UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA Erika PRAŠNIKAR VZOREC IZRAŽANJA GENOV V ENDOMETRIJU V STANJU RECEPTIVNOSTI PRI PREISKOVANKAH Z ADENOMIOZO DOKTORSKA DISERTACIJA Ljubljana, 2022 UNIVERZA V LJUBLJANI BIOTEHNIŠKA FAKULTETA INTERDISCIPLINARNI DOKTORSKI ŠTUDIJ PROGRAMA BIOMEDICINA ZNANSTVENO PODROČJE GENETIKA Erika PRAŠNIKAR VZOREC IZRAŽANJA GENOV V ENDOMETRIJU V STANJU RECEPTIVNOSTI PRI PREISKOVANKAH Z ADENOMIOZO DOKTORSKA DISERTACIJA GENE EXPRESSION PROFILE OF ENDOMETRIUM IN RECEPTIVE STATE IN WOMEN WITH ADENOMYOSIS DOCTORAL DISSERTATION Ljubljana, 2022 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in sklepa Komisije za doktorski študij z dne 05.02.2019 je bilo potrjeno, da kandidatka izpolnjuje pogoje za opravljanje doktorata znanosti na Interdisciplinarnem doktorskem študijskem programu Biomedicina, znanstveno področje genetika. Za mentorja je bil imenovan prof. dr. Borut Kovačič in za somentorico prof. dr. Tanja Kunej. Doktorsko delo je zaključek Interdisciplinarnega doktorskega študijskega programa Biomedicina, znanstveno področje genetika. Raziskovalno delo je bilo opravljeno na Oddelku za reproduktivno medicino in ginekološko endokrinologijo, Univerzitetni klinični center Maribor. Del raziskav je potekal v Centru za humano molekularno genetiko in farmakogenomiko, Medicinske fakultete, Univerze v Mariboru. Komisija za oceno in zagovor: Predsednik: prof. dr. Damjan GLAVAČ Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Inštitut za patologijo Član: doc. dr. Karin WRTITZL Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, Klinični inštitut za genomsko medicino Član: prof. dr. Jernej JAKŠE Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za agronomijo Datum zagovora: 16.11.2022 Erika Prašnikar II Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ŠD Dd DK UDK 575:618.1(043.3) KG adenomiza, bioinformatika, endometrijska receptivnost, endometrioza, genetika, integracija podatkov, qPCR, RNA-seq, obogatitvene analize, transkriptomika AV PRAŠNIKAR, Erika, univ. dipl. bioteh. (UN) SA KOVAČIČ, Borut (mentor), KUNEJ, Tanja (somentorica) KZ SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 ZA Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Interdisciplinarni doktorski študijski program Biomedicina, znanstveno področje genetika LI 2022 IN VZOREC IZRAŽANJA GENOV V ENDOMETRIJU V STANJU RECEPTIVNOSTI PRI PREISKOVANKAH Z ADENOMIOZO TD Doktorska disertacija OP XIII, 148 str., 4 pregl., 10 sl., 2 pril., 285 vir. IJ sl JI sl/en AI Nižja stopnja zanositve pri ženskah z adenomiozo maternice se povezuje z ovirano endometrijsko receptivnostjo za vgnezdenje zarodka. Pripadajoči molekularni vzroki so slabo raziskani zaradi preteklih tehnoloških omejitev neinvazivnih diagnostičnih metod za odkrivanje adenomioze. S pristopi sistemske biologije smo zato identificirali kandidatne biološke poti/gene spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Izvedli smo analizo RNA sekvenciranja (RNA-seq) endometrija v pričakovanem stanju receptivnosti ženskam z (n = 10) in brez (n = 10) ultrazvočnih znakov adenomioze. Identificirane spremenjeno izražene gene smo dalje integrirali s podatki iz pregleda literature, da bi razumeli njihov pomen v povezavi z molekularno biologijo endometrija. Zbrali smo poročane transkripte in proteine, povezane z endometrijsko receptivnostjo pri adenomiozi, pri sorodni, a bolje raziskani endometriozi in pri zdravi maternici, ter poenotili njihovo poimenovanje po genski nomeklaturi zbirke HGNC. S primerjavo podatkov RNA-seq samo potrjeno receptivnih vzorcev (8 adenomioznih in 5 kontrolnih) smo zaznali 382 spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05), ki so bili v največji meri obogateni v poteh, povezanih z odzivi na signalizacijo interferonov, in v poti celične adhezije. Z integracijo zbranih 382 (RNA-seq), 42 (adenomioza), 173 (endometrioza) in 151 (zdrava maternica) genov smo identificirali obogatene poti organizacija zunajceličnega matriksa, regulacija reproduktivnih procesov, odziv na VEGF in signalizacija z interlevkini, ki jih predlagamo kot dodatne kandidate za preučevanje endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Rezultate RNA-seq omejuje neznačilno spremenjeno izražanje genov po popravku vrednosti p (FDR > 0,05), kar bi lahko bila posledica nizkega števila uporabljenih vzorcev. Na podlagi analize podatkov iz dosedanje literature in lastnih rezultatov RNA-seq sklepamo, da je endometrijska receptivnost pri ženskah z adenomiozo spremenjena na ravni signalizacije s citokini imunskega sistema. III Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD) DN Dd DC UDC 575:618.1(043.3) CX adenomyosis, bioinformatics, data integration, endometrial receptivity, endometriosis, genetics, gene set enrichment analysis, qPCR, RNA-seq, transcriptomics AU PRAŠNIKAR, Erika AA KOVAČIČ, Borut (supervisor), KUNEJ, Tanja (co-advisor) PP SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101 PB University of Ljubljana, Biotechnical faculty, Interdisciplinary Doctoral Programme in Biomedicine, Scientific Field Genetics PY 2022 TI GENE EXPRESSION PROFILE OF ENDOMETRIUM IN RECEPTIVE STATE IN WOMEN WITH ADENOMYOSIS DT Doctoral dissertation NO XIII, 148 p., 4 tab., 10 fig., 2 ann., 285 ref. LA sl AL sl/en AB Lower pregnancy rate in women with uterine adenomyosis is associated with impaired endometrial receptivity for embryo implantation. The underlying molecular causes are poorly understood due to past technological limitations of non-invasive methods to diagnose adenomyosis. We therefore applied systems biology approaches to identify candidate biological pathways/genes of altered endometrial receptivity in adenomyosis. We performed RNA sequencing (RNA-seq) analysis of the endometrium in the expected receptive state in women with (n = 10) and without (n = 10) ultrasound signs of adenomyosis. The identified differentially expressed genes were further integrated with data from the literature mining to understand their relevance in the context of endometrial molecular biology. We gathered reported transcripts and proteins associated with endometrial receptivity in adenomyosis, in related but better-studied endometriosis and in healthy uterus, and adopted their gene nomenclature according to the HGNC database. The comparison of RNA-seq data of only confirmed receptive samples (8 adenomyosis and 5 controls) identified 382 differentially expressed genes ( p < 0.05) further mostly enriched in pathways associated with responses to interferon signalling and in pathway related to cell adhesion. By integration of gathered 382 (RNA-seq), 42 (adenomyosis), 173 (endometriosis) and 151 (healthy uterus) genes we identified enriched pathways extracellular matrix organisation, regulation of reproductive processes, VEGF response and signalling by interleukins, which we propose as additional candidate pathway for studying endometrial receptivity in adenomyosis. Our RNA-seq results are limited by insignificant gene expression difference after p-value correction (FDR > 0.05), which may be due to the small sample size. Based on the analysis of existing literature and own RNA-seq results, we conclude that endometrial receptivity in adenomyosis is altered at the level of immune cytokine signalling. IV Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO VSEBINE KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA (KDI) ................................................. III KEY WORDS DOCUMENTATION (KWD) ......................................................................... IV KAZALO VSEBINE ................................................................................................................. V KAZALO ZNANSTVENIH DEL ........................................................................................ VIII KAZALO PREGLEDNIC........................................................................................................ IX KAZALO SLIK ......................................................................................................................... X PRILOGE ................................................................................................................................. XI OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ................................................................................................... XII SLOVARČEK ....................................................................................................................... XIII 1 UVOD S PREDSTAVITVIJO PROBLEMATIKE, CILJEV IN HIPOTEZ..... 1 1.1 PREDSTAVITEV PROBLEMATIKE ...................................................................... 2 1.1.1 Maternica .................................................................................................................. 2 1.1.2 Menstruacijski ciklus endometrija ......................................................................... 2 1.1.3 Molekularni dejavniki vgnezdenja zarodka .......................................................... 3 1.1.4 Adenomioza .............................................................................................................. 5 1.1.4.1 Patogeneza ................................................................................................................. 5 1.1.4.1.1 Podtip I ali notranja adenomioza (angl. intrinsic adenomyosis) ................................ 6 1.1.4.1.2 Podtip II ali zunanja adenomioza (angl. extrinsic adenomyosis) .............................. 7 1.1.4.1.3 Podtip III ali intramuralna adenomioza (angl. intramural adenomyosis).................. 8 1.1.4.1.4 Podtip IV ali nedoločena adenomioza (angl. indeterminate adenomyosis) ............... 8 1.1.4.2 Vpliv na plodnost ....................................................................................................... 8 1.1.4.3 Dejavniki vpliva na endometrijsko receptivnost ....................................................... 9 1.1.5 Omske raziskave endometrija pri različnih ginekoloških stanjih ..................... 11 1.1.5.1 Endometrijska receptivnost (zdrava maternica) ...................................................... 12 1.1.5.2 Adenomioza ............................................................................................................. 12 1.1.5.3 Sorodna bolezen endometrioza ................................................................................ 13 1.2 NAMEN RAZISKAVE IN DELOVNE HIPOTEZE .............................................. 14 1.3 CILJI ........................................................................................................................ 14 2 ZNANSTVENA DELA .......................................................................................... 15 2.1 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA ................................................................. 18 2.1.1 Molekularni podpis evtopičnega endometrija pri endometriozi na podlagi večomske integracijske sinteze ............................................................................. 18 2.1.2 Določanje molekularnega ozadja endometrijske receptivnosti pri adenomiozi .............................................................................................................. 38 2.1.3 Transkriptomika receptivnega endometrija žensk s sonografskimi značilnostmi adenomioze....................................................................................... 64 2.2 OSTALO POVEZOVALNO ZNANSTVENO DELO ........................................... 81 2.2.1 Obogatitvene analize poročanih genov spremenjenega endometrijskega izražanja pri adenomiozi (preverjanje hipoteze 2) ............................................. 81 V Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2.1.1 Uvod ........................................................................................................................ 81 2.2.1.2 Materiali in metode .................................................................................................. 82 2.2.1.3 Rezultati in diskusija ................................................................................................ 84 2.2.1.3.1 Močnejši kandidatni geni spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi ............................................................................................................... 85 2.2.1.3.2 Močnejši kandidatni geni patofiziologije endometrija pri adenomiozi ................... 87 2.2.2 Koekspresijska mreža lncRNA-mRNA iz eksperimentalnih podatkov RNA-seq .................................................................................................................. 91 2.2.2.1 Uvod ........................................................................................................................ 91 2.2.2.2 Materiali in metode .................................................................................................. 91 2.2.2.3 Rezultat in diskusija ................................................................................................. 92 3 RAZPRAVA IN SKLEPI ...................................................................................... 96 3.1 RAZPRAVA ............................................................................................................ 96 3.1.1 Poenotenje heterogenega poimenovanja genetskih lokusov .............................. 96 3.1.2 Identifikacija in preverjanje izražanja izbranih kandidatnih genov spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi .............................. 100 3.1.2.1 Gen LIF .................................................................................................................. 103 3.1.2.2 Gen IL10 ................................................................................................................ 103 3.1.2.3 Gen IL6 .................................................................................................................. 103 3.1.2.4 Gena FOS in JUNB ................................................................................................ 104 3.1.2.5 Gen SOCS3 ............................................................................................................ 104 3.1.3 Transkriptom endometrija v potrjeno receptivni fazi pri adenomiozi ........... 104 3.1.3.1 Vloga IFN pri fiziološkem razvoju endometrija .................................................... 108 3.1.3.2 Vloga IFN pri patofiziologiji adenomioze ............................................................. 109 3.1.4 Integracija spremenjeno izraženih genov analize RNA-seq s podatki iz pregleda literature ............................................................................................... 109 3.1.4.1 Integracija 382 genov adenomiozne skupine s poročanimi geni, povezanimi z endometriozo in zdravo maternico ........................................................................ 110 3.1.4.2 Integracija 382 genov adenomiozne skupine s poročanimi geni, povezanimi z adenomiozo, endometriozo in zdravo maternico ................................................... 111 3.1.5 Pomanjkljivosti raziskave ................................................................................... 113 3.1.5.1 Nizko število uporabljenih vzorcev ....................................................................... 113 3.1.5.2 Posredna diagnoza adenomioze s TVUZ ............................................................... 113 3.1.5.3 Blaga adenomioza .................................................................................................. 114 3.1.5.4 Uporaba vzorcev celotnega tkiva endometrija ...................................................... 114 3.1.5.5 Heterogenost omskih raziskav, iz katerih smo pridobivali podatke ...................... 114 3.1.5.6 Možna potrditvena pristranskost lokusov, pridobljenih iz literature ..................... 115 3.1.5.7 Poenotenje poimenovanja pridobljenih mRNA, ncRNA in proteinov .................. 115 3.1.6 Doprinos raziskave .............................................................................................. 115 3.1.6.1 Genski seti, povezani s spremenjenim endometrijskem izražanjem ..................... 115 3.1.6.2 Izvedba analize RNA-seq ...................................................................................... 116 VI Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3.1.6.3 Natančno datiranje receptivne faze ........................................................................ 117 3.1.6.4 Javno dostopni eksperimentalni podatki RNA-seq ................................................ 117 3.1.7 Preverjanje hipotez .............................................................................................. 117 3.2 SKLEPI .................................................................................................................. 119 4 POVZETEK (SUMMARY) ................................................................................ 122 4.1 POVZETEK ........................................................................................................... 122 4.2 SUMMARY ........................................................................................................... 125 5 VIRI ...................................................................................................................... 129 ZAHVALA PRILOGE VII Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO ZNANSTVENIH DEL Str. Prašnikar E., Knez J., Kovačič B., Kunej T. 2020a. Molecular signature of eutopic endometrium in endometriosis based on the multi-omics integrative synthesis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 37, 7: 1593-1611 .......................................................... .18 Prašnikar E., Kunej T., Repnik K., Potočnik U., Knez J., Kovačič B. 2020b. Determining the molecular background of endometrial receptivity in adenomyosis. Biomolecules, 10, 9: 1311, doi:10.3390/biom10091311: 25 str. ........................................................................... .38 Prašnikar E., Kunej T., Gorenjak M., Potočnik U., Kovačič B., Knez J. 2022. Transcriptomics of receptive endometrium in women with sonographic features of adenomyosis. Reproductive Biology and Endocrinology, 20, 1: 2, doi: 10.1186/s12958-021-00871-5: 16 str. ................................................................................................................. .64 VIII Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO PREGLEDNIC Preglednica 1: 20 najznačilnejših obogatenih poti 60 genov, anotiranih v biološka procesa vgnezdenje zarodka in decidualizacija v zbirki GO ......................... 85 Preglednica 2: Obogatene poti 42 genov, povezanih s spremenjenim izražanjem v endometriju v času njegove receptivnosti (SS faza) med ženskami z in brez adenomioze ............................................................................................. 86 Preglednica 3: 20 najznačilnejših obogatenih bioloških poti, povezanih s patofiziologijo endometrija pri adenomiozi (EvEA) .............................................................. 88 Preglednica 4: 20 najznačilnejših obogatenih bioloških poti seta 518 genov, povezanih s spremenjenim endometrijskim izražanjem P faze med ženskami z in brez adenomioze ..................................................................................................... 89 IX Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 KAZALO SLIK Slika 1: Grafični povzetek raziskave doktorske disertacije .................................................. 17 Slika 2: Potek preverjanja hipoteze 2 .................................................................................... 82 Slika 3: Koekspresijska mreža sedmih izbranih transkriptov lncRNA in njihovih 126 ciljnih transkriptov na eksperimentalnih podatkih RNA-seq .................................. 95 Slika 4: Potek pridobivanja znanja o molekularnih odstopanjih endometrija pri endometriozi ............................................................................................................ 97 Slika 5: Prekrivanje genov uporabljenih setov v naši raziskavi ............................................ 99 Slika 6: Identificirani klastri po gručanju mreže proteinskih interakcij .............................. 101 Slika 7: Relativno izražanje izbranih kandidatnih genov JUNB, FOS, SOCS3, LIF, IL6 in IL10 v endometriju pričakovanega stanja receptivnosti med ženskami z in brez adenomioze .................................................................................................... 102 Slika 8: Mreže s funkcionalno urejenimi skupinami bioloških poti, ki so bile obogatene s setoma 909 (a) in 382 (b) spremenjeno izraženih genov med adenomiozno in kontrolno skupino v analizah podatkov RNA-seq ................................................. 105 Slika 9: Mreža funkcionalno urejenih obogatenih 40 bioloških poti, pridobljenih z integracijo 382 spremenjeno izraženih genov naše adenomiozne skupine z geni, ki smo jih pridobili s pregleda literature in se povezujejo z endometrijsko receptivnostjo pri endometriozi (173 genov) in zdravi maternici (151 genov) ..... 111 Slika 10: Mreža funkcionalno urejenih 57 obogatenih poti, pridobljenih z integracijo 382 spremenjeno izraženih genov naše adenomiozne skupine z oblikovanimi geni endometrijske receptivnosti pri adenomiozi (42 genov), endometriozi (173 genov) in zdravi maternici (151 genov) ................................................................. 112 X Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 PRILOGE Priloga A: Seti genov, uporabljeni v naši raziskavi Priloga B: Pregled molekularnih raziskav, povezanih z adenomiozo XI Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 OKRAJŠAVE IN SIMBOLI CPM štetje na milijon (angl. count per million) DAVID podatkovna zbirka za anotacijo, vizualizacijo in integrirano odkrivanje (angl. The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) EEC endometrijske epitelijske celice (angl. endometrial epithelial cells) ESC endometrijske stromalne celice (angl. endometrial stromal cells) E2 estradiol EMT prehod iz epitelija v mezenhim (angl. epithelial-to-mesenchymal transition) FDR delež napačnih uvrstitev (angl. false discovery rate) GO ontologija funkcij genov (angl. Gene Ontology) HGNC odbor za nomenklaturo genov HUGO (angl. HUGO Gene Nomenclature Committee) HOXA10 protein homebox Hox-A10 (angl. homebox protein Hox-A10) qPCR kvantitativna verižna reakcija s polimerazo (angl. quantitative polymerase chain reaction) IFN iterferon IL interlevkin KEGG kjotska enciklopedija genov in genomov (angl. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) LH luteinizirajoči hormon (angl. luteinizing hormone) lncRNA dolga nekodirajoča RNA (angl. long noncoding RNA) M menstruacijska faza menstruacijskega ciklusa MMP matriks metaloproteinaza (angl. matrix metalloproteinase) MR magnetna resonanca mRNA informacijska RNA (angl. messenger RNA) miRNA mikro RNA (angl. micro RNA) ncRNA nekodirajoča RNA (angl. noncoding RNA) NGS sekvenciranje naslednje generacije (angl. next generation sequencing) OBMP oploditev z biomedicinsko pomočjo P4 progesteron P proliferacijska faza menstruacijskega ciklusa PP pozna proliferacijska faza menstruacijskega ciklusa PS pozna sekrecijska faza menstruacijskega ciklusa RNA-seq RNA sekvenciranje (angl. RNA sequencing) S sekrecijska faza menstruacijskega ciklusa STRING iskalno orodje za pridobivanje interakcijskih genov/protein (angl. Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins) scRNA-seq RNA-seq posameznih celic (angl. single-cell RNA sequencing) SP srednja proliferacijska faza menstruacijskega ciklusa SS srednja sekrecijska faza menstruacijskega ciklusa TVUZ transvaginalni ultrazvok TIAR poškodba in celjenje tkiva (angl. tissue injury and repair) NK/uNK naravna ubijalka / maternična naravna ubijalka (angl. ( uterine) natural killer) ZP zgodnja proliferacijska faza menstruacijskega ciklusa ZS zgodnja sekrecijska faza menstruacijskega ciklusa XII Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 SLOVARČEK Adenomioza Patološko stanje maternice, kjer se endometriju podobno tkivo nahaja v mišični steni maternice. EvEA Evtopični endometrij pri adenomiozi. To je sluznica endometrija, ki se nahaja na pravilnem mestu, obdaja maternično votlino, in predstavlja ciljno tkivo vgnezdenja zarodka. EkEA Ektopični endometrij pri adenomiozi. Endometriju podobno tkivo, ki se nahaja na nepravilnem mestu, in sicer v mišični steni maternice, predstavlja patološke lezije, ki označujejo to bolezen. Endometrioza Adenomiozi sorodna bolezen, kjer se endometriju podobno tkivo nahaja na ektopičnih mestih izven maternice (v trebušni votlini). Endometrijska Čas srednje sekrecijske faze menstruacijskega ciklusa, ko je endometrij receptivnost dovzeten za vgnezdenje zarodka. Datiranje Beleženje faze menstruacijskega ciklusa v kateri je bil pridobljen vzorec endometrija. RNA-seq Določanje globalnega transkriptoma biološkega vzorca z metodo sekvenciranja. XIII Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1 UVOD S PREDSTAVITVIJO PROBLEMATIKE, CILJEV IN HIPOTEZ Adenomioza je patologija maternice, za katero je značilna prisotnost endometriju podobnega tkiva v mišični steni maternice. Po trenutno najbolj raziskani teoriji se nastanek te bolezni povezuje s pridobljenimi invazivnimi lastnostmi celic endometrija, ki migrirajo in obstanejo v spodaj ležečem miometriju (Vannuccini in sod., 2017). Absolutna diagnoza adenomioze je mogoča s histološko analizo vzorcev histerektomije (operativna odstranitev maternice), ki se opravi pri starejših simptomatskih ženskah (Ferenczy, 1998). Z izboljšanjem občutljivosti ultrazvočne tehnologije pa se znaki adenomioze lahko opazijo že pri mlajših ženskah (Bazot in Daraï, 2018). Pri zdravljenju neplodnosti se adenomioza povezuje z zmanjšano možnostjo zanositve (Salim in sod., 2012; Puente in sod., 2016; Sharma in sod., 2019; Nirgianakis in sod., 2020), domnevo zaradi vpliva te bolezni na zmanjšano endometrijsko receptivnost za vgnezdenje zarodka (Campo in sod., 2012). Endometrij, ki obdaja maternično votlino, namreč predstavlja ciljno tkivo vgnezditve zarodka (Altmäe in sod., 2012). Molekularni mehanizmi, ki bi pojasnili domnevno ovirano endometrijsko receptivnost pri adenomiozi, so slabo poznani zaradi malo opravljenih raziskav kot posledica tehnoloških omejitev neinvazivnih diagnostičnih metod adenomioze v preteklosti (Puente in sod., 2016). Zato smo v tej doktorski disertaciji uporabili pristope sistemske biologije, da smo identificirali kandidatne biološke poti in gene spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi maternice. Iz znanstvene literature smo pridobili podatke, ki so se navezovali na genetske vzroke spremenjenega endometrijskega izražanja pri adenomiozi in sorodni, a bolje raziskani endometriozi ter izvedli analizo RNA sekvenciranja (RNA-seq) biopsij endometrija, da smo lahko integrirali podatke in predstavili molekularno ozadje endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Ker se v literaturi uporabljajo različni sistemi poimenovanje proteinov in transkriptov RNA, smo opisane proteine poimenovali po zbirki Uniprot (The UniProt ..., 2019), gene pa po zbirki HGNC (HUGO, 2019). Navedli smo tudi pogosta uporabljena alternativna imena oz. sinonime. Izziv molekularnih raziskav endometrija predstavlja zagotavljanje homogenosti preiskovanih vzorcev, v smislu zagotavljanja enake stopnje fiziološke zrelosti endometrija v trenutku vzorčenja posamezne biopsije. Le primerjava vzorcev, datiranih v isto fazo menstruacijskega ciklusa, omogoča identifikacijo in primerjavo lokusov, povezanih s prisotnostjo endometrijske patologije (Devesa-Peiro in sod., 2021). V genetsko molekularnem delu te doktorske disertacije je bilo preiskovankam vzorčenje endometrija izvedeno med 7. in 9. dnem po izmerjenem vrhu luteinizirajočega hormona (dnevi LH+7–LH+9), ko se pričakuje pojav endometrijske receptivnosti. S primerjavo RNA-seq podatkov smo ugotovili, da je takšno datiranje vzorcev premalo natančno za identifikacijo spremenjeno izraženih genov, povezanih z adenomiozo. Zato smo vzorce endometrija dodatno datirali z uporabo novega molekularnega testa (Saare in sod., 2019), ki deluje na podlagi analize izražanja izbranih genov endometrijske receptivnosti. S ponovno analizo RNA-seq podatkov samo potrjeno receptivnih vzorcev smo identificirali spremenjeno izražene gene in obogatene poti, ki 1 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 predstavljajo močne kandidate za nadaljnje raziskave endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. 1.1 PREDSTAVITEV PROBLEMATIKE 1.1.1 Maternica Maternica je ženski reproduktivni organ, ki omogoča vgnezdenje zarodka v stadiju blastociste in njegov nadaljnji razvoj. Leži v mali medenici med danko in sečnim mehurjem. Spodnji ožji del se imenuje vrat, zgornji širši del telo, zaobljen zgornji del telesa pa fundus. Znotraj maternice se nahaja maternična votlina, ki je prekrita s sluznico, imenovano endometrij, ki predstavlja ciljno tkivo vgnezdenja zarodka. Endometrij je sestavljen iz dveh plasti; bazalna (angl. bazalis) in funkcionalna (angl. functionalis). Bazalna oz. osnovna plast je stalno prisotna in je sestavljena iz žlez, strjene strome in krvnih žil. Nad bazalnim endometrijem se nahaja funkcionalna oz. povrhnja plast, ki jo sestavljajo površinski epitelij, žlezni epitelij in ožiljena stroma. Pod bazalnim endometrijem se nahaja gladko mišičevje maternice ali miometrij, ki podpira stromalno in vaskulatorno tkivo ter omogoča krčenje maternice. Miometrij je razdeljen na notranji in zunanji del. Notranji miometrij imenovan tudi junkcijska cona (angl. junctional zone) se nahaja tik pod bazalno plastjo endometrija in predstavlja sluznično-mišično mejo med endometrijem in zunanjim miometrijem (angl. endometrial-myometrial interface). Notranji miometrij sestavljajo krožna mišična vlakna, zunanji miometrij pa vzdolžna mišična vlakna. Zunanji miometrij obdaja seroza, ki predstavlja najbolj zunanjo plast maternice (Naftalin in Jurkovic, 2009). 1.1.2 Menstruacijski ciklus endometrija Menstruacijski ciklus endometrija označuje rodno dobo ženske. Predstavlja proces, ko je funkcionalna plast endometrija podvržena periodičnim ciklom luščenja v obliki menstrualne krvi, ki mu sledi njegova regeneracija (debeljenje in diferenciacija tkiva) iz bazalne plasti, s čimer je zagotovljeno optimalno okolje za vgnezdenje zarodka v vsakem ciklusu. Dolžina menstruacijskega ciklusa se med ženskami razlikuje in lahko traja od 21 do 35 dni, v povprečju okoli 28 dni. Dinamično spreminjanje endometrija po posameznih fazah menstruacijskega ciklusa sovpada s hormonskim procesom dozorevanja jajčne celice v jajčniku, ki ga narekujejo spreminjajoče se ravni izražanja gonadotropin sproščujočega hormona (angl. gonadotropin releasing hormone, GnRH), folikel stimulirajočega hormona (angl. follicle stimulating hormone, FSH), luteinizirajočega hormona (LH), estradiola (E2) in progesterona (P4) (Sherman in Korenman, 1975; Hawkins in Matzuk, 2008; Makieva in sod., 2018). Pri dolžini 28 dni se menstruacijski ciklus prične z menstruacijsko (M) fazo (dnevi 1-4), kjer se tkivo endometrija lušči iz maternice in kot menstrualna kri zapusti telo. Sledi 2 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 proliferacijska (P) faza (dnevi 4-14), kjer povišano izločanje E2 iz rastoče granuloze v jajčnem mešičku spodbuja mitotično delitev endometrijskih celic strome in epitelija. Posledično se tkivo endometrija debeli, stroma pa se ožili s spiralnimi arterijami. Nagel porast LH (dan LH+0) okoli 36 ur pred ovulacijo (okoli 14. dne ciklusa) omogoči jajčnemu mešičku, da poči in jajčna celica se lahko sprosti iz jajčnika. Granuloza v jajčnem mešičku se pretvori v rumeno telesce, kjer se sinteza E2 preusmeri v sintezo P4. Hormon P4 ustavi debeljenje endometrija in spodbuja izločanje glikogena in mukusa iz endometrijskih žlez, kar označuje zgodnjo sekrecijsko (ZS) fazo (dnevi 15-20). V srednje sekrecijski (SS) fazi (dnevi 21-24) se pojavi t.i. okno vgnezdenja (angl. window of implantation), ki predstavlja kratek časovni okvir endometrijske receptivnosti za vgnezditev zarodka. Časovni okvir okna vgnezdenja je med ženskami različen in naj bi trajal med dnevi LH+6 in LH+11 (Tan in sod., 2018). Istočasno se endometrijske stromalne celice (ESC) v procesu decidualizacije diferencirajo v novo tkivo, imenovano decidua, kamor se lahko vgnezdi zarodek. Decidua zagotavlja vir rastnih dejavnikov in citokinov, ki nadzirajo vgnezdenje in nadaljnji razvoj zarodka, uravnavajo imunski odziv in podpirajo angiogenezo (Okada in sod., 2018). V pozni sekrecijski (PS) fazi (dnevi 25-28) decidua dokončno dozori. Če nosečnost ne nastopi, rumeno telesce propade in posledično upadeta nivoja E2 ter P4, decidua pa je podvržena procesu apoptoze in degradaciji. Menstruacijski ciklus se ponovi (Hawkins in Matzuk, 2008; Makieva in sod., 2018). 1.1.3 Molekularni dejavniki vgnezdenja zarodka Za uspešno vgnezdenje zarodka je potrebna apozicija, adhezija in invazija blastociste v receptivni endometrij. Receptivnost endometrija označuje izgubo komponent mucinov, ki zavirajo pritrditev zarodka, in pa pridobitev adhezijskih molekul kaderinov in integrinov, ki omogočajo njegovo pritrditev (Simón in sod., 2000). V nadaljevanju je predstavljenih nekaj molekularnih dejavnikov, ki sodelujejo pri vgezdenju zarodka. Hormon P4 in receptor za progesteron (angl. progesterone receptor, PGR) imata pomembno vlogo pri vzpostavitvi mikrookolja receptivnega endometrija. Le-to mora biti bogato s citokini in kemokini, ki spodbujajo apozicijo in adhezijo blastociste (Makieva in sod., 2018). Pomembni citokini so zaviralni dejavnik levkemije (angl. leukemia inhibitory factor, LIF), beta interlevkina 1 (angl. interleukin-1 beta, IL1B), spodbujevalni dejavnik rasti kolonij (angl. colony stimulating factor, CSF) in heparin-vezavni epidermalni rastni dejavnik (angl. heparin-binding epidermal growth factor, HB-EGF) (Cullinan in sod., 1996; Florio in sod., 2007; Halasz in Szekeres-Bartho, 2013). Pomembni kemokini, ki sodelujejo pri navzkrižni komunikaciji med endometrijem in zarodkom, pa so IL-8 (angl. interleukin-8; CXCL8), kemokin 2 s C-C motivom (angl. C-C motif chemokine 2, CCL2; pogosto uporabljeno alternativno ime MCP-1), z rastjo uravnavan alfa protein (angl. growth-regulated alpha protein; CXCL1; pogosto uporabljeno alternativno ime C-X-C motif chemokine 1) in receptor 3 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 tipa 4 za C-X-C kemokin (angl. C-X-C chemokine receptor type 4, CXCR4) (Hess in sod., 2007). Signalizacija P4 preko izražanja zaviralnega dejavnika, induciranega s progesteronom (angl. progesterone-induced blocking factor, PIBF), zagotavlja imunotolerantno okolje endometrija za uspešno vgnezdenje blastociste. Izražanje PIBF zavira delovanje celic naravnih ubijalk (NK) in spodbuja citokinski odziv celic T pomagalk tipa 2 (angl. T helper 2, Th2), ki so infiltrirane v stromi endometrija in vzdržujejo protivnetno okolje (Halasz in Szekeres-Bartho, 2013). Hormon P4 nadzira delovanje prepisovalnega dejavnika (angl. transcription factor) proteina homebox Hox-A10 ( HOXA10), ki je pomemben za procese vgnezdenja. Povišano izražanje HOXA10 v epiteliju endometrija tekom okna vgnezdenja vodi v izražanje integrinov alfa 5/beta 3 (angl. integrin alpha-V/beta-3, ITGAV:ITGB3; pogosto uporabljeno alternativno ime αvβ3) in ITGA4:ITGB1 ter tvorbo pinopodov na apikalni strani epitelija, kamor se lahko blastocista vsidra (Nikas in Makrigiannakis, 2003; Halasz in Szekeres-Bartho, 2013). Nekatere raziskave so pokazale, da zarodek in endometrij matere v času vgnezdenja aktivno komunicirata preko zunajceličnih veziklov (angl. extracellular vesicle) (Ng in sod., 2013). Endometrij naj bi v zunajcelične vezikle izločal adhezivne molekule, kot so integrin-vezavni fibronektin in člane poti kinaz fokalne adhezije (angl. focal adhesion kinase, FAK), ki jih sprejmejo celice trofoblasta, da si izboljšajo adhezivne lastnosti (Greening in sod., 2016). Po apoziciji in adheziji sledi invazija blastociste v deciduo, kar sproži migracijo stromalnih celic na mesto vgnezdenja. Stromalne celice obkrožijo zarodek in tako aktivno pripomorejo k njegovemu nadaljnjemu vgnezdenju (Schwenke in sod., 2013). Premikanje in polarnost endometrijskih celic nadzoruje družina proteinov Rho GTPaz, ki s tvorbo stresnih vlaken polimeriziranega aktina in tvorbo lameliopodija omogočijo premikanje celic skozi zunajcelični matriks (angl. extracellular matrix) (Makieva in sod., 2018). Član družine Rho GTPaz, RAC1 (angl. Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, RAC1, s pogostim alternativnim imenom Rac-1) v interakciji s p21-aktivirajočo kinazo oz. PAK (spada med serin/treonin kinaze), omogoči napredovanje lamelipodijev preko integrinske adhezije v smeri migriranja celic. Medtem pa na drugem koncu celice protein RHOA (angl. transforming protein RhoA, RHOA, s pogostim alternativnim poimenovanjem RhoA) omogoči prekinitev adhezijskih stikov. Protein ROCK1 (angl. Rho-associated protein kinase 1, ROCK1), ki jo aktivira RHOA, tvori krčne sile preko interakcij aktina in miozina. Krčenje in odmik zadnjih robov omogoča premikanje telesa celice. Hitro preurejanje citoskeleta in olajšano migracijo stromalnih celic preko signalne kaskade RHOA/ROCK in RAC1/PAK omogoča negenomsko delovanje P4 (Grewal in sod., 2010; Makieva in sod., 2018). Hormon P4 v decidui spodbuja tudi tvorbo vezavnega proteina 1 za inzulinu podoben rastni dejavnik (angl. insulin-like growth factor-binding protein 1, IGFBP1), ki se veže na specifične integrine ITGA5:ITGB1 4 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 trofoblasta in izboljša migracijske in invazivne lastnosti zarodka (Halasz in Szekeres-Bartho, 2013). Za uspešno migracijo stromalnih celic in globoko invazijo trofoblasta je pomembno preurejanje zunajceličnega matriksa (laminini in kolageni). Aktivno preurejanje zunajceličnega matriksa decidue je doseženo s pomočjo proteolitskih encimov matriks metaloproteinaz (MMP). Celice trofoblasta izločajo MMP-2 in -9 za razgradnjo kolagena tipa 4, ki je glavna komponenta bazalnih membran. Hormon P4 lahko preko različnih mehanizmov nadzira aktivnost encimov MMP. S tem deluje kot negativni regulator invazije zarodka, s čimer prepreči njegovo prekomerno agresivnost. Signalizacija PGR normalno deluje preko vezave na specifične P4 odzivne elemente, ki se nahajajo v promotorski regiji ciljnih genov. Hormon P4 pa lahko regulira tudi promotorje brez teh elementov. Tako lahko P4 v stromalnih celicah spodbuja izražanje proproteina beta 1 transformirajočega rastnega dejavnika (angl. transforming growth factor beta-1 proprotein, TGFB1; pogosto uporabljen sinonim TGF-β), ki pa v epitelijskih celicah zavira izražanje MMP7 in aktivira izražanje inhibitorja 3 metaloproteinaz (angl. metalloproteinase inhibitor 3, TIMP3). Po drugem mehanizmu lahko P4 ovira vezavo prepisovalnega dejavnika p65 (angl. transcription factor p65, RELA, pogosto uporabljen sinonim jedrni dejavnik kapa B (angl. nuclear factor NF-kappa-B, NF-κB) na promotorske regije MMP1, MMP3 in MMP9 ter prepreči njihovo transkripcijo. Pri nadziranju izražanja MMP2 hormon P4 spodbuja degradacijo prepisovalnega dejavnika Sp4 (angl. transcription factor Sp4, SP4), s čimer ne pride do tvorbe kompleksa SP4/PGR. Ker ni vezave kompleksa na promotorsko regijo MMP2, je nadaljnja transkripcija tega gena zavrta. Posredno, preko regulacije nivoja leptina ( LEP), pa lahko P4 vpliva na signalno pot pretvornika signala in aktivatorja transkripcije 3 (angl. signal transducer and activator of transcription 3, STAT3), ki uravnava transkripcijo MMP2 in MMP9 (Simón in sod., 2000; Halasz in Szekeres-Bartho, 2013). 1.1.4 Adenomioza 1.1.4.1 Patogeneza Adenomioza je patologija maternice, kjer se endometriju podobno tkivo (celice žleznega epitelija in fibroblasti strome) nahajajo na ektopičnih mestih v mišični steni maternice (miometriju) (Ferenczy, 1998). Adenomiozno tkivo je lahko znotraj miometrija razpršeno (difuzna adenomioza) ali pa se nahaja na enem ali več posameznih mestih (fokalna adenomioza) (Van den Bosch in sod., 2015). Pogosti simptomi adenomioze so močne menstrualne krvavitve, bolečine v spodnjem delu trebuha in neplodnost (Vannuccini in sod., 2017). Absolutna diagnoza adenomioze je mogoča le s histološkim pregledom vzorcev histerektomije. S tehnološkim razvojem tehnik slikanja, kot sta transvaginalni ultrazvok (TVUZ) (Andres in sod., 2018) in magnetna resonanca (MR) (Kissler in sod., 2008), pa je v 5 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 zadnjem času omogočeno zgodnejše neinvazivno odkrivanje te bolezni (Van den Bosch in sod., 2015). Kishi in sod. (2012) so s pomočjo MR opazovali mesta pojavljanja adenomioznega tkiva v miometriju in predlagali štiri podtipe klasifikacije adenomioze. Le-ti so podrobneje opisani v nadaljevanju s pripadajočimi molekularnimi dejavniki patofiziologije. 1.1.4.1.1 Podtip I ali notranja adenomioza (angl. intrinsic adenomyosis) Ta podtip označuje prisotnost adenomiozega tkiva v notranjem miometriju (Kishi in sod., 2012). Je najbolj raziskan podtip adenomioze, čigar nastanek se povezuje s poškodbo notranjega miometrija, kar omogoča celicam bazalne plasti endometrija invazijo spodaj ležečega miometrija (Kishi in sod., 2012). Invazija bazalnega endometrija naj bi bila mogoča, ker za razliko od drugih tkiv sluznice (npr. črevesja) interfaza med endometrijem in miometrijem nima vmesne bazalne membrane (Fusi in sod., 2006; Zhai in sod., 2020b). Do poškodb notranjega miometrija bi lahko prišlo zaradi invazivnih kirurških posegov ali carskih rezov. Poškodbe miometrija pa bi lahko bile tudi fiziološkega izvora zaradi ciklične peristaltične aktivnosti maternice tekom reproduktivne dobe ženske (Kunz in sod., 2007). Poškodovan notranji miometrij naj bi preko lokalno povišanega IL1B izzval aktivacijo sintaze 2 prostaglandina G/H (angl. prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2; s pogostim alternativnim imenom cyclooxygenase-2 oz. COX-2), ki sproži tvorbo prostaglandina E2 (PGE2). Le-ta v poškodovanem tkivu dalje aktivira steroidogeni akutni regulatorni protein (angl. steroidogenic acute regulatory protein, STAR) in aromatazo (angl. aromatase, CYP19A1; pogosto uporabljeno alternativno ime P450 aromatase). Proteina STAR in CYP19A1 sprožita tvorbo in aromatizacijo testosterona v E2, kar vodi v hiperestrogeno okolje endometrija. Hormon E2 preko vezave na izoobliko beta receptorja za estrogen (angl. estrogen receptor beta, ESR2) izzove delitve celic in s tem celjenje poškodbe. Vendar pa povišana raven E2 hkrati deluje tudi na izoobliko alfa receptorja za estrogen (angl. estrogen receptor, ESR1, s pogostim alternativnim imenom ER-alfa), s čimer se poviša sinteza oksitocina. Oksitocin zviša peristaltično aktivnost maternice (hiperperistaltika), s čimer se zvišajo mehanski pritiski v maternici. To pa poškoduje celice miometrija in proces celjenja tkiva se ustavi. Ustvari se mehanizem pozitivne povratne zanke, kjer kronična hiperperistaltika notranjega miometrija vodi v ponavljajoče se cikle samopoškodbe in celjenja tkiva (TIAR). Mehanizem TIAR poškoduje mišična vlakna miometrija, s čimer je olajšan vdor endometrijskih celic (García-Solares in sod., 2018). Raziskave na molekularnem nivoju kažejo, da imajo ESC žensk z adenomiozo v primerjavi z ženskami brez adenomioze višjo zmožnost migriranja (Mehasseb in sod., 2010b). Na podlagi analize izražanja gena regulatorja apoptoze Bcl2 (angl. apoptosis regulator Bcl-2, BCL2) in pripadajočega proteina je bila dokazana tudi njihova boljša odpornost na apoptozo in hitrejše delitve celic (proliferacija) (Jones in sod., 1998; Li J. in sod., 2019). Tudi v raziskavah 6 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 globalne analize transkriptoma endometrija med ženskami z in brez adenomioze so bili identificirani spremenjeno izraženi geni, ki so bili dalje obogateni v bioloških poteh, povezanih z regulacijo apoptoze. Identificirali pa so tudi obogateno signalno pot tarče rapamicina pri sesalcih (angl. mammalian target of rapamycin, mTOR), ki uravnava delitve celic in njihovo preživetje (Herndon in sod., 2016; Xiang in sod., 2019). Pred kratkim so Liu in sod. (2021) izvedli analizo RNA-seq posameznih celic (scRNA-seq) na vzorcih parnega evtopičnega in ektopičnega endometrija ženske z adenomiozo (EvEA in EkEA) ter na kontrolnem vzorcu endometrija ženske z laparaskopsko odstranitvijo mioma (kontrola). S primerjavo transkriptomskih podatkov endometrijskih epitelijskih celic (EEC) tako med EvEA in EkEA kot tudi med EvEA in kontrolnim endometrijem so zaznali spremenjeno izražene gene, ki so bili dalje obogateni v biološke poti, povezane s celičnim gibanjem, celično proliferacijo, angiogenezo in vnetnim procesom. Avtorji so zaključili, da so patološke spremembe prisotne že v EvEA, kar potrjuje teorijo o nastanku adenomioze z invazijo in migracijo endometrijskih celic v miometrij. Dodatno so bili spremenjeno izraženi geni med EvEA in EkEA, obogateni v poteh, povezanih z rakavimi značilnostmi (angiogeneza, celična migracija, vnetje, proliferacija in signalni poti NF-κB ter fosfoinozitida 3 kinaze (angl. phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B (Akt), PI3k/AKT). Avtorji so te poti predlagali kot kandidatne mehanizme, ki omogočajo obstoj adenomioznih lezij v miometriju (Liu in sod., 2021). Migracijske in invazivne lastnosti EEC pri adenomiozi naj bi omogočil mehanizem epitelijsko mezenhimskega prehoda (EMT), ki ga sprožijo povišane vrednosti E2 (Chen in sod., 2010). Za proces EMT je značilno zmanjšano izražanje molekularnega označevalca epitelijskih celic kaderina 1 (angl. cadherin-1, CDH1; pogosto uporabljeno alternativno ime E-cadherin), kar povzroči izgubo celične polarnosti in adhezije. Hkrati pa je povišano izražanje mezenhimskih označevalcev, kot so beta katenin 1 (angl. catenin beta-1, CTNNB1) in drugih članov signalne poti Wnt (Oh in sod., 2013), vimentina (Chen in sod., 2010) ter kinaze vezane na integrin (angl. integrin-linked kinase, ILK) (Zhou in sod., 2018), ki pa celicam omogočajo gibanje (mobilnost). Pri ženskah z adenomiozo je bilo s spremenjenimi vrednostmi izražanja genov lizil oksidaze (angl. lysyl oxidase, LOX), MMP7 (Herndon in sod., 2016), MMP2 in MMP9 (Li in sod., 2006) pokazano tudi moteno delovanje zunajceličnega matriksa EvEA in EkEA, kar bi lahko dodatno pripomoglo k olajšanemu vdoru in preživetju endometrijskih celic v miometriju. 1.1.4.1.2 Podtip II ali zunanja adenomioza (angl. extrinsic adenomyosis) Podtip označuje prisotnost adenomioznega tkiva v zunanjem miometriju, ki se širi proti notranjosti organa (Kishi in sod., 2012). Do infiltracije endometrijska tkiva iz zunanje strani maternice (preko seroze) naj bi prišlo zaradi retrogradne menstruacijske krvavitve preko jajcevodov v trebušno votlino. Od tam pa endometrijske celice (mezenhimske matične celice ali odrasle celice) prodrejo v zunanji miometrij in razvijejo endometrijske zasevke (Zhai in 7 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 sod., 2020b). Teorija etiologije tega podtipa je podprta z visokim deležem žensk s fokalno adenomiozo v zunanjem miometriju na dorzalni (hrbtni) strani maternice in pridruženo globoko infiltrativno endometriozo (angl. deep infiltrating endometriosis) (Chapron in sod., 2017; Khan in sod., 2019). 1.1.4.1.3 Podtip III ali intramuralna adenomioza (angl. intramural adenomyosis) Podtip označuje prisotnost adenomioznega tkiva v centralnem miometriju, ki ga obdaja nepoškodovano mišično tkivo; poškodovan ni notranji miometrij niti seroza (Kishi in sod., 2012). Do nastanka tega podtipa adenomioze naj bi prišlo zaradi de novo transformacije pluripotentnih embrionalnih ostankov Müllerjevih vodov, ki so napačno locirani v miometriju (Ferenczy, 1998). Druga teorija nastanka tega podtipa adenomioze se povezuje z diferenciacijo odraslih endometrijskih matičnih celic, ki naj bi migrirale v miometrij. Pri tej teoriji naj bi endometrijske progenitorne epitelijske celice in mezenhimske matične celice prečkale bazalno plast endometrija in se nato v miometriju dalje delile in diferencirale v epitelijske oz. stromalne celice (Zhai in sod., 2020b). 1.1.4.1.4 Podtip IV ali nedoločena adenomioza (angl. indeterminate adenomyosis) Podtip označuje hudo obliko adenomioze in sestoji iz kombinacij podtipov I–III (Kishi in sod., 2012). 1.1.4.2 Vpliv na plodnost S prelaganjem nosečnosti na kasnejše reproduktivno obdobje je adenomioza pogosto zaznana v diagnostičnih postopkih zdravljenja neplodnosti (Maheshwari in sod., 2012). Puente in sod. (2016) so z uporabo TVUZ diagnosticirali adenomiozo pri 24,4 % žensk (n = 248/1015), ki so se med leti 2009 in 2013 zdravile za neplodnostjo. Od tega jih je imelo 167 (67,3 %) blago, 56 (22,6 %) zmerno in 25 (10,1 %) hudo obliko adenomioze. Adenomioza je bila v višji meri značilno zastopana med ženskami starejšimi od 40 let (29,7 %; n = 94/316) kot pa med mlajšimi od 40 let (22,0 %; n = 154/699). Adenomioza je bila pogostejša pri ženskah s pridruženo endometriozo (35,1 %; n = 34/97) in/ali miomi (18,0 %; n = 48/266). Hashim in sod. (2020) pa so poročali o 7,5 % (n = 24/320) deležu na novo diagnosticirane adenomioze med mladimi neplodnimi ženskami (Hashim in sod., 2020). Razlike o poročanih deležih pojavnosti adenomioze v populacijah bi lahko bile posledica še neoblikovanih popolnih kriterijev za njeno ultrazvočno diagnozo (Bazot in Daraï, 2018). Puente in sod. (2016) so poročali, da je adenomioza pogostejša pri ženskah, ki so imele ponavljajoče neuspešne poizkuse vgnezdenja zarodkov (angl. recurrent implantation failure) (34,7 %; n = 107/308), ponavljajoče splave (38,2 %; n = 26/68) in neuspešne predhodne 8 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 postopke oploditve z biomedicinsko pomočjo (OBMP), (34,7 %, n = 107/305). Avtorji so zaključili, da adenomioza negativno vpliva na plodnost bolnice (Puente in sod., 2016). Podobno so poročali tudi drugi raziskovalci (Salim in sod . , 2012; Thalluri in Tremellen, 2012; Puente in sod., 2016; Sharma in sod., 2019). Po drugi strani pa nekatere raziskave teh povezav niso zaznale (Mijatovic in sod., 2010; Costello in sod., 2011; Benaglia in sod., 2014). Vercellini in sod. (2014) so na podlagi meta analize osmih kliničnih raziskav napovedali 28 % manjšo verjetnost za uspešno nosečnost v postopkih OBMP pri ženskah z adenomiozo kot pa brez adenomioze. Tudi meta analiza, ki so jo opravili Horton in sod. (2019), povezuje adenomiozo maternice z zmanjšanimi stopnjami vgnezdenja zarodkov, nosečnosti in rojstvi otrok ter z zvišano stopnjo splavov. 1.1.4.3 Dejavniki vpliva na endometrijsko receptivnost Molekularnih raziskav o vplivu adenomioze na plodnost je malo. Večina jih je opravljena na posameznem ali manjšem številu kandidatnih genov in/ali pripadajočih proteinih, kar smo povzeli v naši objavljeni raziskavi (Prašnikar in sod., 2020b). V nadaljevanju je naštetih več strukturnih in molekularnih nepravilnosti, s katerimi naj bi adenomiozne lezije negativno vplivale na plodnost bolnice.  Poškodovan notranji miometrij. Prisotnost adenomioznih lezij bi lahko vplivala na organizacijo mišičnih vlaken notranjega miometrija, s čimer naj bi se spremenil vzorec krčenja maternice. Posledično bi to lahko oviralo tako potovanje semenčic proti jajcevodoma kot tudi invazijo zarodka v endometrij (Mehasseb in sod., 2010a; Zhang in sod., 2015).  Prekomerne vrednosti prostih radikalov v maternici. Prisotnost adenomioznih lezij naj bi vodilo v zvišane vrednosti prostih radikalov. Le-to naj bi sprožilo vnetni odziv in nadaljnjo aktivacijo makrofagov in celic T, ki škodujejo spolnim celicam, ovirajo razvoj zarodka in sprožijo splav (Ota in sod., 1998a). V primerjavi s kontrolnimi skupinami so v endometriju žensk z adenomiozo zaznali povišane vrednosti različnih encimov, ki tvorijo ali odstranjujejo proste radikale: superoksid dismutazo (Ota in sod., 1999), glutationin peroksidazo (Ota in sod., 2000), ksantin oksidazo (Ota in sod., 2001a), katalazo (Ota in sod., 2002) in sintazo dušikovega oksida (Ota in sod., 1998b). V endometriju žensk z adenomiozo so poročali o povišanih ravneh izražanja vnetnih citokinov (Sotnikova in sod., 2002; Ulukus E.C. in sod., 2005) kot tudi zvišani citotoksičnosti materničnih celic NK (uNK) (Yang in sod., 2004).  Lokalno povišana koncentracija E2 v maternici. Nenormalno delovanje CYP19A1 v EvEA in EkEA vodi v izražanje od E2 odvisnih genov in s tem ovira pravilno molekularno delovanje endometrija tekom menstruacijskega ciklusa (Maia in sod., 2006; Mehasseb in sod., 2011). 9 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022  Prekomerno ožiljenje endometrija. Prekomerno izražanje regulatornih dejavnikov (VEGF, E2, eNOS in prostaglandini), vključenih v proliferacijo žilnih celic, vodi v prekomerno ožiljenje endometrija v P in S fazi. To naj bi bil tudi vzrok hudih menstruacijskih krvavitev oz. hipermenoreje pri ženskah z adenomiozo (Ota in Tanaka, 2003; Vannuccini in sod., 2017). Pri ženskah z adenomiozo so v primerjavi z ženskami brez adenomioze poročali o znižanem izražanju nekaterih genov in proteinov (navedeni spodaj), ki se povezujejo z vlogo pri endometrijski receptivnosti in decidualizaciji strome.  ITGB3 in SPPP1 (angl. secreted phosphoprotein 1; pogosto uporabljen sinonim osteopontin). Znižano izražanje na ravni gena in proteina tega integrina in njegovega liganda je bilo povezano z zmanjšano adhezijsko kapaciteto decidue za vezavo zarodka (Xiao in sod., 2013).  LIF in LIFR. Znižano izražanje tega citokina in pripadajočega receptorja je bilo povezano z ovirano fosforilacijo in nadaljnjo aktivacijo signalne poti STAT3. Ovirana pot STAT3 pa naj bi zavrla prekinitev medceličnih stikov v lumnu endometrijskega epitelija, kar ovira proces vgenzdenja zarodka (Yen in sod., 2016).  IL-10. Tudi zmanjšano izražanje protivnetnega citokina IL-10 je bilo povezano z ovirano aktivacijo signalne poti STAT3. Posledično naj bi se zmanjšala stopnja izražanja prepisovalnega dejavnika HOXA10, kar zniža izražanje njegovih pripadajočih genov, povezanih s tvorbo pinopodov (pomembni dejavniki adhezije zarodka) in genov, povezanih s procesom decidualizacije strome (Fischer in sod., 2011; Wang in sod., 2018).  Prepisovalni dejavniki z vlogo pri decidualizaciji. Peng in sod. (2021) so z analizo svežih vzorcev biopsij endometrija med ženskami z in brez adenomioze zaznali značilno zmanjšano izražanje genov za prepisovalne dejavnike HOXA10, FOX01 (angl. forkhead box protein O1), KLF5 (angl. Krueppel-like factor 5), CEBPB (angl. CCAAT/enhancer-binding protein beta) in HAND2 (angl. heart- and neural crest derivatives-expressed protein 2). Na primarni kulturi decidualiziranih ESC (dESC), ki so jih pridobili iz žensk z adenomiozo, pa so zaznali spremenjene vrednosti izločanih citokinov CXCL-1, -2, -3, IL-6, -8, SSP1, CCL-2, -12, -20 in VEGFA ter spremenjeno razmerje med izražanjem encimov preoblikovanja zunajceličnega matriksa MMP9 in TIMP1 (Peng in sod., 2021).  miR-21. Zmanjšano izražanje tega transkripta je bilo povezano s posledičnim prekomernim izražanjem gena KLF12 in znižanim izražanjem gena za jedrni receptor NR4A1 (angl. nuclear receptor subfamily 4 group A member 1). To pa naj bi dalje vodilo v znižano 10 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 izražanje pripadajočih PRL in IGFBP1 (molekularna dejavnika decidualizacije) (Yan in sod., 2019). 1.1.5 Omske raziskave endometrija pri različnih ginekoloških stanjih Iz Priloge B, v kateri so zbrane objavljene molekularne raziskave adenomioze, se kaže kompleksnost bioloških in celičnih procesov patofiziologije endometrija pri tej bolezni. Kompleksen pa je tudi fiziološki razvoj endometrija tekom menstruacijskega ciklusa (Makieva in sod., 2018). Zato je na podlagi analize posameznih kandidatnih lokusov težko opredeliti, ali je spremenjeno endometrijsko izražanje vzrok ali posledica prisotnosti adenomioze. Molekularno kompleksnost endometrija je tako smiselno raziskovati z omskimi pristopi, ki omogočajo globalno (angl. genome-wide) molekularno analizo tkiva (Altmäe in sod., 2014). Izraz omika se nanaša na uporabo visoko zmogljivih (angl. high-throughput) tehnik, ki lahko v biološkem vzorcu preiskujejo razlike v genomu (določevanje raznolikosti v DNA zaporedju; genomika), epigenomu (določanje epigenetskih sprememb DNA; epigenomika), transkriptomu (določevanje sestave in obsežnosti izražanja genov iz genoma pod posebnimi pogoji ali v določenem časovnem obdobju; transkriptomika), proteomu (določevanje sestave in razsežnosti proteinov pod posebnimi pogoji ali v določenem časovnem obdobju) in metabolomu (določevanje raznolikosti v sestavi in razsežnosti metabolitov; metabolomika) (Pirih in Kunej, 2017). Tehnologija analize transkriptoma je do danes močno napredovala, saj je iz uporabe mikromrež, ki temelji na tehnologiji hibridizacije, prešla na tehnologijo sekvenciranja naslednje generacije (NGS) (Zhao in sod., 2014). Tehnologija RNA-seq omogoča tvorbo več milijonov kratkih RNA odčitkov, ki se nato s pomočjo bioinformatskih programov poravnajo na referenčni genom, referenčne transkripte ali na novo sestavljene referenčne genome. Na tak način je mogoče preveriti izražanje vseh transkriptov in bolje oceniti njihovo stopnjo izražanja v preiskovanem vzorcu (Wang Z. in sod., 2009). Z nadaljnjimi obogatitvenimi analizami spremenjeno izraženih genov med preiskovanima skupinama pa je mogoče ugotoviti njihovo vlogo v bioloških sistemih. Obogatitvene analize genov je mogoče izvesti z različnimi bioinformacijskimi orodji, kot je npr. DAVID (Huang in sod., 2009), ClueGO (Bindea in sod., 2009) in CluePedia (Bindea in sod., 2013), ki delujejo na podlagi algoritmov, statističnih testov in biološkega znanja različnih podatkovnih zbirk. Najbolj je razširjena uporaba zbirke Gene Ontology (GO), s katero je mogoče za preiskovane gene pridobiti podatke o treh ontologijah: biološki proces (angl. biological process, GO-BP), celična komponenta (angl. cellular component, GO-CC) in molekularna vloga (angl. molecular function, GO-MF) (Ashburner in sod., 2000). Z dodatnimi zbirkami, kot sta npr. KEGG (Kanehisa in sod., 2017) in Reactome (Fabregat in sod., 2016) pa je mogoče analizirati preiskovane gene za dodatne obogatene biološke poti in reakcije. 11 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 1.1.5.1 Endometrijska receptivnost (zdrava maternica) Namen omskih raziskav fiziološkega razvoja endometrija v SS fazi menstruacijskega ciklusa je prepoznati genske družine in pripadajoče signalne poti, ki sodelujejo v procesih endometrijske receptivnosti (Borthwick in sod., 2003; Kao in sod., 2003b; Díaz-Gimeno in sod., 2011; Altmäe in sod., 2012; Sigurgeirsson in sod., 2017; Yu in sod., 2021). Altmäe in sod. (2017) so iz devetih raziskav, ki so primerjale transkriptom vzorcev endometrija med receptivnim (LH+7) in nereceptivnim (LH+2) stanjem, zbrali poročane spremenjeno izražene gene ter med njimi identificirali 57 močnejših kandidatov endometrijske receptivnosti (Altmäe in sod., 2017). Te gene so vključili v komercialni diagnostični test za določevanje pojava receptivne faze (SS faza) v menstruacijskem ciklusu endometrija (Saare in sod., 2019). Poznavanje personaliziranega časa optimalne endometrijske receptivnosti posamezne ženske omogoča načrtovanje optimalnega časa prenosa zarodka v maternico s postopki OBMP. Na tak način naj bi se zagotovila sinhrona komunikacija med zarodkom in endometrijem matere, kar bi zvišalo možnost zanositve. S pomočjo transkriptomskih raziskav in algoritmov strojnega učenja se na tržišču pojavlja vse več takšnih testov (Díaz-Gimeno in sod., 2011; Enciso in sod., 2018; Haouzi in sod., 2021; Zhang in sod., 2021), saj nizka stopnja vgnezditve kljub visoko kvalitetnim zarodkom ostaja eden izmed izzivov zdravljenja neplodnosti (Edwards, 1995; Ruiz-Alonso in sod., 2013; Wyns in sod., 2020). 1.1.5.2 Adenomioza S pregledom literature smo zasledili šest transkriptomskih raziskav endometrija med ženskami z in brez adenomioze (Martinez-Conejero in sod., 2011; Herndon in sod., 2016; Jiang J.F. in sod., 2016; Dior in sod., 2018; Xiang in sod., 2019; Liu in sod., 2021). Večina jih je bila opravljenih na vzorcih endometrija P faze menstruacijskega ciklusa (Herndon in sod., 2016; Jiang J.F. in sod., 2016; Xiang in sod., 2019) z namenom raziskovanja patofiziologije adenomioze. Herndon in sod. (2016) so identificirane spremenjeno izražene gene povezali s sodelovanjem v bioloških poteh apoptoze, odzivom na steroidne hormone in preoblikovanjem zunajceličnega matriksa (Herndon in sod., 2016). Xiang in sod. (2019) so spremenjeno izražene gene povezali s celično rastjo in proliferacijo, celičnim gibanjem in spremenjenim uravnavanjem signalnih poti IL-6 in ERK/MAPK (Xiang in sod., 2019). Jiang J.F. in sod. (2016) pa so poleg mRNA analizirali tudi profil izražanja dolgih nekodirajočih RNA (lncRNA) in izpostavili nekaj kandidatnih lncRNA z vplivom na stopnjo izražanja pripadajočih genov (Xiang in sod., 2019). Pri raziskavi, ki so jo opravili Liu in sod. (2021) in je podrobneje predstavljena v poglavju 1.1.4.1.1, pa datiranje endometrija ni bilo zabeleženo (Liu in sod., 2021). Omenjene raziskave so bile opravljene pri naprednih oblikah adenomioze, pri bolnicah srednjih 40 let ali starejših. Vpliv adenomioze na molekularno ozadje endometrijske receptivnosti pri ženskah v rodni dobi pa sta določevali le dve transkriptomski raziskavi, ena na ženskah z ultrazvočno potrjenimi znaki adenomioze (Martinez-Conejero in sod., 2011) in druga pri ženskah s 12 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 pridruženo endometriozo (Dior in sod., 2018). Martinez-Conejero in sod. (2011) so z metodo mikromrež zaznali 34 genov spremenjenega endometrijskega izražanja med adenomiozno in kontrolno skupino, katerih vloge pa takrat niso povezovali z vplivom na endometrijsko receptivnost. 1.1.5.3 Sorodna bolezen endometrioza V primerjavi z adenomiozo je bilo več omskih raziskav endometrija opravljenih pri endometriozi. Te raziskave smo zbrali in njihove podatke uporabili v naši raziskavi (Prašnikar in sod., 2020a). Endometrioza je sorodna patologija adenomiozi (Benagiano in sod., 2014), kjer pa se endometriju podobno tkivo nahaja na ektopičnih mestih izven maternice, tj. v trebušni votlini in v mali medenici (Del Frate in sod., 2006). Po mednarodni statistični razvrstitvi bolezni in z njimi povezanimi zdravstvenimi težavami (ICD-10, 2019) je adenomioza razvrščena kot »endometrioza maternice«. Adenomioza in endometrioza sta pri bolnicah pogosto sopojavni (Kunz in sod., 2005). Meuleman in sod. (2009) so ocenili, da za endometriozo trpi okoli 47 % ( n = 104/221) žensk, ki se zdravijo za neplodnostjo s parterji z normalnim izvidom spermiograma. Nakazuje se negativen vpliv endometrioze na plodnost bolnice (Strathy in sod., 1982; Macer in Taylor, 2012). V omskih raziskavah endometrija v pričakovanem času receptivnosti med ženskami z in brez endometrioze so bili identificirani številni spremenjeno izraženi geni (Kao in sod., 2003a; Burney in sod., 2007; Tamaresis in sod., 2014; Houshdaran in sod., 2016), miRNA (Zhou in sod., 2016) in proteini (Stephens in sod., 2010). Kao in sod. (2003a) so med 206 spremenjeno izraženimi geni identificirali tudi gene zmanjšane stopnje izražanja, ki sodelujejo pri celični adheziji in pri izločanju proteinov endometrijskega epitelija. Avtorji so zaključili, da lahko endometrij pri endometriozi predstavlja toksično okolje, ki zaradi porušenega delovanja imunskega sistema in zvišanega vnetnega ter apoptoznega odziva ovira vezavo zarodka (Kao in sod., 2003a). Burney in sod. (2007) so pri ženskah z endometriozo opazili spremenjeno uravnavanje prehoda endometrija iz P v S fazo menstruacijskega ciklusa. V vzorcih endometrija SS faze so namreč zaznali povišano izražanje genov, vključenih v procesa sinteze DNA in celične mitoze, kar je značilnost P faze. Avtorji so predlagali, da je endometrij žensk z endometriozo odporen na delovanje P4, kar posledično vpliva na izražanje od P4 odvisnih genov. To pa bi lahko dalje oviralo decidualizacijo strome in stanje receptivnosti (Burney in sod., 2007). Tamaresis in sod. (2014) so spremenjeno izražene gene povezali z aktivacijo imunskih celic, aktivnostjo citokinov, spremenjeno signalno potjo steroidnih hormonov in s spremenjenimi signalnimi potmi rastnega dejavnika, Wnt, MAPK in NFKB (Tamaresis in sod., 2014). Zhou in sod. (2016) so poleg endometrijskih transkriptov mRNA izvedli tudi profiliranje transkriptov miRNA in identificirali zvišano izražanje miR-196a pri endometriozni skupini. Na kulturi dESC, ki so jih pridobili iz žensk z endometriozo, so pokazali, da lahko povišane vrednosti miR-196a zavirajo izražanje gena izooblike beta PGR (pogosto uporabljen simbol v literaturi PGR-B) preko vezave na njegovo 3'-neprevedno regijo 13 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 (angl. untranslated region, UTR). Avtorji so zaključili, da bi lahko bilo spremenjeno izražanje miRNA eden od mehanizmov progesteronske odpornosti endometrija pri endometriozi (Zhou in sod., 2016). Houshdaran in sod. (2016) so vzorcem endometrija hkrati določevali DNA metilom in transkriptom. Pokazali so, da lahko endometrioza vpliva na mehanizme preoblikovanja kromatina in spremeni vzorce metilacije CpG otočkov. Spremembe v metilaciji DNA so dalje povezali s spremenjeno izraženimi geni, ki sodelujejo v celični delitvi, angiogenezi, vnetnemu in imunskemu odzivu ter v odzivu na steroidne hormone (Houshdaran in sod., 2016). Stephens in sod. (2010) pa so s proteomsko analizo pokazali, da v endometriju žensk z endometriozo potekajo potranslacijske modifikacije, ki vodijo v specifične izooblike proteinov. 1.2 NAMEN RAZISKAVE IN DELOVNE HIPOTEZE Namen naloge je bil s pristopi sistemske biologije razširiti znanje o molekularnem ozadju endometrijske receptivnosti za vgnezdenje zarodka pri slabo raziskani adenomiozi. Delovni hipotezi sta bili: Hipoteza 1: Vzorca izražanja genov endometrija v stanju receptivnosti se razlikujeta med skupinama preiskovank z adenomiozo in preiskovank brez adenomioze. Hipoteza 2: Izražanje genov z domnevno vlogo sodelovanja pri vzpostavitvi receptivnega stanja in genov povezanih s patofiziologijo adenomioze je spremenjeno pri preiskovankah z adenomiozo. 1.3 CILJI Cilji doktorske disertacije so bili: 1. Z metodo RNA-seq sekvencirati transkriptom endometrija v pričakovanem stanju receptivnosti ženskam z ultrazvočno diagnozo adenomioze in kontrolni skupini žensk brez patologij maternice. 2. Iz znanstvenih člankov pridobiti gene, nekodirajoče RNA (ncRNA) in proteine, ki se povezujejo s spremenjenim izražanjem v endometriju žensk z adenomiozo v primerjavi z ženskami brez adenomioze. 3. Iz znanstvenih člankov pridobiti gene, ncRNA in proteine, ki se povezujejo s spremenjenim izražanjem v endometriju žensk z endometriozo v primerjavi z ženskami brez endometrioze. 4. Integrirati rezultate izvedene analize RNA-seq s trenutnim znanjem molekularnega ozadja endometrijske receptivnosti pri normalnih in patoloških stanjih. 14 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2 ZNANSTVENA DELA Doktorska disertacija je sestavljena iz treh originalnih znanstvenih člankov in ostalega povezovalnega dela (preverjanje hipoteze 2 in izdelava koekspresijske mreže lncRNA-mRNA). Slika 1 prikazuje grafičen povzetek poteka raziskave doktorske disertacije. Uporabili smo pristope sistemske biologije (sinteza objavljenih podatkov s pregleda literature, izvedba analize RNA-seq in integracija rezultatov RNA-seq s pridobljenimi podatki iz literature), da smo identificirali kandidatne biološke poti in gene, povezane s spremenjeno endometrijsko receptivnostjo pri adenomiozi. Iz znanstvene literature smo pridobili podatke o transkriptih in proteinih, ki se povezujejo z endometrijskim izražanjem v stanju receptivnosti pri različnih ginekoloških stanjih (adenomioza, endometrioza in zdrava maternica) ter s spremenjenim izražanjem v proliferacijskem endometriju pri adenomiozi. Heterogeno poimenovanje lokusov smo poenotili po genski nomenklaturi podatkovne zbirke HGNC (HUGO, 2019). Oblikovali smo sete genov (Priloga A), povezane z endometrijsko receptivnostjo pri adenomiozi (42 genov), endometriozi (173 genov) in zdravi maternici (seta 151 in 60 genov) ter seta, povezana s patofiziologijo endomertija pri adenomiozi (seta 78 in 518 genov). Genske sete smo obogatili, da smo identificirali kandidatne poti ali gene, povezane s patofiziologijo oz. spremenjeno endometrijsko receptivnostjo pri adenomiozi. Izvedli smo analize izražanja na vzorcih endometrija, ki so bili pridobljeni v pričakovanem stanju receptivnosti (med dnevi LH+7 in LH+9) žensk z in brez ultrazvočno potrjene adenomioze. Kvantifikacijo šestih izbranih kandidatnih genov ( IL10, IL6, LIF, SOCS3, JUNB in FOS) smo izvedli z metodo kvantitativnega PCR (qPCR) in sekvenciranjem transkriptoma (mRNA in lncRNA) z metodo RNA-seq. Kandidatne gene za qPCR smo izbrali na podlagi anotiranja v bioloških poteh signalizacija z IL in signalizacija z IL4 in IL13, ki smo ju identificirali z obogatitvenimi analizami oblikovanih setov z 42 (adenomioza), 173 (endometrioza) in 151 (zdrava maternica) geni. Zaznali smo znižano izražanje izbranih genov pri adenomiozni v primerjavi s kontrolno skupino, a je bila razlika statistično neznačilna. Analizo RNA-seq endometrija v pričakovanem stanju receptivnosti med adenomiozno in kontrolno skupino žensk smo izvedli z 10 vzorci vsake skupine. Identificirali smo 909 spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05; popravek vrednosti p (FDR > 0,05) in štiri obogatene biološke poti (Bonferroni vrednost p < 0,05). Te poti so bile nespecifične, zato jim nismo mogli pripisat podporne literature v povezavi z biologijo endometrija. Uporabljenim vzorcem za RNA-seq endometrija smo dodatno datirali fazo menstruacijskega ciklusa ob času vzorčenja biopsije. Natančno datiranje je bilo izvedeno z novim komercialnim molekularnim orodjem beREADY®, ki na podlagi vzorca izražanja izbranih genov omogoča personalizirano datiranje stanja receptivnosti. Od skupno 20 vzorcev je bilo 13 vzorcev datiranih v receptivno fazo, dva v zgodnjo in pet v pozno receptivno fazo. S ponovno primerjavo transkriptomskih podatkov samo 13 potrjeno receptivnih vzorcev endometrija med adenomiozno (n = 8) in kontrolno (n = 5) skupino smo zaznali 382 spremenjeno izraženih genov 15 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ( p < 0,05; FDR > 0,05). Ti geni so bili obogateni v 33 poteh (Bonferroni vrednost p < 0,05), od tega jih je bilo kar 19 povezanih z odzivom na delovanje interferonov (IFN). Zaznali pa smo tudi obogateno pot, povezano s celično adhezijo. Med 382 spremenjeno izraženimi geni je bilo tudi 23 lncRNA. Tem lncRNA smo računali Pearsonov korelacijski koeficient, da smo določili značilne korelacije s preostalimi transkripti podatkovnega seta RNA-seq. Izdelali smo koekspresijsko mrežo mRNA-lncRNA in prepoznali transkripta lncRNA DRAIC in CADM3-AS1 kot pomembni vozlišči s pretežno negativno korelacijo na izražanje ciljnih transkriptov mRNA, ki so bili obogateni v poteh, povezanih s celično adhezijo. Z obogatitveno analizo smo integrirali set 382 genov, povezanih z endometrijsko receptivnostjo naše adenomiozne skupine, z genskimi seti, ki smo jih oblikovali na podlagi sinteze lokusov s pregleda literature in poenotenjem njihove nomenklature (adenomioza 42 genov, endometrioza 173 genov in zdrava maternica 151 genov). Osredotočili smo se na obogatene poti, kjer so anotirani geni izhajali iz vseh uporabljenih setov. Na tak način smo identificirali poti, povezane s preurejanjem zunajceličnega matriksa, s celičnim odzivom na VEGF, uravnavanjem reproduktivnega procesa in signalizacijo z IL ter IFN. Te poti in anotirane gene poleg mehanizmov odziva na IFN predlagamo kot močnejše kandidate spremenjenih procesov endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Na podlagi obogatitvenih analiz setov 78, 518, 42 in 60 genov pa smo identificirali 52 močnejših kandidatnih genov patofiziologije ter 10 močnejših kandidatov spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. 16 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 1: Grafični povzetek raziskave doktorske disertacije. Kandidatne poti in gene spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi smo identificirali s pristopi sistemske biologije: pregled literature za pridobivanje genetskih vzrokov spremenjenega izražanja v endometriju; bioinformacijske analize združenih list genov; analiza RNA-seq za primerjavo transkriptoma endometrija med adenomiozno in kontrolno skupino; integracija spremenjeno izraženih genov naše adenomiozne skupine s podatki iz literature. Uporabljene kratice: HGNC = Odbor za nomenlaturo genov HUGO; IL = interlevkin; IFN = interferon; LH = luteinizirajoči hormon; GO = genska ontologija; totRNA = totalna RNA; lncRNA = dolga nekodirajoča RNA Figure 1: Graphical abstract of doctoral dissertation research. Candidate pathways and genes of altered endometrial receptivity in adenomyosis were identified using systems biology approaches: the literature mining to retrieve genetic causes associated with altered endometrial expression; bioinformatics analyses of synthesized gene lists; RNA-seq analysis to compare endometrial transcriptome between the adenomyosis group and the control group; integration of the identified differentially expressed genes of our adenomyosis group with data from the literature. Abbreviations used: HGNC = HUGO Gene Nomenclature Committee; IL = interleukin; IFN = interferon; LH = luteinising hormone; GO = Gene Ontology; totRNA = total RNA; lncRNA = long noncoding RNA. 17 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.1 OBJAVLJENA ZNANSTVENA DELA 2.1.1 Molekularni podpis evtopičnega endometrija pri endometriozi na podlagi večomske integracijske sinteze Prašnikar E., Knez J., Kovačič B., Kunej T. 2020. Molecular signature of eutopic endometrium in endometriosis based on the multi-omics integrative synthesis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 37: 1593-1611 Namen: Združiti podatke omskih raziskav o molekularnem podpisu evtopičnega endometrija pri endometriozi glede na fazo menstruacijskega ciklusa. Metode: Iz raziskav smo pridobili podatke o genetskih vzrokih spremenjenega izražanja v endometriju žensk z endometriozo. Poimenovanje pridobljenih spremenjeno izraženih transkriptov RNA in proteinov smo poenotili po nomenklaturnem sistemu zbirke HGNC. Gene smo dalje razvrščali glede na fazo menstruacijskega ciklusa, v kateri je bila izvedena analiza endometrija v izvorni raziskavi, in sicer: M, proliferacijska (P), sekrecijska (S), ZS, SS in PS faza ter nenavedena faza (NN), če datiranje endometrija ni bilo izvedeno. Sete genov smo obogatili z bioinformacijskim orodjem DAVID. Rezultati: Iz literature smo pridobili 21 raziskav, kjer so poročali o molekularnih spremembah endometrija pri endometriozi. Od skupno 21 je bilo 13 raziskav opravljenih na transkriptomski, 6 na proteomski in 2 na epigenomski ravni. Pridobljene podatke smo zbrali v katalog s skupno 670 genetskimi vzroki in za 591 vzrokov pridobili uradne genske simbole. Gene smo razvrstili po fazah, tj. M = 3, P = 188, S = 81, ZS = 82, SS = 173, PS = 36 in NN = 28. Med obogatenimi potmi smo identificirali pot signalizacije estrogena, organizacija zunajceličnega matriksa in kemotaksa endotelijskih celic. Naša raziskava je pokazala, da je znanje biologije endometrija razdrobljeno zaradi heterogenosti objavljenih podatkov. Kljub temu smo identificirali 15 genov, ki so bili v vsaj dveh raziskavah iste faze menstruacijskega ciklusa poročani kot spremenjeno izraženi in 33 bioloških poti zbirke GO-BP ali KEGG, ki so bile značilno obogatene v več fazah ciklusa. Zaključki: Večomski vpogled v molekularne vzorce endometrioze bi lahko prispeval k identifikaciji patoloških mehanizmov, ki vplivajo na plodnost takšnih bolnic. To delo je ponujeno pod licenco Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0). 18 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 19 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 20 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 21 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 22 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 23 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 24 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 25 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 26 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 27 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 28 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 29 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 30 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 31 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 32 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 33 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 34 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 35 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 36 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 37 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.1.2 Določanje molekularnega ozadja endometrijske receptivnosti pri adenomiozi Prašnikar E., Kunej T., Repnik K., Potočnik U., Knez J., Kovačič B. 2020. Determining the molecular background of endometrial receptivity in adenomyosis. Biomolecules, 10, 9: 1311, doi: 10.3390/biom10091311: 25 str. Ozadje: Adenomioza je ginekološka patologija z omejenimi dokazi o negativnem vplivu na endometrijsko receptivnost za vgnezdenje zarodka. Pogosto se povezuje z endometriozo, za katero je bilo dokazano, da vpliva na spremenjen vzorec izražanja genov v endometriju. Posledično bi lahko kandidatni geni, ki so bili prepoznani pri endometriozi, služili kot vir za preučevanje delovanja endometrija pri adenomiozi. Metode: Iz pregleda literature smo pridobili transkripte RNA / proteine, ki se povezujejo z endometrijsko receptivnostjo pri ženskah z adenomiozo, ženskah z endometriozo in zdravimi ženskami. Poimenovanje lokusov smo poenotili po nomenklaturi zbirke HGNC. Pridobljene sete genov smo z aplikacijo STRING programa Cytoscape in z orodjem Reactome analizirali za obogatene biološke poti, da smo lahko izbrali kandidatne gene spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Izbranim genom smo z metodo qPCR preverili stopnjo izražanja na vzorcih endometrija žensk z (n = 9) in brez (n = 13) adenomioze. Rezultati: Z obogatitvenima analizama zbranih 173, 42 in 151 genov, povezanih z endometriozo, adenomiozo oz. zdravo maternico, smo identificirali prekrivajoči se poti signalizacija z interlevkini in signalizacija z interlevkinom-4 in interlevkinom-13. Pripadajoče anotirane gene LIF, JUNB, IL6, FOS, IL10 in SOCS3 smo izbrali za kvantifikacijo. Izbrani geni so bili izraženi v zmanjšani stopnji v adenomiozni v primerjavi s kontrolno skupino, vendar je bila razlika statistično neznačilna. Zaključki: Izvedli smo prvo integracijsko analizo, kjer smo na podlagi podatkov endometrijske receptivnosti zdravih žensk in žensk z endometriozo predlagali kandidatne poti in gene spremenjene endometrijske receptivnosti pri ženskah z adenomiozo. To delo je ponujeno pod licenco Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0). 38 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 39 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 40 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 41 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 42 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 43 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 44 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 45 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 46 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 47 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 48 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 49 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 50 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 51 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 52 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 53 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 54 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 55 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 56 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 57 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 58 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 59 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 60 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 61 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 62 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 63 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.1.3 Transkriptomika receptivnega endometrija žensk s sonografskimi značilnostmi adenomioze Prašnikar E., Kunej T., Gorenjak M., Potočnik U., Kovačič B., Knez J. 2022. Transcriptomics of receptive endometrium in women with sonographic features of adenomyosis. Reproductive Biology and Endocrinology, 20, 2, doi: 10.1186/s12958-021-00871-5: 16 str. Ozadje: Ženske z adenomiozo maternice se povezuje z ovirano endometrijsko receptivnostjo za vgnezdenje zarodka v postopkih OBMP. Da bi identificirali molekularne vzroke, vključene v ta proces, smo primerjali transkriptom endometrija tekom okna vgnezdenja med ženskami z in brez adenomioze. Metode: Ženskam z ultrazvočnimi znaki adenomioze (n = 10) in kontrolne skupine (n = 10) smo vzorčili biopsije endometrija, ki so bile na podlagi vrha LH časovno usklajene z oknom vgnezdenja. Vsak vzorec izolirane RNA endometrija smo uporabili za določevanje transkriptoma z metodo RNA-seq (NovaSeq 6000, Illumina) in za klasifikacijo receptivne faze z molekularnim orodjem za datiranje faze menstruacijskega ciklusa (beREADY®, CCHT). Analizo podatkov RNA-seq smo izvedli z uporabo paketov programa Bioconductor v programskem jeziku R, pri čemer smo upoštevali rezultate natančnega datiranja vzorcev endometrija. Za identifikacijo močnejših kandidatnih bioloških poti spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi smo spremenjeno izražene gene naše adenomiozne skupine integrirali s 151, 173 in 42 geni, ki smo jih pridobili iz pregleda literature in se povezujejo z endometrijsko receptivnostjo pri zdravi maternici, endometriozi oz. adenomiozi. Obogatitvene analize smo opravili z uporabo aplikacij ClueGO in CluePedia v programu Cytoscape. Rezultati: Od skupno 20 vzorcev endometrija sta bila 2 datirana v zgodnje receptivno, 13 v receptivno in 5 v pozno receptivno fazo. S primerjavo transkriptomskih podatkov vseh 20 vzorcev smo zaznali 909 spremenjeno izraženih genov (p < 0,05; neznačilno po popravku vrednosti p) in le 4 obogatene biološke poti (Bonferroni vrednost p < 0,05). S ponovno analizo transkriptomskih podatkov samo 13 vzorcev, ki so bili datirani v receptivno fazo, smo zaznali 382 spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05; neznačilno po popravku vrednosti p) in 33 obogatenih poti (Bonferroni vrednost p < 0,05). Te poti, ki so bile že predhodno povezane z biologijo endometrija, so bile npr. izražanje genov, induciranih z IFN in odziv na IFN-alfa. Z integracijo podatkov smo identificirali poti, ki kažejo na edinstven vpliv adenomioze na molekularno organizacijo endometrija (npr. izražanje genov, induciranih z IFN), kot tudi motnje procesov vzpostavitve endometrijske receptivnosti (npr. organizacija zunajceličnega matriksa in tvorba dejavnika tumorske nekroze). Zaključki: Natančno datiranje vzorcev endometrija in analiza RNA-seq sta omogočila identifikacijo spremenjenega odziva na signalizacijo z IFN kot najbolj obetaven kandidatni mehanizem ovirane endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. To delo je ponujeno pod licenco Creative Commons Attribution 4.0 International (CC BY 4.0). 64 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 65 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 66 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 67 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 68 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 69 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 70 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 71 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 72 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 73 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 74 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 75 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 76 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 77 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 78 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 79 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 80 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2 OSTALO POVEZOVALNO ZNANSTVENO DELO 2.2.1 Obogatitvene analize poročanih genov spremenjenega endometrijskega izražanja pri adenomiozi (preverjanje hipoteze 2) 2.2.1.1 Uvod V literaturi se v povezavi z adenomiozo pogosto uporabljata izraza evtopični in ektopični endometrij. Izraz evtopični endometrij se nanaša na endometrij, ki se nahaja na pravilnem mestu v maternici, in sicer obdaja maternično votlino in predstavlja ciljno tkivo za vgnezdenje zarodka (Makieva in sod., 2018). Izraz ektopični endometrij pa se navezuje na endometriju podobno tkivo (adenomiozno tkivo ali lezije), ki se nahaja na nepravilnih mestih v maternici, in sicer znotraj miometrija. Spremenjena molekularna organizacija evtopičnega endometria pri adenomiozi (EvEA) se povezuje z dvema procesoma: vloga pri patofiziologiji, ki omogoča razvoj in napredovanje adenomioze (Vannuccini in sod., 2017) in vloga pri nepopolni endometrijski receptivnosti in decidualizaciji strome, kar ovira vgnezdenje zarodka (Campo in sod., 2012). EvEA tako predstavlja ciljno tkivo za identifikacijo molekularnih označevalcev, povezanih s to boleznijo. Intenzivno iskanje endometrijskih molekularnih označevalcev že poteka pri endometriozi (Ahn in sod., 2017). Pri iskanju endometrijskih molekularnih označevalcev pa je pomembno datiranje menstruacijskega ciklusa vzorcev endometrija. Poročajo namreč, da imajo posamezne faze menstruacijskega ciklusa večji podpis na transkriptom endometrija kot pa patologije endometrija. Za identifikacijo endometrijskih molekularnih označevalcev patologije je pomembna analiza vzorcev, datiranih v isto fazo menstruacijskega ciklusa (Altmäe in sod., 2014; Devesa-Peiro in sod., 2021). Raziskave endometrija, ki so bile usmerjene v identifikacijo mehanizmov patofiziologije endometroze (Laudanski in sod., 2013; Shi in sod., 2014; Cui in sod., 2018) in adenomioze (Herndon in sod., 2016; Jiang J.F. in sod., 2016; Xiang in sod., 2019), so bile opravljene v P fazi menstruacijskega ciklusa. Domneva se, da so razlike v izražanju genov proliferacijskega endometrija med preiskovano in kontrolno skupino povezane s patofiziologijo bolezni, saj v tej fazi menstruacijskega ciklusa ni molekularnega odtisa endometrijske receptivnosti na celokupen transkriptom. V P fazi namreč poteka regeneracija izluščenega endometrija predhodnega ciklusa. To pa se spremeni po nastopu ovulacije, ko prične delovati hormon P4 in menstruacijski ciklus endometrija prestopi v S fazo. V tej fazi se endometrij diferencira v deciduo in v SS fazi nastopi endometrijska receptivnost za vgnezdenje zarodka (Makieva in sod., 2018). Razlike v izražanju genov endometrija SS faze med adenomiozno/endometriozno in kontrolno skupino pa se povezujejo s spremenjeno endometrijsko receptivnostjo zaradi prisotne patologije (Kao in sod., 2003a; Burney in sod., 2007; Martinez-Conejero in sod., 2011; Tamaresis in sod., 2014; Houshdaran in sod., 2016; Zhou in sod., 2016; Dior in sod., 2018). Naš namen je bil z bioinformacijskimi analizami podatkov o poročanih genetskih vzrokih, povezanih s spremenjenim izražanjem v EvEA, identificirati močnejše kandidatne gene 81 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 patofiziologije in močnejše kandidatne gene spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. 2.2.1.2 Materiali in metode Slika 2: Potek preverjanja hipoteze 2. Z orodjem DAVID smo izvedli obogatitvene analize genskih setov. Sete smo oblikovali z združevanjem podatkov (transkripti in proteini) iz pregleda literature in poenotenjem poimenovanja po genski nomenklaturi zbirke HGNC. Gene smo sortirali glede na datirano fazo menstruacijskega ciklusa endometrija v kateri je bila ugotovljena razlika v izražanju med adenomiozno in kontrolno skupino žensk. Seta 78 in 518 genov, povezana s spremenjenim izražanjem v endometriju P faze smo uporabili za identifikacijo kandidatnih genov patofiziologije adenomioze. Set 42 genov, povezan s spremenjenim izražanjem v SS fazi, pa za identifikacijo kandidatnih genov spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Močnejše kandidatne gene smo prioritizirali na podlagi prekrivanja obogatenih bioloških poti. Uporabljene kratice: P faza = proliferacijska faza menstruacijskega ciklusa; SS faza = srednje sekrecijska faza menstruacijskega ciklusa; GO = genska ontologija. Figure 2: The overview of hypothesis 2 testing. Gene set enrichment analyses were performed using the DAVID tool. Gene sets were developed by synthesising data (transcripts and proteins) from literature mining and further adopting of the HGNC gene nomenclature. Genes were sorted according to the dated phase of the menstrual cycle, in which a difference in endometrial expression levels between the adenomyosis and control group of women was reported. The 78 and 518 gene sets associated with altered expression levels in P phase endometrium were used to identify stronger candidates of pathophysiology in adenomyosis. The set of 42 genes associated with altered expression in the mid secretory phase was used to identify stronger candidates of altered endometrial receptivity in adenomyosis. The stronger candidate genes were prioritized based on the overlap of enriched pathways. Abbreviations used: P phase = the proliferative phase of the menstrual cycle; SS phase = the mid secretory phase of the menstrual cycle; GO = Gene Ontology. 82 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Iz zbirke PubMed (PubMed, 2021) smo s ključnimi besedami »adenomyosis« in »pathogenesis« oz. »molecular studies« oz. »genetics« oz. »gene expression« oz. »endometrial differences« pridobili znanstveno literaturo. Raziskave smo v Prilogi B razvrstili glede na preučevane biološke procese. Iz vsake raziskave smo pridobili tudi podatek, če je bil le-ta podan, o datirani fazi menstruacijskega ciklusa ob času vzorčenja endometrija. Poimenovanje preučevanih transkriptom mRNA in ncRNA ter proteinov smo poenotili po genski nomenklaturi zbirke HGNC, da smo lahko glede na datirano fazo menstruacijskega ciklusa združevali podatke (gene) za obogatitvene analize. Iz raziskav, ki so bile opravljene na svežih vzorcih endometrija (EvEA), smo zbrali gene s statistično značilnim spremenjenim izražanjem v P in/ali SS fazi menstruacijskega ciklusa pri ženskah z in brez adenomioze. Raziskave brez podatka o datiranju endometrija smo izločili iz analize. Raziskave, ki smo jih uporabili za sestavo genskih setov, so v Prilogi B označene krepko. Sestavili smo tri sete genov; dva povezana s P in enega s SS fazo. Četrti set genov, povezan s splošnimi procesi vgnezdenja zarodka oz. decidualizacijo strome (SS faza), smo pridobili iz podatkovne zbirke GO. Opis izdelave posameznega genskega seta:  Set 60 genov, s katerim smo identificirali splošne biološke poti endometrijske receptivnosti (SS faza) za uspešno vgnezdenje zarodka. Gene smo pridobili iz zbirke GO, kjer smo se omejili na takson homo sapiens. Iz procesov vgnezdenje zarodka (GO:0007566) in decidualizacija (GO:0046697) smo pridobili 62 oz. 33 anotiranih genov. Po odstranitvi podvojenih genov smo pridobili unikatnih 60 genov.  Set 42 genov, ki smo ga uporabili za identifikacijo močnejših kandidatnih genov spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Gene smo pridobili z združenjem podatkov 6 raziskav kandidatnih lokusov (Xiao in sod., 2010, 2013; Fischer in sod., 2011; Yen in sod., 2016; Wang in sod., 2018; Yan in sod., 2019) in ene transkriptomske analize (Martinez-Conejero in sod., 2011), ki so primerjale izražanje v endometriju v SS faze ciklusa (pričakovan čas endometrijske receptivnosti) med ženskami z in brez adenomioze.  Set 78 genov, s katerim smo identificirali kandidatne poti patofiziologije endometrija pri adenomiozi. Gene smo pridobili z združevanjem podatkov 47 raziskav, ki so poročale o spremenjenem izražanju kandidatnih lokusov v endometriju (EvEA) P faze med ženskami z in brez adenomioze. V zbirki DisGeNET (DisGeNET, 2021) smo sicer našli set genov, povezan z adenomiozo (poimenovano kot endometriosis of uterus, C0341858). Po podrobnem pregledu navedenih genov in podporne literature smo ugotovili, da so bili genski simboli pogosto dodeljeni tudi kraticam različnih uporabljenih izrazov v besedilu izvorne raziskave. V zbirki tudi ni navedeno, ali se spremenjeno izražanje navedenega gena navezuje na ektopični (EkEA) ali evtopični (EvEA) endometrij pri adenomiozi. Ker nas je zanimal patološki efekt adenomioze na ciljno tkivo vgnezdenja zarodka (EvEA), smo ročno pregledali vsako raziskavo, da smo zbrali podatke le tistih raziskav, ki so se 83 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nanašale na spremenjeno izražanje v evtopičnem endometriju med ženskami z in brez adenomioze.  Set 518 genov, ki smo ga uporabili za identifikacijo močnejših kandidatnih genov patofiziologije endometrija pri adenomiozi. Gene smo pridobili z združevanjem podatkov spremenjeno izraženih genov treh transkriptomskih raziskav, ki so bile izvedene na vzorcih endometrija (EvEA) v P fazi pri ženskah z in brez adenomioze (Herndon in sod., 2016; Jiang J.F. in sod., 2016; Xiang in sod., 2019). Oblikovane genske sete smo z bioinformacijskim orodjem DAVID (Huang in sod., 2009) obogatili za ontologijo GO_BP. Iz vsakega seta smo upoštevali do 20 najbolj statistično značilnih poti ( p < 0,05) glede na naraščajočo vrednost p. Na podlagi ujemanja obogatenih poti med setoma iste datirane faze, tj. SS (60 in 42 genov) in P (78 in 518 genov) faza, smo anotirane gene iz seta 42 genov predlagali kot močnejše kandidate spremenjene endometrijske receptivnosti in anotirane gene iz seta 518 genov kot močnejše kandidate patofiziologije. Potek identifikacije kandidatov je predstavljen na Sliki 2. 2.2.1.3 Rezultati in diskusija Pridobili smo 110 raziskav, v katerih so preučevali endometrij pri adenomiozi. Pridobljene raziskave so bile opravljene na svežih humanih vzorcih evtopičnega (EvEA) in/ali ektopičnega (EkEA) endometrija, celičnih kulturah ali na mišjem modelu adenomioze. Pridobljene raziskave smo zbrali in predstavili v Prilogi B. Raziskave smo razvrstili glede na procese, povezane s patofiziologijo oz. patogenezo adenomioze: lokalna proizvodnja in spremenjen metabolizem E2 v maternici; hiperperistaltika maternice; proces TIAR v miometriju; kopičenje imunskih celic na mestu poškodb miometrija in v evtopičnem endometriju; hipoksija; somatske mutacije; epigenetske spremembe; polimorfizmi; aktivacija procesa EMT; zvišana celična migracija; zvišana invazivnost; spremenjena organizacija zunajceličnega matriksa; prekomerna (nevro)angiogeneza; ovirana apoptoza; prekomerna proliferacija; spremenjen vnetni odziv; spremenjene znotrajcelične signalne poti; povečan metabolizem prostih radikalov; fibroza; moten imunološki nadzor; spremenjeno izražanje integrinov in receptorjev za steroidne hormone. Izmed 110 pridobljenih raziskav smo v sestavo genskih setov vključili 7 raziskav analize endometrija v SS fazi in 50 raziskav analize endometrija v P fazi. Geni posameznih setov so navedeni v Prilogi A. Raziskave endometrija SS faze so bile opravljena pri mlajših ženskah v njihovem reproduktivnem obdobju. V teh raziskavah je bila adenomioza diagnosticirana z neinvazivnimi metodami slikanja trebuha. Večina raziskav endometrija P faze pa je bila opravljena pri starejših ženskah z napredno obliko adenomioze. V teh raziskavah je bila diagnoza adenomioze postavljena na osnovi histoloških pregledov vzorcev histerektomije. Z rezultati obogatitvenih analiz smo med zbranimi geni identificirali močnejše kandidate z vlogo pri patofiziologiji oz. pri spremenjeni endometrijski receptivnosti. 84 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2.1.3.1 Močnejši kandidatni geni spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi Močnejše kandidatne gene spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi smo identificirali na podlagi treh prekrivajočih obogatenih bioloških poti, ki smo jih pridobili z analizo setov 60 in 42 genov. Preglednica 1: 20 najznačilnejših obogatenih poti 60 genov, anotiranih v biološka procesa vgnezdenje zarodka in decidualizacija v zbirki GO. Pridobljene biološke poti so nam služile kot vir znanja o splošnih procesih endometrijske receptivnosti. Table 1: Top 20 enriched pathways associated with 60 genes from the GO database that were annotated to biological processes of embryo implantation and decidualization. Retrieved biological pathways served us as a source of knowledge on the general processes of endometrial receptivity. Biološka pot Vred. p Anotirani geni GO:0007566~embryo implantation 2.55E-83 DDR1, HMX3, CALCA, EPO, PRDM14, STC1, FBLN1, PTGS2, PCSK5, TRO, UBE2Q1, TRIM28, STC2, BSG, SPP1, IGFBP7, H3F3B, MMP2, MST1, LIF, ACOD1, EMP2, MMP9, PRLR, TGFBR2, SOD1, VMP1, UBTFL1, POLR1B, IL1B, SCGB1A1, RPL29, FKBP4, RECK, PPARD GO:0046697~decidualization 2.85E-41 GHSR, CITED2, VDR, LIF, STC1, PTGS2, EPOR, CYP27B1, GJB2, STC2, BSG, SPP1, GHRL, JUNB, DEDD, CTSB, PPARD, MEN1 GO:0033280~response to vitamin D 2.83E-07 CYP27B1, STC2, SPP1, STC1, PTGS2 GO:0071456~cellular response to hypoxia 1.39E-05 STC2, MST1, STC1, PTN, PTGS2, PPARD GO:0043627~response to estrogen 5.59E-05 CYP27B1, CITED2, EPO, GHRL, TGFBR2 GO:0008285~negative regulation of cell 2.62E-04 DDR1, CYP27B1, VDR, IL1B, LIF, IGFBP7, proliferation PTGS2, MEN1 GO:0007507~heart development 2.99E-04 CITED2, PTN, PCSK5, EPOR, TGFBR2, PPARD GO:0032147~activation of protein kinase 4.05E-04 CALCA, EPO, EMP2, TGFBR2 activity GO:0030198~extracellular matrix organization 4.09E-04 DDR1, ITGB4, BSG, SPP1, FBLN1, RECK hsa04668:TNF signaling pathway 8.50E-04 IL1B, LIF, PTGS2, JUNB, MMP9 GO:0007267~cell-cell signaling 0.0013 GJB2, CALCA, IL1B, NDP, ASH1L, PCSK5 GO:0010628~positive regulation of gene 0.0015 CITED2, VDR, IL1B, MST1, FBLN1, PPARD expression GO:0022617~extracellular matrix disassembly 0.0019 MMP2, BSG, SPP1, MMP9 GO:0032496~response to lipopolysaccharide 0.0019 CYP27B1, EPO, SCGB1A1, PTGS2, JUNB GO:0000122~negative regulation of 0.0020 TRIM28, CITED2, EPO, VDR, SCGB1A1, transcription from RNA polymerase II promoter PRDM14, JUNB, PPARD, MEN1 GO:0050728~negative regulation of 0.0021 GHSR, ACOD1, GHRL, PPARD inflammatory response hsa04060:Cytokine-cytokine receptor 0.0027 EPO, IL1B, LIF, PRLR, EPOR, TGFBR2 interaction GO:0042493~response to drug 0.0029 SCGB1A1, PTN, PTGS2, JUNB, SOD1, TGFBR2 GO:0007420~brain development 0.0032 HMX3, H3F3B, EPOR, TGFBR2, MEN1 GO:0030336~negative regulation of cell 0.0035 CITED2, STC1, PTN, RECK migration 85 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Z obogatitvijo seta 60 genov (anotirani v biološka procesa vgnezdenje zarodka in decidualizacijo v zbirki GO) smo pridobili 68 statistično značilnih poti ( p < 0,05), katerih prvih 20 je naštetih v Preglednici 1. Z obogatitveno analizo 42 genov (združeni podatki spremenjeno izraženih genov v endometriju SS faze med ženskami z in brez adenomioze) pa smo pridobili 14 statistično značilnih bioloških poti ( p < 0,05), ki so navedene v Preglednici 2. Med prvimi 20 potmi obeh analiz so se prekrivale poti negativno uravnavanje celične proliferacije, organizacija zunajceličnega matriksa in decidualizacija. Pripadajoči anotirani geni IL10, SST, STAT3, LIF, CHD5, CDKN3, COL8A1, COL11A1, ITGB3 in SPP1, ki izhajajo iz seta 42 genov, predstavljajo močnejše kandidate spremenjene molekularne organizacije receptivnega endometrija za vgnezditev zarodka pri adenomiozi maternice. Identifikacija genetskih vzrokov spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi bi lahko vodila v razvoj molekularnega testa, ki bi na podlagi izražanja izbranih genov omogočil boljšo diagnostiko endometrija kot morebiten vzrok neplodnosti pri takšnih ženskah. Poznavanje molekularnih odstopanj pa bi lahko vodilo v razvoj ciljnih terapij za optimalno pripravo endometrija pred naslednjim prenosom zarodka v maternico, da bi zvišali stopnjo zanositve v postopkih OBMP (Revel, 2012; Altmäe in sod., 2017). Preglednica 2: Obogatene poti 42 genov, povezanih s spremenjenim izražanjem v endometriju v času njegove receptivnosti (SS faza) med ženskami z in brez adenomioze. Obogatene poti, ki so se ujemale z obogatitveno analizo 60 genov zbirke GO, so označene krepko. Anotirani geni teh poti predstavljajo močnejše kandidatne gene spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Table 2: Enriched pathways using 42 genes associated with altered endometrial expression levels in the time-frame of receptivity (MS phase) between women with and without adenomyosis. Enriched pathways that matched the results of the analysis of the 60 genes from the GO database are highlighted in bold. The annotated genes in these pathways present the stronger candidate genes of altered endometrial receptivity in adenomyosis. Biološka pot Vred. Anotirani geni p GO:0008285~negative regulation of cell 0.0017 IL10, SST, STAT3, LIF, CHD5, CDKN3 proliferation GO:0008202~steroid metabolic process 0.0040 AKR1B10, SULT1E1, CYP3A7 hsa04630:Jak-STAT signaling pathway 0.0059 IL10, STAT3, LIF, LIFR GO:0030574~collagen catabolic process 0.0087 COL11A1, COL8A1, MMP20 GO:0048861~leukemia inhibitory factor signaling 0.0088 LIF, LIFR pathway GO:0030198~extracellular matrix organization 0.0091 COL11A1, ITGB3, SPP1, COL8A1 GO:0001503~ossification 0.013 COL11A1, SPP1, LTF hsa04512:ECM-receptor interaction 0.021 COL11A1, ITGB3, SPP1 GO:0036376~sodium ion export from cell 0.022 ATP1A2, ATP12A GO:0030007~cellular potassium ion homeostasis 0.026 ATP1A2, ATP12A GO:0010248~establishment or maintenance of 0.028 ATP1A2, ATP12A transmembrane electrochemical gradient GO:0006883~cellular sodium ion homeostasis 0.041 ATP1A2, ATP12A GO:0048545~response to steroid hormone 0.043 SST, SPP1 GO:0046697~decidualization 0.043 LIF, SPP1 86 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2.1.3.2 Močnejši kandidatni geni patofiziologije endometrija pri adenomiozi Močnejše kandidatne gene patofiziologije endometrija pri adenomiozi smo identificirali na podlagi treh prekrivajočih bioloških poti, ki smo jih pridobili z obogatitvijo setov 78 in 518 genov. Z analizo seta 78 genov (združeni podatki 47 raziskav posameznih lokusov, ki so nam služili za identifikacijo patoloških poti endometrija v P fazi pri adenomiozi) smo pridobili 111 statistično značilnih poti ( p < 0,05), katerih prvih 20 je naštetih v Preglednici 3. Z obogatitvijo seta 518 genov (združeni podatki spremenjeno izraženih genov treh transkriptomskih raziskav proliferacijskega endometrija med ženskami z in brez adenomioze) pa smo pridobili 135 statistično značilnih poti ( p < 0,05), katerih prvih 20 je navedenih v Preglednici 4. Med prvimi 20 potmi obeh analiz so se prekrivale pozitivno uravnavanje angiogeneze, negativno uravnavanje apoptoznih procesov in vnetni odziv. Pripadajoči anotirani geni ADM, AGER, ANXA1, BAG3, BCL3, BCL6, BIRC5, BTG1, CD14, CD44, CD74, CEBPB, CSF1, CXCL2, CYBB, CYR61, DUSP1, ECM1, EGR3, ELF3, EPHA2, F3, GATA6, GSTP1, HSPA5, IER3, ITGB2, LTF, MCL1, NFKB2, NFKBIA, NFKBID, PIM1, PIM3, PLAUR, PLK3, PTGIS, PTGS1, PYCARD, RHOB, S100A9, SELE, SERPINE1, SOCS3, SOX9, TAC4, THBS1, TNFAIP3, TWIST1, VEGFA, VHL in ZC3H12A, ki izhajajo iz seta 518 genov, predstavljajo 52 močnejših kandidatnih genov patofiziologije adenomioze. Identificiranim prekrivajočim obogatenim potem setov P faze smo lahko pripisali podporno literaturo v povezavi s patofiziologijo adenomioze:  pozitivno uravnavanje angiogeneze: (Ota in Tanaka, 2003; Li in sod., 2006; Goteri in sod., 2009; Kang in sod., 2009; Liu in sod., 2011; Wang J. in sod., 2016),  negativno uravnavanje apoptoznih procesov: (Jones in sod., 1998; Yang in sod., 2007; Ren in sod., 2010; Huang in sod., 2011; Wang J. in sod., 2016; Hu in sod., 2017; Li J. in sod., 2019),  vnetni odziv: (Ota in sod., 2001b; Sotnikova in sod., 2002; Ulukus E.C. in sod., 2005, 2006; Wang F. in sod., 2009, 2014, 2018; Yang in sod., 2009; Nie in sod., 2009; Huang H. in sod., 2010; Qin in sod., 2012; Zhihong in sod., 2016; Lai in sod., 2016; Park in sod., 2016; Carrarelli in sod., 2017; Jiang in sod., 2017; Jiang J.F. in sod., 2018; Li C. in sod., 2019). Med rezultati obogatitvenih analiz genskih setov P faze pa nismo zaznali poti, ki bi neposredno kazale na mehanizme nastanka adenomioze, podrobneje opisane v uvodnem poglavju. To so poti, ki kažejo na agresivnejše lastnosti endometrijskih celic (prekinitev celičnih stikov, prehod epitelijskih celic v mezenhimske celice, višja stopnja invazije in celične migracije), da lahko migrirajo in obstanejo v spodaj ležečem miometriju. 87 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Preglednica 3: 20 najznačilnejših obogatenih bioloških poti, povezanih s patofiziologijo endometrija pri adenomiozi (EvEA). Poti smo pridobili z obogatitveno analizo 78 genov. Gene smo pridobili z združevanjem podatkov 47 raziskav kandidatnih lokusov, ki so na vzorcih proliferacijskega endometrija poročali o značilnem spremenjenem izražanju med ženskami z in brez adenomioze. Table 3: Top 20 enriched biological pathways associated with the pathophysiology of endometrium in adenomyosis (EvEA). The pathways were obtained by enrichment analysis of 78 genes. Genes were obtained by data synthesis of 47 published candidate locus studies that reported altered expression levels on proliferative endometrial tissue samples between women with and without adenomyosis. Biološka pot Vred. p Anotirani geni GO:0010628~positive 6.63E-15 CXCL8, ROCK1, ROCK2, IL37, NOS3, HDAC1, TWIST1, regulation of gene expression IGF1, F3, RELA, VEGFA, IL6, IL1B, CRH, TLR9, PGR, VIM, TLR6, TLR4, NFE2L2 GO:0019221~cytokine- 4.35E-12 CXCL8, IL37, IL10RA, MMP2, TWIST1, PTGS2, F3, MMP9, mediated signaling pathway RELA, VEGFA, IL6, CD4, IL1B, BCL2, VIM GO:0006954~inflammatory 5.99E-12 CXCL8, IL37, PTGS2, RELA, NFKB1, TLR1, IL6, CNR2, IL1B, response CXCR2, CRH, TLR9, TLR8, TLR6, TLR4, NFE2L2 GO:0030335~positive 1.27E-09 ROCK2, IL1B, MMP2, SNAI1, SNAI2, ITGA6, IGF1, F3, regulation of cell migration MMP9, RHOA, PTK2, VEGFA GO:0032757~positive 2.30E-09 TLR1, IL6, IL1B, TLR9, TLR8, F3, TLR4, RELA regulation of interleukin-8 production GO:0007568~aging 1.68E-08 CNR1, MMP2, DNMT3A, CAT, CD68, PTGS2, RELA, NFKB2, SOD1, NFE2L2 GO:0071222~cellular 1.84E-08 IL6, CXCL8, IL37, IL1B, VIM, CD68, TLR4, RELA, RHOA, response to lipopolysaccharide NFKB1 GO:0043066~negative 2.96E-08 HDAC3, HDAC1, HSPB1, TWIST1, IGF1, MMP9, RELA, regulation of apoptotic process PTK2, NFKB1, VEGFA, NFKBIA, IL6, CAT, BCL2 GO:0032755~positive 6.16E-08 TLR1, IL6, IL1B, TLR9, TWIST1, TLR8, TLR6, TLR4 regulation of interleukin-6 production GO:0043410~positive 7.53E-08 IL6, CD4, CDH2, ROCK1, ROCK2, TLR9, IGF1, SOD1, regulation of MAPK cascade VEGFA GO:0006955~immune 7.87E-08 CXCL8, IL37, HLA-G, TLR1, CD4, CNR2, CXCR1, IL1B, response CXCR2, TLR9, TLR8, TLR6, TLR4 GO:0003180~aortic valve 8.01E-08 ROCK1, ROCK2, NOS3, SNAI1, TWIST1, SNAI2 morphogenesis GO:0045766~positive 8.30E-08 CXCL8, NOS3, IL1B, HSPB1, TWIST1, F3, PAK4, NFE2L2, regulation of angiogenesis VEGFA GO:0009410~response to 1.23E-07 CDH1, ITGA2, MMP2, DNMT3A, CAT, BCL2, PTGS2, RHOA, xenobiotic stimulus DUSP6, SOD1 GO:0048661~positive 1.27E-07 IL6, HDAC1, ITGA2, MMP2, IGF1, PTGS2, TLR4 regulation of smooth muscle cell proliferation GO:0007249~I-kappaB 1.51E-07 NFKBIA, ROCK1, ROCK2, TLR9, TLR8, TLR4, RELA kinase/NF-kappaB signaling GO:0045944~positive 4.54E-07 HDAC3, HDAC1, TWIST1, IGF1, RELA, ESR2, NFKB1, regulation of transcription ACVR2A, NFKB2, VEGFA, NFKBIA, IL6, IL1B, TLR9, ITGA6, from RNA polymerase II PGR, TLR4, NFE2L2 promoter GO:0001934~positive 5.29E-07 CD4, HDAC3, ROCK2, IL1B, CRH, MMP9, PTK2, ACVR2A, regulation of protein VEGFA phosphorylation GO:0042493~response to drug 6.00E-07 CDH1, ITGA2, DNMT3A, CAT, CRH, BCL2, RELA, RHOA, DUSP6, SOD1 88 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Preglednica 4: 20 najznačilnejših obogatenih bioloških poti seta 518 genov, povezanih s spremenjenim endometrijskim izražanjem P faze med ženskami z in brez adenomioze. Ujemajoče se poti obogatitvene analize seta 78 genov so označene krepko. Anotirani geni teh poti predstavljajo močnejše kandidatne gene patofiziologije adenomioze. Table 4: Top 20 enriched biological pathways of 518 genes, associated with altered endometrial expression in P phase between women with and without adenomyosis. Overlapping enriched pathways with enrichment analysis of a set of 78 genes are highlighted in bold. The annotated genes in these pathways are stronger candidate genes of pathophysiology in adenomyosis. Biološka pot Vred. Anotirani geni p GO:0045766~positive 1.91E-06 ECM1, PTGIS, BTG1, ITGB2, SERPINE1, GATA6, CYBB, regulation of angiogenesis TWIST1, ADM, F3, THBS1, RHOB, VEGFA, ZC3H12A GO:0070373~negative 5.43E-06 ERRFI1, DUSP1, GSTP1, SPRY4, LIF, SPRY1, KLF4, GBP1, regulation of ERK1 and ATF3, DUSP6 ERK2 cascade GO:0030198~extracellular 9.63E-06 ELN, ITGB2, ITGA1, SERPINE1, PDGFB, TNC, THBS1, CYR61, matrix organization NFKB2, VCAN, ELF3, COL4A1, BCL3, COL4A5, ITGA7, SOX9, CD44 GO:0045944~positive 2.17E-05 CSRNP1, KDM3A, CEBPB, CEBPD, SRF, SERPINE1, GATA6, regulation of transcription TWIST1, DUX4, DLL1, ETS2, CYR61, GLIS1, SERTAD1, from RNA polymerase II ZC3H12A, NAMPT, SOX9, CCNL1, JUNB, JUN, EGR2, LIF, promoter NFATC2, NFATC1, KLF4, POU5F1, KLF2, NFKB2, VEGFA, NR4A2, NFKBIA, FOSL1, PER1, NR4A1, NR4A3, KLF5, RGCC, ELF3, MAFF, BCL3, FOSB, NCOA7, MZF1, ATF3 GO:0043066~negative 3.97E-05 GSTP1, GATA6, TWIST1, THBS1, CYR61, SOCS3, BAG3, PIM1, regulation of apoptotic PIM3, VHL, SOX9, MCL1, IER3, CD74, PLK3, EGR3, ANXA1, process HSPA5, DUSP1, PLAUR, VEGFA, NFKBIA, BCL3, BIRC5, CD44, LTF GO:0006954~inflammatory 1.45E-04 ECM1, CEBPB, ANXA1, CSF1, ITGB2, CYBB, TNFAIP3, SELE, response CXCL2, AGER, THBS1, PTGS1, NFKB2, PYCARD, ELF3, BCL6, ZC3H12A, TAC4, CD14, NFKBID, S100A9, EPHA2 GO:0008284~positive 1.53E-04 CSF1, PDGFB, TNC, ADM, IRS2, THBS1, DLL1, CTGF, CDC20, regulation of cell ESM1, SERTAD1, NAMPT, SOX9, EDN2, LIF, VEGFA, FOSL1, proliferation GDF9, KLF5, MZB1, BIRC5, CALR, ATF3, RNF187, HBEGF GO:0034097~response to 1.55E-04 FOSL1, JUN, SRF, ACP5, TYMS, JUNB, NFKB2, MCL1 cytokine GO:0045597~positive 1.61E-04 SOCS3, JUN, SRF, VHL, JUNB, CYR61, CTGF regulation of cell differentiation GO:0043124~negative 2.51E-04 PYCARD, PER1, IL1RL1, GSTP1, ZC3H12A, TNFAIP3, NFKBID regulation of I-kappaB kinase/NF-kappaB signaling hsa05166:HTLV-I infection 3.11E-04 EGR2, JUN, SRF, ITGB2, PDGFB, SLC2A1, NFATC2, NFATC1, ETS2, NFKB2, NFKBIA, FOSL1, CDC20, ZFP36, POLD2, E2F2, CALR, HLA-DOB, ATF3 hsa04380:Osteoclast 3.33E-04 JUN, CSF1, IFNGR1, CYBB, NFATC2, NFATC1, NFKB2, differentiation NFKBIA, FOSL1, SOCS3, FOSB, ACP5, JUNB GO:0006915~apoptotic 5.00E-04 PPP1R15A, CSRNP1, ITGB2, TNFAIP3, DUX4, PYCARD, GJA1, process ZC3H12A, PIM1, PMAIP1, PIM3, CD14, PHLDA2, IER3, PLK3, GADD45B, GADD45A, GZMA, C8ORF4, RHOB, NFKBIA, NR4A1, DLC1, MZB1, BIRC5, SGK1, S100A9 GO:0051591~response to 5.47E-04 FOSL1, THBD, PER1, JUN, DUSP1, FOSB, JUNB cAMP se nadaljuje 89 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Preglednice 4 Biološka pot Vred. Anotirani geni p GO:0061469~regulation of 5.83E-04 NR4A1, ERRFI1, NR4A3, BIRC5 type B pancreatic cell proliferation hsa04668:TNF signaling 8.91E-04 NFKBIA, SOCS3, CEBPB, JUN, CSF1, BCL3, LIF, TNFAIP3, pathway SELE, CXCL2, JUNB GO:0001938~positive 9.01E-04 NR4A1, ECM1, NRP2, JUN, EGR3, PDGFB, F3, VEGFA regulation of endothelial cell proliferation GO:0032691~negative 0.0012 ERRFI1, GSTP1, ACP5, TNFAIP3 regulation of interleukin-1 beta production GO:0006366~transcription 0.0014 CSRNP1, EGR2, JUN, CEBPB, CEBPD, SRF, GATA6, NFATC2, from RNA polymerase II NFATC1, KLF4, OVOL1, GLIS1, POU5F1, NFKB2, FOSL1, promoter KLF5, ELF3, POU2AF1, MAFF, FOSB, SOX9, MZF1, JUNB, ATF3 V prihodnje bi bilo potrebno izvesti analize izražanja predlaganih kandidatnih genov, da bi preverili njihov potencial za endometrijske molekularne označevalce patofiziologije adenomioze. Identifikacija takšnih označevalcev bi lahko pripomogla k hitrejši diagnozi zgodnje adenomioze, saj njena trenutna neinvazivna diagnoza kljub visoki ločljivosti aparatur TVUZ ali MR temelji le na subjektivni oceni slik maternice (Loring in sod., 2020). Iskanje endometrijskih molekularnih označevalcev že intenzivno poteka za zgodnejše in zanesljivejše diagnosticiranje endometrioze. Zaradi nespecifičnih simptomov je namreč za kirurško diagnozo endometrioze potrebnih kar 7 let (Gupta in sod., 2016; Ahn in sod., 2017; Saare in sod., 2017: 228). 90 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2.2.2 Koekspresijska mreža lncRNA-mRNA iz eksperimentalnih podatkov RNA-seq 2.2.2.1 Uvod LncRNA so definirane kot transkripti RNA, daljši od 200 nukleotidov, brez protein kodirajočega potenciala. Vloga lncRNA se povezuje z regulatornimi procesi. Delujejo lahko kot epigenetski regulatorji bodisi pozitivnega ali negativnega izražanja okoliških genov. Nekatere lncRNA so prekurzorji majhnih RNA (< 200 nukleotidov) ali narekujejo procesiranje ostalih RNA preko izrezovanja in spajanja transkriptov mRNA (angl. mRNA splicing). LncRNA delujejo tudi kot regulatorji aktivnosti proteinov in njihovih vezavnih partnerjev ali regulirajo lokalizacijo proteinov in celičnih komponent. LncRNA lahko vodijo proteine na specifična mesta na genomu in na tak način vplivajo na stopnjo izražanja genov (Wilusz in sod., 2009). V raziskavah proliferacijskega endometrija tako med ženskami z in brez endometrioze (Wang Y. in sod., 2015a; Cui in sod., 2018) kot tudi med ženskami z in brez adenomioze (Jiang J.F. in sod., 2016) so že poročali o spremenjeno izraženih transkriptih lncRNA, ki so jo jih povezali s patofiziologijo endometrija pri teh dveh boleznih. Delovanje transkriptov lncRNA pa je bilo povezano tudi z uravnavanjem izražanja genov celične adhezije, ki sodelujejo v procesih endometrijske receptivnosti za vezavo zarodka (Fan in sod., 2017; Li D. in sod., 2019). S sedanjo primerjavo podatkov RNA-seq receptivnih vzorcev endometrija med adenomiozno (n = 8) in kontrolno (n = 5) skupino žensk smo med 382 spremenjeno izraženimi geni ( p < 0,05; FDR > 0,05) zaznali tudi 23 transkriptov lncRNA. Tem 23 lncRNA smo s korelacijsko analizo želeli preveriti soizražanje (angl. coexpression) s protein kodirajočimi transkripti (mRNA) iz eksperimentalnih podatkov RNA-seq. Naš namen je bil izdelati koekspresijsko mrežo mRNA-lncRNA in identificirati kandidatne pare lncRNA-mRNA z medsebojnim vplivom na izražanje. 2.2.2.2 Materiali in metode Eksperimentalne RNA-seq podatke 13 vzorcev endometrija, ki so bili datirani v receptivno fazo, smo uporabili za izdelavo koekspresijske mreže kodirajočih (mRNA) in nekodirajočih (lncRNA) genov (angl. coding-noncoding gene co-expression). Transkriptomski podatki so se nanašali na število poravnanih RNA-seq odčitkov na posamezen transkript, ki so bili normalizirani s pretvorbo v skalo štetja na milijon (CPM). Za izdelavo mreže lncRNA-mRNA smo uporabili aplikacijo CoExpNetViz orodja Cytoscape v3.9.1 (Tzfadia in sod., 2016). V aplikaciji smo pod izbrane gene (angl. bait genes) vnesli 23 lncRNA ( LINC00645, LINC00861, FAM138B, GLCCI1-DT, LINC00649, MFSD4A-AS1, LINC00921, LINC02102, INTS6-AS1, ST7-AS1, CERNA1, ZBTB11-AS1, LINC00598, SH3BP5-AS1, DRAIC, CADM3-AS1, MRPS30-DT, SLC7A11-AS1, LINC00958, MCF2L-AS1, 91 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 RNF144A-AS1, SOCS2-AS1 in KDM7A-DT). Te lncRNA so bile spremenjeno izražene v setu 382 genov, ki smo jih identificirali s primerjavo RNA-seq podatkov potrjeno receptivnih vzorcev endometrija med adenomiozno in kontrolno skupino žensk. Izbranim lncRNA smo računali Pearsonov korelacijski koeficient, s čimer smo lahko določili njihove značilne korelacije s preostalimi transkripti podatkovnega seta RNA-seq. Minimalna in maksimalna meja kvartilov je znašala 1 oz. 99. Iskanje pomembnih žarišč znotraj pridobljene biološke mreže lncRNA-mRNA smo izvedli s funkcijo cytoHubba (Chin in sod., 2014) in algoritmom »degree«. Iskali smo 7 najvišje uvrščenih lncRNA ( p < 0,05) z vrednostjo korelacij, ki se je najbolj nagibala proti -1 (negativna korelacija: izražanje prvega transkripta je povišano, izražanje drugega pa znižano oz. obratno) oz. 1 (pozitivna korelacija: izražanje prvega in drugega transkripta je povišano oz. znižano). Nato smo s funkcijo »display the expanded network« pridobili mrežo korelacij 7 najvišje uvrščenih transkriptov lncRNA s transkripti mRNA. Biološko vlogo analiziranih lncRNA smo določevali na podlagi anotacije soizraženih mRNA. Večje klastre ciljnih genov posameznih žarišč smo z bioinformacijskim orodjem DAVID (Huang in sod., 2009) analizirali za obogatene biološke poti GO_BP, KEGG in/ali Reactome ( p < 0,05). 2.2.2.3 Rezultat in diskusija Z računanjem Perasonovega korelacijskega koeficienta med 23 spremenjeno izraženimi lncRNA in podatki celokupnega transkriptoma endometrija v receptivni fazi smo pridobili značilnih 2648 korelacij. Na Sliki 3 je predstavljena koekspresijska mrežna mRNA-lncRNA s skupno uvrščenimi 133 geni. Glede na vrednosti korelacije so bile najvišje uvrščene lncRNA RNF144A-AS1, DRAIC, LINC02102, CADM3-AS1, SOCS2-AS1, LINC00921 in KDM7A-DT. Med temi 7 preiskovanimi lncRNA in ostalimi 126 transkripti RNA smo zaznali 257 parov. Od tega je bilo 212 parov v negativni, 45 pa v pozitivni korelaciji. Med 126 uvrščenimi mRNA v mreži lncRNA-mRNA je bilo 15 genov, ki smo jih zaznali tudi kot spremenjeno izražene znotraj seta 382 genov naše analize RNA-seq. Npr. spremenjeno izražen gen RASEF iz seta 382 genov je v negativni korelaciji z izražanjem lncRNA DRAIC in CADM3-AS1. Gen B9D1, tudi spremenjeno izražen v setu 328 genov, pa je v pozitivni korelaciji z izražanjem DRAIC in CADM3-AS1. Identificirali smo pozitivni korelaciji med transkriptoma mRNA UBE2E2 oz. TMPRSS11D in lncRNA SOCS2-AS1. Oba ciljna gena sta bila tudi spremenjeno izražena v setu 382 genov. V mreži lncRNA-mRNA se kaže, da transkripta lncRNA DRAIC in CADM3-AS1 predstavljata pomembni vozlišči, kar se kaže kot pretežna negativna korelacija z izražanjem ciljnih mRNA. Da bi lahko predlagali biološko vlogo omenjenih lncRNA, smo izvedli obogatitveno analizo klasta njunih ciljnih genov. Skupno smo pridobili 7 obogatenih poti GO-BP ( p < 0,05), ki so bile povezane s celično adhezijo in organizacijo aktinskih filamentov. 92 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pridobili smo tudi tri obogatene poti ( p < 0,05) zbirke Reactome, ki so bile povezane s ciklom RHO GTPaz. Pridobljeni rezultati so v skladu z literaturo iz področja endometrijske receptivnosti, v kateri so opisali vlogo lncRNA pri uravnavanju izražanja genov celične adhezije (Fan in sod., 2017; Li D. in sod., 2019). Iz zbirke Reactome pa smo z obogatitveno analizo klastra ciljnih genov transkriptov lncRNA DRAIC in CADM3-AS1 identificirali tudi biološko pot prirojen imunski sistem, ki pa ni bila statistično značilna ( p = 0,064). Ta pot je še posebej zanimiva, saj je bila večina 382 spremenjeno izraženih genov naše RNA-seq analize anotiranih v biološke procese, povezane z IFN, ki je del prirojenega imunskega odziva. Z obogatitveno analizo klastra ciljnih genov transkriptov lncRNA DRAIC in KDM7A-DT smo identificirali pet obogatenih poti GO-BP ( p < 0,05), povezanih s celičnim odzivom na pomanjkanje dušika in mitofagijo. Tudi iz zbirke KEGG smo identificirali značilno pot, povezano z mitofagijo. Z obogatitveno analizo klastra ciljnih genov transkriptov lncRNA DRAIC in LINC00921 pa smo identificirali le eno neznačilno pot GO-BP transmembranski transport kalcijevega iona. S sedanjo bioinformacijsko analizo smo pokazali, da bi vloga lncRNA DRAIC in CADM3-AS1 pri adenomiozi lahko bila povezana s procesom adhezije. Potrebne so dodatne analize teh kandidatnih lncRNA, da bi lahko bolje ovrednotili, ali adenomioza preko epigenetskih regulatorjev vpliva na adhezivne lastnosti endometrija. 93 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 94 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 3: Koekspresijska mreža sedmih izbranih transkriptov lncRNA in njihovih 126 ciljnih transkriptov na eksperimentalnih podatkih RNA-seq. Geni za lncRNA so označene s trikotniki, preostali geni pa s krogom. Glede na ocenjevalni sistem vozlišč funkcije cytoHubba so najvišje uvrščeni transkripti lncRNA obarvani z rdečo, sledijo oranžni in nato rumeni. Izmed vseh 257 pridobljenih parov lncRNA-mRNA jih je 212 v negativni (robovi mreže obarvani z modro) in 45 v pozitivni (robovi mreže obarvani z zeleno) korelaciji. Z vijolično barvo je obarvanih 15 genov, ki smo jih identificirali tudi kot spremenjeno izražene v setu 382 genov s primerjavo podatkov RNA-seq potrjeno receptivnih vzorcev endometrija med adenomiozno in kontrolno skupino. Figure 3: The coexpression network for selected seven lncRNA transcripts and their 126 target transcripts on experimental RNA-seq data. Given genes for lncRNAs are indicated by triangles and the remaining genes by a circle. According to the node scoring system of cytoHubba function, the highest ranked lncRNA transcripts are coloured red, followed by orange and then yellow. Of the 257 lncRNA-mRNA pairs retrieved, 212 are in negative (network edges coloured with blue) and 45 in positive (network edges coloured with green) correlation. 15 genes of the network are coloured purple and were also identified as differentially expressed in the set of 382 genes by comparison of RNA-seq data of confirmed receptive endometrial samples between adenomyosis and control groups. 95 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3 RAZPRAVA IN SKLEPI 3.1 RAZPRAVA 3.1.1 Poenotenje heterogenega poimenovanja genetskih lokusov S poenotenjem poimenovanja transkriptov RNA in proteinov, ki smo jih pridobili s pregleda literature, povezane z endometrijskim izražanjem pri različnih ginekoloških stanjih, smo lahko izvajali obogatitvene analize in predlagali močnejše kandidatne biološke poti in gene spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Najprej smo s poenotenjem genske nomenklature in obogatitvenimi analizami prikazali vpliv sorodne, a bolje raziskane endometrioze, na molekularno organizacijo endometrija po posameznih fazah menstruacijskega ciklusa (Prašnikar in sod., 2020a). Potek dela raziskave je predstavljen na Sliki 4. Iz 21 raziskav različnih omskih ravni smo zbrali genetske vzroke, ki se povezujejo z odstopanji v izražanju endometrija pri ženskah z endometriozo v primerjavi z ženskami brez endometrioze. Iz vsake raziskave smo pridobili do 15 statistično najznačilnejših znižano in/ali prekomerno izraženih mRNA, ncRNA in/ali proteinov. Skupno smo pridobili 760 lokusov, ki so bili poimenovani po različnih nomenklaturnih sistemih. Lahko so bili poimenovani s številko Gene ID zbirke NCBI (NCBI Gene, 2019), številko EST (angl. expression sequence tag) z oznako Hs ( homo sapiens) zbirke NCBI UniGene (NCBI UniGene, 2019), številko SeqName ID (Ensembl BioMart. 2019), številko MIMAT zbirke MirBase (miRBase, 2019), številko proteina zbirke UniProt (The UniProt ..., 2019), številko GenInfo zbirke NCBI protein (NCBI GenBank, 2019), s starim poimenovanjem ali s sinonimom. Da smo lahko izvedli sintezo podatkov glede na datirano fazo menstruacijskega ciklusa endometrija, v kateri je bilo zaznano spremenjeno izražanje, smo morali najprej poenotiti heterogeno poimenovanje 760 lokusov. To smo storili tako, da smo jim ročno poiskali genske simbole zbirke HGNC, ki podeljuje uradne simbole humanim genom (Braschi in sod., 2019). Na tak način smo pridobili genske simbole za 623 lokusov. Po odstranitvi podvojenih genov smo unikatnih 591 genov razvrstili glede na poročano datirano fazo menstruacijskega ciklusa (M, P, S, ZS, SS in PS faza ter N/N, če podatek o datiranju ni bil naveden). S sortiranjem 623 genov smo identificirali 72 genov (med drugimi ACTB, ANXA4, BPIFB1, EPHX1, MUC5B, PRDX2, VIM, HSP90AB1, ANLN, CCN1, CRISP3, EGR1, FOS, FOSB in TRPM6), ki so se ponovili v več fazah ciklusa oz. v isti fazi ciklusa pri različnih raziskavah. Te gene smo izpostavili kot močnejše kandidatne za endometrijske molekularne označevalce endometrioze, kar bi v prihodnosti pripomoglo k hitrejši diagnozi te bolezni (Prašnikar in sod., 2020a). Endometriozo namreč označujejo nespecifični simptomi, kar otežuje njeno diagnozo (Gupta in sod., 2016; Ahn in sod., 2017; Saare in sod., 2017: 228). Z obogatenjem genskih setov smo identificirali poti, povezane z odstopanji v fiziološkem zorenju endometrija glede na posamezne faze menstruacijskega ciklusa. Predvsem so nas zanimale obogatene poti 173 genov SS faze, ko se pojavi stanje endometrijske receptivnosti. Identificirali smo poti nosečnost, kemotaksa endotelijskih celic, kemotaksa monocit, 96 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 kemotaksa limfocitov, vnetni odziv; in signalna pot, vodena s kemokini. Pridobljene poti kažejo na porušeno celično komunikacijo pri endometriozi, kar je v skladu z literaturo. Lee in sod. (2011) so namreč opisali, da je delovanje kemokinov in citokinov pomembno pri zvišanju števila celic naravne in pridobljene imunosti v endometriju, kjer so potrebne za uspešno vgnezdenje zarodka in vzdrževanje nosečnosti. Po drugi strani se porušeno delovanje citokinov in imunskega sistema povezuje s patogenezo endometrioze (Matarese in sod., 2003). Tudi z obogatitvijo seta 382 spremenjeno izraženih genov med adenomiozno in kontrolno skupino izvedene analize RNA-seq smo identificirali poti, povezane s citokini imunskega sistema (odzivi na signalizacijo z IFN) (Prašnikar in sod., 2022). Pokazali smo, da bi lahko adenomioza in endometrioza do neke mere na podoben način vplivali na biološke procese, povezane z endometrijsko receptivnostjo za vgnezdenje zarodka. Slika 4: Potek pridobivanja znanja o molekularnih odstopanjih endometrija pri endometriozi. Figure 4: Workflow of a study on molecular abnormalities of the endometrium in endometriosis. 97 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Poenotenje poimenovanja po zbirki HGNC (HUGO, 2019) smo izvedli tudi za preiskovane lokuse pridobljenih 110 raziskav endometrija pri adenomiozi. Tudi tu smo pridobljene gene združevali glede na poročano datirano fazo menstruacijskega ciklusa (P in SS faza) in jih dalje obogatili. Na podlagi identificiranih poti smo predlagali 52 močnejših kandidatov patofiziologije endometrija (med drugimi ANXA1, BCL3, BCL6, BIRC5, BTG1, CD14, CD44, CD74, CEBPB, CXCL2, CYR61, DUSP1, ECM1, EGR3, ELF3, EPHA2, HSPA5, IER3, ITGB2, LTF, MCL1, NFKB2, NFKBIA, NFKBID, RHOB, S100A9, SOCS3 in VEGFA) in 10 močnejših kandidatov spremenjene endometrijske receptivnosti ( IL10, SST, STAT3, LIF, CHD5, CDKN3, COL8A1, COL11A1, ITGB3 in SPP1) pri tej bolezni. Poznavanje vloge posameznih endometrijskih genov pri adenomiozi bi lahko vodilo v identifikacijo molekularnih označevalcev, povezanih s to boleznijo. Endometrijski molekularni označevalci patofiziologije bi lahko olajšali diagnozo zgodnje adenomioze, ki trenutno temelji na subjektivni oceni TVUZ ali MR slik maternice (Hershko-Klement in Tepper, 2016; Loring in sod., 2020). Endometrijski molekularni označevalci spremenjenega stanja receptivnosti pri adenomiozi pa bi omogočili boljšo diagnostiko endometrija kot morebiten dejavnik neplodnosti pri teh bolnicah. Nepoznavanje molekularnega ozadja endometrijske receptivnosti je dejavnik, ki omejuje uspešnost postopkov OBMP (Mahajan in sod., 2018; Sebastian-Leon in sod., 2018). Zaradi poenotenja poimenovanja smo lahko med posameznimi oblikovanimi genskimi seti (zbrani podatki iz pregleda literature in rezultati izvedene analize RNA-seq) preverili prekrivanje genov (Slika 5). Uporabljeni geni setov doktorske disertacije so navedeni v Prilogi A. Preverili smo prekrivanje genskih setov, ki smo jih sestavili iz poročanih podatkov o endometrijski receptivnosti pri ženskah z adenomiozo (42 genov) in ženskah z endometriozo (173 genov). Oblikovali smo tudi set 151 genov, poimenovan zdrava maternica (normalni pogoji endometrijske receptivnosti), ki smo ga pridobili z združenjem seznamov genov, povezanih z endometrijsko receptivnostjo, prvega komercialnega molekularnega testa (Díaz-Gimeno in sod., 2011) in meta analize 9 transkriptomskih raziskav (Altmäe in sod., 2017). V povezavi z normalnimi pogoji endometrijske receptivnosti smo oblikovali tudi set 60 genov iz zbirke GO, ki so bili anotirani v procese vgnezdenja zarodka in/ali decidualizacijo. Vključili smo tudi seta, povezana s spremenjenim endometrijskim izražanjem v P fazi pri adenomiozi, ki smo ju oblikovali z združevanjem genov raziskav kandidatnih lokusov (78 genov) in transkriptomskih raziskav (518 genov). V primerjavo pa smo vključili še set 382 genov, ki smo jih identificirali kot spremenjeno izražene med adenomiozno in kontrolno skupino v primerjavi RNA-seq podatkov potrjeno receptivnih vzorcev. Med setoma 382 in 151 genov se je prekrivalo pet genov ( KRT7, DEFB1, TSPAN8, GABARAPL1 in BUB1B). Med setoma 328 in 173 so se prekrivali BST2, LCK in SCGB2A2. Slednji je bil skupen še s setom 151 genov. Setoma 382 in 518 genov je bilo skupnih 9 genov ( CPSF1, S1PR4, ACP5, RFX2, HERC2P2, CYBB, SLC2A3, HBB in EPOR). Kar 19 genov ( ERG3, NR4A3, RGS1, GZMA, VHL, PER1, FOSB, MIR339, SOCS3, EGR2, ATF3, ZFP36, C1QA, C1QTNF6, CYP3A5, CXCL2, JUNB, VEGFA in VIM) je bilo skupnih setoma 173 in 518 98 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 genov (oba seta sta bila oblikovana na podlagi združevanja podatkov omskih raziskav). Zanimivo je, da ni skupnega gena med setoma 60 in 151 genov, saj se oba navezujeta na procese endometrijske receptivnosti. Med setoma 151 in 518 genov je bilo skupnih 13 genov ( DKK1, C D C20, GADD45A, ADAMTS1, BCL6, EFNA1, MT2A, ECM1, CAPN6, THBD, S100A4, HLA-DOB in CCNB2). To bi lahko nakazovalo vpliv patofizioloških procesov endometrija na njegovo stanje receptivnosti pri adenomiozi. Slika 5: Prekrivanje genov uporabljenih setov v naši raziskavi. Posamezni seti se navezujejo na gene, pridobljene s poenotenjem HGNC genske nomenklature podatkov s pregleda literature (Set A_SSfaza_lit: 42 genov. Set A_Pfaza_transc.: 518 genov. Set A_Pfaza_lokusi: 78 genov; Set Z.M._SSfaza_lit: 151 genov. Set GO_SSfaza: 60 genov in Set E_SSfaza_lit: 173 genov) in gene, identificirane kot spremenjeno izražene s primerjavo RNA-seq podatkov potrjeno receptivnih vzorcev med adenomiozno in kontrolno skupino (Set A_SSfaza_RNA-seq: 382 genov). Uporabljene kratice: ZM. = zdrava maternica; P faza = proliferacijska faza menstruacijskega ciklusa; SS faza = srednja sekrecijska faza menstruacijskega ciklusa; lit. = literatura; transc. = transkriptomske analize; GO = genska ontologija; E = endometrioza. Figure 5: Gene overlap between used sets in our study. The individual sets refer to genes obtained by adoption of the HGNC gene nomenclature for extracted data by the literature mining (Set A_SSfaza_lit: 42 genes. Set A_Pfaza_transc.: 518 genes. Set A_Pfaza_lokusi: 78 genes; Set ZM._SSfaza_lit: 151 genes. Set GO_SSfaza: 60 genes and Set E_SSfaza_lit: 173 genes) and genes identified as differentially expressed by comparing RNA-seq data of confirmed receptive endometrial samples between the adenomyosis and the control group (Set A_SSfaza_RNA-seq: 382 genes). Abbreviations used/legend: ZM. = healthy uterus; P faza = the proliferative phase of the menstrual cycle; SS faza = the mid secretory phase of the menstrual phase; lit. = literature; transc. = transcriptomics analyses; GO = Gene Ontology; E = endometriosis. 99 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3.1.2 Identifikacija in preverjanje izražanja izbranih kandidatnih genov spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi V objavljeni raziskavi (Prašnikar in sod., 2020b) smo z dvema bioinformacijskima analizama predlagali 6 kandidatnih genov ( JUNB, IL10, IL6, SOCS3, FOS in LIF) spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi in dalje preverili njihovo izražanje na biopsijah endometrija žensk z in brez adenomioze. Za obogatitvene analize smo uporabili podatke iz pregleda literature, ki smo jih oblikovali v genske sete, povezane z endometrijsko receptivnostjo pri ženskah z adenomiozo (42 genov), ženskah z endometriozo (173 genov) in ženskah z zdravo maternico (151 genov). Pri prvi bioinformacijski analizi smo v zbirki bioloških poti Reactome (Fabregat in sod., 2016) obogatili samo genska seta adenomiozne (42 genov) in endometriozne (173 genov) skupine. Pridobili smo pet prekrivajočih poti, vključno signalizacija z IL4 in IL13. Anotirane gene IL10, STAT3, LIF, SOCS3, IL6, VIM, FOS, JUNB, VEGFA in HSP90B1 te poti smo uporabili kot vir kandidatov za analizo izražanja. Pri drugi bioinformacijski analizi pa smo poleg adenomioznega (42 genov) in endometrioznega (173 genov) seta uporabili še gene zdrave maternice (151 genov). Z aplikacijo STRING (Szklarczyk in sod., 2019) orodja Cytoscape (Shannon in sod., 2003) smo gene vseh treh setov projicirali v biološko mrežo proteinskih interakcij (angl. protein-protein interaction network). Tako smo pridobili mrežo s 315 vozlišči (proteini) in 1130 robovi (interakcije), ki smo jo dalje gručali in identificirali tri večje klastre, ki so prikazani na Sliki 6. Ker smo v orodju Cytoscape vsak set genov označili z drugačno barvo, smo lahko v mreži in klastrih sledili izvoru posameznih anotiranih genov. Opazili smo, da so bili v t.i. Cluster 1 anotirani geni vseh treh setov, kar smo interpretirali kot spremenjena molekularna organizacija endometrijske receptivnosti zaradi prisotne ginekološke patologije. Z obogatitveno analizo tega klastra smo identificirali poti vnetni odziv, celična kemotaksa, odziv na druge organizme/organske substance/lipide, regulacija aktivnosti signalnega receptorja in signalizacija z IL. Slednjo pot z anotiranimi geni LIF, LIFR, STAT3, IL15, JUNB, FOS, SOCS3, ANXA2, BCL6, IL6, IL10, CXCL2, CCL3 in CCL3L3 smo izbrali kot drugi vir kandidatnih genov za analizo izražanja. Končno smo med anotiranimi geni poti signalizacija z IL4 in IL13 in signalizacija z IL izbrali šest kandidatnih genov , in sicer JUNB, SOCS3, IL6, LIF, IL10 in SOCS3. Izbranim genom smo s qPCR preverili stopnjo izražanja v biopsijah endometrija žensk z (n = 9) in brez (n = 13) ultrazvočnih znakov adenomioze. Biopsije endometrija smo pridobili v pričakovanem stanju receptivnosti, in sicer med 7. in 9. dnem po izmerjenem vrhu hormona LH v urinu, ki naznanja ovulacijo preiskovanke (dnevi LH+7–LH+9). Izražanje izbranih genov smo normalizirali z geometrijsko sredino izražanja referenčnih genov GAPDH in 18S rRNA. Končno razliko v relativnem izražanju izbranih genov med preiskovanima skupinama smo preračunali z metodo 2-ΔΔCq (Livak in Schmittgen, 2001). Zaznali smo znižano stopnjo 100 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 izražanja preiskovanih genov pri adenomiozni skupini (Slika 7), vendar je bila razlika neznačilna. Slika 6: Identificirani klastri po gručanju mreže proteinskih interakcij. Proteini mreže se nanašajo na zbrane gene, povezane z endometrijsko receptivnostjo pri adenomiozi (n = 42 genov; označeni z modro barvo), endometriozi (n = 173 genov; označeni z rdečo barvo) in zdravi maternici (n = 151 genov; označeni z zeleno barvo). Z rumeno barvo so v t.i. Cluster 1 označeni izbrani geni za qPCR. Figure 6: Identified clusters by clustering of the protein-protein interactions network. The proteins of the network refer to the gathered genes associated with endometrial receptivity in adenomyosis (n = 42 genes; highlighted in blue), endometriosis (n = 173 genes; highlighted in red) in a healthy uterus (n = 151 genes; highlighted in green). The genes selected for qPCR are highlighted in yellow in the so-called Cluster 1. 101 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 7: Relativno izražanje izbranih kandidatnih genov JUNB, FOS, SOCS3, LIF, IL6 in IL10 v endometriju pričakovanega stanja receptivnosti med ženskami z in brez adenomioze. Figure 7: Relative expression of selected candidate genes JUNB, FOS, SOCS3, LIF, IL6, and IL10 in the endometrium of the expected receptive state between women with and without adenomyosis. Kljub neznačilni razliki v izražanju izbranih kandidatnih genov v naši analizi, pa v literaturi citokine, kamor spadajo tudi IL, navajajo kot pomembne dejavnike uspešnega vgnezdenja zarodka (Chaouat in sod., 2007). Kot že omenjeno so citokini pomembni pri začetni adheziji zarodka, nadaljnjem preurejanju zunajceličnega matriksa decidue in pri oblikovanju ožilja za zarodek (Chaouat in sod., 2007). Citokini sodelujejo pri uravnavanju lokalnega imunskega sistema maternice, s čimer zavarujejo zarodek pred imunskim napadom matere. Med S fazo menstruacijskega ciklusa decidua stimulira pritok različnih populacij imunskih celic: uNK, limfociti in makrofagi (Flynn in sod., 2000; Okada in sod., 2018). Celice T pomagalke (angl. helper T, Th) izločajo citokine tipa 2 (IL-4, IL-13, IL-5, IL-9 in IL-10), ki delujejo spodbudno 102 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 na invazijo trofoblasta v deciduo (Veenstra van Nieuwenhoven in sod., 2003). Neravnovesje v izražanju citokinov naj bi vplivalo na število in delovanje imunskih celic v endometriju, kar bi lahko bil eden izmed vzrokov neplodnosti (Chaouat in sod., 2007). Za izbrane kandidatne gene naše kvantifikacijske analize smo našli veliko podporne literature v povezavi z endometrijsko receptivnostjo. 3.1.2.1 Gen LIF Citokin LIF je glikoprotein, ki spodbuja decidualizacijo endometrijske strome pri človeku in miši (Shuya in sod., 2011). Chung in sod. (2016) so v kulturi EEC opazili povišano raven izražanja adhezijskih molekul ITGAV, ITGB3 in ITGB5 (potrebnih za pritrditev trofoblasta zarodka na epitelij endometrija) potem, ko so dodajali LIF (Chung in sod., 2016). Serafini in sod. (2009) so ženskam, pri katerih so v biopsijah sekrecijskega endometrija zaznali močno imunohistokemijsko barvanje za LIF, napovedali za 6,4 % višjo stopnjo zanositve v postopkih OBMP (Serafini in sod., 2009). Pri ženskah z nepojasnjeno neplodnostjo (Franasiak in sod., 2014) in pri ženskah z adenomiozo (Xiao in sod., 2010; Yen in sod., 2016) pa so že poročali o znižanih vrednostih izražanja endomertijskega LIF in pripadajočega proteina, kar je bilo povezano z zmanjšano endometrijsko receptivnostjo za vezavo zarodka pri teh ženskah. 3.1.2.2 Gen IL10 Protivnetni citokin IL-10 deluje kot negativni regulator aktivacije makrofagov in limfocitov T (Kühn in sod., 1993). V zgodnji nosečnosti se povišano izražanje IL-10 povezuje z vzdrževanjem imunotolerance matere do zarodka (Thaxton in Sharma, 2010). Wang in sod. (2018) so znižane vrednosti izražanja IL-10 v času endometrijske receptivnosti pri ženskah z adenomiozo povezali z vplivom na zmanjšano izražanje pripadajočega HOXA10, to pa na znižano stopnjo endometrijsko receptivnost pri teh ženskah. Po drugi strani pa so Wang F. in sod. (2009) poročali o prekomernem izražanju IL-10 v EEC pri adenomiozi v primerjavi s kontrolno skupino, kar so povezali z nenormalnim vnetnim odzivom in patogenezo te bolezni. 3.1.2.3 Gen IL6 Citokin IL-6 je vključen v akutne faze vnetnega odziva, zorenje limfocitov B, diferenciacijo makrofagov in Th tipa 1/2 (Diehl in Rincón, 2002). Domneva se, da je pri ženskah z rednimi menstruacijskimi ciklusi izražanje IL-6 najnižje v P fazi, nato pa postopoma raste z vrhom v SS fazi (Von Wolff, 2000). Zhihong in sod. (2016) so v času okna vgnezdenja po kontrolirani stimulaciji jajčnikov zaznali višje ravni izražanja endometrijskega IL-6 pri ženskah z adenomiozo v primerjavi s kontrolno skupino, kar so povezali z ovirano endometrijsko receptivnostjo. Yang in sod. (2006) so poročali o zvišani ravni izražanja IL6 v primarni kulturi ESC žensk z adenomiozo potem, ko so jih gojili skupaj z makrofagi. Prekomerno izločanje IL-6 so avtorji povezali s povišano stopnjo proliferacije stromalnih in vaskulatornih 103 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 celic, kar spodbuja tvorbo in obstoj adenomioznih lezij na ektopičnih mestih (Yang in sod., 2006). Po drugi strani pa so Ponce in sod. (2009) pri ženskah z endometriozo zaznali zmanjšano izražanje endometrijskega IL6 in IL6 v PS v primerjavi z ženskami brez te bolezni. To so povezali z odpornostjo endometrija na apoptozne procese, kar bi lahko pripomoglo k razvoju in napredovanju endometrioze (Ponce in sod., 2009). 3.1.2.4 Gena FOS in JUNB Proteina FOS in JUNB sta podenoti, ki dimerizirata in tvorita kompleks prepisovalnega dejavnika, aktivator protein 1 (angl. activator protein 1). Ta prepisovalni dejavnik nadzira izražanje genov celičnega cikla (proliferacija, diferenciacija, apoptoza in odziv na stres), (Jochum in sod., 2001). Baiyong in sod. (1999) so pokazali, da lahko spremenjeno izražanje proteina JUNB vpliva na diferenciacijo populacij limfocitov Th v tip 1 ali v tip 2. Najprej so iz JUNB-pozitivne transgene miši izolirali naivne CD4 limfocite T in jih dalje diferencirali v populacijo celic Th1. Zaradi prekomernega izražanja JUNB pa so te celice izločale citokin IL-4, ki ga običajno izločajo celice Th2 (Baiyong in sod., 1999). V sekrecijskem endometriju žensk z endometriozo so poročali o prekomernem izražanju tako JUNB (Absenger in sod., 2004; Tamaresis in sod., 2014) kot tudi FOS (Tamaresis in sod., 2014) in FOS (Pan in sod., 2008), kar so povezali z vlogo pri patofiziologiji te bolezni. Po drugi strani pa Morsch in sod. (2009) niso opazili razlik v stopnji fosforilacije FOS med ženskami z in brez endometrioze. 3.1.2.5 Gen SOCS3 Znotrajcelični protein SOCS3 sodeluje pri negativnem uravnavanju vnetnega odziva, saj zavre signalizacijo citokinov (Lang in sod., 2003). Dong in sod. (2009) so predlagali, da bi lahko zmanjšana signalizacija SOCS3 zvišala vnetni odziv na trofoblast placente (angl. placental trophoblast), kar vodi v preeklampsijo. Na celični kulturi trofoblasta placente JEG-3 so namreč pokazali, da je prekomerno izražanje SOCS3 vodilo v povišano stopnjo izločanja IL-10, ki deluje spodbudno za nadaljnjo nosečnost (Dong in sod., 2009). Braunschweig in sod. (2011) pa so pokazali, da utišanje SOCS3 vodi v zvišano citotoksičnost kulture celic NK-92, ki predstavljajo celični model uNK. 3.1.3 Transkriptom endometrija v potrjeno receptivni fazi pri adenomiozi Analizo RNA-seq sekvenciranja transkriptoma (mRNA in lncRNA) endometrija v pričakovanem stanju receptivnosti smo izvedli pri 10 ženskah z adenomiozo in 10 ženskah brez patologije rodil. Identificirali smo 909 spremenjeno izraženih genov (vrednost p (linearni model in empirični Bayes) < 0,05; vrednost p po testu FDR > 0,05). Te gene smo nato obogatili z aplikacijama ClueGO (Bindea in sod., 2009) in CluePedia (Bindea in sod., 2013) v orodju Cytoscape in pridobili štiri statistično značilne (Bonnferoni p vrednost < 0,05) biološke poti. Z aplikacijama so bile poti razvrščene v mrežo s funkcionalno urejenimi 104 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 skupinami glede na podobno biološko vlogo. S setom 909 genov smo identificirali le dve takšni skupini (Slika 8a), in sicer znotrajcelični transport lipidov (angl. intracellular lipid transport) in aktivnost ikosanoidnega receptorja (angl. icosanoid receptor activity). Slika 8: Mreže s funkcionalno urejenimi skupinami bioloških poti, ki so bile obogatene s setoma 909 (a) in 382 (b) spremenjeno izraženih genov med adenomiozno in kontrolno skupino v analizah podatkov RNA-seq. a) Štiri obogatene poti, razvrščene v dve funkcionalni skupini, smo identificirali z analizo 909 genov. Set 909 genov smo identificirali s primerjavo podatkov RNA-seq vseh 20 vzorcev endometrija, ki smo jih pridobili med dnevi LH+7 in LH+9 (10 vzorcev adenomiozne in 10 vzorcev kontrolne skupine). b) Skupno 33 obogatenih poti, razvrščenih v sedem funkcionalnih skupin, smo identificirali z analizo 382 genov. Set 382 genov smo identificirali po ponovni analizi podatkov RNA-seq, kjer smo upoštevali samo potrjeno receptivne vzorce endometrija (8 iz adenomiozne in 5 iz kontrolne skupine) glede na rezultate natančnega datiranja receptivne faze. Povečava mreže (c) tesno prepletenih poti, povezanih z mehanizmi odziva na delovanje IFN. Z zeleno barvo so označene poti z anotiranimi geni zmanjšanega izražanja v adenomiozni skupini. Z oranžno barvo pa so označene poti z anotiranimi geni prekomernega izražanja v adenomiozni skupini. S sivo barvo so označene poti z enakomernim deležem anotiranih genov znižanega in genov povišanega izražanja. Figure 8: Networks with functionally sorted groups of biological pathways enriched by 909 (a) and 382 (b) genes that were differentially expressed between the adenomyosis and the control groups in two RNA-seq data analyses. a) Four enriched pathways, sorted into two functional groups, were identified with the analysis of 909 genes. The 909 gene set was identified by comparing the RNA-seq data of all 20 endometrial samples obtained between days LH+7 and LH+9 (10 samples from the adenomyosis group and 10 samples from the control group). b) A total of 33 enriched pathways, classified into seven functional groups, were identified with the analysis of 382 genes. The set of 382 genes was identified after re-analysis of the RNA-seq data, where only confirmed receptive endometrial samples (8 from the adenomyosis group and 5 from the control group) were considered according to the results of the precise dating of the receptive phase. Magnification of the network of (c) tightly connected pathways associated with mechanisms of response to IFN action. Pathways with annotated downregulated genes in the adenomyosis group are highlighted in green. Pathways annotated with upregulated genes the adenomyosis group are highlighted in orange. Pathways with an equal proportion of annotated down-and up-regulated genes are highlighted in grey. 105 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Identifikacija visokega števila (n = 909) spremenjeno izraženih genov, vendar nizkega števila obogatenih bioloških poti (n = 4), bi lahko bila posledica uporabe nehomogenih vzorcev glede na stadij fiziološkega razvoja endometrija ob času vzorčenja biopsije. To pomeni, da bi se lahko vzorci endometrija preiskovank v trenutku vzorčenja biopsije nahajali v različnih stadijih S faze menstruacijskega ciklusa, kljub temu, da je bilo vzorčenje izvedeno med dnevi LH+7 in LH+9, ko se pojavi pričakovani čas receptivnosti. Poročajo namreč, da časovni pojav in trajanje receptivne faze v SS fazi ni enak pri vseh ženskah, kot se je to menilo včasih. Receptivna faza se lahko pojavi prej ali kasneje od pričakovane in traja različno dolgo (Ruiz-Alonso in sod., 2013; Tan in sod., 2018). V postopkih OBMP prenos blastociste v maternico v času nereceptivnega endometrija prepreči njeno uspešno vezavo na epitelij (Sebastian-Leon in sod., 2018). Tudi pri ženskah z adenomiozo so poročali o časovnem zamiku stanja receptivnosti znotraj menstruacijskega ciklusa, kar bi lahko bila posledica nižjega deleža zanositve pri zdravljenju neplodnosti (Mahajan in sod., 2018). Dodatno, Devesa-Peiro in sod. (2021) so z analizo dostopnih transkriptomskih podatkov pokazali, da je podpis endometrijskih patologij na transkriptom endometrija zamaskiran pri primerjavi vzorcev endometrija različnih faz menstruacijskega ciklusa. Opazili so, da imajo na transkriptomsko analizo med primerjalnima skupinama večji vpliv spreminjajoče se faze menstruacijskega ciklusa, kot pa naj bi bil vpliv sopojavne patologije. Pri iskanju endometrijskih molekularnih označevalcev patologij s pomočjo visoko občutljivih omskih tehnik so avtorji poudarili pomen natančnega datiranja endometrija ob času vzorčenja (Devesa-Peiro in sod., 2021). Zaradi teh navedenih argumentov smo frakcijo vsake izolirane endometrijske RNA, ki smo jo uporabili za RNA-seq, uporabili še za personalizirano datiranje receptivne faze menstruacijskega ciklusa ob času vzorčenja biopsije. Natančna klasifikacija receptivne faze vzorcev je bila opravljena z novim molekularnim orodjem beREADY® (Saare in sod., 2019). Orodje na podlagi vzorca izražanja 57 endometrijskih genov določi stanje receptivne faze, kar pa omogoča načrtovanje optimalnega časa prenosa zarodkov v maternico s postopki OBMP (Saare in sod., 2019). Z rezultati testiranja receptivne faze smo ugotovili, da vsi vzorci niso bili pridobljeni v optimalni receptivni fazi. Od skupno 20 vzorcev jih je bilo 13 v receptivni fazi, 2 sta bila v zgodnji in 5 v pozni receptivni fazi. Analizo pridobljenih podatkov RNA-seq smo ponovili z upoštevanjem rezultatov natančnega datiranja receptivne faze vzorcev endometrija. V ponovni analizi RNA-seq smo upoštevali le transkriptomske podatke 13 vzorcev potrjeno receptivne faze (8 iz adenomiozne in 5 iz kontrolne skupine). Transkriptomske podatke preostalih 7 mejno receptivnih vzorcev smo izključili iz analize. S tem smo preprečili vpliv ZS oz. PS faze menstruacijskega ciklusa na transkriptomsko analizo, povezano z endometrijsko receptivnostjo (SS faza). Z analizo samo potrjeno receptivnih vzorcev med adenomiozno in kontrolno skupino smo identificirali 382 spremenjeno izraženih genov (vrednost p (linearni model in empirični Bayes) < 0,05; vrednost p po testu FDR > 0,05). Ti geni so bili obogateni v statistično značilnih (Bonnferoni p vrednost < 0,05) 33 poteh (20 poti anotiranih v ontologijo GO_BP, 6 v zbirko Reactome Pathways in 7 v Reactome Reactions). Izmed 33 poti, se jih je kar 19 nanašalo na poti, 106 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 povezane z mehanizmi odziva na IFN (Slika 8c). Skupno 33 poti s pripadajočimi anotiranimi geni je bilo razvrščenih v mrežo s 7 funkcionalno urejenimi skupinami (Slika 8b). V aplikaciji ClueGO je možna tudi vizualizacija deleža anotiranih genov posameznega seta genov. V primeru, da več kot 60 % anotiranih genov izhaja iz posameznega genskega seta, je obogatena pot/funkcionalna skupina mreže obarvana s predhodno določeno barvo tega seta. V primeru, da anotirani geni obogatene poti/funkcionalne skupine v enakomernem deležu izhajajo iz različnih genskih setov, potem je ta pot/funkcionalna skupina obarvana sivo (Bindea in sod., 2009). Med identificiranimi 382 spremenjeno izraženimi geni izvedene analize RNA-seq smo v aplikacijo posebej vnesli zvišano (n = 166) in posebej znižano (n = 216) izražene gene v adenomiozni skupini. Od skupno 7 funkcionalnih skupin so bili v štirih večinoma anotirani geni znižanega izražanja: izražanje genov, induciranih z IFN (angl. expression of IFN-induced genes; anotirani geni BST2, IFI35, IFIT1, IFITM1, ISG15, MX1, OAS2, OAS3 in STAT1 izraženi v zmanjšani, IRF6 pa v zvišani stopnji); odziv na interferon alfa (angl. response to interferon-aplha; anotirani BST2, EIF2AK2, IFITM1 in LAMP3); konjugacija proteina ISG15 (angl. ISG15-protein conjugation; anotirani ISG15, UBA7 in UBE2E2) in homofilna celična adhezija preko adhezivnih molekul membrane plazme (angl. homophilic cell adhesion via plasma membrane adhesion molecules; anotirani AMIGO1, CDH15, CDH24, CDH6, FAT1, FAT2, PALLD, PCDHA9 in PLXNB3 izraženi v zmanjšani, CDHR1 in NECTIN4 v zvišani stopnji). V funkcionalno skupino procesi metabolizma cisteina (angl. cysteine metabolic process) pa so bili anotirani MPST, TST in VSIG2 povišano izraženi, SLC7A11 se je izražal v zmanjšani stopnji. Identificirali pa smo tudi dve funkcionalni skupini s primerljivima deležema anotiranih tako povišano kot znižano izraženih genov: bolezni, povezane z O-glikozilacijo proteinov (angl. diseases associated with O-glycosylation of proteins; anotirani ADAMTS17, ADAMTS5 in ADAMTSL2 izraženi v povišani, ADAMTSL1, MUC13, MUC5B in THSD7A v znižani stopnji) in homeostaza retine (angl. retina homeostasis; anotirani AZGP1, CDHR1 in NECTIN4 izraženi v povišani, ALPK3, ATP1B2, CDH15 in POTEJ v znižani stopnji). Identificirana obogatena pot homofilna celična adhezija preko adhezivnih molekul membrane plazme z večino anotiranih genov, ki so bili znižano izraženi pri adenomiozni v primerjavi s kontrolno skupino, bi lahko nakazovala na zmanjšano kapaciteto adhezivnosti endometrija pri tej bolezni. Molekule celične adhezije (integrini, kaderini, selektini in imunoglobulini) so pomembni dejavnik receptivnosti endometrija, saj zvišajo adhezivne lastnosti epitelija, kamor se lahko pritrdi blastocista (Achache in Revel, 2006). Glede na analizo z aplikacijama ClueGO/CluePedia so funkcionalne skupine izražanje genov, induciranih z IFN, odziv na interferon alfa in konjugacija proteina ISG15 povezani procesi, kar se znotraj biološke mreže kaže kot tesno prepletanje poti s skupnimi anotiranimi geni (Slika 8b in 8c). Te biološke poti, ki smo jih identificirali s pomočjo RNA-seq in natančnim datiranjem receptivne faze vzorcev endometrija, predlagamo kot močnejše kandidatne poti za nadaljnje raziskave endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Tem biološkim potem, 107 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 povezanim z IFN, smo našli podporno literaturo tako iz področja vgnezdenja zarodka kot iz patofiziologije adenomioze. 3.1.3.1 Vloga IFN pri fiziološkem razvoju endometrija Pri procesu vgnezdenja zarodka se vloga IFN povezuje z vzdrževanjem lokalnega vnetnega okolja, ki spodbuja migracijo trofoblasta v deciduo do žilnega sistema matere (Hannan in sod., 2011; Gnainsky in sod., 2014). Popovici in sod. (2000) so povišano izražanje genov vnetnih citokinov (vključno tip I IFN alfa/beta) povezali z vključevanjem limfocitov in makrofagov v deciduo. De Veer in sod. (2001) so na podlagi analiz z mikromrežami ugotovili, da družina citokinov IFN sproži izražanje številnih genov, vključenih v protivirusne, protiproliferacijske in imunosupresijske procese. Pot prenosa signala se prične po vezavi IFN na površinske receptorje, ki sprožijo aktivacijo družine proteinov JAK (angl. janus kinase). Aktivirane kinaze JAK fosforilirajo družino prepisovalnih dejavnikov STAT, ti pa se dalje vežejo v homo- ali heterodimere in tvorijo komplekse z drugimi prepisovalnimi dejavniki. Skupaj se vežejo na odzivne elemente, stimulirane z IFN (angl. IFN-stimulated response elements, ISRE), ki se nahajajo na promotorski regiji genov, stimulirani z IFN (angl. IFN-stimulated genes, ISGs) in aktivirajo njihovo transkripcijo. Poznanih je več kot 300 ISGs (De Veer in sod., 2001). Ubikvintinu podoben protein ISG15 je potranskripcijski preoblikovalec, ki se lahko v procesu isgilacije (angl. ISGylation) kovalentno veže na različne proteine. Delovanje ISG15 se povezuje s številnimi celičnimi procesi in stanji (translacija proteinov, dinamika citoskeleta, izločanje eksosoma, avtofagija, stabilnost genoma in rak) in je močen kandidat ciljnih terapevtskih pristopov (Jiménez Fernández in sod., 2020). Protein ISG15 lahko deluje kot znotrajcelični ali kot izvencelični protein. Znotrajcelično izražanje ISG15, ki je odvisno od signalnih poti tipa 1 IFN alfa/beta, označuje prirojeni imunski odziv na virusne in mikrobne patogene. Zunajcelično izražanje ISG15 pa lahko pri limfocitih izzove izločanje IFN gama, citokina tipa 2 (Swaim in sod., 2017). Raziskave na miših so pokazale, da ima pospešeno izražanje ISG15 med zgodnjo nosečnostjo pomembno vlogo pri razvrščanju celic uNK, ki so vključene v preoblikovanje spiralnih arterij za normalen dotok krvi plodu (Austin in sod., 2003). Poročali so že o spremenjeni ravni izražanja nekaterih citokinov v pričakovanem času endometrijske receptivnosti pri ženskah z adenomiozo (Zhihong in sod., 2016) in ženskah z endometriozo (Kharfi in sod., 2003; Ulukus M. in sod., 2005). Citokini, vključeni v proces decidualizacije stromalnih celic, uravnavajo prehod iz provnetnega v protivnetni odziv (Wilczyński, 2005). Prehod v ravnovesju citokinov se povezuje tudi z uravnavanjem ravnovesja med endometrijsko receptivnostjo in selektivnostjo, s čimer se omogoči vgnezdenje samo visoko kakovostnih zarodkov (kromosomsko stabilni zarodki z dobrimi invazivnimi lastnostmi) (Macklon in Brosens, 2014). Porušeno ravnovesje med receptivnostjo in selektivnostjo endometrija pa je bilo povezano z vgnezdenjem tudi zarodkov slabše kvalitete, kar pa lahko vodi v prekinitev nosečnosti (Quenby in sod., 2002). Višjo stopnjo splavov opažajo tudi pri ženskah z adenomiozo v primerjavi z ženskami brez adenomioze (Martinez-Conejero in sod., 2011; Stanekova in sod., 2018). Tako morda 108 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 obogatene poti odziva na delovanje IFN, ki smo jih identificirali z geni zmanjšanega izražanja izvedene analize RNA-seq, kažejo na slabšo endometrijsko selektivnost žensk z adenomiozo, kar omogoča vgnezdenje tudi slabših zarodkov, a vodi v splav. 3.1.3.2 Vloga IFN pri patofiziologiji adenomioze Sotnikova in sod. (2002) so poročali o povišanih vrednostih vnetnih citokinov IFNG, IFNA, TNF, IL1B in epidermalnega rastnega dejavnika (EGF) pri ženskah z adenomiozo v primerjavi v zdravimi ženskami, potem ko so analizirali supernatant 24 ur gojenih mononuklearnih celic (limfociti in makrofagi) endometrija PS faze. Avtorji so lokalno povišano sintezo citokinov v endometriju povezali s spodbujanjem celične proliferacije, kar vodi v razvoj adenomioze (Sotnikova in sod., 2002). Tremellen in Russell (2012) pa sta pri ženskah s hudo obliko adenomioze in ponavljajočimi neuspešnimi poskusi vgnezdenja zarodka poročala o povišanih vrednostih celic uNK in makrofagov v funkcionalni plasti endometrija PS faze, ko sta jih primerjala z ženskami z blago adenomiozo ali z zdravimi ženskami. To sta povezala z negostoljubnim imunskim okoljem endometrija zaradi bolezni, kar lahko ovira uspešno vgnezditev zarodka (Tremellen in Russell, 2012). Na podlagi rezultatov obogatitvenih analiz setov 909 in 382 genov, ki smo ju identificirali z izvedeno analizo RNA-seq ob upoštevanju rezultatov natančnega datiranja endometrija in podporne literature sklepamo, da set 382 genov bolj reprezentativno predstavlja podpis adenomioze na transkriptom endometrija v receptivni fazi, kot pa sprva pridobljenih 909 genov. Da bi razumeli vlogo teh 382 genov v povezavi z molekularnimi procesi endometrijske receptivnosti, smo jih dalje integrirali z zbranimi podatki iz pregleda literature. 3.1.4 Integracija spremenjeno izraženih genov analize RNA-seq s podatki iz pregleda literature Identificiranih 382 spremenjeno izraženih genov v endometriju receptivnega stanja med adenomiozno in kontrolno skupino analize RNA-seq smo integrirali z genskimi seti, ki smo jih oblikovali na podlagi podatkov iz literature. Uporabili smo tri genske sete, ki se povezujejo z endometrijsko receptivnostjo pri ženskah z adenomiozo (42 genov), ženskah z endometriozo (173 genov) in ženskah z zdravo maternico (151 genov). Integrirane genske sete smo obogatili v aplikacijah ClueGO/CluePedia v orodju Cytoscape in med pridobljenimi biološkimi potmi iskali tiste, kjer so anotirani geni izhajali iz vseh treh ginekoloških skupin (nespecifične poti). Takšne poti smo predlagali kot močnejše kandidatne biološke poti spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. 109 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Integracijo identificiranih 382 genov analize RNA-seq s podatki iz pregleda literature smo izvedli z dvema ločenima obogatitvenima analizama, kjer smo spreminjali set vključenih genov adenomiozne skupine. 3.1.4.1 Integracija 382 genov adenomiozne skupine s poročanimi geni, povezanimi z endometriozo in zdravo maternico Pri prvi obogatitveni analizi smo v set genov adenomiozne skupine vključili le 382 spremenjeno izraženih genov, ki smo jih identificirali z lastno analizo RNA-seq. Uporabili smo še seta 151 in 173 genov zdrave oz. endometriozne skupine. Po obogatitvi smo identificirali 40 bioloških poti, ki so bile urejene v 11 funkcionalnih skupin (Slika 9). Identificirali smo tri nespecifične funkcionalne skupine organizacija zunajceličnega matriksa (angl. extracellular matrix organization), celični odziv na dražljaje vaskulatornega endotelijskega rastnega dejavnika (angl. cellular response to vascular endothelial growth factor (VEGF) stimulus) in uravnavanje procesa reprodukcije (angl. regulation of reproductive process). Poti teh skupin predlagamo kot močnejše kandidate spremenjene endometrijske receptivnosti pri ženskah z adenomiozo. Predlaganim potem smo lahko tudi pripisali podporno literaturo. Preoblikovanje zunajceličnega matriksa je pomemben proces vgrezanja zarodka v deciduo (Okada in sod., 2014). Pri ženskah z adenomiozo (Li in sod., 2006; Herndon in sod., 2016) in ženskah z endometriozo (Di Carlo in sod., 2009; Pino in sod., 2009; Matsuzaki in sod., 2010) so že poročali o neravnovesju izražanja encimov, odgovornih za preoblikovanje zunajceličnega matriksa. Tudi angiogeni dejavniki (npr. VEGF) so pomembni mehanizmi vgnezdnja zarodka, saj omogočajo tvorbo novih krvnih žil (angiogeneza) in preoblikovanje ožilja endometrija za njegovo celično rast in diferenciacijo v deciduo (Okada in sod., 2014). Tudi pri identifikaciji močnejših kandidatnih genov patofiziologije adenomioze smo z obogatitvijo oblikovanih setov 78 in 518 genov P faze identificirali pot pozitivno uravnavanje angiogeneze. Veliko raziskav poroča o spremenjenem izražanju angiogenih dejavnikov (Goteri in sod., 2009; Kang in sod., 2009; Liu in sod., 2011; Wang J. in sod., 2016) in ožiljenju (Ota in Tanaka, 2003; Li in sod., 2006) endometrija pri adenomiozi. Pričakovano smo za adenomiozni set genov pridobili specifično funkcionalno skupino izražanje genov, induciranih z IFN. Opazili pa smo, da je bila znotraj te funkcionalne skupine tudi nespecifična pot signalizacija IFN, kjer so bili anotiranimi geni vseh treh uporabljenih ginekoloških skupin. 110 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Slika 9: Mreža funkcionalno urejenih obogatenih 40 bioloških poti, pridobljenih z integracijo 382 spremenjeno izraženih genov naše adenomiozne skupine z geni, ki smo jih pridobili s pregleda literature in se povezujejo z endometrijsko receptivnostjo pri endometriozi (173 genov) in zdravi maternici (151 genov). Z modro so označene funkcionalne skupine/poti z večino anotiranih genov adenomiozne skupine. Z roza so označene funkcionalne skupine/poti anotiranih genov endometriozne skupine. Z zeleno so označene poti anotiranih genov zdrave maternice. S sivo barvo so označene nespecifične poti z enakomernim deležem anotiranih genov vseh treh ginekoloških stanj. Figure 9: A network of functionally sorted enriched 40 biological pathways obtained by integrating 382 differentially expressed genes of our adenomyosis group with genes obtained from the literature mining that were associated with endometrial receptivity in endometriosis (173 genes) and healthy uterus (151 genes). Functional groups/pathways with the majority of annotated genes of the adenomyosis group are highlighted in blue. Functional groups/pathways of the annotated genes from the endometriosis group are highlighted in pink. Pathways annotated with genes of a healthy uterus are highlighted in green. Non-specific pathways with an equal proportion of annotated genes from all three gynaecological conditions are highlighted in grey. 3.1.4.2 Integracija 382 genov adenomiozne skupine s poročanimi geni, povezanimi z adenomiozo, endometriozo in zdravo maternico Pri drugi analizi pa smo adenomioznemu setu s 382 geni lastne analize RNA-seq dodali še 42 genov, ki smo jih pridobili s pregledom literature in se povezujejo s spremenjeno endometrijsko receptivnostjo pri adenomiozi (skupno 424 genov). Uporabili smo še seta 173 (endometrioza) in 151 (zdrava maternica) genov. Po obogatitvi smo identificirali 57 poti, ki 111 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 so bile urejene v 18 funkcionalnih skupin (Slika 10). Identificirali smo še tri dodatne nespecifične funkcionalne poti, ki so bile povezane s signalizacijo s citokini ( signalizacija IL4 in IL13, uravnavanje produkcije superdružine citokinov TNF (angl. regulation of TNF superfamily cytokine production) in signalizacija IL10). Slika 10: Mreža funkcionalno urejenih 57 obogatenih poti, pridobljenih z integracijo 382 spremenjeno izraženih genov naše adenomiozne skupine z oblikovanimi geni endometrijske receptivnosti pri adenomiozi (42 genov), endometriozi (173 genov) in zdravi maternici (151 genov). Z modro so označene funkcionalne skupine/poti z večino anotiranih genov adenomiozne skupine. Z roza so označene funkcionalne skupine/poti, anotiranih genov endometriozne skupine. Z zeleno so označene poti anotiranih genov zdrave maternice. S sivo barvo so označene nespecifične poti z enakomernim deležem anotiranih genov vseh treh ginekoloških stanj. Figure 10: Network of functionally sorted 57 enriched pathways obtained by integration of 382 differentially expressed genes of our adenomyosis group with developed gene sets associated with endometrial receptivity in adenomyosis (42 genes), endometriosis (173 genes), and healthy uterus (151 genes). Functional groups/pathways with the majority of annotated genes of the adenomyosis group are highlighted in blue. Functional groups/pathways annotated with genes from endometriosis group are highlighted in pink. Pathways annotated with genes from the healthy uterus group are highlighted in green. Grey indicates non-specific pathways with an equal proportion of annotated genes from all three gynaecological conditions. 112 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Na podlagi integracije lastnih rezultatov analize RNA-seq in podatkov iz literature smo prišli do zaključka, da se spremenjena endometrijska receptivnost pri ženskah z adenomiozo nakazuje na ravni signalizacije citokinov imunskega sistema. 3.1.5 Pomanjkljivosti raziskave 3.1.5.1 Nizko število uporabljenih vzorcev Transkriptomsko analizo podatkov potrjeno receptivnih vzorcev endometrija smo izvedli med 8 ženskami z adenomiozo in 5 ženskami kontrolne skupine. Nizko število uporabljenih vzorcev omejuje končne zaključke glede identificiranih 382 spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05), ker so bile razlike v izražanju genov statistično neznačilni po popravku vrednosti p ( FDR > 0,05). Po izračunih z modelom negativne binomske porazdelitve, ki so jih predlagali Li X. in sod. (2019), ocenjujemo, da bi za večjo statistično moč naših rezultatov potrebovali okoli 35 vzorcev biopsij endometrija. Zaradi dolgotrajnega nabiranja biopsij endometrija, ki je bilo omejeno samo na ovulatorne ženske, mlajše od 42 let, brez pridruženih ginekoloških patologij in na točno določen stadij fiziološkega razvoja endometrija znotraj menstruacijskega ciklusa, bi bilo potrebno v prihodnje izvesti multicentrično nabiranje vzorcev. Tako bi lahko zagotovili večjo statistično moč analize RNA-seq. 3.1.5.2 Posredna diagnoza adenomioze s TVUZ Diagnoza adenomioze pri preiskovankah naše raziskave je temeljila na pregledu rodil s TVUZ. Pri transkriptomskih raziskavah, ki so preučevale patofiziološke vidike endometrija pri adenomiozi, je zanesljiva diagnoza adenomioze lahko temeljila na histološkem pregledu vzorcev histerektomije (Herndon in sod., 2016; Jiang J.F. in sod., 2016; Xiang in sod., 2019). To pa ni mogoče pri ženskah, ki želijo ohraniti svojo reproduktivno sposobnost. V transkriptomskih raziskavah, orientiranih na plodnost pri ženskah z adenomiozo (Martinez-Conejero in sod., 2011) in na sopojavnost z endometriozo (Dior in sod., 2018), je bila možna le neinvazivna diagnoza z metodami slikanja (TVUZ ali MR). Ultrazvočna identifikacija adenomioze je zahtevna, saj še ni oblikovanih enotnih kriterijev za diagnozo (Chapron in sod., 2020). Kljub temu, pa so Andres in sod. (2018) v meta analizi 7 raziskav, ki so ocenjevale natančnost TVUZ pri diagnozi adenomioze po njeni potrditvi s histerektomijo, določili 83,8 % občutljivost in 63,9 % specifičnost metode TVUZ. Zaključili so, da je TVUZ ustrezna metoda za diagnozo adenomioze (Andres in sod., 2018). Da bi v naši raziskavi zmanjšali variabilnost ocenjevalca med opazovalci, je TVUZ maternice in medenične votline izvedel vedno isti ginekolog, ki je strokovnjak za ginekološki ultrazvok (stopnja 3 glede na evropsko zvezo društev za ultrazvok v medicini in biologiji (angl. European Federation of Societies for Ultrasound in Medicine and Biology)). 113 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3.1.5.3 Blaga adenomioza Pri sodelujočih preiskovankah smo zaznali prisotnost blage adenomioze. Rezultati RNA-seq bi lahko bili drugačni pri hudi obliki adenomioze. Pri kliničnem delu zdravljenja neplodnosti smo opazili malo žensk z napredno obliko adenomioze, ki bi izpolnjevale vključitvene kriterije (ovulatorni menstruacijski ciklus, brez sopojavnosti z endometriozo/miomov in mlajše od vključno 42 let). Rezultati RNA-seq bi lahko bili tudi drugačni, če bi kontrolno skupino sestavljale le potrjeno plodne ženske, saj velik delež preiskovank še nikoli ni bilo nosečih (primarna sterilnost). Koot in sod. (2016) so namreč poročali o molekularnih odstopanjih endometrija v stanju receptivnosti tudi pri ženskah brez patologij rodil. 3.1.5.4 Uporaba vzorcev celotnega tkiva endometrija Za izvedbo analiz qPCR in RNA-seq smo uporabili RNA, ki je bila izolirana iz vzorcev celotnega tkiva endometrija. Endometrij je heterogeno tkivo, sestavljeno iz neenakomernih deležev epitelijskih (površinskih in žleznih), stromalnih, vaskulatornih in imunskih celic. Suhorutshenko in sod. (2018) so z računalniškim pristopom razčlenjenja (dekonvolucija) transkriptoma celotnega tkiva endometrija pokazali, da je lahko spremenjeno izražanje posameznega celičnega tipa zamaskirano z odtisom izražanja ostalih celičnih tipov (Suhorutshenko in sod., 2018). Da bi pridobili natančnejši vpogled v molekularno ozadje posameznih endometrijskih celičnih tipov v stanju receptivnosti pri adenomiozi, bi lahko izvedli metodo scRNA-seq (Tang in sod., 2010). Po drugi strani pa so poročali o tehnično zahtevni izolaciji posameznih EEC, kar je vodilo v nizko raven pridobljenih transkriptomskih podatkov in slabo pokritost referenčnega genoma (Krjutškov in sod., 2016). V literaturi je malo opravljenih omskih raziskav na posameznih celicah endometrija. Identificiranih spremenjeno izraženih genov naše analize RNA-seq ne bi mogli integrirati s podatki iz literature, ki v večini temeljijo na analizah celotnega tkiva endometrija. 3.1.5.5 Heterogenost omskih raziskav, iz katerih smo pridobivali podatke Podatki o transkriptih RNA in proteinih spremenjenega endometrijskega izražanja pri endometriozi, ki smo jih uporabili za izdelavo kataloga, so izhajali iz heterogenih omskih raziskav. Skupno 21 raziskav se je razlikovalo po vključitvenih / izključitvenih kriterijih preiskovane in kontrolne skupine, izvedbi vzorčenja endometrija, metodi datiranja faze menstruacijskega ciklusa, protokolih shranjevanja vzorcev in izolaciji molekul, uporabljenih platformah za globalno analizo, bioinformacijskih analizah in podajanju končnih rezultatov. Posledično je med raziskavami slabo prekrivanje identificiranih spremenjeno izraženih lokusov, povezanih z endometriozno skupino. Pri raziskavi, ki so jo opravili Tamaresis in sod. (2014) smo zasledili tudi vključitev manjšega števila vzorcev endometrija žensk z adenomiozo (4 od skupno 144) v endometriozno in kontrolno skupino. Prisotnost dodatnih patologij pa bi lahko vplivalo na podpis transkriptoma endometrija (Hever in sod., 2006) Tudi 114 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Altmäe in sod. (2017) so v meta analizi devetih transkriptomskih raziskav poročali o slabem prekrivanju identificiranih genov, povezanih z endometrijsko receptivnostjo kot posledica heterogenih zasnov raziskav. 3.1.5.6 Možna potrditvena pristranskost lokusov, pridobljenih iz literature Gene, ki smo jih uporabili za izdelavo kataloga pri endometriozi oz. za identifikacijo močnejših kandidatov patofiziologije adenomioze, smo pridobili iz omskih raziskav, kjer pa njihovo spremenjeno izražanje večinoma ni bilo potrjeno z dodatnimi kvantifikacijskimi metodami (qPCR, prenos po western ali imunohistokemija). Vključevanje takšnih genov v sintezo podatkov pa bi lahko vplivalo na rezultate obogatitvenih analiz. Če v izvorni raziskavi niso potrdili spremenjenega izražanja izbranih lokusov z dodatnimi analizami, potem teh lokusov nismo upoštevali pri obogatitvenih analizah. 3.1.5.7 Poenotenje poimenovanja pridobljenih mRNA, ncRNA in proteinov Poimenovanje transkriptov RNA in proteinov, ki smo jih pridobili s pregledom literature, smo poenotili po genski nomenklaturi zbirke HGNC (HUGO, 2019), da smo lahko izvajali bioinformacijske analize. Popolne povezave med transkriptomom in proteomom ni, saj se raven izražanja genov uravnava tudi s potranskripcijskimi mehanizmi. Npr. vezava molekul miRNA na ciljno mRNA vodi v njeno razgradnjo ali ovirano nadaljnjo translacijo (Bartel, 2004). Prekurzorski transkript mRNA je lahko podvržen alternativnim oblikam izrezovanja intronov in spajanja eksonov (Wang Y. in sod., 2015b) ter potranslacijskim preoblikovanjem (Walsh in sod., 2005), kar lahko vodi v več različnih izooblik proteinov. 3.1.6 Doprinos raziskave 3.1.6.1 Genski seti, povezani s spremenjenim endometrijskem izražanjem S podatki iz pregleda literature smo razvili najobsežnejše genske sete, povezane s spremenjenim endometrijskem izražanjem pri ženskah z adenomiozo in ženskah z endometriozo. Po poenotenju heterogenega poimenovanja genetskih lokusov med objavljenimi raziskavami smo identificirali nekaj prekrivajočih se genov/obogatenih bioloških poti. Le-ti bi lahko predstavljali močnejše kandidate za endometrijske molekularne označevalce adenomioze oz. endometrioze. Poenotenje poimenovanja genetskih lokusov, ki smo ga izvedli v tej doktorski disertaciji, bo tudi olajšalo izmenjavo podatkov in informacij med raziskovalci. S pregledom znanstvene literature in poenotenjem nomenklature genetskih lokusov smo pridobili 42 in 173 genov spremenjenega endometrijska izražanja v pričakovanem stanju receptivnosti pri ženskah z adenomiozo oz. ženskah z endometriozo. Dodatno smo s 115 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 poenotenjem poimenovanja večravninskih omskih raziskav lahko izdelali katalog 591 genov, s katerimi je mogoče preučevati vpliv endometrioze na celoten menstruacijski ciklus endometrija in iskati korelacije z vplivom adenomioze na molekularno organizacijo endometrija. Izdelan katalog z urejenimi geni glede na datirano fazo menstruacijskega ciklusa omogoča nadaljnje zbiranje podatkov. Ponovitve obogatitvenih analiz z dodatnimi poznavanji genskih interakcij, ki se zbirajo v bioloških zbirkah, pa bodo omogočile identifikacijo bolj specifičnih bioloških poti. Po poenotenju nomenklature genetskih lokusov smo izvedli sintezo genov, povezanih s spremenjenim endometrijskim izražanjem v P in SS fazi pri adenomiozi, da smo lahko izvedli obogatitvene analize za identifikacijo močnejših kandidatov patofiziologije oz. spremenjene receptivnosti pri tej bolezni. V podatkovni zbirki DisGeNET (DisGeNET, 2021) smo sicer našli gene, povezane z adenomiozo, vendar iz zbirke ni bilo možno razbrati, ali se posamezen gen navezuje na izražanje v evtopičnem (EvEA) ali ektopičnem (EkEA) endometriju pri adenomiozi. V tej doktorski disertaciji nas je zanimal pomen spremenjeno izraženih genov le EvEA, saj predstavlja ciljno tkivo za vgnezditev zarodka. Identifikacija in poznavanje vloge posameznih genov EvEA bi lahko vodilo v izdelavo specifičnih molekularnih testov, ki bi ali olajšali zgodnjo neinvazivno diagnozo adenomioze ali omogočili diagnostiko endometrija kot možen vzrok neplodnosti pri takšnih bolnicah. 3.1.6.2 Izvedba analize RNA-seq Analizo RNA-seq smo izvedli z vzorci endometrija brez sopojavnosti dodatnih patologij rodil tako v adenomiozni kot tudi v kontrolni skupini. Z dodatnim TVUZ pregledom rodil, ki je bil izveden tik pred vzorčenjem biopsije endometrija, smo lahko preverili morebitno sopojavnost dodatnih ginekoloških patologij pri preiskovankah. Z ultrazvočnim pregledom so bile pri eni od preiskovank adenomiozne in kontrolne skupine ugotovljene prisotnosti manjših miomov, pri eni od preiskovank kontrolne skupine pa obojestransko vnetje jajcevodov. Vzorce endometrija teh žensk smo vseeno uporabili za kvantifikacijo izbranih šestih kandidatnih genov s qPCR, saj ni bilo večjih odstopanj v izražanju z ali brez upoštevanja teh vzorcev. V analizo RNA-seq transkriptoma pa smo vključili samo tiste vzorce endometrija, kjer razen znakov adenomioze ugotovljenih drugih ultrazvočnih odstopanj rodil (v kontrolno skupino smo vključevali ženske, ki so se zdravile s postopki OBMP zaradi moškega ali tubarnega dejavnika neplodnosti). Na tak način smo preprečili podpis drugih patologij na transkriptom endometrija. V bioinformacijskih raziskavah (Prašnikar in sod., 2020a, 2020b), ki smo ju opravili s podatki iz objavljenih znanstvenih člankov, smo opazili, da so bile tako v preiskovano (endometrioza in adenomioza) kot tudi v pripadajočo kontrolno skupino pogosto vključene tudi ženske s pridruženimi patologijami maternice. 116 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 3.1.6.3 Natančno datiranje receptivne faze Vzorcem endometrija smo natančno datirali receptivno fazo menstruacijskega ciklusa. Smo prvi, ki smo vzorce izolirane endometrijske RNA uporabili tako za RNA-seq transkriptoma, kot tudi za natančno datiranje personaliziranega stanja receptivne faze z molekularnim orodjem beREADY®. Z datiranjem smo zagotovili homogenost preiskovanih skupin v povezavi z zagotavljanjem enakega fiziološkega stadija razvoja (receptivna faza) endometrija tekom menstruacijskega ciklusa. S primerjavo podatkov RNA-seq potrjeno receptivnih vzorcev smo preprečili vpliv vzorcev zgodnje receptivne faze (ZS faza) ali pozno receptivne faze (PS faza) na podpis transkriptoma endometrija v stanju receptivnosti (SS faza). Le z upoštevanjem rezultatov datiranja endometrija pri analizi RNA-seq smo med adenomiozno in kontrolno skupino identificirali spremenjeno izražene gene, ki so bili obogateni v biološke poti, povezane z odzivom na delovanje IFN. V podobnih omskih raziskavah je bilo datiranje endometrija opravljeno z urinskimi LH testi ali s histološkim pregledom biopsije, kar se povezuje s slabo natančnostjo v primerjavi z molekularnimi testi (Coutifaris in sod., 2004; Díaz-Gimeno in sod., 2013). 3.1.6.4 Javno dostopni eksperimentalni podatki RNA-seq Surovi podatki RNA-seq so, skupaj s podatki natančnega datiranja vsakega vzorca, javno dostopni v bazi Gene Expression Omnibus (GEO) pod številko GSE185392. Naši podatki so s tem dostopni tudi drugim raziskovalcem. Vsaka vzorčena biopsija je bila nemudoma potopljena v raztopino RNAlater, s čimer smo dosegli visoko stopnjo ohranjenosti izolirane RNA (številka integritete RNA (angl. RNA integrity number, RIN > 8,5) in nadaljnjo dobro pokritost referenčnega genoma hg19 (> 97,5 %) z odčitki RNA-seq. Z dodatnim datiranjem endometrija pa smo zagotovili transkriptomske podatke potrjeno receptivnih vzorcev endometrija, ki bodo uporabni tudi v prihodnjih integracijskih analizah. 3.1.7 Preverjanje hipotez Hipoteza 1: Vzorca izražanja genov endometrija v stanju receptivnosti se razlikujeta med skupinama preiskovank z adenomiozo in preiskovank brez adenomioze. Zavrnili smo hipotezo 1. To hipotezo smo preverjali z metodama RNA-seq in qPCR. Z metodo RNA-seq smo primerjali endometrijske vzorce med skupinama 10 žensk z adenomiozo in 10 žensk brez adenomioze. Glede na rezultate datiranja receptivne faze smo mejno receptivne vzorce izključili iz seta transkriptomskih podatkov in analizo ponovili na podskupini samo receptivnih vzorcev med 8 ženskami z adenomiozo in 5 ženskami brez adenomioze. Pri prvi primerjavi smo zaznali 909, pri drugi pa 382 statistično značilno spremenjeno izraženih genov med skupinama ( p < 0,05). Hipotezo smo zavrnili, ker je bila pri obeh primerjavah razlika v izražanju genov po popravku za testiranje vrednosti p neznačilna (FDR > 0,05). Z metodo 117 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 qPCR smo primerjali stopnjo izražanja šestih prioritiziranih kandidatnih genov LIF, IL10, IL6, JUNB, FOS in SOCS3 v endometriju med 9 ženskami z in 13 ženskami brez adenomioze. Znižano izražanje izbranih genov med adenomiozno in kontrolno skupino ni bilo statistično značilno, zato smo hipotezo 1 ponovno zavrnili. Hipoteza 2: Izražanje genov z domnevno vlogo sodelovanja pri vzpostavitvi receptivnega stanja in genov, povezanih s patofiziologijo adenomioze, je spremenjeno pri preiskovankah z adenomiozo. Hipotezo 2 smo delno potrdili. Hipotezo smo preverjali z bioinformacijskim orodjem DAVID, s katerim smo izvedli obogatitvene analize bioloških poti s štirimi seti genov. Sete smo oblikovali z združevanjem podatkov o genih, ncRNA in proteinih, ki se v znanstveni literaturi povezujejo s spremenjenim endometrijskim izražanjem med ženskami z in brez adenomioze. Za preverjanje prvega dela hipoteze o vplivu adenomioze na endometrijsko receptivnost smo sestavili dva seta genov:  60 genov iz zbirke GO, anotiranih v biološko pot vgnezdenje zarodka in/ali decidualizacija. Z obogatitvijo seta smo pridobili biološke poti normalnega procesa endometrijske receptivnosti;  42 genov, ki se v dosedanji literaturi (n = 7) povezujejo o spremenjenim endometrijskim izražanjem v pričakovanem času receptivne faze (SS faza) med ženskami z in brez adenomioze. Na podlagi rezultatov obogatitvene analize smo iz tega seta identificirali močnejše kandidate spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomizi. Za preverjanje drugega dela hipoteze o sodelovanju endometrija pri patofiziologiji adenomioze pa smo sestavili naslednja dva seta genov:  78 genov, pridobljenih iz dosedanjih raziskav kandidatnih lokusov (n = 47), v katerih so poročali o spremenjenem izražanju endometrija v P fazi med ženskami z in brez adenomioze. Vključili smo samo raziskave endometrija P faze, saj se v S fazi zaradi delovanja hormona P4 pojavi okno vgnezdenja z značilnim transkriptomskim podpisom. Razlika v izražanju v P fazi med adenomiozno in kontrolno skupino bi lahko bila zaradi patofiziologije bolezni. Z obogatenjem seta smo pridobili kandidatne poti patofiziologije evtopičnega endometrija pri adenomiozi (EvEA).  518 genov, pridobljenih iz transkriptomskih raziskav (n = 3) endometrija P faze med ženskami z in brez adenomioze. Na podlagi rezultatov obogatitve smo iz tega seta identificirali 52 močnejših kandidatov patofiziologije adenomioze. Iz seta 42 genov je bilo 10 genov anotiranih v tri biološke poti ( negativna regulacija celične proliferacije, organizacija zunajceličnega matriksa in decidualizacija), ki so bile obogatene tudi s setom 60 genov zbirke GO. Tako smo za teh 10 genov potrdili vlogo sodelovanja v procesih endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. 118 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Iz seta 518 genov je bilo 52 genov anotiranih v tri biološke poti ( pozitivno uravnavanje angiogeneze, negativno uravnavanje apoptoznih procesov in vnetni odziv), ki so bile obogatene tudi s setom 78 genov. Kljub temu pa te poti niso kazale na neposredne mehanizme, ki se povezujejo z razvojem adenomioze (zvišana invazivnost, izguba celične polarnosti, zvišana motilnost in mehanizmi poškodb oz. celjenje). Hipotezo 2 smo tako le delno potrdili. 3.2 SKLEPI V doktorski disertaciji smo preverjali dve delovni hipotezi: 1. Vzorca izražanja genov endometrija v stanju receptivnosti se razlikujeta med skupinama preiskovank z adenomiozo in preiskovank brez adenomioze; 2. Izražanje genov z domnevno vlogo sodelovanja pri vzpostavitvi receptivnega stanja in genov povezanih s patofiziologijo adenomioze je spremenjeno pri preiskovankah z adenomiozo. Za potrjevanje hipoteze 1 smo na vzorcih endometrija v pričakovanem stanju receptivnosti pri ženskah z in brez ultrazvočnih znakov adenomioze izvedli kvantifikacijo izbranih kandidatnih genov z metodo qPCR in sekvenciranje transkriptoma z metodo RNA-seq. Za potrjevanje hipoteze 2 pa smo izvedli obogatitvene analize zbranih genov s pregleda literature, povezane s spremenjenim endometrijskim izražanjem pri adenomiozi, da bi identificirali močnejše kandidate patofiziologije endometrija oz. spremenjene endometrijske receptivnosti za vezavo zarodka pri tej bolezni. Rezultati doktorske naloge glede potrjevanja hipoteze 1 so:  Z RNA-seq sekvenciranjem transkriptoma (mRNA in lncRNA) endometrija pri 10 ženskah z in 10 brez adenomioze smo identificirali 909 spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05; FDR > 0,05), ki so bili obogateni v štirih bioloških poteh (Bonferroni p < 0,05), vključno v poti znotrajceličnega transporta lipidov.  Kljub vzorčenju biopsij endometrija med dnevi LH+7–LH+9 je bilo z dodatnim testiranjem personalizirane endometrijske receptivnosti 13 od skupno 20 vzorcev datiranih v receptivno, dva v zgodnje receptivno in 5 v pozno receptivno fazo menstruacijskega ciklusa.  S ponovno analizo podatkov RNA-seq samo potrjeno receptivnih vzorcev adenomiozne (n = 8) in kontrolne (n = 5) skupine smo identificirali 382 spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05; FDR > 0,05), ki so bili obogateni v 33 bioloških poti (Bonferroni p < 0,05).  Izmed 33 obogatenih poti se jih je kar 19 navezovalo na procese odziva na signalizacijo IFN. Zaznali smo tudi obogateno pot, povezano s celično adhezijo. 119 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022  Za poti, povezane z odzivom na IFN, smo našli podporno literaturo tako v povezavi s procesi vgnezdenja zarodka, kot tudi s patofiziologijo adenomioze.  Na koekspresijski mreži mRNA-lncRNA smo pokazali, da transkripta lncRNA DRAIC in CADM3-AS1, ki izhajata iz seta 382 spremenjeno izraženih genov analize RNA-seq, predstavljata pomembni vozlišči negativne korelacije z izražanjem ciljnih transkriptov, ki so bili obogateni v poteh, povezanih s celično adhezijo.  Na podlagi rezultatov obogatitvenih analiz in podporne literature sklepamo, da set 382 genov bolj reprezentativno predstavlja podpis adenomioze na transkriptom endometrija v stanju receptivnosti, kot pa sprva zaznanih 909 genov. Rezultate bi bilo potrebno preveriti na večjem številu vzorcev.  Hipotezo 1 smo zavrnili zaradi neznačilnega izražanja po popravku vrednosti p (test FDR) tako 909 kot tudi 382 spremenjeno izraženih genov med adenomiozno in kontrolno skupino žensk. Rezultati doktorske naloge glede potrjevanja hipoteze 2 so:  S poenotenjem poimenovanja transkriptov RNA in proteinov smo iz 47 raziskav kandidatnih lokusov in treh transkriptomskih raziskav pridobili 78 oz. 518 genov, povezanih s spremenjenim izražanjem v proliferacijskem endometriju pri adenomiozi.  Na podlagi obogatitvenih analiz smo identificirali 10 močnejših kandidatnih genov spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi (vključno LIF, STAT3, IL10, CDH5, SSP1, ITGB3 in MMP20) in 52 močnejših kandidatov patofiziologije endometrija pri adenomiozi (vključno ANXA1, BCL6, CXCL2, DUSP1, EPHA2, NFKB1A, PTGS1, S100A9, SOCS3 in VEGFA).  Hipotezo 2 smo le delno potrdili, ker obogatene poti v povezavi s patofiziologijo, niso kazale na neposredne patološke mehanizme endometrija, ki se povezujejo z razvojem te bolezni (npr. izguba celične polarnosti, povišana agresivnost in celična migracija). Poleg potrjevanja hipotez smo v tej doktorski disertaciji izvedli tudi analizo omskih raziskav, v katerih so poročali o genetskih vzrokih spremenjenega izražanja v endometriju žensk s sorodno, a bolje raziskano endometriozo. Geni, povezani z endometrijsko receptivnostjo pri endometriozi in zdravi maternici so nam omogočili boljše razumevanje biološkega pomena spremenjeno izraženih genov adenomiozne skupine, ki smo jih identificirali z izvedeno analizo RNA-seq. Dodatni rezultati so:  Z združevanjem podatkov iz 21 omskih raziskav, ki so poročale o spremenjeno izraženih transkriptih in proteinih v endometriju med ženskami z in brez endometrioze, in poenotenjem genske nomenklature smo izdelali katalog s 591 geni, ki smo jih razvrstili glede na datirano fazo menstruacijskega ciklusa. 120 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022  Z obogatitveno analizo endometrioznih genskih setov, povezanih s fazami menstruacijskega ciklusa, smo identificirali poti, povezane s signalizacijo estrogenov, organizacijo zunajceličnega matriksa in celično adhezijo. Natančneje, 173 genov SS faze (pričakovani čas endometrijske receptivnosti) je bilo obogatenih v poteh, povezanih s produkcijo citokinov, vnetnim odzivom, kemotakso endotelijskih in imunskih celic ter z regulacijo apoptoze.  Z obogatitvenimi analizami zbranih genov s pregleda literature, ki se povezuje z endometrijsko receptivnostjo pri ženskah z adenomiozo (42 genov), ženskah z endometriozo (173 genov) in zdravih ženskah (151 genov), smo identificirali močnejše kandidatne poti signalizacije z IL.  Izbranim šestim genom IL6, IL10, LIF, SOCS3, FOS in JUNB, ki so bili anotirani v poti signalizacije z IL, smo preverili stopnjo izražanja na vzorcih endometrija pri ženskah z in brez adenomioze. Ugotovili smo nižjo stopnjo izražanja preiskovanih genov pri adenomiozni skupini, a je bila razlika neznačilna.  V obliki mreže funkcionalno urejenih obogatenih poti smo integrirali set 382 spremenjeno izraženih genov adenomiozne skupine izvedene analize RNA-seq s seti 42, 173 in 151 genov endometrijske receptivnosti adenomioze, endometrioze oz. zdrave maternice. Identificirali smo poti organizacija zunajceličnega matriksa, celični odziv na stimule z VEGF, signalizacija z IFN, signalizacija z IL in uravnavanje reproduktivnih procesov z anotiranimi geni vseh uporabljenih setov. Te poti predstavljajo dodatne močnejše kandidate spremenjenih procesov receptivnosti pri adenomiozi.  Z rezultati obogatitvenih analiz podatkov iz pregleda literature in izvedene analize RNA-seq smo pokazali na korelacije spremenjenih molekularnih procesov (produkcija citokinov, celična adhezija, organizacija zunajceličnega matriksa in ožiljenje) receptivnosti endometrija med endometriozo in adenomiozo. Na podlagi analiz dosedanjih poročanih podatkov o molekularnem ozadju endometrijske receptivnosti in lastnih rezultatov RNA-seq sklepamo, da je endometrijska receptivnost pri ženskah z adenomiozo spremenjena na ravni signalizacije s citokini imunskega sistema. Poznavanje vloge posameznih genov v endometriju pri adenomiozi bi v prihodnje lahko vodilo v identifikacijo endometrijskih molekularnih označevalcev. Le-ti bi omogočili bodisi lažjo neinvazivno diagnozo adenomioze ali natančnejšo diagnostiko endometrijske receptivnosti za zarodek pri ženskah z adenomiozo maternice, ki se zdravijo za neplodnostjo. 121 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 4 POVZETEK (SUMMARY) 4.1 POVZETEK Adenomiozo maternice označuje prisotnost endometriju podobnega tkiva znotraj miometrija (Van den Bosch in sod., 2015). Molekularne spremembe endometrija pri tej bolezni se povezujejo tako s patofiziologijo, ki vodijo v razvoj in/ali napredovanje adenomioze (Vannuccini in sod., 2017), kot tudi z njegovo ovirano receptivnostjo za vgnezdenje zarodka (Campo in sod., 2012). Adenomiozo so povezali z nižjo stopnjo zanositve (Salim in sod., 2012; Thalluri in Tremellen, 2012; Puente in sod., 2016; Sharma in sod., 2019). Molekularni dejavniki domnevno ovirane endometrijske receptivnosti so slabo poznani zaradi tehnoloških omejitev metode TVUZ pri neinvazivni diagnozi adenomioze v preteklosti (Campo in sod., 2012). V literaturi smo našli le šest raziskav kandidatnih lokusov (Xiao in sod., 2010, 2013; Fischer in sod., 2011; Yen in sod., 2016; Wang in sod., 2018; Yan in sod., 2019) in eno transkriptomsko (Martinez-Conejero in sod., 2011) analizo endometrija v pričakovanem stanju receptivnosti pri ženskah z adenomiozo maternice v njihovem rodnem obdobju. Zato smo v tej doktorski disertaciji uporabili pristope sistemske biologije, kjer smo na podlagi podatkov iz pregleda literature in izvedene analize RNA-seq prikazali vpliv adenomioze na molekularno organizacijo endometrijske receptivnosti. S primerjavo podatkov RNA-seq potrjeno receptivnih vzorcev endometrija med ženskami z (n = 8) in brez (n = 5) adenomioze smo najprej identificirali 382 spremenjeno izraženih genov, ki so bili obogateni v poteh, povezanih z mehanizmi odziva na IFN. Set 382 genov smo dalje integrirali s podatki iz pregleda literature, ki so se navezovali na molekularno ozadje endometrija v stanju receptivnosti pri ženskah z adenomiozo (42 genov), ženskah s sorodno, a bolje raziskano endometriozo (173 genov) in ženskah z zdravo maternico (151 genov). Z zbranimi seti genov smo izvedli obogatitveno analizo bioloških poti in iskali poti z anotiranimi geni vseh uporabljenih setov. Na tak način smo identificirali poti organizacija zunajceličnega matriksa, celični odziv na dražljaje VEGF, uravnavanje procesa reprodukcije, signalizacija z IL in regulacija produkcije superdružine citokinov TNF, ki jih predlagamo kot dodatne kandidatne poti spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi (Prašnikar in sod., 2022). Skupno smo za sekvenciranje transkriptoma (mRNA in lncRNA) endometrija uporabili 20 vzorcev (10 v adenomiozni in 10 v kontrolni skupini). Z analizo vseh 20 vzorcev smo identificirali 909 spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05), ki so bili obogateni le v štirih poteh ( p < 0,05). Zaradi njihove splošne narave (npr. pot znotrajcelični transport lipidov) jim nismo mogli pripisati podporne literature v povezavi z vgnezdenjem zarodka ali s patofiziologijo adenomioze. Takšni rezultati bi lahko bili posledica različne fiziološke zrelosti uporabljenih vzorcev endometrija, kljub temu, da je bila vsaka biopsija pridobljena med dnevi LH+7 in LH+9 (pričakovani čas endometrijske receptivnosti). Ker poročajo o personaliziranem pojavu in trajanju receptivne faze v menstruacijskem ciklusu (Ruiz-Alonso in sod., 2013; Mahajan in sod., 2018; Tan in sod., 2018) ter o zamaskiranem podpisu patologije na transkriptom 122 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 endometrija pri primerjavi vzorcev različnih faz ciklusa (Devesa-Peiro in sod., 2021), smo vse vzorce dodatno datirali. To smo izvedli s pomočjo novega molekularnega orodja, ki na podlagi vzorca izražanja izbranih 57 genov endometrijske receptivnosti določi personalizirano stanje receptivne faze (Saare in sod., 2019). Z rezultati testiranja smo 20 vzorcev datirali v tri skupine: v zgodnjo receptivno fazo (n = 2); receptivno fazo (n = 13); in pozno receptivno fazo (n = 5). S ponovno analizo transkriptomskih podatkov samo potrjeno receptivnih vzorcev endometrija adenomiozne (n = 8) in kontrolne (n = 5) skupine smo identificirali že omenjenih 382 spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05). Ti geni so bili obogateni v 33 poteh ( p < 0,05), od tega je bilo 19 povezanih z mehanizmi odziva na signalizacijo IFN. V povezavi z vgnezdenjem zarodka se vloga IFN povezuje z aktivacijo celic uNK, ki nadzorujejo globino vgnezdenja trofoblasta v deciduo in omogočajo preoblikovanje spiralnih arterij za dotok krvi zarodku (Austin in sod., 2003; Wilczyński, 2005; Hannan in sod., 2011). V povezavi s patofiziologijo adenomioze pa se izmerjene prekomerne vrednosti IFN endometrija povezujejo z lokalno povišano vrednostjo vnetnih citokinov v maternici, ki vodijo v razvoj lezij (Sotnikova in sod., 2002). Zaključimo lahko, da smo z RNA-seq transkriptoma in natančnim datiranjem vzorcev endometrija identificirali poti odziva na delovanje IFN, ki predstavljajo najbolj obetavne kandidate za nadaljnje raziskave endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Z obogatitvijo identificiranih 382 genov analize RNA-seq smo pridobili tudi pot, povezano s celično adhezijo, kjer so bili, tako kot v poteh IFN, v večini anotirani geni zmanjšanega izražanja pri adenomiozni v primerjavi s kontrolno skupino. To bi lahko kazalo na zmanjšano receptivnost endometrija za vezavo zarodka. Rezultat je v skladu z literaturo, saj zadostna kapaciteta adhezije endometrija omogoča pritrditev blastociste na njegov epitelij (Achache in Revel, 2006). Obogatene poti, povezane s celično adhezijo, smo zaznali tudi pri analizi genov koekspresijske mreže, ki smo jo izdelali med 23 spremenjeno izraženimi lncRNA seta 382 genov in celokupnim transkriptomom. Identificirali smo namreč transkripta lncRNA DRAIC in CADM3-AS1, ki sta imela pretežno negativno korelacijo z izražanjem njunih ciljnih transkriptov, ki so bili obogateni v poteh, povezanih s celično adhezijo. Poročali so že o vplivu lncRNA na stopnjo izražanja genov, ki v endometriju kodirajo proteine adhezije (Fan in sod., 2017; Li D. in sod., 2019). Ti dve lncRNA predstavljata kandidatna dejavnika epigenetskega vpliva adenomioze na izražanje genov, povezanih z endometrijsko receptivnostjo. Naše končne zaključke glede spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05) analize RNA-seq omejuje njihovo neznačilno izražanje po popravku vrednosti p (FDR > 0,05). Nizka statistična moč analize bi lahko bila posledica nizkega števila uporabljenih vzorcev. Pridobivanje biopsij endometrija je dolgotrajen proces, zato bi bilo potrebno v prihodnje izvesti multicentrično nabiranje vzorcev za dodatne analize RNA-seq. 123 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Za izvedbo bioinformacijskih analiz podatkov o genetskih vzrokih (transkripti mRNA in ncRNA ter proteini spremenjenega endometrijskega izražanja), ki smo jih pridobili iz objavljenih raziskav, smo najprej poenotili njihovo heterogeno poimenovanje po genski nomenklaturi zbirke HGNC (HUGO, 2019). Nato smo lahko glede na poročano datirano fazo menstruacijskega ciklusa izvorne raziskave združevali gene in jih obogatili, da bi razumeli njihov biološki pomen. Na tak način smo zbrali znanje o vplivu endometrioze na molekularno organizacijo endometrija tekom menstruacijskega ciklusa (Prašnikar in sod., 2020a) in predlagali močnejše kandidatne gene patofiziologije (P faza) in spremenjene endometrijske receptivnosti (SS faza) pri adenomiozi. Zaradi slabo raziskanega vpliva adenomioze na endometrijsko receptivnost smo pri sorodni, a bolje raziskani endometriozi (Del Frate in sod., 2006) nabirali znanje o molekularnih odstopanjih endometrija ob prisotni patologiji (Prašnikar in sod., 2020a). Iz 21 raziskav različnih omskih ravni smo združili spremenjeno izražene endometrijske lokuse ter po poenotenju nomenklature pridobili 591 genov, ki smo jih razvrstili glede na datirano fazo ciklusa. Z obogatitvijo 173 genov SS faze smo med drugimi identificirali poti, povezane s produkcijo citokinov, vnetnim odzivom in kemotakso endotelijskih in imunskih celic. Tudi IFN, čigar poti odziva na njihovo delovanje smo zaznali z obogatitvijo genov izvedene analize RNA-seq, spadajo med citokine imunskega sistema. S tem smo pokazali na možne korelacije v spremenjenih procesih endometrijske receptivnosti med adenomiozo in endometriozo. Dodatno smo z obogatitvenima analizama samo pridobljenih podatkov iz pregleda literature, tj. genov, povezanih z endometrijsko receptivnostjo pri adenomiozi (42 genov), endometriozi (173 genov) in zdravi maternici (151 genov), identificirali poti, povezane z delovanjem citokinov imunskega sistema ( signalizacija z IL in signalizacija z IL4 in IL13) . Izbranim šestim genom ( JUNB, FOS, SOCS3, IL6, IL10 in LIF), ki so bili anotirani v te dve poti, smo tudi preverili stopnjo izražanja na vzorcih endometrija ženskam z (n = 9) in brez (n = 13) adenomioze. Zaznali smo zmanjšano izražanje preiskovanih genov pri adenomiozni skupini, a je bila razlika statistično neznačilna. Raziskavo bi bilo potrebno ponoviti na večjem številu vzorcev (Prašnikar in sod., 2020b). Za identifikacijo 52 močnejših kandidatnih genov (vključno ANXA1, BCL6, CXCL2, DUSP1, EPHA2, NFKB1A, PTGS1, S100A9, SOCS3 in VEGFA) patofiziologije endometrija pri adenomioze smo združevali podatke 50 raziskav, opravljenih v P fazi. V tej fazi namreč ni delovanja hormona P4 in z receptivnostjo povezanih genov, zato razlike v endometrijskim izražanju med preiskovano in kontrolno skupino verjetneje kažejo na patofiziološke spremembe (Makieva in sod., 2018). Za identifikacijo 10 močnejših kandidatnih genov ( IL10, SST, STAT3, LIF, CHD5, CDKN3, COL8A1, COL11A1, ITGB3 in SPP1) spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi pa smo združevali podatke sedmih raziskav endometrija SS faze. Poznavanje vloge posameznih genov pri adenomiozi bi lahko vodilo v identifikacijo endometrijskih molekularnih označevalcev te bolezni. Specifičen molekularni test bi lahko pripomogel k zanesljivejši diagnozi zgodnje adenomioze, ki je trenutno omejena le na visoko občutljive, vendar subjektivne metode slikanja (Hershko-Klement in Tepper, 124 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 2016). Medtem bi s specifičnim molekularnim testom za diagnostiko endometrijske receptivnosti pri adenomiozi lahko preverili, ali je endometrij dejavnik neplodnosti pri neplodnih ženskah z adenomiozo. Poznavanje patoloških procesov endometrijske receptivnosti bi lahko vodilo v razvoj novih terapevtskih pristopov priprave endometrija pred prenosom zarodka v postopkih OBMP. 4.2 SUMMARY Uterine adenomyosis is characterized by the presence of endometrium-like tissue within the myometrium (Van den Bosch et al., 2015). Molecular alterations of the endometrium in this disease are associated both with the pathophysiology leading to the development and/or progression of adenomyosis (Vannuccini et al., 2017), as well as with its impaired receptivity for embryo implantation (Campo et al., 2012). Adenomyosis has been associated with lower pregnancy rate (Salim et al., 2012; Thalluri and Tremellen, 2012; Puente et al., 2016; Sharma et al., 2019). The molecular aspects of presumed impaired endometrial receptivity are poorly understood due to the technological limitations of the TVUS method in the non-invasive diagnosis of adenomyosis in the past (Campo et al., 2012). From the literature survey we obtained only six candidate locus studies (Xiao et al., 2010, 2013; Fischer et al., 2011; Yen et al., 2016; Wang et al., 2018; Yan et al., 2019) and one transcriptomic study (Martinez-Conejero et al., 2011) where endometrium of expected receptivity was analysed in women with uterine adenomyosis in their reproductive age. Therefore, in this doctoral dissertation, we have applied systems biology approaches to demonstrate the impact of adenomyosis on the molecular organization of endometrial receptivity based on data from a literature review and RNA-seq analysis performed. First, we compared RNA-seq data of confirmed receptive endometrial samples between women with (n = 8) and without (n = 5) adenomyosis and identified 382 differentially expressed genes that were enriched in pathways related to IFN response mechanisms. The set of 382 genes was further integrated with data from a literature mining associated with the molecular background of the endometrial receptive state in women with adenomyosis (42 genes), women with a related but better-studied endometriosis (173 genes) and women with a healthy uterus (151 genes). We performed a biological pathway enrichment analysis with developed gene sets and searched for pathways annotated with genes from all the sets used. In this way, we identified pathways extracellular matrix organization, cellular response to VEGF stimulus, regulation of reproductive process, signalling by IL and regulation of TNF superfamily cytokine production, which we proposed as additional candidate pathways of altered endometrial receptivity in adenomyosis (Prašnikar et al., 2022). In total, we used 20 endometrial samples (10 in the adenomyosis and 10 in the control group) for transcriptome (mRNA and lncRNA) sequencing. Analysis of all 20 identified 909 differentially expressed genes ( p < 0.05) further enriched in only four pathways ( p < 0.05). 125 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Due to their general nature (e.g. intracellular lipid transport), we could not attribute to them any supporting literature in relation to the embryo implantation or to the pathophysiology of adenomyosis. Such results could be due to the different physiological maturity of used endometrial samples, despite the fact that each biopsy was retrieved between days LH+7 and LH+9 (the expected time of endometrial receptivity). As the personalized appearance and duration of the receptive phase in the menstrual cycle has been reported (Ruiz-Alonso et al., 2013; Mahajan et al., 2018; Tan et al., 2018) and a masked signature of pathology on the endometrial transcriptome when comparing samples from different phases of the cycle (Devesa-Peiro et al., 2021), we additionally performed endometrial dating of all samples. We utilized a novel molecular tool that determines a personalized receptive phase status based on the expression pattern of 57 selected endometrial receptivity genes (Saare et al., 2019). Considering the results of endometrial receptivity testing, we classified endometrial samples into three groups: early receptive phase (n = 2), receptive phase (n = 13), and late receptive phase (n = 5). We reanalysed the RNA-seq data considering only confirmed receptive endometrial samples from adenomyosis (n = 8) in control (n = 5) groups and identified the aforementioned 382 differentially expressed genes ( p < 0.05). These genes were enriched in 33 pathways ( p < 0.05), 19 of which were related to IFN signalling response mechanisms. In relation to embryo implantation, the role of IFN is associated with the activation of uNK cells, which control the depth of trophoblast implantation in the decidua and support the remodelling of the spiral arteries for blood supply to the embryo (Austin et al., 2003; Wilczyński, 2005; Hannan et al., 2011). In relation to the pathophysiology of adenomyosis, upregulated levels of endometrial IFN have been associated with locally enhanced production of inflammation cytokines in the uterus leading to lesion development (Sotnikova et al., 2002). In conclusion, RNA-seq of the transcriptome and accurate dating of endometrial samples have resulted in the identification of pathways of response to IFN action that represent the most promising candidate for further investigation of impaired uterine receptivity in adenomyosis. The enrichment of the 382 genes also identified a pathway related to cell adhesion, where, as in the IFN pathways, the majority of annotated genes were downregulated in women with adenomyosis compared to the control group. This could indicate an impaired uterine receptivity for embryo implantation in adenomyosis. This is in agreement with the literature, as sufficient endometrial adhesion capacity allows the blastocyst to attach to its epithelium (Achache and Revel, 2006). In addition, enriched pathways related to cell adhesion were also identified by analysing the genes in a co-expression network, which was constructed between 23 differentially expressed lncRNA derived from a set of 382 gene set and the whole transcriptome. Namely, we identified lncRNA transcripts DRAIC and CADM3-AS1, which had a predominantly negative correlation with the expression of their target transcripts, that were enriched in cell adhesion-related pathways. The regulatory role of lncRNA on the expression level of genes encoding adhesion proteins in the endometrium has been previously reported (Fan et al., 2017; Li et al., 2019). These two lncRNAs represent candidates factors 126 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 for the epigenetic impact of adenomyosis on the expression of genes related to endometrial receptivity. Our final conclusions regarding the identified differentially expressed genes (p < 0.05) from the RNA-seq analysis are limited due to their non-significant expression level after p value correction (FDR > 0.05). The low statistical power of the analysis could be a consequence of small sample size. The gathering of endometrial biopsies is a time-consuming process; therefore, future multicentre sample collection for additional RNA-seq analyses should be performed. In order to perform bioinformatics analyses of the genetic causes (mRNA and ncRNA transcripts and proteins) extracted from published studies reporting dysregulation in the endometrium, we first adopted their heterogeneous nomenclature according to the HGNC (HUGO, 2019) gene nomenclature. Then, we could sort obtained genes according to the reported menstrual cycle phase of endometrial dating in the original study for downstream enrichment analyses to understand their biological role. In this way, we provided a knowledge presenting the impact of endometriosis on endometrial molecular organisation through the menstrual cycle (Prašnikar et al., 2020a) and suggested stronger candidate genes of pathophysiology (proliferative (P) phase) and altered endometrial receptivity (mid-secretory (MS) phase) in adenomyosis. Due to the poorly understood impact of adenomyosis on endometrial receptivity, we chose the related, but better-studied endometriosis (Del Frate et al., 2006) to gain knowledge of dysregulated endometrium when the pathology persists (Prašnikar et al., 2020a). We obtained 591 genes after pooling differentially expressed endometrial loci from 21 published studies of different omics levels and adopting their nomenclature according to the HGNC database (HUGO, 2019). The genes were further sorted according to the reported phase of the menstrual cycle. By enriching 173 genes of the MS phase, we also identified pathways related to cytokine production, inflammatory response and chemotaxis of endothelial and immune cells. On the other hand, cytokines of the immune system also include IFNs, whose response pathways to their action were identified in the enrichment analysis of identified genes from our RNA-seq analysis. In view of this, we have demonstrated possible correlations in altered endometrial receptivity processes between adenomyosis and endometriosis. Additionally, we identified pathways related to immune system cytokines ( signalling by IL and signalling by IL4 and IL13) by two enrichment analyses of data retrieved only from the literature review, i.e. genes associated with endometrial receptivity in adenomyosis (42 genes), endometriosis (173 genes) and healthy uterus (151 genes). We further checked endometrial expression levels of selected six genes ( JUNB, FOS, SOCS3, IL6, IL10 and LIF) that were annotated in these two pathways. Endometrial samples were obtained between days LH+7–LH+9 from women with (n = 9) and without (n = 13) adenomyosis. We detected downregulation of selected genes in the adenomyosis compared to the control group, but the difference was statistically insignificant. The study should be repeated in a larger sample size (Prašnikar et al., 2020b). 127 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Identification of 52 stronger candidate genes (including ANXA1, BCL6, CXCL2, DUSP1, EPHA2, NFKB1A, PTGS1, S100A9, SOCS3 and VEGFA) of endometrial pathophysiology in adenomyosis based on data synthesis from 50 studies performed in the P phase. In this phase, progesterone hormone (P4) and receptivity-related genes are absent, so differences in endometrial expression patterns between study and control groups are more likely due to pathophysiological changes (Makieva et al., 2018). To identify 10 stronger candidate genes ( IL10, SST, STAT3, LIF, CHD5, CDKN3, COL8A1, COL11A1, ITGB3 and SPP1) of altered endometrial receptivity in adenomyosis, we pooled data from seven studies performed in the MS phase. Understanding the role of individual genes in adenomyosis could lead to the identification of endometrial molecular markers of this disease. A specific molecular test could contribute to a more reliable diagnosis of early adenomyosis, which is currently limited only to highly sensitive but subjective imaging methods (Hershko-Klement and Tepper, 2016). While a specific molecular test for the diagnosis of uterine receptivity in adenomyosis could better determine whether the endometrium is a factor for infertility in these women. Knowledge of the pathological processes of endometrial receptivity in adenomyosis could lead to the development of new therapeutic approaches for endometrial preparation prior the embryo transfer in assisted reproductive technology treatment. 128 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 5 VIRI Absenger Y., Hess-Stumpp H., Kreft B., Krätzschmar J., Haendler B., Schütze N., Regidor P.A., Winterhager E. 2004. Cyr61, a deregulated gene in endometriosis. Molecular Human Reproduction, 10, 6: 399-407 Achache H., Revel A. 2006. Endometrial receptivity markers, the journey to successful embryo implantation. Human Reproduction Update, 12, 6: 731-746 Ahn S.H., Singh V., Tayade C. 2017. Biomarkers in endometriosis: challenges and opportunities. Fertility and Sterility, 107, 3: 523-532 Altmäe S., Esteban F.J., Stavreus-Evers A., Simón C., Giudice L., Lessey B.A., Horcajadas J.A., Macklon N.S., D’Hooghe T., Campoy C., Fauser B.C., Salamonsen L.A., Salumets A. 2014. Guidelines for the design, analysis and interpretation of “omics” data: focus on human endometrium. Human Reproduction Update, 20, 1: 12-28 Altmäe S., Koel M., Võsa U., Adler P., Suhorutšenko M., Laisk-Podar T., Kukushkina V., Saare M., Velthut-Meikas A., Krjutškov K., Aghajanova L., Lalitkumar P.G., Gemzell-Danielsson K., Giudice L., Simón C., Salumets A. 2017. Meta-signature of human endometrial receptivity: a meta-analysis and validation study of transcriptomic biomarkers. Scientific Reports, 7, 1: 10077, doi: 10.1038/s41598-017-10098-3: 15 str. Altmäe S., Reimand J., Hovatta O., Zhang P., Kere J., Laisk T., Saare M., Peters M., Vilo J., Stavreus-Evers A., Salumets A. 2012. Research resource: interactome of human embryo implantation: identification of gene expression pathways, regulation, and integrated regulatory networks. Molecular Endocrinology, 26, 1: 203-217 An M., Li D., Yuan M., Li Q., Zhang L., Wang G. 2017. Interaction of macrophages and endometrial cells induces epithelial–mesenchymal transition-like processes in adenomyosis. Biology of Reproduction, 96, 1: 46-57 Andres M.P., Borrelli G.M., Ribeiro J., Baracat E.C., Abrão M.S., Kho R.M. 2018. Transvaginal ultrasound for the diagnosis of adenomyosis: systematic review and meta-analysis. Journal of Minimally Invasive Gynecology, 25, 2: 257-264 Ashburner M., Ball C.A., Blake J.A., Botstein D., Butler H., Cherry J.M., Davis A.P., Dolinski K., Dwight S.S., Eppig J.T., Harris M.A., Hill D.P., Issel-Tarver L., Kasarskis A., Lewis S., Matese J.C., Richardson J.E., Ringwald M., Rubin G.M., Sherlock G. 2000. The Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nature genetics, 25, 1: 25-29 Austin K.J., Bany B.M., Belden E.L., Rempel L.A., Cross J.C., Hansen T.R. 2003. Interferon-stimulated gene-15 (Isg15) expression is up-regulated in the mouse uterus in response to the implanting conceptus. Endocrinology, 144, 7: 3107-3113 Baiyong L., Tournier C., Davis R.J., Flavell R.A. 1999. Regulation of IL-4 expression by the transcription factor JunB during T helper cell differentiation. The EMBO Journal, 18, 2: 420-432 Bartel D.P. 2004. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 116, 2: 281-297 Bazot M., Daraï E. 2018. Role of transvaginal sonography and magnetic resonance imaging in the diagnosis of uterine adenomyosis. Fertility and Sterility, 109, 3: 389-397 Ensembl BioMart. 2019. Hinxton, EMBL's european Bioinformatics Institute http://www.ensembl.org/biomart/martview/bcec885dcf44191334b3f4cea3152994 (23. sep. 2019) Benagiano G., Brosens I., Habiba M. 2014. Structural and molecular features of the 129 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 endomyometrium in endometriosis and adenomyosis. Human Reproduction Update, 20, 3: 386-402 Benaglia L., Cardellicchio L., Leonardi M., Faulisi S., Vercellini P., Paffoni A., Somigliana E., Fedele L. 2014. Asymptomatic adenomyosis and embryo implantation in IVF cycles. Reproductive BioMedicine Online, 29, 5: 606-611 Bindea G., Galon J., Mlecnik B. 2013. CluePedia Cytoscape plugin: Pathway insights using integrated experimental and in silico data. Bioinformatics, 29, 5: 661-663 Bindea G., Mlecnik B., Hackl H., Charoentong P., Tosolini M., Kirilovsky A., Fridman W.H., Pagès F., Trajanoski Z., Galon J. 2009. ClueGO: A Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics, 25, 8: 1091-1093 Borthwick J.M., Charnock-Jones D.S., Tom B.D., Hull M.L., Teirney R., Phillips S.C., Smith S.K. 2003. Determination of the transcript profile of human endometrium. Molecular Human Reproduction, 9, 1: 19-33 Braschi B., Denny P., Gray K., Jones T., Seal R., Tweedie S., Yates B., Bruford E. 2019. Genenames.org: the HGNC and VGNC resources in 2019. Nucleic Acids Research, 47, D1: D786-D792 Braunschweig A., Poehlmann T.G., Busch S., Schleussner E., Markert U.R. 2011. Signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and suppressor of cytokine signaling (SOCS3) balance controls cytotoxicity and IL-10 expression in decidual-like natural killer cell line NK-92. American Journal of Reproductive Immunology, 66, 4: 329-335 Bulmer J.N., Jones R.K., Searle R.F. 1998. Intraepithelial leukocytes in endometriosis and adenomyosis: comparison of eutopic and ectopic endometrium with normal endometrium. Human Reproduction, 13, 10: 2910-2915 Burney R.O., Talbi S., Hamilton A.E., Kim C.V., Nyegaard M., Nezhat C.R., Lessey B.A., Giudice L.C. 2007. Gene expression analysis of endometrium reveals progesterone resistance and candidate susceptibility genes in women with endometriosis. Endocrinology, 148, 8: 3814-3826 Campo S., Campo V., Benagiano G. 2012. Adenomyosis and infertility. Reproductive BioMedicine Online, 24, 1: 35-46 Carrarelli P., Yen C., Arcuri F., Funghi L., Tosti V., Wang T., Huang J.S., Petragllia F. 2015. Myostatin, follistatin and activin type II receptors are highly expressed in adenomyosis. Fertility and Sterility, 104, 3: 744-752 Carrarelli P., Yen C., Funghi L., Arcuri F., Tosti C., Bifulco G., Luddi A., Lee C., Petraglia F. 2017. Expression of inflammatory and neurogenic mediators in adenomyosis: a pathogenetic role. Reproductive Science, 24, 3: 369-375 Chaouat G., Dubanchet S., Ledée N. 2007. Cytokines: important for implantation? Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 24, 11: 491-505 Chapron C., Tosti C., Marcellin L., Bourdon M., Lafay-Pillet M.C., Millischer A.E., Streuli I., Borghese B., Petraglia F., Santulli P. 2017. Relationship between the magnetic resonance imaging appearance of adenomyosis and endometriosis phenotypes. Human Reproduction, 32, 7: 1393-1401 Chapron C., Vannuccini S., Santulli P., Abrão M.S., Carmona F., Fraser I.S., Gordts S., Guo S.W., Just P.A., Noël J.C., Pistofidis G., Van den Bosch T., Petraglia F. 2020. Diagnosing adenomyosis: an integrated clinical and imaging approach. Human Reproduction Update, 26, 3: 392-411 Chen N., Du B., Zhou H., Shen F., Li J., Xie Z. 2017. Abnormal expression of Nrf2 may play 130 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 an important role in the pathogenesis and development of adenomyosis. PLoS ONE, 12, 8: e0182773, doi: 10.1371/journal.pone.0182773: 10 str. Chen Y.J., Li H.Y., Huang C.H., Twu N.F., Yen M.S., Wang P.H., Chou T.Y., Liu Y.N., Chao K.C., Yang M.H. 2010. Oestrogen-induced epithelial-mesenchymal transition of endometrial epithelial cells contributes to the development of adenomyosis. Journal of Pathology, 222, 3: 261-270 Chin C.H., Chen S.H., Wu H.H., Ho C.W., Ko M.T., Lin C.Y. 2014. cytoHubba: identifying hub objects and sub-networks from complex interactome. BMC Systems Biology, 8, Suppl 4: S11, doi: 10.1186/1752-0509-8-S4-S11: 7 str. Chung T.W., Park M.J., Kim H.S., Choi H.J., Ha K.T. 2016. Integrin αvβ3 and αvβ5 are required for leukemia inhibitory factor-mediated the adhesion of trophoblast cells to the endometrial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 469, 4: 936-940 Costello M.F., Lindsay K., McNally G. 2011. The effect of adenomyosis on in vitro fertilisation and intra-cytoplasmic sperm injection treatment outcome. European Journal of Obstetrics Gynecology and Reproductive Biology, 158, 2: 229-234 Coutifaris C., Myers E.R., Guzick D.S., Diamond M.P., Carson S.A., Legro R.S., McGovern P.G., Schlaff W.D., Carr B.R., Steinkampf M.P., Silva S., Vogel D.L., Leppert P.C. 2004. Histological dating of timed endometrial biopsy tissue is not related to fertility status. Fertility and Sterility, 82, 5: 1264-1272 Cui D., Ma J., Liu Y., Lin K., Jiang X., Qu Y., Lin J., Xu K. 2018. Analysis of long noncoding RNA expression profiles using RNA sequencing in ovarian endometriosis. Gene, 673, 140-148 Cullinan E.B., Abbondanzo S.J., Andersont P.S., Pollardt J.W., Lesseyt B.A., Stewart C.L. 1996. Leukemia inhibitory factor (LIF) and LIF receptor expression in human endometrium suggests a potential autocrine/paracrine function in regulating embryo implantation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 93, 7: 3115-3120 Del Frate C., Girometti R., Pittino M., Del Frate G., Bazzocchi M., Zuiani C. 2006. Deep retroperitoneal pelvic endometriosis: MR imaging appearance with laparoscopic correlation. Radiographics, 26, 6: 1705-1719 De Veer M.J., Holko M., Frevel M., Walker E., Der S., Paranjape J.M., Silverman R.H., Williams B.R. 2001. Functional classification of interferon-stimulated genes identified using microarrays. Journal of Leukocyte Biology, 69, 6: 912-920 Devesa-Peiro A., Sebastian-Leon P., Pellicer A., Diaz-Gimeno P. 2021. Guidelines for biomarker discovery in endometrium: correcting for menstrual cycle bias reveals new genes associated with uterine disorders. Molecular Human Reproduction, 27, 4: gaab011 Di Carlo C., Bonifacio M., Tommaselli G.A., Bifulco G., Guerra G., Nappi C. 2009. Metalloproteinases, vascular endothelial growth factor, and angiopoietin 1 and 2 in eutopic and ectopic endometrium. Fertility and Sterility, 91, 6: 2315-2323 Díaz-Gimeno P., Horcajadas J.A., Martinez-Conejero J.A., Esteban F.J., Alama P., Pellicer A., Simon C. 2011. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility and Sterility, 95, 1: 50-60 Díaz-Gimeno P., Ruiz-Alonso M., Blesa D., Bosch N., Martínez-Conejero J.A., Alamá P., Garrido N., Pellicer A., Simón C. 2013. The accuracy and reproducibility of the endometrial receptivity array is superior to histology as a diagnostic method for endometrial receptivity. Fertility and Sterility, 99, 2: 508-517 131 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Diehl S., Rincón M. 2002. The two faces of IL-6 on Th1/Th2 differentiation. Molecular Immunology, 39, 9: 531-536 Dior U.P., Nisbet D., Fung J.N., Foster G., Healey M., Montgomery G.W., Rogers P.A., Holdsworth-Carson S.J., Girling J.E. 2018. The association of sonographic evidence of adenomyosis with severe endometriosis and with gene expression in eutopic endometrium. Journal of Minimally Invasive Gynecology, 26, 5: 941-948 Dong Q., Fan R., Zhao S., Wang Y. 2009. Over-expression of SOCS-3 gene promotes IL-10 production by JEG-3 trophoblast cells. Placenta, 30, 1: 11-14 DisGeNET v7.0. 2021. Endometriosis of uterus. Barcelona, Integrative Biomedical Informatics Group. https://www.disgenet.org/browser/0/1/1/C0341858/25/25/223/_a/_b./-score/ (15. jan. 2022) Edwards R.G. 1995. Clinical approaches to increasing uterine receptivity during human implantation. Human Reproduction, 10, Suppl 2: 60-66 Enciso M., Carrascosa J.P., Sarasa J. 2018. Development of a new comprehensive and reliable endometrial receptivity map (ER Map/ER Grade) based on RT-qPCR gene expression analysis. Human Reproduction, 33, 2: 220-228 Fabregat A., Sidiropoulos K., Garapati P., Gillespie M., Hausmann K., Haw R., Jassal B., Jupe S., Korninger F., McKay S., Matthews L., May B., Milacic M., Rothfels K., Shamovsky V., Webber M., Weiser J., Williams M., Wu G., Stein L., Hermjakob H., D'Eustachio P. 2016. The Reactome pathway knowledgebase. Nucleic Acids Research, 44, D1: D481-D487. https://reactome.org/ (25. feb. 2021) Fan L., Han H., Guan J., Zhang X., Cui Q., Shen H., Shi C. 2017. Aberrantly expressed long noncoding RNAs in recurrent implantation failure: a microarray related study. Systems Biology in Reproductive Medicine, 63, 4: 269-278 Ferenczy A. 1998. Pathophysiology of adenomyosis. Human Reproduction Update, 4, 4: 312-322 Fischer C., Kayisili U., Taylor H. 2011. HOXA10 expression is decreased in endometrium of women with adenomyosis. Fertility and Sterility, 95, 3: 1133-1136 Florio P., Rossi M., Viganò P., Luisi S., Torricelli M., Torres P.B., Maria A., Blasio D., Petraglia F. 2007. Interleukin 1beta and progesterone stimulate activin a expression and secretion from cultured human endometrial stromal cells. Reproductive sciences, 14, 1: 29-36 Flynn L., Byrne B., Carton J., Kelehan P., O’Herlihy C., O’Farrelly C. 2000. Menstrual cycle dependent fluctuations in NK and T-lymphocyte subsets from non-pregnant human endometrium. American Journal of Reproductive Immunology, 43, 4: 209-217 Franasiak J.M., Holoch K.J., Yuan L., Schammel D.P., Young S.L., Lessey B.A. 2014. Prospective assessment of midsecretory endometrial leukemia inhibitor factor expression versus ανβ3 testing in women with unexplained infertility. Fertility and Sterility, 101, 6: 1724-1731 Fusi L., Cloke B., Brosens J.J. 2006. The uterine junctional zone. Best Practice and Research: Clinical Obstetrics and Gynaecology, 20, 4: 479-491 García-Solares J., Donnez J., Donnez O., Dolmans M.M. 2018. Pathogenesis of uterine adenomyosis: invagination or metaplasia? Fertility and Sterility, 109, 3: 371-379 Gnainsky Y., Dekel N., Granot I. 2014. Implantation: mutual activity of sex steroid hormones and the immune system guarantee the maternal-embryo interaction. Seminars in Reproductive Medicine, 32, 5: 337-345 132 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Goteri G., Lucarini G., Montik N., Zizzi A., Stramazzotti D., Fabris G., Tranquilli A.L., Ciavattini A. 2009. Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α), and microvessel density in endometrial tissue in women with adenomyosis. International Journal of Gynecological Pathology, 28, 2: 157-163 Greening D.W., Nguyen H.P.T., Elgass K., Simpson R.J., Salamonsen L.A. 2016. Human endometrial exosomes contain hormone-specific cargo modulating trophoblast adhesive capacity: insights into endometrial-embryo interactions. Biology of Reproduction, 94, 2: 38 Grewal S., Carver J., Ridley A.J., Mardon H.J. 2010. Human endometrial stromal cell Rho GTPases have opposing roles in regulating focal adhesion turnover and embryo invasion in vitro. Biology of Reproduction, 83, 1: 75-82 Guo J., Chen L., Luo N., Li C., Chen R., Qu X., Liu M., Kang L., Cheng Z. 2016. LPS/TLR4-mediated stromal cells acquire an invasive phenotype and are implicated in the pathogenesis of adenomyosis. Scientific Reports, 6, 21416 Guo Q., Zhang H., Zhao X., Fu Y., Zhang J., Li M. 2014. Loss of expressions of Dusp6, Sprouty4, and Sef, negative regulators of FGF2/ERK1/2 signaling, in the endometrium of women with adenomyosis. International Journal of Gynecological Pathology, 33, 3: 288-297 Guo Y., Lang X., Lu Z., Wang J., Li T., Liao Y., Jia C., Zhao W., Fang H. 2015. MiR-10b directly targets ZEB1 and PIK3CA to curb adenomyotic epithelial cell invasiveness via upregulation of E-cadherin and inhibition of Akt phosphorylation. Cellular Physiology and Biochemistry, 35, 6: 2169-2180 Gupta D., Hull M.L., Fraser I., Miller L., Bossuyt P.M.M., Johnson N., Nisenblat V. 2016. Endometrial biomarkers for the non-invasive diagnosis of endometriosis. Cochrane Database of Systematic Reviews, 4, CD012165, doi: 10.1002/14651858.CD012165: 294 str. Halasz M., Szekeres-Bartho J. 2013. The role of progesterone in implantation and trophoblast invasion. Journal of Reproductive Immunology, 97, 1: 43-50 Hannan N.J., Evans J., Salamonsen L.A. 2011. Alternate roles for immune regulators: establishing endometrial receptivity for implantation. Expert Review of Clinical Immunology, 7, 6: 789-802 Haouzi D., Entezami F., Torre A., Innocenti C., Antoine Y., Mauries C., Vincens C., Bringer-Deutsch S., Gala A., Ferrieres-HOA A., Ohl J., Gonzalez Marti B., Brouillet S., Hamamah S. 2021. Customized frozen embryo transfer after identification of the receptivity window with a transcriptomic approach improves the implantation and live birth rates in patients with repeated implantation failure. Reproductive Sciences, 28, 1: 69-78 Hashim H.A., Elaraby S., Fouda A.A., Rakhawy M. El. 2020. The prevalence of adenomyosis in an infertile population: a cross-sectional study. Reproductive BioMedicine Online, 40, 6: 842-850 Hatok J., Zubor P., Galo S., Kirschnerova R., Dobrota D., Danko J., Racay P. 2011. Endometrial aromatase mRNA as a possible screening tool for advanced endometriosis and adenomyosis. Gynecological Endocrinology, 27, 5: 331-336 Hawkins S.M., Matzuk M.M. 2008. Menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences, 1135: 10-18 Herndon C.N., Aghajanova L., Bayalan S., Erikson D., Barragan F., Goldfien G., Vo K.C., Hawkins S., Giudice L.C. 2016. Global transcriptome abnormalities of the eutopic 133 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 endometrium from women with adenomyosis. Reproductive Sciences, 23, 10: 1289-1303 Hershko-Klement A., Tepper R. 2016. Ultrasound in assisted reproduction: a call to fill the endometrial gap. Fertility and Sterility, 105, 6: 1394-1402.e4 Hess A.P., Hamilton A.E., Talbi S., Dosiou C., Nyegaard M., Nayak N., Genbecev-Krtolica O., Mavrogianis P., Ferrer K., Kruessel J., Fazleabas A.T., Fisher S.J., Giudice L.C. 2007. Decidual stromal cell response to paracrine signals from the trophoblast: amplification of immune and angiogenic modulators. Biology of Reproduction, 76, 1: 102-117 Hever A., Roth R.B., Hevezi P.A., Lee J., Willhite D., White E.C., Marin E.M., Herrera R., Acosta H.M., Acosta A.J., Zlotnik A. 2006. Molecular characterization of human adenomyosis. Molecular Human Reproduction, 12, 12: 737-748 Horton J., Sterrenburg M., Lane S., Maheshwari A., Li T.C., Cheong Y. 2019. Reproductive, obstetric, and perinatal outcomes of women with adenomyosis and endometriosis: a systematic review and meta-analysis. Human Reproduction Update, 25, 5: 593-633 Houshdaran S., Nezhat C.R., Vo K.C., Zelenko Z., Irwin J.C., Giudice L.C. 2016. Aberrant endometrial DNA methylome and associated gene expression in women with endometriosis. Biology of Reproduction, 95, 5: 93 Hu H., Li H., He Y. 2017. MicroRNA-17 downregulates expression of the PTEN gene to promote the occurrence and development of adenomyosis. Experimental and Therapeutic Medicine, 14, 4: 3805-3811 Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A. 2009. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Research, 37, 1: 1-13. https://david.ncifcrf.gov/ (17. jan. 2022) Huang H., Yu H., Chan S., Sc B., Lee C., Wang H., Soong Y. 2010. Eutopic endometrial interleukin-18 system mRNA and protein expression at the level of endometrial-myometrial interface in adenomyosis patients. Fertility and Sterility, 94, 1: 33-39 Huang P.C., Tsai E.M., Li W.F., Liao P.C., Chung M.C., Wang Y.H., Wang S.L. 2010. Association between phthalate exposure and glutathione S-transferase M1 polymorphism in adenomyosis, leiomyoma and endometriosis. Human Reproduction, 25, 4: 986-994 Huang T.S., Chen Y.J., Chou T.Y., Chen C.Y., Li H.Y., Huang B.S., Tsai H.W., Lan H.Y., Chang C.H., Twu N.F., Yen M.S., Wang P.H., Chao K.C., Lee C.C., Yang M.H. 2014. Oestrogen-induced angiogenesis promotes adenomyosis by activating the Slug-VEGF axis in endometrial epithelial cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 18, 7: 1358-1371 Huang Y., Zheng W., Mu L., Ren Y., Chen X., Liu F. 2011. Expression of tyrosine kinase receptor B in eutopic endometrium of women with adenomyosis. Archives of Gynecology and Obstetrics, 283, 4: 775-780 HUGO Gene Nomenclature Committee. 2019. Cambridge, European Bioinformatics Institute. https://www.genenames.org/ (10. jun. 2019) Ibrahim M.G., Chiantera V., Frangini S., Younes S., Köhler C., Taube E., Plendl J., Mechsner S. 2015. Ultramicro-trauma in the zone and pale cell migration in adenomyosis. Fertility and Sterility, 104, 6: 1475-1483 Ibrahim M.G., Sillem M., Plendl J., Chiantera V., Sehouli J., Mechsner S. 2017. Myofibroblasts are evidence of chronic tissue microtrauma at the endometrial-myometrial junctional zone in uteri with adenomyosis. Reproductive Sciences, 24, 10: 1410-1418 134 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ICD-10. 2019. Diseases of the genitourinary system. International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems. Geneva, WHO. https://icd.who.int/browse10/2019/en#/N80.0 (10. apr. 2020) Inoue S., Hirota Y., Ueno T., Fukui Y., Yoshida E., Hayashi T., Kojima S., Takeyama R., Hashimoto T., Kiyono T., Ikemura M., Taguchi A., Tanaka T., Tanaka Y., Sakata S., Takeuchi K., Muraoka A., Osuka S., Saito T., Oda K., Osuga Y., Terao Y., Kawazu M., Mano H. 2019. Uterine adenomyosis is an oligoclonal disorder associated with KRAS mutations. Nature Communications, 10, 1: 5785, doi: 10.1038/s41467-019-13708-y: 13 str. Jiang C., Gong W., Chen R., Ke H., Qu X., Yang W., Cheng Z. 2018. RhoA/ROCK/ARHGAP26 signaling in the eutopic and ectopic endometrium is involved in clinical characteristics of adenomyosis. Journal of International Medical Research, 46, 12: 5019-5029 Jiang C., Liu C., Guo J., Chen L., Luo N., Qu X., Yang W., Ren Q., Cheng Z. 2017. The expression of Toll-like receptors in eutopic and ectopic endometrium and its implication in the inflammatory pathogenesis of adenomyosis. Scientific Reports, 7, 1: 7365, doi: 10.1038/s41598-017-07859-5: 7 str. Jiang J.F., Sun A.J., Xue W., Deng Y., Wang Y.F. 2016. Aberrantly expressed long noncoding RNAs in the eutopic endometria of patients with uterine adenomyosis. European Journal of Obstetrics Gynecology and Reproductive Biology, 199, 32-37 Jiang J.F., Xiao S.S., Xue M. 2018. Decreased expression of interleukin-37 in the ectopic and eutopic endometria of patients with adenomyosis. Gynecological Endocrinology, 34, 1: 83-86 Jiang Y., Jiang R., Cheng X., Zhang Q., Hu Y., Zhang H., Cao Y., Zhang M., Wang J., Ding L., Diao Z., Sun H., Yan G. 2016. Decreased expression of NR4A nuclear receptors in adenomyosis impairs endometrial decidualization. Molecular Human Reproduction, 22, 9: 655-668 Jiménez Fernández D., Hess S., Knobeloch K.P. 2020. Strategies to target ISG15 and USP18 toward therapeutic applications. Frontiers in Chemistry, 21, 7: 923, doi: 10.3389/fchem.2019.00923: 12 str. Jin Z., Liu H., Xu C. 2020. Estrogen degrades Scribble in endometrial epithelial cells through E3 ubiquitin ligase HECW1 in the development of diffuse adenomyosis. Biology of Reproduction, 102, 2: 376-387 Jochum W., Passegué E., Wagner E.F. 2001. AP-1 in mouse development and tumorigenesis. Oncogene, 20, 19: 2401-2412 Jones R.K., Searle R.F., Bulmer J.N. 1998. Apoptosis and bcl-2 expression in normal human endometrium, endometriosis and adenomyosis. Human Reproduction, 13, 12: 3496-3502 Kamada Y., Nakatsuka M., Asagiri K., Noguchi S., Habara T., Takata M., Kudo T. 2000. GnRH agonist-suppressed expression of nitric oxide synthases and generation of peroxynitrite in adenomyosis. Human Reproduction, 15, 12: 2512-2519 Kanehisa M., Furumichi M., Tanabe M., Sato Y., Morishima K. 2017. KEGG: new perspectives on genomes, pathways, diseases and drugs. Nucleic Acids Research, 45, D1: D353-D361 Kang S., Zhoa J., Liu Q., Zhou R., Wang N., Li Y. 2009. Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms are associated with the risk of developing adenomyosis. Environmental and Molecular Mutagenesis, 50, 5: 361-266 Kao L.C., Germeyer A., Tulac S., Lobo S., Yang J.P., Taylor R.N., Osteen K., Lessey B.A., 135 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Giudice L.C. 2003a. Expression profiling of endometrium from women with endometriosis reveals candidate genes for disease-based implantation failure and infertility. Endocrinology, 144, 7: 2870-2881 Kao L.C., Tulac S., Lobo S., Imani B., Yang J.P., Germeyer A., Osteen K., Taylor R.N., Lessey B.A., Giudice L.C. 2003b. Global gene profiling in human endometrium during the window of implantation. Endocrinology, 143, 6: 2119-2138 Khan K.N., Fujishita A., Koshiba A., Kuroboshi H., Mori T., Ogi H., Itoh K., Nakashima M., Kitawaki J. 2019. Biological differences between intrinsic and extrinsic adenomyosis with coexisting deep infiltrating endometriosis. Reproductive BioMedicine Online, 39, 2: 343-353 Khan K.N., Kitajima M., Hiraki K., Fujishita A., Nakashima M., Masuzaki H. 2015. Involvement of hepatocyte growth factor-induced epithelial-mesenchymal transition in human adenomyosis. Biology of Reproduction, 92, 2: 1-11 Kharfi A., Labelle Y., Mailloux J., Akoum A. 2003. Deficient expression of tumor necrosis factor receptor type 2 in the endometrium of women with endometriosis. American Journal of Reproductive Immunology, 50, 1: 33-40 Kim S.R., Kim S.H., Lee H.W., Chae H.D., Kim C.H., Kang B.M. 2010. Increased expression of p21-activated kinase in adenomyosis. Fertility and Sterility, 94, 3: 1125-1128 Kishi Y., Suginami H., Kuramori R., Yabuta M., Suginami R., Taniguchi F. 2012. Four subtypes of adenomyosis assessed by magnetic resonance imaging and their specification. American Journal of Obstetrics and Gynecology, 207, 2: 114.e1-114.e7, doi: 10.1016/j.ajog.2012.06.027: 6 str. Kissler S., Zangos S., Kohl J., Wiegratz I., Rody A., Gätje R., Vogl T.J., Kunz G., Leyendecker G., Kaufmann M. 2008. Duration of dysmenorrhoea and extent of adenomyosis visualised by magnetic resonance imaging. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology, 137, 2: 204-209 Kitawaki J., Koshiba H., Ishihara H., Kusuki I., Tsukamoto K., Honjo H. 2000. Progesterone induction of 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 during the secretory phase occurs in the endometrium of estrogen-dependent benign diseases but not in normal endometrium. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 85, 9: 3292-3296 Kitawaki J., Noguchi T., Amatsu T., Maeda K., Tsukamoto K., Yamamoto T., Fushiki S., Osawa Y., Honjo H. 1997. Expression of aromatase cytochrome P450 protein and messenger ribonucleic acid in human endometriotic and adenomyotic tissues but not in normal endometrium. Biology of Reproduction, 57, 3: 514-519 Kolioulis I., Zafrakas M., Grimbizis G., Miliaras D., Timologou A., Bontis J.N., Tarlatzis B.C. 2017. Immunohistochemical expression pattern of metastasis suppressor KISS-1 protein in adenomyosis lesions and normal endometrium. European Journal of Obstetrics Gynecology and Reproductive Biology, 210: 64-68 Koot Y.E.M., Van Hooff S.R., Boomsma C.M., Van Leenen D., Koerkamp M.J.A.G., Goddijn M., Eijkemans M.J.C., Fauser B.C.J.M., Holstege F.C.P., Macklon N.S. 2016. An endometrial gene expression signature accurately predicts recurrent implantation failure after IVF. Scientific Reports, 6, 19411, doi: 10.1038/srep19411: 12 str. Krjutškov K., Katayama S., Saare M., Vera-Rodriguez M., Lubenets D., Samuel K., Laisk-Podar T., Teder H., Einarsdottir E., Salumets A., Kere J. 2016. Single-cell transcriptome analysis of endometrial tissue. Human Reproduction, 31, 4: 844-853 Kühn R., Löhler J., Rennick D., Rajewsky K., Müller W. 1993. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell, 75, 2: 263-274 136 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Kunz G., Beil D., Huppert P., Noe M., Kissler S., Leyendecker G. 2005. Adenomyosis in endometriosis—prevalence and impact on fertility. Evidence from magnetic resonance imaging. Human Reproduction, 20, 8: 2309-2316 Kunz G., Herbertz M., Beil D., Huppert P., Leyendecker G. 2007. Adenomyosis as a disorder of the early and late human reproductive period. Reproductive BioMedicine Online, 15, 6: 681-685 Lai T.H., Wu P.H., Wu W. Bin. 2016. Involvement of NADPH oxidase and NF-κB activation in CXCL1 induction by vascular endothelial growth factor in human endometrial epithelial cells of patients with adenomyosis. Journal of Reproductive Immunology, 118: 61-69 Lang R., Pauleau A.L., Parganas E., Takahashi Y., Mages J., Ihle J.N., Rutschman R., Murray P.J. 2003. SOCS3 regulates the plasticity of gp130 signaling. Nature Immunology, 4, 6: 546-550 Laudanski P., Charkiewicz R., Kuzmicki M., Szamatowicz J., Charkiewicz A., Niklinski J. 2013. MicroRNAs expression profiling of eutopic proliferative endometrium in women with ovarian endometriosis. Reproductive Biology and Endocrinology, 11, 78: 1-7 Lee J.Y., Lee M., Lee S.K. 2011. Role of endometrial immune cells in implantation. Clinical and Experimental Reproductive Medicine, 38, 3: 119-125 Leyendecker G., Bilgicyildirim A., Inacker M., Stalf T., Huppert P., Mall G., Böttcher B., Wildt L. 2015. Adenomyosis and endometriosis. Re-visiting their association and further insights into the mechanisms of auto-traumatisation. An MRI study. Archives of Gynecology and Obstetrics, 291, 4: 917-932 Li B., Chen M., Liu X., Guo S.W. 2013. Constitutive and tumor necrosis factor-α-induced activation of nuclear factor-κB in adenomyosis and its inhibition by andrographolide. Fertility and Sterility, 100, 2: 568-577 Li C., Chen R., Jiang C., Chen L., Cheng Z. 2019. Correlation of LOX-5 and COX-2 expression with inflammatory pathology and clinical features of adenomyosis. Molecular Medicine Reports, 19, 1: 727-733 Li D., Jiang W., Jiang Y., Wang S., Fang J., Zhu L., Zhu Y., Yan G., Sun H., Chen L., Zhang N. 2019. Preliminary functional inquiry of lncRNA ENST00000433673 in embryo implantation using bioinformatics analysis. Systems Biology in Reproductive Medicine, 65, 2: 164-173 Li J., Yanyan M., Mu L., Chen X., Zheng W. 2019. The expression of Bcl-2 in adenomyosis and its effect on proliferation, migration, and apoptosis of endometrial stromal cells. Pathology Research and Practice, 215, 8: 152477, doi: 10.1016/j.prp.2019.152477: 6 str. Li T., Li Y.-G., Pu D.M. 2006. Matrix metalloproteinase-2 and -9 expression correlated with angiogenesis in human adenomyosis. Gynecologic and Obstetric Investigation, 62, 4: 229-235 Li X., Wu D., Cooper N.G.F., Rai S.N. 2019. Sample size calculations for the differential expression analysis of RNA-seq data using a negative binomial regression model. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology, 18, 1: 20180021, doi: 10.1515/sagmb-2018-0021: 17 str. Liu X., Guo S. 2012. Aberrant immunoreactivity of deoxyribonucleic acid methyltransferases in adenomyosis. Gynecologic and Obstetric Investigation, 74, 2: 100-108 Liu X., Nie J., Guo S.W. 2011. Elevated immunoreactivity to tissue factor and its association with dysmenorrhea severity and the amount of menses in adenomyosis. Human Reproduction, 26, 2: 337-345 137 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Liu X., Nie J., Guo S.W. 2012. Elevated immunoreactivity against class I histone deacetylases in adenomyosis. Gynecologic and Obstetric Investigation, 74, 1: 50-55 Liu X., Shen M., Qi Q., Zhang H., Guo S. 2016. Corroborating evidence for platelet-induced epithelial-mesenchymal transition and fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in the development of adenomyosis. Human Reproduction, 31, 4: 734-749 Liu Z., Sun Z., Liu H., Niu W., Wang X., Liang N., Wang X., Wang Y., Shi Y., Xu L., Shi W. 2021. Single-cell transcriptomic analysis of eutopic endometrium and ectopic lesions of adenomyosis. Cell and Bioscience, 11, 1: 51, doi: 10.1186/s13578-021-00562-z: 17 str. Livak K.J., Schmittgen T.D. 2001. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods, 25, 4: 402-408 Loring M., Chen T.Y., Isaacson K.B. 2020. A systematic review of adenomyosis: it’s time to reassess what we thought we knew about the disease. Journal of Minimally Invasive Gynecology, 28, 3: 644-655 Macer L.M., Taylor S.H. 2012. Endometriosis and infertility: a review of the pathogenesis and treatment of endometriosis-associated infertility. Obstet Gynecol Clin Nort Am, 39, 4: 535-549 Macklon N.S., Brosens J.J. 2014. The human endometrium as a sensor of embryo quality. Biology of Reproduction, 91, 4: 98, doi: 10.1095/biolreprod.114.122846: 8 str. Mahajan N., Kaur S., Alonso M.R. 2018. Window of implantation is significantly displaced in patients with adenomyosis with previous implantation failure as determined by endometrial receptivity assay. Journal of Human Reproductive Science, 11, 4: 353-358 Maheshwari A., Gurunath S., Fatima F., Bhattacharya S. 2012. Adenomyosis and subfertility: a systematic review of prevalence, diagnosis, treatment and fertility outcomes. Human Reproduction Update, 18, 4: 374-392 Maia H., Casoy J., Correia T., Freitas L., Pimentel K., Athayde C., Coutinho E. 2006. Effect of the menstrual cycle and oral contraceptives on aromatase and cyclooxygenase-2 expression in adenomyosis. Gynecological Endocrinology, 22, 10: 547-551 Makieva S., Giacomini E., Ottolina J., Sanchez A.M., Papaleo E., Vigan P. 2018. Inside the endometrial cell signaling subway: mind the gap(s). International Journal of Molecular Sciences, 19, 9: 2477, doi: 10.3390/ijms19092477: 28 str. Martinez-Conejero J.A., Morgan M., Montesinos M., Fortu S., Meseguer M., Simón C., Horajadas J.A., Pellicer A. 2011. Adenomyosis does not affect implantation, but is associated with miscarriage in patients undergoing oocyte donation. Fertility and Sterility, 96, 4: 943-951 Matarese G., De Placido G., Nikas Y., Alviggi C. 2003. Pathogenesis of endometriosis: natural immunity dysfunction or autoimmune disease? Trends in Molecular Medicine, 9, 5: 223-228 Matsuda M., Sasabe H., Adachi Y., Suzuki T., Mori T. 2001. Increased invasion activity of endometrial stromal cells and elevated expression of matrix metalloproteinase messenger RNA in the uterine tissues of mice with experimentally induced adenomyosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology, 185, 6: 1374-1380 Matsuzaki S., Maleysson E., Darcha C. 2010. Analysis of matrix metalloproteinase-7 expression in eutopic and ectopic endometrium samples from patients with different forms of endometriosis. Human Reproduction, 25, 3: 742-750 Mehasseb M.K., Bell S.C., Pringle J.H., Habiba M.A. 2010a. Uterine adenomyosis is associated with ultrastructural features of altered contractility in the inner myometrium. Fertility and Sterility, 93, 7: 2130-2136 138 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Mehasseb M.K., Panchal R., Taylor A.H., Brown L., Bell S.C., Path F.R.C., Habiba M. 2011. Estrogen and progesterone receptor isoform distribution through the menstrual cycle in uteri with and without adenomyosis. Fertility and Sterility, 95, 7: 2228-2235 Mehasseb M.K., Taylor A.H., Pringle J.H., Bell S.C., Habiba M. 2010b. Enhanced invasion of stromal cells from adenomyosis in a three-dimensional coculture model is augmented by the presence of myocytes from affected uteri. Fertility and Sterility, 94, 7: 2547-2551 Meuleman C., Vandenabeele B., Fieuws S., Spiessens C., Timmerman D., D’Hooghe T. 2009. High prevalence of endometriosis in infertile women with normal ovulation and normospermic partners. Fertility and Sterility, 92, 1: 68-74 Mijatovic V., Florijn E., Halim N., Schats R., Hompes P. 2010. Adenomyosis has no adverse effects on IVF/ICSI outcomes in women with endometriosis treated with long-term pituitary down-regulation before IVF/ICSI. European Journal of Obstetrics and Gynecology, 151, 1: 62-65 Miyashita M., Koga K., Takeuchi A., Makabe T., Taguchi A., Urata Y., Izumi G., Takamura M., Harada M., Hirata T., Hirota Y., Wada-Hiraike O., Yoshino O., Fujii T., Osuga Y. 2019. Expression of nerve injury-induced protein1 (Ninj1) in endometriosis. Reproductive Sciences, 26, 8: 1105-1110 Morsch D.M., Carneiro M.M., Lecke S.B., Araújo F.C., Camargos A.F., Reis F.M., Spritzer P.M. 2009. C-fos gene and protein expression in pelvic endometriosis: a local marker of estrogen action. Journal of Molecular Histology, 40, 1: 53-58 miRBase. 2019. Swindon, Biotechnology and biological Sciences Research Council. https://www.mirbase.org/ (20. sep. 2019) Mu L.I.N., Chen W., Ma Y., Zheng W.E.I. 2015. Expression of focal adhesion kinase in the eutopic endometrium of women with adenomyosis varies with dysmenorrhea and pelvic pain. Experimental and Therapeutic Medicine, 10, 5: 1903-1907 Naftalin J., Jurkovic D. 2009. The endometrial–myometrial junction: a fresh look at a busy crossing. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, 34, 1: 1-11 NCBI Gene. 2019. Bethesda, National Library of Medicine. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene (20. jan. 2019) NCBI UniGene. 2019. Bethesda, National Library of Medicine. https://ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov/2019/02/01/ncbi-to-retire-the-unigene-database/ (20. jan. 2019) NCBI GenBank. 2019, Bethesda, National Library of Medicine. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/sequenceids/ (20. sep. 2019) Ng Y.H., Rome S., Jalabert A., Forterre A., Singh H., Hincks C.L., Salamonsen L.A. 2013. Endometrial exosomes/microvesicles in the uterine microenvironment: a new paradigm for embryo-endometrial cross talk at implantation. PLoS ONE, 8, 3: e58502, doi: 10.1371/journal.pone.0058502: 13 str. Nie J., Liu X., Guo S.W. 2010a. Promoter hypermethylation of progesterone receptor isoform B (PR-B) in adenomyosis and its rectification by a histone deacetylase inhibitor and a demethylation agent. Reproductive Sciences, 17, 11: 995-1005 Nie J., Liu X., Guo S.W. 2010b. Immunoreactivity of oxytocin receptor and transient receptor potential vanilloid type 1 and its correlation with dysmenorrhea in adenomyosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology, 202, 4: 346.e1-8 Nie J., Lu Y., Liu X., Guo S. 2009. Immunoreactivity of progesterone receptor isoform B, nuclear factor k B, and IkBa in adenomyosis. Fertility and Sterility, 92, 3: 886-889 Nikas G., Makrigiannakis A. 2003. Endometrial pinopodes and uterine receptivity. Annals of 139 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 the New York Academy of Sciences, 997: 120-123 Nirgianakis K., Kalaitzopoulos D.R., Schwartz A.S.K., Spaanderman M., Kramer B.W., Mueller M.D., Mueller M. 2020. Fertility, pregnancy and neonatal outcomes of patients with adenomyosis: a systematic review and meta-analysis. Reproductive BioMedicine Online, 42, 1: 185-206 Oehler M.K., Greschik H., Fischer D.C., Tong X., Schuele R., Kieback D.G. 2004. Functional characterization of somatic point mutations of the human estrogen receptor α (hERα) in adenomyosis uteri. Molecular Human Reproduction, 10, 12: 853-860 Oh S.J., Shin J.H., Kim T.H., Lee H.S., Yoo J.Y., Ahn J.Y., Broaddus R.R., Taketo M.M., Lydon J.P., Leach R.E., Lessey B.A., Fazleabas A.T., Lim J.M., Jeong J.W. 2013. β - Catenin activation contributes to the pathogenesis of adenomyosis through epithelial-mesenchymal transition. Journal of Pathology, 231, 2: 210-222 Okada H., Tsuzuki T., Murata H. 2018. Decidualization of the human endometrium. Reproductive Medicine and Biology, 17, 3: 220-227 Okada H., Tsuzuki T., Shindoh H., Nishigaki A., Yasuda K., Kanzaki H. 2014. Regulation of decidualization and angiogenesis in the human endometrium: mini review. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research, 40, 5: 1180-1187 Ota H., Igarashi S., Hatazaw J., Tanaka T. 1999. Immunohistochemical assessment of superoxide dismutase expression in the endometrium in endometriosis and adenomyosis. Fertility and Sterility, 72, 1: 129-134 Ota H., Igarashi S., Hatazawa J., Tanaka T. 1997. Distribution of heat shock proteins in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and adenomyosis. Fertility and Sterility, 68, 1: 23-28 Ota H., Igarashi S., Hatazawa J., Tanaka T. 1998a. Is adenomyosis an immune disease? Human Reproduction Update, 4, 4: 360-367 Ota H., Igarashi S., Hatazawa J., Tanaka T. 1998b. Endothelial nitric oxide synthase in the endometrium during the menstrual cycle in patients with endometriosis and adenomyosis. Fertility and Sterility, 69, 2: 303-308 Ota H., Igarashi S., Kato N., Tanaka T. 2000. Aberrant expression of glutathione peroxidase in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and adenomyosis. Fertility and Sterility, 74, 2: 313-318 Ota H., Igarashi S., Sasaki M., Tanaka T. 2001a. Xanthine oxidase in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and adenomyosis. Human Reproduction, 75, 4: 785-790 Ota H., Igarashi S., Sasaki M., Tanaka T. 2001b. Distribution of cyclooxygenase-2 in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and adenomyosis. Human Reproduction, 16, 3: 561-566 Ota H., Igarashi S., Sato N., Tanaka H., Tanaka T. 2002. Involvement of catalase in the endometrium of patients with endometriosis and adenomyosis. Fertility and Sterility, 78, 4: 804-809 Ota H., Igarashi S., Tanaka T. 1996. Expression of γδT cells and adhesion molecules in endometriotic tissue in patients with endometriosis and adenomyosis. American Journal of Reproductive Immunology, 35, 5: 477-482 Ota H., Tanaka T. 1997. Integrin adhesion molecules in the endometrial glandular epithelium in patients with endometriosis or adenomyosis. The Journal of Obstretics and Gynaecology Research, 23, 5: 485-491 Ota H., Tanaka T. 2003. Stromal vascularization in the endometrium during adenomyosis. Microscopy research and technique, 60, 4: 445-449 140 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Pan H., Sheng J.Z., Tang L., Zhu R., Zhou T.H., Huang H.F. 2008. Increased expression of c-fos protein associated with increased matrix metalloproteinase-9 protein expression in the endometrium of endometriotic patients. Fertility and Sterility, 90, 4: 1000-1007 Park H., Kim S.H., Cho Y.M., Ihm H.J., Oh Y.S., Hong S.H., Chae H.D., Kim C.H., Kang B.M. 2016. Increased expression of nuclear factor kappa-B p65 subunit in adenomyosis. Obstetrics & Gynecology Science, 59, 2: 123-129 Peng Y., Jin Z., Liu H., Xu C. 2021. Impaired decidualization of human endometrial stromal cells from women with adenomyosis. Biology of Reproduction, 104, 5: 1034-1044 Pino M., Galleguillos C., Torres M., Sovino H., Fuentes A., Boric M.A., Johnson M.C. 2009. Association between MMP1 and MMP9 activities and ICAM1 cleavage induced by tumor necrosis factor in stromal cell cultures from eutopic endometria of women with endometriosis. Reproduction, 138, 5: 837-847 Pirih N., Kunej T. 2017. Toward a taxonomy for multi-omics science? Terminology development for whole genome study approaches by omics technology and hierarchy. OMICS A Journal of Integrative Biology, 21, 1, doi: 10.1089/omi.2016.0144: 16 str. Ponce C., Torres M., Galleguillos C., Sovino H., Boric M.A., Fuentes A., Johnson M.C. 2009. Nuclear factor κB pathway and interleukin-6 are affected in eutopic endometrium of women with endometriosis. Reproduction, 137, 4: 727-737 Popovici R.M., Kao L.C., Giudice C.G. 2000. Discovery of new inducible genes in in vitro decidualized human endometrial stromal cells using microarray technology. Endocrinology, 141, 9: 3510-3513 Prašnikar E., Knez J., Kovačič B., Kunej T. 2020a. Molecular signature of eutopic endometrium in endometriosis based on the multi-omics integrative synthesis. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 37, 7: 1593-1611 Prašnikar E., Kunej T., Gorenjak M., Potočnik U., Kovačič B., Knez J. 2022. Transcriptomics of receptive endometrium in women with sonographic features of adenomyosis. Reproductive Biology and Endocrinology, 20, 1: 2, doi: 10.1186/s12958-021-00871-5: 16 str. Prašnikar E., Kunej T., Repnik K., Potočnik U., Knez J., Kovačič B. 2020b. Determining the molecular background of endometrial receptivity in adenomyosis. Biomolecules, 10, 9: 1311, doi:10.3390/biom10091311: 25 str. PubMed. 2021. Bethesda, National Library of Medicine. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ (20. dec.2021) Puente J.M., Fabris A., Patel J., Patel A., Cerrillo M., Requena A., Garcia-Velasco J.A. 2016. Adenomyosis in infertile women: prevalence and the role of 3D ultrasound as a marker of severity of the disease. Reproductive Biology and Endocrinology, 14, 1: 60, doi: 10.1186/s12958-016-0185-6: 9 str. Qi S., Zhao X., Li M., Zhang X., Lu Z., Yang C., Zhang C., Zhang H., Zhang N. 2015. Aberrant expression of Notch1/numb/snail signaling, an epithelial mesenchymal transition related pathway, in adenomyosis. Reproductive Biology and Endocrinology, 13, 96, doi: 10.1186/s12958-015-0084-2: 10 str. Qin X., Zhang H., Wang F., Xue J., Wen Z. 2012. Expression and possible role of interleukin-10 receptors in patients with adenomyosis. European Journal of Obstetrics and Gynecology, 161, 2: 194-198 Quenby S., Vince G., Farquharson R., Aplin J. 2002. Recurrent miscarriage: a defect in nature’s quality control? Human Reproduction, 17, 8: 1959-1963 Ren Y., Mu L., Ding X., Zheng W. 2010. Decreased expression of Beclin 1 in eutopic 141 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 endometrium of women with adenomyosis. Archives of Gynecology and Obstetrics, 282, 4: 401-406 Revel A. 2012. Defective endometrial receptivity. Fertility and Sterility, 97, 5: 1028-1032 Ruiz-Alonso M., Blese D., Diaz-Gimeno P., Gomez E., Fernandez-Sanchez M., Carranza F., Carrera J., Vilella F., Pellicer A., Simon C. 2013. The endometrial receptivity array for diagnosis and personalized embryo transfer as a treatment for patients with repeated implantation failure. Fertility and Sterility, 100, 3: 818-824 Saare M., Laisk T., Teder H., Paluoja P., Palta P., Koel M., Kirss F., Karro H., Sõritsa D., Salumets A., Krjutškov K., Peters M. 2019. A molecular tool for menstrual cycle phase dating of endometrial samples in endometriosis transcriptome studies. Biology of Reproduction, 101, 1: 1-3 Saare M., Peter M., Aints A., Laisk-Podar T., Salumets A., Altmäe S. 2017. OMICs studies and endometriosis biomarker identification. V: Biomarkers for endometriosis. D’Hooghe T. (ur.). Cham, Springer International Publishing: 227-258 Salim R., Riris S., Saab W., Abramov B., Khadum I., Serhal P. 2012. Adenomyosis reduces pregnancy rates in infertile women undergoing IVF. Reproductive BioMedicine Online, 25, 3: 273-277 Schwenke M., Knöfler M., Velicky P., Weimar C.H.E., Kruse M., Samalecos A., Wolf A., Macklon N.S., Bamberger A.M., Gellersen B. 2013. Control of human endometrial stromal cell motility by PDGF-BB, HB-EGF and trophoblast-secreted factors. PLoS ONE, 8, 1: e54336, doi: 10.1371/journal.pone.0054336: 14 str. Sebastian-Leon P., Garrido N., Remohí J., Pellicer A., Diaz-Gimeno P. 2018. Asynchronous and pathological windows of implantation: two causes of recurrent implantation failure. Human Reproduction, 33, 4: 626-635 Serafini P.C., Silva I.D.C.G., Smith G.D., Motta E.L.A., Rocha A.M., Baracat E.C. 2009. Endometrial claudin-4 and leukemia inhibitory factor are associated with assisted reproduction outcome. Reproductive Biology and Endocrinology, 7, 30, doi: 10.1186/1477-7827-7-30: 9 str. Shaked S., Jaffa A.J., Grisaru D., Elad D. 2015. Uterine peristalsis-induced stresses within the uterine wall may sprout adenomyosis. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology, 14, 3: 437-444 Shan K., Lian-Fu Z., Hui D., Wei G., Na W., Xia J., Yan L. 2006. Polymorphisms in the promoter regions of the matrix metalloproteinases-7, -9 and the risk of endometriosis and adenomyosis in China. Molecular Human Reproduction, 12, 1: 35-39 Shannon P., Markiel A., Ozier O., Baliga S.N., Wang T.J., Ramage D., Amin N., Schwikowski B., Ideker T. 2003. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research, 13, 11: 2498-2504 Sharma S., Bathwal S., Agarwal N., Chattopadhyay R., Saha I., Chakravarty B. 2019. Does presence of adenomyosis affect reproductive outcome in IVF cycles? A retrospective analysis of 973 patients. Reproductive BioMedicine Online, 38, 1: 13-21 Shen M., Liu X., Zhang H., Guo S.W. 2016. Transforming growth factor β1 signaling coincides with epithelial-mesenchymal transition and fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation in the development of adenomyosis in mice. Human Reproduction, 31, 2: 355-369 Shen X., Duan H., Wang S., Gan L., Xu Q., Li J.J. 2019. Decreased expression of cannabinoid receptors in the eutopic and ectopic endometrium of patients with adenomyosis. BioMed Research International, 2019, 5468954, doi: 142 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 10.1155/2019/5468954: 8 str. Sherman B.M., Korenman S.G. 1975. Hormonal characteristics of the human menstrual cycle throughout reproductive life. Journal of Clinical Investigation, 55, 4: 699-706 Shi B., Tu H., Sha L., Luo X., Wu W., Su Y., Yang S., Wang H. 2019. Upregulation of long noncoding RNA TUG1 by EGR1 promotes adenomyotic epithelial cell migration and invasion through recruiting EZH2 and suppressing TIMP2. Molecular Reproduction and Development, 86, 2: 239-247 Shi J.H., Jin L., Leng J.H., Lang J.H. 2016. Expression of potassium channels in uterine smooth muscle cells from patients with adenomyosis. Chinese Medical Journal, 129, 2: 200-205 Shi X.Y., Gu L., Chen J., Guo X.R., Shi Y.L. 2014. Downregulation of miR-183 inhibits apoptosis and enhances the invasive potential of endometrial stromal cells in endometriosis. International Journal of Molecular Medicine, 33, 1: 59-67 Shuya L.L., Menkhorst E.M., Yap J., Li P., Lane N., Dimitriadis E. 2011. Leukemia inhibitory factor enhances endometrial stromal cell decidualization in humans and mice. PLoS ONE, 6, 9: e25288, doi: 10.1371/journal.pone.0025288: 11 str. Sigurgeirsson B., Jemt A., Hanna A., Ujvari D., Westgren M., Lundeberg J., Gidlof S. 2017. Comprehensive RNA sequencing of healthy human endometrium at two time points of the menstrual cycle. Biology of Reproduction, 96, 1: 24-33 Simón C., Martín J.C., Pellicer A. 2000. Paracrine regulators of implantation. Bailliere’s Best Practice and Research in Clinical Obstetrics and Gynaecology, 14, 5: 815-826 Sotnikova N., Antsiferova I., Malyshkina A. 2002. Cytokine network of eutopic and ectopic endometrium in women with adenomyosis. American Journal of Reproductive Immunology, 47, 4: 251-255 Stanekova V., Woodman R.J., Tremellen K. 2018. The rate of euploid miscarriage is increased in te setting of adenomyosis. Human Reproduction Open, 2018, 3: hoy011, doi: 10.1093/cercor/bhw393: 8 str. Stephens A.N., Hannan N.J., Rainczuk A., Meehan K.L., Chen J., Nicholls P.K., Rombauts L.J.F., Stanton P.G., Robertson D.M., Salamonsen L.A. 2010. Post-translational modifications and protein-specific isoforms in endometriosis revealed by 2D DIGE. Journal of proteome research, 9, 5: 2438-2449 Strathy J.H., Molgaard C.A., Coulam C.B., Melton L.J. 1982. Endometriosis and infertility: a laparoscopic study of endometriosis among fertile and infertile women. Fertility and Sterility, 38, 6: 667-672 Streuli I., Santulli P., Chouzenoux S. 2015. Activation of the MAPK/ERK cell-signaling pathway in uterine smooth muscle cells of women with adenomyosis. Reproductive Sciences, 22, 12: 1549-1560 Suhorutshenko M., Kukushkina V., Velthut-Meikas A., Altmäe S., Peters M., Mägi R., Krjutškov K., Koel M., Codoñer F.M., Martinez-Blanch J.F., Vilella F., Simón C., Salumets A., Laisk T. 2018. Endometrial receptivity revisited: endometrial transcriptome adjusted for tissue cellular heterogeneity. Human Reproduction, 33, 11: 2074-2086 Swaim C.D., Scott A.D., Canadeo L.A., Huibregtse J.M. 2017. Extracellular ISG15 signals cytokine secretion through the LFA-1 integrin receptor. Mollecular Cell, 68, 3: 581-590.e5., doi: 10.1016/j.molcel.2017.10.003: 31 str. Szklarczyk D., Gable A.L., Lyon D., Junge A., Wyder S., Huerta-Cepas J., Simonovic M., Doncheva N.T., Morris J.H., Bork P., Jensen L.J., Von Mering C. 2019. STRING v11: protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional 143 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research, 47, D1: D607-D613 Takahashi K., Nagata H., Kitao M. 1989. Clinical usefulness of determination of estradiol level in the menstrual blood for patients with endometriosis. Acta obstetricia et gynecologica Japan, 41, 11: 1849-1850 Tamaresis J.S., Irwin J.C., Goldfien G.A., Rabban J.T., Burney R.O., Nezhat C., DePaolo L. V., Giudice L.C. 2014. Molecular classification of endometriosis and disease stage using high-dimensional genomic data. Endocrinology, 155, 12: 4986-4999 Tan J., Kan A., Hitkari J., Taylor B., Tallon N., Warraich G., Yuzpe A., Nakhuda G. 2018. The role of the endometrial receptivity array (ERA) in patients who have failed euploid embryo transfers. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 35, 4: 683-692 Tang F., Barbacioru C., Nordman E., Li B., Xu N., Bashkirov V.I., Lao K., Surani M.A. 2010. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols, 5, 3: 516-535 Thalluri V., Tremellen K.P. 2012. Ultrasound diagnosed adenomyosis has a negative impact on successful implantation following GnRH antagonist IVF treatment. Human Reproduction, 27, 12: 3487-3492 Thaxton J.E., Sharma S. 2010. Interleukin-10: a multi-faceted agent of pregnancy. American Journal of Reproductive Immunology, 63, 6: 482-491 The UniProt Consortium. 2019. UniProt: a worldwide hub of protein knowledge. Nucleic Acids Research, 47, D1: D506-D515. https://www.uniprot.org/ (10.8.2019) Tremellen K.P., Russell P. 2012. The distribution of immune cells and macrophages in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. II : adenomyosis and macrophages. Journal of Reproductive Immunology, 93, 1: 58-63 Tzfadia O., Diels T., De Meyer S., Vandepoele K., Aharoni A., Van de Peer Y.. 2016. CoExpNetViz: comparative co-expression networks construction and visualization tool. Frontiers in Plant Science, 6, 6: 1194, doi: 10.3389/fpls.2015.01194: 7 str. Ulukus E.C., Ulukus M., Seval Y., Zheng W., Arici A. 2005. Expression of interleukin-8 and monocyte chemotactic protein-1 in adenomyosis. Human Reproduction, 20, 10: 2958-2963 Ulukus M., Ulukus E.C., Seval Y., Cınar O., Zheng W., Arici A. 2006. Expression of interleukin-8 receptors in patients with adenomyosis. Fertility and Sterility, 85, 3: 714-720 Ulukus M., Ulukus E.C., Seval Y., Zheng W., Arici A. 2005. Expression of interleukin-8 receptors in endometriosis. Human Reproduction, 20, 3: 794-801 Van den Bosch T., Dueholm M., Leone F.P.G., Valentin L., Rasmussen C.K., Votino A., Van Schoubroeck D., Landolfo C., Installé A.J.F., Guerriero S., Exacoustos C., Gordts S., Benacerraf B., D’Hooghe T., De Moor B., Brölmann H., Goldstein S., Epstein E., Bourne T., Timmerman D. 2015. Terms, definitions and measurements to describe sonographic features of myometrium and uterine masses: a consensus opinion from the Morphological Uterus Sonographic Assessment (MUSA) group. Ultrasound in Obstetrics and Gynecology, 46, 3: 284-298 Vannuccini S., Tosti C., Carmona F., Huang S.J., Chapron C., Guo S.W., Petraglia F. 2017. Pathogenesis of adenomyosis: an update on molecular mechanisms. Reproductive BioMedicine Online, 35, 5: 592-601 Veenstra van Nieuwenhoven A.L., Heineman M.J., Faas M.M. 2003. The immunology of successful pregnancy. Human Reproduction Update, 9, 4: 347-357 144 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Vercellini P., Consonni D., Dridi D., Bracco B., Frattaruolo M.P., Somigliana E. 2014. Uterine adenomyosis and in vitro fertilization outcome: a systematic review and meta-analysis. Human Reproduction, 29, 5: 964-977 Von Wolff M.. 2000. Regulated expression of cytokines in human endometrium throughout the menstrual cycle: dysregulation in habitual abortion. Molecular Human Reproduction, 6, 7: 627-634 Walsh C.T., Garneau-Tsodikova S., Gatto G.J. 2005. Protein posttranslational modifications: the chemistry of proteome diversifications. Angewandte Chemie - International Edition, 44, 45: 7342-7372 Wang F., Li H., Yang Z., Du X., Cui M., Wen Z. 2009. Expression of interleukin-10 in patients with adenomyosis. Fertility and Sterility, 91, 5: 1681-1685 Wang F., Shi X., Qin X., Wen Z., Zhao X., Li C. 2015. Expression of CD56 in patients with adenomyosis and its correlation with dysmenorrhea. European Journal of Obstetrics and Gynecology, 194: 101-105 Wang F., Wen Z., Li H., Yang Z., Zhao X., Yao X. 2008. Human leukocyte antigen-G is expressed by the eutopic and ectopic endometrium of adenomyosis. Fertility and Sterility, 90, 5: 1599-1604 Wang J., Deng X., Yang Y., Yang X., Kong B., Chao L. 2016. Expression of GRIM-19 in adenomyosis and its possible role in pathogenesis. Fertility and Sterility, 105, 4: 1093-1101 Wang J., Huang C., Jiang R., Du Y., Zhou J., Jiang Y., Yan Q., Xing J., Hou X., Zhou J., Sun H., Yan G. 2018. Decreased endometrial IL-10 impairs endometrial receptivity by downregulating HOXA10 expression in women with adenomyosis. BioMed Research International, 2018, 2549789, doi: 10.1155/2018/2549789: 9 str. Wang Q., Wang L., Shao J., Wang Y., Jin L.P., Li D.J., Li M.Q. 2014. L-22 enhances the invasiveness of endometrial stromal cells of adenomyosis in an autocrine manner. International Journal of Clinical and Experimental Pathology, 7, 9: 5762-5771 Wang S., Duan H., Zhang Y., Sun F.Q. 2016. Abnormal activation of RhoA/ROCK-I signaling in junctional zone smooth muscle cells of patients with adenomyosis. Reproductive Sciences, 23, 3: 333-341 Wang Y., Duan H., Wang S., Quan Y., Huang J., Guo Z. 2021a. Talin1 induces epithelial-mesenchymal transition to facilitate endometrial cell migration and invasion in adenomyosis under the regulation of microRNA-145-5p. Reproductive Sciences, 28, 5: 1523-1539 Wang Y., Duan H., Wang S., Quan Y., Huang J., Guo Z. 2021b. Upregulated Talin1 synergistically boosts β-estradiol-induced proliferation and pro-angiogenesis of eutopic and ectopic endometrial stromal cells in adenomyosis. Reproductive Biology and Endocrinology, 19, 1: 70, doi: 10.1186/s12958-021-00756-7: 15 str. Wang Y., Li Y., Yang Z., Liu K., Wang D. 2015a. Genome-wide microarray analysis of long non-coding RNAs in eutopic secretory endometrium with endometriosis. Cellular Physiology and Biochemistry, 37, 6: 2231-2245 Wang Y., Liu J., Huang B., Xu Y., Li J., Huang L., Lin J., Zhang J., Min Q., Yang W., Wang X. 2015b. Mechanism of alternative splicing and its regulation. Biomedical Reports, 3, 2: 152-158 Wang Z., Gerstein M., Snyder M. 2009. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics, 10, 1: 57-63 Wilczyński J.R. 2005. Th1/Th2 cytokines balance - yin and yang of reproductive 145 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 immunology. European Journal of Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology, 122, 2: 136-143 Wilusz J.E., Sunwoo H., Spector D.L. 2009. Long noncoding RNAs: functional surprises from the RNA world. Genes and Development, 23, 13: 1494-1504 Wu X., Zuo W., Liu H., Wang Z., Xu C. 2019. Decreased expression of cell polarity protein Scribble correlated with altered subcellular localization of the Crumbs homologue 3 protein in human adenomyotic endometrial cells. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research, 45, 6: 1148-1159 Wyns C., Bergh C., Calhaz-Jorge C., De Geyter C., Kupka M.S., Motrenko T., Rugescu I., Smeenk J., Tandler-Schneider A., Vidakovic S., Goossens V. 2020. ART in Europe, 2016: results generated from European registries by ESHRE. Human Reproduction Open, 2020, 3: hoaa032, doi: 10.1093/hropen/hoaa032: 17 str. Xiang Y., Sun Y., Yang B., Yang Y., Zhang Y., Yu T., Huang H., Zhang J., Xu H. 2019. Transcriptome sequencing of adenomyosis eutopic endometrium: a new insight into its pathophysiology. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 23, 12: 8381-8391 Xiao Y., Li T., Xia E., Yang X., Sun X., Zhou Y. 2013. Expression of integrin ß3 and osteopontin in the eutopic endometrium of adenomyosis during the implantation window. European Journal of Obstetrics and Gynecology, 170, 2: 419-422 Xiao Y., Sun X., Yang X., Zhang J., Xue Q., Cai B., Zhou Y. 2010. Leukemia inhibitory factor is dysregulated in the endometrium and uterine flushing fluid of patients with adenomyosis during implantation window. Fertility and Sterility, 94, 1: 85-89 Xu X.Y., Zhang J., Qi Y.H., Kong M., Liu S.A., Hu J.J. 2018. Linc-ROR promotes endometrial cell proliferation by activating the PI3K-Akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences, 22, 8: 2218-2225 Xue J., Zhang H., Liu W., Liu M., Shi M., Wen Z., Li C. 2013. Metformin inhibits growth of eutopic stromal cells from adenomyotic endometrium via AMPK activation and subsequent inhibition of AKT phosphorylation: a possible role in the treatment of Adenomyosis. Reproduction, 146, 4: 397-406 Yan Q., Yan G., Zhang C., Wang Z., Huang C., Wang J., Zhou J., Liu Y., Ding L., Zhang Q., Zhen X., Jiang Y., Sun H. 2019. MiR-21 reverses impaired decidualization through modulation of KLF12 and NR4A1 expression in human endometrial stromal cells. Biology of Reproduction, 100, 5: 1395-1405 Yang B., Wang L., Wan X., Li Y., Yu X., Qin Y., Luo Y., Wang F., Huang O. 2017. Elevated plasma levels of lysophosphatidic acid and aberrant expression of lysophosphatidic acid receptors in adenomyosis. BMC Women’s Health, 17, 1: 118, doi: 10.1186/s12905-017-0474-z: 8 str. Yang J.H., Wu M.Y., Chen C.D., Chen M.J., Yang Y.S., Ho H.N. 2007. Altered apoptosis and proliferation in endometrial stromal cells of women with adenomyosis. Human Reproduction, 22, 4: 945-952 Yang J.H., Wu M.Y., Chen M.J., Chen S.U., Yang Y.S., Ho H.N. 2009. Increased matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 secretion but unaffected invasiveness of endometrial stromal cells in adenomyosis. Fertility and Sterility, 91, 5 Suppl: 2193-2198 Yang J., Wu M., Chang D., Chang C., Yang Y., Ho H. 2006. Increased interleukin-6 messenger RNA expression in macrophage-cocultured endometrial stromal cells in adenomyosis. American Journal of Reproductive Immunology, 55, 3: 181-187 Yang J.H., Chen M.J., Chen H.F., Lee T.H., Ho H.N., Yang Y.S. 2004. Decreased expression 146 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 of killer cell inhibitory receptors on natural killer cells in eutopic endometrium in women with adenomyosis. Human Reproduction, 19, 9: 1974-1978 Ye H., He Y., Wang J., Song T., Lan Z., Zhao Y., Xi M. 2016. Effect of matrix metalloproteinase promoter polymorphisms on endometriosis and adenomyosis risk: evidence from a meta-analysis. Journal of Genetics, 95, 3: 611-619 Yen C., Liao S., Huang S.J., Tabak S., Arcuri F., Lee C., Arici A., Petraglia F., Wang H., Kayisli U.A. 2016. Decreased endometrial expression of leukemia inhibitory factor receptor disrupts the STAT3 signaling in adenomyosis during the implantation window. Reproductive Sciences, 24, 8: 1176-1186 Yi K.W., Kim S.H., Ihm H.J., Oh Y.S., Chae H.D., Kim C.-H., Kang B.M. 2015. Increased expression of p21-activated kinase 4 in adenomyosis and its regulation of matrix metalloproteinase-2 and -9 in endometrial cells. Fertility and Sterility, 103, 4: 1089-1097.e2 Yu S.L., Kim T.H., Han Y.H., Kang Y., Jeong D.U., Lee D., Kang J., Park S.R. 2021. Transcriptomic analysis and competing endogenous RNA network in the human endometrium between proliferative and mid‑secretory phases. Experimental and Therapeutic Medicine, 21, 6: 660, doi: 10.3892/etm.2021.10092: 16 str. Zhai J., Li S., Sen S., Opoku-Anane J., Du Y., Chen Z.J., Giudice L.C. 2020a. m6A RNA methylation regulators contribute to eutopic endometrium and myometrium dysfunction in adenomyosis. Frontiers in Genetics, 11, 716, doi: 10.3389/fgene.2020.00716: 16 str. Zhai J., Vannuccini S., Petraglia F., Giudice L.C. 2020b. Adenomyosis: mechanisms and pathogenesis. Seminars in Reproductive Medicine, 38, 2–03: 129-143 Zhang D., Xia W., Tong T., Li C., Shi W., Yan M., Xue R., Guan X., Zhang J. 2016. Correlation between Cyr61 expression and clinicopathologic parameters in adenomyosis. Journal of Reproductive Immunology, 118: 42-49 Zhang W., Li Q., Liu H., Chen W., Zhang C., Li H., Lu X., Chen J., Li L., Wu H., Sun X. 2021. Transcriptomic analysis of endometrial receptivity for a genomic diagnostics model of Chinese women. Fertility and Sterility, 116, 1: 157-164 Zhang X., Lu B., Huang X., Xu H., Zhou C., Lin J. 2010. Innervation of endometrium and myometrium in women with painful adenomyosis and uterine fibroids. Fertility and Sterility, 94, 2: 730-737 Zhang Y., Yu P., Sun F., Li T.C., Cheng J.M., Duan H. 2015. Expression of oxytocin receptors in the uterine junctional zone in women with adenomyosis. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, 94, 4: 412-418 Zhao L., Zhou S., Zou L., Zhao X. 2013. The expression and functionality of stromal caveolin 1 in human adenomyosis. Human Reproduction, 28, 5: 1324-1338 Zhao S., Fung-Leung W.P., Bittner A., Ngo K., Liu X. 2014. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PLoS ONE, 9, 1: e78644, doi: 10.1371/journal.pone.0078644: 13 str. Zheng D., Duan H., Wang S., Xu Q., Gan L., Li J., Dong Q. 2018. FAK regulates epithelial-mesenchymal transition in adenomyosis. Molecular Medicine Reports, 18, 6: 5461-5472 Zhihong N., Yun F., Pinggui Z., Sulian Z., Zhang A. 2016. Cytokine profiling in the eutopic endometrium of adenomyosis during the implantation window after ovarian stimulation. Reproductive Sciences, 23, 1: 124-133 Zhou M., Fu J., Xiao L., Yang S., Song Y., Zhang X., Feng X., Sun H., Xu W., Huang W. 2016. MiR-196a overexpression activates the MEK/ERK signal and represses the progesterone receptor and decidualization in eutopic endometrium from women with 147 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 endometriosis. Human Reproduction, 31, 11: 2598-2608 Zhou S., Yi T., Liu R., Bian C., Qi X., He X., Wang K., Li J., Zhao X., Huang C., Wei Y. 2012. Proteomics identification of annexin A2 as a key mediator in the metastasis and proangiogenesis of endometrial cells in human adenomyosis. Molecular and Cellular Proteomics, 11, 7: M112.017988, doi: 10.1074/mcp.M112.017988: 24 str. Zhou W., Peng Z., Zhang C., Liu S., Zhang Y. 2018. ILK-induced epithelial-mesenchymal transition promotes the invasive phenotype in adenomyosis. Biochemical and Biophysical Research Communications, 497, 4: 950-956 148 Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovankah z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 ZAHVALA Doktorsko delo je financirala Javna agencija za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS) v okviru programa mladih raziskovalcev. Najlepše se zahvaljujem montorju dr. Borotu Kovačiču za priložnosti izobraževanja in pridobivanja izkušenj iz področja reproduktivne medicine ter nasvete pri raziskovalnem delu. Zahvaljujem se somentorici dr. Tanji Kunej za veliko pomoč pri bioinformacijskih analizah in pisanju člankov. Zahvaljujem se preiskovankam, ki so sodelovale v raziskavi. Zahvaljujem se Jasni Muršič za pomoč pri pridobivanju preiskovank in dr. Juretu Knezu za izvedbo ultrazvokov. Zahvaljujem se tudi ostalim sodelavcem Oddelka za reproduktivno medicino in ginekološko endokrinologijo Univerzitetnega kliničnega centra Maribor za pomoč pri delu in izmenjavi mnenj. Zahvaljujem se dr. Mariu Gorenjaku za analizo podatkov RNA-seq. Zahvaljujem se članom komisije za pregled doktorske naloge, konstruktivne predloge in za oceno ter zagovor doktorske disertacije. Zahvaljujem se domačim in prijateljem, ki ste me spodbujali pri delu. Predvsem pa se zahvaljujem Gašperju za neskončno razumevanje, podporo, strpnost in pomoč pri urejanju slik za članke. Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 PRILOGE Priloga A. Seti genov, uporabljeni v naši raziskavi Supplementary A. Used gene sets in our research. Skupina Vir (št. Geni genov) ADENOMIOZA Lastna TAS2R43, SCGB2A2, DLX3 ,LINC00645, ODAM, RAET1G, HORMAD1, AZGP1, MICA, UPK1B, OR1Q1, RBP7, DEFB1, (SS faza) analiza APOM, ATOH8, DEFB109A, CUTALP, SYN3, OR1J4, FOXD4L4, NYAP1, LOC642846, VSIG2, AMH, LINC00861, RNA-seq TMPRSS13, PDCD1, MIR3124, TRGC2, GZMK, ADAMTSL2, TRPC5, CCDC168, LIMS3-LOC440895, NECTIN4, MMP23A, (382 genov) ABHD12B, FAM138B, GLCCI1-DT, LINC00649, HSD17B3, MFSD4A-AS1, ZP1, PTGER1, ANGPTL5, MOCOS, CEP44, DNM1P46, DNAH5, PRSS30P, ADAMTS17, RASGEF1B, HSD17B2, ANKRD40CL, ZNF600, LCK, S1PR4, PROZ, TCAP, IRF6, ANKRD53, SGSM1, MIR151A, SLC26A8, ZNF578, FAM90A25P, BMP8B, H3-4, HYAL3, ALK, LOC400464, CHMP4C, ARSA, CNKSR3, C3orf52, SYNE3, ANOS1, LINC00921, RASGRP4, HTATIP2, RASEF, NGEF, ADAMTS5, ZNF486, TGM4, CDHR1, PRSS16, LINC02102, GABARAPL1, ZC3HAV1, INTS6-AS1, GABRR2, ZNF552, HSBP1L1, MFSD4A, ST7-AS1, TOP1P1, MPZL3, SH3GLB2, ANKRD18A, CCDC152, SERHL2, SLC43A2, CARD16, ABCA1, PDLIM5, LTBP2, EPOR, CACFD1, CD200, LTB4R, CD101, GSTZ1, TST, C5orf63, MPST, CERNA1, AGTPBP1, WDR82, RFLNB, ACSS2, IMPG2, PIK3CB, ZBTB11-AS1, SPTLC3, RNF19B, LINC00598, WDR91, DTX4, HEXA, HERC2P3, DND1, ABHD15, LOC541473, UBE2H, PNPLA8, MAGI3, RALBP1, QRICH2, TRMT10C, MIGA2, NPC1, ARAP2, ATP6V0E1, JOSD1, PPTC7, IL10RB, ATP2B1, CYREN, STXBP1, FAM131A, DCBLD1, SH3BP5-AS1, PINK1, AP5B1, SFT2D2, HPS6, LYST, TAOK1, ZNF234, ZNF417, MYLIP, ABITRAM, SIDT2, SNX25, SMYD2, ZNF267, APP, SMARCE1, PCNX2, GSTO1, PARP10, CCDC82, MSI2, UBE2E2, UBA7, MRPL1, IFI35, RBL1, SOCS2, RBPMS, CMC1, MTMR9LP, CPSF1, ADGRF3, DHX58, TMEM150C, B9D1, PPIC, PALLD, PDCD2L, EPM2A, EIF2AK2, LMO4, COL4A6, LY6E, ACOT7, TRIM14, RHOJ, FAM133CP, FAT1, CRYL1, CPVL, CDH24, GNAI1, SAMD9L, CARD10, RNF113B, CADM4, CD109, SLC15A3, CISD1, RFX2, TRIM22, PCDHA9, KRT7, ABCA17P, GRIN3A, YBEY, PXYLP1, COL21A1, KDM7A-DT, SETD9, RORB, SOCS2-AS1, PTPRVP, ATP1B2, BUB1B, GOLGA8T, PDE3A, CD209, CDH6, STAT1, FGD2, RUNDC3A, NPNT, PLS1, HERC2P2, FGFR4, ADAMTSL1, ALPK3, PLXNB3, RTP4, IFITM1, ADGRL4, ACP5, RNASE6, BICC1, SUSD2, C9orf116, INKA1, CEACAM19, STK32B, DCDC2, RGL1, PPM1J, SLC46A3, CLEC7A, KCTD14, AK5, CYBB, LOC729970, LOC100134317, MIR548S, MYO7B, FGL2, SPEG, RNF144A-AS1, PPP1R27, SCAMP5, SOD3, FAM81A, MLKL, SKA3, SLC2A3, RAB39A, POTEJ, PLEKHA6, MCF2L-AS1, LAMP3, TNNI1, BGN, RNASE1, ISG15, LINC00958, FAT2, LOC644135, ZNF215, MIR181A2, FAM86B3P, CYGB, GBGT1, se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge A Skupina Vir (št. Geni genov) ADENOMIOZA Lastna MYH11, SCIN, FCGR1CP, MALRD1, XG, FSD1, RELN, CCER2, SLC7A11-AS1, TMEM71, HBB, TBXAS1, C12orf75, (SS faza) analiza GNRHR, CDH15, FOXC1, HTR1D, ANO4, ULK4P3, PPARGC1A, TMPRSS3, SLC7A11, FUT3, ATP2C2, ERN2, GNG10, RNA-seq BCRP3, PLEKHS1, SLC14A1, IHH, OAS3, THSD7A, BST2, KLHL14, SELL, WFDC1, NOSTRIN, ERC2, RGS7BP, IFIT1, (382 genov) CCDC198, RASL10A, CD1C, MX1, ZDHHC8P1, TCEAL5, MUC13, TLR10, PDE1C, COL26A1, AMIGO1, TRPM8, ACVR1C, KAAG1, SHISA3, CHRNA7, ASAH2, TMEM119, DOK5, OAS2, CES5AP1, SLC2A5, ANKS1B, LOC200772, LIPH, MYOM3, TMPRSS11D, SIGLEC5, OGDHL, FILIP1, CNTNAP3B, TSPAN33, MRPS30-DT, SLC4A10, SOHLH2, PLG, IFI44L, FLJ22447, SEMA3E, TSPAN8, CHL1, CNTNAP3, CADM3-AS1, MUC5B, PTPRZ1, KLK10, CES1P1, DRAIC, TMEM252, CYP4F30P. ADENOMIOZA Literatura AKR1B10, ATP12A, ATP1A2, C15orf62, C3orf33, CACNA1E, CDKN3, CHD5, CLDN4, COL11A1, COL8A1, CYP3A7, (SS faza) (42 genov) ERCC6L, FNDC1, GPR78, HOXA10, IL10, ITGB3, KCNA4, KLF12, LIF, LIFR, LIPH, LTF, MB, MIR21, MMP20, NR4A1, PSG6, SCGB2A2, SPC25, SPINK2, SPP1, SST, STAT3, SULT1E1, TBX15, TCN1, TMEM190, TMPRSS11B, TUBAL3, ZNF295-AS1. ENDOMTERIOZA Literatura ABCB11, ABCC3, ACKR1, ACO2, ADGRF1, AFF4, AGT, AIMP1, ALPI, AMY1A, AMY2A, AMY2B, ANXA2, ANXA5, AOC1, (SS faza) (173 genov) ATF3, BST2, C1QA, C1QTNF6, CA1, CA12, CASP5, CCBE1, CCL3, CCL3L1, CCL3L3, CCL8, CCN1, CCT8, CDA, CDK5R1, CELF1, COL12A1, CORO1B, CRABP1, CRISP3, CST7, CTSW, CWH43, CXCL2, CYP3A5, DDIT4L, DDX17, DEPP1, DLG5, DNAJC3, DST, EDNRB, EGR1, EGR2, EGR3, EIF1, EIF4A1, EIF4A2, ENPP3, FMN2, FOS, FOSB, GALP, GSN, GUCY1B1, GZMA, HACD1, HOXA9, HPCAL4, HSP90B1, FNA21, IL6, IMMT, JUNB, KCNK2, KRIT1, KRT18, KRT5, KRTAP19-2, LAMA3, LCK, LONRF2, LPP, LRRD1, LTB4R2, LUZP1, MALL, MAP4, MAPK8, MET, MIR135A1, MIR138-1, MIR138-2, MIR1915, MIR194-2, MIR196A1, MIR196A2, MIR219B, MIR22, MIR26B, MIR3196, MIR339, MIR365B, MIR3686, MIR374B, MIR4251, MIR4252, MIR4254, MIR4425, MIR4723, MIR505, MIR542, MIR548AA2, MIR548AP, MIR548T, MIR5585, MIR921, MMP26, MUC7, MYL12A, NCR1, NEAT1, NFAT5, NR4A1, NR4A3, PAX8, PCSK5, PCYOX1, PDHB, PER1, PITX1, PLEK, PLEKHA2, POMZP3, PRDX6, PRIM2, PRRC2C, PTAFR, RAB9BP1, RBBP4, RGS1, RIF1, RIN1, RNF150, RNH1, RSRP1, S100A3, S100A8, SAP30L, SCG2, SCGB2A2, SEMA3C, SERPINB8, SHB, SLA, SLC15A4, SLC1A1, SLC44A2, SMG1, SOCS3, SON, SP3P, TAF6L, TGFB3, THRAP3, TRIM15, TRPM6, TUBA1C, VDAC1P1, VEGFA, VHL, VIM, YBX1, YBX1P2, YWHAE, ZFP36, ZIC2. ZDRAVA Literatura ABCC3, ACADSB, ADAMTS1, ALPL, AMIGO2, ANG, ANO1, ANXA2, ANXA4, AOX1, APOD, ARG2, ARID5B, ASPM, MATERNICA (151 genov) ATP1B1, ATP6V0E2, ATP6V1A, BARD1, BCL6, BUB1B, C1R, C4BPA, CAPN6, CATSPERB, CCNB2, CDA, CDC20, CDK1, CENPE, CEP55, CFD, CLDN4, CLU, COL16A1, COMP, CP, CRABP2, CSRP2, CTNNA2, CXCL13, CXCL14, DDX52, DEFB1, DEPP1, DEPTOR, DKK1, DLGAP5, DPP4, DYNLT3, ECI2, ECM1, EDN3, EDNRB, EFNA1, ENPEP, EPHB3, se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge A Skupina Vir (št. Geni genov) ZDRAVA Literatura FANCI, FOSL2, FXYD2, G0S2, GABARAPL1, GADD45A, GALNT12, GALNT4, GAS1, GAST, GBP2, GDF15, GPX3, MATERNICA (151 genov) GREM2, HABP2, HEY2, HLA-DOB, HPSE, ID4 , IDO1, IL15, IMPA2, KCNG1, KIF11, KIF20A, KIF4A, KMO, KRT7, LAMB3, LIF, LMCD1, LMOD1, LRRC17, LYPD3, MAOA, MAP2K6, MFAP2, MFAP5, MMP26, MPPED2, MSX1, MT1G, MT1H, MT2A, MTCL1, NDC80, NDRG1, NDRG2, NNMT, NRG2, OLFM1, OLFM4, PAEP, PAQR4, PBK, PENK, PLA1A, PLAAT3, PLAAT4, PMEPA1, POLD4, POSTN, PRC1, PRKCQ, PRR15L, PRUNE2, PTPRR, RASSF2, RETREG1, RNASE4, RPRM, S100A1, S100A4, S100P, SCGB2A2, SERPINA5, SERPING1, SFRP4, SLC1A1, SNX10, SOD2, SORD, SOX17, SPDEF, SPP1, SYNE2, TACC3, TAGLN, TBC1D2, TCN1, THBD, TMSB15A, TOP2A, TRH, TSPAN8. ZDRAVA Poti ACF, MMP2, CGI-38, ITGB4, DDR1, PPARD, PCSK5, TGFBR2, HMX3, ACOD1, H3F3B, MST1, EPO, STC2, RECK, SOD1, MATERNICA vgenzdnje CALCA, IL1B, UBTFL1, SPP1, SCGB1A1, MMP9, LIF, PRLR, FBLN1, PTGS2, BSG, RPL29, STC1, EMP2, H3-3A, FKBP4, zarodka in FUT7, TRO, TRIM28, TEAD4, IGFBP7, UBE2Q1, VMP1, TPPP3, PRDM14, POLR1B, A1CF, HEL-S-44, MIR21, CTSB, PTN, deciduali-CITED2, GJB2, MEN1, CYP27B1, DEDD, VDR, JUNB, EPOR, NDP, TCF23, GHSR, ASH1L, GHRL. zacija zbirke GO (60 genov) ADENOMIOZA Literatura: CYP19A1, CD3, CD4, CD8, CD68, VEGFA, HDAC1, HDAC3, DNMT3A, METTL3, YTHDC1, PTK2, SNAI1, SNAI2, TWIST1, (P faza) raziskave CDH1, VIM, CDH2, SCRIB, TLN1, MIR145, DDT, MMP2, MMP9, F3, UCHL1, BCL2, NDUFA13, IGF1, FST, ACVR2A, kandidat-nih ACVR2B, LINC-ROR, TLR4, IL6, IL1B, CRH, IL10RA, IL37, CXCL8, TLR1, TLR6, TLR8, TLR9, CXCR1, CXCR2, PTGS2, lokusov PI3K, AKT, CNR1, CNR2, RELA, NFKB1, PAK4, NFKBIA, NFKB2, DUSP6, SPRY4, SEF, NFE2L2, ROCK1, ROCK2, RHOA, (78 genov) ARHGAP26, NOS3, SOD1, GPXs, XDH, CAT, HLA-G, NKB1, GL182, HSPB1, ITGA2, ITGA6, CDH1, ESR2, PGR. ADENOMIOZA Literatura: LOC100293539, SNORD116-5, SNORD116-7, SNORD116-3, SNORD116-9, ND2, SNORD116-8, SNRPN, RPL13A, SNHG3, (P faza) transkript- GP1BB, SNORD116-4, SNORD33, SNORA73A, SNORD41, SNORD116-1, YIPF4, DUX4L4, DUX4L6, DUX4L5, DUX4L3, omske DUX4L7, DUX4L2, RFC1, GP1BB, SNORD95, DUX2 SIAE, DUX4L7, DUX4, DUX2, GNB2L1, KRTAP5-1, PLCL1, TAP2, raziskave HLA-DOB, KRTAP5-1, MIR339, ZBTB34 , CXorf18, LOC100132147, SIAE, MIR326, MIR19 , SNORD55, LOC440518, (518 genov) MIR139, C2orf27B, HOXA11, UQCRQ, RPL35, FAM58B, POU5F1B, VHL, PGM5P2, ZNRF2, EIF3K, GDF9, TYMS, TGFBI, RPN2, ATP5I, SNRPF, ADAM12, GLIPR1, RPL38, HSPA5, EEF1A2, NDUFAB1, RPS19, UQCR11, GSTP1, C4orf46, TOMM7, C11orf10, MYL5, MT2A, KRR1, CALR, CD74, ECM1, UBE2J2, COX7C, TNC, PFDN5, RPS12, SCD, VIM, NUCKS1, POM121, RBP7, RPLP0, NDUFA1, SNORA33, VCAN, RPS25, RPS15A, RPS28, POM121C, RPS28, MMP7, GJA1, RNF113A, RBP1, RNASEK, SEC61G, RPL27, COX6C, RPL41, ZNF778, n342839, n336615, TCONS_l2_00002951, n338918, se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge A Skupina Vir (št. Geni genov) ADENOMIOZA Literatura: n335251, n410159, n339991, n387706, n335092, n333546, THBS2, PRUNE2, HSPB1, COL4A1, SVIL, A2M, ITGA1, CD44, (P faza) transkript- RERG, MATN2, n333955, TCONS_l2_00013366, NR_002960, TCONS_00022823, n338909, n386477, n4541, n337373, omske n335557, n334090, HBA1, KIAA1210, HIST1H2AB, HBB, HBA2, GZMA, HIST1H3F, HIST1H3B, KLRB1, CACNA1D, raziskave CPSF1, LTF, MSRB3, ELK2AP, TAC4, MZB1, IGLL1/IGLL5, JCHAIN, S100A9, SPIB, POU2AF1, SHISA9, S1PR4, ITGB2, (518 genov) LOC101929567, GCHFR, LOC389033, TMEM160, F12, CIB2, GMFG, BIRC5, ABCC9, TMEM121, VAV1, TNNC1, CHCHD5, SCNN1B, LINC00506, GNLY, TMEM238, PLAC9, FUOM, CDCA5, DIO2, CYBB, SLC16A13, AP2S1, EXOSC4, GJA4, NDUFS6, POC1A, C1QTNF6, SDSL, MRPL27, NUDT18, NTHL1, FBXW9, CDT1, SPC25, ALKBH7, CD14, IFI27L2, VPS18, FAM207A, PTGS1, CORO1A, CDCA2, E2F2, SAC3D1, CKS1B, PMVK, MRPS34, MFSD5, CD7, CDKN2AIPNL, PEX11G, DPT, MRPL54, OPHN1, MRPL37, NUDT1, GPATCH3, C1QA, POLA2, RPL39L, FCGR3A/FCGR3B, ISOC2, RNF187, POLD2, EIF4EBP1, NDP, GPATCH4, CLPP, COMTD1, CDC20, SF3B5, NKG7, ZNF775, MFSD3, GPAA1, HN1, PLEKHJ1, FEN1, PYCARD, C1orf122, DCTPP1, ZNHIT2, APEH, CCNB2, USP5, ACP5, TMEM37, SDF2L1, NDUFB7, CCDC167, RRM1, S100A4, SDHAF1, BORCS6, MRPL14, VSTM4, CHMP6, B3GALT6, TIMM22 IFNGR1, RAB5A, DUSP6, RHOB, SEC31B, CLDN4, R3HDM2, SRF, MESDC1, RGL3, RNF19A, TOM1L2, PAN3, PPP1R10, LIMS3/LIMS4, NFKBID, MICAL3, WWC3, DENND4B, FAM189A2, NFKB2, SLC2A1, NRBP2, ULK3, RRN3P1, USP54, TP53INP2, PXDC1, ZSWIM6, TGIF1, KDM3A, HERC2P2, LINC00174, PDXDC2P, SLC38A2, SHANK3, TIPARP, SNX9, CNKSR1, NAMPT, RALGDS, TMCO4, SS18L1, CSF1, CLK3, MIDN, mir-8, DLC1, CELSR1, IER5, POFUT2, SUN1, SEMA3B, ERF, CAPN15, CHKA, TRIO, AGAP6 , BAG3, FHL1, MCL1, AGER, MTMR11, ZNF558, KIAA1683, AASS, CACNA1H, ZNF331, PDGFB, ZFAND5, ELMSAN1, INPP5E, VPS37B, IRS2, WEE1, IFRD1, SULT4A1, ZNF83, ITGA7, KLF5, KMT5C, TWIST1, PLA2G6, CLK1, RNF122, LLGL2, PPP1R15B, CEBPB, LOC729218, ATXN7L2, GABARAPL1, RFX2, SPRY4, DLL1, FRMD4B, TSC22D2, VEGFA, ENO2, F3, UGCG, JUN, LRP5L, ZFYVE28, CELF6, MZF1, COL4A5, ESM1, KSR1, MTRNR2L8, RGCC, CCNL1, ARID5A, ITPRIP, HERC2P9, TSPYL2, GBP1, PLIN5, FAM179A, EPHA2, ABCG1, NRP2, SPRY1, INSIG1, EPOR, BCL3, ETS2, SERTAD1, DNAJB4, NFATC2, CTGF, NCOA7, KLF2, EFNA1, COL6A4P2, RAP2C, VWA3A, SLC22A3, ANXA1, ADM, HBEGF, THBD, GADD45A, RGS1, C2CD4B, THBS1, GPRC5A, DGKD, CCDC40, RND3, BTG1, PPP1R12B, CHRD, PFKFB3, PLAUR, PIM1, JUNB, NFATC1, CACNA1C, ITPKC, MXD1, PAK3, RGS2, CAPN6, RGS16, PER2, DNAJB1, MYADM, CD69, C8orf4, NFKBIA, LINC00893, HPX ,TMEM184A, NPIPB4, CYR61, SLC2A3, DUSP1, GLIS1, ELF3, BCL6, KLF4, PTGIS, DUSP2, BRINP1, CD55, CES4A, LDLR, LOC102724428/SIK1, ELN, LOC100133331, ZC3H12A, GATA6, LOC613037, CD83, SGK1, ADAMTS8, mir-132, PMAIP1, ERRFI1, PIM3, PPP1R15A, USP43, KLF6, CEBPD, IER3, ADAMTS1, OVOL1, PLK3, TNFRSF12A, mir-614, BHLHE40, NR4A2, PHLDA2, DUSP5, LGI2, EGR2, CMYA5, CSRNP1, EDN2, DKK1, HSPB7, NR4A3, POU5F1, LIF, EMP1, GADD45B, FOSB, RERG, CNN1, SOX9, PER1, PRELP, SCGB3A1, TRIB1, JPH2, SOCS3, TNFAIP3, MAFF, ATF3, C11orf96, TNFAIP8L3, ZFP36, NR4A1, EGR3, FOSL1, DUOXA1, PDE4C, CXCL2, NFASC, SERPINE1, WHRN, PDLIM3, CYP3A5, GEM, IL1RL1, ARC, SELE, REXO1. Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 Priloga B. Pregled molekularnih raziskav, povezanih z adenomiozo. Raziskave smo razvrstili glede na preiskovani mehanizem, povezan s patogenezo/patofiziologijo adenomioze. Zbrali smo tudi transkriptomske raziskave EvEA. Poimenovanje genetskih lokusov smo poenotili po zbirki HGNC. Referenčna literatura, označena s krepko, se navezuje na vključene raziskave v identifikacijo močnejših kandidatnih genov patofiziologije oz. spremenjene endometrijske receptivnosti pri adenomiozi. Uporabljene kratice: EvEA = evtopični endometrij pri adenomiozi; EkEA = ektopični endometrij pri adenomiozi; K = kontrolni endometrij iz maternice brez adenomioze; EEC = endometrijske epitelijske celice; ESC = endometrijske stromalne celice; P = proliferacijska faza; ZP = zgodnja proliferacijska faza; SP = srednja proliferacijska faza; PS = pozna proliferacijska faza; S = sekrecijska faza, ZS = zgodnja sekrecijska faza, SS = srednja sekrecijska faza, PS = pozna sekrecijska faza; E2 = estradiol; P4 = progesteron; TIAR = proces poškodbe in celjenja tkiva; EMT = prehod iz epitelijskih v mezenhimske celice; uNK = maternične celice naravne ubijalke. Supplementary B. The overview of molecular studies associated with adenomyosis. The studies were sorted according to the observed mechanism associated with the pathogenesis/pathophysiology of adenomyosis. We also gathered transcriptomics studies of EvEA. The nomenclature of genetic loci was adopted according to the HGNC database. Reference literature highlighted in bold refers to research included in the identification of stronger candidate genes for pathophysiology or altered endometrial receptivity in adenomyosis. Used abbreviations: EvEA = eutopic endometrium of adenomyosis; EkEA = ectopic endometrium of adenomyosis; K = control endometrium from nonadenomyosis uteri; EEC = endometrial epithelial cells; ESC = endometrial stromal cells; P = the proliferative phase; ZP= the early proliferative phase; SP = the mid proliferative phase; PS = the late proliferative phase; S = the secretory phase; ZS = the early secretory phase; SS = the mid secretory phase; PS = the late secretory phase; PS = the late secretory phase; E2 = estradiol; P4 = progesterone; TIAR = tissue injury and repair; EMT = epithelial-to-mesenchymal transition; uNK = uterine natural killer. Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 1. Sprožilci/dejavniki adenomioze Lokalna (Takahashi in ↑ E2 v menstrualni krvi žensk z A proti K. proizvodnja in sod., 1989) spremenjen metabolizem E2 v maternici se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 1. Sprožilci/dejavniki adenomioze Lokalna (Kitawaki in ↑ CYP19A1 (encim, ki katalizira pretvorbo steroidov v estrogene) in protein v žlezah epitelija EvEA in EkEA proti K (brez proizvodnja in sod., 1997) navedene faze ciklusa ob vzorčenju). spremenjen (Hatok in ↑ CYP19A1 v EvEA žensk s hudo obliko bolezni proti K, pridobljenih v ZP fazi. metabolizem E2 v sod., 2011) maternici (Maia in sod., ↑ CYP19A1 v stromi EvEA proti EkEA, pridobljenih v P in S fazah → zvišana aktivnost CYP19A1 pri A bi lahko vplivala na 2006) stalno izražanje PTGS2 v S fazi. (Kitawaki in ↑ HSD17B2 (pretvarja E2 v biološko manj aktiven estron) v EvEA proti K, pridobljenih v S fazi → metabolizem E2 je sod., 2000) spremenjen pri ženskah z A. Hiperperistaltika (Leyendecker Hiperperistaltika je glavni mehanizem samotravmatizacije maternice pri A, ki vodi v lokalno vnetje in proliferacijo bazalnega maternice in sod., 2015) endometrija (slikanje maternice z MRI). (Zhang in ↑ OXTR (receptor za oksitocin) v notranjem miometriju fundusa maternice pri A proti K, pridobljenih v P in S fazah. sod., 2015) (Shi in sod., ↑ KCNMA1 (angl. calcium-activated potassium channel subunit alpha 1. K+ kanalčki, ki sodelujejo pri krčenju miometrija) in 2016) KCND2 (angl. potassium voltage-gated channel subfamily D member 3) v celicah gladkega mišičja miometrija A proti K. (Wang S. in ↑ ROCK1 (protein kinaza, ki ima med drugimi tudi vlogo pri krčenju gladkih mišic) v notranjem miometriju pri A proti K, sod., 2016) pridobljenih v P in S fazah. Brez sprememb v stopnji izražanja ROCK1 tekom menstruacijskega ciklusa pri A (pri K višje izražanje v P, kot pa v S fazi); ↑ ROCK1, RHOA in MYL (angl. myosin light chain (ni navedene podenote)) v kulturi celic gladkega mišičja miometrija A proti K po 24-urnem gojenju z E2 → E2 bi lahko preko ↑ signalne poti RHOA/ROCK1 vplival na krčenje notranjega miometrija pri A. Kronično (Ibrahim in ↑ znaki TIAR pri A proti K: nejasna meja med bazalnim endometrijem in notranjim miometrijem; spremenjena orientiranost poškodovanje in sod., 2015) gladkih mišičnih vlaken notranjega miometrija in prisotnost celic gladkega mišičja znotraj strome bazalnega endometrija celjenje (barvanje preparatov histerektomije po Van Gieson). notranjega (Ibrahim in ↑ ACTA2 (angl. actin, aortic smooth muscle: molekularni označevalec miofibroblastov, ki nakazujejo mikropoškodbo tkiva) in miometrija sod., 2017) kolagen 1 (ni navedene natančne podenote) v notranjem miometriju pri A proti K. (mehanizem TIAR) se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 1. Sprožilci/dejavniki adenomioze Kronično (Shaked in ↑ stopnja stresa v notranjem miometriju A pri zvišani aplitudi znotrajmaterničnih pritiskov (uporaba programske opreme z poškodovanje in sod., 2015) dvodimenzionalnim (2D) modelom maternične stene, ki je bila izpostavljena različnim frekvencam pritiskov) → ↑ stres zaradi ↑ celjenje krčenja maternice lahko vodi v poškodbo celic notranjega miometrija, s tem pa aktivacijo mehanizmov TIAR in tvorbo lezij. notranjega miometrija (mehanizem TIAR) Kopičenje (Bulmer in ↑ število znotrajepitelnih T celic (levkociti CD3+) v P fazi EvEA in EkEA proti K; imunskih celic na sod., 1998) ↑ število levkocitov CD43+ v P in ES fazi EkEA proti EvEA. mestu poškodb (Ota in sod., ↑ število podtipov T celic v stromi EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah: miometrija in v 1996) - ↑ podtip gama delta (γδ) T celic (prepoznavajo antigene in proteine vročinskega šoka s čimer aktivirajo vnetne reakcije in EvEA migracijo makrofagov ter T celic); - ↑ podtip αβ T celic; - ↑ CD4+ T celic; - ↑ CD3+ T celic; - ↑ CD8+ T celic; - ↑ makrofagov. ↑ izražanje antigenov HLA, ki se nahajajo na antigen predstavitvenih celicah (HLA-ABC in HLA-DR, ki se povezuje s CD8 oz. CD4 molekulami na T celicah), in ↑ ICAM1 (adhezijski protein z vlogo pri tvorbi histokompatibilnega kompleksa) v P in S fazi žlez EkEA proti EvEA in K. (An in sod., ↑ število makrofagov (CD68+) v EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah; 2017) ↑ CCL2 (kemokin, ki ↑ kemotakso in aktivacijo mononuklearnih fagocitov) in ↑ agregacija makrofagov v kulturi EECs iz EvEA in EkEA proti K; Polarizacija makrofagov v tip M2, ki spodbujajo obnovitev tkiva (↑ CD163, IL10 in MMP12 ter ↓ MMP9 v A proti K) ob gojenju z Ishikawa celicami ( in vitro model A) ali s kulturo EEC iz EvEA → makrofagi lahko pri A sprožijo procese EMT. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 1. Sprožilci/dejavniki adenomioze Kopičenje (Tremellen ↑ gostota infiltriranih makrofagov (CD163+) in celic naravnih ubijalk (CD56+) v LS fazi v stromi EvEA hude oblike bolezni imunskih celic na and Russell, vs. K → imunološki mehanizmi bi lahko motili uspešno vgnezditev zarodka pri A. mestu poškodb 2012) miometrija in v (Zhihong in ↑ število makrofagov (CD68+) v epiteliju in stromi EvEA vs. K sedmi dan po injiciranju humanega horionskega gonadotropina EvEA sod., 2016) (hCG) v procesu kontrolirane stimulacije jajčnikov → ↑ delovanje E2 v EvEA lahko vodi v ↑ vnetnih citokinov in dalje ↑ gostoto makrofagov v EvEA. Hipoksija (Goteri in ↑ HIF1A (angl. hypoxia-inducible factor 1-alpha. Prepisovalni dejavnik, ki se veže na DNA odzivne elemente hipoksije in sod., 2009) aktivira VEGFA) in VEGFA v epiteliju EkEA proti EvEA in K, pridobljenih v P in S fazi; ↑ gostota malih žilic (angl. microvascular density, MDV = žile/mm2) v EkEA proti EvEA in K → hipoksija izzove izražanje VEGFA in tvorbo novih žil (angiogenezo) v EkEA. Somatske mutacije (Inoue in sod., Mutacije onkogena KRAS v EkEA in EvEA (sekvenciranje celotnega eksoma) → mutiran KRAS ↑ invazivnost in proliferacijo 2019) endometrijskih celic na ektopičnem mestu. (Oehler in Mutacije ESR1 v EkEA; sod., 2004) ↓ zmožnost vezave mutiranega ESR1 na DNA (in vitro test vezave na DNA) in ↓ transaktivacijska sposobnost (in vitro test prehodne transfekcije) →↓ odzivnost na estrogene Epigenetske (Liu in sod., ↑ izražanje HDAC1 (angl. histone deacetylase 1. Uravnava deacetilacijo histonov) in HDAC3 v EkEA in EvEA proti K, spremembe 2012) pridobljenih v P in S fazah; ↑ HDAC2 v EkEA proti EvEA in K; ↑ HDAC2 v EvEA značilno pozitivno (dalje poz.) povezano s stopnjo dismenoreje. (Liu in Guo, ↑ izražanje DNMT1 (angl. DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1. Uravnava metilacijo po podvojevanju DNA) in DNMT3B v 2012) EkEA proti EvEA in K, pridobljenih v P in S fazi; ↓ DNMT3A v EkEA in EvEA proti K; ↑ DNMT1 EvEA značilno poz. povezano s hudo menstrualno krvavitvijo; ↑ DNMT3B v EkEA značilno poz. povezano s stopnjo dismenoreje. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 1. Sprožilci/dejavniki adenomioze Epigenetske (Nie in sod., ↑ metilacija (hipermetilacija) promotorja izooblike B PGR v kulturi ESC iz EkEA proti K, pridobljenih v P in S fazi. spremembe 2010a) (Zhai in sod., ↓ delež N6-metiladenozina (m6A: uravnavajo nukleacijo, alternativno izrezovanje, translacijo in stabilnost molekul mRNA) v 2020a) totalni RNA EvEA proti K, pridobljenih v P fazi; ↓ izražanje m6A regulatorjev RNA metilacije ( METTL3 in protein ter YTHDC1) v P fazi v EvEA proti K → spremenjeno izražanje regulatorjev m6A RNA metilacije bi lahko bili vključeni v patogenezo A. Polimorfizmi (Ye in sod., Polimorfizem -1607 1G/2G gena MMP1 ↑ nagnjenosti za razvoj A . 2016) (Shan in sod., Alel G polimorfizma -181A/G MMP7 ↑ nagnjenost za razvoj A . 2006) (Kang in sod., Genotipa G/G polimorfizma -1154G/A in C/C polimorfizma -2578C/A gena VEGF ↑ nagnjenost za razvoj A. 2009) (Huang P.C. Ničelni genotip (ni navedene specifične lokacije) GSTM1 (angl. glutathione S-transferase Mu 1. Encim detoksifikacije) in in sod., 2010) izpostavljenost ftalatom ↑ nagnjenost za razvoj A. 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Aktivacija procesa prehoda epitelija v mezenhim (EMT) Proces EMT poteka v več korakih: Izguba izražanja (Zheng in ↑ PTK2 in pripadajoči protein (angl. focal adhesion kinase 1. Omogoča prenos celičnega signala integrinov in drugih označevalcev za sod., 2018) površinskih receptorjev. Sodeluje pri regulaciji celične adhezije, migracije, proliferacije in preživetja), SNAI1, SNAI2, TWIST1 epitelijske celice in v EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah; pridobitev izražanja ↓ CDH1 in protein in ↑ VIM in protein ter CDH2 (staro ime N-kaderin) v P in S fazi EvEA proti K; mezenhimskih ↓ zmožnost migracije (in vitro test migracije Transwell) kulture celic EvEA po utišanju PTK2 z malo interferenčno RNA ( PTK2-siRNA) → ↓ VIM, SNAI1, SNAI2, TWIST1, CDH2, PI3K in AKT ter ↑ CDH1 pri A proti negativna K → signalna pot označevalcev PTK2/PI3K/AKT v EvEA bi lahko vplivala na izražanje molekul, ki sodelujejo v procesu EMT. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Aktivacija procesa prehoda epitelija v mezenhim (EMT) Proces EMT poteka v več korakih: Izguba izražanja (Mu in sod., ↑ PTK2 in protein v EvEA proti K (ni navedene faze ciklusa ob vzorčenju) → značilna poz. povezava med stopnjo izražanja označevalcev za 2015) PTK2 in dismenorejo ter bolečinami v predelu medenice pri A. epitelijske celice in (Chen in sod., ↑ VIM in ↓ CDH1 v epiteliju EkEA proti EvEA in K, pridobljenih v ZP in S fazah → značilna negativna (neg.) povezava med pridobitev 2010) serumskimi vrednostni E2 in izražanjem CDH1 v EkEA in EvEA → E2 sproži EMT v endometrijskih celicah → A; izražanja ↑ morfološke spremembe endometrijskih epitelijskih celic v celice, podobne fibroblastom, po 24-urnem gojenju ESR+ mezenhimskih Ishikawa celic z E2 → ↑ migracija in invazija (in vitro test s Boydenovimi komorami) ter ↓ CDH1 in ↑ SNAI2, VIM in CDH2. označevalcev Razvoj A pri SCID miših 21. dan po ksenotransplantaciji humanega EvEA ali EkEA, pridobljenih v P fazi, in izpostavljenosti E2 → E2 ↑ invazivnost in adhezijo endometrija ali A lezij. (Zhou in sod., ↑ ILK (angl. integrin-linked protein kinase) in protein, CDH2 in protein ter VIM in ↓ CDH1 in protein v EvEA (ne pri VIM) in 2018) EkEA proti K (ni navedene faze ciklusa ob vzorčenju) → ILK sproži EMT, kar vodi v razvoj A. (An in sod., ↓ CDH1 in ↑ VIM v EvEA in EkEA proti K (ni navedene faze ciklusa ob vzorčenju); 2017) ↑ CDH2 in ↓S100A4 in KRT7 (angl. keratin, type II cytoskeletal 7) v EkEA proti EvEA in K; ↑ stopnja EMT v EkEA in EvEA proti K (določeno glede na razmerja med stopnjami izražanja označevalcev EMT); ↓ CDH1 in KRT7 ter ↑ VIM, CDH2 in S100A4 ob gojenju kulture EEC iz EvEA z makrofagi → makrofagi lahko sprožijo procese, podobne EMT. (Khan in ↓ CDH1 v epiteliju bazalnega EvEA proti K, pridobljenih v S fazi; sod., 2015) ↑ VIM v epiteliju bazalnega in funkcionalnega EvEA proti K; ↑ SLUG, SNAI1 in CDH2 ter ↓ CDH1 v kulturi EEC iz EvEA in/ali Ishikawa celicah po 48-urnem gojenju s HGF (angl. hepatocyte growth factor) in po gojenju s HGF ob dodatku E2 → HGF in dalje E2 spodbujata procese EMT v bazalnem EvE se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Aktivacija procesa prehoda epitelija v mezenhim (EMT) Proces EMT poteka v več korakih: Izguba celične (Wu in sod., ↓ SCRIB (angl. protein scribble homolog. Evolucijsko ohranjen protein ogrodja, vključen v različne polarizirane celice) v apikalno bazalne 2019) EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah → polarnost celic žleznega epitelija je spremenjena v EvEA. polarnosti (Jin in sod., ↑ CYP19A1 in HECW1 (angl. E3 ubiquitin-protein ligase HECW1. Ligaza, ki sodeluje pri ubikvitinaciji proteinov) ter ↓ 2020) SCRIB v EvEA proti K (ni navedene faze ciklusa ob vzorčenju); Izgubljena apikalno bazalna polarnost epitelijskih celic na 3D kulturi primarnih celic žlez EvEA ob gojenju z E2; ↓ proteinov polarnosti (SCRIB, CRB3 in CDH1) žlez epitelija v kulturi Ishikawa celic po 24 in 48-urnem gojenju z E2; ↑ oz. ↓ SCRIB v kulturi Ishikawa celic po HECW1-siRNA oz. hiperizražanju HECW1 → E2, preko ubikvintina HECW1 spodbuja potranslacijske modifikacije, ki vodijo v degradacijo proteina SCRIB. To uniči apikalno-bazalno polarnost žleznih epitelijskih celic bazalnega endometrija, kar pripomore k razvoju difuzne A. Zvišana celična (Zhou in sod., ↑ zmožnost motilnosti (in vitro test celjenja rane) in invazivnosti kulture ESC iz EvEA proti K. migracija 2018) (motilnost) (Ibrahim in ↑ migracija znotrajepitelijskih golih celic (niso povezane z okolico prek dezmosomov) iz žlez bazalnega endometrija v stromo sod., 2015) EkEA (transmisijsko elektronsko mikroskopiranje). (Wang in ↑ TLN1 (angl. Talin-1. Povezuje strukture citoskeleta) in ↓ MIR145 (miR-145-5p cilja regijo 3'UTR TLN1) v EvEA in EkEA sod., 2021a) proti K, pridobljenih v P in S fazah → izražanje TLN1 bi lahko bilo regulirano preko miRNA; ↑ gibljivost in kapaciteta invazivnosti (in vitro testa invazije Transwell in celjenja rane) kulture EEC iz EvEA in EkEA pri prekomernem izražanju TLN1 oz. ↓ celična invazija po izbitju TLN1. (Zhai in sod., ↑ DDT (angl. D-dopachrome decarboxylase. Označevalec celične migracije in proliferacije) v P fazi EvEA proti K → ↑ DDT v 2020a) EvEA bi lahko, z vplivom na procese m6A RNA metilacije, uravnaval celično migracijo. (Khan in sod., ↑ migracija (in vitro test z Boydenovo komoro) kulture EECs iz EvEA po 48-urnem gojenju samo s HGF in po gojenju s HGF 2015) in dodatkom E2 → HGF/E2 bi lahko ↑ invazivnost endometrijskih celic in njihovo migracijo proti miometriju. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Aktivacija procesa prehoda epitelija v mezenhim (EMT) Proces EMT poteka v več korakih: Zvišana (Zhou in sod., ↑ ANXA2 (angl. annexin A2. Na E2 odziven protein) v EkEA proti EvEA, pridobljenih v P in S fazah; invazivnost 2012) Značilna poz. povezava med stopnjo izražanja ANXA2 v EkEA in hudo obliko dismenoreje; endometrija ↑ ANXA2 in proces EMT (↓ CDH1 in ↑ VIM ter SNAI2) po gojenju ESR+ Ishikawa celic z E2; ↓ rast endometrijskega tkiva, metastaz in stopnje angiogeneze v mišjem modelu A po utišanju ANXA2 → E2 bi lahko ↑ ANXA2 in sprožil proces EMT. (Zhao in sod., ↓ CAV1 (angl. caveolin-1: ogrodni protein znotraj kaveolarnih membran) in ↑ CCL5 (angl. C-C motif chemokine 5; pogosto 2013) uporabljen simbol RANTES) v stromi EkEA proti EvEA in K, pridobljenih v P in S fazah; ↑ kapaciteti proliferacije (in vitro test celične proliferacije) in metastaz (in vitro migracijski test Transwell) v kulturi ESC iz EvEA po utišanju s CAV1-siRNA → izguba izražanja CAV1 v stromi vodi v sproščanje CCL5 in s tem morebiti na razvoj A; ↑ izražanje mediatorjev provnetnega okolja (TNF, IL6, CCL2, IL10 in CCL5) in mediatorjev dismenoreje (NO in PGE2) ter aktivacija signalne poti ERK-PTK2 (se povezuje s celično motilnostjo in invazijo) v kulturi ESC iz EvEA po izbitju CAV1 → ↓ CAV1 v endometriju bi lahko vodilo v vnetno okolje in sprožilo tvorbo NO in PGE2, kar vodi v simptom dismenoreje. (Kolioulis in ↑ KISS1 (angl. metastasis-suppressor KiSS-1. Protein zaviranja metastaz) v žlezah EvEA in EkEA proti K (ni navedene faze ob sod., 2017) vzorčenju). (Matsuda in ↑ invazivnost (in vitro test invazivnosti z rekonstrukcijo bazne membrane matriksa in želatine, Matrigel) kulture ESC iz sod., 2001) mišjega modela A proti K. (Qi in sod., ↑ NOTCH1 (angl. neurigenic locus notch homolog protein 1. Spada v družino transmembranskih receptorjev z domnevno 2015) vlogo pri vzpostavitvi procesa EMT. Vezani v kompleks lahko uravnavajo prepisovanje genov, povezanih z EMT: SNAI1 in SNAI2), CDH1, SNAI1 in SNAI2 ter ↓ NUMB (angl. protein numb homolog, inhibitor NOTCH signalizacije) v EkEA proti EvEA, pridobljenih v P in S fazah → signalna pot NOTC1/NUMB/SNAIL ima vlogo pri patogenezi in razvoju A. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Aktivacija procesa prehoda epitelija v mezenhim (EMT) Proces EMT poteka v več korakih: Zvišana (Shi in sod., ↑ lncRNA TUG1 (angl. taurine upregulated 1. lncRNA, ki je ↑ pri različnih oblikah raka, kjer ↑ celično migracijo in invazijo) invazivnost 2019) v EkEA proti EvEA, pridobljenih v različnih fazah ciklusa; endometrija ↑ migracija in invazija v kulturi EEC iz EkEA proti EvEA, pridobljenih v S fazi ( in vitro test Transwell); ↓ migracija in invazija ter ↑ TIMP2 v kulturi EEC iz EkEA po TUG1-siRNA ( in vitro test Transwell); ↓ TUG1 v kulturi EEC iz EkEA po EGR1-siRNA (angl. early growth response protein 1; predviden prepisovalni dejavnik, ki se veže na promotor TUG1) → EGR1 se veže na promotor TUG1 in regulira njegovo prepisovanje. ↑ TUG1 se preko epigenetskega delovanja veže na ciljni EZH2 (angl. histone-lysine N-methytransferase EZH2), (test imunoprecipitacije RNA-vezavnih proteinov), kar ↓ njegovo zmožnost vezave na promotor TIMP2 (uravnava celično migracijo in invazijo). Posledično se ↑ migracija in invazija epitelijskih celic ter pospeši razvoj A. (Guo in sod., ↓ MIR10B in ↑ ZEB1 (angl. zinc finger E-box-binding homeobox 1. Prepisovalni dejavnik, ki deluje kot zaviralec transkripcije) 2015) in PIK3CA (angl. phospatidylinositol 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform). Kodira enoto proteina PI3K v EkEA in EvEA proti K, pridobljenih iz različnih faz ciklusa; ↓ celična migracija in invazivnost ( in vitro test Transwell) ter ↓ ZEB1 in PIK3CA v kulturi EEC iz EkEA po prekomernem izražanju miR-10b; ↑ ZEB1 in PIK3CA po transfkeciji kulture EEC iz EkEA z anti-miR-10b; ↑ CDH1 in ↓ p-AKT po ZEB1-siRNA in PIK3CA-siRNA (ciljna gena miR-10b) v kulturi EECs iz A → miR-10b cilja 3' UTR regije ZEB1 in PIK3C s čimer ↑ invazivnost (↑ CDH1 in inhibicija fosforilacije AKT) epitelijskih celic pri A. Spremembe v (Matsuda in ↑ MMP14 v maternici mišjega modela A vs. K → ↑ invazivnost stromalnih celic v zunajcelični matriks vpliva na razvoj A. organizaciji sod., 2001) zunajceličnega (Li in sod., ↑ MMP2 in -9 v EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v P in S fazah → ↑ izražanje MMPs bi lahko vplivalo na razvoj A, preko matriksa 2006) ↑ invazije endometrijskega tkiva v miometrij in angiogenezo v A lezijah. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Spremembe v (Yang in sod., ↑ MMP2 in TIMP1 v kulturi ESC iz EvEA proti K, pridobljenih v ES ali SS fazah, po gojenju 48 ur v mediju DMEM na 37°C. organizaciji 2009) zunajceličnega matriksa (Yi in sod., ↓ MMP2 in -9 v kulturi ESC iz EvEA proti K (ni navedene faze ciklusa ob vzorčenju) in v kulturi Ishikawa celic vs. negativna 2015) K po transfekciji s PAK4-siRNA → ↑ PAK4, preko regulacije MMP2 in -9, ↑ invazivnost endometrijskih celic, kar vpliva na razvoj A. (Zhang in ↑ CCN1 in protein (angl. CCN family member 1. Protein zunajceličnega matriksa z vlogo spodbujanja adhezij, migracij in sod., 2016) mitoze ter pri uravnavanju proliferacije, angiogeneze, rasti tumorjev in embriogenezi) v EkEA proti EvEA, pridobljenih v P in S fazah; ↑ CCN1 v EkEA žensk s hudo proti blagi menoragiji in/ali dizmenoreji. ↑ CCN1 v EvEA žensk starih 30 - 39 let proti EvEA žensk starih 40 - 49 in > 50 let. Prekomerna neuroangiogeneza Angiogeneza (Huang in ↑ ožiljenje EkEA proti EvEA, pridobljenih v EP, SP in S fazah (3D Doppler ultrazvok); sod., 2014) ↑ gostota malih žil, VEGFA in SNAI2 v EkEA proti EvEA, pridobljenih v ZP, SP in S fazah; ↑ SNAI2 in ↑ pripadajočega odzivnega VEGFA v ESR+ Ishikawa celicah proti ESR- Ishikawa celicam po 24-urnem gojenju z E2; ↑ implantacija ksenotransplantiranega adenomioznega tkiva in angiogeneza pri SCID miši po 21-dnevni izpostavljenosti E2 → ↑ E2 vodi v ↑ VEGFA, kar spodbuja tvorbo žil ter v ↑ SNAI2, kar ↑ migracijo endotelijskih celic in sproži EMT (in vitro test tvorbe kapilarne cevke). (Li in sod., ↑ VEGFA v EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v P in S fazah → ↑ izražanje MMP2 in -9 vpliva na ↑ invazivnost 2006) endometrijskega tkiva v miometrij in ↑ angiogenezo v A lezijah. (Wang in ↑ žilni potencial (in vitro test žilne cevke in tvorbe združb) kulture ESC iz EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P fazi; sod., 2021b) ↑ VEGFB in ANGPTL4 ter dodatno ↑ žilni potencial kulturi ESC iz EvEA in EkEA proti K po dodatku E2. (Ota and ↑ ožiljenje v P in S fazi EvEA proti K (pri K ↑ ožilje endometrija samo v S fazi), (morfometrične meritve kapilar ob Tanaka, 2003) histereskopiji)→ nenormalno ožiljenje EvEA je povezano s simptomom hipermenoragije. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Prekomerna neuroangiogeneza Angiogeneza (Wang J. in ↑ VEGFA v žlezah epitelija EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v P in S fazah; sod., 2016) ↑ gostota malih žilic v EkEA proti EvEA in K → VEGFA inducira angiogenezo pri razvoju A; ↑ VEGFA in STAT3 v Ishikawa celical po transfekciji z NDUFA13-siRNA → spremenjeno izražanje NDUFA13 vpliva na uravnavanje apoptoze in angiogeneze pri razvoju A. (Goteri in ↑ VEGFA v epiteliju, stromi in endoteliju EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazi. sod., 2009) (Liu in sod., ↑ F3 (angl. tissue factor. Spada v družino citokinskih receptorjev z vlogo pri procesu koagulacije) v žlezah epitelija EkEA in 2011) EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah → ↑ imunoreaktivnost F3 v poz. povezavi s stopnjo dismenoreje in količino menstrualne krvi pri A. Tvorba živčnih (Zhang in ↑ UCHL1 (angl. ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1, pogosto uporabljen sinonim PGP9.5. Povezuje se s tvorbo vlaken sod., 2010) živčnih niti) v P in S fazah funkcionalnega EvEA žensk z v primerjavi z ženskami brez simptomov bolečin v mali medenici. (Carrarelli in ↑ NGF (angl. beta-nerve growth factor), SYP (angl. synaptophysin), MAP2 (angl. microtuble associated protein 2) v EkEA sod., 2017) proti EvEA in K, pridobljenih v P fazi → oživčene A lezije bi lahko povzročale bolečine v predelu medenice; ↑ NGF v kulturi ESCs iz K po 3-urnem gojenju z UCN (urokortinom: vnetni dejavnik). (Wang F. in ↑ NCAM1 (angl. neural cell adhision molecule 1, pogosto uporabljen sinonim CD56. Molekula, vključena v adhezijo sod., 2015) nevronov) v epiteliju EkEA z dismenorejo proti EkEA brez dismenoreje, EvEA ter K → izražanje NCAM1 značilno poz. povezano s stopnjo dismenoreje. Pri A žleze epitelija ↑ izločajo NCAM1, kar stimulira rast živčnih niti v stromi in povzroča dismenorejo; ↑ NCAM1 v S proti P fazi EvEA žensk z dismenorejo (ni bilo razlik v izražanju NCAM1 med fazama v EkEA) → Spolni steroidni hormoni bi lahko uravnavali izražanje NCAM1. (Nie in sod., ↑ TRPV1 (angl. transient receptor potential cation channel subfamily V member 1. Vlogo pri vnetni bolečini in hipealgeziji – 2010b) preobčutljivost na bolečinske dražljaje) in OXTR v EkEA proti EvEA in K, pridobljenih v P in S fazah (izražanje TRPV1 tekom ciklusa se pri K ni spreminjalo, medtem ko je bilo izražanje OXTR višje v S kot pa v P fazi) → ↑ OXTR in TRPV1 v značilni poz. povezavi s stopnjo dismenoreje. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Prekomerna neuroangiogeneza Tvorba živčnih (Miyashita in ↑ NINJ1 (angl. ninjurin-1. Molekula nevronskih celic) v epiteliju EkEA proti EvEA in K (ni navedene faze ciklusa ob vlaken sod., 2019) vzorčenju); ↑ NINJ1 v kulturi ESC, pridobljenih iz žensk z endometriomom, po 3- do 6-urnem gojenju z IL1B → vnetni dražljaji bi lahko ↑ NINJ1, kar ↑ simptom bolečine v predelu medenice. Blokirana (An in sod., ↑ apoptoza ( pretočna citometrija) Ishikawa celic po 48-urnem gojenju z makrofagi → makrofagi ↑ invazivnost in migracijo apoptoza 2017) endometrijskih epitelijskih celic v procesu EMT. (Yang in ↓ apoptoza ( FACS) v kulturi ESC iz EvEA proti K po 24-urnem gojenju z ali brez vodikovega peroksida (H2O2). sod., 2007) (Li J. in sod., ↑ BCL2 in protein (angl. apoptosis regulator Bcl-2. Blokira signalne poti apoptoze in spodbuja preživetje celic) v P in S fazi 2019) EvEA proti K; ↑ stopnja apoptoze (pretočna citometrija) in ↓ stopnja preživetja (kit za štetje celic 8, CCK-8 assay) ter relativne razdalje migracije (in vitro test celjenja rane) v kulturi ESC iz EvEA 48 ur po transfekciji z BCL2-siRNA proti neg. K. (Jones in ↓ BCL2 v strome EkEA proti EvEA, brez variacij v izražanju tekom menstru. ciklusa; sod., 1998) Brez razlik v izražanju BCL2 v EvEA tekom menstr. ciklusa (pri K ↑ BCL2 v PS fazi); Nizka stopnja apoptoze v K, EkEA in EvEA (barvanje celic z metodo TUNEL (the dUTP nick-end labelling)); BCL2+ stromalne celice identificirane kot pretežno levkociti (dvojno imunohistokemijsko barvanje) → povišano izražanje BCL2 v endometriju v PS fazi sovpada z značilnim ↑ številom infiltriranih levkocitov. (Hu in sod., ↓ PTEN in protein (tumor supresor, ki se povezuje s celično proliferacijo, apoptozo, invazijo in metastazo) in ↑ MIR17 v EvEA 2017) proti K (ni navedene faze ciklusa ob vzorčenju); ↑ PTEN in BAX (angl. apoptosis regulator BAX) ter ↓ BCL2, CCNE1 (angl. G1/S-specific cyclin-E1) in CCND1 v kulturi ESCs po utišanju MIR17; ↑ apoptoza (pretočni citometer) in ↓ živost ( test MTT: kolorimetričen test za določevanje aktivnosti celičnega metabolizma) kulture ESCs po prekomernem izražanju PTEN ali utišanju MIR17 → miR-17 bi lahko ciljala 3'UTR regijo PTEN. Izražanje MIR17 pri A bi lahko vplivalo na celično apoptozo in izražanje ciklinov, ki regulirajo celični cikel. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Blokirana (Wang J. in ↓ NDUFA13 (angl. NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 13. Regulator apoptoze in angiogeneze) v apoptoza sod., 2016) EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v P in S fazah; ↓ stopnja apoptoze EkEA in EvEA proti K ( TUNEL barvanje) → ↓ NDUFA13 v žlezah epitelija bi lahko ↓ stopnjo apoptoze in ↑ kapaciteto infiltracije v miometrij, kar vodi v razvoj A. (Huang in ↑ NTRK2 (angl. BDNF/NT-3 growth factors receptor: tirozin kinazni receptor, ki sodeluje tudi pri odpornosti celic na sod., 2011) apoptozo) v S fazi EvEA proti K.  Avtofagija (Ren in sod., ↓ BECN1 (angl. Beclin-1) v EvEA proti K (ni podatka o fazi ciklusa ob vzorčenju); 2010) ↓ BECN1 in protein v kulturi ESC iz EvEA proti K; Značilna neg. korelacija v izražanju BECN1 v EvEA in serumskimi vrednostmi CA125 ter bolečinami v predelu medenice. Prekomerna (Wang in ↑ celična proliferacija ( in vitro test tvorbe kolonij na plošči in test celične viabilnosti) kulture ESC iz EvEA in EkEA proti K, celična sod., 2021b) pridobljenih v P fazi; proliferacija Dodatno ↑ proliferacija (↑ PCNA (angl. proliferating cell nucleas antigen) in MKI67 (angl. proliferation marker protein Ki- 67)) kulture EEC iz EkEA in EvEA proti K po 24-urnem gojenju z E2 → E2 s ↑ TLN1 bi lahko spodbujala proliferacijo stromalnih endometrijskih celic in tvorbo novih žil, kar omogoča rast in preživetje A lezij. (Li J. in sod., ↓ stopnja preživetja (in vitro štetje celic) kulture ESC iz EvEA 48 ur po transfekciji z BCL2-siRNA. 2019) (Yang in sod., ↑ MKI67 in celična proliferacija (test celične proliferacije CellTiter 96 AQueous Nonradioactive) kulture ESC iz EvEA proti 2007) K, pridobljenih v ZS ali SS fazah, po 48-urnem samostojnem gojenju ali ob dodajanju E2, MPA, IL6 ali IFNG → spremenjena proliferacija in apoptoza EvEA bi lahko nakazovala nekatere mehanizme patofiziologije A. (Zhai in sod., ↑ IGF1 (angl. insulin-like growth factor. Rastni dejavnik, ki uravnava proliferacijo epitelijskih celic in signalne poti AKT) v P 2020a) fazi v EvEA proti K; Spremenjeno izražanje IGF1 v značilni povezavi z izražanjem METTL3 (metilira adenozinske ostanke na položaju N6 nekaterih RNA) v EvEA (določanje transkriptoma z mikromrežo) → IGF1 bi lahko bil ciljni gen regulatorjev m6A RNA metilacije. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Prekomerna (Carrarelli in ↑ rastnih dejavnikov proliferacije, apoptoze in angiogenezo ( INHBA (angl. inhibin beta A chain, pogosto uporabljeno ime celična sod., 2015) Activin A. Spada med citokine) in MSTN (miostatin)) v EkEA proti EvEA in K, pridobljenih v P fazi; proliferacija ↑ FST (folistatin) v EkEA in EvEA proti K; ↑ ACVR2A (tip 2A receptorja za aktivin) in ACVR2B v EkEA in EvEA proti K → ↑ INHBA v A lezijah bi lahko vodilo v vnetje, spremenjeno celično proliferacijo, ↑ invazivnost in angiogenezo v miometriju. Spremenjeno izražanje rastnih dejavnikov v EkEA vpliva, preko avtokrinih/parakrinih efektov, na spremenjeno izražanje pripadajočih receptorjev v EvEA, kar bi lahko vplivalo na plodnost takšnih žensk. (Xu in sod., ↑ LINC-ROR (intergenska lncRNA) v EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v P fazi; 2018) ↑ proliferacija (test CCK-8), (↓ PTEN in ↑ p-Akt, p-PTEN in p-PDK1) kulture EEC ob prekomernem izražanju LINC-ROR oz. ↑ PTEN in ↓ p-Akt, p-PTEN ter p-PDK1 po izbitju LINC-ROR → LINC-ROR spodbuja delitev endometrijskih celic preko poti PI3K-Akt. (Guo in sod., ↑ TLR4 (angl. toll-like receptor 4. Mediator naravne imunosti) in pripadajoč protein v EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v 2016) ZP fazi; ↑ proliferacija (test CCK-8) in invazivna rast v ESC po 24-urnem gojenju z LPS (bakterijski lipopolisaharid, ki v gostitelju izzove vnetje) → aktivacija LPS/TLR4 signalne poti (↑ TLR4, LY96, (angl. lymphocyte antigen 96. Veže bakterijski LPS), MXD88, NFKB v kulturi ESC iz EvEA, EkEA in K → signalna pot TLR4 izzvala ↑ TGFB1, IL6, VEGF, EGF in MMP2 → LPS bi lahko stimuliral stromalne celice, da izražajo dejavnike proliferacije in invazivnosti pri A. Spremenjeno (Zhihong in ↑ IL6, IFNG in CCL2 (kemokin, ki je močan aktivator celic uNK. Visoko število uNK bi lahko bilo povezano s splavi in izražanje sod., 2016) neplodnostjo) ter ↓ IL10 in IL17 v EvEA proti K, pridobljenih sedem dni po injeciranju hCG v procesu kontrolirane stimulacije mediatorjev vnetja jajčnikov. (citokini, kemokini (Sotnikova in ↑ IFNG, IFNA, TNF, IL1B in EGF ter ↓ CXCL8 (pogosto uporabljen sinonim IL8) v supernatantu 24 ur gojenih in prostaglandini) sod., 2002) mononuklearnih celic, pridobljenih iz PS faze EvEA proti K → spremenjeno izražanje citokinov bi lahko nakazovalo aktivacijo T limfocitov. ↑ aktivnost imunskih celic bi lahko ustvarila pogoje, ki dovoljujejo infiltracijo in proliferacijo celic, s tem pa razvoj A. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Spremenjeno (Carrarelli in ↑ IL1B in CRH (angl. corticoliberin. Vnetni dejavnik) v P fazi EvEA proti K; izražanje sod., 2017) ↑ vnetnih posrednikov ( IL1B, CRH, UCN (angl. urocortin)) in ↑ nevrogenih posrednikov ( NGF, SYP in MAP2) v EkEA proti mediatorjev vnetja EvEA in K → A lezije so nova mesta izražanja vnetnih in nevrogenih posrednikov, ki so vpleteni v patogenezo A. (citokini, kemokini (Yang in sod., ↑ IL6 v primarni kulturi ESC iz EvEA proti K ob gojenju z makrofagi → Makrofagi naj bi izločali citokine, ki ↑ celično in prostaglandini) 2006) proliferacijo ektopičnih implantov pri A (čeprav so makrofagi sposobni citolize EvE in EkE, lahko z izločanjem citokinov tudi ↑ celično rast in proliferacijo → IL6 ima angiogeni in mitogeni efekt). (Wang F. in ↑ IL10 (protivnetni citokin) v žlezah epitelija EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v S fazi; sod., 2009) ↑ IL10 v epiteliju EvEA v S proti P fazi → ciklično variranje izražanja IL10 v EvEA tekom faz menst. ciklusa → v EvEA in EkEA prihaja do nenormalnega vnetnega odziva. (Wang in ↓ IL10, HOXA10 (prepisovalni dejavnik, ki sodeluje pri razvoju endometrija: decidualizacija strome, infiltracija levkocitov in sod., 2018) razvoj pinopodov ter vpliva na izražanje drugih genov, ki sodelujejo v procesu vgnezdenja zarodka) in p-STAT3 v SS fazi v EvEA proti K; Značilna poz. povezava med stopnjo IL10 in p-STAT3; ↑ HOXA10 po 12-urnem gojenju Ishikawa celic z IL10 → ↑ stopnja vezave in vitro modela blastociste (BeWo sferoidi) na Ishikawa celice → IL10 ↑ fostofilacijo STAT3, s tem pa ↑ HOXA10, kar deluje spodbudno na proces vgnezdenja → spremenjena signalna pot IL10/STAT3/HOXA10 v EvEA bi lahko vplivala na vgnezditev zarodka ali decidualizacijo. (Fischer in ↓ HOXA10 v SS fazi v stromi EvEA proti K → ↓ HOXA10 bi lahko vplivala na nižjo stopnjo vgnezitve zarodka pri A. sod., 2011) (Qin in sod., ↑ IL10RA v epiteliju EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah (višje izražanje IL10RA v S kot pa v P fazi pri K in 2012) EvEA); ↑ IL10RB v epiteliju EkEA proti EvEA in K (brez variabilnosti v izražanju med P in S fazama) → receptorji za IL10 bi lahko bili vključeni v imunotolerantne in/ali protivnetne procese pri A. (Jiang J.F. in ↓ IL37 (protivnetni citokin) v EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v P in S fazah → v EvEA lahko pride do nenormalnega sod., 2018) vnetnega odziva. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Spremenjeno (Huang H. in ↑ IL18R in razmerje med IL18BP in IL18 (IL18BP/IL18) v EvEA proti K (ni navedene faze ciklusa ob vzorčenju). izražanje sod., 2010) mediatorjev vnetja (Wang in ↑ IL22, IL22RA1, IL10RB v EkEA in EvEA proti K (ni navedene faze ciklusa ob vzorčenju); (citokini, kemokini sod., 2014) ↑ invazivnost (in vitro test invazivnosti z Matrigel), IL22RA1, IL10RB, CCL5, CXCL8, IL6 in VEGFA ter ↓ CD82 (supresor in prostaglandini) metastazij) po 48-urnem gojenju z IL22 kulture ESC iz EvEA proti K → IL22 ima avtokrini efekt na izražanje IL22RA1 in IL10RB. ↑ izražanje IL22 vodi v ↑ izražanje z invazivnostjo povezanih molekul, kar ↑ invazivnost ESC pri razvoju A. (Lai in sod., ↑ CXCL1 (kemoatraktant za nevtrofilce. Avtokrino prenaša vpliv na endotelijske celice) v epiteliju EvEA proti K (ni navedene 2016) faze ciklusa ob vzorčenju); Značilna poz. povezava med konc. VEGFA in CXCL1 v epiteliju → VEGFA je močan mediator izločanja CXCL1; ↑ CXCL1 v kulturi EECs iz EvEA po 16-urnem gojenju z naraščajočimi koncentracijami VEGFA → VEGFA inducira sproščanje CXCL1 preko NADP oksidaze (↑ NCF1: encim s sodelovanjem pri tvorbi reaktivnih kisikovih spojin) in signalne poti NFKB (↑ NFKBIB, RELA in NFKB1), kar ↑ proliferacijo EEC (in vitro test celične viabilnosti/proliferacije) in celično migracijo vaskulatornega endotelija (in vitro test migracije HUVEC (angl. human umbilical vein endothelial cell)). (Jiang in ↑ IL6, CXCL8 (pogosto uporabljen simbol IL8), TLR1, -6, -8 in -9 (angl. Toll-like receptors. Komponentne naravne imunosti, sod., 2017) ki varujejo gostitelja pred vdorom bakterij in virusov) in pripadajočih proteinov v EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P fazi; Značilna poz. korelacija med izražanjem TLR1, -2, -4, -5 in -9 ter IL6 in CXCL8 v EkEA in EvEA → IL6 in CXCL8 bi lahko bili vključeni v vnetne procese pri A. (Ulukus E.C. ↓ CXCL8 (kemoatrtaktni dejavnik, ki aktivira nevrofilce in T celice, ne pa monocit) in CCL2 (pogosto uporabljen simbol in sod., 2005) MCP-1. Izzove kemotakso in aktivacijo mononuklearnih fagocitov) v S fazi v epiteliju EvEA proti K (pri K ↑ izražanje CCXL in CCL2 v S proti P fazi) → ni ciklične variacije v izražanju CXCL8 in CCL2 v epiteliju EvEA (spolni steroidni hormoni bi lahko v EvEA izzvali nenormalni vnetni odziv); ↑ CXCL8 in CCL2 v EkEA proti EvEA → v EvEA bi lahko potekal nenormalen vnetni odziv. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Spremenjeno (Ulukus in ↑ CXCR1 in CXCR2 (receptorja za CXCL8, ki se nahajata na nevtrofilcih) v P fazi v epiteliju EvEA in EkEA proti K → izražanje sod., 2006) receptorji za CXCL8 bi lahko bili vključeni v patogenezo A. mediatorjev vnetja (Ota in sod., ↑ PTGS2 (angl. prostaglandin G/H synthase 2, pogosto uporabljen simbol COX-2. Vzdržuje celično homeostazo, izraža se (citokini, kemokini 2001b) tekom vnetja in celične proliferacije ter diferenciacije. Vlogo ima tudi v procesih reprodukcije) v P fazi na površini epitelija in prostaglandini) EvEA proti K (ni razlik v izražanju PTGS2 tekom menstruacijskega ciklusa v EvEA, medtem ko je pri K najnižje v ZP fazi s postopnim naraščanjem, ki ostaja visoko v S fazi) → ↑ PTGS2 in posledična ↑ produkcija prostaglandinov bi lahko vodila v nenormalne pogoje v maternici, z negativnim vplivom na procese vgnezdenja zarodka. (Li C. in sod., ↑ ALOX5 (angl. polyunsaturate fatty acid 5-lipoxygenase. Encim, ki katalizira pretvorbo arahidonske kisline v levkotrine, ki so 2019) pomembni mediatorji vnetja) in protein, PTGS2 in protein, IL6 in CXCL8 v EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v ZP fazi; Značilna poz. povezava med stopnjami izražanja ALOX5 in PTGS2 z IL6 in CXCL8 v EvEA → A je kronična imunska vnetna bolezen. (Xiao in sod., ↓ LIF v SS fazi EvEA proti K in LIF v izpirku maternične tekočine A vs. K → A bi lahko vplivala na hormonske in 2010) imunološke pogoje, kar ↓ receptivnost endometrija za zarodek. (Yen in sod., ↓ LIF in protein, LIFR in protein , pSTAT3 in pERK v SS fazi EvEA proti K; 2016) ↑ p-STAT3 in pERK v kulturi ESC po 5 do 60 min gojenja z LIF → ovirana signalizacija LIF sovpada z ↓ stopnjo vgnezditve zarodka pri ženskah z A. Spremenjene (Xue in sod., ↑ z AMP aktivirana protein kinaza (AMPK) v kulturi ESC iz EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah; znotrajcelične 2013) ↑ p-AMPK in ↓ signalna pot PI3K/AKT ter proliferacija po gojenju z metforminom (zdravilo, ki se uporablja za zdravljenje signalne poti diabetesa tipa 2, poz. pa naj bi vplival tudi na endometrijske nepravilnosti) kulture ESC iz EvEA proti K, pridobljenih v S fazi → metformin inhibira celično rast preko aktivacije AMPK in posledičnega zaviranja signalne poti PI3K/AKT v stromi EvEA, kar je opazno predvsem v S fazi. (Zheng in ↑ PI3K in protein ter AKT in protein v P in S fazah EvEA proti K; sod., 2018) ↓ PI3K in AKT ter označevalci EMT po transfekciji kulture endometrijskh celic s PTK2-siRNA → Signalna pot PTK2/PI3K/AKT bi lahko sodelovala v procesu EMT endometrijskih celic pri razvoju A. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Spremenjene (Wang in ↑ CTNNB1 (angl. catenin beta-1) in GSK3B (angl. glycogen synthase kinase-3 beta) ter ↓ AXIN1 (angl. axin-1) po 72-urnem znotrajcelične sod., 2021a) gojenju kulture EEC iz EkEA in EvEA, pridobljenih v P in S fazah, s prekomernim izražanjem TLN1 → aktivacija signalne poti signalne poti Wnt/beta-katenin bi lahko ↑ migracijske in invazivne lastnosti epitelija EvEA in EkEA. (Shen in sod., ↓ CNR1 (angl. cannabioid receptor 1. Receptor za endogene kanabinoide) in protein, ter CNR2 in protein v EvEA in EkEA proti 2019) K, pridobljenih v P in S fazah → Izguba ciklične spreminjanja izražanju CNR1 glede na menstr. ciklus pri A (pri K izražanje CNR1 in -2 višje v S kot pa v P fazi) → kanaboidni receptorji bi lahko imeli vlogo pri patogenezi A. (An in sod., ↑ izražanje genov signalnih poti TGFB1/SMAD3 in IL6/STAT3 po gojenju Ishikawa celic z makrofagi (analiza globalnega 2017) transkriptoma). (Nie in sod., ↓ NFKBIA (angl. nuclear factor-kappa-B inhibitor alpha) in ↑ RELA (NFKB podenota p65), NFKB1 (NFKB podenota 50) in 2009) NFKB2 (NFKB podenota p52) v EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah → EvEA kaže stalno aktivnost signalne poti NFKB (NFKB je prepisovalni dejavnik z vlogo uravnavanja izražanja genov, vključenih v procese vnetja, proliferacije, apoptozo, invazijo in angiogenezo. Različni rastni dejavniki in oksidativni stres lahko aktivirajo NFKB), kar bi lahko ↓ izoobliko B PGR (deluje kot protivnetni dejavnik, tako da zavira aktivacijo NFKB); Značilna poz. povezava med izražanjem NFKB2 in hudo menstrualno krvavitvijo. (Li in sod., ↑ NFKB-DNA vezavna aktivnost (↑ RELA in NFKB1), PTGS2, VEGF in F3 (angl. tissue factor: vlogo pri vzpostavitvi 2013) aktivacije trombocitov in koagulacije) v stromi EkEA proti K, pridobljenih v P in S fazah → NFKB bi lahko vplival na razvoj A, saj regulira izražanje PTGS2 in genov vnetnih citokinov/kemokinov, celične proliferacije, invazije, angiogeneze ter oksidativnega stresa. (Park in sod., ↑ RELA v jedru in citoplazmi stromalnih celic EvEA in EkEA proti K v P, ZS (ne v EkEA proti K) in SS fazah; 2016) ↑ RELA v jedru žleznih celic EvEA in EkEA proti K v P, ZS, SS in PS fazi in v citoplazmi žleznih celic EvEA in EkEA proti K v P fazi → aktivirana signalna pot NFKB bi lahko sodelovala pri patogenezi in/ali patofiziologiji A. (Yi in sod., ↑ PAK4 (angl. serine/threonine-protein kinase PAK 4. Serin proteaza z vlogo v signalnih poteh, ki uravnavajo organizacijo 2015) citoskeletnega aktina, celično morfologijo, adhezijo in motilnost) v P, ZS, SS in PS fazah v epiteliju EvEA in EkEA proti K; ↑ PAK4 v ZS in SS fazah v stromi EvEA in EkEA (ne v ZS fazi) proti K; ↑ aktivacija NFKB (↑ RELA) in PAK4 v kulturi ESC iz EvEA po dodajanju TNF → Pot NFKB regulira izražanje PAK4 → ↑ PAK4 lahko vpliva na invazivnost endometrijskih celic preko uravnavanja aktivnosti MMP2 in -9, kar prispeva k razvoju A. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Spremenjene (Kim in sod., ↑ PAK1 v S fazi v žlezah epitelija EkEA (in LS fazi) in EvEA proti K; znotrajcelične 2010) ↑ PAK1 v SS fazi v stromi EvEA in EkEA (in P, ES in LS fazah) proti K → V EvEA tekom SS faza bi lahko bilo ovirano signalne poti zmanjševanje izražanja PAK1, ki ga narekuje P4. (Streuli in ↑ fosforilacija ERK1 in -2 v kulturi gladkega mišičja miometrija A proti K; sod., 2015) ↑ stopnja proliferacije v kulturi celic gladkega mišičja miometrija A proti K → ↑ aktivacije signalne poti protein kinaze aktivirana z miotegom / kinaza regulirana z zunajceličnim signalom (MAPK/ERK) v miometriju pri A vodi v ↑ celično proliferacijo. (Guo in sod., ↓ DUSP6, SPRY4 in SEF (angl. similar expression to FGF) v P in S fazah EvEA proti K → ↓ izražanje DUSP6, SPRY4 in 2014) SEF (neg. modulatorji signalne poti FGF2/ERK1/-2) v EvEA bi lahko vplivalo na razvoj A. (Chen in ↑ NFE2L2 (angl. nuclear factor erythroid 2-related factor 2. Jederni dejavnik, ki nadzira procese stresa zaradi poškodb) v sod., 2017) EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah; ↑ oz. ↓ MMP9 in migracija (in vitro test hitrosti celjenja rane) v kulturi EEC iz EvEA proti K po prekomernem izražanju NFE2L2 oz. transfekciji celic z NFE2L2-siRNA → NFE2L2 bi lahko preko regulacije izražanja MMP9 sprožil migracijo endometrijskih celic na ektopična mesta. (Jiang C. in ↑ ROCK1, ROCK2 in RHOA (povezani z organizacijo citoskeleta, celično migracijo in celičnim ciklom) in pripadajoči proteini sod., 2018) v EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P fazi; ↓ ARHGAP26 (angl. Rho GTPase-activating protein 26. Protein, ki aktivira GTPazo za RHOA. Ključen pri razvoju mišic, deluje tudi kot supresor tumorjev) v EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v P fazi → aktivirana signalna pot RHOA/ROCK pri A bi lahko bila povezana z nenormalnim krčenjem miometrija, dismenorejo in s količino menstrualne krvavitve. (Jiang Y. in ↓ NR4A1 (angl. nuclear receptor subfamily 4 group A member 1), NR4A2, NR4A3, FOXO1 in IGFBP1 v SS fazi EvEA proti K; sod., 2016) ↓ označevalca decidualizaacije (PRL in IGFBP1) v kulturi ESC iz EvEA proti K po 4 dnevnem gojenju z 8-Br-cAMP in MPA; ↑ oz. ↓ PRL in IGFBP1 v kulturi ESC iz EvEA po prekomernem izražanju NR4A1 oz. NR4A1-siRNA / FOXO1-siRNA → Prepisovalni dejavnik FOXO1 cilja gene receptorjev za NR4A, ki so močni regulatorji decidualizacije endometrijske strome. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 2. Molekularni procesi nastanka A glede na teorijo vrivanja celic bazalnega endometrija v spodaj ležeči miometrij Spremenjene (Yang in ↑ LPAR1 (angl. lysophosphatidic acid receptor 1. Spada med receptorje, ki vežejo LPA: fosfolipidi, ki posredujejo signale za znotrajcelične sod., 2017) celično proliferacijo, diferenciacijo, preureditev citoskeleta in celične interakcije), LPAR4 in LPAR5 ter ↓ LPAR2 in LPAR3 v signalne poti EkEA in EvEA proti K, pridobljenih v P fazi; ↑ CXCL8 v kulturi ESC iz K po 24- ali 48-urnem gojenju z LPA → LPA imajo vlogo pri patofiziologiji A. (Yan in sod., ↓ NR4A1 in MIR21 ter ↑ KLF12 in protein v SS fazi v EvEA proti K; 2019) ↑ oz. ↓ PRL in IGFBP1, KLF12 in NR4A1 (ne pri utišanju miR-21) v kulturi ESC iz A in K pri prekomernem izražanju oz. utišanju miR-21; ↓ decidualizacija v ESC iz K po prekomerno izražanje KLF12 → miR-21 cilja 3'UTR regijo prepisovalnega dejavnika KLF12, s čimer ↓ KLF12, to pa dalje spodbuja decidualizacijo. 3. Molekularne spremembe zaradi prisotne adenomioze Povečan (Ota in sod., ↑ NOS3 (angl. nitric oxide synthase, endothelial) v epiteliju in stromi EvEA proti K preko celotnega menst. ciklusa (na metabolizem 1998b) površini in v žlezah epitelija K najšibkejše izražanje NOS3 v ZP fazi, nato narašča z vrhom v SS fazi, ko prične upadati. V prostih radikalov stromi K je izražanje stalno) → citokini, ki jih izločajo ali stroma EvEA, ali prekomerno št. makrofagov ali T celice lahko ↑ NOS3, kar ↑ dušikov oksid (NO). S tem pa sta lahko prizadeta gibljivost spermijev in razvoj zgodnjega zarodka. (Kamada in ↑ NOS3 v S fazi v žlezah epitelija EkEA proti EvEA in K (izražanje NOS3 v epiteliju in endoteliju žil K in EvEA šibko v P sod., 2000) fazi, ki se okrepi v S fazi. Pri EkEA izražanje tudi v P fazi); ↑ NOS2 (angl. nitric oxide synthase, inducible) v stromi EkEA proti EvEA in K, pridobljenih v P fazi; ↓ NOS2 v stromi EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v S fazi → v EkEA se tvorijo visoke doze NO in superoksida. (Ota in sod., ↑ Cu,Zn-SOD1 (angl. superoxide dismutase [Cu-Zn]. Encim z antioksidativno vlogo, ki katalizira razpad superoksidnega 1999) aniona na kisik (O2) in H2O2) na površini in v žlezah epitelija EvEA proti K preko celotnega menst. ciklusa (pri K šibko izražanje v ZP in SP fazi, ki postopoma raste z vrhom v SS fazi, nato pa upada); ↑ Mangan (Mn)-SOD2 v žlezah epitelija EvEA proti K preko celotnega menst. ciklusa (pri K šibko izražanje v P fazi, ki narašča z vrhom v PS fazi) → endometrijske celice, imunske celice ali makrofagi stimulirajo ↑ SOD1 v EvEA, kar bi lahko bil vzrok neplodnosti in splavov. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 3. Molekularne spremembe zaradi prisotne adenomioze Povečan (Ota in sod., ↑ GPXs (angl. glutathione peroxidase (ni naveden podtip). Deluje kot koencim glutationina, s katerim katalizira razpad H2O2 in metabolizem 2000) lipidnih peroksidov do H2O in alkohola) na površini in v žlezah epitelija EkEA in EvEA proti K skozi celoten menst. ciklus (pri prostih radikalov K šibko izražanje v ZP fazi, ki postopoma narašča z vrhom v ZS fazi, nato upade) → aktiviran imunski sistem in tvorba prostaglandina pri A bi lahko vodila v tvorbo reaktivnih hidroksilnih radikalov. (Ota in sod., ↑ XDH (angl. xanthine dehydrogenase/oxidase. Katalizira oksidacijo hipoksantina in ksantina v sečno kislino, kar ob visokih 2001a) koncentracijah O2 producira superokside) na površini in v žlezah epitelija ter v stromi EvEA in EkEA preko K preko celotnega menst. ciklusa (v epiteliju K nizko izražanje v ZP fazi, ki narašča z vrhom v SS fazi, medtem ko v stromi vrh izražanja doseže v PP fazi). (Ota in sod., ↑ CAT (angl. catalase. Katalizira pretvorbo H2O2 v H2O in O2) v žlezah epitelija EvEA in EkEA proti K preko celotnega 2002) menst. ciklusa (v žlezah epitelija K nizko izražanje v ZP fazi, s postopnim naraščanjem in vrhom v PS fazi). Moten imunološki (Wang in ↑ izražanje HLA-G (angl. HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G) v žlezah epitelija EvEA in EkEA proti K nadzor sod., 2008) (stroma in epitelij K skoraj brez izražanja HLA-G) tekom menst. ciklusa; ↑ izražanje HLA-G v stromi EvEA proti EkEA → izražanje HLA-G bi lahko ektopičnim celicam omogočilo, da preživijo imunski nadzor gostitelja. (Yang in ↓ receptorjev za inhibicijo celic ubijalk (angl. killer cell inhibitory receptors, KIRs - NKB1 in GL182) na površini uNK celic v sod., 2004) EvEA proti K, pridobljenih v P in S fazah → nakazuje se ↑ citotoksičnost uNK v EvEA (KIRs na površini uNK se vežejo z MHC molekulami normalnih celic, kar inhibira delovanje uNK). (Ota in sod., ↑ HSPB1 (angl. heat shock protein beta-1. Stresni proteini, ki sodelujejo pri imunskem nadzoru preko procesiranja/predstavitve 1997) antigena ali delujejo kot molekularni šaperoni pri vezavi denaturiranih peptidov) v P in S fazah v žlezah epitelija EvEA proti K (pri K višje izražanje v S, kot pa v P fazi). Spremenjeno (Ota and ↑ integrinov (ITGA2 in -6 ter CDH1. Tvorijo interakcije med celicami in celicami z zunajceličnim matriksom) v P fazi izražanje Tanaka, žleznega epitelija EvEA proti K; integrinov 1997) ↓ ITGA4 (spodbuja interakcije med celicami) v S fazi žleznega epitelija EvEA proti K → spremenjeno izražanje integrinov in kaderina bi lahko nakazovalo na spremenjeno mikrookolje receptivnosti EvEA za zarodek. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 3. Molekularne spremembe zaradi prisotne adenomioze Spremenjeno (Xiao in sod., ↓ ITGA3 (adhezijski receptor na površini celic, čigar izražanje se poviša v času okna vgnezdenja) in protein ter SPP1 (ligand, ki izražanje 2013) se veže na ITGA3) in protein v SS fazi v lumnu in žlezah epitelija EvEA proti K → možna ↓ interakcija med trofoblastom in integrinov endometrijem pri A. Spremembe v (Mehasseb in ↓ ESR1 v SS fazi v žlezah epitelija in strome funkcionalne plasti EvEA proti K; izražanju sod., 2011) ↑ ESR2 v P fazi v žlezah epitelija funkcionalne plasti EvEA in v vseh fazah menst. ciklusa v EkEA proti K; receptorjev za ↓ PGR (izooblika A in B) v SS in LS fazi v stromi funkcionalne plasti EvEA in EkEA proti K → ↑ ESR2 v EvEA, ki bi lahko steroidne hormone omogočal ↑ prenos signala E2 s proliferativnim in proapoptoznim delovanjem, in istočasno ↓ izooblike B PGR, ki prevaja signal P4 (ima antiproliferativni efekt), bi lahko ustvarilo okolje, ki spodbuja razvoj A. Spremenjeno izražanje receptorjev v EvEA bi lahko vodilo v ↓ izražanje genov, povezanih z vgnezdenjem zarodka. (Nie in sod., ↓ izooblika B PGR v EvEA in EkEA proti K, pridobljenih v P in S fazah → EvEA bi lahko kazal znake odpornosti na P4. 2009) Odsotnost PGR v EkEA pa bi bil lahko vzrok slabe uspešnosti zdravljenja A s progestacijsko terapijo. Fibroza (Shen in sod., ↑ št. trombocitov ( trikromo barvanje po Massonu, barvanje po Van Gieson) v EkEA v miši z inducirano A proti K → EkEA so adenomioznih lezij 2016) rane, ki so podvržene ponavljajočim se poškodbam in celjenju, kar vodi v fibrozo. se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 3. Molekularne spremembe zaradi prisotne adenomioze Fibroza (Liu in sod., ↑ stopnja kolagenskih vlaken (trikromo barvanje po Massonu, barvanje po Van Gieson in Picrosirius rdeče barvanje) v EkEA adenomioznih lezij 2016) proti K → A vsebuje fibrozno tkivo; ↑ gostota trombocitov (↑ ITGA2B (angl. integrin alpha-IIb, pogost uporabljen sinonim CD41)) v stromi EkEA proti K, pridobljenih v P in S fazah; ↑ VEGF v epiteliju in CD31, ki označuje MVD, v stromi EkEA proti K; ↑ PCNA (angl. proliferating cell nuclear antigen) v epiteliju EkEA proti K; ↑ TGFB1 (angl. transforming growth factor beta-1 proprotein) in p-SMAD3 v EkEA proti K; ↓ CDH1 in ↑ VIM v EkEA proti K; ↑ ACTA2 (pogost sinonim α-SMA) in Kolagen 1 (ni podatka o podtipu) v epiteliju in stromi EkEA proti K; ↑ LOX (Označevalec za določanje obsežnosti fibroze) v epiteliju in stromi EkEA proti K; ↓ izooblika B PGR v EkEA proti K; ↑ DES (angl. desmin. Označevalec diferenciranih in zrelih celic gladkega mišičja), MYH11 (angl. Myosin-11, pogosto uporabljen sinonim SM-MHC( smooth muscle myosin heavy chain): specifičen označevalec celic gladkega mišičja) in OXTR v tkivu gladkega mišičja in stromi EkEA proti K → kopičenje trombocitov v EkEA ↑ TGFB1, kar ↑ mehanizme EMT, transdiferenciacijo fibroblastov v miofibroblaste (angl. fibroblast-to-myofibroblast transdifferentiation, FMT) in metaplazijo gladkih mišic (angl. smooth muscle metaplasia, SMM). Tvori se fibroza. Trombociti, bi lahko bili tudi vzrok prekomernega krčenja maternice in oživčenja miometrija. 4. Transkriptomske raziskave EvEA (Martinez- Adenomioza potrjena s TVUZ in MR; Conejero in Biopsija endometrija pridobljena v SS fazi 6 ženskam z in 6 brez adenomioze; sod., 2011) Uporabljena tehnologija mikromrež (ni naveden podatek o platformi) → 34 spremenjeno izraženih genov ( p < 0,05). (Herndon in Adenomioza potrjena s histerektomijo; sod., 2016) Vzorci endometrija pridobljeni v P fazi 3 ženskam z difuzno adenomiozo in 5 kontrolam; Uporabljena tehnologija mikromrež (Human Gene 1.0 ST, Affymetrix) → 1024 spremenjeno izraženih genov (FDR < 0,05; > 2-kratna razlika v izražanju ). se nadaljuje Prašnikar E. Vzorec izražanja genov v endometriju v stanju receptivnosti pri preiskovank z adenomiozo. Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2022 nadaljevanje Priloge B Mehanizem Referenčna Glavni rezultat in ugotovitve raziskave patofiziologije literatura adenomioze 4. Transkriptomske raziskave EvEA (Jiang J.F. in Adenomioza potrjena s histerektomijo; sod., 2016) Vzorci endometrija pridobljeni v P fazi 4 ženskam z adenomiozo in 4 kontrolam; Uporabljena tehnologija mikromrež (Human Transcritome Array 2.0., Affymetrix) → 165 in 612 spremenjeno izraženih lncRNA oz. mRNA (FDR < 0,05). (Dior in sod., Adenomioza potrjena s TVUZ ženskam s pridruženo endometriozo; 2018) Vzorci endometrija pridobljeni v ZP, SP, ZS, SS in PS fazi ženskam z in brez adenomioze (ni navedenih številk); Uporabljena tehnologija mikromrež (Human HT-12v4.0 Beadchips, Illumina) → 0 spremenjeno izraženih genov (FDR < 0,05). (Xiang in Adenomioza potrjena s histerektomijo; sod., 2019) Vzorci endometrija pridobljeni v P fazi 6 ženskam z adenomiozo in 6 kontrolam; Uporabljena tehnologija RNA-seq (Hiseq 2500, Illumina) → 373 spremenjeno izraženih genov (FDR < 0,05). (Liu in sod., Adenomioza potrjena z histerektomijo; 2021) Vzorci endometrija pridobljen (ni navedenega podatka o datiranju) eni ženski z adenomiozo in eni kontroli z miomom; Uporabljena tehnologija scRNA-seq (HiSeq X Ten, Illumina) → 196 spremenjeno izraženih genov vseh celičnih tipov ( p < 0,05).