venske krvi, zmanjšan za tisto količino plazme, ki ostane po centrifugiranju v stolpcu celic. Dobimo ga, če vrednost hematokrita, ki jo dobimo ob centrifugiranju venske krvi, pomnožimo s faktorjem za zaostalo plazmo: Htpr = Htizm × Fzp (Htpr – pravi hematokrit venske krvi, Htiz – izmerjeni hematokrit venske krvi, Fzp – faktor za zaostalo plazmo) Faktor za zaostalo plazmo dobimo s primerjavo pravega volumna krvi živali in preračunanega volumna krvi iz venskega hematokrita in znaša za psa 0,97, za ovco 0,91, za kozo 0,91 in za človeka 0,99.  Telesni hematokrit: Razmerje med eritrociti in plazmo v velikih krvnih žilah je drugačno kot v majhnih, zato se razlikujejo tudi vrednosti hematokrita. Hematokrit venske in arterijske krvi je večji kot hematokrit v majhnih krvnih žilah zaradi razlik med razmerjem površine endotela krvnih žil in volumnom lumena, ob pretoku krvi je več plazme na površini toka krvi. Vrednost telesnega hematokrita dobimo z množenjem pravega hematokrita venske krvi s faktorjem za razmerje telo/vene ali z množenjem izmerjenega hematokrita s splošnim korekcijskim faktorjem: Httel = Htpr × Ft:v = Htizm × Fspl (Httel – telesni hematokrit, Ft:v – faktor za razmerje telo/vene, Fspl – splošni korekcijski faktor) Faktor za razmerje telo/vene znaša za psa 0,89, za kozo 0,90, za prašiča 0,71 in za kunca 0,89. Vpliv na ta faktor imajo npr. starost, velikost, stopnja aktivnosti živali, koncentracija hemoglobina. Splošni korekcijski faktor venskega hematokrita (Fspl) pa dobimo z množenjem faktorja za zaostalo plazmo s faktorjem za razmerje telo/vene (Fspl= Fzp × Ft:v). 16 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.5.2 Prikaz merjenja hematokrita Merjenje hematokrita lahko prikažemo z računalniško simulacijo (npr. PhysioEx). Računalniško simulacijo odpremo z izbiro ukaza Poskus/Določanje hematokrita (Experiment/Haematocrit determination) v poglavju Krvne analize (Blood analyses). Virtualni laboratorij za merjenje hematokrita prikazuje slika 1.3. Na spodnjem delu virtualnega laboratorija je enota za shranjevanje rezultatov, nad njo je levo hematokritska centrifuga, desno stojalo za epruvete, med njima pa posodica z voskom za zapiranje cevk. V zgornjem desnem kotu so heparinizirane steklene kapilare, v levem pa čitalec hematokrita. Spodaj levo je posoda za odlaganje s krvjo kontaminiranega materiala. a) Postopek: 1. Kapilarno cevko premaknemo v prvo epruveto s krvjo; cevka se napolni zaradi kapilarnega vleka. 2. Napolnjeno kapilarno cevko premaknemo k posodici z voskom; cevka se zamaši na spodnji strani. 3. Napolnjeno in zamašeno kapilarno cevko prenesemo v mikrohematokritsko centrifugo. 4. Postopek ponovimo še z ostalimi vzorci. 5. Delovanje centrifuge naravnamo na 5 minut (s tipkama (+) in (–) ob prikazu) in z ukazom Start poženemo centrifugo. 6. Ko se centrifuga ustavi in odpre, prenesemo 1. cevko v merilec hematokrita, ki nam pokaže višino stolpca eritrocitov in levkocitov. Rezultate zapišemo v zgornji tabeli. 7. Postopek ponovimo še z ostalimi cevkami. Slika 1.3: Virtualni laboratorij za merjenje hematokrita 17 01 FIZIOLOGIJA KRVI Številka Višina stolpca Višina stolpca Vrednost krvi eritrocitov hematokrita vzorca Razlaga (mm) (mm) (1/1) 1 2 3 4 5 6 b) Naloge: 1. Rezultate meritev vnesite v zgornjo tabelo! 2. Razložite, kakšni so po vašem mnenju razlogi za razlike med izmerjenimi vrednostmi hematokrita! 1.5.3 Določanje hematokrita z metodo po Wintrobeju a) Material:  Wintrobejeve hematokritske epruvete, citratna kri, brizga z dolgo iglo, centrifuga in staničevina. b) Postopek: a) Z dobro premešano citratno krvjo napolnimo (z brizgo z dolgo iglo) Wintrobejevo epruveto do zgornje oznake. b) Cevko centrifugiramo 30 minut pri 3000 obratih/min. c) Po končanem centrifugiranju odčitamo višino stolpca eritrocitov. c) Naloge: 1. Narišite in opišite hematokritsko cevčico po Wintrobeju! 2. Izmerite hematokritsko vrednost krvi! 18 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.5.4 Določanje hematokrita z mikrohematokritsko metodo a) Material:  Citratna kri, kapilarne cevčice (heparinizirane), vosek (kit), mikrohematokritska centrifuga, normogram za odčitanje vrednosti (slika 1.4). b) Postopek: 1. Kapilarne cevčice napolnimo s krvjo in na enem koncu zamašimo. 2. Cevčice vstavimo v centrifugo (z zamašenim koncem navzven). 3. Centrifugiramo 2 minuti in pol (števila obratov ni treba uravnavati, ker je avtomatsko regulirano). 4. Po končanem centrifugiranju cevčico namestimo v ležišče pomičnega dela na čitalcu, ki ga premikamo toliko časa, da leži vsebina kapilare med spodnjo in zgornjo oznako normograma. c) Naloge: 1. Opišite cevčico za izvedbo mikrohematokritske metode! 2. Izmerite mikrohematokritsko vrednost vzorca krvi! Vrednost primerjajte z rezultatom, ki ste ga izmerili z makrohematokritsko metodo! Slika 1.4: Normogram za določanje vrednosti hematokrita 19 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.6 SEDIMENTACIJA KRVI V krvi, ki smo ji dodali antikoagulant, je suspenzija eritrocitov nekaj časa stabilna, nato pa pride do posedanja eritrocitov in njihovega ločevanja iz plazme. Intenzivnost tega posedanja – sedimentacije – je merilo stabilnosti suspenzije eritrocitov v krvni plazmi. Hitrost sedimentacije je odvisna od stopnje adhezivnosti in nagnjenosti eritrocitov k aglutinaciji, velikosti eritrocitov, prisotnosti različnih snovi v plazmi (npr. serumski albumini povečajo stabilnost suspenzije eritrocitov in upočasnijo sedimentacijo, fibrinogen, glikoproteidi in gamaglobulini pa jo pospešijo), viskoznosti krvne plazme, specifične teže krvnih celic ali plazme, zunanje temperature, antikoagulantov in nagiba merilne pipete. Pri različnih živalskih vrstah poteka različno hitro. Najhitrejša je pri konju, medtem ko je pri eritrocitih prežvekovalcev zanemarljiva. Vpliv eritrocitov lahko dokažemo s poskusom: če damo eritrocite konja v govejo plazmo, ti hitro sedimentirajo, eritrociti goveda v konjski plazmi pa počasi. Tabela 1.5: Vrednosti navpične sedimentacije eritrocitov (v mm) pri domačih živalih in človeku Vrsta Čas sedimentacije živali 30 min 60 min 120 min 24 ur govedo 0,5 1,0 2,0 12,0 konj 107,0 135,0 143,0 148,0 ovca – 0,6 1,3 12,6 koza 0,25 0,5 1,0 8,0 prašič 2,5 5,0 10,0 45,0 pes 1,0 2,0 4,0 10,0 mačka 2,7 7,3 16,0 46,0 kunec 1,0 1,5 3,0 31,0 kokoš – 4,0 8,0 45,0 človek – Ž – 3–12 12–25 – M – 2–10 10–20 – Proces sedimentacije poteka v treh fazah. V prvi sedimentirajo posamezni eritrociti, v drugi eritrociti, združeni v agregate, v tretji pa se seseda stebriček eritrocitov in pri tem iztiska med celicami zastalo plazmo. Faktorje, ki vplivajo na sedimentacijo krvi, lahko zbirno prikažemo s formulo: 2r2 (S 𝑉 1 − S2)g 𝑠 = 9n (Vs – hitrost sedimentacije krvi, r – premer eritrocita, S1 – gostota eritrocitov, S2 – gostota plazme, g – konstanta gravitacije, n – koeficient viskoznosti plazme) Pri zdravih osebkih je sedimentacija eritrocitov razmeroma počasna, povečano nastajanje fibrinogena in imunoglobulinov pa povzroči zlepljanje eritrocitov in oblikovanje stolpcev ( rouleaux), zato se eritrociti posedajo hitreje. Merjenje sedimentacije eritrocitov ni specifičen diagnostični postopek, temveč se uporablja le kot pomožni podatek pri ocenjevanju 20 01 FIZIOLOGIJA KRVI zdravstvenega stanja. Z njegovo pomočjo lahko spremljamo razvoj različnih bolezni, predvsem vnetij in nekaterih oblik raka (ob slabšanju stanja pacienta hitrost sedimentacije narašča, ob izboljšanju pa upada). Vpliv različnih fizioloških in patoloških stanj na hitrost sedimentacije lahko najbolje vidimo pri psih, mačkah in prašičih.  Pospešena sedimentacija nastopi, kadar v organizmu nastaja več fibrinogena, glikoproteidov, gamaglobulinov oziroma manj albuminov, kot je fiziološko zaradi povečanega razpadanja tkiv, vdora ali sproščanja tujih beljakovin v organizem, zmanjšanja števila eritrocitov ali količine hemoglobina v njih ali povečanja deleža vode v krvi. To se lahko zgodi pri številnih akutnih in kroničnih obolenjih ter malignih tumorjih, anemijah in hipotireoidizmu. Fiziološko je sedimentacija pospešena v gravidnosti.  Upočasnjena sedimentacija se pojavi ob policitemijah, hemokoncentraciji, hudi oslabelosti organizma in pri alergijskih boleznih. 1.6.1 Prikaz merjenja sedimentacije Merjenje sedimentacije eritrocitov lahko prikažemo z računalniško simulacijo PhysioEx. Poskus odpremo z ukazoma Poskus/Hitrost sedimentacije eritrocitov (Experiment/Erytrocyte Sedimentation Rate) v poglavju Krvne analize (Blood analyses). V virtualnem laboratoriju (slika 1.5) so na polički v zgornjem delu ekrana stekleničke z vzorci krvi. Desno od njih je steklenička z natrijevim citratom, ki ga pri tej metodi moramo dodati vzorcem krvi. Pod poličko sta stojalo za epruvete z mešalcem in omarica s cevkami za sedimentacijo. Pod omarico je ura, s katero merimo čas sedimentacije. Na desnem robu virtualnega laboratorija je omarica s povečevalnim steklom, ki pomaga pri odčitavanju rezultatov. Spodaj levo je posoda, v katero odlagamo ves material, ki je prišel v stik s krvjo. Slika 1.5: Virtualni laboratorij za prikaz hitrosti sedimentacije eritrocitov 21 01 FIZIOLOGIJA KRVI a) Postopek: 1. V stojalo postavimo 6 epruvet. 2. Iz stekleničke s 1. vzorcem prenesemo 1 ml krvi v 1. epruveto. Postopek ponovimo še z ostalimi 5 vzorci. 3. Iz stekleničke z natrijevim citratom prenesemo po 0,5 ml raztopine v vsako epruveto. 4. Izberemo ukaz Premešaj (Mix) na stojalu za epruvete. Vsebina epruvet se meša 5 sekund. Po končanem mešanju se odpre omarica z epruvetami za sedimentacijo. 5. Prvo epruveto z vzorcem premaknemo nad prvo sedimentacijsko epruveto in prelijemo vsebino. Izpraznjeno epruveto premaknemo v posodo za odpadke. Postopek ponovimo še z ostalimi vzorci. 6. Nastavimo čas na 60 min (s tipko (+)) in poženemo meritev (Start). Omarica se zapre. Po izteku časa sedimentacije (v virtualnem laboratoriju 60 sek) se vrata omarice ponovno odprejo. 7. Epruveto s prvim vzorcem premaknemo v omarico s povečevalnim steklom in odčitamo sedimentacijo. Rezultat zapišemo. Postopek ponovimo še z ostalimi vzorci. b) Naloge: 1. Rezultate meritev vnesite v tabelo! 2. Odgovorite na spodnja vprašanja:  Kako se razlikuje čas sedimentacije med posameznimi vzorci?  Pojasnite vzroke za nastale razlike! Številka Hitrost sedimentacije Razlaga vzorca (mm/h) 1 2 3 4 5 6 1.6.2 Metoda navpične sedimentacije (po Westergreenu) a) Material:  Stojalo za pipete, Westergreenove pipete (30 cm dolge steklene cevke z notranjim premerom 1–2 mm, graduirane od zgoraj navzdol v presledkih 1 mm v dolžini 200 mm), citratna kri različnih živalskih vrst. b) Postopek: 1. Kri vsesamo do oznake 0 in pipeto vstavimo v stojalo. 2. Zapišemo točen čas in odčitamo rezultate 10, 20, 30 in 60 min ter po 2, 3 in 24 urah po začetku merjenja. 22 01 FIZIOLOGIJA KRVI c) Naloge: 1. Narišite in opišite pipeto po Westergreenu! 2. Ugotovite vrednost sedimentacije v vašem vzorcu krvi v različnih časovnih obdobjih (10, 20, 30 in 60 min ter po 2, 3 in 24 urah) po začetku merjenja in grafično ponazorite rezultate! 3. Meritve izvedite s krvjo različnih živalskih vrst in primerjajte rezultate! Slika 1.6: Komplet za določanje sedimentacije po Westergreenu 1.6.3 Metoda poševne sedimentacije V poševno ležečih epruvetah kri hitreje sedimentira, ker se pri sesedanju eritrocitov vzpostavi kroženje: eritrociti hitreje dosežejo steno poševne cevke, po kateri naglo drsijo proti dnu, po nasprotni steni pa se dviga plazma. Najhitreje poteka sedimentacija pri nagibu 66°. Tedaj je v dvajsetih minutah tolikšna kot v navpični cevki v 24 urah. a) Material:  Aparat za sedimentacijo krvi (npr. po Taubnerju), citratna kri. b) Postopek: 1. Spodnjo posodico aparata po Taubnerju napolnimo do notranjega roba, jo pokrijemo z zamaškom, v katerega smo namestili stekleno cevko, in privijamo zamašek, dokler meniskus krvi ne doseže oznake 0. 2. Napolnjene cevke položimo v ležišče. 3. Po 20 minutah odčitamo rezultate. c) Naloge: 1. Shematično narišite sestavne dele aparata za poševno sedimentacijo! 2. Razložite (narišite) vzroke za hitrejši potek sedimentacije pri poševni metodi v primerjavi z navpično! 3. Ugotovite vrednosti sedimentacije v vzorcih krvi različnih vrst domačih živali in jih primerjajte z vrednostmi, ki ste jih dobili z metodo po Westergreenu! 23 01 FIZIOLOGIJA KRVI 4. Grafično prikažite rezultate! 1.7 HEMOLIZA IN OSMOTSKA REZISTENCA ERITROCITOV Če eritrocitna membrana poči, vsebina eritrocita preide v okolico in rdeče obarva serum ali plazmo. Delno razpadanje eritrocitov (hemoliza) je fiziološki pojav in je posledica staranja eritrocitov. V različnih patoloških stanjih pa eritrociti razpadajo v večjem obsegu (npr. ob nekaterih oblikah anemije). Zunaj organizma razpadanje eritrocitov povzročajo različne kemične snovi (npr. eter, kloroform, amonijeve in žolčne soli, lugi, kisline, saponini itd.), ki raztapljajo eritrocitno membrano, in fizikalni dejavniki, npr. previsoka ali prenizka temperatura okolja, grobo ravnanje s krvjo (stresanje) ali močan podtlak v brizgi ob jemanju krvi. 1.7.1 Prikaz hemolize a) Material:  Citratna kri, destilirana voda, fiziološka raztopina za toplokrvne živali, zamrzovalnik, hematološke epruvete v stojalu, pipete, mikropipete. b) Postopek: 1. Pripravimo in označimo tri hematološke epruvete. 2. V prvo in tretjo epruveto odpipetiramo 5 ml fiziološke raztopine, v drugo pa 5 ml destilirane vode. 3. V vsako epruveto z mikropipeto dodamo enako količino krvi in vsebino epruvet premešamo. 4. Tretjo epruveto damo za 2 uri v zamrzovalnik in nato vsebino počasi odtajamo. c) Naloge: 1. Shematično prikažite izvedbo vaje! 2. Opišite vsebino epruvet in razložite opazovane pojave! 1.7.2 Določanje osmotske rezistence eritrocitov V hipotonični raztopini voda iz okolja prehaja v eritrocit, dokler se osmotski tlak ne izenači. Če je razlika prevelika, pa pride do pokanja membrane eritrocitov in hemolize. V različnih koncentracijah hipotoničnih raztopin eritrociti hemolizirajo postopno glede na odpornost njihovih membran proti osmotskemu tlaku okolice, kar imenujemo osmotska rezistenca eritrocitov. V laboratoriju ugotavljamo odpornost eritrocitov v primerjavi s serijo hipotoničnih raztopin NaCl. Koncentracija, pri kateri opazimo začetno hemolizo eritrocitov, se imenuje minimalna osmotska rezistenca eritrocitov (pri tej koncentraciji propadejo najmanj odporni eritrociti). Vrednost koncentracije NaCl, pri kateri razpadejo vsi eritrociti, pa se imenuje maksimalna osmotska rezistenca eritrocitov (pri tej koncentraciji propadejo tudi najbolj odporni eritrociti). Osmotska rezistenca eritrocitov (tabela 1.6) je odvisna od velikosti in oblike eritrocitov (na splošno velja: čim manjša je celica, tem bolj je občutljiva na vdor vode in prej hemolizira). Zato se razlikuje glede na vrsto živali in fiziološko ali patološko stanje živali (zmanjšana je npr. ob hemolitični zlatenici, avtoimunskih hemolitičnih anemijah, zastrupitvah in obsežnih opeklinah, povečana pa ob hipokromnih anemijah in talasemiji). 24 01 FIZIOLOGIJA KRVI Za natančnejše določanje stopnje hemolize med minimalno in maksimalno osmotsko rezistenco eritrocitov uporabljamo kolorimetrično metodo, rezultate pa lahko ponazorimo grafično. Do uvedbe mednarodnega merskega sistema (SI) so osmotsko rezistenco eritrocitov izražali v g% (g/100 ml) NaCl, sedaj pa je uvedeno izražanje v mmol/L. Pretvorbe opravimo po formulah: mmol/L (NaCl) = mg/100 ml (NaCl) × 0,170 mg/100 ml (NaCl) = mmol/L (NaCl) × 5,8 Tabela 1.6: Minimalna in maksimalna osmotska rezistenca eritrocitov pri različnih vrstah domačih živali in pri človeku K o n c e n t r a c i j a N a C l Vrsta M i n i m a l n a M a k s i m a l n a živali g/100 ml mmol/L g/100 ml mmol/L konj 0,59 100,3 0,39 66,3 govedo 0,59 100,3 0,42 71,66 ovca 0,60 102,0 0,45 76,5 koza 0,62 105,40 0,48 81,6 prašič 0,74 125,8 0,45 76,5 pes 0,45 76,5 0,36 61,2 človek 0,44 74,8 0,32 54,4 a) Material:  Citratna kri, destilirana voda, osnovna raztopina NaCl snkc 170 mol/L (mkc 10 g/L), pipete (10 ml), kapalke, stojalo z 12 epruvetami, centrifuga in fotometer (z zelenim filtrom – 540 nm). b) Postopek: 1. Po navodilih (tabela 1.7) pripravimo serijo raztopin NaCl od izotonične v prvih do močno hipotonične v zadnjih epruvetah. Kot osnovno raztopino uporabimo raztopino NaCl s koncentracijo 10 g/L. 2. V vsako epruveto dodamo po 1 kapljico krvi in dobro premešamo vsebino. 3. Po približno 30 minutah centrifugiramo vzorce (5 min/1000 obratov v min). 4. Po končanem centrifugiranju si ogledamo vsebino epruvet – pozorni smo na barvo raztopine in na prisotnost oziroma velikost "gumbka" eritrocitov na dnu epruvet. 5. Vsebino posameznih epruvet fotometriramo – odčitamo ekstinkcije vzorcev. Kot slepi vzorec uporabimo destilirano vodo. Odstotek hemolize izračunamo po formuli: % hemolize = ( en ) × 100 % emax (en – ekstinkcija testnega vzorca, emax – maksimalna ekstinkcija) c) Naloge: 1. Na osnovi sprememb v vsebini posameznih epruvet in fotometriranja ugotovite minimalno in maksimalno osmotsko rezistenco vašega vzorca eritrocitov (krvi)! 2. Rezultate opazovanj in meritev vnesite v tabelo 1.7! 3. Na osnovi kolorimetrije narišite krivuljo osmotske rezistence eritrocitov! 25 01 FIZIOLOGIJA KRVI Tabela 1.7: Priprava hipotoničnih raztopin NaCl Št. Volumen Volumen Koncentracija Videz vsebine Ekstinkcija Delež epruvete osnovne H O raztopine epruvete [e] hemolize 2 raztopine [ml] [g/L] [% H ] NaCl [ml] 1 10,0 0 10 2 9,6 0,4 9,6 3 9,2 0,8 9,2 4 8,8 1,2 8,8 5 8,4 1,6 8,4 6 8,0 2,0 8,0 7 7,6 2,4 7,6 8 7,2 2,8 7,2 9 6,8 3,2 6,8 10 6,4 3,6 6,4 11 6,0 4,0 6,0 12 5,6 4,4 5,6 13 5,2 4,8 5,2 14 4,8 5,2 4,8 15 4,4 5,6 4,4 16 4,0 6,0 4,0 17 3,6 6,4 3,6 18 3,2 6,8 3,2 19 2,8 7,2 2,8 20 2,4 7,6 2,4 21 2,0 8,0 2,0 22 1,6 8,4 1,6 23 1,0 9,0 1,0 24 0 10,0 0,0 26 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.8 HEMOGLOBIN Hemoglobin (Hb) je najpomembnejša sestavina eritrocitov. Kemično je kromoproteid, sestavljen iz osrednjega beljakovinskega dela – globina, na katerega so vezani štirje hemi (pigmentni kompleksi železa s protoporfirinom). V celotnem Hb je približno 0,338 % železa. Funkcija Hb je prenos kisika in ogljikovega dioksida, ima pa tudi pufrsko vlogo. 1.8.1 Določanje koncentracije hemoglobina Določanje koncentracije Hb v krvi ima velik pomen, saj na osnovi sprememb v količini lahko sklepamo na nekatere motnje v zvezi z nastajanjem in dozorevanjem eritrocitov in na količino kisika, ki je navzoča v cirkulaciji. Kvantitativno določanje Hb se uporablja za diagnostiko anemij in drugih bolezni krvi in krvnega obtoka. Koncentracija Hb naraste pri policitemiji in nekaterih boleznih srca in ožilja. Povečana je tudi pri osebkih, ki živijo na večjih nadmorskih višinah. Zmanjša pa se pri anemijah, hipotireoidizmu, nekaterih boleznih jeter in ledvic ter po akutni krvavitvi. Koncentracijo Hb v krvi določamo z različnimi kvantitativnimi metodami. Te delimo na kolorimetrijske (na osnovi primerjav barve raztopin Hb ali njegovih derivatov s standardi), plinometrijske (na osnovi sposobnosti Hb, da veže kisik), kemijske (na osnovi določanja v Hb vezanega železa) in fizikalne (na osnovi določanja specifične teže krvi). V klinični hematologiji se uporabljajo številne metode določanja koncentracije Hb. Po mednarodnem merskem sistemu (SI) izražamo koncentracijo Hb v mol/L krvi (tabela 1.1). V praksi koncentracijo Hb še vedno izražajo v g/100 ml ali v g/L. Tabela 1.8: Koncentracija hemoglobina pri domačih živalih (po Jainu) Vrsta Hemoglobin živali [g/L] govedo 100 (80–150) ovca 115 (90–150) koza 100 (80–120) prašič 130 (100–160) konj 130 (80–190) pes 150 (120–180) mačka 120 (80–150) človek 140 (120–180) A) Prikaz kolorimetričnega določanja koncentracije hemoglobina Postopek lahko prikažemo z računalniško simulacijo (npr. PhysioEx). Pri tej metodi je treba vzorec krvi najprej premešati z leseno palčko, da hemolizira. Hemoglobinometer omogoča prenos zelene svetlobe skozi hemolizirani vzorec in primerjavo njegove barve z barvnimi standardi znanih koncentracij Hb. Intenzivnost obarvanja vzorca je odvisna od količine Hb v njem. Zelena barva se uporablja, ker je človeško oko sposobno zelo natančno razlikovati različne odtenke zelene barve. 27 01 FIZIOLOGIJA KRVI Iz menija poskusov v poglavju Krvne analize (Blood analyses) izberemo ukaz Poskus/Določanje hemoglobina (Experiment/Hemoglobin Determination). V virtualnem laboratoriju (slika 1.7) je zgoraj desno polička s 5 vzorci krvi, levo pa hemoglobinometer. Spodaj je na sredini enota za zapisovanje rezultatov. Nad njo je laboratorijska mizica, na kateri pripravljamo vzorce, ob njej pa posodica z lesenimi palčkami za mešanje vzorcev. Levo je posoda s komoricami za merjenje Hb, desno pa posoda za odlaganje s krvjo kontaminiranega materiala. Slika 1.7: Virtualni laboratorij za kolorimetrično določanje koncentracije hemoglobina a) Postopek: 1. Komorico za kri premaknemo na laboratorijsko mizico. 2. Iz prve stekleničke s pomočjo kapalke na zamašku prenesemo kapljico krvi v komorico in jo premešamo z leseno palčko (ob vzorcu se pojavi prikaz časa mešanja, ki traja 45 s). 3. Palčko premaknemo v posodo za odpadke, komorico s hemolizirano krvjo pa v hemoglobinometer. Takoj nato se prikaže barvna skala, katere levi del kaže barvo testnega vzorca, desni del pa barve standardnih vzorcev. 4. Ročico na desni strani prikaza počasi dvigamo in spuščamo, dokler barva testnega vzorca na desni ne ustreza barvi enega od standardov na levi strani. Tedaj odčitamo koncentracijo Hb na prikazu (v g/100 ml) in jo zapišemo. 5. Postopek, opisan v točkah 1 do 4, ponovimo še z ostalimi vzorci! b) Naloge: 1. Rezultate meritev vnesite v tabelo! 2. Odgovorite na spodnja vprašanja:  Kakšne so fiziološke vrednosti koncentracij Hb pri domačih živalih?  Ali obstaja razlika med samci in samicami? 28 01 FIZIOLOGIJA KRVI Številka Koncentracija Hb Razlaga vzorca g/100 mL g/L 1 2 3 4 5 B) Določanje koncentracije hemoglobina po Sahliju Po tej metodi hemoliziramo eritrocite s solno kislino, sproščeni Hb pa preide v kisli hematin (klorhemin), ki je rjave barve. Raztopino kislega hematina redčimo z destilirano vodo, dokler se barva raztopine ne ujema z barvo standarda. a) Material:  Hemoglobinometer po Sahliju, mikropipete, steklena palčka, raztopina HCl snkc 0,1 mol/L (mkc 3,6 g/L), destilirana voda. b) Postopek: 1. V epruveto hemoglobinometra odpipetiramo do oznake 10 raztopino HCl. 2. Z mikropipeto dodamo 0,02 ml krvi in jo splaknemo z vsrkavanjem in izpihavanjem tekočine. 3. Epruveto potresemo, da se kri dobro premeša s solno kislino. 4. Po enominutnem premoru pričnemo v epruveto po kapljicah dodajati destilirano vodo (raztopino večkrat premešamo s stekleno palčko), dokler barva raztopine v epruveti ni enaka barvi standarda. 5. Na graduaciji epruvete odčitamo višino stolpca raztopine, to je količino Hb v gramih. Ta postopek je razmeroma hiter, vendar ne dovolj natančen, zato se uporabljajo druge, sodobnejše in bolj natančne laboratorijske metode. C) Določanje koncentracije hemoglobina po Drabkinu Hb pretvorimo z Drabkinovim reagentom v cianmethemoglobin. Reakcija poteka po enačbi: Hb + K-fericianid  met-Hb + KCN  cianmet-Hb a) Material:  Drabkinov reagent (natrijev bikarbonat 1 g, kalijev karbonat 0,1 g, kalijev cianid 0,05 g, kalijev fericianid 0,2 g, destilirana voda do 1 L), mikropipete, avtomatska brizga, kiveta, fotometer. b) Postopek: 1. V epruveto s 5 ml Drabkinovega reagenta dodamo 0,02 ml krvi in dobro premešamo. 2. Po 5 minutah fotometriramo pri 540–546 nm. Ničlišče naravnamo z reagentom. 3. Koncentracijo Hb izračunamo po formuli: Hb (g/L) = e × 368 (Hb (g/L) – koncentracija Hb v g/L krvi, e – izmerjena ekstinkcija vzorca) 29 01 FIZIOLOGIJA KRVI Č) Določanje koncentracije oksihemoglobina Pri tej metodi preide Hb iz predhodno hemolizirane krvi ob stiku z zrakom v oksiHb, ki ga določamo fotometrično. a) Material:  Raztopina amonijaka (4 ml koncentrirane raztopine amonijaka z gostoto 0,88 g/cm3, razredčene z destilirano vodo do 1 L), mikropipeta, fotometer. b) Postopek: 1. V epruveto s 5 ml raztopine amonijaka dodamo 0,02 ml krvi, ki hemolizira. Hb pri tem preide v oksiHb. 2. Raztopino fotometriramo pri 578 nm (ničlišče nastavimo z raztopino amonijaka). D) Ostale metode določanja koncentracije hemoglobina  Določanje koncentracije hemoglobina po Tallquistu služi le za grobo oceno vrednosti koncentracije Hb. Kapljico krvi kanemo na filtrirni papir, kjer nastane madež. Barvno nianso madeža primerjamo s standardno barvno skalo.  Določanje koncentracije hemoglobina po količini železa v krvi temelji na določanju količine železa v Hb na osnovi dejstva, da 1 g Hb vsebuje 3,35 mg železa.  Določanje koncentracije hemoglobina na osnovi plinometrije: Metoda temelji na določanju količine na Hb vezanega kisika po principu, da 1 g Hb veže nase 1,34 ml kisika. 1.8.2 Določanje hemoglobinskega tipa pri ovcah Molekula Hb je sestavljena iz nebeljakovinskega dela hema, ki je enak pri vseh vretenčarjih, in beljakovinskega globina, ki se razlikuje glede na zaporedje in vrsto aminokislin. Zaradi razlike v aminokislinski sestavi imajo hemoglobini različen naboj, zato se v električnem polju pri elektroforezi obnašajo različno. Zato obstajajo razlike med živalskimi vrstami, pasmami in tudi med živalmi iste vrste in pasme. Kadar pri Hb določene živalske vrste ali pasme opazimo razlike pri elektroforetski gibljivosti, govorimo o različnih tipih Hb. Pri ovcah so ugotovili tipe Hb A, B, C, D in F. Najpogostejša sta tipa A in B, tipa C in D sta zelo redka. Tip F (fetalni tip) pa je ugotovljen samo pri fetusih in ga po rojstvu zamenja adultni Hb. Homozigotne živali imajo tip Hb A ali B, heterozigotne pa AB. Pri slovenskih avtohtonih pasmah ovc (jezersko-solčavski in bovški) je najpogostejši tip Hb A. Tipe Hb najenostavneje določamo z elektroforezo na škrobnem gelu (slika 1.8). a) Material:  Hidrolizirani škrob, EDTA, H3BO3, TRIS, steklena plošča velikosti 24 × 14 cm, steklene ali plastične letvice (široke 2 in debele 0,3 cm), vakuumska steklenica, vakuumska črpalka, vodna kopel, pribor za elektroforezo (slika 1.8) z usmernikom, hemolizirana kri, koščki filtrirnega papirja (0,7 × 0,5 cm), penasta krpa. 30 01 FIZIOLOGIJA KRVI Kp – kadička s pufrom E – elektroda iz platinske žice M – most med pufrom in škrobnim gelom F – koščki filtrirnega papirja, namočeni v raztopino hemoglobina Š – škrobni gel P – steklena plošča T – smer potovanja električnega toka U – električni usmernik V – električni vodnik Slika 1.8: Shematični prikaz elektroforetskega določanja tipov hemoglobina b) Postopek: 1. Priprava pufrov:  Pufer za kadičke: 40,4 g TRIS pufra, 4,0 g EDTA in 3,0 g H3BO3 raztopimo v 2000 ml destilirane vode; z 0,1 mol NaOH ali 0,1 mol HCl popravimo pH na 8,9.  Pufer za pripravo gela: 150 ml pufra za kadičke dodamo v 350 ml destilirane vode. 2. Priprava gel plošče: V 150 ml pufra za pripravo gela dodamo 50 g hidroliziranega škroba, suspenzijo vlijemo v vakuumsko steklenico, nato dodamo še 350 ml pufra, ki smo ga nekaj minut segrevali v vreli vodni kopeli. Suspenzijo škroba segrevamo v vreli vodni kopeli 10 do 15 minut, do pojava mehurčkov, ki jih odstranimo z vakuumsko črpalko. Tako pripravljeni gel enakomerno razlijemo po stekleni plošči. Ko se gel nekoliko strdi in postane opalescenten, ga pokrijemo s plastično folijo in obtežimo za 24 ur, da se dokončno strdi. Pred uporabo gel ploščo prečno razrežemo; prvi rez naredimo 5 cm od roba plošče, druge v razmaku 3 cm. 3. Izvedba postopka elektroforeze: Koščke filtrirnega papirja pomočimo v vzorce krvi, jih osušimo na staničevini in vstavimo v zareze gel plošče. V eno vrsto postavimo 10 do 12 papirčkov. Kadički napolnimo s pufrom za kadičke in vzpostavimo mostove med gelom in 31 01 FIZIOLOGIJA KRVI pufrsko tekočino. Usmernik nastavimo na 200 V, ga vključimo in pustimo, da električni tok teče skozi sistem kakih 10 minut. V tem času Hb preide iz papirčkov na gel. Nato izključimo tok, odstranimo papirčke, pokrijemo gel s tanko plastično folijo in nadaljujemo z elektroforezo pri napetosti 200 V 2 uri. 4. Branje rezultatov: Rezultati so kvalitativni in so shematsko prikazani na sliki 1.9. Madež, ki zaostaja, je hemoglobin tipa Hb B, madež, ki potuje naprej, je tipa Hb A, če pa sta nastala dva madeža na mestu med pozicijo A in B, je to tip Hb AB. Slika 1.9: Tipi hemoglobina A, B in AB 1.8.3 Nastanek kristalov klorhemina (Teichmanovi kristali) Hemini so spojine porfirina z železom, v katerih je železo trovalentno, ker je tretja valenca vezana s katerimkoli negativnim ionom. Med heminskimi spojinami je najbolj poznan klorhemin, katerega kristalčke imenujemo Teichmanovi kristalčki. Opisani postopek je bil eden prvih, s katerim so v sodni medicini dokazovali prisotnost krvi v vzorcih materiala. a) Material:  Kapljica (osušene) krvi, NaCl v kristalčkih, ocetna kislina, predmetno in pokrovno stekelce, skalpel, plinski gorilnik in kapalka. b) Postopek: S skalpelom ostrgamo osušeno kri in damo ostružke na predmetno steklo. Dodamo nekaj kristalčkov NaCl, vse dobro premešamo in pokrijemo s pokrovnim stekelcem. Od strani s kapalko dodamo ocetno kislino, ki zaradi kapilarnosti vstopi pod krovno stekelce in prepoji vsebino. Nato preparat 30 do 60 sekund previdno segrevamo nad plamenom, pri čemer pazimo, da vsebina ne zavre. Če je ocetna kislina izhlapela, jo ponovno dodamo, ker tako lažje nastopi kristalizacija. V ohlajenem preparatu pod mikroskopom opazujemo drobne rjavorumene kristalčke klorhemina. Pri tem postopku najprej nastane hemoliza zaradi dodatka ocetne kisline, pri segrevanju ocetne kisline ob prisotnosti NaCl nastane HCl, ki hidrolizira hemoglobin in s tako nastalim heminom tvori klorhemin. 32 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.9 ŠTETJE KRVNIH CELIC Krvne celice lahko štejemo z mikroskopom, z elektronskimi števci, eritrocite pa tudi fotometrično. Pred začetkom štetja mešamo kri s posebnimi raztopinami, s katerimi fiksiramo le tisto vrsto celic, ki jo želimo šteti, druge vrste celic pa razkrojimo. 1.9.1 Štetje krvnih celic z mikroskopom A) Splošni principi štetja krvnih celic Nekateri pripomočki in splošni principi štetja so identični pri vseh metodah štetja krvnih in drugih celic. Komora (hemocitometer, slika 1.10) je debelejša steklena ploščica, prečno razdeljena s štirimi kanalčki. Na sredini se nahaja poglobljen del (s podolžnim kanalčkom je razdeljen na dva dela), na vsaki polovici je vgravirana mrežica za štetje krvnih celic. Na hemocitometru so oznake za vrsto mrežice, globino in velikost največjih in najmanjših kvadratkov. Slika 1.10: Komora za štetje krvnih celic Mrežice se med seboj razlikujejo po številu in velikosti vrisanih likov. Imenujemo jih po avtorjih, npr. Bürkerjeva, Bürker-Türckova, Thomova, Neubauerjeva, Spencerjeva. Slika 1.11: Razporeditev kvadratkov v Bürker-Türckovi mrežici 33 01 FIZIOLOGIJA KRVI  Mrežica po Bürker-Türcku (slika 1.11) je kvadrat s stranico 3 mm, razdeljen na 9 kvadratov s površinami 1 mm2. Vsak kvadrat s površino 1 mm2 je razdeljen na 16 srednjih kvadratkov, ki jih omejujejo dvojne črte. Površina takega kvadratka znaša 1/25 mm2, površina pravokotnika med dvojnima črtama pa 1/100 mm2. Srednji kvadratki v osrednjem, večjem (1 mm2) kvadratu so s podolžnimi in navpičnimi črtami razdeljeni na najmanjše kvadratke v mrežici, katerih površina znaša 1/400 mm2. Melanžer je posebna mikropipeta z graduirano kapilarno cevčico, ki je v zgornjem delu trebušasto razširjena. Nad brušeno konusno konico je kapilarni del razdeljen na 10 enot. Označeni sta enoti 0,5 in 1. V trebušasti razširitvi se nahaja steklena kroglica, ki označuje, za katero vrsto melanžerja gre, omogoča mešanje vzorca v trebušasti razširitvi in se v suhem melanžerju ne lepi na steno. Melanžerje polnimo z gumijasto cevčico s plastičnim ustnikom, ki jo nataknemo na zgornji del melanžerja.  Melanžer za štetje eritrocitov (slika 1.12 (a)) ima v razširjenem delu, ki je 100-krat večji kot volumen kapilare, rdečo kroglico. a b Če kri potegnemo do oznake 1, z dodajanjem raztopine za štetje dosežemo razredčitev 1 : 100, če potegnemo kri do oznake 0,5, pa razredčitev 1 : 200.  Melanžer za štetje levkocitov (slika 1.12 (b)) ima v razširjenem delu, ki je 10-krat večji od volumna kapilarne cevke, belo kroglico. Če kri potegnemo do oznake 1, dosežemo razredčitev 1 : 10, če jo potegnemo do oznake 0,5, pa razredčitev 1 : 20. Slika 1.12: Melanžer za štetje eritrocitov (a) in levkocitov (b) Princip štetja: Ob štetju krvnih celic moramo paziti na vrstni red štetja posameznih kvadratkov, prav tako pa je pomemben sistem štetja celic v posameznem kvadratku, da ne prihaja do napak pri štetju. Načine štetja prikazuje slika 1.13. Slika 1.13: Način štetja krvnih celic ( A – smer štetja celic, B – uvrščanje celic v kvadrat) 34 01 FIZIOLOGIJA KRVI B) Štetje eritrocitov z mikroskopom Za štetje eritrocitov potrebujemo Haymovo raztopino, ki razkroji levkocite in trombocite ter fiksira eritrocite. Sestavljena je iz kristaliničnega natrijevega sulfata (2,5 g), NaCl (0,5 g), HgCl2 (0,25 g), želatine (0,21 g) in destilirane vode (do 100 ml). a) Priprava vzorca: 1. Kri vsesamo v melanžer do oznake 1 ali 0,5 (kri človeka) oziroma 0,3 (kri živali). Kri najprej vsesamo do izbrane oznake, nato konusni del obrišemo s staničevino, melanžer držimo vodoravno in se s staničevino narahlo dotikamo njegove konice, tako da se stebriček krvi spusti do zaželene oznake. 2. Previdno in hitro vsesamo Haymovo raztopino do oznake 101. Pri tem pazimo, da v cevčico ne pride zrak ali da kri ne izteče. Z dodajanjem Haymove raztopine dosežemo razredčitev krvi 1 : 100, 1 : 200 oziroma pri živalih 1 : 333,3. 3. Stresanje vsebine v melanžerju traja 3 minute. Stresamo lahko ročno, tako da melanžer držimo med palcem in kazalcem, ali pa s posebnim mešalcem. 4. Priprava komorice za štetje celic: Komorico pokrijemo s pokrovnico, ki jo čvrsto pritrdimo s prijemalkami (peresi), tako da se na obeh straneh pokažejo mavrične barve (Newtonovi pasovi). 5. Polnjenje komorice: Iz melanžerja najprej spustimo nekaj kapljic vsebine, nato se z njegovim konusom dotaknemo reže ob robu krovnega stekelca komore in ta se zaradi kapilarnega vleka napolni. Če smo v komoro spustili preveč raztopine oziroma so se napolnili prečni žlebovi, jo obrišemo s staničevino. Pri polnjenju komore moramo paziti, da nam pod pokrovnico ne zaidejo mehurčki zraka. Če se to zgodi, jo moramo očistiti in ponovno napolniti. Ko smo komoro napolnili, jo pustimo nekaj časa, da se celice umirijo. b) Štetje celic: 1. Ploščico namestimo pod mikroskop, pod majhno povečavo poiščemo mrežico in preverimo, če so celice enakomerno razporejene. 2. Pod večjo povečavo poiščemo osrednji kvadratek z najmanjšimi vrisanimi kvadratki. Preštejemo eritrocite v 80 najmanjših kvadratkih (1/400 mm2). Pri tem pazimo, da eritrocitov na črtah med kvadratki ne štejemo dvakrat. c) Izračun: Število eritrocitov v litru krvi izračunamo po formuli: Er = (n/80) × 400 × 100 (200; 333,3) × 10 × 106 (Er – število eritrocitov v vzorcu; n – število eritrocitov, preštetih v 80 kvadratkih; 400 – ker je površina kvadratka 1/400 mm2, po množenju dobimo število v 1 mm2; 100 (200, 333,3) – razredčitev krvi v melanžerju; 10 – ker je globina komorice 0,1 mm, pri množenju s tem številom dobimo število eritrocitov v 1 mm3; 10 6 – ker se po SI število eritrocitov izraža v litru krvi) č) Primer: Kri smo redčili s Haymovo raztopino v razmerju 1 : 200, pri štetju v mrežici po Bürker-Türcku smo v 80 kvadratkih našteli 500 eritrocitov. Er = (500/80) × 400 × 200 × 10 = 5 × 106/mm3 = 5 × 1012/L 35 01 FIZIOLOGIJA KRVI C) Štetje levkocitov z mikroskopom Za štetje levkocitov potrebujemo Türckovo raztopino, ki preparira in obarva jedra levkocitov ter razgradi eritrocite, trombocite in citoplazmo levkocitov. Sestavljena je iz ledocetne kisline (3 ml), raztopine gentiana violet (1 ml) in destilirane vode (do 100 ml). a) Priprava vzorca: 1. Kri vsesamo v melanžer do oznake 1 ali 0,5 po enakem postopku kot za štetje eritrocitov. 2. Vsesamo Türckovo raztopino do oznake 11 in s tem dosežemo razredčitev krvi 1 : 10 ali 1 : 20. 3. Stresanje vsebine melanžerja: ker se levkociti lepijo na stene melanžerja, mora biti stresanje intenzivnejše kot pri eritrocitih. 4. Priprava komore za štetje: postopek je enak kot za štetje eritrocitov. 5. Polnjenje komore: postopek je enak kot za štetje eritrocitov. b) Štetje celic: Levkocite štejemo v kvadratkih s površino 1/16 mm2 (Neubauerjeva komora) ali 1/25 mm2 (Bürcker-Türckova komora). Preštejemo vse celice v 16 ali 25 kvadratkih srednje velikosti. c) Izračun: Število levkocitov v litru krvi izračunamo po formuli: L = n × 10 (20) × 10 × 106 (L – število levkocitov; n – število celic, preštetih v 16 (1 mm2); 10 (20) – razredčitev krvi v melanžerju; 10 – globina komorice je 0,1 mm, pri množenju s tem številom dobimo število levkocitov v 1 mm3; 10 6 – ker se po SI število eritrocitov izraža v litru krvi) č) Primer: V 25 kvadratkih srednje velikosti Bürker-Türckove mrežice smo prešteli 98 celic. V melanžerju je bila kri razredčena v razmerju 1 : 10. L = 98 × 10 × 10 = 9800/mm3 krvi = 9,8 × 109/L krvi. Č) Štetje trombocitov Za štetje trombocitov uporabljamo direktni ali indirektni postopek.  Direktni postopek: Reagent za štetje trombocitov je sestavljen iz kokainovega hidroklorida (13 g), NaCl (0,2 g) in destilirane vode do 100 ml. Kri redčimo v silikoniziranem melanžerju za eritrocite ali silikonizirani epruveti z mikropipeto. Stabilizirane trombocite v suspenziji, s katero napolnimo komoro, opazujemo s faznim mikroskopom. Vidimo jih kot modre točke. Štejemo jih v velikih kvadratih (1 mm2) v mrežici.  Indirektni postopek (po Foniu): Pripravimo razmaz krvi, ki ga obarvamo po May-Grünwald- Giemsi. Hkrati preštejemo eritrocite v komorici. V obarvanem razmazu preštejemo število trombocitov na 1000 eritrocitov. Iz promilnih vrednosti trombocitov in s pomočjo števila eritrocitov izračunamo število trombocitov v 1 mm3 krvi po formuli: t T = Er × 1000 (T – število trombocitov v 1 mm3, Er – število eritrocitov v 1 mm3 (prešteto v komorici), t – število trombocitov v razmazu) 36 01 FIZIOLOGIJA KRVI Primer:  V komorici smo prešteli 4 × 106 Er/mm3 krvi, v krvnem razmazu pa smo prešteli 50 trombocitov. T = 4 × 106 × (50/1000) = 200 × 103/mm3 = 200 × 109/L krvi D) Štetje krvnih celic pri perutnini V krvi ptic imajo jedra razen levkocitov in trombocitov tudi eritrociti, zato metode, ki jih uporabljamo za štetje krvnih celic pri sesalcih, za ptice niso uporabne. Za štetje krvnih celic pri perutnini se uporabljata direktna ali indirektna metoda. Indirektna metoda: Preiskovano kri perutnine mešamo v melanžerju za eritrocite s Haymovo raztopino v razmerju 1 : 200. Celice preštejemo v komorici in ugotovimo njihovo skupno število. Pripravimo tudi krvni razmaz, obarvan po Pappenheimu, v katerem štejemo krvne celice. Preštejemo skupaj 3000 krvnih celic tako, da si ločeno zapisujemo število posameznih vrst. Število posameznih vrst krvnih celic izračunamo po formulah: Er = S × nEr ; L = S × nL oziroma Tr = S × nTr 3000 3000 3000 (S – število vseh celic, preštetih v komori v 1 mm3, Er – število eritrocitov v mm3, nEr – število eritrocitov v razmazu, L – število levkocitov v mm3, nL – število levkocitov v razmazu, Tr – število trombocitov v mm3, nTr – število trombocitov v razmazu) Direktna metoda temelji na principu, da se posamezne vrste krvnih celic v razmazu ptičje krvi različno obarvajo z reagentom po Nattu in Herricku. Po redčenju krvi z reagentom v eritrocitnem melanžerju v razmerju 1 : 100 in 5-minutnem mešanju štejemo krvne celice v komorici. Število celic v mm3 izračunamo po formulah: Er = (Z/80) × 400 × 100 × 10 × 106 L = (N/9) × 10 × 100 × 106 Tr = (N/9) × 10 × 100 × 106 (Z – število eritrocitov, preštetih v 80 kvadratkih v mrežici, N – število celic (levkocitov ali trombocitov), preštetih v kvadratkih s površino 1 mm2, 10 6 – ker se po SI število krvnih celic izraža v litru krvi) 37 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.9.2 Štetje krvnih celic s hematološkimi analizatorji Hematološki analizatorji omogočajo hitro in natančno štetje in oceno lastnosti krvnih celic na principih električnih, optičnih ali kombiniranih načinov detekcije. Ne glede na način detekcije aparature delujejo tako, da vsesajo določen volumen nativne ali razredčene krvi v sistem tankih cevk, ki vzorec usmeri skozi senzor. Električne meritve temeljijo na merjenju električnega upora pri prehodu celic skozi električno polje. Ker krvne celice slabo prevajajo električni tok, pretok suspenzije celic v elektrolitski raztopini poveča električni upor. Število sprememb upora v časovni enoti je sorazmerno s številom celic, velikost spremembe upora pa je sorazmerna z njihovo velikostjo. Pri optičnih meritvah pa vzorec krvi potuje v enakomernem toku skozi področje detekcije z žarkom vidne svetlobe ali laserskim žarkom. Sipano svetlobo, ki nastane, če žarek zadene celico, registrirajo posebni detektorji in jo spremenijo v električni impulz. S hematološkimi analizatorji je mogoče z visoko natančnostjo prešteti število eritrocitov, trombocitov in levkocitov, pri katerih je mogoče določiti tudi subpopulacije na osnovi njihovih fizikalnih in kemičnih lastnosti. Hematološki analizatorji omogočajo tudi merjenje vrednosti hematokrita in koncentracije hemoglobina in izračunajo oziroma izmerijo eritrocitne konstante. Tabela 1.9: Število krvnih celic (povprečje in razpon normalnih vrednosti) pri domačih živalih in človeku Vrsta Eritrociti Levkociti Trombociti živali [× 1012/L] [× 109/L] [× 109/L] govedo 7,0 (5,0–9,8) 8 (4–12) 400 (100–600) ovca 11,5 (9,0–15,0) 8 (4–10) 400 (250–750) prašič 6,8 (5,5–8,5) 16 (11–22) 505 (252–650) konj 8,6 (6,5–12,5) 9 (5–13) 240 (110–360) pes 6,6 (5,0–8,5) 12 (8–18) 200–600 mačka 7,2 (5,0–9,5) 12 (5–19) 450 (300–750) kunec 5,2 (4,0–6,5) 8 (5–12) kokoš 2,4 (1,9–3,2) 26 (10–35) 35,8 (19–41) raca 2,1 (1,8–2,3) 23 (9–28) človek 5,0 (4,2–6,3) 7 (4–10) 200–500 38 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.10 ERITROCITNI INDEKSI Z eritrocitnimi indeksi (citarnostnimi konstantami, konstantami eritrocitov) ugotavljamo povprečni volumen, velikost, debelino eritrocitov in njihovo napolnjenost s hemoglobinom. V veterinarski praksi se uporabljajo za diagnostiko anemij, saj nam omogočajo presojanje velikosti eritrocitov in njihove napolnjenosti s hemoglobinom. Za izračun eritrocitnih indeksov moramo poznati število eritrocitov, vrednost hematokrita in koncentracijo hemoglobina v preiskovanem vzorcu krvi. Eritrocitni indeksi so: povprečni volumen eritrocitov, povprečna absolutna količina hemoglobina, povprečna relativna količina hemoglobina, povprečni premer eritrocitov in povprečna debelina eritrocitov.  Povprečni volumen eritrocitov – MCV (Mean Corpuscular Volume) pokaže povprečno prostornino enega eritrocita. Da nam podatke o vrsti anemije glede na velikost celice (npr. makrocitna, mikrocitna, normocitna). Izračunamo ga po formuli: MCV = Ht × 1000 [fL] Er (Ht – vrednost hematokrita (1/1), Er – število eritrocitov (1012/L), fL – femtolitri (1 fL = 10–15 L)) Primer: Ht = 0,35 Er = 7 × 1012 /L 0,35 × 1000 MCV = = 50 𝑓𝐿 7  Povprečna absolutna količina hemoglobina – MCH (Mean Corpuscular Haemoglobin) pokaže povprečno količino hemoglobina v posameznem eritrocitu. Na osnovi MCH lahko ugotovimo, ali je anemija normo-, hipo- ali hiperhromna. Izračunamo jo po formuli: MCH = Hb [pg] Er (Hb – koncentracija hemoglobina (g/L), Er – število eritrocitov (1012/L), pg – pikogrami (1 pg = 10–12 g) Primer: Hb = 140 g/L Er = 7 × 1012/L 140 MCH = = 20 𝑝𝑔 7  Povprečna relativna količina hemoglobina – MCHC (Mean Corpuscular Haemoglobin Concentration) izraža količino hemoglobina v določenem volumnu eritrocitov. Je boljši indikator vsebnosti hemoglobina v eritrocitih kot MCH, ker ta ne upošteva velikosti celice. Izračunamo jo po formuli: MCHC = Hb [g/L] Ht (Hb – koncentracija hemoglobina (g/L), Ht – vrednost hematokrita (1/1)) Primer: Hb = 140 g/L Ht = 0,35 140 MCHC = = 400 𝑔⁄ 𝐸𝑟 0,35 𝐿 39 01 FIZIOLOGIJA KRVI  Povprečni premer eritrocitov – MCD (Mean Corpuscular Diameter) se meri mikroskopsko – z mikrometrsko skalo, ki se vstavi v okular mikroskopa (50 µm v okularju se mora ujemati s stranico malega kvadratka v komori za štetje eritrocitov). Rezultat izrazimo v µm, izmeriti pa moramo večje število eritrocitov in izračunati srednjo vrednost. Krvni razmaz, v katerem merimo MCD, obarvamo po May-Grünwald-Giemsi. Tabela 1.10: Povprečne vrednosti eritrocitnih indeksov pri domačih živalih Vrsta MCV MCH MCHC MCD živali [fL] [pg] [g/L] [μm] konj 45,5 15,9 352 5,5 govedo 52,0 14,0 315 5,8 ovca 34,0 10,0 325 3,2–6,0 koza 19,5 6,5 330 2,5–3,9 prašič 60,0 19,0 320 6,0 pes 70,0 22,8 340 7,0  Povprečna debelina eritrocitov – MCT (Mean Corpuscular Thickness) se izračuna po formuli: MCD MCT = 2  MCD  π    2   PCV (Packed Cell Volume) je izraz za hematokrit in ga predvsem ameriški avtorji prištevajo med eritrocitne indekse. 40 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.11 KRVNE SKUPINE Eritrociti domačih živali in človeka imajo na svoji površini številne specifične antigene, ki pripadajo različnim sistemom krvnih skupin. Krvne skupine se med seboj razlikujejo po lastnostih, ki jih pogojujejo na eritrocite vezani antigeni (aglutinogeni) in protitelesa v plazmi (aglutinini). Aglutinogeni so vezani tudi na nekatere druge celice organizma, npr. na levkocite, trombocite in epitelijske celice. So genetsko pogojeni in se dedujejo po Mendlovih pravilih. V organizmu živali in človeka obstaja večje število sistemov krvnih skupin. Krvne skupine moramo upoštevati pri dajanju transfuzij. Če prejemnik transfuzije prejme inkompatibilno kri, v kateri so protitelesa (aglutinini) proti aglutinogenom na njegovih eritrocitih, lahko v nekaj minutah pride do t. i. transfuzijske reakcije. Ta je posledica hemolize in aglutinacije eritrocitov, ki povzročijo cirkulacijski šok in koagulopatije, ki so lahko za prejemnika take krvi usodni. Čeprav se na celični membrani eritrocitov nahajajo številni aglutinogeni, najmočnejšo transfuzijsko reakcijo povzročajo tisti iz sistemov ABO in Rh. Določanje krvnih skupin se uporablja tudi v genetiki, ker so genetsko pogojene in se dedujejo po Mendlovih pravilih, v kriminalistiki za identifikacijo oseb na osnovi krvi, sline, sperme in v sodni medicini in veterini za ugotavljanje očetovstva. Pri ljudeh je znanih 14 sistemov krvnih skupin, med katerimi so najpomembnejši ABO, Rh in MNS.  Znotraj sistema ABO so štiri krvne skupine – A, B, AB in O s podskupinami. Protitelesa za ta sistem krvnih skupin v krvi ljudi pričnejo nastajati prve mesece po rojstvu brez predhodne senzibilizacije. V serumu ima človek protitelesa proti tistim antigenom sistema ABO, ki jih nima na lastnih eritrocitih. V Evropi ima približno 40 % populacije krvno skupino A, 15 % krvno skupino B, 7 % krvno skupino AB in 38 % krvno skupino O . Tabela 1.11: Sistem krvnih skupin ABO pri človeku Krvna skupina Aglutinogeni Aglutinini (na eritrocitih) (v serumu) A (A1–A5) A anti B (ß) B B anti A () AB (A1B–A5B) A in B – O – anti A in anti B  Sistem Rh: Znotraj tega sistema sta krvni skupini Rh+ (Rh pozitivna) in Rh– (Rh negativna). Eritrociti Rh+ ljudi vsebujejo določene antigene ("D"). Če Rh– oseba (teh je v Evropi približno 15 %) pride v stik z Rh+ krvjo, npr. s transfuzijo ali v nosečnosti, pride v njeni krvi do tvorbe protiteles proti Rh+, kar ob ponovnem stiku z Rh+ krvjo povzroči hemolizo te krvi. Če je npr. mati Rh–, otrok pa Rh+, predhodno nastala protitelesa v krvi matere lahko povzročijo hemolizo pri otroku, kar vodi do težkih obolenj ali smrti novorojencev.  Sistem MNS je manj pomemben, upošteva se ga ob natančnem določanju krvnih skupin. Krvne skupine pri živalih se ne pojavljajo na osnovi predhodno formiranih protiteles (kot je to sistem ABO pri človeku), pač pa so vezane na aglutinogene, ki se nahajajo na eritrocitih (so podobne sistemu Rh pri človeku). Pri domačih živalih se krvne skupine označujejo z velikimi tiskanimi črkami, začenši z A. Med enako poimenovanimi krvnimi skupinami različnih vrst živali ni 41 01 FIZIOLOGIJA KRVI nobene povezave. V literaturi obstajajo različni podatki o številu sistemov krvnih skupin pri posameznih vrstah domačih živali. Po Jainu je to število pri konju 8 (po podatkih drugih avtorjev 25), pri govedu 12 (z več kot 80 krvnimi skupinami), pri ovci 8, pri prašiču 15 in pri psu 8. V veterinarski medicini velja, da prvo transfuzijo krvi lahko damo živalim brez nevarnosti ne glede na krvni tip, če pa transfuzijo želimo ponavljati, obstaja nevarnost transfuzijske reakcije, ker žival s prvo transfuzijo senzibiliziramo (povzročimo tvorbo protiteles). 1.11.1 Prikaz določanja krvnih skupin sistemov ABO in Rh Krvne skupine sistemov ABO in Rh določamo z antiserumi, ki vsebujejo protitelesa proti antigenom A, B oziroma Rh (D). Reakcija aglutinacije dokazuje prisotnost določenega tipa antigenov. Slika 1.14: Virtualni laboratorij za ugotavljanje krvnih skupin Določanje krvnih skupin pri človeku lahko prikažemo z računalniško simulacijo PhysioEx. Poskus odpremo z ukazom Poskus/Določanje krvnih skupin (Experiment/Blood Typing) v poglavju Krvne analize (Blood Analyses). V virtualnem laboratoriju (slika 1.14) je zgoraj desno 6 vzorcev krvi, levo pa so stekleničke z antiserumi anti-A, -B in -Rh). Spodaj levo je enota za zapisovanje rezultatov, nad njo pa laboratorijska mizica, na kateri pripravljamo vzorce. Levo od mizice je posoda s predmetnimi stekli za določanje krvnih skupin, nad njo pa palčke za mešanje vzorcev. Modro palčko uporabljamo za mešanje vzorca s serumom anti-A, rumeno za mešanje vzorca s serumom anti-B, belo pa za mešanje vzorca s serumom anti-Rh. Desno od mizice je osvetljena plošča za opazovanje vzorcev. Ob odčitavanju rezultatov se pod poličko s krvnimi vzorci odpre slika preparata. V spodnjem desnem kotu je posoda za odlaganje s krvjo kontaminiranega materiala. 42 01 FIZIOLOGIJA KRVI a) Postopek: 1. Predmetno steklo premaknemo na laboratorijsko mizico (vdolbine na njem so označene od leve proti desni z A, B in Rh). 2. Iz prve stekleničke z vzorcem premaknemo zamašek s kapalko nad levo jamico predmetnega stekla (kapljica krvi kane vanjo). Z istim vzorcem napolnimo še ostali dve jamici. 3. Pokrovček stekleničke anti-A premaknemo nad levo jamico (vanjo kane kapljica seruma anti-A). Postopek ponovimo še z ostalima antiserumoma (anti-B v srednjo in anti-Rh v desno vdolbinico). 4. S palčkami ustrezne barve premešamo vzorce. Uporabljene palčke premaknemo v posodo za kontaminirane odpadke. 5. Predmetnico s pripravljenimi vzorci premaknemo nad osvetljeno ploščo in izberemo ukaz Osvetli (Light). Nad predmetnico se odpre slika, na kateri si lahko ogledamo vzorec. 6. Pod vsako kapljico izberemo oznako » positive« (če je prisotna aglutinacija (koagulacija)) oziroma » negative« (če je vzorec homogen). Rezultate zapišemo. 7. Z izbiro oznake »X« zapremo prikaz. 8. Postopek ponovimo še z ostalimi vzorci. b) Naloge: 1. Rezultate meritev vnesite v tabelo ((+) aglutinacija, (–) aglutinacije ni)! 2. Odgovorite na spodnja vprašanja:  Kateri antigeni so na eritrocitih oseb s krvno skupino AB?  Katera protitelesa so v krvi oseb s krvno skupino AB?  Ali ima oseba s krvno skupino 0 na eritrocitih antigene? Številka Aglutinacija s Aglutinacija s Aglutinacija s serumom Krvna vzorca serumom anti-A serumom anti-B anti-Rh skupina 1 2 3 4 5 6 43 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.11.2 Določanje krvnih skupin sistema ABO pri človeku a) Material:  Serumi za določanje krvnih skupin, predmetnice, lancete, alkohol, vata. b) Postopek: 1. Na predmetnico kanemo po eno kapljico seruma anti-A in anti-B. 2. Poleg kapljice seruma kanemo kapljici krvi ter ju z vogalom predmetnice ali s stekleno palčko zmešamo. 3. Opazujemo nastanek aglutinacije (izkosmičenja), če kri vsebuje antigene, ki se vežejo na protitelesa v serumu. c) Naloge:  Z metodo na predmetnici določite svojo krvno skupino! OPOZORILO: Zaradi nevarnosti okužbe z virusom HIV ali hepatitisa uporabljamo material za enkratno uporabo in gumijaste rokavice, s krvjo onesnažene površine pa razkužimo. Rezultata ne navajajte kot svojo krvno skupino! Uradno določitev krvne skupine lahko opravi le pooblaščeni zavod. A B AB 0 Slika 1.15: Shematični prikaz določanja krvnih skupin sistema ABO človeka z metodo na predmetnici 44 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.12 LASTNOSTI KRVNE PLAZME/SERUMA 1.12.1 Pufrska kapaciteta krvne plazme/seruma Kri, ki kroži v ožilju, vzdržuje svoj pH v zelo ozkih mejah (7,3 do 7,5) kljub neprestanemu prihajanju bazičnih in kislih snovi v organizem s hrano in nastajanju različnih metabolitov. Vzdrževanje acidobaznega ravnotežja omogočajo pufrski sistemi krvi in funkcija nekaterih organov (dihala, ledvice). Glavni pufrski sistemi krvi so bikarbonatni, fosfatni, proteinski pufer in hemoglobin eritrocitov.  Bikarbonatni pufer (natrijev bikarbonat (NaHCO3) in ogljikova kislina (H2CO3) v razmerju 20 : 1) je najvažnejši; ima 65 % pufrske kapacitete krvi in je bolj učinkovit za kisline kot za baze.  Fosfatni pufer (primarni natrijev fosfat (NaH2PO4) – kisli in sekundarni natrijev fosfat (Na2HPO4) – bazični) ima v krvi razmeroma majhno pufrsko kapaciteto (1 %), važnejša pa je njegova vloga v celici.  Proteinski pufer (–NH + 3 in –COO–) je v primerjavi z anorganskimi bolj sposoben vzdrževati stalen pH, nanj pa odpade 6 % pufrske kapacitete krvi).  Hemoglobin eritrocitov pa ima 28 % pufrske kapacitete krvi. a) Material:  Krvni serum/plazma, raztopina HCl snkc 0,1 mol/L (mkc 3,6 g/L), metiloranž, destilirana voda, fiziološka raztopina, bireta, dve Erlenmeyerjevi bučki. b) Postopek: 1. V prvo erlenmajerico odpipetiramo 2 ml krvnega seruma in 1 ml destilirane vode ter dodamo 1 kapljico metiloranža. 2. V drugo erlenmajerico odpipetiramo 2 ml fiziološke raztopine in 1 ml destilirane vode ter dodamo 1 kapljico metiloranža. 3. Vsebino obeh erlenmajeric titriramo s HCl do rdečega obarvanja raztopine in izmerimo porabo HCl. c) Naloge: 1. Izmerite porabo HCl pri titraciji krvnega seruma in fiziološke raztopine! 2. Razložite vzroke za nastalo razliko! 45 01 FIZIOLOGIJA KRVI 1.12.2 Ločitev beljakovinskih frakcij krvne plazme z obarjanjem Beljakovine krvne plazme delimo na enostavne in sestavljene.  K enostavnim sodijo: fibrinogen, ki sodeluje pri procesih koagulacije krvi, albumini, ki omogočajo vzpostavljanje koloidnoosmotskega tlaka na kapilarni membrani, in globulini (α in β), ki sodelujejo pri prenosu snovi in so substrat za različne biokemične reakcije, γ globulini pa imajo obrambno funkcijo – protitelesa).  K sestavljenim beljakovinam pa sodijo lipoproteidi in glikoproteidi. Med seboj jih lahko ločimo z različnimi metodami, npr. z elektroforezo, ultracentrifugiranjem, raztapljanjem v organskih topilih ali s sedimentacijo z različnimi solmi. Frakcije plazemskih beljakovin imajo različne specifične lastnosti. Zaradi svojih fizikalno-kemičnih posebnosti se obnašajo različno v prisotnosti nekaterih kemičnih snovi oziroma njihovih raztopin: fibrinogen aglutinira pri polovični nasičenosti plazme z NaCl, globulini aglutinirajo pri polovični nasičenosti plazme z raztopino amonijevega sulfata, albumini pa pri popolni zasičenosti z amonijevim sulfatom. a) Material:  Krvna plazma (oksalatna ali citratna), krvni serum, nasičena raztopina NaCl, nasičena raztopina amonijevega sulfata (NH4)2SO4, amonijev sulfat v kristalih, pipete, epruvete, lijaki, filtrirni papir, centrifuga. b) Postopek: 1. V prvo epruveto odpipetiramo 5 ml krvne plazme in enako količino nasičene raztopine NaCl (s tem dosežemo polovično nasičenost plazme z NaCl); vsebino epruvete dobro premešamo, nastale kosmiče pa izločimo s centrifugiranjem. 2. V drugo epruveto odpipetiramo 5 ml seruma in enako količino nasičene raztopine amonijevega sulfata (s tem dosežemo polovično zasičenost plazme z amonijevim sulfatom); nastalo oborino filtriramo. 3. Filtratu dodajamo amonijev sulfat v substanci toliko časa, dokler se kristali v vodi ne topijo več (nasičenost!); nastalo oborino ponovno filtriramo. c) Naloge:  Shematično narišite in izvedite postopek! 46 2 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA Fiziologija krvnega obtoka ali kardiovaskularna fiziologija obravnava procese delovanja srca in krvnega obtoka in zakonitosti gibanja krvi v ožilju – hemodinamiko. 2.1 ŽABJE SRCE KOT MODEL ZA ŠTUDIJ DELOVANJA SRCA Srčna mišica se od skeletne razlikuje tako po histološki zgradbi kot po mehanizmih delovanja. Skeletna mišica se krči pod vplivom živčnih dražljajev, medtem ko se srčna depolarizira spontano, v rednih presledkih in stalno. Glavni notranji dejavnik, ki vpliva na frekvenco srca, je depolarizacija ritmovnika, ki se prenaša po ostalem prevodnem sistemu srca. Čeprav delovanje srca zaradi avtomatizma ni odvisno od živčnih dražljajev, pa na frekvenco njegovega delovanja lahko vplivajo dražljaji, ki pridejo v srce po vegetativnem živčnem sistemu. Poskusi s področja kardiovaskularne fiziologije so tehnično težko izvedljivi ali problematični iz etičnih razlogov. V praksi se največkrat izvajajo na srcu hladnokrvnih živali (žab, krastač, želv), ki tako kot drugi organi hladnokrvnih živali deluje še dolgo po izolaciji iz organizma. Pri tem jih ni treba oskrbovati s hranilnimi snovmi in kisikom ter jih držati na konstantni telesni temperaturi, kar je potrebno za organe toplokrvnih živali. Morfološko se srce hladnokrvnih živali nekoliko razlikuje od srca sesalcev in ptic, osnovni principi njegovega delovanja pa so enaki. Glavni deli žabjega srca so sinus venosus, dva preddvora (atrija) in en prekat (ventrikel). Na ventralni strani srca iz prekata izhaja arterijsko deblo ( truncus arteriosus) , ki se takoj razdeli na pljučno arterijo in aorto. Na dorzalni strani srca pa se nahaja venozni sinus, v katerega se vlivajo telesne vene. Iz tega prehaja kri v desni preddvor. V levi preddvor se skozi pljučne vene vliva oksigenirana kri iz pljuč. V prekatu se arterijska in venska kri delno mešata. 2.1.1 Prikaz delovanja srca žabe Namesto poskusov na živih živalih se v pedagoške namene uporabljajo računalniške simulacije delovanja srca in vplivov različnih dejavnikov nanj. Simulacije so bile razvite na osnovi meritev, opravljenih na izoliranih srcih žab ali sesalcev, zlasti podgan. Za prikaz delovanja srca bomo uporabili računalniški program PhysioEx. Iz glavnega menija programa izberemo poglavje Kardiovaskularna fiziologija žabe (Frog Cardiovascular Physiology). V virtualnem laboratoriju (slika 2.1) je v zgornjem desnem kotu osciloskop, ki na ekranu zapisuje delovanje srca. Hitrost registracije uravnavamo z ukazom Orodja/Prilagodi prikaz (Tools/Modify Display). Frekvenca srca (število utripov v minuti) je prikazana pod ekranom osciloskopa levo, podatki o trenutnem delovanju srca pa so prikazani pod ekranom osciloskopa desno, in sicer: - normalno delovanje srca (heart rate normal) – srce deluje normalno, - delovanje srca se spreminja (heart rate changing) – število utripov se povečuje ali zmanjšuje oz. - delovanje srca je stabilno (heart rate stable) – delovanje srca je enakomerno, vendar je frekvenca večja ali manjša od normalne. 47 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA Pod osciloskopom je električni stimulator. Srce lahko dražimo s posameznimi dražljaji (Single Stimulus) ali s serijo dražljajev (Multiple stimulus). Če srce dražimo s serijo dražljajev, je njihova frekvenca prikazana v okencu pod tipko (Stimuli/sec); uravnavamo jo z izbiranjem tipk (+) ali (–) ob prikazu frekvence. Ob izbiri ukaza Multiple Stimulus se ta spremeni v ukaz Stop Stimulus, ki omogoča prekinitev draženja v kateremkoli trenutku. Električna napetost impulzov je navedena v prikazu Voltage in se uravnava samodejno. Iz stimulatorja zgoraj levo izhaja nosilec za elektrode, v katerega prenesemo elektrodo iz omarice v spodnjem levem kotu. Zgornjo elektrodo uporabljamo za neposredno draženje srca (Direct Heart Stimulation), spodnjo pa za draženje vagusa (Vagus Nerve Stimulation). Na levi strani je enota za vzdrževanje delovanja srca. Srce je iz telesa žabe dvignjeno s kaveljčkom. Ta je povezan s pretvornikom na vrhu nosilne ročice, ki mehanske spremembe ob krčenju srca pretvarja v električne impulze, ti pa se prenašajo v osciloskop. Med poskusi na srce neprekinjeno kaplja Ringerjeva raztopina, segreta na 23 °C, ki preprečuje izsušitev preparata in omogoča njegovo normalno delovanje. Slika 2.1: Virtualni laboratorij za registracijo delovanja srca žabe A) Osnovna registracija delovanja srca žabe a) Postopek: 1. Nekaj časa opazujemo delovanje preparata. 2. Na prikazu frekvence srca odčitamo število kontrakcij v minuti. b) Naloge:  Izmerite in zapišite frekvenco delovanja srca! 48 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA B) Prikaz nastanka ekstrasistol Ekstrasistole ali prezgodnje srčne kontrakcije so sistolična krčenja srca, ki izstopajo iz njegovega običajnega ritma. Nastopijo, kadar nastane dodaten impulz zunaj normalnega ritma v samem sistemu za nastanek in prevajanje impulzov srca ali kadar v srce pride kak dodaten impulz iz okolja. Ekstrasistola lahko nastane v fazi diastole ali pavze, ne pa v fazi sistole (zaradi neobčutljivosti srca v celotni sistoli). Velikost kontrakcije v ekstrasistoli je enaka ali manjša, kot je sistolična kontrakcija, pavza, ki sledi, pa je daljša od normalne ( kompenzatorna pavza) . a) Postopek: 1. Elektrodo za direktno stimulacijo srca premaknemo v nosilec za elektrode. 2. S posameznimi dražljaji stimuliramo srce v različnih obdobjih krčenja (ob začetku in na višku ventrikularne sistole, med diastolo). Ob tem lahko opazimo nastanek ekstrasistol – dodatnih kontrakcij, ki sledijo ventrikularni sistoli. Prav tako opazujemo kompenzatorno pavzo, ki sledi ekstrasistoli in omogoča, da srce ponovno ujame normalni ritem. 3. Srce dražimo z zaporednimi dražljaji s frekvenco 20 v sekundi. Z ukazom Stop Stimulus ustavimo draženje. b) Naloge: 1. Ugotovite, med katerim obdobjem ventrikularne kontrakcije je mogoče izzvati ekstrasistolo in razložite vzroke za nastale pojave! 2. Ugotovite, kaj se zgodi ob draženju srca z večjim številom zaporednih dražljajev! C) Učinek draženja n. vagusa na delovanje srca Čeprav srce lahko deluje tudi, kadar so njegovi živci prerezani ( denervacija), je v intaktnem organizmu njegovo delovanje pod stalnim vplivom živčnih impulzov. Ta vpliv je najbolj očiten na frekvenco srca in moč njegove kontrakcije. Učinek n. vagusa je bil odkrit l. 1845 na žabjem srcu in tedaj so prvič dokazali, da stimulacija živca lahko povzroči tudi upočasnitev delovanja organa, ne le pospešitev. Parasimpatična živčna vlakna vstopajo v srce kot rami cardiaci n. vagi, vpliv pa imajo na sinusni vozel (desni vagus), atrioventrikularni vozel (levi vagus) ter na mišičnino atrijev, ne pa ventriklov. Parasimpatikus deluje zaviralno na delo srca. Simpatikus (iz cervikalnih in torakalnih ganglijev) vpliva na oba vozla in mišičnino ventriklov ter spodbuja delovanje srca. a) Postopek: 1. V nosilec prenesemo elektrodo za stimulacijo n. vagusa. 2. S pritiskanjem na tipki (+) in (–) uravnamo stimulator na 50 dražljajev v sekundi. 3. Srce stimuliramo s serijo dražljajev, dokler se ne ustavi in nato ponovno začne delovati (vagusni pobeg). b) Naloge:  Razložite, kakšen je učinek stimulacije vagusa na srce! 49 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA Č) Vplivi fizikalnih in kemičnih dejavnikov na delovanje srca Za izvedbo te serije poskusov iz glavnega menija izberemo poglavje Vplivi na frekvenco srca (Modifiers of Heart Rate). Virtualni laboratorij je identičen kot pri prejšnjih poskusih, dodatno pa so v njem različne raztopine, ki vplivajo na delovanje srca. Spreminjamo lahko tudi temperaturo Ringerjeve raztopine za prelivanje srca.  Vpliv temperature na delovanje srca Po Van't Hoffovem zakonu dvig temperature za 10 °C povzroči dva- do trikratno povečanje hitrosti delovanja organov. Spreminjanje temperature vpliva tudi na delovanje srca. Če sinus venosus prelivamo s hladno Ringerjevo raztopino, se delo srca upočasni, pod vplivom tople Ringerjeve raztopine po pospeši. Prelivanje drugih delov srca nima vpliva na frekvenco njegovega delovanja. a) Postopek: 1. Zapišemo frekvenco srca: …………………………………………………………….. 2. Na prikazu temperature Ringerjeve raztopine izberemo 5 °C. Na srce začne kapljati hladna Ringerjeva raztopina. Opazujemo spremembe na zapisu delovanja srca. 3. Ko se na prikazovalniku aktivnosti srca prikaže sporočilo, da je delovanje srca stabilno, ponovno zapišemo njegovo frekvenco: ………………………………………… 4. Nato na prikazu temperature Ringerjeve raztopine izberemo 23 °C. Na srce začne kapljati raztopina s sobno temperaturo. 5. Ko se prikaže sporočilo, da je delovanje srca normalno, na prikazu temperature Ringerjeve raztopine izberemo 32 °C, tako da na srce začne kapljati topla raztopina. Opazujte spremembe na zapisu delovanja srca! 6. Ko se na prikazovalniku aktivnosti srca prikaže sporočilo, da je delovanje srca stabilno, ponovno zapišemo njegovo frekvenco delovanja: ……………………………… 7. Ob koncu poskusa srce ponovno prelivamo z Ringerjevo raztopino, segreto na 23 °C. S poskusi lahko nadaljujemo, ko se delovanje srca normalizira, kar razberemo z zapisa na osciloskopu. b) Naloge:  Opišite in razložite, kako spreminjanje temperature Ringerjeve raztopine vpliva na delovanje srca!  Prikaz učinka pilokarpina na srce Prelivanje srca z raztopino pilokarpina učinkuje enako kot stimulacija parasimpatikusa (vagusa). a) Postopek: 1. Zapišemo frekvenco srca: ………………………………………………………………. 2. S kapalko prelijemo srce z nekaj kapljicami raztopine pilokarpina. 3. Opazujemo zapis delovanja srca na ekranu osciloskopa. 4. Ko se na prikazovalniku osciloskopa izpiše obvestilo, da je delovanje srca stabilno, zapišemo frekvenco srca: ……………………………………………………………….. 5. Nato prelivamo srce z Ringerjevo raztopino (23 °C). Ko se prikaže obvestilo, da je frekvenca srca normalna, je preparat pripravljen za naslednji poskus. b) Naloge:  Razložite, kako na srce učinkuje pilokarpin! 50 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA  Prikaz učinka adrenalina Adrenalin (epinefrin) je hormon sredice nadledvične žleze. Pospešuje delo srca, povzroča dvig krvnega tlaka in pospešuje pretok krvi skozi skeletne mišice, srce in možgane. Podoben učinek ima draženje simpatikusa. a) Postopek: 1. Zapišemo frekvenco srca: …………………………………………………………………………………………………… 2. S kapalko prelijemo srce z nekaj kapljicami raztopine adrenalina. 3. Opazujemo zapis delovanja srca na ekranu osciloskopa. 4. Ko se na prikazovalniku osciloskopa izpiše obvestilo, da je delovanje srca stabilno, ponovno zapišemo frekvenco srca: …………………………………………………………………………………………………… 5. Prelivamo srce z Ringerjevo raztopino (23 °C). Ko se prikaže obvestilo, da je frekvenca srca normalna, je preparat pripravljen za naslednji poskus. b) Naloge:  Opišite in razložite, kaj se zgodi po prelivanju srca z adrenalinom!  Zakaj je učinek adrenalina enak kot draženje simpatikusa?  Prikaz učinka različnih ionov na delovanje srca Na delovanje srca vplivajo ioni nekaterih soli: najbolj izrazito K+, Ca2+, pa tudi Mg2+ in Na+. Koncentracija ionov K+ in Ca2+ v izvencelični tekočini ima tolikšen učinek na delovanje srca zaradi vloge pri nastanku in prenosu akcijskega potenciala. Višek ionov K+ zmanjša negativnost membranskega potenciala v mirovanju, ob tem pa slabi tudi akcijski potencial, višek ionov Ca2+ pa ima obraten učinek. Ioni K+ zato zmanjšajo moč krčenja srca, zavirajo prevajanje srčnih impulzov preko atrio-ventrikularnega vozla in s tem upočasnijo delovanje srca ter povzročijo njegovo ustavitev v diastoli (če se normalna koncentracija poveča za 2- do 3-krat). Ioni Ca2+ povečajo moč krčenja srca, velike količine pa lahko povzročijo bradikardijo, aritmijo in zaustavitev delovanja srca v sistoli. V organizmu ta učinek normalno ni možen: deficit ionov Ca2+ vodi v tetanije, višek pa se nalaga v kosteh in drugih tkivih. Na+ ioni pa zmanjšujejo učinek Ca2+ na krčenje po nastanku akcijskega potenciala. a) Postopek: 1. Zapišemo frekvenco srca: …………………………………………………………………………………………………… 2. Srce prelijemo z nekaj kapljicami raztopine Ca2+ in opazujemo zapis njegovega delovanja na ekranu osciloskopa. 3. Ko se na prikazovalniku osciloskopa izpiše obvestilo, da je delovanje srca stabilno, ponovno zapišemo frekvenco srca: ……………………………………………….…………………………………………………… 4. Prelivamo srce z Ringerjevo raztopino (23 °C). Ko se prikaže obvestilo, da je frekvenca srca normalna, je preparat pripravljen za naslednji poskus. 5. Po enakem postopku (točke 1. do 4.) najprej ponovimo poskus z raztopino, ki vsebuje Na+ in nazadnje še z raztopino, ki vsebuje K+. Zapišemo frekvenco srca po prelivanju z Na+: …………………..………………… in K+: …………………………………………………………………………………………., b) Naloge: Opišite in razložite, kako ioni Ca2+, K+ in Na+ vplivajo na delovanje srca! 51 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.1.2 Lokalizacija srčnega avtomatizma (Stanniusove ligature) Avtomatizem je sposobnost organa, da lahko deluje brez vplivov živčnega sistema in da impulzi za njegovo delovanje nastajajo v njem samem. V srcu sesalcev je glavni center avtomatizma srca (ritmovnik) sinusni (Keith-Flackov) vozel v steni desnega preddvora, med ustjema v. cavae cranialis in caudalis. Depolarizacija, ki nastane v njem, se v obliki koncentričnih valov širi po mišičju preddvorov. Nato doseže atrioventrikularni (Aschov-Tawarov) vozel v septumu med desnim preddvorom in desnim prekatom. Od tega se impulz širi po Hissovem snopu do miokarda prekatov. Prenos impulzov med muskulaturo preddvorov in prekatov ni mogoč zaradi atrioventrikularne pregrade. Čeprav v žabjem srcu sistem za nastajanje in prevajanje impulzov morfološko ni popolnoma jasen, deluje na podoben način kot pri sesalcih. Stanniusove ligature so dokaz, da impulzi za delo srca nastajajo v sami srčni mišici. Stannius je proučeval prevodnost srca tako, da ga je na različnih mestih podvezoval in opazoval njegovo delovanje. Pri originalnem delu je namestil 25 ligatur. Za razumevanje prevodnosti srca so pomembne tri, ki jih namestimo na žabje srce. a) Material:  izolirano žabje srce, kimograf, sukanec, štoparica. b) Postopek: Izolirano žabje srce obesimo na kimograf in nanj namestimo posamezne ligature. 1. Prvo Stanniusovo ligaturo namestimo na prehodu sinusa venosusa v srčna preddvora. Ob pravilni namestitvi se srce ustavi, venozni sinus pa deluje naprej. 2. Drugo Stanniusovo ligaturo namestimo enako kot v prvem primeru, poleg tega pa še drugo na prehodu iz preddvorov v prekat (v atrio-ventrikularni žleb). Srce se po namestitvi prve ligature ustavi, po namestitvi druge pa začne ponovno delovati, vendar v drugačnem ritmu kot pred tem. 3. Tretjo Stanniusovo ligaturo namestimo na atrio-ventrikularnem žlebu. Srce se najprej ustavi, nato pa začneta sinus venosus in preddvor delovati v svojem, prekat pa v svojem ritmu. c) Naloge: 1. Shematično prikažite namestitev posameznih Stanniusovih ligatur! 2. Razložite vzroke za spremembe v delovanju srca po namestitvi posameznih ligatur! 52 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.2 ELEKTROKARDIOGRAFIJA Pri krčenjih miokarda nastajajo električni tokovi, ki se preko pljuč in okolnega tkiva prevajajo na telesno površino. Tu jih ob uporabi posebnega aparata lahko tudi zapišemo. Aparat, ki registrira električne spremembe pri delovanju srca, se imenuje elektrokardiograf, zapis elektrokardiogram, metoda pa elektrokardiografija ali skrajšano EKG. Elektrokardiograf je v osnovi voltmeter z ojačevalcem, ki električno informacijo kot funkcijo časa posname na papir ali prikaže na osciloskopu. Prvi zapis električnih pojavov pri delovanju srca je opravil nizozemski fiziolog Einthoven že leta 1903. Aparat, ki ga je pri tem uporabil, je bil galvanometer z napeto žico. Delovanje te naprave temelji na fizikalnem principu, da se električni vodnik, ki se nahaja v magnetnem polju in skozi katerega spustimo električni tok, odmakne pravokotno na smer magnetnega polja in električnega toka. Na tej osnovi so kasneje proizvajalci razvili različne tipe EKG aparatov. Sodobni EKG aparati so opremljeni z osciloskopom, napravami za zapisovanje ali shranjevanje zapisa, lahko pa tudi za prenos zapisa po telefonu. 2.2.1 Registracija EKG A) Princip EKG Princip elektrokardiografskega zapisa lahko ponazorimo z izoliranim miokardom v raztopini NaCl (slika 2.2). A – stanje navideznega mirovanja (celotna površina organa je enako nabita); kazalec galvanometra je na ničli (na zapisu bi nastala ravna črta) B – na levi strani organa je nastal akcijski potencial (depolarizacija), na desni pa je stanje enako kot na sliki A, galvanometer se zato odkloni (na zapisu bi nastala vzpenjajoča se krivulja) C – negativni naboj na površini organa se je razširil po vsej površini (ves organ je vzdražen – depolariziran); kazalec galvanometra je na ničli (zapis se spusti na osnovni nivo) D – pojav repolarizacije (razlika med levo in desno stranjo organa); glede na potek repolarizacije se kazalec galvanometra lahko odkloni a) na levo (odklon krivulje navzdol) ali b) na desno (odklon krivulje navzgor) E – repolarizacija po vsem organu; kazalec galvanometra se vrne na ničelno pozicijo (zapis je ravna črta) Slika 2.2: Princip zapisa električnih potencialov miokarda 53 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA Zapis akcijskih potencialov, ki izvirajo iz srca, je drugačen kakor zapis bioelektričnih potencialov drugih organov (npr. mišic ali živcev). Vzrok posebnosti zapisa je predvsem posledica specifičnega načina širjenja impulza v srcu. B) Odvodi Na telesni površini obstaja nepregledna množica točk, na katerih je mogoče meriti akcijske potenciale srca, zato so mesta za njihovo merjenje natančno določena. Mesta, na katera nastavimo merilne elektrode, s katerimi odvajamo potenciale iz telesa na aparat, imenujemo odvode. Poznamo tri vrste odvodov: standardne odvode iz okončin, pojačane unipolarne odvode iz okončin in prekordialne odvode.  Pri EKG človeka ali drugih sesalcev nastavimo tri standardne odvode iz okončin, ki ustvarijo trikotnik okoli srca. Pri prvem namestimo elektrodi na desno in levo sprednjo okončino. Za drugi odvod namestimo elektrodi na sprednjo desno in zadnjo levo okončino, za tretji odvod pa na prednjo in zadnjo levo okončino. Namestitev elektrod na okončine pri psu prikazuje slika 2.3. Te odvode se najpogosteje uporabljaja za zajemanje EKG v veterinarski diagnostiki srčnih obolenj.  Ojačani unipolarni odvodi iz okončin registrirajo spremembo napetosti ene okončine glede na povprečno napetost drugih dveh. Tehnično je to izvedeno tako, da sta dve okončini preko električnih uporov vezani z Slika 2.3: Namestitev elektrod pri EKG psa negativnim, ena pa s pozitivnim (LP – leva prednja noga, DP – desna prednja noga, LZ polom merilnega aparata. – leva zadnja noga) Kadar je pozitivni pol spojen z desno sprednjo okončino, se odvod označi kot aVR. Drugi odvod je označen kot aVL in registrira napetost na prednji levi okončini, tretji pa je aVF odvod, ki registrira napetost na levi zadnji okončini (a = augmented /pojačan/, R = right, L = left, F = foot).  S prekordialnimi odvodi (odvodi s prsnega koša) registriramo EKG z elektrodo s 6 ločenimi točkami, ki jih postavimo na točno določena mesta na prsnem košu v področju srca. Elektroda je spojena s pozitivnim polom elektrokardiografa, negativna (indiferentna) elektroda pa je preko uporov zvezana z obema prednjima in levo zadnjo okončino. Ker je površina srca zelo blizu stene prsnega koša, vsak prekordialni odvod registrira električni potencial tistega dela miokarda, ki je neposredno pod elektrodo. Prekordialni odvodi se uporabljajo predvsem v humani medicini za diagnostiko specifičnih motenj v delovanju srca. 54 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA C) Zapis EKG Pri pravilni namestitvi elektrod dobimo značilen zapis oz. krivuljo EKG (glej sliki 2.4 in 2.5). Na krivulji so razvidni zobci, ki jih po Einthovenu označujemo P, Q, R, S in T. Navzgor obrnjene zobce opredeljujemo kot pozitivne, navzdol obrnjene pa kot negativne. P, R, S in T zobci so v fizioloških pogojih pozitivni, Q in S pa sta negativna. Na krivulji EKG ločimo poleg valov tudi intervale. Slika 2.4: Zapis EKG (razlaga je v tekstu)  Val P (slika 2.5 (a)) označuje proces depolarizacije atrijev. Odklon povzroči pozitivni naboj v prednji levi okončini glede na prednjo desno. Ob koncu depolarizacije atrijev se napetost povrne na 0. V tem trenutku se akcijski potencial širi skozi atrioventrikularni vozel in začetni del Hissovega snopa. Ta tkiva so tako majhna, da sprememb napetosti na površini telesa ni mogoče zaznati. Če depolarizacija zajame hkrati oba atrija, je zobec enoten, kadar pa se pojavi časovna razlika med depolarizacijo levega in desnega atrija, se pojavi P zobec z dvema vrhovoma. Procesa repolarizacije atrijev (ki bi ga lahko imenovali atrijski T val) v fizioloških pogojih ne vidimo, ker je prekrit s procesom depolarizacije ventriklov. Pri človeku in govedu val P traja okoli 0,1, pri mesojedih 0,04 in pri konju 0,2 sekundi.  Interval P–R (atrioventrikularni interval) je proces od začetka električne aktivnosti atrijev do nastanka depolarizacije ventriklov in ustreza procesu širjenja depolarizacijskega vala preko atrijev, atrioventrikularnega vozla, Hissovega snopa in Purkinjejevih vlaken. Trajanje je odvisno od frekvence srca: večja, kot je frekvenca, krajši je interval. Če je interval daljši, pomeni, da se impulz dalj časa prevaja preko atrioventrikularnega vozla. Naslednje zaznavne spremembe na površini telesa so povezane z depolarizacijo ventriklov. 55 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA  Prvi del tega procesa je depolarizacija, ki se širi z leve na desno preko interventrikularnega septuma (slika 2.5 (b)). Ta prva faza ventrikularne depolarizacije običajno povzroči majhno razliko v napetosti med prednjima okončinama, pri čemer je prednja leva rahlo negativna. Negativni odklon, ki nastane, se imenuje val Q.  Naslednja faza ventrikularne depolarizacije povzroči velik pozitiven naboj v prednji levi okončini glede na prednjo desno, ker se med ventrikularno depolarizacijo impulz širi do apeksa srca, nato po Purkinjejevih vlaknih navzgor po notranji strani sten ventriklov in iz notranjosti na površino ventriklov (slika 2.5 (c), male puščice). Skupni učinek teh akcijskih potencialov je velik električni dipol, ki je obrnjen diagonalno navzdol in proti levi (zaradi takega položaja srca v prsnem košu) in zaradi masivne stene levega ventrikla). Pozitivni odklon, ki nastane, se imenuje val R. Slika 2.5: Spremembe električne napetosti med širjenjem akcijskega potenciala v srcu psa in njihova vloga pri zapisu EKG (DP – desna prednja okončina, LP – leva prednja okončina, LZ – leva zadnja okončina, a) depolarizacija atrijev, b) zgodnja depolarizacija ventriklov, c) depolarizacija ventriklov, d) zgodnja depolarizacija ventriklov)  Potem, ko se je akcijski potencial razširil skozi stene obeh ventriklov, se razlika med naboji povrne na 0. Na koncu ventrikularne depolarizacije se pojavi kratkotrajen, majhen naboj v LP glede na DP okončino, katerega fizikalne osnove niso znane (slika 2.5 (d)). Odklon, ki nastane, se imenuje val S. 56 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA  Posledica ventrikularne depolarizacije je kompleks QRS, v katerem je zobec R pozitiven, ostala dva pa negativna. Podaljševanje te faze pomeni, da je proces depolarizacije upočasnjen ali da je depolarazicija obeh ventriklov asinhrona. Ravna črta na koncu tega kompleksa pomeni, da je proces depolarizacije zajel celotni miokard obeh ventriklov.  Električni pojavi, ki sledijo, so posledica repolarizacije ventriklov. Val repolarizacije se širi s površine v notranjost, zato nastane dipol z negativno stranjo, obrnjeno navzgor in proti desni (slika 2.5 (e)). Zato med ventrikularno repolarizacijo pride do pozitivnega naboja v prednji levi glede na prednjo desno okončino. Rezultat tega je pozitivni val T.  Segment S–T predstavlja depolarizacijo ventriklov do začetka ventrikularne repolarizacije. Traja od konca QRS kompleksa do začetka T vala.  Interval Q–T je celotni zapis od pričetka depolarizacije do konca repolarizacije ventriklov. Imenujemo ga tudi električna sistola.  Interval P–P ustreza času med dvema kontrakcijama atrijev. Uporablja se za izračun števila kontrakcij atrijev na minuto.  Interval R–R ustreza času med dvema kontrakcijama ventriklov. Uporablja se za izračun števila kontrakcij ventriklov na minuto. Tabela 2.1: Trajanje valov in intervalov EKG zapisa pri nekaterih vrstah domačih živali in pri človeku Vrsta V a l o z . i n t e r v a l [ s ] živali P P–R Q–R–S Q–T pes 0,04 0,06–0,13 0,05–0,06 0,15–0,25 mačka 0,04 0,05–0,09 0,04 0,12–0,18 konj 0,20 0,22–0,56 0,08–0,17 0,32–0,64 govedo 0,10 0,16–0,30 0,08–0,14 0,32–0,64 človek 0,10 0,12–0,21 0,08 2.2.2 Klinična uporaba EKG Z merjenjem električne aktivnosti srca lahko ugotavljamo izvor električnega dražljaja, širjenje depolarizacije in potek repolarizacije miokarda. Dobljene rezultate primerjamo z normalno aktivnostjo srčne mišice. Elektrokardiografija je v klinični praksi uporabna predvsem pri diagnostiki aritmij (z EKG lahko ugotovimo izvor in frekvenco impulzov) in pri ugotavljanju stanja miokarda (odkloni EKG so pogosto spremenjeni zaradi patoloških, lahko pa tudi psiholoških dejavnikov). Snemanje EKG je potrebno izvesti ob spremembah v frekvenci delovanja srca ali dihanja, šoku, omedlevicah, nezavesti, krčih, ob pojavu srčnih šumov, spremembah v velikosti srca, ob cianozi, motnjah v elektrolitskem ravnotežju (npr. v zvezi z boleznimi ledvic), ob nekaterih sistemskih in kužnih boleznih (npr. piometra, vnetje pankreasa, borelioza, parvoviroza). Prav tako se praviloma izvaja pred operativnimi posegi, med njimi in po njih (kardiološki monitoring). 57 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.3 KARDIOVASKULARNA DINAMIKA Fiziologijo krvnega obtoka delimo na dve različni, a med seboj povezani skupini procesov: 1. delovanje srca kot črpalke in 2. transport krvi po krvnih žilah. 2.3.1 Mehanika črpalk Srce je kompleksen organ, sestavljen iz štirih komor, ki delujejo kot dve zaporedno vezani črpalki (leva in desna polovica srca). Desno srce črpa kri v pljuča in nato v levo srce, ki s krvjo oskrbuje telo, nato pa se kri vrača v desno srce. Vsak utrip srca sestavljata diastola in sistola. Med diastolo se srce sprosti in napolni s krvjo, med sistolo pa skrči in iztisne kri v arterijski in pljučni krvni obtok. Dolžina diastole je eden od dejavnikov, ki določajo količino krvi v srcu ob koncu obdobja polnjenja. Volumen prekatov na koncu diastole, tik pred srčno sistolo, se imenuje končni diastolični volumen. Kljub iztiskanju krvi ob sistoli prekata se ta nikoli ne izprazni do konca, pač pa manjša količina krvi (končni sistolični volumen) ostane v njem. Razlika med končnim diastoličnim in končnim sistoličnim volumnom je udarni (sistolični) volumen. To je količina krvi, ki se iztisne v krvni obtok ob sistoli prekata. Če udarni volumen pomnožimo s frekvenco srca (število utripov v minuti), dobimo minutni volumen srca. To je količina krvi, ki jo srce prečrpa v eni minuti. Z računalniško simulacijo lahko prikažemo delovanje enostavne črpalke z eno komoro, fizikalne koncepte simulacije pa lahko uporabimo pri razlagi delovanja srca sesalcev pri črpanju krvi. Slika 2.6: Virtualni laboratorij za prikaz mehanike črpalk Simulacijo poženemo z izbiro poglavja Mehanika črpalk (Pump Mechanics) iz glavnega menija programa. V virtualmen laboratoriju (slika 2.6) sta dve kontrolni enoti: zgoraj enota za kontrolo opreme, ki se uporablja za nastavitev eksperimentalnih pogojev, spodaj pa enota za zbiranje rezultatov, kjer se zapisujejo rezultati meritev. Nad kontrolno enoto so nameščeni trije stekleni 58 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA valji. Tekočina se pretaka iz levega v desni valj skozi srednjega, ki deluje kot enostavna črpalka. Levi valj in cev, ki vodi iz njega, ponazarjata venski krvni obtok, črpalka eno polovico srca (ali le en prekat), desna cev in valj pa arterijski krvni obtok. Enosmerni pretok tekočine zagotavljata ventila na ceveh ob vstopu in izstopu iz črpalke. Če bi črpalka predstavljala levi prekat, potem bi bil levi ventil bikuspidalna, desni pa aortna (semilunarna) zaklopka. Črpalka se prazni ob pritisku bata navzdol (zaradi povečanja tlaka), njeno polnjenje in dviganje bata pa povzroča tlak v levem valju. Tlak v desnem valju deluje nasprotno tlaku črpalke. Razlika med tlakom v črpalki in desnem valju je prikazana na enoti za prikaz zbiranja rezultatov (Pres.Dif.R.). Z ukazom Samodejno črpanje (Auto Pump) na zgornji kontrolni enoti poženemo črpalko, ki izvede izbrano število črpanj (Max. Strokes). Ukaz Single povzroči eno črpanje. Če je število črpanj 5 ali več, se po koncu poskusa v desnem delu zgornje kontrolne enote predvajata frekvenca črpanja (Rate (strokes/min)) in pretok (Flow (ml/min)). Polmer leve in desne cevi (Flow tube radius (mm)) določimo z izbiro oznak (+) oziroma (–). Začetni (Start) in končni (End) volumen črpalke (Pump volume (ml)) določimo z izbiro oznak (+) ali (–) na kontrolni enoti. Udarni volumen črpalke (količina tekočine, iztisnjena ob enem črpanju) se avtomatsko izračuna z odštevanjem končnega volumna od začetnega in se izpiše v oknu (Stroke). Enota za zbiranje podatkov zapisuje in prikazuje rezultate, ki jih zbiramo med poskusom. Z ukazom Record Data rezultate shranimo, z ukazom Delete Line izbrišemo vrstico, z ukazom Clear Data Set pa odstranimo iz spomina vse podatke. A) Učinek polmera cevi na delovanje črpalke Čeprav bomo spreminjali samo polmer desne (odvodne) cevi, skušajte predvideti, kaj bi se zgodilo, če bi spreminjali polmer leve (dovodne) cevi. a) Postopek: 1. Iz menija poskusa izberemo ukaz Pump Mechanics. V seznamu nastavitev na levi strani spodnje kontrolne enote izberemo nastavitev Rad.R. (obarva se modro). Kontrolna enota bo registrirala spremembe pretoka krvi glede na spremembe premera cevi. 2. Z izbiro oznak (+) oz. (–) določimo polmer leve (3 mm) in desne cevi (2 mm). Med celotnim poskusom naj bo tlak v levem valju 40 mm Hg, tlak črpalke 120 mm Hg in tlak v desnem valju 80 mm Hg. Začetni volumen črpalke naj bo 120 ml (končni diastolični volumen), končni 50 ml (končni sistolični volumen), število črpanj pa 10. 3. Z ukazom Auto Pump poženemo črpalko. Tekočina se skozi črpalko prečrpa iz levega v desni valj. Po 10 črpanjih se v oknih Flow in Rate izpišeta vrednost pretoka krvi (ml/min) in frekvence črpalke (črpanja/min). Rezultate zapišemo. Z ukazom Refill ponovno napolnimo levi valj. 4. Polmer desne cevi postopoma povečujemo za 1 mm in vsakič ponovimo postopek, opisan v 3. točki, dokler ne dosežemo največjega polmera (6 mm). Rezultate zapišemo v spodnjo tabelo. b) Naloge: 1. Rezultate meritev uporabite za pripravo grafikona, ki prikazuje učinek polmera cevi na pretok krvi (abscisa: polmer cevi [mm], ordinata: pretok krvi [ml/min])! 2. Na osnovi dobljenih rezultatov odgovorite na spodnja vprašanja: 59 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA  Kaj bi se zgodilo s pretokom krvi, če bi spreminjali (povečevali ali zmanjševali polmer leve cevi?  Kaj bi se zgodilo s pretokom krvi in frekvenco srca, če bi se spremenil (povečal ali zmanjšal) levi polmer? Meritev 1. 2. 3. 4. 5. polmer desne 2 mm 3 mm 4 mm 5 mm 6 mm cevi [mm] pretok krvi [ml/min] frekvenca [n/min] B) Učinek udarnega volumna na delovanje črpalke Pri živalih v mirovanju srce iztisne iz prekata približno 60 % krvi (udarni volumen), 40 % pa je ostane v njem. Čeprav preprosta črpalka ne deluje popolnoma enako kot srce, pa rezultate meritev vseeno lahko uporabimo za razlago delovanja srca. S poskusom bomo ugotavljali, kako spreminjanje začetnih in končnih volumnov črpalke vpliva na njeno delovanje. Meritev Udarni volumen Frekvenca Pretok krvi [ml] [n/min] [ml/min] 1 10 2 20 3 30 4 40 5 50 6 60 7 70 8 80 9 90 10 100 11 110 12 120 a) Postopek: 1. Iz menija poskusa izberemo ukaz Mehanika črpalk (Pump Mechanics). V seznamu nastavitev na levi strani kontrolne enote izberemo nastavitev udarni volumen (Str.V.) – obarva se modro. Kontrolna enota bo zapisovala spremembe pretoka krvi glede na spremembe udarnega volumna. 2. Z izbiro oznak (+) oz. (–) nastavimo začetni volumen (Start) na 120 ml in končnega (End) na 110 ml, zato je udarni volumen 10 ml. Med celotnim poskusom naj bo tlak v levem valju 40 mm Hg, tlak črpalke 120 mm Hg in tlak v desnem valju 80 mm Hg. Polmer obeh cevi naj bo 60 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 3 mm, število črpanj pa 10. 3. Z ukazom Auto Pump poženemo črpalko. Tekočina se skozi črpalko prečrpa iz levega v desni valj. Po 10 črpanjih se v prikazih Flow in Rate prikaže vrednost pretoka krvi (ml/min) in frekvence črpalke (črpanja/min). Rezultate zapišemo. Z ukazom Refill ponovno napolnimo levi valj. 4. Z zmanjševanjem končnega volumna postopoma povečujemo udarni volumen za 10 enot, dokler ni dosežen največji možni udarni volumen (120 ml). 5. Rezultate zapišemo v spodnjo tabelo. b) Naloge: 1. Rezultate meritev uporabite za pripravo grafikona, ki prikazuje učinek udarnega volumna na frekvenco srca (abscisa: udarni volumen [ml], ordinata: frekvenca srca [n/min])! 2. Na osnovi dobljenih rezultatov odgovorite na spodnja vprašanja:  Kaj se zgodi s frekvenco črpalke, če se njen udarni volumen poveča?  Kaj bi se zgodilo s tlakom med polnjenjem črpalke, če desni ventil ne bi tesnil? Če to apliciramo na srce, kaj bi se zgodilo, če ne bi tesnila aortna zaklopka?  Kaj bi se zgodilo, če bi se aortna zaklopka slabo odpirala? 2.3.2 Pretok krvi po žilah Dejavniki, ki vplivajo na kroženje krvi po krvnem obtoku, so krvni tlak, periferni odpor in viskoznost krvi. Razmerje med njimi opisuje Poiseuilleva enačba: ∆Pr4 ∆Q = 8ɳl ( Q – pretok krvi,  P – razlika v krvnem tlaku med dvema koncema žile, r – polmer žile,  – viskoznost krvi, l – dolžina žile) Iz enačbe lahko vidimo, da je pretok krvi premo sorazmeren polmeru krvne žile na 4. potenco, kar pomeni, da že majhne spremembe polmera vodijo v velike spremembe pretoka krvi. V organizmu je spreminjanje polmera krvnih žil učinkovit in občutljiv način uravnavanja pretoka krvi. Najpomembnejši dejavnik uravnavanja pretoka krvi pa je periferni odpor, ker lahko uravnava cirkulacijo v posameznih organih neodvisno od sprememb sistemskega krvnega tlaka. Viskoznost in dolžina krvnih žil se pri zdravih osebkih le malo spreminjata, zato je njun vpliv na pretok krvi majhen. Virtualni laboratorij za proučevanje odpora krvnih žil, ki ga prikazuje slika 2.7, odpremo z izbiro poglavja Kardiovaskularna dinamika (Cardiovascular Dynamics) v glavnem meniju programa. V virtualnem laboratoriju sta dva steklena valja, nameščena nad kontrolno enoto aparature. Z ukazom Start (pod levim valjem) začne kri teči iz levega valja (ki predstavlja srce) v desnega (ki predstavlja katerikoli organ) skozi cev, ki ju spaja in predstavlja aorto. Z ukazom Refill (pod ukazom Start) ponovno napolnimo levi valj in izpraznimo desnega. Eksperimentalne pogoje uravnavamo z izbiro oznak (+) ali (–) ob vsakem od ukazov, ki so na zgornjem delu kontrolne enote (Polmer (Radius), Viskoznost (Viscosity) in Dolžina (Lenghth)). Pod kontrolno enoto je enota za zapisovanje rezultatov. Te shranimo z ukazom Shrani rezultate (Record Data), zbrišemo pa z ukazom Odstrani vrstico (Delete Line) ali Odstrani rezultate (Clear Data Set). 61 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA Slika 2.7: Virtualni laboratorij za proučevanje pretoka krvi po žilah A) Učinki polmera cevi na pretok tekočine Z osnovnim poskusom bomo prikazali, kako na pretok krvi vpliva polmer krvnih žil. a) Postopek: 1. Iz menija poskusa izberemo ukaz Odpor žil (Vessel Resistance). V seznamu nastavitev na levi strani kontrolne enote izberemo nastavitev Polmer (Radius); oznaka se obarva modro. Kontrolna enota bo zapisovala spremembe pretoka krvi glede na spremembe polmera cevi. 2. Z izbiro oznak (+) oz. (–) izberemo polmer cevi 1 mm in viskoznost 1. Med celotnim poskusom naj bo krvni tlak 100 mm Hg, dolžina cevi pa 50 mm. 3. Z ukazom Start poženemo poskus. Ko se vsa kri pretoči iz levega v desni valj, na prikazu za pretok krvi (Flow (ml/min)) odčitamo vrednost pretoka in ga zapišemo. Z ukazom Refill ponovno napolnimo levi valj. 4. Polmer cevke postopoma povečujemo za 1 mm in vsakič ponovimo postopek, opisan v 3. točki, dokler ne dosežemo največjega polmera (6 mm). Rezultate zapišemo v spodnjo tabelo. Meritev 1. 2. 3. 4. 5. 6. polmer cevke 1 2 3 4 5 6 [mm] pretok krvi [ml/min] 62 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA b) Naloge: 1. Rezultate meritev uporabite za pripravo grafikona, ki prikazuje vpliv polmera krvne žile na pretok krvi (abscisa – polmer krvne žile [mm], ordinata – pretok krvi [ml/min])! 2. Na osnovi dobljenih rezultatov odgovorite na spodnja vprašanja:  Kaj se je dogajalo s pretokom krvi, ko smo povečevali premer cevi?  V poskusu smo simulirali mehansko spreminjanje premera cevi. Kako ta pojav poteka v organizmu? B) Učinek viskoznosti na pretok tekočin Kri je 3- do 4-krat bolj viskozna kot voda, katere relativna viskoznost je 1 (gl. vajo 6.3). Čeprav na viskoznost krvi vplivajo številni dejavniki, npr. dehidracija ali sprememba števila eritrocitov, je zaradi homeostatskih mehanizmov organizma zelo stabilna. Namen poskusa je prikazati, kaj se zgodi v kardiovaskularnem sistemu, kadar se ravnotežje mehanizmov za vzdrževanje viskoznosti krvi poruši. a) Postopek: 1. Izberemo izhodiščne pogoje poskusa, in sicer krvni tlak 100 mm Hg, polmer cevi 5 mm, viskoznost 1 in dolžino cevi 50 mm. 2. V seznamu nastavitev na levi strani kontrolne enote izberemo nastavitev Viscosity; oznaka se obarva modro. Kontrolna enota bo zapisovala spremembe pretoka krvi glede na spremembe viskoznosti tekočine. 3. Z ukazom Start poženemo poskus. Ko se vsa kri pretoči iz levega v desni valj, na prikazu za pretok krvi (Flow (ml/min)) odčitamo vrednost pretoka in ga zapišemo (Record Data). Z ukazom Refill ponovno napolnimo levi valj. 4. Viskoznost tekočine postopoma povečujemo za 1 enoto in vsakokrat ponovimo postopek, opisan v 3. točki, dokler ne dosežemo največje viskoznosti (10). Rezultate zapišemo v spodnjo tabelo. b) Naloge: 1. Rezultate meritev uporabite za pripravo grafikona, ki prikazuje vpliv viskoznosti na pretok krvi (abscisa – relativna viskoznost krvi, ordinata – pretok krvi [ml/min])! 2. Na osnovi rezultatov poskusa odgovorite na spodnja vprašanja:  Kako spreminjanje viskoznosti krvi vpliva na njen pretok?  Ali je spreminjanje pretoka tekočine premo ali obratno sorazmerno z viskoznostjo?  Kaj se zgodi s pretokom krvi, če se poveča/zmanjša število krvnih celic?  Kaj se zgodi s pretokom krvi, če v organizmu pride do dehidracije?  Razmislite, ali je spreminjanje viskoznosti smiselno za uravnavanje pretoka krvi po organizmu? Meritev 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. viskoznost 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 krvi pretok krvi [ml/min] 63 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA C) Učinek dolžine cevi na pretok tekočin Razen v obdobju rasti organizma se dolžina krvnih žil ne spreminja bistveno. V tem poskusu bomo proučevali fizikalno razmerje med dolžino cevi in pretokom tekočine in prikazali, kako se razlikuje pretok krvi v žilah enakega polmera, a različne dolžine. a) Postopek: 1. Nastavimo izhodiščne pogoje poskusa, in sicer krvni tlak 100 mm Hg, polmer cevi 5 mm, viskoznost 3,5 in dolžino cevi 10 mm. 2. V seznamu nastavitev na levi strani kontrolne enote izberemo nastavitev dolžine (Length); oznaka se obarva modro. Kontrolna enota bo zapisovala spremembe pretoka krvi glede na spremembe dolžine cevi. 3. Z ukazom Start poženemo poskus. Ko se vsa kri pretoči iz levega v desni valj, na prikazu za pretok krvi (Flow (ml/min) ) odčitamo vrednost pretoka in ga zapišemo (Record Data). Z ukazom Refill ponovno napolnimo levi valj. 4. Dolžino cevi postopoma povečujemo za 5 mm in vsakič ponovimo postopek, opisan v 3. točki, dokler ne dosežemo največje dolžine (50 mm). Rezultate zapišemo v spodnjo tabelo. Meritev 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. dolžina cevi 10 15 20 25 30 35 40 45 50 [mm] pretok krvi [ml/min] b) Naloge: 1. Rezultate meritev uporabite za pripravo grafikona, ki prikazuje vpliv dolžine žile na pretok krvi (abscisa – dolžina žile [mm], ordinata – pretok krvi [ml/min])! 2. Na osnovi dobljenih rezultatov odgovorite na spodnja vprašanja:  Kako dolžina cevi vpliva na pretok tekočine?  Razmislite, zakaj spreminjanje dolžine krvnih žil ni primeren način uravnavanja pretoka krvi v organizmu? Č) Učinek tlaka na pretok tekočin Razlike v krvnem tlaku na različnih področjih krvnega obtoka omogočajo tok krvi po žilah. S poskusom bomo prikazali, kako naraščanje krvnega tlaka vpliva na pretok krvi. a) Postopek: 1. Nastavimo izhodiščne pogoje poskusa, in sicer krvni tlak 25 mm Hg, polmer cevi 5 mm, viskoznost 3,5 in dolžino cevi 50 mm. 2. V seznamu nastavitev na levi strani kontrolne enote izberemo nastavitev tlaka (Pressure); oznaka se obarva modro. Kontrolna enota bo registrirala spremembe pretoka krvi glede na spremembe krvnega tlaka. 3. Z ukazom Start poženemo poskus. Ko se vsa kri pretoči iz levega v desni valj, na prikazu za pretok krvi (Flow (ml/min)) odčitamo vrednost pretoka in ga zapišemo (Record Data). Z ukazom Refill ponovno napolnimo levi valj. 4. Tlak postopoma povečujemo za 25 mm Hg in vsakič ponovimo postopek, opisan v 3. točki, 64 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA dokler ne dosežemo največjega tlaka (225 mm Hg). Rezultate zapišemo v spodnjo tabelo. Meritev 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. tlak 25 50 75 100 125 150 175 200 225 [mm Hg] pretok krvi [ml/min] b) Naloge: 1. Rezultate meritev uporabite za pripravo grafikona, ki prikazuje vpliv tlaka na pretok krvi (abscisa – krvni tlak [mm Hg], ordinata – pretok krvi [ml/min])!! 2. Na osnovi dobljenih rezultatov odgovorite na spodnja vprašanja:  Kako krvni tlak vpliva na pretok krvi?  Kakšen je potek krivulje na grafikonu v primerjavi z ostalimi poskusi?  Čeprav spreminjanje krvnega tlaka vpliva na pretok krvi, razmislite, zakaj ni tako učinkovito kot spreminjanje polmera žil! 2.3.3 Merjenje hitrosti gibanja krvi Hitrost gibanja krvi je odvisna od delovanja srca in stanja v krvnih žilah. V aorti je hitrost največja v času sistole, v času diastole pa pada. Poleg pulznih oscilacij na hitrost vpliva tudi oddaljenost od srca, zato je v aorti in velikih venah največja, v kapilarah pa najmanjša. Pri merjenju hitrosti pretoka krvi ločimo volumensko in linearno hitrost. Volumska hitrost je količina krvi, ki preteče v časovni enoti skozi krvno žilo določenega premera, linearna hitrost pa je hitrost, s katero kri oziroma delec krvi preide pot med dvema mestoma v žili. Za merjenje hitrosti pretoka krvi se uporabljajo različne aparature oziroma metode. Ena od skupin aparatov deluje na principu merjenja spremembe temperature. Aparati so izdelani tako, da preparirano žilo segrevamo na enem koncu in s termoelementom merimo temperaturo krvi na drugem. Temperaturna razlika je sorazmerna količini tekočine, ki preide skozi žilo. Poleg tega se uporablja tudi t. i. termična sonda. To je z električnim tokom segreta igla, ki jo vstavimo v krvno žilo. Hlajenje sonde merimo s termoelementom. Stopnja hlajenja je sorazmerna količini krvi, ki preide skozi žilo. V zadnjem času so izdelali naprave, s katerimi je mogoče meriti pretok krvi v intaktni žili. Ena od teh naprav je tudi elektromagnetni merilec pretoka krvi. Princip njegovega delovanja temelji na pojavu indukcije. Če naglo premikamo žico med poloma močnega magneta, se v vodniku pojavi indukcijski tok (slika 2.8). Podoben učinek dobimo, če postavimo žilo v magnetno polje. Ker se v krvi nahaja zelo veliko nabitih delcev, se pri gibanju teh skozi magnetno polje pojavi indukcijski tok, ki ga lahko zaznamo z ustreznim aparatom. Električna napetost je sorazmerna pretoku krvi. Ultrazvočni merilec hitrosti pretoka (slika 2.9) deluje na principu Dopplerjevega efekta. V osnovi aparat deluje kot proizvajalec ultrazvoka. Ta nastane zaradi delovanja električnega toka na kristal, ki prične vibrirati in oddajati ultrazvok frekvence nekaj milijonov Hz. Kristal je nameščen tako, da oddaja ultrazvok v smeri toka krvi. Zvok potuje vzdolž žile in pri tem zadene eritrocite, ki se oddaljujejo od izvora zvoka. Ko se zvok od njih odbije, potuje odbiti zvok nazaj proti kristalu. Frekvenca odbitih valov je nižja od emitiranih. Z merjenjem razlike v frekvenci oddanih in odbitih valov je možno določiti hitrost toka krvi. 65 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA Slika 2.8: Princip delovanja elektromagnetnega merilca pretoka krvi (a – nastanek elektromotorne sile v žici, ki se pomika skozi elektromagnetno polje, b – nastanek elektromotorne sile v elektrodah, nameščenih na krvni žili) Slika 2.9: Ultrazvočni merilec hitrosti pretoka krvi (kristali) (a – osnovna konstrukcija, b in c – moderna merilca pretoka krvi v velikih krvnih žilah) 2.3.4 Merjenje časa obtoka krvi Čas obtoka krvi je čas, ki je potreben, da kri preide celotni obtok in se vrne v isto žilo. Opisanih je nekaj metod določanja časa obtoka pri živalih in ljudeh. Pri živalih je bila dolgo časa poznana le metoda z uporabo Evansovega modrila. Po tej metodi je bilo potrebno anestezirani živali preparirati obe jugularni veni in v njiju vstaviti trajni kanili. V eno od ven so aplicirali barvilo, iz druge pa pustili počasi odtekati kri. Istočasno, ko so dajali barvilo, so sprožili štoparico. Ko se je v iztekajoči krvi pojavilo barvilo, so štoparico ustavili in izmerili čas. Pri modificirani metodi se živali preparira obe jugularni veni, pod eno se namesti belo (papirnato) podlago, v drugo pa vbrizga modrilo. Ob pojavu modre barve v veni z belo podlago se izmeri čas. Podobna je metoda z uporabo radioaktivnih izotopov. V eno od jugularnih ven damo izotop, na drugi pa merimo radioaktivnost. Kot izotop lahko uporabljamo K125J ali K131J, z radioaktivnim fosforjem (32P) ali tehnecijem (99mTc) markirane eritrocite in z radioaktivnim jodom (125J ali 131J) ali tehnecijem markirane serumske albumine. Pri tem je potrebno hitro injiciranje (v bolusu). Podobna je metoda za določanje časa obtoka pri laboratorijskih glodavcih z uporabo fluorescentnega uranina. Anestezirani podgani ali miši vbrizgamo v repno veno 0,5 ml uranina (natrijev fluorescinat 0,53 mol/l oz. 20 g/l) in ob dajanju vključimo štoparico. Zatem žival dvignemo tako, da visi s smrčkom navzdol. V zatemnjeni sobi ob osvetlitvi živali z ultravijolično svetlobo opazimo najprej fluorescenco uhljev, oči in smrčka, zatem prednjih in končno še zadnjih okončin. Ko se pojavi fluorescenca na zadnjih nogah, štoparico ustavimo. 66 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.4 SRČNI TONI Srčni toni so zvočni pojavi, ki spremljajo delo srca. So posledica delovanja srčnih zaklopk in vibracij, ki nastanejo ob delu srca. Te se prenašajo po tkivih, ki ležijo med srcem in površino prsnega koša, ta pa pri tem deluje kot resonator (jih ojača). Srčne tone lahko poslušamo neposredno (s stetoskopom) ali posredno (s fonendoskopijo in fonokardiografijo). 2.4.1 Poslušanje srčnih tonov Ob poslušanju dela srca lahko slišimo dva srčna tona: prvega ali sistoličnega in drugega ali diastoličnega, pri nekaterih živalskih vrstah pa še vzporedne srčne tone (tretjega in četrtega). Srčne tone moramo razlikovati od srčnih šumov – patoloških zvokov, ki nastajajo ob delu srca, če so npr. okvarjene srčne zaklopke. Prvi (sistolični) srčni ton nastane v času sistole prekatov, ko se srčna mišica skrči in se zapirajo atrioventrikularne zaklopke. Dejavniki za njegov nastanek so zapiranje atrioventrikularnih zaklopk in napenjanje kitastih vrvic ( chorde tendinei), vibriranje miokarda prekata, odpiranje semilunarnih zaklopk ter vibriranje aorte in a. pulmonalis neposredno po zapiranju zaklopk. Vpliv na intenzivnost tona imajo ekstrakardialni faktorji (debelost, razvitost prsnih mišic) in kardialni faktorji (položaj zaklopk, intenzivnost fizičnega dela). Drugi (diastolični) srčni ton nastane ob diastoli prekatov, ko se srčna mišica sprosti in se zapirajo semilunarne zaklopke pod vplivom pritiska krvi iz a. pulmonalis in aorte. Faktorji za njegov nastanek so zapiranje semilunarnih zaklopk, vibracije krvi, sten pljučne arterije in aorte. Vpliv na jakost drugega srčnega tona ima višina arterijskega tlaka. Tretji srčni ton nastane v zgodnji fazi diastole zaradi predhodnega odpiranja atrioventrikularnih zaklopk in vibracij sten prekata ob polnjenju s krvjo. Pogost je pri konju in muli. Četrti srčni ton nastane med sistolo preddvorov; slišimo ga lahko pri konju, muli, oslu, mački in govedu. Naloge:  S stetoskopom poslušajte srčne tone pri človeku in različnih vrstah domačih živali! 2.4.2 Fonokardioskopija in fonokardiografija Registracija srčnih tonov je možna tudi z električnim ojačanjem zvoka, ki ga izvajamo s fonendoskopom. Mikrofon fonendoskopa namestimo na površino prsnega koša. Srčne tone lahko tudi grafično zapišemo z aparatom, imenovanim fonokardiograf; metoda se imenuje fonokardiografija, zapis pa fonokardiogram. S fonokardiografijo lahko zapišemo in natančneje analiziramo srčne tone, njihov pričetek v srčnem ciklusu, trajanje in natančno število kakor tudi amplitudo in frekvenco vibracij v posameznem tonu. S srčnim katetrom, ki ga uvedemo neposredno v srce, pa izvajamo intrakardialno fonokardiografijo. Zapis srčnih tonov temelji na sledečem principu. Vibracije, ki bi sicer delovale na timpanično membrano ušesa pri avskultaciji ali fonendoskopiji, zazna mikrofon, katerega nihanje lahko registriramo z ustreznim elektronskim sistemom. Sodobni, računalniško podprti fonokardiografi lahko ojačajo in ustrezno analizirajo poljuben sektor zapisa. 67 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA Normalni fonokardiogram običajno prikaže prvi srčni ton kot samostojno skupino hitrih vibracij, kjer hitro nastopi maksimalna amplituda in prav tako naglo izgine. Traja običajno 0,10 do 0,17 sekund s frekvenco oscilacij med 25 in 50 v sekundi. Pričetek prvega srčnega tona sovpada s pričetkom ventrikularne sistole. Natančnejše analize prvega srčnega tona so pokazale, da sestoji iz dveh delov. Prvi del se ujema z izometrično kontrakcijo ventrikla, zato se imenuje izometrična komponenta, drugi del pa se ujema z ejekcijo krvi iz ventrikla, zato ga imenujemo ejekcijska komponenta prvega srčnega tona. Drugi srčni ton je zapisan kot skupina štirih do šestih vibracij z velikimi amplitudami in traja okoli 0,14 do 0,16 sekund. Njegov pričetek se ujema s pojavom zobca na zapisu aortnega oziroma centralnega arterijskega pulza (glej vajo 2.6). Tudi drugi srčni ton se na fonokardiogramu pogosto prikaže kot skupina dveh ločenih zapisov. Nastane kot posledica asinhronega zapiranja semilunarnih zaklopk na aorti in pljučni arteriji. Tretji srčni ton se ujema s končno fazo hitrega polnjenja srca. Medtem ko nekateri avtorji menijo, da je ton samostojen, ga drugi prištevajo k drugemu srčnemu tonu. Četrti srčni ton je po nekaterih avtorjih dejansko začetni ton in ga imenujejo fiziološki avrikularni ali atrijski ton. Nastane kot posledica vibracije ventriklov po vstopu krvi iz atrijev. Pri natančni analizi je ugotovljeno, da vsebuje do štiri komponente. Naloge:  Shematično narišite fonokardiogram in označite elemente! 68 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.5 MINUTNI VOLUMEN SRCA Količino krvi, ki izhaja iz srca, lahko izrazimo kot sistolični ali kot minutni volumen. Sistolični ali udarni volumen srca je količina krvi, ki jo srce iztisne v eni sistoli. Z drugimi besedami je to razlika med volumnom srca na koncu diastole (končni diastolični volumen) in volumnom srca na koncu sistole (končni sistolični volumen). Minutni volumen pa je količina krvi, ki jo srce prečrpa v času ene minute. Soodvisnost med sistoličnim in udarnim volumnom lahko izrazimo takole: MV = SV × fs (MV – minutni volumen srca, SV – sistolični volumen srca, fs – frekvenca srca) Ker je tehnično lažje izvedljivo merjenje minutnega volumna srca kot sistoličnega, običajno izmerimo minutni volumen, sistoličnega pa izračunamo. Za merjenje minutnega volumna so znane neposredne (kirurške ali krvave) in posredne (kemične in dilucijske) metode. 2.5.1 Kirurške metode merjenja minutnega volumna srca Pri kirurških metodah lahko uporabljamo merilce pretoka krvi (opisani v vaji 2.3.3), ki jih vstavimo neposredno v aorto. Metode so grobe, zato so uporabne samo za nekatere poskuse. 2.5.2 Kemične metode merjenja minutnega volumna srca Kemične metode so uporabne pri živalih in tudi pri ljudeh. Temeljijo na direktnem Fickovem principu, ki izhaja iz dejstva, da je pri uravnovešeni porabi O2 oziroma nastajanju CO2 količina O2, ki se veže v pljučih, ali količina CO2, osvobojena v eni minuti, enaka količini O2, ki se je vezala na hemoglobin, ali volumnu CO2, ki je nastal v istem času. Primer opisuje določanje minutnega volumna na osnovi določanja O2. Volumen O2, vezanega v pljučih, znaša: VpO2 = (FinsO2 – FexpO2) × Vmin (VpO2 – količina kisika, vezanega v pljučih, FinsO2 – volumen kisika v vdihanem zraku, FexpO2 – volumen kisika v izdihanem zraku, Vmin – minutni volumen ventilacije) Količina kisika v krvi znaša: VkO2 = (FaO2 – FvO2) × MV (VkO2 – količina kisika v krvi, FaO2 – koncentracija kisika v arterijski krvi, FvO2 – koncentracija kisika v venski krvi, MV – minutni volumen) Če torej menimo, da sta vrednosti količine kisika v pljučih in količina kisika v krvi enaki, lahko to zapišemo: (FinsO2 – FexpO2) × Vmin = (FaO2 – FvO2) × MV torej je minutni volumen (F MV = ins O2 − Fexp O2) × V (F min a O2 − Fv O2) Določanje minutnega volumna se tehnično izvede tako, da se izmeri minutni volumen pljučne ventilacije, koncentracija O2 v vdihanem in izdihanem zraku ter v arterijski in venski krvi. Izmerjene vrednosti se vstavi v formulo. Na podoben način lahko določimo minutni volumen tudi z merjenjem CO2. Metode na osnovi indirektnega Fickovega principa so izvedene tako, da oseba ali žival vdihne točno določeno količino nekega nevtralnega plina, kot npr. acetilena ali N2O, nakar se izmeri njegova koncentracija v krvi in izdihanem zraku. 69 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.5.3 Dilucijske metode merjenja minutnega volumna srca Dilucijske metode temeljijo na določanju stopnje razredčitve (dilucije) v kri vbrizganega indikatorja. Kot indikator lahko uporabljamo koloidna barvila, npr. Evansovo modrilo, srčno zelenilo (cardio green) ali serumske albumine, označene z radioaktivnim izotopom. Indikator je potrebno vbrizgati v veno ali s katetrom neposredno vnesti v desno srce. Poleg tega pa je potrebno kanilirati arterijo in iz nje v krajših časovnih zaporedjih jemati vzorce krvi, v katerih se določi koncentracija barvila. Na absciso koordinatnega sistema nanašamo čas odvzema posameznih vzorcev, na ordinato pa koncentracije barvila v njih. Tako dobimo parabolično krivuljo, ki ponazarja spremembo koncentracije barvila v določenem časovnem obdobju. Čas [s] Slika 2.10 : Krivulja spreminjanja koncentracije barvila pri dilucijski metodi merjenja minutnega volumna srca (razlaga je v tekstu) Na zgornji krivulji na sliki 2.10 vidimo, da se je barvilo pojavilo v arterijski krvi približno 3 sekunde po injiciranju. Nato koncentracija barvila narašča in doseže maksimalno vrednost v približno 6 do 7 sekundah. Sledi nagel padec koncentracije, vendar se ne pade na ničlo, pač pa se za dalj časa ustali na določeni vrednosti. Vzrok temu je ponovno vračanje barvila s krvjo skozi srce v arterijski obtok. Da bi določili, kdaj bi se krivulja spustila na ničelno vrednost, padajoči del krivulje ekstrapoliramo do abscise. Tako lahko precej točno ocenimo čas, potreben, da srce odstrani vse vbrizgano barvilo. Nato izračunamo povprečno koncentracijo barve v mililitru krvi v času trajanja krivulje. Minutni volumen nato lahko izračunamo s formulo: MV = Bi × 60 C × t (MV – minutni volumen srca [ml/min], Bi – injicirano barvilo [mg], C – povprečna koncentracija barvila v ml krvi v času trajanja krivulje [mg/ml], t – čas trajanja krivulje [s]) Naloga:  Izračunajte minutni volumen srca na osnovi obeh grafikonov dilucijske metode na sliki 2.10! 70 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.6 PULZ 2.6.1 Merjenje pulza pri domačih živalih in pri človeku Pulz je posledica ritmičnih oscilacij arterijskih sten, ki nastane zaradi spreminjajočega se krvnega tlaka v njihovem lumnu. Dejansko gre za prenos širjenja sten aorte ob sistoli in njihovega vračanja v prvotni položaj ob diastoli. V obliki valov se to širjenje prenaša vzdolž arterij vse do arteriol. Število utripov v časovni enoti je identično številu srčnih kontrakcij. Merjenje pulza se uporablja pri diagnostiki različnih bolezenskih stanj srca in krvnega obtoka. Pri pulzu ugotavljamo njegovo frekvenco (število utripov v minuti), ritem (kako si srčni utripi slede) in kvaliteto (jakost pulza, napolnjenost arterij). Pri nekaterih domačih živalih, npr. pri psu, ovci in kozi, je ritem fiziološko pogosto nepravilen. Pulz najenostavneje merimo s palpacijo na dostopnih, površinskih arterijah (pri konju in govedu – a. mandibularis, pri manjših živalih, npr. psu, mački – a. femoralis, pri človeku – a. radialis), kjer preštejemo število utripov v časovni enoti (v eni minuti). Pulz lahko registriramo tudi mehansko, s pomočjo enostavnih ali tudi bolj zapletenih sfigmografov. Krivulja, ki jo pri tem dobimo, se imenuje sfigmogram in jo prikazuje slika 2.11. Vzpenjajoči se del krivulje imenujemo anakrotni, padajoči del pa katakrotni del. Anakrotni del je posledica naglega dviga tlaka v žili, ki nastane zaradi sistole srca. Na katakrotnem delu je najprej viden padec tlaka kot posledica odtekanja krvi na periferijo, zobec na tem delu krivulje (katakrotna elevacija ali dikrotni zobec) pa je posledica pulzacije aortne stene zaradi povečanja tlaka pri odbijanju krvi od zaprtih semilunarnih zaklopk. Slika 2.11: Sfigmogram 1 – anakrotni del, 2 – dikrotni zobec na katakrotnem delu Naloge: 1. Izmerite svoj pulz ob mirovanju in po fizičnem naporu! 2. Ugotovite, v kolikem času po fizičnem naporu se pulz vrne na začetno vrednost! 71 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.6.2 Hitrost širjenja pulznega vala Pulzni val pomeni časovno zakasnitev pulza med dvema mestoma na ožilju. Hitrost širjenja pulznega vala izmerimo tako, da na dveh, od srca različno oddaljenih mestih istočasno registriramo pulz. a) Material:  poskusna oseba, kimograf, opremljen z Mareyevima bobnoma za registracijo pulza (slika 2.12), meter. b) Postopek: Nad arterijo radialis na nadlakti namestimo manšeto, ki je s cevjo povezana z enim od Mareyevih bobnov. Na golen poskusne osebe namestimo manšeto, ki je po vmesnem delu povezana z drugim Mareyevim bobnom, in jo napolnimo z zrakom. Pisali obeh Mareyevih bobnov naj bosta eno nad drugim na isti navidezni vertikalni črti. Izmerimo razdaljo od srca do mesta meritve na a. radialis in do mesta meritve na a. tibialis. Ko sprožimo kimograf, Slika 2.12: Merjenje hitrosti širjenja pulznega vala obenem zapišemo čas. Pri pri človeku zapisovanju pulzov na obeh mestih (K – kimograf, MK – Mareyev boben, M – manometer, P vidimo, da se pulz na a. tibialis pojavi – zračna črpalka, r – manšeta na roki, n – manšeta na kasneje kot na a. radialis. nogi) Zapišemo ali izračunamo časovni zaostanek na obeh mestih. Pri izračunu ocenjujemo, kot da sta obe mesti na isti žili in na osnovi časovne razlike in razdalje med njima izračunamo hitrost širjenja pulznega vala po formuli: Vp = ds/dt (Vp – hitrost širjenja pulznega vala, ds – razdalja med obema mestoma, dt – časovna razlika pri registraciji obeh pulzov) 72 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.7 MERJENJE KRVNEGA TLAKA 2.7.1 Neposredno merjenje krvnega tlaka v arteriji karotis pri kuncu Neposredno merjenje krvnega tlaka (krvava metoda) je bil prvi način, s katerim je bil leta 1776 izmerjen krvni tlak v a. femoralis pri konju. Danes se ta metoda uporablja pri eksperimentalnem delu, pri ugotavljanju vpliva nekaterih farmakoloških snovi na krvni tlak in pri dolgotrajnih kirurških posegih (v veterinarski medicini predvsem pri psih). a) Material:  kunec, operacijska mizica, pribor za operacijo, kimograf, živosrebrni manometer, respiratorni boben, stimulator, uretan (mkc 250 g/L), Ringerjeva raztopina za toplokrvne živali, acetilholin, adrenalin. b) Postopek:  Prepariranje: 1. Kunca narkotiziramo in ga fiksiramo na operacijsko mizico. 2. Pripravimo in izprepariramo operacijsko polje na vratu. 3. Izprepariramo n. vagus; z vodilom napeljemo pod živcem zanko, ne da bi jo zategnili. 4. Izprepariramo sapnik, ga prerežemo in vstavimo traheotubus. 5. Izprepariramo a. carotis: na dveh mestih pod žilo nastavimo zanki, s prijemalko za žilo pa preprečimo cirkulacijo v a. carotis. Nato zadrgnemo proksimalno zanko in zarežemo v arterijo; skozi zarezo vanjo potisnemo žilno kanilo in jo podvežemo z distalno zanko. Slika 2.13: Shematični prikaz neposrednega merjenja krvnega tlaka v a. carotis pri kuncu (K – kimografski valj, R – respiratorni boben, M – živosrebrni manometer, t – traheotubus, a – a. carotis com., s – sapnik, k – žilna kanila, r – steklena cevka s fiziološko raztopino, ž – živo srebro, p – plovec s pisalko) 73 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA  Namestitev na kimograf: 1. Traheotubus povežemo z respiratornim bobnom. Ko vanj prihaja izdihani zrak, se nabori raztegnejo (dvig krivulje na kimografu), ob vdihu pa skrčijo (krivulja se spusti). 2. Žilno kanilo z gumijasto cevko, napolnjeno z Ringerjevo raztopino, povežemo z živosrebrnim manometrom. Odpremo prijemalko za žilo in omogočimo dotok krvi v cevko oziroma v manometer. Spremembe tlaka, ki nastajajo v a. carotis, se neposredno prenašajo po Ringerjevi raztopini na živo srebro v U cevki. V drugem kraku manometra je plovec s čvrstim pisalom, ki zapisuje spremembe na kimografski valj. Ob sistoli srca se zapis krivulje dvigne, ob diastoli pa pade.  Registracija: Na zapisu bomo opazovali dve krivulji: krivuljo krvnega tlaka in krivuljo dihanja. Ob zapisu krvnega tlaka registriramo 3 stopnje oscilacij: – Oscilacije I. reda (pulzne) ustrezajo spremembam krvnega tlaka v času sistole in diastole levega ventrika. Arterijski tlak je največji v času sistole ventriklov, ko se pozitivni val tlaka z veliko hitrostjo prenese na arterije. V času diastole pa krvni tlak pade, vendar ne na 0 kot v ventriklih, pač pa zaradi elastičnosti arterij samo do neke določene, relativno visoke vrednosti (diastolični tlak). – Oscilacije II. reda (respiratorne) so posledica sprememb krvnega tlaka zaradi dihanja. V času vdiha, ko se zniža intratorakalni tlak, je pritekanje krvi v srce olajšano in iztiskanje oteženo, v času izdiha pa je obratno. Na krvni tlak vpliva dihanje tudi po živčnem sistemu zaradi draženja presoreceptorjev v loku aorte in karotidnem sinusu ob širjenju pljuč med vdihom. Glede na to, kateri od faktorjev prevladuje, se krvni tlak nekoliko poveča med vdihom ali izdihom. Pri človeku nastopi rahel dvig krvnega tlaka (za nekaj mm Hg) ob vdihu, padec pa ob izdihu. Pri živalih pa pride do padca krvnega tlaka ob vdihu (ob tem se pri kanidih poveča tudi frekvenca srca), in do dviga krvnega tlaka ob izdihu. – Oscilacije III. reda (vazomotorične) so odvisne od vzdraženja vazomotoričnih centrov in v zvezi s tem od vzdraženja vazomotoričnih vlaken krvnih žil. Lahko jih opazimo le pri dolgotrajnem registriranju krvnega tlaka ali pa pri umetno izzvanih spremembah v vazomotorni regulaciji krvnega tlaka.  Vpliv različnih faktorjev na arterijski tlak: – Draženje vagusa: Z elektrodo se dotaknemo izprepariranega živca. Nastopi padec krvnega tlaka zaradi upočasnjenega delovanja srca (zmanjšanje minutnega volumna srca, periferna vazodilatacija). – Dajanje adrenalina: Zaradi pojačanega dela srca in krčenja perifernih krvnih žil nastopi hiter dvig krvnega tlaka. Podoben učinek bi izzvalo draženje simpatikusa. – Dajanje acetilholina: Zavira delo srca, povzroča delno širjenje sistemskih krvnih žil in zato nastopi padec krvnega tlaka. c) Naloge: 1. Narišite registracijske zapise krvnega tlaka takoj po preparaciji in ob delovanju različnih faktorjev! 2. Na osnovi kimografskega zapisa ugotovite in izračunajte spremembe v krvnem tlaku in dihanju po draženju vagusa in dajanju obeh raztopin! 3. Razložite nastale spremembe! 74 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.7.2 Natančno merjenje krvnega tlaka Z neposrednimi (krvavimi) metodami je mogoče meriti majhne in nagle spremembe krvnega tlaka. Meritve omogočajo posebne naprave – pretvorniki ( transducerji) , ki mehanske spremembe tlaka pretvorijo v električne signale. Te ustrezni elektronski aparati zaznajo in registrirajo (npr. osciloskop in oscilograf) ali pretvorijo iz analogne v digitalno obliko. Na sliki 2.14 so prikazani trije modeli pretvornikov. Vsem je skupno, da skozi iglo vstopa kri v majhno komorico, pokrito s tanko membrano. Sprememba tlaka v krvni žili povzroči spremembo tlaka v komorici, zato se membrana premakne. Pretvornik A deluje na principu . kondenzatorja. Nad membrano je kovinska plošča, kateri se membrana približa, kadar naraste tlak v komorici. Pri tem se spremeni električna kapaciteta med ploščo in membrano, ki jo primeren aparat lahko zazna. Na membrani pretvornika B je drobna železna palčka, ki se skladno z membrano premika v tuljavo ali iz nje. Pri tem nastane indukcijski tok, ki ga je Slika 2.14: Tipi pretvornikov za zapisovanje mogoče registrirati. sprememb krvnega tlaka (razlaga je v tekstu) V pretvorniku C je nad membrano napeta tanka žica, ki deluje kot upornik. Ko se žica raztegne, njen upor raste, ko se krči, pa pada. Spremembe v upornosti zazna ustrezen elektronski sistem. Prav tako je mogoče na membrano namestiti drobno zrcalo in vanj usmeriti snop svetlobnih žarkov. Ti se odbijajo in padajo na premikajoči se fotografski papir, na katerem puščajo sled. 2.7.3 Posredno merjenje krvnega tlaka A) Posredno merjenje krvnega tlaka pri človeku Krvni tlak je produkt dela srca (srčnega outputa) in odpora krvnega obtoka. Zaradi ritmičnega delovanja srca prihaja kri v krvni obtok v sunkih. S to metodo merimo krvni tlak v arterijah, pri čemer dobimo dve vrednosti: višji – sistolični tlak je posledica sistole ventriklov, nižji – diastolični tlak pa nastane v diastoli, tik pred naslednjo kontrakcijo ventrikla. Povprečni ali srednji krvni tlak izračunamo po formuli: P = D + ⅓(S – D) (P – povprečni krvni tlak, D – diastolični tlak, S – sistolični tlak) Na vrednosti krvnega tlaka vplivajo starost, spol, teža, zdravstveno stanje in fizično delo osebkov. Vrednost krvnega tlaka se izraža v milimetrih živega srebra [mm Hg], po mednarodnem merskem sistemu (SI) pa v kilopaskalih [kPa]. Merjenje krvnega tlaka temelji na principu, da je tlak v manšeti, ki ovija roko, enak tistemu v žili ( a. brachialis). Metodo je uvedel in izpopolnil italijanski zdravnik Riva-Rocci, po katerem se tudi imenuje. V humani medicini je posredno merjenje krvnega tlaka sestavni del vsakega pregleda, vedno pogosteje pa se uporablja tudi v veterinarski medicini. Naprava za merjenje krvnega tlaka pri človeku (sfigmomanometer) je sestavljena iz gumijaste 75 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA manšete, ki se ovije okoli nadlakti, zračne tlačilke za vpihavanje zraka v manšeto, živosrebrnega manometra ali aneroida, sistema cevi in ventilov. Pri merjenju krvnega tlaka potrebujemo tudi stetoskop. a) Postopek: 1. Manšeto ovijemo okoli nadlakti, medtem ko je roka naslonjena na mizo. 2. Z gumijasto črpalko napolnimo manšeto. 3. Z ventilom na črpalki pričnemo spuščati zrak iz manšete, obenem prislonimo stetoskop na notranjo stran komolčnega pregiba, kjer poteka a. brachialis. 4. Ko v določenem trenutku zaslišimo utripu podobne šume (Korotkove šume), odčitamo tlak. To je sistolični krvni tlak. 5. Nadaljujemo s spuščanjem zraka iz manšete, dokler šumi ne prenehajo; tedaj zopet odčitamo tlak – to je diastolični krvni tlak. Razlaga: Ko smo napolnili manšeto z zrakom, se je pretok krvi v a. brachialis ustavil. Pri spuščanju zraka iz manšete popušča pritisk na arterijo, dokler tlak v arteriji ne prevlada tlaka v manšeti. Tedaj se arterija nekoliko odpre in v njej se prične vzpostavljati pretok krvi, vendar le ob največjem, torej sistoličnem tlaku. Pri tem nastajajo turbulentna gibanja krvi, ki jih slišimo s stetoskopom, imenujemo pa jih Korotkovi šumi. Pri nadaljnjem popuščanju tlaka v manšeti se arterija vedno bolj širi, dokler ne doseže normalnega premera; tedaj pretok krvi v njej postane laminaren, šumi pa izginejo, ker kri prehaja skozi arterijo tudi v fazi diastole (diastolični tlak). b) Naloge: 1. Shematično narišite sfigmomanometer! 2. Izmerite sistolični in diastolični tlak v mirovanju in po obremenitvi in razložite nastale spremembe! B) Posredno merjenje krvnega tlaka pri živalih Krvni tlak pri velikih in majhnih sesalcih je približno enakega velikostnega reda. Ker so pri velikih živalih arterije bistveno daljše kot pri majhnih, bi pričakovali, da je pri velikih živalih tudi njihov odpor večji, kar pa ni res. Pri velikih živalih teče kri velik del krvnega obtoka po dolgih, širokih žilah, ki nudijo toku krvi le majhen odpor. Za premagovanje tega je potrebna le majhna sila. Dolžina arteriol in kapilar pa je pri vseh živalih približno enaka, zato je tudi odpor toku krvi v teh žilah približno enak. Zato pa tudi ni treba, da bi bil krvni tlak pri velikih živalih večji kot pri majhnih. Izjema pri tem je žirafa: zaradi premagovanja velike višinske razlike med srcem in možgani (približno 3 m) je potreben visok arterijski tlak. Princip posrednega merjenja krvnega tlaka pri živalih je podoben kot pri ljudeh. Tlak merimo na a. femoralis pri psih ali na repni arteriji ( a. coccigealis) pri velikih in nekaterih laboratorijskih živalih, npr. pri podganah. Aparat za merjenje krvnega tlaka pri živalih je podoben tistemu, ki se uporablja pri ljudeh in je sestavljen iz gumijaste manšete, zračne tlačilke, manometra in cevi, namesto stetoskopa pa uporabljamo ultrazvočni merilec, ki temelji na Dopplerjevem efektu. Sonda, ki jo prislonimo na žilo distalno od manšete, oddaja ultrazvočne signale in jih tudi sprejema. Te signale aparat pretvarja v zvočne, ki jih lahko poslušamo po zvočniku ali s slušalkami. Pri tem načinu merjenja diastoličnega tlaka zvok ne izgine, pač pa se le spremeni njegova frekvenca. Zato je diastolični tlak nekoliko težje določiti kot pri ljudeh. 76 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.7.4 Vpliv nekaterih dejavnikov na delovanje srca in krvni tlak pri človeku A) Opazovanje venskega tlaka Razlike v krvnem tlaku v različnih venah so pomembne za tok krvi v smeri proti srcu. V najmanjših venah je tlak okoli 2 kPa (15 mm Hg), v večjih okoli 1 kPa (7,5 mm Hg), v velikih dovodnicah pa 0 kPa. V venskem obtoku je pomemben tudi vpliv hidrostatičnega tlaka. Ta je posledica delovanja sile težnosti na kri. V delih telesa, ki so nad nivojem desne polovice srca, hidrostatični tlak pripomore k boljšemu dotoku krvi proti srcu, v delih pod nivojem desne polovice srca pa se toku krvi zoperstavlja. a) Postopek: 1. Opazujte in zapišite stopnjo napolnjenosti ven na roki in dlani, ko roko držite: o iztegnjeno v višini srca: .......................................................................................................... o nad glavo: ............................................................................................................................... o spuščeno ob telesu: ............................................................................................................... 2. Postavite se pred tablo s koščkom krede v roki. Držite roko spuščeno ob telesu, dokler se vene ne napolnijo. Dvignite iztegnjeno roko na višino srca (vene na roki bodo še vedno napolnjene) in označite položaj roke na tabli. 3. Pomočnik naj vam dviga roko, dokler se vene ne izpraznijo. Višino naj označi na tabli. 4. Izmerite razdaljo med obema točkama (v cm): ………………………………………… b) Naloge:  Izračunajte venski tlak v mm Hg (kPa) po formuli: 1,055 P = (d – 10) × × 10 13,55 (d – razdalja med obema točkama [cm], 10 – odpor krvnih žil [cm krvi], 1,055 – gostota krvi, 13,55 – gostota živega srebra) B) Vpliv ohladitve na pulz in arterijski krvni tlak Poskus prikazuje spremembo krvnega tlaka zaradi stresa, ki nastane pod vplivom okolja. Test so včasih uporabljali za odkrivanje potencialnega povišanega krvnega tlaka pri ljudeh, pri čemer je povišanje sistoličnega in/ali diastoličnega tlaka za več kot 23 mm Hg (3,06 kPa) pomenilo hiperreakcijo. Povečanje udarnega volumna srca (pozitivno inotropno delovanje), ki nastane kot reakcija na stres, prispeva k povečanju sistoličnega tlaka. Spremembe frekvence srca in perifernega odpora pa povzročijo dvig diastoličnega tlaka. Ker se srčna frekvenca poveča, ko naraste arterijski tlak, te spremembe niso posledica refleksa mehanoreceptorjev (baroreceptorjev). a) Ekipa:  poskusna oseba, merilec pulza, merilec krvnega tlaka, časomerilec, zapisnikar. b) Oprema:  vedro ledeno mrzle vode, sfigmomanometer, stetoskop, štoparica. c) Postopek: 1. Poskusna oseba naj mirno sedi. Na levo roko ji namestimo manšeto sfigmomanometra. Izmerite (3- do 5-krat v obdobju 5 min): o normalen krvni tlak ............................................................................................................ 77 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA o pulz ...................................................................................................................................... 2. Poskusna oseba naj potopi prosto roko v ledeno vodo za 60 sekund. Izmerite (ob potopitvi, po 30 sekundah in po 1 minuti): o krvni tlak ........................................................................................................................... o pulz .................................................................................................................................... 3. Poskusna oseba naj vzame roko iz vode. Izmerite (v enominutnih intervalih, dokler se ne povrneta na izhodiščno vrednost): o krvni tlak ........................................................................................................................... o pulz .................................................................................................................................... č) Naloge: 1. Rezultate meritve vnesite v grafikon (čas – abscisa, krvni tlak – ordinata)! 2. Odštejte povprečni pulz oz. krvni tlak pred potopitvijo roke od vrednosti, izmerjenih po potopitvi roke! Ta vrednost predstavlja indeks labilnosti krvnega tlaka. C) Valsalvin manever Poskus prikazuje odvisnost med vračanjem venozne krvi v srce, udarnim volumnom in arterijskim tlakom. Po kompresiji abdominalne v. cave se vračanje venske krvi v srce najprej poveča (za 1–5 sekund), nato pa zmanjša (za 5–60 sekund), kar vodi do padca sistoličnega in diastoličnega tlaka. Padajoči venski tlak sproži refleks baroreceptorjev (mehanoreceptorjev) in poveča srčno frekvenco. Po sprostitvi abdominalne kontrakcije se proces obrne in opazimo lahko povečanje arterijskega tlaka. a) Ekipa:  poskusna oseba, merilec pulza, merilec krvnega tlaka, časomerilec, zapisnikar. b) Oprema:  sfigmomanometer, stetoskop, štoparica ali ura s sekundnim kazalcem. c) Postopek: 1. Poskusna oseba naj udobno sedi. Izmerite 5 × v enominutnih intervalih: o krvni tlak ................................................................................................................................... o pulz ............................................................................................................................................ 2. Poskusna oseba naj izdihne, močno napne abdominalno muskulaturo in zadrži dihanje 30 sekund. Izmerite (v času 5 min po koncu abdominalne kontrakcije): o krvni tlak (v 30-sekundnih intervalih) ....................................................................................... o pulz (v 10-sekundnih intervalih (utripi/10 sek × 6 = frekvenca na minuto)) ............................ č) Naloge:  Zapišite rezultate in meritve vnesite v grafikon (čas – abscisa, krvni tlak – ordinata)! 78 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA Č) Vpliv položaja telesa na pulz in arterijski krvni tlak Poskus prikazuje spremembe frekvence srca in krvnega tlaka zaradi sprememb v položaju telesa, ki jih večinoma povzroči ortostatična reakcija. Pri tem procesu inhibicija vračanja venske krvi v srce (ob ležanju) vzdraži baroreceptorje v karotidnem sinusu, ki preko vazomotoričnega centra povečajo vpliv simpatikusa na srce. Njegova hronotropna komponenta se kaže kot povečanje frekvence srca. Zato ima reakcija refleksno komponento. Nasprotno pa med vadbo povečan ergotropni učinek pospeši delovanje srca. Metabolične spremembe, ki ob tem nastanejo, potrebujejo določen čas, da se povrnejo na izhodiščno raven. Zato je upadanje frekvence srca po vadbi počasno. a) Ekipa:  poskusna oseba, časomerilec, merilec pulza, merilec krvnega tlaka, zapisnikar. b) Oprema:  sfigmomanometer, stetoskop, štoparica ali ura s sekundnim kazalcem. c) Postopek: 1. Namestite sfigmomanometer na levo roko poskusne osebe in izmerite krvni tlak, kakor je navedeno v protokolu. Prav tako merite pulz na desni radialni arteriji eno celo minuto ali po navodilih v protokolu. Ko začnete s poskusom, ga ne smete prekinjati. 2. Poskusna oseba naj udobno sedi. Izmerite pulz in arterijski krvni tlak. 3. Poskusna oseba naj se uleže. Izmerite: o pulz prvo minuto ležanja ………………………………………………………………………………..…….……….. o pulz drugo minuto ležanja …………………………………………………………………………..…………………. o pulz in krvni tlak tretjo minuto ležanja ……………………………………………………………..……………. 4. Poskusna oseba naj se usede. Izmerite: o pulz prvo minuto mirnega sedenja ……………………………………………………………….…………….. o pulz drugo minuto mirnega sedenja …………………………………………………………………….……… o pulz in krvni tlak tretjo minuto mirnega sedenja ………………………………………………….……... 5. Poskusna oseba naj vstane. Izmerite: o pulz prvo minuto stanja ………………………………………………………………………………………………. o pulz drugo minuto stanja …………………………………………………………………………………………….. o pulz in krvni tlak tretjo minuto stanja ………………………………………………………………………….. 6. Poskusna oseba naj teče na mestu 1 minuto. Izmerite: o pulz prvo minuto teka na mestu (preštejte pulz prvih 15 sek takoj po prenehanju teka, vrednost dobite tako, da št. utripov pomnožite s 4) ………………………………….…................. o pulz in krvni tlak prvo minuto mirnega sedenja po vaji ….…………………………………...………. o pulz in krvni tlak drugo minuto mirnega sedenja po vaji ………………………………………........ o pulz in krvni tlak tretjo minuto mirnega sedenja po vaji ……………………………………….……… 79 02 FIZIOLOGIJA KRVNEGA OBTOKA 2.8 KAPILARNA CIRKULACIJA 2.8.1 Opazovanje kapilarne cirkulacije v mezenteriju žabe Kapilarno cirkulacijo v organizmu si lahko predstavljamo na osnovi opazovanja cirkulacije v mezenteriju žabe. a) Material:  narkotizirana žaba, preparirna mizica z izrezom v sredini, igle, mikroskop. b) Postopek: 1. Narkotizirano žabo položimo na preparirno mizico. 2. Na lateralni strani trebuha naredimo rez in skozenj izvlečemo črevo z mezenterijem. 3. Poiščemo primerno mesto na mezenteriju z lepo vidno mrežo žil in ga razpremo skozi okence na preparirni mizici. 4. Pod majhno povečavo mikroskopa opazujemo cirkulacijo v mezenteriju. c) Naloge: 1. Opazujte preparat pod mikroskopom in na osnovi smeri pretoka krvi poiščite arterije in vene! 2. Narišite preparat in smer pretoka krvi v žilah! 80 3 FIZIOLOGIJA DIHANJA Fazi dihanja ( pulmonarne ventilacije) sta vdih in izdih. Ob vdihu se skrčijo zunanje medrebrne mišice in trebušna prepona, kar poveča volumen prsnega koša. Zato v njem nastane podtlak in zrak prodre v pljuča. Med normalnim izdihom se inspiratorne mišice sprostijo, diafragma se dvigne, stena prsnega koša pa se pomakne navznoter (oz. v normalen položaj). Ob tem tlak v prsnem košu in v pljučih naraste, zato se zrak iztisne. Izdih je običajno pasiven proces, lahko pa se intenzivira s krčenjem trebušnih in notranjih medrebrnih mišic. 3.1 DOLOČANJE FREKVENCE DIHANJA Pod frekvenco dihanja razumemo število Tabela 3.1: Frekvenca dihanja pri nekaterih vdihov v časovni enoti (eni minuti). Na dihanje vrstah domačih živali in pri človeku vplivajo številni zunanji in notranji dejavniki Vrsta Frekvenca (npr. velikost telesa, starost, fizični napor, [vdihi/min] razburjenje, temperatura okolja, napolnjenost konj 8–16 prebavnega trakta, vročinska stanja), ki govedo 10–30 povzročajo znatna nihanja v frekvenci dihanja ovca, koza 12–20 določenega osebka. prašič 8–18 Frekvenco dihanja najlaže ugotavljamo z pes 10–30 opazovanjem in istočasno palpacijo prsnega mačka 20–30 koša ali trebuha z dlanjo ter štetjem števila budra 10–50 vdihov (ali izdihov) v eni minuti. Ugotavljamo kokoš 40–50 jo lahko tudi s pnevmografom. človek 15–20 3.2 MERJENJE PLJUČNIH VOLUMNOV IN KAPACITET Metoda, s katero se merijo pljučni volumni in kapacitete, je spirometrija, naprava za merjenje pa se imenuje spirometer. Merjenje je lahko statično ali dinamično. Pri statičnem merjenju se določa končna velikost (volumen) izdiha, ne upošteva pa se hitrost, s katero se izdih odvija. S statičnim merjenjem lahko izmerimo naslednje pljučne volumne in kapacitete:  Respiratorni volumen je količina zraka, ki se vdihne pri normalnem, mirnem vdihu ali izdihne pri normalnem izdihu. Vrednost pri konju je 6 L, pri ovci in kozi 300 ml, pri govedu 4 L in pri človeku 500 ml.  Rezervni inspiratorni volumen (dopolnilni zrak) je volumen zraka, ki ga po normalnem vdihu še lahko vdihnemo z maksimalnim vdihom. Vrednost pri konju je 12 L, pri človeku pa 3 L.  Rezervni ekspiratorni volumen (rezervni zrak) je volumen zraka, ki ga po normalnem izdihu še lahko izdihnemo s forsiranim, maksimalnim izdihom. Vrednost pri konju je 12 L, pri človeku pa 1 L.  Vitalna kapaciteta je volumen zraka, ki ga žival (človek) lahko iztisne iz pljuč z maksimalnim izdihom, ki sledi maksimalnemu vdihu. Vitalna kapaciteta je vsota respiratornega volumna, 81 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA rezervnega inspiratornega volumna in rezervnega ekspiratornega volumna.  Inspiracijska kapaciteta je maksimalna količina zraka, ki se lahko vdihne po normalnem izdihu. Je vsota rezervnega inspiratornega volumna in respiratornega volumna. Če zrak še tako intenzivno izdihnemo, pa določenega volumna ne moremo iztisniti iz pljuč in zato tudi ne izmeriti s spirometrijo. Volumen tega zraka pa lahko določimo z nekaterimi drugimi metodami, npr. z redčenjem helija ali z metodo izpiranja dušika. K tem volumnom oziroma kapacitetam štejemo rezidualni volumen in funkcijsko rezidualno kapaciteto.  Rezidualni volumen je količina zraka, ki ostane v pljučih tudi po najglobljem izdihu. Vrednost pri konju znaša 12 L, pri človeku pa 1,2 do 1,6 L (pri ženski približno 25 % vitalne kapacitete, pri moškem pa 33 %).  Funkcijska rezidualna kapaciteta je količina zraka, ki ostane v pljučih po normalnem izdihu. Je vsota rezervnega ekspiratornega volumna in rezidualnega volumna.  Totalna kapaciteta pljuč pa je količina zraka, ki jo vsebujejo pljuča po maksimalnem vdihu. Je vsota vseh štirih pljučnih volumnov. Slika 3.1: Pljučni volumni in pljučne kapacitete (po Andrewu) (RIV – rezervni inspiratorni volumen, DV – respiratorni volumen, REV – rezervni ekspiratorni volumen, RV – rezidualni volumen, IK – inspiratorna kapaciteta, FRK – funkcijska rezidualna kapaciteta, VK – vitalna kapaciteta, TKP – totalna kapaciteta pljuč) 82 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA 3.2.1 Merjenje vitalne kapacitete s spirometrom po Hutchinsonu Spirometer po Hutchinsonu sestavlja kovinski cilinder, napolnjen z vodo, v katerega je vstavljen oziroma potopljen nekoliko manjši kovinski cilinder s skalo ( graduacijo) v mililitrih . Na vrhu tega je odprtina, ki je z gumijasto cevjo povezana z ustnikom, skozi katerega se vpihava zrak v spirometer. Ob tem se graduirani valj dviga iz vode in na skali lahko neposredno odčitamo količino izdihanega zraka. Vitalna kapaciteta ljudi je odvisna od položaja telesa v času merjenja, moči dihalnih mišic in raztegljivosti pljuč ter stene prsnega koša. Pri mladih moških je v povprečju 4,6 L, pri ženskah pa 3,1 L. Rezidualni volumen znaša pri ženskah približno 25 % vitalne kapacitete, pri moških pa 33 %. a) Postopek: 1. Pred začetkom merjenja napravo napolnimo z vodo, skalo notranjega valja pa z oznako "0" namestimo na zgornji nivo vode v spirometru. Skozi ustnik previdno izdihnemo zrak v spirometer na različne načine. 2. Po normalnem izdihu maksimalno (forsirano) izdihnemo v spirometer – s tem izmerimo rezervni ekspiratorni volumen. 3. Po normalnem vdihu maksimalno (forsirano) izdihnemo v spirometer; od izmerjene vrednosti odštejemo vrednost pod 1. in dobimo respiratorni volumen. 4. Po maksimalnem vdihu maksimalno izdihnemo – rezultat je vitalna kapaciteta. b) Naloge: 1. Shematično narišite spirometer! 2. Izmerite oziroma izračunajte svojo vitalno kapaciteto in druge pljučne volumne! 3.2.2 Merjenje vitalne kapacitete pljuč s suhim spirometrom ( vitalografom) Za merjenje pljučnih volumnov in kapacitet lahko uporabljamo tudi t. i. suhi spirometer. Osnovni sestavni del suhega spirometra je gumijsta vreča, ki je na eni strani vezana na cev za dihanje, po drugi strani pa z napravo za registriranje. Poskusna oseba vdihuje zrak v gumijasti rezervoar, ki se razteza in premika pisalo po papirju za registracijo. 3.2.3 Prikaz merjenja pljučnih volumnov in kapacitet Merjenje pljučnih volumnov in kapacitet lahko prikažemo tudi z računalniško simulacijo PhysioEx. Računalniška simulacija prikazuje osnovne mehanske funkcije respiratornega sistema. Po zagonu programa v glavnem meniju izberemo ukaz Mehanika respiratornega sistema (Respiratory System Mechanics). V virtualnem laboratoriju (slika 3.2) je v steklenem valju na levi strani ekrana model pljuč, na desni strani osciloskop s prikazom rezultatov, na dnu pa enota za shranjevanje podatkov. Gumijasta diafragma zapira dno steklenega valja in je nameščena na ročico črpalke pod valjem. Ročica dviga in spušča diafragmo, pri čemer vsesava in iztiska atmosferski zrak. Pregrada med obema kriloma pljuč deli valj na dve ločeni polovici. Model pljuč je povezan s cevjo za zrak, katere premer se lahko spreminja z izbiranjem oznak (+) ali (–) pod oznako Polmer (Radius (mm)). Pretok vdihanega oz. izdihanega zraka je prikazan pod oznako Flow (liters). 83 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA Z ukazom Start pod steklenim valjem se prične meritev, med katero model pljuč »diha« z normalnim dihalnim volumnom. Zapis dihanja je prikazan na ekranu osciloskopa. Ukaza ERV (ekspiratorni rezervni volumen) in FVC (forsirana vitalna kapaciteta) pa omogočata izvedbo meritev različnih pljučnih volumnov in kapacitet, ki so ob koncu meritve prikazane v okencih pod osciloskopom. Z ukazom Zapiši rezultate (Record Data) se vsi podatki za posamezno meritev izpišejo na tabeli enote za shranjevanje podatkov. Podatke lahko v celoti izbrišemo (Clear Table) ali pa izbrišemo samo posamezne vrstice tabele (Delete Line). Slika 3.2: Virtualni laboratorij za proučevanje pljučnih volumnov in kapacitet a) Postopek: 1. Z izbiro (+) ali (–) nastavimo polmer cevi za zrak na 5 mm. 2. Z ukazom Start poženemo model, ki začne »dihati« zaradi premikov diafragme. Dihalni gibi pljuč se zapisujejo na ekranu osciloskopa. Na prikazu pretoka zraka nad modelom lahko opazujemo dihalni volumen. V prikazu rezultatov (pod osciloskopom) pa vidimo povprečni dihalni volumen in število vdihov (izdihov) na minuto (Pump Rate). 3. Z ukazom Clear Tracing izbrišemo zapis na osciloskopu. 4. Ponovno izberemo ukaz Start, nato pa čez nekaj sekund pritisnemo tipko ERV pod valjem, čez 2 sekundi pa še tipko FVC, da zaključimo meritve dihalnih volumnov. Ekspiratorni rezervni volumen, inspiratorni rezervni volumen in rezidualni volumen bodo avtomatsko izračunani in prikazani pod osciloskopom. 5. Rezultate meritev vnesemo v spodnjo tabelo. TV: ERV: IRV: RV: VK: TLC: mRV: b) Naloge: Na osnovi rezultatov meritev izračunajte vitalno kapaciteto pljuč, totalno pljučno kapaciteto in minutni respiratorni volumen (mRV); rezultate vnesite v tabelo! 84 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA 3.3 VLOGA INTRAPLEVRALNEGA TLAKA IN SURFAKTANTA PRI MEHANIZMU PLJUČNE VENTILACIJE Pljuča so elastičen organ, ki se širi in krči pod vplivom atmosferskega tlaka in negativnega tlaka v plevralni votlini, med porebrnico in popljučnico (intraplevralni tlak). Ta je manjši kot tlak v alveolih in je posledica tendence pljuč, da se zaradi svoje elastičnosti in površinske napetosti alveolarne tekočine sesedejo (kolabirajo), kar vleče pljuča od stene prsnega koša in na ta način v interplevralnem prostoru ustvarja podtlak. Zaradi tega podtlaka se pljuča prilegajo stenam prsnega koša in med dihanjem pasivno spreminjajo svoj volumen. Skupna tendenca pljuč, da bi se ločila od stene prsnega koša, je merilo velikosti intraplevralnega tlaka. Normalna vrednost je 4 mm Hg, ob globokem vdihu pa 9 do 12 mm Hg. Ker je tlak v interplevralnem prostoru nižji od atmosferskega, vsaka odprtina, ki nastane v steni prsnega koša, povzroči, da se intraplevralni tlak izenači z atmosferskim. Stanje imenujemo pnevmotoraks. Zaradi tega pljuča kolabirajo ( atelektaza). Na stiku tekočine in plina se molekule tekočine med seboj privlačijo močneje kot z molekulami plina, kar na površini tekočine povzroča nastanek površinske napetosti. Ker se površinska napetost upira silam, ki težijo k povečanju površine, deluje tako, da zmanjšuje velikost votlin, kot so npr. alveoli. Če bi bili alveoli prevlečeni z vodo, bi bilo polnjenje pljuč z zrakom zelo težko, če že ne nemogoče. Vendar pa vodna plast, ki pokriva površino alveol, vsebuje surfaktant (lipoprotein, podoben detergentu), ki zmanjšuje površinsko napetost z zmanjševanjem privlačnih sil med vodnimi molekulami. 3.3.1 Prikaz mehanizma pljučne ventilacije z Dondersonovim modelom Mehanizem pljučne ventilacije na enostaven način lahko ponazorimo z Dondersonovim modelom. To je steklenica, ki ima namesto dna gumijasto opno, zamašena pa je z gumijastim zamaškom, skozi katerega je nameščena steklena cevka. Na to cevko namestimo sapnik z nepoškodovanimi pljuči kunca. a) Postopek:  S prsti premikamo gumijasto opno navzgor in navzdol in opazujemo spremembe oblike in velikosti pljuč. b) Naloge: 1. Narišite shemo Dondersonovega modela! 2. Razložite spremembe, ki nastanejo ob dviganju in spuščanju gumijaste opne in jih primerjajte s spremembami v prsni votlini ob dihanju! 85 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA 3.3.2 Prikaz dejavnikov, ki vplivajo na dihanje Vlogo intraplevralnega tlaka in surfaktanta lahko prikažemo z računalniško simulacijo programa PhysioEx. Iz menija programa izberemo poglavje Dejavniki, ki vplivajo na dihanje (Factors Affecting Respiration). Virtualni laboratorij je podoben kot pri prejšnji seriji poskusov (slika 3.2). Dodatno so v njem razpršilec surfaktanta nad steklenim valjem in ventili na vsaki strani valja. Z ukazom Surfactant v model pljuč razpršimo določeno količina surfaktanta, z ukazom Izpiranje (Flush) pa se surfaktant odstrani. Ob pritisku na ventil se ta odpre in tlak znotraj polovice valja se izenači z atmosferskim. Z ukazom Reset nad modelom ventila zapremo. Rezultati poskusov so prikazani pod osciloskopom, z izbiro ukaza Record Data pa se shranijo v tabelo na dnu ekrana. Na modelu dihal je interperitonealni prostor področje med stenami valja in modelom pljuč. Razlike v tlakih med vdihom in izdihom so za levo in desno polovico modela prikazane ločeno. A) Opazovanje intraplevralnega tlaka a) Postopek: 1. Z ukazom Clear Tracing izbrišemo predhodni zapis z ekrana osciloskopa, z ukazom Flush pa izperemo surfaktant iz pljuč. 2. Polmer zračne cevke nastavimo na 5 mm (z izbiro (+) oz. (–)). 3. Z ukazom Start poženemo model in zapišemo normalno dihanje. Po končani meritvi zapišemo izmerjene vrednosti. 4. S pritiskom na oznako Valve Closed na levi strani valja odpremo levi ventil in z ukazom Start poženemo simulacijo. Po končani meritvi zapišemo rezultate v spodnji tabeli. 5. Odprti ventil zapremo (s pritiskom na oznako Valve Open) in z ukazom Start poženemo novo meritev in zapišemo rezultate. 6. Z ukazom Reset (nad valjem) odstranimo zrak iz intraplevralnega prostora in poženemo naslednjo simulacijo (Start) in zapišemo rezultate. Meritev Tlak Pretok zraka levo desno levo desno skupaj normalno dihanje pnevmotoraks zaprt pnevmotoraks normalno dihanje b) Naloge: 1. Na osnovi opazovanja obnašanja modela in rezultatov meritev odgovorite na spodnja vprašanja:  Kaj se zgodi s pljuči v levi polovici valja po odprtju ventila?  Kako se tlak v levi polovici pljuč razlikuje od tistega v desni? Razložite!  Kako se pretok zraka v levi polovici pljuč razlikuje od tistega v desni, zakaj nastane razlika?  Kaj bi se zgodilo, če pljučni krili ne bi bili ločeni s pregrado?  Ali so se kolabirana pljuča odzivala na gibe diafragme? Razložite!  Zakaj so se kolabirana pljuča v levi polovici valja povrnila v prvotno stanje, ko smo izbrali ukaz Reset? 86 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA B) Prikaz vpliva surfaktanta Iz menija programa izberemo poglavje Dejavniki, ki vplivajo na dihanje (Factors Affecting Respiration). Virtualni laboratorij (slika 3.2) je podoben kot pri prejšnji seriji poskusov. Dodatno so v njem razpršilec surfaktanta nad steklenim valjem in ventili na vsaki strani valja. Z ukazom Surfactant povzročimo, da se v model pljuč razprši določena količina surfaktanta, z ukazom Izpiranje (Flush) pa se surfaktant odstrani. Ob pritisku na ventil se ta odpre in tlak znotraj polovice valja se izenači z atmosferskim. Z ukazom Reset nad modelom ventila zapremo. Rezultati poskusov so prikazani pod osciloskopom, z izbiro ukaza Record Data pa se shranijo. Meritev Frekvenca Tlak Pretok zraka dihanja levo desno levo desno skupaj (n/min) brez surfaktanta z dodatkom surfaktanta a) Postopek: 1. S tipkama (+) oz. (–) nad modelom pljuč uravnamo polmer zračne cevi na 5 mm. 2. Izvedemo osnovno meritev (Start) in zapišemo rezultate v spodnjo tabelo. 3. Dvakrat zapored izberemo ukaz Surfactant. Z ukazom Start ponovimo meritev in zapišemo rezultate. b) Naloge: 1. Kako se je zapis ob uporabi surfaktanta razlikoval od osnovnega zapisa delovanja pljuč? 87 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA 3.4 NADZOR IN URAVNAVANJE DIHANJA Hitrost in globina dihanja se prilagajata potrebam organizma po kisiku, urejajo pa ju parcialni tlak ogljikovega dioksida (Pco2) in kisika (Po2) ter pH krvi. Kemoreceptorji v možganih se aktivirajo ob dvigu Pco2 v cerebrospinalni tekočini in vzdražijo center za dihanje, kar povzroči povečanje frekvence in globine dihanja, to pa vodi k povečanju alveolarne ventilacije in odstranjevanju CO2 iz krvi. Periferni kemoreceptorji (v aorti in a. carotis) pa odgovarjajo na spremembe v Po2 in pH krvi. 3.4.1 Prikaz učinkov različnih načinov dihanja na raven CO2 Učinek različnih načinov dihanja na Pco2 v krvi lahko prikažemo z računalniško simulacijo PhysioEx. V meniju poskusa izberemo poglavje Spremembe dihanja (Variations in Breathing). Osnovni elementi, ki se prikažejo na ekranu, so enaki kot pri prvi seriji poskusov, pod osciloskopom pa se nahajajo ukazi za izbiro različnih vzorcev dihanja (slika 3.3). Ukaz Hiperventilacija (Hyperventilation) povzroči, da pljuča dihajo hitreje kot normalno. Majhna vrečka samodejno prekrije cevko za dovod zraka, če izberemo ukaz Predihavanje (Rebreathing). Ukaz Zadrževanje dihanja (Breathe Holding) ustavi dihanje. Ukaz Normalno dihanje (Normal Breathing) pa v vsakem trenutku omogoči normalno dihanje. Prikazi pod osciloskopom kažejo parcialni tlak CO2 v zraku, ki se nahaja v pljučih, maksimalni in minimalni parcialni tlak CO2 in frekvenco dihanja. Podatke, ki jih zberemo med poskusom, shranimo v tabelo na dnu ekrana z ukazom Record Data. Slika 3.3: Virtualni laboratorij za prikaz učinkov dihanja na raven CO2 88 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA A) Hiperventilacija Pri tem načinu dihanja sta frekvenca dihanja in s tem alveolarna ventilacija večji od potreb organizma. a) Postopek: 1. Z izbiro oznak (+) oz. (–) uravnamo premer dovodne cevke na 5 mm. 2. Z ukazom Start poženemo meritev. Ukaz na tipki se spremeni v Stop, ki omogoča, da dihanje lahko kadarkoli ustavimo. Po končani meritvi shranimo parametre normalnega dihanja (Record Data) in izbrišemo zapis na osciloskopu. 3. Ponovno poženemo meritev in po nekaj sekundah izberemo ukaz Hyperventilation. Opazujemo prikaz Pco2 in vzorec dihanja. 4. Z ukazom Stop ustavimo registracijo, preden zapis pride do konca ekrana osciloskopa, in zapišemo rezultate v tabelo. Način dihanja Pco2 Frekvenca Pretok zraka dihanja normalno dihanje hiperventilacija ponovno vdihavanje zadrževanje dihanja b) Naloge:  Razložite, kaj se zgodi s Pco2 med hiperventilacijo? B) Ponovno vdihovanje Pri tem načinu dihanja se ponovno vdihuje zrak, ki je bil izdihnjen, zato se Pco2 poveča. a) Postopek: 1. Izberemo ukaz Start in po 2 sekundah še ukaz Rebreathing. Ob tem se nad cevjo za dovod zraka samodejno namesti balon, ki omogoča, da se iz pljuč izdihani zrak ponovno vrača v model. 2. Opazujemo vzorec dihanja na osciloskopu in Pco2 med poskusom. Ko zapis pride do konca ekrana osciloskopa, z ukazom Stop ustavimo poskus. 3. Rezultate meritve zapišemo v tabelo pri poskusu A. b) Naloge: 1. Kaj se dogaja s Pco2 med poskusom? 2. Ali se globina in vzorec dihanja spreminjata? C) Zadrževanje dihanja Zadrževanje dihanja je ekstremna oblika prejšnjega poskusa, pri čemer ni izmenjave zraka med pljuči in zunanjo atmosfero. a) Postopek: 1. Izberemo ukaz Start in po 2 sekundah še ukaz Breath Holding. 2. Počakamo približno 5 sekund, nato pa izberemo ukaz Normal Breathing. Opazujemo vzorec 89 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA dihanja na osciloskopu in Pco2 med poskusom. Ko zapis pride do konca ekrana osciloskopa, z ukazom Stop ustavimo poskus. 3. Rezultate meritve zapišemo v tabelo pri poskusu A. b) Naloge: 1. Kaj se dogaja s Pco2 med zadrževanjem dihanja? 2. Kaj se zgodi z vzorcem dihanja, ko se začne normalno dihanje? 3.4.2 Vplivi na dihanje pri človeku Med fizičnim naporom in drugimi fiziološkimi stanji, ki povečajo metabolično aktivnost organizma, mora respiratorni sistem tkiva oskrbeti z zadostno količino O2 in odstraniti iz tkiv povečane količine CO2. Dihalni center v podaljšani hrbtenjači in mostu uravnava stopnjo ventilacije v skladu s potrebami telesa, tako da se Po2 in Pco2 le malo spreminjata tudi med intenzivnim delom ali drugimi tipi respiratornega stresa. Na dihanje vplivajo tudi zunanji (periferni) kemoreceptorji v karotidnem sinusu. Ti so občutljivi na kemične spremembe v krvi (Po2, Pco2, pH krvi) in prevajajo impulze v dihalni center ter na ta način pomagajo uravnavati respiratorno aktivnost. Porast Pco2, padec pH krvi ali Po2 z vzdraženjem kemoreceptorjev in dihalnega centra pospešijo pljučno predihavanje. a) Ekipa:  poskusna oseba, merilec dihanja, časomerilec, zapisnikar. b) Pripomočki:  štoparica ali ura s sekundnim kazalcem. c) Postopek:  Frekvenca dihanja: 1. Z opazovanjem dviganja in spuščanja prsnega koša določite frekvenco dihanja pri poskusni osebi, ki mirno sedi. 2. Meritve izvedite trikrat zapored z enominutnimi presledki in vnesite rezultate v tabelo! 3. Rezultate uporabite za primerjavo z rezultati naslednjih meritev!  Hiperventilacija in apnea 1. Poskusna oseba naj z odprtimi usti globoko diha 2 minuti (hiperventilacija). 2. Ugotovite spremembo frekvence dihanja po končani hiperventilaciji! 3. Meritev izvedite trikrat zapored z enominutnimi presledki in vnesite rezultate v tabelo!  Hipoventilacija 1. Poskusna oseba naj si na obraz namesti papirnato vrečko in z odprtimi usti 2 minuti diha vanjo. 2. Ugotovite spremembo frekvence dihanja po končanem postopku! 3. Meritev izvedite trikrat z enominutnimi presledki in vnesite rezultate v tabelo!  Zadrževanje dihanja 1. Poskusna oseba naj s prsti stisne nosnice in zadrži dihanje za 0,5 do ene minute. Takoj nato ugotovite frekvenco dihanja! 2. Meritev izvedite trikrat z enominutnimi presledki in vnesite rezultate v tabelo!  Čas zadrževanja dihanja po normalnem dihanju 1. Poskusna oseba naj mirno sedi in normalno diha 2 do 3 minute. Nato naj s prsti stisne nosnice in zadržuje dihanje tako dolgo, kot zmore. 90 08 FIZIOLOGIJA DIHANJA 2. Izmerite čas zadrževanja dihanja! Meritev izvedite trikrat z enominutnimi presledki in vnesite rezultate v spodnjo tabelo!  Čas zadrževanja dihanja po pospešenem dihanju 1. Poskusna oseba naj 2 minuti globoko diha z odprtimi usti. Nato naj takoj s prsti stisne nosnice in zadržuje dihanje tako dolgo, kot zmore. 2. Meritev izvedite trikrat z enominutnimi presledki in vnesite rezultate v tabelo!  Čas zadrževanja dihanja po telesni vadbi 1. Poskusna oseba naj 2 minuti teče na mestu ali izvaja počepe. 2. Takoj po končani vadbi naj s prsti stisne nosnice in zadržuje dihanje tako dolgo, kot zmore. Izmerite čas zadrževanja dihanja! 3. Meritev izvedite trikrat z enominutnimi presledki in vnesite rezultate v tabelo! 1. meritev 2. meritev 3. meritev Povprečje Frekvenca dihanja Hiperventilacija in apnea Hipoventilacija Zadrževanje dihanja Čas zadrževanja dihanja po normalnem dihanju Čas zadrževanja dihanja po pospešenem dihanju Čas zadrževanja dihanja po telesni vadbi 91 4 FIZIOLOGIJA LEDVIC Produkte metabolizma iz organizma izločajo različni organi, med katerimi so najpomembnejše ledvice. Vsako ledvico sestavlja več milijonov nefronov, ki so osnovne funkcionalne enote ledvic. Pri nastajanju urina v nefronu potekajo glomerulna filtracija, reabsorpcija in sekrecija. Glomerularna filtracija je pasiven proces, pri katerem ob prehodu tekočine iz lumna glomerularnih kapilar v Bowmanovo kapsulo nastane primarni urin, iz tega pa med procesi reabsorpcije in sekrecije v ledvičnih kanalčkih nastane sekundarni (definitivni) urin. Iz kanalčkov reabsorbirane snovi prehajajo v medcelični prostor in se vračajo v krvni obtok po peritubularnih kapilarah, ki obdajajo ledvične kanalčke. Peritubularne kapilare izhajajo iz eferentnih arteriol in se izlivajo v vene, ki zapuščajo ledvice. 4.1 PRIKAZ GLOMERULNE FILTRACIJE Računalniška simulacija omogoča prikaz delovanja ledvic na modelu nefrona. Principi glomerulne filtracije, ki jih spoznamo ob študiju modela, služijo za razumevanje delovanja ledvic kot celote. Slika 4.1: Virtualni laboratorij za proučevanje glomerulne filtracije Iz glavnega menija izberemo ukaz Fiziologija ledvic (Renal System Physiology), ki odpre virtualni laboratorij za proučevanje glomerulne filtracije (slika 4.1). Glavni elementi virtualnega laboratorija so enota za oskrbo s krvjo (na levi), model nefrona znotraj rezervoarja (na desni) s kontrolno enoto pod njim ter enota za zapisovanje rezultatov (na dnu ekrana). Levi valj predstavlja telesni krvni obtok, ki oskrbuje nefron. Tlak krvi v valju lahko uravnavamo z izbiro oznak nad valjem (Pressure (+) ali (–) ). Zgornja cevka z nastavljivim polmerom, ki predstavlja aferentno arteriolo, povezuje levi valj z modelom glomerula. Druga cevka z nastavljivim polmerom pa predstavlja 92 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC eferentno arteriolo in izhaja iz glomerula. Iz nefrona izhaja večkrat zavita cevka, ki predstavlja ledvični kanalček. Po njej teče filtrat v zbirno posodico (na spodnjem desnem delu ekrana). Nad modelom nefrona sta prikaz glomerulnega tlaka (Glomerular Pressure) in stopnje glomerulne filtracije (Glomerular Filtr. Rate). Model nefrona je v kopeli s koncentracijsko razliko 1200 mosm. Ukaz Start požene poskus, ukaz Refill pa ponovno napolni valj s krvjo. Podatke, ki jih dobimo ob meritvah, lahko shranimo v podatkovni enoti (Record Data). 4.1.1 Učinek premera žil na glomerulno filtracijo Poskus prikazuje vpliv premera aferentne in eferentne arteriole na stopnjo glomerulne filtracije, t. j. količine tekočine, ki se prefiltrira skozi Bowmanovo kapsulo v časovni enoti. a) Postopek: 1. Na kontrolni enoti izberemo ukaz Afferent. Kontrolna enota bo zapisovala stopnjo sprememb zaradi spreminjanja premera aferentne cevke. 2. Polmer aferentne cevke nastavimo na 0,30 mm, polmer eferentne pa na 0,40 mm. Tlak v posodi naj bo 90 mm Hg. 3. Z ukazom Start poženemo poskus. Med poskusom vidimo tok tekočine skozi nefron in zbirni kanalček v zbirno posodo. Po končanem poskusu na zgornjem prikazu odčitamo stopnjo glomerularne filtracije in zapišemo rezultate v tabelo. 4. Z ukazom Refill ponovno napolnimo levi valj in s tem pripravimo model za naslednji poskus. 5. V nadaljevanju postopoma (za 0,1 mm) povečujemo polmer aferentne cevke in vsakokrat ponovimo celotno meritev (stopnje 3 do 4). Rezultate zapišemo. Meritev 1 2 3 polmer aferentne cevke [mm] polmer eferentne cevke [mm] tlak v čaši [mm Hg] glomerulni tlak [mm Hg] stopnja glomerulne filtracije volumen primarnega urina [ml] b) Naloge: Odgovorite na spodnji vprašanji:  Kaj se zgodi s stopnjo glomerulne filtracije, ko povečujemo polmer aferentne cevke?  Kako bi na stopnjo glomerulne filtracije vplivalo povečanje ali zmanjšanje polmera eferentne cevke? 93 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC 4.1.2 Učinek tlaka na glomerulno filtracijo Krvni tlak v žilah, ki oskrbujejo glomerul, in tlak v ledvičnih cevkah vplivata na stopnjo glomerularne filtracije. Poskus prikazuje spreminjanje stopnje glomerulne filtracije glede na spremembe krvnega tlaka. a) Postopek: 1. Na kontrolni enoti izberemo oznako Pressure (oznaka se obarva modro). 2. Polmer aferentne cevke nastavimo na 0,5 mm in eferentne na 0,4 mm. Polmerov cevk med poskusom ne spreminjajmo. 3. Tlak v levi čaši naravnamo na 80 mm (z izbiro oznak (+) in (–)). 4. Z ukazom Start poženemo poskus in zapišemo izmerjene parametre v spodnji tabeli. 5. Tlak v levem valju postopoma povečujemo za 10 mm Hg, dokler ne dosežemo vrednosti 100 mm Hg. Ob vsakem povečanju tlaka ponovimo poskus in shranimo rezultate. Meritev 1 2 3 tlak v čaši [mm Hg] glomerulni tlak [mm Hg] stopnja glomerulne filtracije volumen urina [ml] b) Naloge: Odgovorite na spodnji vprašanji:  Kaj se zgodi s stopnjo glomerulne filtracije, ko narašča tlak v čaši?  Kako bi spreminjanje polmera aferentne in eferentne cevke vplivalo na stopnjo glomerulne filtracije? 94 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC 4.2 PRIKAZ NASTAJANJA KONČNEGA (DEFINITIVNEGA) URINA Z računalniško simulacijo PhysioEx lahko proučujemo vplive spreminjanja koncentracije peritubularne tekočine na nastajanje urina. Prikažemo lahko tudi vplive hormonov (aldosterona in ADH) ter vlogo glukoznih nosilcev pri tem procesu. V glavnem meniju programa izberemo poglavje Simulacija tvorbe urina (Simulating Urine Formation). Virtualni laboratorij (slika 4.2) je podoben kot v prejšnji seriji poskusov, le da v njem ni enote za uravnavanje krvnega tlaka (ker je pri teh poskusih ne potrebujemo). Dodatno je v virtualnem laboratoriju polička z raztopinama aldosterona in ADH (na desni strani ekrana). Nad modelom nefrona je enota za dodajanje glukoznih nosilcev, spodaj levo pa analizator sestave urina (Probe). Koncentracijo v kopeli okoli nefrona uravnavamo z oznakama (+) oz. (–) ob prikazu koncentracije na kontrolni enoti modela. Z ukazom Dispense skozi šobe na dnu napolnimo tank z izbrano raztopino. Z ukazom Start poženemo poskus. Po končanem poskusu lahko vzorec raztopine iz tanka analiziramo (Probe). Hormone apliciramo tako, da potegnemo pokrovček stekleničke do odprtine na kopeli (zgoraj desno). Tipki (+) in (–) na kontroli glukoznih nosilcev omogočata uravnavanje števila glukoznih nosilcev, ki se vgradijo v simulirani proksimalni zaviti tubul z ukazom Add Carriers. Podatki, izpisani v prikazu rezultatov, so odvisni od poskusa, ki ga izvajamo, in jih lahko shranimo (Record Data). Slika 4.2: Virtualni laboratorij za prikaz nastajanja urina 95 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC 4.2.1 Vpliv koncentracijske razlike na sestavo definitivnega urina Med nastajanjem urina topljenci in voda prehajajo iz lumna nefrona v peritubularni prostor. Pasivni transport topljencev in vode iz lumna ledvičnih cevk je delno odvisen od koncentracijske razlike v okolici nefrona. Če je nefron prepusten za topljence ali vodo, se bo ustvarilo ravnotežje med peritubularno tekočino in vsebino nefrona. Antidiuretični hormon (ADH) poveča prepustnost distalnih zavitih cevk in zbirnih cevk za vodo, tako da prehaja voda na področja z večjo koncentracijo topljencev (običajno iz lumna nefrona v peritubularno področje). Pri tem poskusu bomo proučevali procese pasivne reabsorpcije. a) Postopek: 1. V oknu za vnos podatkov (Data Set) izberemo oznako Razlika (Gradient) (izbrani parameter se obarva modro). 2. Pokrovček s kapalko stekleničke z ADH premaknemo nad odprtino kopeli; ADH se veže na zbirno cevko (okolica cevke se obarva zeleno). 3. Koncentracijski gradient uravnamo z izbiro oznak (+) oz. (–) na 300 mosm in izberemo ukaz Dispense pod prikazom osmolarnosti. 4. Z ukazom Start poženemo poskus. Filtrat se bo pomikal skozi nefron in zbiral v čaši pod koncem zbirnega kanalčka. 5. Med potekom poskusa opazujemo prikaz Probe. Ko se sonda obarva rdeče, jo premaknemo v čašo za zbiranje urina. Na ta način izmerimo koncentracijo topljencev v urinu, ki se pokaže v prikazu Concentration. 6. Po koncu poskusa shranimo rezultate z ukazom Record Data in jih zapišemo v tabelo. 7. V nadaljevanju ponavljamo poskus (stopnje 2 do 6) tako, da postopoma (za 300 mosm) povečujemo koncentracijski gradient do 1200 mosm. Meritev 1 2 3 konc. razlika [mosm] koncentracija glukoze [mg/100 ml] koncentracija kalija [mg/100 ml] volumen urina [ml] osmotski tlak urina [mosm] b) Naloge:  Kaj se je zgodilo s koncentracijo urina, ko je koncentracijski gradient naraščal? 96 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC 4.2.2 Učinek glukoznih nosilcev na reabsorpcijo glukoze Ker so za transport glukoze iz lumna nefrona v intersticijski prostor potrebni glukozni nosilci, je količina reabsorbirane glukoze omejena. Če je glukoza vezana na vse nosilce, ki so na voljo, se višek glukoze izloča v urin. V tem poskusu bomo prikazali učinek spreminjanja količine glukoznih nosilcev v proksimalnih zavitih kanalčkih na reabsorpcijo glukoze. a) Postopek: 1. V oknu za vnos podatkov (Data Set) izberemo Glucose (izbrani parameter se obarva modro). 2. Z oznakama (+) oz. (–) uravnamo koncentracijski gradient na 1200 mosm in izberemo ukaz Dispense. 3. Najprej izvedemo meritev brez dodanih glukoznih nosilcev. Poskus poženemo z ukazom Start in shranimo rezultate (Record Data) ter jih zapišemo v tabelo. 4. Z oznakama (+) oz. (–) uravnamo število glukoznih nosilcev na 100. Z ukazom Dodaj nosilce (Add Carriers) se ti vnesejo v membrano proksimalnega zavitega kanalčka. Poskus poženemo z ukazom Start in shranimo rezultate (Record Data) ter jih zapišemo v spodnjo tabelo. 5. Poskus ponovimo še z 200 in 400 glukoznimi nosilci. Meritev 1 2 3 4 število glukoznih nosilcev koncentracija glukoze [mg/100ml] koncentracija kalija [mg/100 ml] volumen urina [ml] b) Naloge: Odgovorite na naslednja vprašanja:  Kaj se zgodi s količino glukoze v urinu, če se število glukoznih nosilcev povečuje?  Količina glukoze v normalnem urinu je majhna, ker je običajno na voljo zadosti nosilcev glukoze. Razmislite, kaj bi se zgodilo, če bi bilo v urinu več glukoze, kot je lahko prenesejo razpoložljivi nosilci!  Razložite, zakaj se nahaja glukoza v urinu diabetikov! 97 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC 4.2.3 Prikaz učinka hormonov na nastajanje urina Koncentracija urina, ki se izloča iz ledvic, je odvisna od trenutnih potreb organizma. Če npr. osebek popije veliko količino vode, se bo višek vode izločil, nastala bo velika količina redkega urina. Po drugi strani pa ob dehidraciji nastajajo majhne količine koncentriranega urina. Čeprav koncentracijska razlika omogoča izločanje koncentriranega urina, je koncentracija urina v prvi vrsti pod hormonalno kontrolo. Simulacija prikazuje učinek dveh različnih hormonov na delovanje ledvic, in sicer aldosterona, ki nastaja v nadledvični žlezi, in ADH, ki nastaja v hipotalamusu in se shranjuje v nevrohipofizi. Aldosteron deluje v distalnih zavitih cevkah, kjer omogoča reabsorpcijo ionov Na+ in zato tudi vode na račun izgube ionov K+, ADH pa poveča prepustnost distalnih cevk in zbirnih cevk za vodo, zato omogoča reabsorpcijo vode iz filtrata. a) Postopek: 1. V oknu za vnos podatkov (Data Set) izberemo Hormone (izbrani parameter se obarva modro). 2. Z izbiro tipk (+) oz. (–) uravnamo koncentracijski gradient na 1200 mosm in izberemo ukaz Dodaj (Dispense). 3. Z ukazom Start poženemo poskus. Rezultate shranimo (Record Data) in zapišemo v tabelo. Na ta način dobimo osnovne podatke, ki jih bomo potrebovali za primerjave z ostalimi meritvami. 4. Pri enakih eksperimentalnih pogojih apliciramo v kopel aldosteron (okolica distalne zavite cevke in zbirnega kanalčka se obarva rdeče). 5. Z izbiro ukaza Start poženemo poskus in shranimo rezultate (Record Data). 6. Nato, znova pri enakih eksperimentalnih pogojih, apliciramo v kopel ADH (okolica distalne zavite cevke in zbirnega kanalčka se obarva zeleno). 7. Z izbiro ukaza Start poženemo poskus in zapišemo rezultate v tabelo. Meritev 1 2 3 aldosteron ADH glukoza [mg/100 ml] kalij [mg/100 ml] volumen urina [ml] osmotski tlak urina [mosm] b) Naloge: Na osnovi rezultatov meritev odgovorite na spodnja vprašanja:  Kako se je količina urina po dodatku aldosterona razlikovala od bazalne vrednosti?  Razložite razliko med celotno količino kalija pri obeh izvedenih poskusih!  Kako se je količina urina po dodatku ADH razlikovala od bazalne vrednosti?  Primerjajte učinke aldosterona in ADH! 98 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC 4.3 LASTNOSTI IN SESTAVA KONČNEGA URINA Urin je telesni izloček ali ekskret, s katerim se izločajo končni produkti metabolizma (predvsem dušika) in višek vode ter drugih snovi, ki so sicer fiziološko izredno pomembne (minerali, aminokisline, vitamini itd.). Fizikalne lastnosti in kemična sestava urina so odvisne od vrste živali, starosti, prehrane, fiziološkega ali patološkega stanja. V sestavi urina se odražajo stanja v uropoetskem, prebavnem, cirkulatornem, hormonalnem in živčnem organskem sistemu. Z analizo urina lahko dobimo informacije o delovanju teh sistemov pa tudi celotnega organizma. V urinu najdemo stalne, občasne in slučajne kemične sestavine.  Stalne sestavine so vedno v urinu tako zdravih kot bolnih organizmov. Mednje npr. sodijo sečnina, kreatinin, sečna kislina, nekateri pigmenti, pa tudi kloridi, sulfati in fosfati natrija, kalija, magnezija in kalcija.  Občasne sestavine so v urinu živali in ljudi samo v določenih fizioloških in patoloških stanjih. Laktozo najdemo v urinu gravidnih živali in živali v laktaciji, glukozo v stanju hiperglikemije ali pri sladkorni bolezni, nekatere hormone med spolnim ciklusom, aceton in ketonska telesa pri acetonemiji, beljakovine pri telesnih naporih in obolenjih ledvic itd.  Slučajne sestavine urina pridejo v telo s hrano in se iz njega izločajo nespremenjene. To so različna rastlinska barvila, zdravila ipd. 4.3.1 Odvzem urina Pri domačih živalih zbiramo urin za preiskave največkrat s katetrizacijo sečnega mehurja. Pri poskusih, pri katerih je potrebno zbirati urin dolgo časa, so živali opremljene s posebnimi katetri, po katerih se urin zbira v steklenice. Pregled urina je najbolje opraviti neposredno po odvzemu, sicer pa ga hranimo v hladilniku ali mu dodamo nekatere antiseptike (kloroform, toluol, formalin, solno kislino, timol, živosrebrni cianid ipd.). Ob uporabi le-teh je potrebno vedeti, da nekateri lahko vplivajo na rezultate določenih preiskav. 4.3.2 Pregled fizikalnih lastnosti urina A) Volumen urina Kadar merimo volumen izločenega urina, ga zbiramo 24 ur z občasno kateterizacijo ali zbiranjem v posode po posebno instaliranih cevkah ali vodih. Celodnevna količina je odvisna od količine sprejete vode, od nekaterih metaboličnih in hormonalnih procesov, ki potekajo v telesu, in od načinov izločanja vode po drugih poteh (znojenje, slinjenje, bruhanje, driska ipd.). Če je količina urina povečana, govorimo o poliuriji, če je zmanjšana, pa o oliguriji. Kadar se urin preneha izločati, govorimo o anuriji. B) Vonj urina Vonj urina je specifičen za vsako živalsko vrsto in izvira iz različnih produktov metabolizma z značilnimi vonji. Vonj konjskega urina je aromatičen, govejega nekako sladkoben, urin prašiča in mesojedov, predvsem mačk, pa ogaben. Okus je zaradi NaCl in sečnine grenkoslan. 99 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC Tabela 4.1: Volumen in gostota urina Vrsta živali Volumen Gostota [ml/kg tel. [g/L] mase/dan] mačka 10–20 1020–1030 govedo 17–45 1030–1045 pes 20–100 1016–1060 koza 10–40 1015–1045 ovca 10–40 1015–1045 konj 3–18 1025–1060 prašič 5–30 1010–1050 C) Videz, barva in konsistenca urina Urin je pri večini domačih živali bledorumena do rjava bistra vodena tekočina, pri konju pa je moten in sirupast ali celo sluzast zaradi sluzi, ki nastaja in se izloča v uretrih in zgornjem področju uretre, in drobnih, suspendiranih kristalčkov kalcijevega karbonata. Po nekajurnem stanju vsak urin postane moten zaradi nastajanja amonijaka in sesedanja kristalov. Zelo hitro postane moten urin prežvekovalcev, predvsem zaradi sedimentacije kalcijevega karbonata. Značilna rumena barva urina izvira iz barvila urohroma. Poleg tega je v urinu tudi urobilinogen, ki nastaja v črevesju pri delovanju bakterij na bilirubin, ki iz črevesja preide v kri in se izloča z urinom. V urinu psa in človeka je lahko tudi uroeritin, v urinu prežvekovalcev pa uroporfirin, ki dajeta urinu rdečkast nadih. Intenzivnost obarvanja urina je odvisna od njegove koncentracije: bolj ko je koncentriran (in gost), intenzivnejša je njegova obarvanost. Pri diabetesu je urin blede barve, ker se ga izloča veliko in je razredčen. Če je urin koncentriran, je njegova barva temna. V urinu je lahko tudi hemoglobin, ki ga obarva rdeče. Če so v urinu eritrociti, govorimo o hematuriji, če pa je hemoglobin v urinu raztopljen, govorimo o hemoglobinuriji. Urin je lahko obarvan tudi zaradi barvil v hrani, nekaterih zdravil in umetnih barvil. Npr. antociani v pesi obarvajo urin rdečkasto, medtem ko ga sulfonamidi rdeče. Santonin ga obarva intenzivno rumeno ali zelenkasto pri kislem pH urina, pri alkalnem pH pa je barva rdečkasta ali celo vijoličasta. Tudi fenolftalein pri alkalni reakciji obarva urin rdeče. Č) Gostota urina Gostota urina je odvisna od količine v njem raztopljenih snovi in je obratno sorazmerna količini izločenega urina (če je izločenega urina veliko, je njegova gostota manjša, če pa se ga izloči malo, je večja). Okvirne vrednosti gostote urina so od 1,010 g/cm3 pri prašiču do 1,060 g/cm3 pri konju in psu (tabela 4.1). Gostoto urina merimo z areometrom, ki je posebej umerjen za določanje gostote urina in se imenuje urometer. Urometer potopimo v urinski kozarec, napolnjen z urinom, in na skali odčitamo vrednost gostote. Za natančno merjenje moramo upoštevati temperaturo urina: če je višja od temperature, pri kateri je bil urometer kalibriran, za vsake 3 °C dodamo 0,001 g/cm3; če je nižja, to vrednost odštejemo za vsake 3 °C. Prav tako moramo opraviti nekatere popravke, kadar urin vsebuje glukozo ali beljakovine. Za vsakih 0,1 g beljakovin na liter urina odštejemo 0,003 100 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC g/cm3, za 55,51 mmol glukoze na liter urina pa odštejemo 0,004 od odčitane vrednosti na urometru. D) Elektrokemična reakcija pH urina je odvisen od vrste živali, prehrane in metabolizma. Okvirne vrednosti so od 5 do 8,5. Mesojedi imajo v glavnem kisel urin, rastlinojedi alkalnega, vsejedi pa glede na vrsto hrane kislega ali alkalnega. Kisel pH dajejo urinu kisli fosfati, bazičnega pa karbonati. pH urina najlaže določamo z indikatorskimi papirčki. Papirček namočimo v urin in barvo primerjamo z barvno skalo. Da barva urina ne bi motila rezultata preiskave, ga razredčimo z destilirano vodo v razmerju 1 : 10. Ker ima urin pufrske lastnosti, z redčenjem ne spremenimo njegovega pH. Naloge: 1. Oglejte si barvo in konsistenco vzorcev urina različnih vrst domačih živali in opišite razlike, ki ste jih opazili! 2. Primerjajte vonj vzorcev urina! 3. Z areometrom določite gostoto vzorcev urina! 4. Določite pH urina različnih vrst domačih živali! 4.3.3 Kemične preiskave urina A) Kvalitativni in kvantitativni pregled urina na glukozo Kvalitativno lahko določimo glukozo v urinu s Fehlingovo reakcijo (gl. Laboratorijske vaje in računalniške simulacije v fiziologiji 1.del, vaja 4.1.3) ali z uporabo primernih indikatorskih papirčkov. Kvantitativno pa jo najlažje določimo s tovarniško izdelanimi testi. Naloge: 1. Z metodo po Fehlingu ugotovite glukozo v vzorcu urina! 2. V istem vzorcu ugotovite glukozo z indikatorskim papirčkom in primerjajte rezultate obeh meritev! B) Dokaz žolčnih barvil po Gmelinu in žolčnih kislin po Pettenhoferju Kvalitativni dokaz žolčnih barvil in žolčnih kislin v urinu izvedemo z enakima postopkoma kot v žolču (gl. Laboratorijske vaje in računalniške simulacije v fiziologiji 1.del, vaji 4.4.3 in 4.4.4). Naloge:  Izvedite reakciji za dokaz žolčnih barvil in kislin v urinu! C) Dokaz beljakovin v urinu Za kvalitativni in kvantitativni način prikazovanja beljakovin v urinu je znanih več metod. V nadaljevanju navajamo nekaj starejših metod in sodobnejšo metodo na osnovi elektroimunoforeze. 101 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC  Dokaz beljakovin s sulfosalicilno kislino a) Material:  urin, sulfosalicilna kislina (mkc 200 g/L), epruvete, 5-mililitrska pipeta, kapalka. b) Postopek: V epruveto damo približno 5 ml bistrega urina in po kapljicah dodajamo sulfosalicilno kislino. Če so v urinu beljakovine, bo dodatek vsake kapljice povzročil oblaček zameglitve. Po intenzivnosti reakcije lahko približno ocenimo količino beljakovin, kot je prikazano na tabeli 4.2.  Dokaz beljakovin z dušikovo kislino (metoda po Hellerju) a) Material:  urin, koncentrirana dušikova kislina (HNO3), epruveta, pipeta. b) Postopek: V epruveto odpipetiramo 1 ml koncentrirane dušikove kisline in nanjo ob steni epruvete previdno nalijemo 3 ml urina tako, da se tekočini ne pomešata. c) Rezultat: Če so v urinu beljakovine v koncentraciji najmanj 0,03 g/L, se na mejni ploskvi obeh tekočin pojavi bel prstan. č) Naloge:  Z eno od zgoraj opisanih metod dokažite beljakovine v vzorcu urina! Tabela 4.2: Ocena koncentracije beljakovin v urinu Koncentracija [g/L] Videz urina po dodatku sulfosalicilne kisline 0,01 rahla opalescenca 0,1 motnost 0,5 močno izražena motnost 1,0 veliko sedimenta na dnu epruvete Č) Kvantitativno določanje hemoglobina – benzidinska proba (po Adlerju) Metoda temelji na ugotovitvi, da hemoglobin in njegovi derivati katalizirajo oksidacijo mnogih polifenolov v prisotnosti vodikovega peroksida (delujejo psevdoperoksidativno). a) Material:  razredčena raztopina vodikovega peroksida – H2O2 (k 3 ml H2O2 dodamo 97 ml vode), ledocetna kislina, benzidin, epruvete, kapalke. b) Postopek: 1. Za noževo konico benzidina damo v epruveto, dodamo 2 ml ocetne kisline in dobro premešamo. 2. Vzamemo 0,5 ml pod 1. pripravljene raztopine in jo zmešamo z 2 ml raztopine H2O2. Zmes mora ostati brezbarvna. 3. Zakislimo 5 ml urina z dodatkom 0,5 ml ocetne kisline, prekuhamo (s tem uničimo termolabilne peroksidaze, ki bi sicer lahko motile probo) in ohladimo. 4. Iz tako prirejenega urina nalijemo počasi 2 ml na predhodno (pod 2.) pripravljeni reagens, 102 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC tako da se tekočini ne zmešata. Če je v urinu hemoglobin, se na stični ploskvi pojavi zelen ali moder prstan. c) Naloge:  Z zgoraj opisano metodo ugotovite, če se v vzorcu urina nahaja hemoglobin! D) Reakcija na aceton (po Legalu) Aceton v urinu je vedno skupaj z acetocetno in oksimasleno kislino in je navadno znak težke acidoze organizma. Ugotovimo ga lahko z reakcijo po Legalu, ki je zelo občutljiva, zato se uporablja tudi v klinične namene. a) Material:  natrijev nitroprusid (mkc 100 g/L), raztopina NaOH 5 mol/L (mkc 20 g/100ml), ledocetna kislina. b) Postopek: 1. V epruveto nalijemo 5 ml urina in dodamo 10 kapljic NaOH. 2. V epruveto dodamo 1 ml raztopine natrijevega nitroprusida; vsebina epruvete se obarva rdeče (zaradi kreatinina). 3. Dodamo nekaj kapljic ocetne kisline in si ogledamo obarvanost raztopine. Če je v njej aceton (ali acetocetna kislina), se obarvanost raztopine intenzivira, ker natrijev nitroprusid z acetocetno kislino v alkalnem mediju daje kompleksno spojino vijolične ali rdeče barve. Če acetona (ali acetocetne kisline) v urinu ni, barva vzorca preide v rumenozeleno. c) Naloge:  Ugotovite prisotnost acetona v vzorcu urina! E) Reakcija na indikan (po Obermayerju) Z izrazom indikan poimenujemo soli indoksil žveplene kisline in indoksiglukuronate. Te spojine nastanejo z bakterijsko razgradnjo triptofana v debelem črevesu na indol in skatol, ki se v glavnem izločata z blatom, v manjši meri pa se resorbirata in preideta v jetra. Tu se indol oksidira v indoksil in esterificira z žvepleno ali glukuronsko kislino. Običajno je indikana v urinu malo, njegova koncentracija pa naraste, če pride do povečanega gnitja v črevesju. Običajno je to v primerih obstipacije, ko se resorbira več razgradnih produktov triptofana. Koncentracija indikana je povečana tudi tedaj, če je v telesu gnojni proces, pri katerem bakterije razgrajujejo beljakovine. Postopek določanja temelji na dejstvu, da se estri indoksila saponificirajo, indoksil pa oksidira v indigo in ekstrahira s kloroformom. a) Material:  kloroform, tehnična solna kislina, epruvete, pipete. b) Postopek: 1. V epruveto nalijemo približno 5 ml urina, dodamo enako količino solne kisline in dobro premešamo. 2. Dodamo še 2 ml kloroforma in previdno premešamo z nekajkratnim obračanjem epruvete. 3. Epruveto pustimo nekaj časa stati, da se kloroform oddvoji. Ob indigu v vzorcu urina se kloroform obarva modro. Po intenziteti barve presodimo, ali je reakcija pojačana v primerjavi z normalnim urinom (rahlo modro obarvanje). 103 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC c) Naloge:  Z zgoraj opisano metodo ugotovite prisotnost indikana v vzorcu urina! F) Hitri testi za analiziranje urina V klinični praksi se za hitro in natančno analiziranje urina uporabljajo posebni testni trakovi. Z njimi lahko določimo različne kemične sestavine urina (beljakovine, glukozo, hemoglobin, nitrite, ketone, urobilinogen, bilirubin), prisotnosti levkocitov in eritrocitov ter pH urina. Barvne spremembe na posameznih poljih testnega traku primerjamo s priloženo barvno skalo, kar omogoča kvalitativno ali semikvantitativno presojo rezultatov. V humani in veterinarski medicini se uporabljajo različne komercialne izvedbe testnih trakov, ki se med seboj razlikujejo po številu in vrsti analiz, vsi pa se uporabljajo na enak način. Za izvedbo hitrih testov uporabljamo svež, necentrifugiran urin brez dodatka konzervansov. a) Postopek: 1. Testni trak vzamemo iz tulca in ga za kratek čas (1 s) potopimo v urin; tulec takoj zapremo! 2. Odvečni urin odstranimo s tem, da trak potegnemo po robu posode. 3. Po 60 (za levkocite po 60 do 120) sekundah primerjamo barvne spremembe posameznih polj na traku z barvami na skali (na posodici). Spremembe, ki nastanejo na robu polja ali po več kot 2 minutah, so diagnostično nepomembne. b) Naloge:  Opišite uporabljeni komercialni test za hitro analiziranje urina! Navedite, katere sestavine se določajo in na kakšen način!  S testnimi lističi analizirajte vzorce urina različnih vrst domačih živali, zapišite in razložite rezultate! 4.3.4 Mikroskopski pregled urina Z mikroskopom lahko opazujemo nekatere organske in neorganske sestavine urina. Pred pregledom urin pustimo stati v konusnih kozarcih ali pa ga centrifugiramo. Kapljico sedimenta kanemo na predmetno steklo in ga opazujemo pod mikroskopom. Sediment lahko tudi obarvamo, npr. z 1 % vodno raztopino eozina ali s Türckovo raztopino, ki jo sicer uporabljamo pri štetju levkocitov. A) Opazovanje kristalov organskih in neorganskih soli  Karbonatni kristali: Kristalčki kalcijevega (CaCO3) in magnezijevega (MgCO3) karbonata (slika 4.3 (a)) so normalna sestavina urina rastlinojedov, pri mesojedih pa so samo v alkalnem urinu. Pod mikroskopom se vidijo kot brezbarvne ali rumenkaste kroglice, lahko pa so tudi v obliki razpotegnjenega šesterokotnika ali dvodelnega biskvita. Včasih so tudi amorfni. Z dodatkom kisline se raztapljajo, pri čemer se pojavljajo mehurčki plina.  Fosfati: Kristalčki kalcijevega fosfata – Ca2(PO4)2 (slika 4.3 (b)) – so v obliki belih ali sivih palčk ali zrnc v vsakem alkalnem urinu in izginejo ob zakislitvi (npr. po dodatku ocetne kisline).  Tripelfosfati: Kristalčki amonij-magnezijevega fosfata (slika 4.3 (c)) se pojavijo ob amonijakalnem vrenju v urinu in so podobni pokrovu krste.  Urati: Kristalčki (slika 4.3 (d)) so v vsakem kislem, koncentriranem urinu in mu v večji 104 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC koncentraciji dajejo tipično opekasto rdečo barvo ( sedimentum lateritum), pod mikroskopom pa so videti kot amorfna zrnca. Kristali amonijevega urata pa so videti kot krogle z zvezdastimi izrastki ali bodicami (kot kostanjeve ježice). Urati se raztapljajo ob segrevanju ali po dodatku baz.  Kristali sečne kisline: Pojavljajo se v kislem urinu in imajo obliko rombov (npr. vretena, brusa, piramide, slika 4.3 (e)). Pogosti so v urinu mesojedov. Oborina izgine po dodatku alkalij.  Oksalati: To so kristali kalcijevega oksalata (slika 4.3 (f)), ki so raztopljeni v urinu, iz katerega se obarjajo ob kislem pH. Imajo značilno obliko oktaedra ali pisemske kuverte. Njihovo izločanje v urinu (oksalaturija) je lahko posledica vsebnosti v hrani, npr. v rabarbari, špargljih, ali pa motenj v metabolizmu (diabetes), predvsem pri konju.  Hipurna kislina: To so kristalčki v obliki prizem ali tankih rombastih ploščic in so normalna sestavina konjskega urina. Topijo se v amonijaku in alkoholu.  Kristali tirozina: V urinu (slika 4.3 (g)) jih najdemo le pri nekaterih boleznih (npr. ciroza jeter, levkemija, diabetična koma) kot posledico motenj v metabolizmu aminokislin. Imajo obliko zvezdic ali tankih iglic, zbranih v snopiče.  Kristali holesterola: V urinu (slika 4.3 (h)) jih najdemo pri boleznih ledvic. Imajo obliko rombastih ploščic, ki jim manjkajo vogali.  Cistinski kristalčki: V urinu ljudi in psov jih najdemo pri motnjah v reabsorpciji aminokisline cistina iz glomerularnega filtrata in so pomemben dejavnik za nastajanje ledvičnih ali sečnih kamnov. Imajo heksagonalno obliko. V urinu lahko najdemo tudi kristale sulfonamidov in penicilina ter nekaterih drugih antibiotikov. B) Opazovanje nekristaliziranih sestavin urinskega sedimenta V urinskem sedimentu se lahko nahajajo tudi različne celice, npr. celice epitela (ledvic, sečnih poti, zunanjih spolnih organov), krvne celice (eritrociti, levkociti), tumorske celice, spolne celice, različni mikroorganizmi (bakterije, glivice) ter cilindri. V klinične namene se najpogosteje opazujejo neobarvani preparati pri slabši osvetlitvi vidnega polja (delno zapiranje kondenzorja) ali s fazno- kontrastnim mikroskopom. Pripraviti je možno tudi trajne preparate, ki jih lahko obarvamo na najrazličnejše načine (npr. po May-Grünwald-Giemsi, po Papanicolauu). Cilindri so tvorbe v obliki trakov ali valjev z ostrimi obrisi, dolžine do 1 mm, ki predstavljajo odlitke ledvičnih kanalčkov (distalnih tubulov in zbirnih kanalčkov). Cilindri so sestavljeni iz celičnih elementov (pravi cilindri) ali iz raznih soli (lažni ali psevdocilindri). Pojav cilindrov v urinu ne pomeni vedno bolezni ledvic, saj se po fizičnih naporih lahko pojavijo tudi v urinu zdravih osebkov. Glede na sestavo ločimo hialine, epitelne, zrnate, levkocitne, eritrocitne, voščene, mastne, bakterijske, holesterolne, pigmentne, cilindre natrijevega ali amonijevega urata itd., katerih izvor oziroma nastanek je vezan na določene patološke spremembe mokril. Zato ima njihovo ugotavljanje diagnostični pomen. Naloge:  Z mikroskopom si oglejte urinski sediment, ugotovite in narišite različne tvorbe, ki jih opazite! 105 09 FIZIOLOGIJA LEDVIC a) karbonati b) fosfati c) tripelfosfati d) urati e) sečna kislina f) oksalati g) tirozin h) holesterol i) cistin Slika 4. 3: Kristalčki različnih snovi v urinu 106 5 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA 5.1 KONTRAKCIJE MIŠIC ŽABE Vsako skeletno mišico sestavlja več sto ali celo več tisoč celic, od katerih vsaka sodeluje pri krčenju mišice. Če izolirano skeletno mišico poskusne živali dražimo z električnim tokom, se obnaša enako kot mišica v organizmu ( in vivo). Zato delovanje mišic lahko proučujemo na izoliranih mišicah. Največ v ta namen uporabljamo izolirane mišice žab. Tudi te, podobno kot srce, ohranijo zmožnost krčenja (kontrakcije) še dolgo po izolaciji iz organizma. Pri tem jih ni treba ohranjati v kontroliranih fizioloških pogojih (telesna temperatura, dodajanje hranilnih snovi in kisika). Namesto poskusov na izoliranih mišicah živali lahko v pedagoške namene uporabljamo tudi računalniške simulacije (npr. PhysioExe), ki so bile razvite na osnovi meritev, opravljenih na mišicah žab ali podgan. Slika 5.1: Virtualni laboratorij za prikaz enostavnih mišičnih kontrakcij Simulacijo poženemo z izbiro poglavja Fiziologija skeletnih mišic (Skeletal Muscle Physiology) iz glavnega menija programa. Najpomembnejši del virtualnega laboratorija (slika 5.1) je ekran osciloskopa. Ta grafično prikazuje rezultate meritev in omogoča njihovo analizo. Na vodoravni osi ekrana je prikazan čas potovanja zapisa po ekranu, ki je samodejno uravnan na 200 milisekund. Lahko ga povečamo tako, da oznako 200 msec premikamo levo v zaželeni položaj na časovni osi. Moč krčenja mišice je prikazana na navpični osi. Z ukazom Clear Tracing (v levem spodnjem kotu ekrana) izbrišemo zapis z ekrana. Pod osciloskopom je električni stimulator. Ukaz Stimulate posreduje električni dražljaj do mišice po elektrodah, ki ležijo na njeni površini. Napetost dražljaja 107 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA uravnavamo z izbiro oznak (+) ali (–) pod ukazom. Trije prikazi desno od ukaza Stimulate so namenjeni merjenju moči krčenja mišice. Aktivna moč nastaja med mišično kontrakcijo, medtem ko pasivna izvira iz raztegnjene mišice. Skupna moč je vsota aktivne in pasivne moči. Mišica je nameščena na ročicah levo od osciloskopa. Kaveljček, ki prebada zgornjo kito mišice, je del pretvornika, ki meri moč krčenja mišice, tisti, ki prebada spodnjo tetivo, pa fiksira mišico. Omarica za uteži pod ročicami za mišico je aktivna le v nekaterih poskusih, v njej pa so različne uteži. Začetno dolžino mišice lahko uravnamo z izbiro oznak (+) ali (–) ob prikazu dolžine mišice (Muscle length). Rezultate meritev lahko shranimo in prikažemo v enoti za prikaz podatkov pod osciloskopom (Record Data). 5.1.1 Enostavna mišična kontrakcija Enostavna mišična kontrakcija je reakcija mišice na enkratni dražljaj ustrezne jakosti. V organizmu je enostavnih mišičnih kontrakcij razmeroma malo, večinoma so sestavljene. Enostavna mišična kontrakcija je sestavljena iz treh faz:  Latentna faza traja od trenutka vzdraženja do začetka kontrakcije mišice; vključuje čas, potreben, da dražljaj preide po motoričnem živcu skozi živčno-mišično sinapso, in čas od vzdraženja mišice do začetka kontrakcije.  Faza kontrakcije zajema čas kontrakcije – krčenja mišice.  Faza dekontrakcije zajema čas relaksacije – sprostitve mišice, torej njenega vračanja v začetni položaj. Trajanje posameznih faz mišične kontrakcije je odvisno od vrste mišice. Latentna faza m. gastrocnemiusa žabe traja približno 0,01 s, faza kontrakcije približno 0,04 s in faza dekontrakcije približno 0,05 s. A) Registracija enostavne mišične kontrakcije a) Postopek: 1. Z ukazom Stimulate vzdražimo mišico. Ker je sprva napetost stimulatorja nastavljena na 0 V, mišica ne reagira. 2. Z oznako (+) zraven ukaza Stimulate povečamo napetost na 3 V in ponovno vzdražimo mišico. Mišica se skrči in zapis kontrakcije je viden na osciloskopu. Rezultate meritve shranimo, nato z ukazom Clear Tracing pobrišemo zapis na osciloskopu. b) Naloge:  Določite posamezne faze mišične kontrakcije! B) Določitev trajanja latentne faze Latentna faza je na zapisu mišične kontrakcije čas med sprožitvijo dražljaja in začetkom kontrakcije. Njeno trajanje lahko izmerimo s pomočjo računalnika. a) Postopek: 1. Napetost na stimulatorju uravnamo na 5 V. Oznaka 200 ms naj bo na desnem robu osciloskopa. 2. Z ukazom Stimulate poženemo meritev. 108 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA 3. Izberemo ukaz Measure in pritiskamo na desno puščico ob prikazu časa, dokler ne opazimo prvega dviga vrednosti v prikazu aktivne moči. Ta vrednost je dejansko nad pravo dolžino latentne faze. Zato moramo pritiskati na levo puščico, dokler se v prikazu aktivne moči ponovno ne pojavi vrednost 0. V tem trenutku računalnik izmeri čas med dražljajem in zadnjim trenutkom, ko je aktivna moč še enaka nič. b) Naloge:  Odgovorite na spodnji vprašanji: 1. Kako dolgo traja latentna faza mišične kontrakcije? 2. Kaj se z mišico dogaja v tem navideznem obdobju mirovanja? C) Opazovanje vpliva velikosti dražljaja na mišično kontrakcijo Vzdražljivost je ena od lastnosti mišic. Skeletna mišica odgovarja na dražljaje različne jakosti z različno stopnjo krčenja. S povečevanjem dražljaja se povečuje tudi moč krčenja mišice zaradi naraščanja števila vzdraženih mišičnih vlaken. Mišica se popolnoma skrči, ko so vzdražena vsa mišična vlakna. Nadaljnje povečevanje dražljaja ne povzroči še večjega odziva. Ta poskus simulira aktivnost mišice in vivo, ko povečevanje števila vzdraženih motoričnih enot povečuje moč krčenja. Osnovna funkcionalna enota v intaktni mišici je motorična enota, ki jo sestavlja skupina mišičnih vlaken z motoričnim nevronom. Ko v motoričnem nevronu nastane akcijski potencial, se vsa mišična vlakna motorične enote skrčijo. Število mišičnih vlaken v motorični enoti je različno (mišice, ki izvajajo precizne gibe 3–5, mišice, ki izvajajo grobe gibe več 100 ali 1000). Posamezna motorična enota odgovarja na dražljaj po zakonu " vse ali nič " (kot srce): preslaboten dražljaj ne povzroči skrčenja, zadosti močen pa maksimalno skrčenje. Celotna mišica je sestavljena iz motoričnih enot z različnimi pragi vzdražljivosti. Dražljaj določene jakosti vzdraži samo tiste motorične enote, katerih prag vzdražljivosti je dosežen ali presežen. Ko je dosežen maksimalni dražljaj, se skrčijo vse mišične celice, zato se mišica skrči maksimalno. Če jakost dražljaja še povečujemo, ni možno še večje krčenje mišice. Glede na to ločimo več stopenj dražljajev:  subminimalni dražljaj ni zadosti močan, da bi vzdražil mišico;  minimalni dražljaj vzdraži mišico le toliko, da se minimalno skrči (krčijo se celice oz. motorične enote z najnižjim pragom);  maksimalni dražljaj – s stopnjevanjem jakosti dražljaja se mišica vse močneje krči, dokler ni dražljaj tako močan, da je dosežena maksimalna kontrakcija (skrčene so vse mišične celice oz. motorične enote);  supramaksimalni dražljaj – njegova jakost je večja od maksimalnega, vendar ne povzroči še večje kontrakcije mišice. a) Postopek: 1. Pred začetkom meritve izbrišemo predhodne zapise na osciloskopu. 2. Napetost uravnamo na 0 V in z ukazom Stimulate vzdražimo mišico. Po končani meritvi shranimo rezultate (Record Data). 3. Postopoma povečujemo napetost za 1 V in ponavljamo meritev, dokler ne dosežemo največje napetosti (10 V). Vsakokrat shranimo rezultate. 109 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA b) Naloge: 1. Rezultate meritev vnesite v tabelo! 2. Na osnovi dobljenih rezultatov grafično prikažite vpliv velikosti dražljaja (napetosti) na mišično kontrakcijo (abscisa – napetost [V]; ordinata – moč krčenja [gms])! Meritev Napetost [V] Moč krčenja [gm/s] 3. Odgovorite na spodnja vprašanja:  Kakšna je minimalna napetost, ki povzroči mišično kontrakcijo (prag vzdražljivosti)?  Kakšna napetost povzroči maksimalno kontrakcijo mišice?  Razložite opazovani pojav! Č) Vpliv temperature na enostavno mišično kontrakcijo Sprememba temperature vpliva tudi na enostavno mišično kontrakcijo, in sicer znižanje upočasni hitrost kontrakcije, povišanje pa jo pospeši. Krivulja enostavne mišične kontrakcije (slika 5.2) je ob segrevanju mišice bolj strma in krajša kot pred segrevanjem (ker vse tri faze potekajo hitreje in bolj intenzivno), ob ohladitvi mišice pa je bolj položna in daljša kot v prvem primeru (ker so vse faze enostavne mišične kontrakcije podaljšane). Slika 5.2: Vpliv temperature na enostavno mišično kontrakcijo A – mišica na sobni temperaturi (kontrola); B – ohlajena mišica; C – ogreta mišica; K – kontrakcija; R – relaksacij; k – trajanje kontrakcije; r – trajanje relaksacije ; h – amplituda 110 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA a) Material: mišični preparat, Ringerjeva raztopina za hladnokrvne živali (pri sobni temperaturi, segreta na 37 °C, ohlajena na 5 °C), kimograf, prirejen za registracijo mišičnih kontrakcij, električni stimulator, elektrode. b) Postopek: 1. Pripravimo mišični preparat in ga namestimo na kimograf. Na distalni in proksimalni del mišice pritrdimo elektrodi. Kimograf povežemo s stimulatorjem tako, da ob maksimalni hitrosti vrtenja vzdraži mišični preparat le en dražljaj. 2. Registriramo miogram enostavne mišične kontrakcije (na sobni temperaturi). 3. Preparat prelivamo s toplo Ringerjevo raztopino in registriramo enostavno mišično kontrakcijo ogretega preparata. 4. Preparat prelivamo z ledeno Ringerjevo raztopino in registriramo mišično kontrakcijo ohlajenega preparata. c) Naloge: 1. Ugotovite čas trajanja posameznih faz enostavne mišične kontrakcije pri različnih temperaturah! 2. Izračunajte, za koliko mm se je skrčila mišica pri posamezni kontrakciji! 5.1.2 Sestavljena mišična kontrakcija Prejšnji poskusi so pokazali, da je moč mišične kontrakcije mogoče povečati s povečevanjem napetosti dražljaja. Drugi način za povečanje moči mišične kontrakcije pa je povečanje frekvence dražljajev, ki stimulirajo mišico. V tem primeru vsak naslednji dražljaj povzroči novo kontrakcijo, preden se mišica relaksira. Skrajna oblika tega pojava je tetanična mišična kontrakcija, pri kateri dražimo mišico z dražljaji tako velike frekvence, da se mišica med posameznimi dražljaji sploh ne relaksira. Iz menija poskusa izberemo poglavje Več dražljajev (Multiple Stimulus). Edina sprememba opreme v primerjavi s predhodnimi poskusi (slika 5.1) je vidna na stimulatorju, kjer se nahajata ukaza Posamezni dražljaj (Single Stimulus) in Več dražljajev (Multiple Stimulus). Ob izbiri ukaza Multiple Stimulus se ta spremeni v ukaz za prekinitev draženja (Stop Stimulus), električni dražljaji pa prihajajo v mišico s frekvenco, prikazano pod tipko, dokler se mišica ne utrudi ali ne prekinemo draženja. Frekvenco dražljajev (št./sek) določimo z izbiro ukazov (+) ali (–) ob prikazu frekvence. A) Prikaz vpliva dveh zaporednih dražljajev na mišično kontrakcijo Ob delovanju dveh enako močnih dražljajev na mišico v časovnem intervalu, krajšem od trajanja enostavne mišične kontrakcije, nastane karakteristični zapis sumirane mišične kontrakcije (slika 5.3). Če drugi dražljaj nastopi v latentni fazi predhodne kontrakcije (manj kot 0,01 s za prvim), učinka ne bo, ker je mišica v latentni fazi nevzdražljiva. Če drugi dražljaj nastopi v fazi kontrakcije mišice (v aktivni fazi) po prvem dražljaju (več kot 0,01 s in manj kot 0,05 s za prvim), nastane sumirana kontrakcija, ki ima videz krivulje z enim vrhom, njena višina pa presega višino enostavne mišične kontrakcije. Če pa drugi dražljaj nastopi v fazi dekontrakcije (v pasivni fazi) po prvem dražljaju (več kot 0,05 s za prvim), nastane sumirana kontrakcija, ki ima videz krivulje z dvema vrhovoma, njena višina pa prav tako presega višino enostavne mišične kontrakcije. 111 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Slika 5.3: Sumirana mišična kontrakcija A – drugi dražljaj nastopi v fazi kontrakcije; B – drugi dražljaj nastopi v fazi relaksacije; Kk – kontrolna kontrakcija (ob stoječem kimografu); D1, D2 – prvi in drugi dražljaj; L1, L2 – latentna faza po 1. in 2. dražljaju; k1, k2 – trajanje kontrakcije po 1. in 2. dražljaju; h – amplituda kontrakcije po enem dražljaju; hs – amplituda sumirane kontrakcije a) Postopek: 1. Dolžino mišice naravnamo na 75 mm, napetost dražljaja pa na 8 V. Oznaka 200 msec naj bo na desnem robu ekrana osciloskopa. 2. Z ukazom Single Stimulus registriramo enostavno mišično kontrakcijo. 3. Meritev ponovimo s tem, da ukaz Single Stimulus naglo ponovimo dvakrat zapored. Ogledamo si zapis mišične kontrakcije. 4. Poskus ponavljamo tako, da spreminjamo interval med zaporednima dražljajema. b) Naloge:  Razložite vzroke za opazovani pojav!  Kako je povečevanje časovnega intervala vplivalo na obliko mišične kontrakcije? B) Tetanična mišična kontrakcija Kvaliteta mišične kontrakcije je odvisna od frekvence dražljajev, ki prihajajo v mišico. Da dobimo tetanično kontrakcijo pod eksperimentalnimi pogoji (slika 5.4), moramo uporabiti dražljaje določene frekvence in intenzivnosti. Glede na stopnjo frekvence lahko dobimo dve vrsti tetaničnih kontrakcij:  Nepopolni tetanični krč nastane, če je frekvenca dražljajev manjša od 20/s (vsak dražljaj pade v pasivno fazo predhodne kontrakcije). 112 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA  Popolni (gladki) tetanični krč pa nastane, če je frekvenca dražljajev večja od 20/s (vsak naslednji dražljaj pade v aktivno fazo predhodne kontrakcije). Ob tem nastopi popolna kontrakcija mišice, ki traja 10–20 sekund, nato pa zaradi utrujenosti upada. Slika 5.4: Tetanične kontrakcije mišic (D – dražljaji, NTK – nepopolna tetanična kontrakcija, TK – popolna tetanična kontrakcija, Hk – amplituda kontrolne kontrakcije, h1 – amplituda nepopolne tetanične kontrakcije, H1 – amplituda popolne tetanične kontrakcije, M – miogram, Kk – kontrolna kontrakcija) a) Postopek: 1. Dolžina mišice naj bo 75 mm, napetost dražljaja pa 5 V. 2. Frekvenco dražljajev uravnamo na 30/s. Z ukazom Multiple Stimulus poženemo simulacijo. Ko se zapis na osciloskopu približa desnemu robu ekrana, ustavimo poskus z ukazom Stop Stimulus. Z ukazom Record Data shranimo rezultate. 3. Meritev ponavljamo tako, da frekvenco dražljajev postopoma povečujemo (60/s, 90/s, 120/s in 150/s). Vsakokrat shranimo rezultate. b) Naloge: 1. Rezultate meritev vnesite v tabelo! Meritev Frekvenca dražljajev [s–1] Moč kontrakcije [gm/s] 2. Grafično ponazorite rezultate (abscisa – frekvenca dražljajev [s–1], moč kontrakcije [gms])! 3. Odgovorite na spodnja vprašanja:  Kako se spreminja oblika zapisa ob povečevanju frekvence dražljajev? Razložite vzroke za opazovani pojav!  Na grafikonu določite frekvenco dražljajev, nad katero se moč kontrakcije ne povečuje! 113 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA C) Utrujenost mišice Zaradi dolgotrajnega, neprekinjenega krčenja se mišica utrudi, zato se ne more več krčiti. Mišična utrujenost je posledica pomanjkanja ATP, ki se porablja tako pri kontrakciji kot pri dekontrakciji mišice. Nastopi zaradi kontrakcijskih in metaboličnih procesov v samem mišičnem vlaknu pa tudi procesov, ki potekajo v živčno-mišični sinapsi, motoričnem nevronu, sinapsah in v motoričnih centrih. Utrujena mišica na dražljaje najprej odgovarja slabo, potem pa sploh ne več. a) Postopek: 1. Dolžina mišice naj bo 75 mm, napetost dražljaja 10 V, frekvenca dražljajev pa 150/s. 2. Z ukazom Multiple Stimulus poženemo registracijo in jo ustavimo, ko zapis večkrat preide preko ekrana. b) Naloge:  Opišite in narišite miogram utrujanja mišice!  Razložite razloge za nastale spremembe! 5.1.3 Izotonična in izometrična mišična kontrakcija Mišične kontrakcije se glede na to, ali je med kontrakcijo možno krajšanje mišice ali ne, delijo na izotonične in izometrične. V organizmu se večinoma pojavljajo mešane kontrakcije.  Izotonična kontrakcija nastane, kadar se mišica lahko nemoteno krajša, pri čemer se njen tonus ne spreminja (npr. fleksije okončin).  Izometrična kontrakcija pa nastane, če je spreminjanje dolžine mišice onemogočeno, pač pa se ob kontrakciji spreminja njen tonus (napetost). Pri tem mišica ne opravlja zunanjega dela (npr. dviganje), pač pa notranje (povečanje tonusa). Take kontrakcije nastopijo npr. ob stoji v mišicah iztegovalkah nog in v žvekalnih mišicah ob drobljenju hrane (ko je stik med griznimi ploskvami že vzpostavljen). A) Proučevanje izometrične kontrakcije Pri izometrični kontrakciji se dolžina mišice ne spreminja. V eksperimentalnih pogojih to dosežemo s fiksacijo obeh koncev mišice. Dolžina mišice pred krčenjem je pomemben dejavnik, ki določa moč krčenja. Pasivna moč je posledica raztezanja mišice in je odvisna od njene elastičnosti. Aktivna moč pa nastane med fiziološkim krčenjem mišice. Skupna moč kontrakcije je vsota pasivne in aktivne moči in jo lahko izmerimo. Poskus poženemo z izbiro ukaza Izometrična kontrakcija (Isometric Contraction) iz menija poskusov. Pri tem poskusu je ekran osciloskopa razdeljen na dva dela, od katerih levi prikazuje zapis časovnega poteka mišične kontrakcije, desni pa podatke o aktivni, pasivni in skupni moči kontrakcije. a) Postopek: 1. Z izbiro oznak (+) oz. (–) ob ustreznih prikazih naravnamo moč dražljaja na 8,2 V, dolžino mišice pa na 75 mm. 2. Z ukazom Stimulate vzdražimo mišico in shranimo rezultate (Record Data). Na levem ekranu osciloskopa vidimo zapis enostavne mišične kontrakcije, na desnem pa tri točke, ki predstavljajo aktivno (rdeča pika), pasivno (zeleni kvadratek) in skupno (rumeni kvadratek) moč kontrakcije. 114 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA 3. Mišico skrajšamo na 50 mm (z oznako (–) ob prikazu dolžine mišice). Z ukazom Stimulate jo ponovno vzdražimo in shranimo rezultate (Record Data). 4. Stimulacijo ponavljamo tako, da vsakokrat povečamo dolžino mišice za 10 mm, dokler ne dosežemo največje dolžine 100 mm, in ob vsakem draženju shranimo rezultate. Meritev Dolžina mišice [mm] Aktivna moč [gm/s] Pasivna moč [gm/s] Skupna moč [gm/s] b) Naloge: 1. Rezultate meritev vnesite v tabelo! 2. Grafično prikažite razmerje med dolžino mišice in močjo kontrakcije (abscisa – dolžina mišice [mm], ordinata – moč kontrakcije [gms])! 3. Na osnovi dognanj, do katerih ste prišli pri poskusu, odgovorite na spodnji vprašanji:  Kaj se zgodi z aktivno in pasivno jakostjo, ko dolžina mišice narašča? Pojasnite opazovani pojav na celični ravni! B) Proučevanje učinka obremenitve na izotonično kontrakcijo Med izotonično kontrakcijo se dolžina mišice nemoteno spreminja, moč kontrakcije pa ostaja enaka. V eksperimentalnih pogojih en konec mišice ostaja prost in nanj lahko obešamo različne uteži, medtem ko je drugi konec fiksiran in povezan s pretvornikom. Če mišico postopoma obremenjujemo z vse težjim bremenom, se bo vedno šibkeje in vedno počasneje krčila. Ta pojav imenujemo razmerje med obremenitvijo in hitrostjo kontrakcije (force-velocity relationship). V posameznem mišičnem vlaknu je stopnja kontrakcije premo sorazmerna dolžini posamezne sarkomere pred začetkom kontrakcije. Vsaka sarkomera se bo skrčila z optimalno močjo, če je njena dolžina optimalna (niti predolga niti prekratka), preden se kontrakcija začne. Če mišico v mirovanju preobremenimo, se bodo njeni elastični in kontraktilni elementi raztegnili. Na molekularni ravni dolžina sarkomere odraža prekrivanje debelih in tankih filamentov. Teorija drsečih filamentov predpostavlja, da je moč kontrakcije mišičnih vlaken premo sorazmerna številu mostičkov med debelimi in tankimi filamenti.  Če se filamenti začno kontrahirati ob veliki dolžini sarkomere, se debeli in tanki filamenti komaj prekrivajo in tvorijo le malo mostičkov, kar pomeni, da na začetku kontrakcije drseči filamenti le minimalno sodelujejo, zato ne morejo ustvariti zadostne sile.  Pri optimalni dolžini sarkomere se filamenti začnejo kontrahirati z več mostički med debelimi in tankimi filamenti, zato se vlakna lahko optimalno skrčijo.  Če je sarkomera krajša od optimalne, so na začetku kontrakcije debeli in tanki filamenti preveč prekriti, zato debeli lahko premikajo kratke samo na kratki razdalji, preden se tanki aktinski filamenti nasprotnih strani sarkomere začno prekrivati. To pa prepreči formacijo mostičkov. Če se sarkomera preveč skrajša, debeli filamenti prehajajo v Z diske na koncu sarkomere, zato je tvorba mostičkov onemogočena, moč kontrakcije pa upada. 115 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Iz menija poskusa izberemo poglavje Izotonična kontrakcija (Isotonic Contraction). Oprema virtualnega laboratorija je podobna kot pri prejšnjih poskusih. V tem poskusu je omarica z utežmi odprta, z miško jih je mogoče namestiti na spodnjo kito preparata. Po obremenitvi mišice z utežmi je njena dolžina podana v prikazu Muscle Length. Z izbiro oznak (+) oz. (–) lahko uravnavamo višino podstavka za uteži, ki je prikazana v oknu Platform Hight. a) Postopek: 1. Z izbiro oznak (+) oz. (–) ob ustreznih prikazih naravnamo moč dražljaja na 10 V, višino podstavka uteži pa na 50 mm. 2. Na spodnjo tetivo mišice namestimo največjo utež (2 g). 3. Z ukazom Stimulate vzdražimo mišico in shranimo rezultate (Record Data). 4. Stimulacijo ponavljamo tako, da vsakokrat znižamo višino podstavka uteži za 10 mm (od 50 do 100 mm). Rezultate meritev shranimo. b) Naloge: 1. Rezultate meritev vnesite v tabelo! 2. Grafično prikažite razmerje med dolžino mišice in aktivno močjo krčenja (abscisa – višina podstavka [mm], ordinata – aktivna moč [gms])! 3. Odgovorite na spodnja vprašanja:  Kako je povečevanje dolžine mišice vplivalo na krčenje mišice?  Razložite vzroke za opazovani pojav! Meritev Dolžina [mm] Aktivna moč [gms] 5.1.4 Elastičnost mišic Mišica kaže svojo elastičnost na ta način, da se po prenehanju obremenitve povrne v prvotno stanje. Ta lastnost mišice je odvisna od njene strukture in od sprememb koloidnega stanja snovi, ki sestavljajo mišice. a) Material: mišični preparat, Ringerjeva raztopina za hladnokrvne živali, kimograf, električni stimulator, elektrode, uteži. b) Postopek: 1. Pripravimo mišični preparat ( m. gastrocnemius), ga namestimo na kimograf in povežemo z elektrodami stimulatorja. 2. Ob mirujočem kimografu registriramo enostavno mišično kontrakcijo, nato pa mišico postopoma obremenjujemo, registriramo enostavno mišično kontrakcijo in po vsaki registraciji premaknemo kimografski valj za 0,5 cm naprej. To ponavljamo toliko časa, dokler se dolžina mišice ne povečuje več. 3. Nato pričnemo mišico razbremenjevati in ves postopek ponavljamo, dokler ne snamemo vseh uteži. c) Naloge: 1. Narišite sliko zapisa, ki ste ga registrirali! 2. Razložite vzroke za nastale spremembe! 116 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA 5.2 ERGOMETRIJA Medtem ko je razmeroma lahko izmeriti silo, moč in delo ter prikazati utrujenost posameznih, izoliranih mišic, pa je težje meriti te elemente pri skupini mišic ali pri celotnem organizmu v gibanju ali pri delu. V ta namen so izdelani posebni aparati, imenovani ergometri ali dinamometri. Pri ljudeh je možno meriti moč in delo posameznih okončin (npr. Porterjev ročni, Asmussenov nožni ergometer). Izdelani so tudi ergometri za merjenje sile udarca, stiska rok, čeljusti itd. Najpogosteje se pri ljudeh uporabljajo ergometri v obliki kolesa. Pri teh se ob obremenitvi merijo tudi različni drugi fiziološki parametri (npr. frekvenca srca, krvni tlak, EKG, frekvenca dihanja, poraba kisika, količina izločenega ogljikovega dioksida). Ergometrija pri živalih se lahko opravlja ob delu (tek, vleka voza), nakar se elementi opravljenega dela izračunajo. Natančne podatke pa lahko dobimo z uporabo posebej izdelanih ergometrov v obliki tekočega traku (angl. treadmill). S to napravo je možno natančno kontrolirati obremenitev živali, s priključenimi merilnimi napravami pa meriti spremembe fizioloških parametrov, jemati kri v določenih časovnih presledkih itd. 5.2.1 Utrujanje prstnih mišic pri človeku Utrujanje prstnih mišic pri človeku lahko prikažemo z ergografom (slika 5.5). Kimografski zapis, ki ga dobimo ob tem, imenujemo ergogram. Na tem zapisu lahko vidimo, da se amplituda kontrakcij med daljšim mišičnim delom postopoma manjša in na koncu popolnoma preneha. Ergogram je lahko individualno različen, odvisen od stopnje obremenitve, tempa dela ter fizičnega in psihičnega stanja poskusne osebe. a) Material:  ergograf, aparat za registracijo, metronom, sfigmomanometer. b) Postopek: 1. Poskusna oseba namesti roko v ergometer, na enega od prstov pa namestimo zanko, na kateri visi utež. V skladu z ritmom metronoma naj s prstom dviga utež tako dolgo, da amplituda kontrakcij, ki jih registriramo na kimografskem valju, pade za polovico. Poskus ponavljamo z različnimi prsti in različno težkimi utežmi. 2. Poskus ponovimo, s tem da na nadlaket poskusne osebe namestimo manšeto sfigmomanometra in jo napolnimo do tlaka 30 kPa. 3. Registracijo utrujenosti prstnih mišic izvedemo še potem, ko je poskusna oseba 10 minut namakala roko v ohlajeni vodi. 4. Nato registracijo utrujenosti prstnih mišic izvedemo še potem, ko je poskusna oseba 10 minut namakala roko v vroči vodi. c) Naloge: 1. Primerjajte med seboj rezultate dela različnih prstov na levi in desni roki! 2. Izračunajte opravljeno delo prstnih mišic do nastopa mišične utrujenosti! 3. Primerjajte rezultate meritev pri normalnem delu prstov in po blokiranju krvnega obtoka ter po ohladitvi ali segrevanju prstov! 117 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Slika 5.5: Ergograf (na vzmet) za registriranje utrujenosti prstnih mišic 5.3 FIZIOLOGIJA GIBANJA Za vzdrževanje položaja telesa pri stoji in gibanju ima vsaka živalska vrsta razvit specifičen gibalni aparat. Glavni deli gibalnega aparata so okončine in hrbtenica, vendar pa pri vzdrževanju statičnih in dinamičnih funkcij sodelujejo tudi drugi organi, npr. rep, glava in vrat. 5.3.1 Mehanski vplivi na potek gibanja A) Težišče Telo živali je pod vplivom sile težnosti, ki deluje na vse dele telesa. Položaj težišča je odvisen od oblike in drže telesa in ima velik vpliv na njegovo statiko in dinamiko. Težišče in obremenitev prednjih in zadnjih okončin pri živalih lahko določimo s posebno tehtnico ( po Borelliju). Položaj težišča in od tega odvisna obremenitev okončin sta odvisna od vrste živali, pasme in drže telesa. Težišče živali je v notranjosti prsnega koša, nad ksifoidnim podaljškom, pri človeku pa na področju medenične votline. Težišče pri konju in govedu leži relativno kavdalno; prednje noge pri konju nosijo približno 58 % mase telesa, pri govedu pa 55 %. Pri psih prednje noge nosijo približno 62 % telesne teže (pri pasmi mali angleški hrt celo 79 %). Položaj težišča in obremenitev nog ima velik pomen za stojo in gibanje živali. Glede na položaj težišča živali laže hodijo naprej kot nazaj. Z dviganjem glave in vratu se težišče pomakne nazaj, s spuščanjem pa naprej. Vpliv na položaj težišča ima tudi nošenje bremena ali vlečenje tovora. Pri delovnih konjih se npr. s spuščanjem glave in vratu težišče pomakne naprej, prednje noge so zato bolj obremenjene s težo telesa, z razbremenitvijo zadnjih nog pa se poveča njihova delovna moč. Pri dresurnih konjih pa se z dviganjem glave in vratu razbremenijo prednje noge. Tudi pri ustavljanju ob večji hitrosti se glava in vrat dvigneta in težišče pomakne nazaj. 118 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Slika 5.6: Oporna ploskev in vpliv položaja glave na težišče konja B) Oporna ploskev Pri četveronožcih ima oporna ploskev obliko pravokotnika, katerega vogale predstavljajo podplatne ploskve okončin. Telo je v ravnotežju, če težiščnica pada na oporno ploskev. Če težišče živali ne leži natanko na sredini med prednjima in zadnjima nogama (v središču pravokotnika), bo žival vedno imela na razpolago dva alternativna podporna trikotnika, katerih vogale predstavljata dve nogi bliže težišču in ena bolj oddaljena (slika 5.6). Stoječega četveronožca je razmeroma težko spraviti iz ravnotežja, dokler stoji na vseh štirih nogah. Takoj, ko stoji le na treh nogah, je oporna ploskev spremenjena v trikotnik in zmanjšana na polovico, zato je tudi ravnotežje manj stabilno (slika 5.6). Glede na položaj težišča je žival lažje vreči iz ravnotežja v stran, kar ima velik pomen pri podiranju velikih živali. Za razliko od četveronožcev je oporna ploskev pri dvonožcih (npr. človeku) majhna, težišče pa razmeroma visoko. Zato je za stojo na dveh nogah potrebno nekoliko večje mišično delo, večji nagibi človeka v stoji pa niso možni zaradi hitre izgube ravnotežja. Da bi se lahko obdržalo ravnotežje pri stoji, je potrebna določena trdnost sklepov in mišično delo, zato se mišice ob tem utrujajo in je trajanje stoje omejeno. Kopitarji za razliko od drugih živali ne kažejo znakov utrujenosti ob stoji in lahko zelo dolgo stojijo ali celo spijo stoje, ker imajo okončine, zlasti prednje, pretežno fiksirane s tetivami in le malo z mišicami. 5.3.2 Ležanje Ob ležanju je težišče najbliže oporni ploskvi, zato za ohranjanje ravnotežja mišično delo ni potrebno in si mišice najbolj odpočijejo. Živali običajno ne leže na hrbtu (kot človek) zaradi specifične zgradbe hrbtenice.  Konj navadno leži bočno, glava in vrat sta dvignjena, okončine pa skrčene. Pri veliki utrujenosti se uleže popolnoma, okončine pa so skrčene ali iztegnjene.  Prežvekovalci leže podobno kot konji, s tem da imajo glavo obrnjeno nazaj.  Prašič leži popolnoma bočno.  Mesojedi leže na različne načine, pogosto z glavo med trebuhom in okončinami, pri čemer je hrbtenica upognjena. 119 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA 5.3.3 Spreminjanje položaja na mestu Med gibanja, ki se odvijajo na mestu, štejemo leganje, vstajanje, vzpenjanje na zadnje noge in brcanje. Zanje je značilno, da se izvajajo z določenimi gibi in s specifičnim vrstnim redom, značilnim za določeno vrsto živali.  Leganje: Konj skrči noge in se spusti na eno ali drugo stran, ob tem drži glavo in vrat visoko. Prežvekovalec spusti glavo, skrči prednje noge in se spusti na oba karpalna sklepa, potem pa pomakne zadnje noge čimbolj kranialno, jih skrči in se spusti na tla. Prašič, pes in mačka najprej skrčijo zadnje noge, nato pa prednje.  Vstajanje: Konj se iz bočnega ležečega položaja namesti v trebušno-prsnega tako, da noge potegne pod trebuh, nato nagne glavo naprej in se dvigne najprej na prednje noge in potem na zadnje. Prežvekovalec izravna telo na skrčenih prednjih nogah, nato se dvigne na zadnje noge, potisne prednje naprej eno za drugo in se dvigne še s prednjimi. Prašič in mesojedi vstajajo podobno kot konj. Pes in mačka se lahko iz ležečega položaja takoj dvigneta na vse štiri noge.  Vzpenjanje na zadnje noge se pri vseh samcih izvaja kot uvod v koitus, pri konjih ima obrambno funkcijo, vidimo pa ga lahko tudi pri mladičih med igro. Ob tem se zadnje noge pomaknejo pod telo, glava in vrat pa se dvigneta. S tem se težišče telesa pomakne nazaj. Z iztegnjenimi prednjimi nogami se žival dvigne na zadnjih. Tedaj je oporna ploskev zelo majhna, ravnotežje pa slabo. Za vzdrževanje ravnotežja je potrebno veliko naprezanje mišic, zato žival tega položaja ne vzdrži dolgo.  Brcanje izvajajo konji in govedo v obrambne namene, in sicer z eno ali obema zadnjima nogama tako, da jih hitro in močno iztegnejo nazaj (konj) ali vstran in nazaj (govedo). Kadar se brcanje izvaja z eno nogo, se stabilnost ravnotežja zmanjša za polovico, zato se brcanje lahko prepreči z dviganjem noge na strani, kjer nas žival lahko brcne. Med brcanjem z obema zadnjima nogama (ritanje) se težišče s spuščanjem glave in vratu premakne naprej, zato ga lahko preprečimo, če glavo in vrat živali zadržimo, da je ne more skloniti. Ker konj brca običajno nazaj, pregledujemo njegove zadnje noge z bočne strani, pri govedu pa je treba stati zadaj, ker navadno brca vstran. 5.3.4 Hoja živali Hoja je koordinirano gibanje okončin, ki poteka ponavljajoče se po določenem, za vsako vrsto hoje specifičnem zaporedju. Gibanje okončin spremlja gibanje različnih delov telesa, npr. nihanje glave, vratu, ušes in repa živali, ritmična nihanja hrbta), ki omogočajo sprotno uravnavanje težišča živali. Premikanje naprej poteka z iztezanjem okončin, še zlasti zadnjih, pri čemer se težišče telesa pomika naprej. Različne faze gibanja posameznih okončin si sledijo hitro ena drugi, med posameznimi okončinami pa obstaja določen fazni zamik. Ob hoji se vsaka posamezna okončina premika po določenem zaporedju gibov: stopalo se dotakne tal pred ramenskim (kolčnim) sklepom in ostane na tleh, dokler se ramenski (kolčni) sklep ne premakne pred stopalo; nato se odrine, dvigne in v zraku pomakne naprej ter pripravi za naslednji korak. Glede na to ločimo štiri faze gibanja okončine: fazo naslanjanja in fazo odrivanja, ko stopalo stoji na tleh, ter fazo dviganja in fazo lebdenja, ko je stopalo v zraku. 120 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Slika 5.7: Faze gibanja prednjih okončin konja (a) dviganje, b) lebdenje, c) naslanjanje, d) odrivanje) Pri živalih, ki hodijo po tleh, ločimo glede na hitrost gibanja hojo in tek, pri teku pa ločimo kas in galop. Različne oblike gibanja so najbolje proučene pri konju zaradi njegovega pomena v transportu in športu. Zato je tudi večina oblik hoje v nadaljnjem besedilu opisana pri konju, čeprav se pri drugih vrstah četveronožcev ne razlikujejo bistveno. A) Hoja in tek dvonožcev Dvonožci (človek, nekatere ptice) se izmenoma podpirajo z eno in obema nogama.  Pri hoji v koraku ena noga (pasivna) stoji na tleh, druga (aktivna) pa se odriva, dviga in spusti na tla. Šele tedaj se vse ponovi z drugo nogo (aktivna in pasivna noga se zamenjata). Zato pri tej obliki gibanja ob vsakem koraku nastopi trenutek, ko sta obe okončini na tleh.  Pri teku se izmenično ena noga dviga in lebdi, druga pa se opira na tla. Stopala se krajši čas dotikajo tal kot lebdijo, zato ob vsakem koraku telo določen trenutek lebdi v zraku (pasivna noga se odrine, preden aktivna stopi na tla). Drugi način gibanja nekaterih dvonožcev (kenguruji, nekatere vrste glodavcev in ptic) pa je sonožno poskakovanje. A B Slika 5.8: Časovni potek hoje (A) in teka (B) dvonožcev (x – naslanjanje, y – lebdenje) 121 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA B) Kljusanje (pas) To je najenostavnejše gibanje četveronožcev, ki je značilno za kamele, slone, žirafe, bizone in gnuje. Pri konju je redko in ga lahko opazimo le pri nekaterih pasmah konj. Lahko ga opazimo tudi pri domačih mesojedih, kjer je običajno znak utrujenosti. Ker pri tej obliki hoje prednja in zadnja noga iste strani izvajata iste, sinhronizirane gibe, govorimo o dvojno simetričnem hodu. Pri tej obliki gibanja vsak ciklus sestavljata dve obdobji naslanjanja in dve obdobji lebdenja, zato se v vsakem ciklusu slišita dva udarca kopit. Zanj je značilno izmenično nagibanje telesa levo in desno. Ob kljusanju se hitrost gibanja lahko spreminja brez spreminjanja vrstnega reda nog. Pri tem lahko konji presežejo tudi hitrost 50 km/h. Slika 5.9: Kljusanje (pes) (1 – odrivanje desnega ipsilateralnega para, 2 – naslanjanje levega ipsilateralnega para) C) Kas Tudi kas je dvojno simetrični hod, pri katerem sta hkrati aktivni diagonalni nogi. Tudi pri tej obliki gibanja vsak ciklus sestavljata dve obdobji naslanjanja in dve obdobji lebdenja (slika 5.10), zato se v vsakem ciklusu slišita dva udarca kopit. Dolžina koraka je 1,8 do 5,9 m, hitrost gibanja pa je povprečno 18 km/h (2,8 do 14,2 m/s oziroma 10 do 50 km/h). Glede na razmerje med časom naslanjanja in lebdenja ločimo štiri osnovne tipe kasa: delovni, srednji, pojačani in kratki kas. Pri kratkem kasu (slika 5.11 (A)) je faza naslanjanja daljša kot faza lebdenja, zato se v določenem trenutku vse štiri noge dotikajo tal. Pri pojačanem kasu (slika 5.11 (B)) pa naslanjanje traja krajši čas kot lebdenje, zato se v določenih fazah noge ne dotikajo tal, pač pa lebdijo v zraku. Da bi bilo to možno, je potreben določen pospešek v višino, kar povzroča vertikalno nihanje telesa. 122 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Slika 5.10: Faze gibanja konja v kasu (1 – naslanjanje desnega diagonalnega para, 2 – naslanjanje levega diagonalnega para) Slika 5.11: Časovni potek gibanja okončin pri konju v kratkem (A) in dolgem (B) kasu ( x – naslanjanje, y – lebdenje, pd – prednja desna, pl – prednja leva, zd – zadnja desna, zl – zadnja leva noga) 123 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Č) Hoja v koraku To je najpočasnejša oblika gibanja četveronožcev, pri kateri prednje in zadnje noge izvajajo enake gibe, vendar ne istočasno, pač pa s faznim premikom za približno pol koraka. Naslanjanje na tla je pri hoji v koraku vedno hkrati vsaj z dvema nogama, in to tako, da je med istostranskimi (ipsilateralnimi) naslanjanji vrinjeno eno diagonalno. Vrstni red je tak: ipsilateralni par, diagonalni par, ipsilateralni par druge strani, diagonalni par, ponovitev. Zato pri konju v koraku v vsakem ciklusu slišimo štiri udarce kopit (slika 5.12). Dolžina koraka pri tej vrsti gibanja je 1,2–1,8 m, hitrost gibanja pa je 1,2–1,8 m/s (4,3–6,5 km/h). Glede na časovno razmerje med trajanjem faze lebdenja in naslanjanja ločimo svobodni in delovni korak. Nekateri avtorji pa razlikujejo kratki, okrepljeni, srednji in svobodni korak. Pri svobodnem koraku (slika 5.13 (A)) fazi naslanjanja in lebdenja trajata enako dolgo, telo pa se v vsakem trenutku naslanja na dve nogi. Dolžina koraka je 1,3–1,8 m, hitrost je 6–7 km/h. Pri delovnem koraku (slika 5.13 (B)) pa je faza naslanjanja nog daljša kot faza lebdenja, zato se telo največ časa naslanja hkrati na tri noge. Hitrost gibanja je manjša kot pri prosti hoji. Hoja nazaj je po načinu premikanja nog podobna kot kas: diagonalni par nog stopi skoraj hkrati nazaj in se dotakne tal, preden se od tal odrine drugi diagonalni par. Ta oblika gibanja vsem štirinožcem dela težave zaradi pomanjkanja vaje, strahu, šibkega mišičja prednjih nog in slabe kostne povezave med prednjimi nogami in trupom. Slika 5.12: Faze gibanja konja pri hoji v koraku (1 – naslanjanje zadnje desne noge, 2 – naslanjanje prednje leve noge, 3 – naslanjanje zadnje leve noge, 4 – naslanjanje prednje leve noge) 124 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Slika 5.13: Časovni potek gibanja okončin konja: v prostem (A) in delovnem koraku (B) (pd – prednja desna, pl – prednja leva, zd – zadnja desna, zl – zadnja leva noga) D) Galop Pri galopu se noge gibljejo nesimetrično. Dviganje nog in spuščanje na zemljo poteka v naslednjem vrstnem redu: prva zadnja, druga zadnja in diagonalna prednja hkrati ter nazadnje druga prednja (slika 5.14). Pri tem gibanju telo znaten čas lebdi v zraku. Ker se diagonalni par nog giblje sinhrono, se pri galopu slišijo trije udarci (tritaktni – canter galop). Pri tej obliki galopa je pri konju dolžina korakov 2 do 4,5 m, hitrost gibanja pa 2,9 do 9 m/s (10,4 do 32,4 km/h). Vodeča prednja noga pri galopu je tista, ki zadnja zapušča tla. Ta noga se najbolj iztegne naprej in glede na to ločimo levi in desni galop. Če se diagonalni pari ne gibljejo popolnoma sinhrono, pa se lahko slišijo štirje udarci ( grand galop). Pri tej vrsti galopa (slika 5.16) pride do desinhronizacije diagonalnega para nog, ki ne stopi na tla hkrati, pač pa najprej z zadnjo, nato pa šele s sprednjo nogo. Od časovnega zamika med prednjo in zadnjo nogo diagonalnega para je odvisna dolžina koraka in s tem tudi hitrost galopa. Pri štiritaktnem galopu konji dosežejo dolžino korakov 4,5 do 7,2 m in hitrost pa 9 do 20 m/s (32,4 do 70 km/h). Glede na trajanje faze naslanjanja in lebdenja (slika 5.15) razlikujemo kratki (šolski) galop, pri katerem sta fazi lebdenja in naslanjanja enako dolgi, srednji galop, pri katerem je faza naslanjanja nekoliko krajša od faze lebdenja, in hitri galop, pri katerem je faza lebdenja znatno daljša od faze naslanjanja. Pasji ali ciklični galop (slika 5.17) sestoji iz skokov z zadnjih nog na prednje. Gibanje parov nog pri tem ni nujno popolnoma sinhronizirano. Tako galopirajo mali psi, mačke, večina glodavcev in prežvekovalci. 125 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Slika 5.14: Faze gibanja konja v levem tritaktnem galopu (1 – naslanjanje zadnje desne noge, 2 – naslanjanje desnega diagonalnega para, 3 – naslanjanje prednje leve noge) Slika 5.15: Časovni potek gibanja okončin konja v desnem tritaktnem galopu (pd – prednja desna, pl – prednja leva, zd – zadnja desna, zl – zadnja leva noga) 126 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA Slika 5.16: Faze gibanja konja v levem štiritaktnem galopu (1 – naslanjanje zadnje desne noge, 2 – naslanjanje zadnje leve noge, 3 – naslanjanje prednje desne noge 4 – naslanjanje prednje leve noge) Slika 5.17: Ciklični galop psa 127 10 FIZIOLOGIJA MIŠIC IN GIBANJA E) Skok konja Lahko se opravi z mesta, iz različnih hodov, najlaže pa iz galopa. Konj se v galopu močno odrine z iztegnjeno prednjo nogo, tako da težišče pade na zadnji del telesa (sliki 5.18 (a) in (b)). Močno skrčene zadnje noge se naglo iztegnejo in dajo zalet za skok (slika 5.18 (c)). Prednje noge preidejo oviro v skrčenem položaju, nato pa se takoj iztegnejo in premikajo naprej. Pri doskoku se najprej dotakne tal prva iztegnjena prednja noga, nato druga prednja (slika 5.18 (č)). Maksimalno skrčene zadnje noge lebde nad zapreko in se dotaknejo tal, ko so jih prednje (ali vsaj ena prednja) že ponovno zapustile (sliki 5.18 (d) in (e)). Po skoku konj spet nadaljuje z galopom in lahko ponovno brez težav skoči čez naslednjo zapreko. Slika 5.18: Skok konja (razlaga je v tekstu) 128 LITERATURA LITERATURA  Cestnik V, Čebulj-Kadunc N: Poskusi in demonstracije v fiziologiji. Del 1. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 1993.  Cestnik V, Čebulj-Kadunc N: Poskusi in demonstracije v fiziologiji. Del 2. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 1994.  Cestnik V: Fiziologija domačih živali: uvod, splošna fiziologija, fiziologija krvi. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 1993.  Cestnik V: Fiziologija endokrinega sistema pri domačih živalih. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 1996.  Cestnik V: Fiziologija krvnega obtoka, dihanja, izločanja, urejanja pH in termoregulacije pri domačih živalih. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 1995.  Cestnik V: Fiziologija prebave pri domačih živalih. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 1994.  Cestnik V: Metabolizem pri domačih živalih. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 1995.  Cotter SM: Hematology. 2nd ed. Jackson Hole, Wyoming: Teton NewMedia, 2001.  Cunningham's textbook of veterinary physiology. 5th ed. St. Louis (Missouri): Elsevier Saunders, 2013.  Dukes' physiology of domestic animals. 12th ed. Ithaca: Cornell University Press, 2004.  Eades SC, Bounous DI: Laboratory profiles of equine diseases. St. Louis: Mosby, 1997.  Engelking L, Rebar AH: Metabolic and Endocrine Physiology. Jackson Hole, Wyoming: Teton NewMedia, 2006.  Farm animal metabolism and nutrition. Wallingford: CABI Publishing, 2000.  Hlastala MP, Berger AJ: Physiology of respiration. Oxford: Oxford University Press, 2001.  Jain NC: Essentials of veterinary hematology. Philadelphia: Lea & Febiger, 1993.  McLean JA, Tobin G: Animal and human calorimetry. Cambridge: Cambridge University Press, 2002.  Nemec Svete A, Frangež R: Klinična biokemija v veterinarski medicini: učbenik za študente veterinarske medicine. Ljubljana: Veterinarska fakulteta, 2013.  Osborne CA, Davis LS, Sanna J, Unger LK, O'Brien TD, Clinton CW, Davenport MP. Identification and interpretation of crystalluria in domestic animals: a light and scanning electron microscopic study. J Vet Med 1990; 85(1):18–37.  Pivk B: Vaje iz hematologije [Elektronski vir]: delovni zvezek za 3. letnik srednje tehniške šole. Ljubljana: Center RS za poklicno izobraževanje, 2007. 129 LITERATURA  Sjaastad ØV, Sand O, Hove K: Physiology of Domestic Animals. Oslo: Scandinavian Veterinary Press, 2010.  Stabler T, Peterson G: PhysioEx 5.0 laboratory simulations in physiology: with worksheets for human physiology. San Francisco: Benjamin Cummings, 2005.  Zakon o zaščiti živali. Ur List RS 2013; 38: 1457 (3. 5. 2013)  Zakon o meroslovju. Ur List RS 2005; 26: 892. (15.3.2005)  Williams AG, Coleman GS: The rumen protozoa. New York: Springer-Verlag, 1992. 130