Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 171 Pregledni znanstveni članek @publisher.id: 2923 @primary-language: sl, en @discipline-en: Microbiology and immunology, Stomatology, Neurobiology, Oncology, Human reproduction, Cardiovascular system, Metabolic and hormonal disorders, Public health (occupational medicine), Psychiatry @discipline-sl: Mikrobiologija in imunologija, s tomatologija, nevrobiologija, Onkologija, r eprodukcija človeka, srce in ožilje, Metabolne in hormonske motnje, Javno zdravstvo (varstvo pri delu), Psihiatrija @article-type-en: Editorial, Original scientific article, Review article, Short scientific article, Professional article @article-type-sl: Uvodnik, izvirni znanstveni članek, Pregledni znanstveni članek, klinični primer, strokovni članek @running-header: Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA @reference-sl: Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 @reference-en: Zdrav Vestn | March – April 2020 | Volume 89 Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA Molecular genetic aspects of ancient DNA analyses Irena Zupanič Pajnič Iz vleč ek Prispevek na pregleden način opisuje molekularnogenetske vidike preiskav človeške starodav- ne DNA in uporabo molekularnogenetskih metod za preučevanje DNA, pridobljene iz človeških arheoloških bioloških materialov. V arheoloških bioloških materialih so pogosto edini vir sta- rodavne DNA skeletni ostanki (kosti in zobje), zato se bomo osredinili na ta tkiva. Iz pregledane literature bomo povzeli, kateri skeletni elementi so najprimernejši za preiskave starodavne DNA in kako iz njih pridobimo DNA. Prav tako bomo razložili naravo starodavne DNA in njeno ohra- njenost. V arheoloških bioloških materialih je zelo malo DNA in je močno poškodovana. Zato se zlasti pri delu s starodavnimi človeškimi vzorci pojavijo težave, povezane s kontaminiranjem s sodobno DNA človeka. Za zmanjšanje tega tveganja je potrebno upoštevati več standardnih pre- vidnostnih ukrepov in preverjati avtentičnost starodavne DNA. V prispevku bomo tem ukrepom namenili posebno pozornost. Opisali bomo genetske označevalce, ki jih v arheogenetiki najpo - gosteje preiskujemo, in prednosti novih, visoko zmogljivih tehnik sekvenciranja za razvoj in pre- učevanje starodavne DNA. Danes lahko z njimi preiskujemo bolj razgrajeno DNA in s tem starejše arheološke biološke materiale. Tako pridobivamo ogromne količine kakovostnih podatkov, ki zahtevajo vključevanje strokovnjakov na področju bioinformatike. Prispevek bomo zaključili s predstavitvijo preiskav starodavne DNA v Sloveniji. Abstract This review article presents molecular genetic aspects of human ancient DNA analyses and use of molecular genetic methods for study of DNA obtained from human archaeological biological materials. In archaeological biological materials, skeletal remains (bones and teeth) are often the only source of ancient DNA and we will focus on these tissues. From the literature reviewed, we will summarise which skeletal elements are most suitable for the investigation of ancient DNA and how to extract the DNA from them. The nature and preservation of ancient DNA will be described as well. However, low amount and degradation of ancient DNA causes several pro- blems, especially when working with ancient human samples that may be contaminated with modern human DNA. To minimise the risk of contamination, several standard precautions are usually adopted and the authenticity of ancient DNA checked. We will pay special attention to these measures. The genetic markers most frequently examined in archaeogenetics and the ad- vantages of new, high-performing sequencing techniques for the development and study of an- cient DNA will be described. Using new techniques that may help us retrieve data of better quali- ty and quantity, we can investigate more degraded DNA and thus older archaeological biological materials, thereby obtaining huge amounts of data that require the involvement of experts in the field of bioinformatics. The paper will be completed by the presentation of ancient DNA analyses performed in Slovenia. Citirajte kot/Cite as: z upanič Pajnič i. [Molecular genetic aspects of ancient dna analyses]. zdrav vestn. 2020;89(3–4):171–89. Inštitut za sodno medicino, Medicinska fakulteta, Univerza v Ljubljani, Ljubljana, Slovenija Korespondenca/ Correspondence: irena z upanič Pajnič, e: irena.zupanic.pajnic@ gmail.com Ključne besede: arheogenetika; človeški skeletni ostanki; poškodovana DNA; kontaminacija Key words: archaeogenetics; human skeletal remains; damaged DNA; contamination Prispelo: 29. 1. 2019 Sprejeto: 14. 8. 2019 172 Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 JAVNO ZDrAVS tVO (VAr StVO PrI DELU) DOI: 10.6016/z dravvestn.2923 1  Uvod Ko se v genetskih preiskavah upo‑ rablja DNA, izolirana iz slabo ohranje‑ nih, lahko več stoletij ali tisočletij sta‑ rih ostankov organizmov, govorimo o starodavni DNA (angl. ancient DNA, aDNA). Časovna meja med starimi – arheološkimi in relativno modernimi – forenzičnimi človeškimi ostanki se med različnimi državami razlikuje. Večina držav označi kot arheološko vse, kar je starejše od 50 do 100 let (1). Opredelitev je odvisna tudi od drugih okoliščin, kot je možnost identificiranja oseb in s tem vrnitve posmrtnih ostankov družini. Če je oseba, ki je odgovorna za smrt, še ved‑ no živa in je proti njej možno sprožiti kazenski postopek, se posmrtni ostanki prav tako obravnavajo kot forenzični. Po Bouwmanu (2) je starodavna DNA tista, ki je starejša od 70 let po nastopu smrti osebe ali živega bitja. Začetki prei‑ skav starodavne DNA segajo v leto 1984, področje pa je doživelo bliskovit razvoj nekaj let pozneje z odkritjem verižne reakcije s polimerazo (angl. Polymerase Chain Reaction, PCR), kar je omogo‑ čilo preučevanje zelo majhnih količin in tarčno specifičnih odsekov DNA v arheološkem biološkem materialu, do‑ datno pa se je okrepilo z razvojem no‑ vejših, visoko zmogljivih tehnik sekven‑ ciranja naslednje generacije (angl. Next Generation Sequencing, NGS) (3). Arheogenetika je interdisciplinarna veda, pri kateri je za sintezo in razume‑ vanje vseh zbranih podatkov (tako arhe‑ oloških kot genetskih) potrebno sodelo‑ vanje strokovnjakov različnih področij. S preiskavo starodavne DNA odgovar‑ jamo na arheološka vprašanja, zato ob pomanjkanju sodelovanja med različni‑ mi strokovnjaki, genetskih podatkov o starodavni DNA ne moremo smiselno interpretirati. Ob sodelovanju arheo‑ logov, paleozoologov, genetikov, bioin‑ formatikov in drugih lahko s pomočjo arheogenetike odgovorimo na nekatera družbena in kulturna vprašanja človeške zgodovine ter dobimo vpogled v meha‑ nizme evolucije organizmov. Tako nam DNA, pridobljena iz arheoloških ostan‑ kov, ponuja številne možnosti za razi‑ skovanje starodavnih populacij, njihovih migracij, bolezni, genetskih sprememb zaradi načina prehrane (npr. laktozna in‑ toleranca) in specifičnih genetskih prila‑ goditev na življenjsko okolje in določe‑ ne bolezni (npr. malarija) (2,4). Študije o genetski raznolikosti v sodobnih popu‑ lacijah na primer kažejo na afriške pred‑ nike vseh sodobnih ljudi (5). Vendar pa je starodavna DNA zelo uničena, zato se zlasti pri delu s starodavnimi človeškimi vzorci pojavijo težave, povezane s kon‑ taminacijo s sodobno DNA ljudi, ki pri preiskavah sodelujejo ali so bili v stiku s skeletnimi ostanki (6). Da bi zmanjšali tveganje za napačno pridobivanje rezul‑ tatov zaradi možnosti kontaminacije s sodobno DNA, je na področju preiskav starodavne DNA treba upoštevati več standardnih previdnostnih ukrepov za preprečevanje kontaminacije in prever‑ janje avtentičnosti starodavne DNA (7). Del člankov, ki so navedeni v poglavju Literatura, je v svojem magistrskem delu pregledal Marcel Obal (8) in jih v tem preglednem članku povzemamo. Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 173 Pregledni znanstveni članek 2  V plivi r azličnih dejavnik o v  na ohranjenost starodavne DNA Arheološki skeletni ostanki vsebujejo zelo malo DNA, ki je močno razgrajena (degradirana). Uspešnost genetskih prei‑ skav dodatno omejujejo inhibitorji reak‑ cije PCR, ki so pogosto prisotni v starih skeletih (9,10). Na neuspeh preiskav pa lahko vpliva tudi velika izpostavljenost kontaminaciji s sodobno DNA (11). Škodljivi učinki različnih dejavnikov okolja močno vplivajo na ohranjenost starih skeletnih ostankov, zato iz njih težko pridobimo nepoškodovano in ne‑ kontaminirano DNA. Po smrti organiz‑ ma se celično ravnovesje poruši. Pride do poškodb DNA in do njene fragmen‑ tacije, zaradi česar postaja razmerje med številom fragmentov posamezne dolžine in njihovo dolžino obratnosorazmer‑ no; najdaljših fragmentov DNA se oh‑ rani najmanj (3,12). Preučevanje DNA, izolirane iz različno starih posmrtnih ostankov, najdenih na različnih lokaci‑ jah, dokazuje, da na ohranjenost DNA ne vpliva zgolj čas, ki je pretekel od smrti organizma, temveč predvsem okolje, v katerem se je organizem po smrti naha‑ jal. Geološke in kemijske lastnosti zemlje ter prisotnost soli, izpostavitev sevanju, pH, dostop kisika in vlage, prisotnost mikroorganizmov ter temperatura so glavni dejavniki okolja, ki vplivajo na ohranjenost (13‑15). Poleg fragmentacije lahko pod vplivom teh dejavnikov pride tudi do navzkrižnega povezovanja verig in sprememb ter delecij v nukleotidnem zaporedju (13). Najprimernejši pogoji za dobro ohranjanjenost DNA so nizka izpostavljenost ultravijoličnemu (UV) sevanju, hitra izsušitev posmrtnih ostan‑ kov, nizka vlažnost, visoka koncentracija soli, rahlo bazičen ali nevtralen pH, niz‑ ka vsebnost huminskih kislin, odsotnost mikroorganizmov in predvsem nizka temperatura, ki je ključnega pomena (12). Vzorci podobne starosti, shranjeni pri nizkih temperaturah, so bolje ohranje‑ ni kot tisti, ki so bili izpostavljeni višjim temperaturam. Na količino in kakovost DNA v starodavnih vzorcih vpliva tudi ravnanje s skeleti po izkopu (16). Vzorci, dlje časa shranjeni v muzejskih zbirkah, običajno pri sobni temperaturi, dajejo slabše rezultate tipizacije kot sveže izko‑ pani vzorci (16). Na ohranjenost DNA pa vplivajo tudi individualnospecifični dejavniki, kot so rasna pripadnost, spol, starost in tip skeletnih elementov (17). 3  Sestava in potek razgradnje kosti in zob Prve izolacije starodavne DNA so bile narejene iz ostankov mehkih tkiv, saj so raziskovalci predpostavljali, da je v njih največ DNA, podobno kot pri ži‑ vih bitjih. Kasneje so poskušali izolirati starodavno DNA tudi iz kosti. Uspešna izolacija leta 1989 je pokazala, da ske‑ letni ostanki vsebujejo več DNA kot oh‑ ranjena mehka tkiva (18). Zaradi svoje strukture se najdlje in najbolje ohranijo kosti in zobje, zato so običajno najboljši in pogosto edini vir DNA. Mehka tkiva so na makrostrukturni ravni fizično bolj dostopna mikroorganizmom in drugim dejavnikom okolja, zaradi česar je njihov razkroj hitrejši, nasprotno pa so kosti fi‑ zično bolj odporne in se zato bolje ohra‑ nijo (13,19). Razumevanje sestave in poteka raz‑ gradnje kosti in zob nam pomaga pri iz‑ biri primernih vzorcev za pridobitev in preučevanje DNA v starih skeletnih os‑ tankih, zato si poglejmo strukturo kos‑ ti in zob! Anatomsko zob razdelimo na krono, vrat in korenimo. Zunanja plast krone je prekrita s sklenino, ki je najtr‑ še tkivo v človeškem telesu in je skoraj v celoti mineralnega izvora in ne vsebuje 174 Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 JAVNO ZDrAVS tVO (VAr StVO PrI DELU) celic. Korenina zoba je prekrita s cemen‑ tom, ki je mineralizirano tkivo, sestavlje‑ no iz hidroksiapatita, kolagena in drugih nekolagenskih proteinov (15). Cement brez celic se nahaja v vratnem delu zob‑ ne korenine. Cement, ki vsebuje v med‑ celičnino ujete celice, pa se nahaja v api‑ kalnem delu zobne korenine in je dober vir DNA (20). Na meji med krono in ko‑ renino – v področju, imenovanem zob‑ ni vrat, – se stikata sklenina in cement, pod njima pa se nahaja zobovina, ki ščiti zobno pulpo. Zobovina in pulpa predsta‑ vljata glavnino zoba in sta v nasprotju s sklenino bogata s celicami; večinoma gre za odontoblaste in fibroblaste. Zobovino sestavljajo hidroksiapatit, kolagen tipa I in voda (15). Zobna pulpa je dobro oži‑ ljena in oživčena in predstavlja bogat vir DNA. Zobje z večjo pulpo in zobje z več koreninami so najboljši vir DNA, saj vsebujejo več celic pulpe, prav tako pa imajo več zobnega cementa v primerjavi z zobmi z eno korenino. Po priporočilih so najprimernejši kočniki, če slednjih ni, se za uporabo priporočajo ličniki (15). Kostninino makroskopsko delimo na kompaktno in spongiozno. Kompaktna kostnina sestavlja zunanji del koncev dolgih kosti (epifiza) in ploščatih kos‑ ti ter srednji del dolgih kosti (diafi‑ za). Spongiozo najdemo v notranjosti ploščatih kosti in v koncih dolgih kosti. Zaradi krhkosti spongiozne kostnine le‑ta potrebuje zunanjo zaščitno plast kompaktne kostnine (13). Mikroskopsko kost sestavljajo celice in medcelični‑ na. Medceličnina sestoji iz organskega in anorganskega dela. Organski del je v največji meri kolagen tipa I in nekateri drugi proteini in glikoproteini, anorgan‑ ski del pa hidroksiapatit, sestavljen iz kalcijevih in fosfatnih ionov, prisotni pa so še bikarbonatni, magnezijevi, kalijevi in natrijevi ioni (13). Kalcijevi in fosfatni ioni tvorijo krtistale hidroksiapatita, iz katerih so plošče, ki ležijo vzdolž kola‑ genskih vlaken. Povezava kolagenskih vlaken s kristali zagotavlja trdnost in od‑ pornost kostnine (13). Tafonomske pro ‑ cese, ki vplivajo na ohrnitev DNA v ske‑ letnih tkivih, smo opisali že v prejšnjem poglavju (čas, ki je potekel od smrti or‑ ganizma, faktorji okolja in individulno specifični dejavniki). Na to, kako hitro in na kakšen način bodo dejavniki oko‑ lja vplivali na spremembe v kosteh in zobeh po smrti, pa v veliki meri vpliva poroznost. Velikost por v kostnem tkivu in njihova medsebojna povezanost dolo‑ čata, kako bodo vanj in iz njega preha‑ jali voda, mikroorganizmi in drugi del‑ ci (19). Propad kostnih celic in mehkih tkiv v žilah naredi kost bolj porozno. Zaradi večanja poroznosti s časom lah‑ ko v prsti prisotne glive in bakterije ter v vodi prisotne cianobakterije lažje vdira‑ jo v tkivo in ga delajo še bolj poroznega, s čimer zmanjšajo možnost njegovega preživetja (13). Nasprotno pa lahko pri ‑ de tudi do zmanjšanja poroznosti zaradi permineralizacije, ki postopoma vodi v fosilizacijo, zaradi česar se kost bolje oh‑ rani (19). Mehanizmi procesa razgradnje in lo‑ kacije ohranjanja DNA v kostnem tkivu še niso v celoti raziskani. Kemp in Smith sta zagovornika hipoteze, ki pravi, da omogoča stabilnost DNA in njeno oh‑ ranitev v starodavnih skeletnih ostankih vezava DNA na hidroksiapatit, ki pred‑ stavlja glavno kostno maso (21). Na ul ‑ trastrukturni ravni naj bi na upočasnje‑ no razgradnjo molekule DNA in zaščito pred encimskimi procesi v skeletnih os‑ tankih vplivala vezava njenih negativno nabitih fosfatnih skupin na hidroksilne skupine hidroksiapatita, čemur pritrju‑ je dejstvo, da se ob povečani razgradnji hidroksiapatita ohrani manj DNA, prav tako pa naj bi se molekula DNA vezala na kolagen – ekstrakcija DNA iz kostne‑ ga prahu je zato možna iz hidroksiapa‑ titne in kolagenske frakcije (12,13,22). Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 175 Pregledni znanstveni članek Kolagen in hidroksiapatit skupaj tvorita tesno strukturo, ki zaradi majhnih por onemogoča kolagenazam vdor mikroor‑ ganizmov (23). Ohranjenost in količina DNA vedno ne sovpadata z makroskopskim stanjem kosti, saj se lahko ta zdi morfološko v slabem stanju, a je iz nje v nekaterih primerih vseeno možno ekstrahirati za‑ dostno količino dobro ohranjene DNA. Nasprotno nam stanje na mikroskopski ravni pove mnogo več o ohranjenos‑ ti in količini DNA. Raziskava strukture srednjeveških človeških kosti s trans‑ misijsko elektronsko mikroskopijo in imunohistokemijskimi metodami ter vsebnosti in ohranjenosti DNA v teh kosteh je pokazala povezavo med struk‑ turo in vsebnostjo ter ohranjenostjo DNA. Dobro ohranjena DNA se nahaja v agregatih kristalov, povezana je z zelo dobro ohranjeno mikrostrukturo z malo demineralizacije, ohranjenimi lamela‑ mi, visoko vsebnostjo kolagena in bolj kompaktnim izgledom pri transmisijski elektronski mikroskopiji, kjer so vidni intaktni osteoni in dobro organiziran kostni matriks z vsebnostjo kolagena in osteokalcina (22). Pri zobeh je pulpa dobro ožiljena in oživčena in predstavlja bogat vir DNA, vendar je lahko prisotna v omejeni koli‑ čini ali je celo ni pri starih zobeh, med‑ tem ko zobna korenina vsebuje približno desetkrat več DNA kot krona, saj slednjo večinoma sestavlja brezcelična zobna sklenina. Če sklenino uporabimo pri vzorčenju v kombinaciji z ostalimi zob‑ nimi tkivi, lahko prisotnost mineralov moti ekstrakcijo in zavira pomnoževanje DNA v reakciji PCR (15). Po smrti posa ‑ meznika so zobje podvrženi v veliki meri enakim dejavnikom kot kosti, a so na te dejavnike bolj odporni in zato primer‑ nejša izbira za genetske preiskave, saj so bolje zaščiteni tako zaradi zgradbe tkiv kot tudi zaradi pozicije v čeljusti. Vse to predstavlja dodatno obrambo pred okoljskimi vplivi in fizičnimi poškod‑ bami, ki bi lahko pospešili propad tkiv. Preiskave forenzičnih skeletnih ostankov so pokazale, da je najugodnejši medij, v katerem se zobje lahko nahajajo od smrti posameznika do najdbe, zrak. Nekoliko slabše rezultate dajejo zobje, ki so bili za‑ kopani v zemljo, najslabše pa zobje, ki so bili v vodi (15). Zobna tkiva se razgrajuje‑ jo počasi tudi v skrajnih razmerah, saj so odporna na skrajne temperature in manj dovzetna za hidrolizo (12). Hkrati, po ‑ dobno kot pri kosteh, tudi zobe ščiti ko‑ lagen. Mineralizirani kolagen je mnogo odpornejši od nemineraliziranega in se zato ob odsotnosti encimske razgradnje lahko v kosteh ohranja več sto ali celo več tisoč let (23). Voda, pH in poroznost mineraliziranega tkiva so dejavniki, ki vplivajo na topnost hidroksiapatita; voda omogoči raztapljanje mineralnih ionov, prav tako se topnost viša z nižanjem pH. Izmenično suha in vlažna okolja in okolja z nenehnim vodnim pretokom so bolj škodljiva kot nenehno vlažna oko‑ lja (15,19,23). Potrebno je upoštevati tudi, ali je zob po smrti izpadel ali ne, saj al‑ veolna kost pomaga zmanjšati možnost kontaminacije (15). 4  Upor ab a r azličnih  skeletnih elementov za preiskave starodavne DNA Za genetske preiskave skeletov iz arheoloških najdišč ni vedno mogoče vzorčiti večjega števila skeletnih elemen‑ tov. Skeleti so pogosto nepopolni in so hkrati pomembni del kulturne dedišči‑ ne. Genetske preiskave so destruktivne, saj delček kosti ali zoba zmeljemo v prah in tako pomenijo oster poseg v kulturno dediščino. Zaradi svoje destrukivne na‑ rave in posega v neobnovljivi vir kultur‑ ne dediščine je treba genetske preiskave 176 Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 JAVNO ZDrAVS tVO (VAr StVO PrI DELU) temeljito upravičiti in utemeljiti tako s prispevkom na področju genetskih prei‑ skav kot na področju kulturne dediščine. Za preiskave starodavne DNA moramo izbrati najprimernejši skeletni element in nekaj alternativnih, ki bi prav tako omogočali uspešno preiskavo. Najprimernejše za izoliranje in ana‑ lizo DNA iz skeletov so po trenutnih priporočilih za vzorčenje forenzičnih skeletov kompaktne kosti, predvsem dolge kosti nog (stegnenica in golenica) in zobje, manj primerne pa so ploščate in spongiozne kosti, kot so kosti lobanje, vretenca in rebra, pri čemer so za vzor‑ čenje najprimernejši predeli kompaktne kostnine (24‑27). Mundorff in sodelav ‑ ci (17,28) v najnovejših študijah forenzič‑ nih skeletnih posmrtnih ostankov doka‑ zujejo, da dolge, kompaktne kosti morda niso (edina) najboljša izbira za analizo DNA. Ugotavljajo, da so rezultati analiz pogačic, stopalnic in prstnic nog in rok primerljivi ali celo boljši od stegnenic in golenic. Ugotavljajo, da je količina je‑ drne DNA na enoto mase kosti mnogo višja pri majhnih spongioznih kosteh, ki jih do sedaj običajno niso vzorčili in uporabljali za genetske preiskave, v pri‑ merjavi s kompaktnimi kostmi (17). Potrditev temu so tudi nekatere druge forenzične raziskave, ki govorijo o zelo uspešnih analizah DNA, pridobljene iz tovrstnih kosti, in celo priporočajo upo‑ rabo prstnic kot nadomestek za stegne‑ nico zaradi lažjega vzorčenja in dobrih rezultatov (29,30). Majhne spongiozne kosti je enostavneje vzorčiti, saj za vzor‑ čenje ne potrebujemo žage, kar zmanjša možnost kontaminacije s sodobno DNA, hkrati pa je vzorčenje teh kosti hitrejše in učinkovitejše. Vzroki za večjo koli‑ čino in bolj ohranjeno DNA v tej vrsti kostnine še niso znani. Andronowski in sodelavci (29) preko raziskave mi‑ krostrukture kostnine ugotavljajo, da kljub večjemu številu osteocitnih lakun v kompaktni kostnini ni povezave s koli‑ čino DNA na enoto mase vzorca, so pa s pomočjo sinhrotrone radiacijske mikro‑ računalniške tomografije opazili ostanke prostemu očesu nevidnih mehkih tkiv med trabekulami spongiozne kostnine in postavili hipotezo, da bi naj ostanki mehkih tkiv vsebovali celice kostnega mozga, pokostnice in endoosteuma, kar naj bi vplivalo na večjo količino DNA v spongiozni kostnini (29). Prav tako v nasprotju z uveljavljenimi priporočili za vzorčenje forenzičnih skeletov naj‑ novejše raziskave kažejo, da je za genet‑ ske preiskave skeletiziranih posmrtnih ostankov najprimerneje vzorčiti zobni cement v predelu korenine (20) in ne ce‑ lega zoba. Pri preiskavah arheoloških skeletov se veliko raziskav osredinja na primerja‑ vo različnih skeletnih elementov s sred‑ njim delom senčnice – skalnico, ki je ena najtrših kosti v človeškem telesu (31,32). Pinhasi s sodelavci (33) je ugotovil, da je skalnica najprimernejši skeletni ele‑ ment za vzorčenje arheoloških skeletnih ostankov (33). Gamba in sodelavci (34) s primerjavo količine DNA v skalnicah in zobeh prihajajo do zaključka, da je ko‑ ličina endogene DNA v skalnici večja od tiste v zobeh, vendar pa pri slednjih niso vzorčili le zobnega cementa (34). Medtem Hansen in sodelavci (32) s pre ‑ iskavo obeh elementov (zobni cement in skalnica), pridobljenih iz istega ske‑ leta, ki se med seboj razlikujejo po sta‑ rosti in okolju, v katerem so se po smrti nahajali, ugotavljajo, da lahko dobro ohranjen zobni cement vsebuje enako ali celo večjo količino DNA kot skalni‑ ca, vendar pa ob slabi ohranjenosti zob (krhki zobje, brez cementa) priporočajo uporabo skalnice. Slednja je po njihovih raziskavah v slabših ohranitvenih pogo‑ jih odpornejša oziroma bolje zaščitena v primerjavi z zobnim cementom, zato se DNA v njej ohrani dlje (32). Do podob ‑ Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 177 Pregledni znanstveni članek nih ugotovitev prihajajo Pilli in sodelav‑ ci (31), ki s primerjavo skalnic, stegnenic in zob posameznega skeleta, skupno tri‑ najst skeletov iz 6. do 7. stoletja, dokazu‑ jejo, da se DNA v skalnici ohrani bolje tudi v primerjavi s stegnenico in zobmi. Sklepajo, da je vzrok temu visoka gostota kostnine v skalnici, kar zviša odpornost in zmanjša poškodbe in razkroj DNA, ki bi ga povzročile bakterije po smrti orga‑ nizma (31). 5  Gene t ski o znač e v alci v  preiskavah starodavne DNA Zgolj približno 5 % celotne molekule DNA so eksoni, tj. tisti deli, ki predsta‑ vljajo zaporedja, ki kodirajo proteine. Preostanek molekule DNA so nekodi‑ rajoča področja, imenovana introni, ka‑ terih vloga kljub temu, da predstavljajo večinski del, še ni v celoti znana (35). V evolucijskih procesih so introni izpostav‑ ljeni nekoliko drugačnim procesom kot eksoni; mutacije se lahko pojavijo v tako kodirajočih kot tudi nekodirajočih predelih DNA, vendar pri slednjih niso nujno fenotipsko izražene. Toda v njih vseeno povzročajo visoko stopnjo po‑ limorfnosti, saj so mutacije tukaj manj nadzorovane kot v kodirajočih predelih. Tako najdemo denimo hipervariabilne lokuse na avtosomih in spolnih kromo‑ somih, ki jih uporabljamo kot označe‑ valce za razlikovanje oseb v nekodirajo‑ čih regijah, saj so zaradi visoke stopnje polimorfnosti ti predeli mnogo bolj in‑ dividualno specifični (35). V človeškem genomu poznamo tri vrste takih poli‑ morfizmov: minisatelite, mikrosatelite ali kratke tandemske ponovitve (angl. Short Tandem Repeat, STR) in polimorfizme posameznega nukleotida (angl. Single Nucleotide Polymorphism, SNP) (35) . V arheogenetiki se od teh genetskih ozna‑ čevalcev uporabljajo predvsem lokusi STR na avtosomih in kromosomu Y ter označevalci SNP . Mikrosateliti so predeli DNA, ki sestojijo iz zaporednih ponav‑ ljajočih se homolognih enot (osnovnih motivov). Visoka stopnja polimorfnosti mikrosatelitnih lokusov je posledica raz‑ ličnega števila ponovitev osnovnih moti‑ vov, zaradi česar govorimo o dolžinskih polimorfizmih (35). Pri označevalcih SNP obstaja v genomu na točno dolo‑ čenih mestih več možnih različic baz; med aleli je torej razlika zgolj pri enem nukleotidu. Gre za najpogostejšo obliko polimorfizma v genomu, ki se pojavlja v bi‑, ‑ ali tetraalelni obliki (35). Lokusi STR in označevalci SNP so zaradi svoje velikosti (lokusi STR 100 do 400 baznih parov in označevalci SNP do 150 baznih parov) pri preiskavah starodavne DNA, ki je močno razgrajena, najprimernejši za uporabo, saj je pomnoževanje DNA v reakciji PCR uspešnejše, če pomno‑ žujemo krajše odseke (36). Avtosomski mikrosateliti, ki se dedujejo kodominan‑ tno, se nahajajo na katerem koli izmed 22 parov avtosomov, torej kromosomih, ki niso odgovorni za določitev spola. Tako kot avtosomi in kromosom X, vse‑ buje tudi kromosom Y mikrosatelite, vendar jih je na kromosomu Y manj za‑ radi njegove majhnosti (12). Kromosom Y ni udeležen v rekombinaciji, zato lah‑ ko z genetsko preiskavo mikrosatelitov kromosoma Y sledimo očetovi liniji, saj imajo vsi potomci istega očeta identičen haplotip kromosoma Y. Odsek moleku‑ le DNA, ki je podedovan le po enem od staršev, imenujemo haplotip. Molekule DNA pa se ne nahajajo le v celičnem jedru, pač pa jih najdemo tudi v mitohondrijih – organelih, odgovornih za proizvodnjo celične energije. MtDNA je dolga 16.569 bp in ima v celoti določe‑ no nukleotidno zaporedje (37). Za prei ‑ skave starodavne DNA je zaradi izredne polimorfnosti zanimiva zlasti nekodi‑ rajoča kontrolna regija mtDNA (38). Človeške celice vsebujejo številne kopi‑ 178 Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 JAVNO ZDrAVS tVO (VAr StVO PrI DELU) je mitohondrijskega genoma, kar daje, v primerjavi z le dvema kopijama jedrnega genoma, veliko večjo možnost ekstrak‑ cije mtDNA iz starih, slabo ohranje‑ nih bioloških vzorcev (39). Vsaka celica vsebuje približno 500 mitohondrijev, vsak mitohondrij pa 5 do 10 molekul mtDNA (40). Pri preiskavi starodavne DNA je prednost uporabe mtDNA pred jedrno DNA tudi v tem, da se ohrani daljši čas, saj jo pred razgradnjo z ekso‑ nukleazami ščitita njena krožna oblika in mitohondrijska ovojnica (40). Zaradi naštetih lastnosti mtDNA lahko biološke vzorce, katerih tipizacija jedrne DNA ni uspešna, preiskujemo s polimorfizmi mtDNA. MtDNA se deduje po materi in se v nespremenjeni obliki prenese na vse materine potomce ne glede na spol, zato uporabljamo njena nukleotidna zapo‑ redja kot označevalce za maternalne ro‑ dovnike, kar je potrebno upoštevati pri izbiri referenčnega oziroma primerjalne‑ ga vzorca pri identifikaciji zgodovinskih osebnosti. Osebe z enakimi zaporedji nukleotidov mtDNA imajo skupnega ženskega prednika (39), kar predstavlja osnovo za identifikacijo bioloških vzor‑ cev s tipizacijo mtDNA. Mitohondrijski genom je zato zelo uporaben za določa‑ nje identitete starih posmrtnih ostankov ter preučevanje genealoških odnosov, saj lahko kot referenčni vzorec uporabimo tudi za nekaj generacij oddaljene sorod‑ nike po materini liniji (38). Starodavna DNA je običajno razgra‑ jena na 100 do 500 bp dolge fragmente, baze pa so zaradi molekulskih poškodb (depurinacija in deaminacija) spreme‑ njene (18,41). Razumevanje teh procesov in njihovih učinkov na starodavno DNA je bistveno za pravilno izbiro tarčnih sekvenc, ki morajo biti kratke, saj lahko le na ta način iz starodavne DNA prido‑ bimo genetsko informacijo in se izogne‑ mo napačni interpretaciji rezultatov. V preteklosti so genetske preiskave staro‑ davne DNA temeljile predvsem na pre‑ iskavah mtDNA (42). V zadnjem času pa nekatere raziskovalne skupine (med njimi tudi naša) poročajo o uspešni tipi‑ zaciji jedrne DNA, pridobljene iz starih skeletov (43−46). Tipizacija avtosomske jedrne DNA je za identifikacijske namene najpri‑ mernejša, saj je individualno specifična in nam daje informacijo o sorodstvu po obeh starših (47). Preiskujemo dol ‑ žinske polimorfizme področij STR ali polimorfizme SNP, saj so izredno varia‑ bilni, zaradi rekombinacije individualno specifični in imajo veliko moč razlikova‑ nja, ki omogoča zanesljivo identifikacijo posameznika (12,43,48). Kadar tipizacija jedrnih področij STR zaradi močne raz‑ grajenosti DNA ni mogoča, lahko upo‑ rabimo tudi označevalce SNP. Nedavni razvoj tehnologije NGS ima pri preiska‑ vah DNA, pridobljene iz skeletnih ostan‑ kov, veliko prednosti v primerjavi s teh‑ nologijo kapilarne elektroforeze, ki se je uporabljala pred tem (49). S tehnologijo NGS je mogoče identificirati tudi močno razgrajene skeletne ostanke, pri čemer uporabimo identifikacijske označevalce SNP (50), katerih dolžina pomnoženih fragmentov je pod 150 baznih parov. Pri identifikaciji zgodovinskih oseb‑ nosti in drugih posameznikov bližnjih sorodnikov, ki bi bili najprimernejši za preiskovanje avtosomskih polimorfiz‑ mov, STR ali SNP ni več na razpolago. Namesto njih lahko uporabimo daljne sorodnike po materini ali očetovi liniji, pri čemer v preiskavo vključimo line‑ arne genetske označevalce mtDNA in kromosoma Y. Kromosom Y in mtDNA nam omogočata sledenje očetovi in ma‑ terini liniji (kromosom Y se namreč de‑ duje v nespremenjeni obliki od očeta na sinove, mtDNA pa se prav tako prenaša v nespremenjeni obliki na vse potomce, ne glede na spol). Ujemanje haplotipov kromosoma Y kaže na skupno predniško Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 179 Pregledni znanstveni članek poreklo po očetovi strani in mtDNA po materini strani. Zaradi enostarševskega dedovanja mtDNA in kromosoma Y ne prihaja do rekombinacije, razen v krat‑ kem, terminalnem predelu kromosoma Y, ki se rekombinira s kromosomom X (51). Pri identifikaciji zgodovinskih osebnosti lahko s kromosomom Y ali mtDNA kot referenčne vzorce uporabi‑ mo tudi več generacij oddaljene sorod‑ nike po očetovi ali materini liniji (52‑54). Če za identifikacijo zgodovinskih osebnosti in drugih posameznikov ni na razpolago daljnih sorodnikov, si lahko pomagamo s fenotipizacijo DNA (55). Gre za področje, ki se je razvilo pred kratkim in nam omogoča napoved zu‑ nanjih vidnih značilnosti posamezni‑ ka iz molekule DNA, npr. barvo oči in barvo las (56) in biogeografsko ali predniško poreklo (57). Tako izdelamo obrazno kompozicijo. Analize označe‑ valcev Y‑STR, Y ‑SNP ter kontrolne regije mtDNA in SNP mtDNA ter določitev haploskupin, preko katerih lahko dolo‑ čimo filogeografsko poreklo, so bile do nedavnega glavne metode za določanje predniškega porekla, saj so ti označeval‑ ci geografsko zelo diferencirani (58) in s povečevanjem filogenetske resolucije kromosoma Y raziskovalci v zadnjem času dokazujejo dodatno informativno‑ st tudi v zahodnoevropskih populaci‑ jah (59,60). Vendar pa nam dajejo prei‑ skave označevalcev na kromosomu Y in mtDNA le informacijo o očetovi in ma‑ terini liniji, saj niso podvrženi rekombi‑ naciji. Prikazujejo le delno sliko porekla, zlasti v primerih kompleksnega rodo‑ slovja posameznika. Nasprotno nam av‑ tosomski označevalci predniškega pore‑ kla ali biogeografski označevalci (angl. Ancestry Informative Markers, AIM), ki so široko razporejeni po avtosomih, za‑ gotavljajo popolnejšo sliko predniškega porekla in jih uporabljamo za določitev najverjetnejšega biogeografskega pore‑ kla ali izvora populacije, ki ji posame‑ znik pripada. Danes predstavljajo glavne označevalce za raziskovanje predniškega porekla posameznika (61). AIM so ge‑ netski polimorfizmi, večinoma enonu‑ kleotidni polimorfizmi – SNP, ki kažejo velike razlike v frekvencah alelov med različnimi etničnimi skupinami in jih lahko na osnovi tega genetsko razliku‑ jemo med seboj (62). Na genetsko po‑ reklo sklepamo iz primerjave genetske raznovrstnosti preiskovanega vzorca z vzorci raznovrstnosti v sodobnih po‑ pulacijah. Poleg odkrivanja rodoslovja posameznika, igrajo označevalci AIM tudi pomembno vlogo pri identifikaciji pogrešanih oseb in žrtev množičnih ne‑ sreč (63,64). V primerjavi z označevalci STR so označevalci AIM zelo kratki in jih je mogoče uporabiti za uspešno ge‑ notipizacijo vzorcev, pridobljenih iz zelo razgrajenih skeletnih ostankov z nizko vsebnostjo DNA (65). 6  Pr epr eč e v anje  kontaminacije in preverjanje avt entično s ti s t ar odavne  DNA Stari skeletni ostanki vsebujejo zelo malo DNA ali pa je ta močno razgra‑ jena, zato so arheološki skeleti zelo dovzetni za kontaminacijo s sodobno DNA (21). Pravilen pristop k izkopu skeletnih ostankov, antropološki obde‑ lavi in shranjevanju tovrstnega biološke‑ ga materiala je za uspešnost genetskih preiskav ključnega pomena. Nepravilni postopki pri rokovanju s skeletnimi os‑ tanki in njihovo neprimerno shranje‑ vanje lahko privedejo do kontaminacije in razgradnje endogene DNA kosti in zob. Posledica tega so napačni rezultati molekularnogenetskih analiz ali neu‑ spešna analiza (41). Ob izkopu skeletnih ostankov, njihovem čiščenju, antropolo‑ 180 Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 JAVNO ZDrAVS tVO (VAr StVO PrI DELU) ški preiskavi in shranjevanju je z vidika nadaljnjih genetskih preiskav potrebno upoštevati troje. Prvič! Pri izkopu je ob‑ vezna uporaba zaščitnih sredstev (zlasti čistih rokavic, mask za usta ter nos in zaščitnih oblačil), prav tako je njiho‑ va uporaba potrebna pri antropološki analizi (dodatno je potrebno razkuževa‑ nje delovne površine in inštrumentov). Drugič! Pri čiščenju skeletnih ostankov je potrebno upoštevati dejstvo, da umi‑ vanje skeletnih ostankov pred njihovim shranjevanjem zmanjša pH in koncen‑ tracijo soli v kosteh, kar negativno vpli‑ va na ohranitev DNA (16). Tretjič! Zelo pomembno je shranjevanje skeletnih ostankov po izkopu v primernih pogo‑ jih. Po Fultonu (66) je najprimernejši način za dolgoročno shranjevanje sta‑ rih skeletnih ostankov odvisen od tega, v kakšnih pogojih okolja so bili vzorci zbrani ob najdbi oziroma izkopu. Če je bil vzorec ob najdbi zamrznjen, je za shranjevanje najboljše vzdrževanje te temperature. Če je bil vzorec najden pri sobni temperaturi, ga je treba shraniti v hladnem in suhem okolju in ga ne zamr‑ zniti, zlasti če je predvidenih več ciklov zamrzovanja/odmrzovanja. Na splošno je izogibanje pogojem okolja, za katere je znano, da vplivajo na poškodbe DNA, ključnega pomena za ohranjanje vzorca. Idealno je hladno, suho, temperaturno stabilno okolje (66). DNA je dovzetna za poškodbe zaradi ponavljajočih se ciklov zamrzovanja in odmrzovanja, zato jo je treba odtajati čim manj pogosto (67). Izogibati se je potrebno vročini, zamrzo‑ vanju/odmrzovanju in vlagi (66). Pred genetsko preiskavo je najpogo‑ stejša površinska kontaminacija zaradi neprimernega rokovanja (prijemanje skeletnih ostankov brez zaščitnih roka‑ vic). Pride lahko tudi do kontaminacije globjih plasti, kar je odvisno od poroz‑ nosti in ohranjenosti skeletiziranih po‑ smrtnih ostankov (6,68). Površinsko kontaminacijo v genetskem laboratoriju odstranjujemo z različnimi metodami. Med njimi so najpogostejše spiranje v vodi, detergentu, kislini, etanolu ali be‑ lilu, obsevanje z UV‑svetlobo, pri kosteh fizično odstranjevanje površine in kot zadnja, pridobitev DNA iz materiala, odvzetega iz notranjosti kosti ali zoba. Za učinkovito odstranevanje površin‑ ske kontaminacije se običajno uporablja različna kombinacija naštetih tehnik. Kosti v laboratorijih najpogosteje očis‑ timo mehansko in kemično, medtem ko pri zobeh mehansko čiščenje nadomesti obsevanje z UV‑svetlobo. Tako zniža ‑ mo količino prisotne kontaminirajoče DNA in količino inhibitorjev (69). Kosti očistimo s fizičnim odstranjevanjem po‑ vršine, pri čemer uporabimo brusilno napravo in jih speremo z detergentom, vodo in etanolom. Odstranimo površin‑ sko plast kosti, da zmanjšamo kontami‑ nacijo, do katere pride zaradi neposre‑ dnega rokovanja s kostmi pred genetsko preiskavo. Do kontaminacije starodavne DNA z moderno človeško DNA pa lahko pride tudi med genetskimi preiskavami, obi‑ čajno zaradi nepravilnega postopanja z vzorci brez uporabe zaščitnih sredstev (rokavic, kirurških mask, zaščitnih če‑ pic, zaščitnih plaščev, zaščitnih prevlek za čevlje), lahko pa je kontaminacija posledica prisotnosti eksogene DNA v reagentih, na materialih ali v zra‑ ku, kjer se DNA veže na aerosole (70) . Starodavna DNA je močno razgrajena in količinsko zelo omejena, zato je mož‑ nost njene kontaminacije s sodobno DNA zelo velika (41,70). Pri delu s staro ‑ davno DNA je v laboratoriju ključnega pomena preprečevanje in zaznava kon‑ taminacije s sodobno DNA ter upošte‑ vanje meril za preverjanje istovetnosti starodavne DNA (41,69) . Med učinkovi‑ tostjo pomnoževanja in dolžino pomno‑ ženih produktov mora biti pri starodav‑ Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 181 Pregledni znanstveni članek ni DNA obratnosorazmerna povezava, ki kaže razgrajenost in poškodovanost starodavne DNA (41). Istovetnost sta ‑ rodavnih sekvenc lahko preverimo tudi z vzorcem poškodb molekule DNA in mutacijami, ki so značilne za starodav‑ no DNA (41). Da bi se v čim večji meri izognili laboratorijski kontaminaciji, je potrebno vzorce kosti in zob obdelovati in iz njih ekstrahirati DNA v ločenem la‑ boratoriju, ki je izključno namenjen ob‑ delavi starih skeletnih ostankov. Prostori za obdelavo skeletnih vzorcev, ekstrak‑ cijo DNA in pripravo reakcij PCR mo‑ rajo biti strogo ločeni od prostorov, kjer se izvajajo t. i. postopki “post‑ PCR” (69) . Laboratorij mora biti opremljen s komo‑ rami s Hepa‑filtri, ki preprečujejo vnos kontaminacijske DNA. Pri postopku ekstrakcije je potrebno uporabiti zašči‑ tna oblačila, laboratorijske površine pa je potrebno čistiti z belilom in obsevati z UV‑ svetlobo (41). Za prepoznavanje morebitnega izvora kontaminacije je pomembno, da vzpostavimo eliminacij‑ sko zbirko genetskih profilov vseh oseb, ki so rokovale z vzorci vse od izkopa in skozi nadaljnje analize, da lahko potr‑ dimo pravilnost oziroma avtentičnost genetskih profilov, pridobljenih iz pre‑ učevanih vzorcev. Če je le mogoče, je potrebno tipizirati enake genetske ozna‑ čevalce kot pri starodavni DNA tudi pri laboratorijskih delavcih, muzejskem osebju, antropologih in arheologih, ki so prišli v stik s skeletnimi ostanki. Poleg tega je pomembno tudi, da hkrati z vsa‑ ko serijo vzorcev analiziramo negativno kontrolo, slednjo pa je potrebno vključiti tudi v vsako reakcijo PCR, da preveri‑ mo in identificiramo morebitni vzrok kontaminacije kakega od prej upora‑ bljenih reagentov in materialov (41). Iz istega vzorca je potrebno DNA ekstra‑ hirati vsaj dvakrat in pri tipizaciji obeh ekstraktov dobiti identično zaporedje DNA (41). 7  Pridobitev starodavne DNA iz skeletnih ostankov Visoko učinkovite ekstrakcijske me‑ tode so osnova za raziskovanje in prido‑ bitev kakršnih koli genetskih podatkov iz starodavnih bioloških materialov, saj je za uspešno genetsko preiskavo pot‑ rebno pridobiti zadostne količine dovolj kakovostne DNA (10,14). Kot so pokaza‑ le zadnje študije, je pri starih skeletnih ostankih za pridobitev DNA najprimer‑ nejša popolna demineralizacija, saj omo‑ goča iz arheoloških vzorcev pridobitev večjih količin DNA (71‑73). Pri izolaciji DNA je potrebno paziti, da se izognemo izpostavljanju vzorcev visokim tempera‑ turam, močnim detergentom ali obde‑ lavi z drugimi agresivnimi postopki, saj tako preprečimo nadaljnjo razgradnjo starodavne DNA (69). Za čim uspešnej‑ šo demineralizacijo je ključnega pome‑ na, da zmeljemo kosti in zobe v kar se da fini prah in tako omogočimo, da je čim večja površina vzorca v stiku s ke‑ lacijsko raztopino (69). Mletje izvedemo s pomočjo homogenizatorja in tekočega dušika; s slednjim hladimo vzorce in ko‑ vinske komore za mletje ter tako prepre‑ čimo pregrevanje. Postopek dekalcifika‑ cije z 0,5 M EDTA omogoči ločevanje celic kosti od kostne mase (74). EDTA močno veže kalcij in tako omogoča de‑ mineralizacijo (69). Za popolno demi ‑ neralizacijo 1 g prahu kosti ali zob je pot‑ rebnih 15 ml 0,5 M EDTA (75). Oborini, dobljeni po demineralizaciji, dodamo ekstrakcijski pufer za lizo, proteinazo K (endolitična serinska proteaza, ki cepi proteine na posamezne aminokisline) in DTT (reducent, ki cepi disulfidni most med cisteinskima ostankoma v protei‑ nu). Po inkubaciji pridobimo lizat z ek‑ strahirano DNA. V starih skeletih je pri‑ sotnih veliko inhibitorjev reakcije PCR, zato moramo ekstrahirano DNA očistiti. Pri vzorcih kosti, izkopanih iz zemlje, so 182 Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 JAVNO ZDrAVS tVO (VAr StVO PrI DELU) najpogostejši inhibitorji reakcije PCR huminske in flavinske kisline in kalcijev klorid (76). Inhibitorji reakcije PCR pre‑ prečujejo vezavo polimeraze na verigo DNA, zato jih je potrebno za učinkovito pomnoževanje v reakciji PCR v čim večji meri odstraniti. DNA očistimo s pomoč‑ jo naprave Biorobot EZ1 (Qiagen) (77), ki temelji na vezavi molekul DNA na površino magnetnih delcev, prevlečenih s silicijem; vezava poteka v prisotnosti kaotropičnih soli. Naprava magnetne delce z vezanimi molekulami DNA od preostanka lizata loči z magnetom, nato pa magnetne delce spira in DNA eluira z vodo ali s pufrom (77). Tak način čišče‑ nja je pri starodavni DNA zelo učinko‑ vit. Prisotnost inibitorjev reakcije PCR v ekstrahirani DNA kosti lahko preverimo z reakcijo qPCR, ki omogoča hkratno kvantifikacijo jedrne DNA, moške DNA, določitev stopnje razgrajenosti DNA in prisotnost inhibitorjev reakcije PCR v izolatih (45). Glede na to, da so skeletni ostanki iz arheoloških najdišč izpostav‑ ljeni neugodnim vplivom okolja, lahko pričakujemo močno razgrajenost DNA. Pri takih vzorcih je ključnega pomena oceniti količino in kakovost DNA, ki je na voljo za genetsko preiskavo. Za oceno stopnje razgrajenosti DNA na istem lo‑ kusu pomnožujemo dva različno dolga fragmenta. Razmerje med količino krat‑ kega in dolgega fragmenta nam omogo‑ ča oceno kakovosti DNA preko izraču‑ na degradacijskega indeksa. Z reakcijo qPCR tako prepoznamo vzorce kosti, ki bi jih uspešneje preiskovali z alternativ‑ nimi genotipizacijskimi označevalci, npr. z označevalci SNP kot s konvencionalno tipizacijo področij STR (45). Za uspešne preiskave starodavne DNA moramo poleg napredne tehnike ekstrakcije in čiščenja DNA uporabiti tudi pomnoževalne komplete, ki imajo večjo toleranco do inhibitorjev reakcije PCR ter so bolj občutljivi in bolj robu‑ stni (78). Takšni so kompleti, ki so na trgu zadnjih nekaj let. Starejši komple‑ ti, ki se še zmeraj uporabljajo, so manj učinkoviti pri pomnoževanju starodav‑ ne DNA. 8  Primeri preiskav starodavne DNA v Sloveniji Na Inštitutu za sodno medicino smo leta 2007 popolnoma prenovili prostore Molekularnogenetskega laboratorija in pridobili ločen laboratorij, ki je izključ‑ no namenjen obdelavi starih skeletnih ostankov. Prav tako pa smo pred krat‑ kim pridobili nov laboratorij za pripravo vzorcev za masivno paralelno sekvenci‑ ranje – tehnologijo, s katero smo se opre‑ mili. Po priporočilih, ki sta jih opisala za preiskave starodavne DNA Rohland in Hofreiter (69), je za to, da se bi izognili laboratorijski kontaminaciji, potrebno vzorce kosti in zob obdelovati in iz njih ekstrahirati DNA v ločenem laborato‑ riju, ki je izključno namenjen obdelavi starih skeletnih ostankov. Prostori za obdelavo skeletnih vzorcev, ekstrakcijo DNA in pripravo reakcij PCR morajo biti strogo ločeni od prostorov, kjer se izvajajo t. i. “post‑PCR” postopki (69). Vse preiskave arheoloških skeletov op‑ ravljamo v skladu s priporočili za prei‑ skave starodavne DNA, ki smo jih opisali v poglavju Preprečevanje kontaminacije in preverjanje avtentičnosti starodavne DNA. Leta 2004 smo začeli s preiska‑ vami starih forenzičnih skeletov (zlasti iz obdobja druge svetovne vojne), pri čemer smo najprej veliko časa vložili v optimizacijo ekstrakcijskega postopka. Izkušnje, ki smo jih pridobili pri genet‑ skih raziskavah skeletnih ostankov iz slovenskih povojnih množičnih grobišč, so nam v veliko pomoč pri razvijanju metod za molekularnogenetske preiska‑ ve veliko starejših skeletnih ostankov iz arheoloških najdišč. Tako smo leta 2011 Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 183 Pregledni znanstveni članek opravili molekularnogenetsko preiska‑ vo skeletov iz Auerspergove kapele iz 17. stoletja (44). Leta 2017 smo pridobi ‑ li raziskovalni projekt, ki ga financira Slovenska agencija za raziskovalno de‑ javnost (J3–8214 – Določitev najprimer - nejših skeletnih elementov za molekular- nogenetsko identifikacijo starih človeških posmrtnih ostankov), katerega glavni cilj je ponovna ocena veljavnih svetovnih priporočil za izbiro dolgih kosti nog in zob za tipizacijo in na osnovi doblje‑ nih rezultatov sprememba priporočene strategije vzorčenja skeletnih elemen‑ tov za genetsko identifikacijo skeletnih ostankov. Po dosedanjih študijah se na‑ mreč DNA ohrani najdlje in najbolje v dolgih kosteh, zlasti stegnenicah in zo‑ beh (24‑27) (pri arheoloških skeletih v skalnici) (33), zato se po veljavnih pri‑ poročilih za genetsko identifikacijo ske‑ letnih ostankov vzorčijo dolge kosti nog (stegnenice) in zobje (24‑27) (pri arheo‑ loških skeletih skalnice) (33). Najnovejše študije na sorazmerno svežih skeletih so pokazale, da bi bile za genetsko identi‑ fikacijo primernejše drobne kosti dlani in stopal (17,28‑30), zato pri starih ske‑ letnih ostankih v okviru projekta razi‑ skujemo, ali so drugi skeletni elementi, kot so stegnenice in zobje (arheološki skeleti skalnice), primernejši za genet‑ sko identifikacijo posameznika. Te kosti je enostavneje vzorčiti, saj za vzorčenje ne potrebujemo žage, kar zmanjša mož‑ nost kontaminacije s sodobno DNA. Za primerjavo uspešnosti pridobitve DNA iz različnih skeletnih elementov v okvi‑ ru projekta uporabljamo skelete iz ob‑ dobja druge svetovne vojne in skelete iz različnih arheoloških najdišč. Skelete iz obdobja druge svetovne vojne je v svoji magistrski nalogi z naslovom »Uporaba različnih skeletnih elementov za genet‑ sko identifikacijo žrtev druge svetovne vojne« preiskoval Marcel Obal (8). Pri treh skeletih iz povojnega grobišča je obdelal 56 skeletnih elementov na posa ‑ mezni skelet in pridobil največje količine DNA iz stopalnic in dlančnic. Skeleti iz povojnih grobišč in arheoloških najdišč nam služijo kot modeli slabo ohranjenih skeletnih ostankov, izsledke raziskav pa bomo lahko aplicirali na rutinske sodno‑ medicinske primere molekularnogenet‑ skih identifikacij skeletov. Raziskovalni projekt temelji na potrebi po hitrem in učinkovitem vzorčenju skeletnih ele‑ mentov in uspešni pridobitvi jedrnih ge‑ netskih profilov za identifikacijo pogre‑ šanih oseb in žrtev množičnih katastrof. V okviru projekta je bil sklenjen dogovor z Javnim zavodom Republike Slovenije za varstvo kulturne dediščine za pridobi‑ tev skeletnih ostankov iz slovenskih ar‑ heoloških najdišč, pri čemer so arheolo‑ gi povzorčili pri 17 skeletih približno 20 skeletnih elementov, zlasti dlani in stopal (ter za primerjavo stegnenice, skalnice in zobe). V okviru opisanega raziskovalne‑ ga projekta, ki je v teku, smo opravili fa‑ kultetno Prešernovo nalogo, z naslovom Določitev primernosti drobnih kosti nog in rok za molekularnogenetsko tipizacijo starih skeletnih ostankov, ki je bila na‑ grajena s fakultetno Prešernovo nagrado Medicinske fakultete za leto 2017 (79). Arheološke skelete smo vključili tudi v študijo, pri kateri smo ugotavljali, kakšna je možnost uporabe reagentov za kvanti‑ tativno reakcijo PCR in določanje koli‑ čine ter razgrajenosti DNA za napoved uspešnosti tipizacije jedrnih mikrosate‑ litov (45). Zanimalo nas je tudi, ali lahko z genetskimi metodami starim skeletom določimo barvo las in oči (80). Vsako od naštetih raziskav bomo v nadaljevanju podrobneje opisali. Leta 2009 so arheologi na tržni‑ ci v Ljubljani v stranski kapeli cerkve Frančiškanskega samostana, za katero je znano, da je bila Auerspergova grob‑ nica, izkopali pet skeletov iz 17. stoletja. Ob vznožju enega od skeletov so našli 184 Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 JAVNO ZDrAVS tVO (VAr StVO PrI DELU) kovinsko posodo s srcem, na kateri je bilo vgravirano ime Ferdinand II. in le‑ tnici rojstva in smrti (1655–1706). Leta 2011 smo na Inštitutu za sodno medicino po naročilu Mestnega muzeja Ljubljana opravili molekularnogenetsko preiska‑ vo skeletov iz Auerspergove kapele (44). Skeleti so bili slabo ohranjeni, kosti so razpadle na majhne koščke. Le pri dveh skeletih so bili ohranjeni fragmen‑ ti stegnenic in zobje, pri ostalih smo za molekularnogenetsko preiskavo upora‑ bili dele lobanj. Iz več kot 300 let starih zob skeleta 4 smo uspeli pridobiti jedrno DNA za uspešno tipizacijo označevalcev STR avtosomske DNA in kromosoma Y. Uspeli smo pridobiti kompleten moški genetski profil jedrne avtosomske DNA, skoraj kompleten haplotip kromosoma Y, ki nam omogoča sledenje očetovi li‑ niji in primerjavo s še živečimi potomci po očetovi strani in haplotip mtDNA, ki nam omogoča sledenje materini liniji in primerjavo s še živečimi potomci po ma‑ terini strani. Dobljeni genetski profili se niso ujemali s profili oseb iz eliminacijske podatkovne zbirke. Med učinkovitostjo pomnoževanja in dolžino pomnoženih produktov smo dokazali obratnosoraz‑ merno povezavo, kar potrjuje njihovo avtentičnost (44). Da bi lahko skelet, za katerega smo pridobili genetske profile, identificirali, bi morali profile primerjati s še živečimi neposrednimi potomci po očetovi ali materini liniji. Primerjalnih družinskih vzorcev do danes žal še nis‑ mo prejeli. Zelo pomembno je, da se pre‑ iskave starodavne DNA dobro načrtuje‑ jo, da jih je dejansko možno izpeljati do konca. V okviru Prešernove naloge z naslo‑ vom Določitev primernosti drobnih kosti nog in rok za molekularnogenetsko tipi- zacijo starih skeletnih ostankov smo leta 2017 opravili pilotsko študijo, v katero smo vključili 13 skeletov iz različnih slo‑ venskih arheoloških najdišč. Najstarejši skelet je bil iz 3. stoletja, najmlajši iz 18. stoletja. Za posamezen arheološki ske‑ let smo v preiskavo vključili 6 skeletnih elementov (senčnico, stegnenico, zob, dlančnico, stopalnico in prstnico), iz ka‑ terih smo pridobili starodavno DNA, jo kvantificirali in tipizirali z avtosomskimi označevalci STR. Dobljene genetske pro‑ file smo ovrednotili na osnovi števila us‑ pešno pomnoženih označevalcev STR. S statistično obdelavo smo ugotovili, da so za genetske preiskave starodav‑ nih skeletnih ostankov primerne tudi drobne kosti dlani in stopal. Količina ohranjene starodavne DNA iz senčnic, zob in stegnenic je bila primerljiva s tis‑ to iz drobnih kosti končnih delov udov. Enako je veljalo za uspešnost tipizacije označevalcev STR, ki je bila primerljiva med preiskovanimi skeletnimi elemen‑ ti. Ugotovili smo, da bi bilo za genetske preiskave starodavnih skeletov smiselno poleg senčnic, stegnenic in zob vzorči‑ ti tudi stopalnice, dlančnice in prstni‑ ce (79). Dobljeni genetski profili se niso ujemali s profili oseb iz eliminacijske podatkovne zbirke. Med učinkovitostjo pomnoževanja in dolžino pomnoženih produktov smo dokazali obratno soraz‑ merno povezavo, kar potrjuje njihovo avtentičnost (79). S tehniko qPCR smo z določitvi‑ jo količine DNA in njene razgrajenosti uspeli napovedati uspešnost genetskih preiskav jedrnih označevalcev STR v starodavnih skeletnih ostankih in skele‑ tih iz obdobja druge svetovne vojne (45). Za starodavno DNA je zelo pomembna pridobitev čim večjega števila informa‑ cij o izolirani DNA, saj imamo opravka z močno poškodovanimi molekulami, katerih preiskave označevalcev STR so težavne in drage. Zato je pred postop‑ kom tipizacije označevalcev STR smi‑ selno poleg informacije o količini izoli‑ rane DNA pridobiti tudi informacijo o njeni kakovosti. S tem namenom smo Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 185 Pregledni znanstveni članek uporabili najnovejši, visoko informativ‑ ni qPCR komplet PowerQuant System (Promega). Z njim smo določili količi‑ no skupne jedrne DNA, količino moške DNA, ki nam omogoča določitev spola, in stopnjo razgrajenosti DNA, ki nam pove, kako dolge fragmente imamo v izo‑ latu. Pridobljeni podatki so nam služili za oceno uspešnosti tipizacije označe‑ valcev STR. Namen preiskave je bil pre‑ veriti, ali lahko kvantifikacijski komplet PowerQuant uporabimo kot presejalno metodo za uspešnost tipizacije ozna‑ čevalcev STR pri starih skeletih in tako napovedati uspešnost tipizacije področij STR. Ugotovili smo, da lahko z upora‑ bo tega kompleta, ki je bistveno cenejši od kompletov za pomnoževanje podro‑ čij STR, napovemo uspešnost tipizacije področij STR pri starih kosteh (45). S fenotipizacijo DNA, ki omogoča napoved zunanjih vidnih lastnosti po‑ sameznika iz molekule DNA, smo 60 skeletom iz obdobja druge svetovne voj‑ ne uspeli določiti barvo oči in las (80). Preiskovali smo označevalce SNP siste‑ ma HIrisPlex in pri vseh, razen pri enem skeletu, smo kljub starosti skeletnih ostankov ekstrahirano DNA uspešno ti‑ pizirali in pridobili informacijo o barvi oči in las in dokazali možnost njihove uporabe za identificiranje žrtev druge svetovne vojne (80). V pripravi je prei‑ skava, pri kateri bomo barvo oči in las določili večjemu številu starodavnih ske‑ letov, katerih starost je od 200 do 1.700 let, pri čemer bomo uporabili tehnologi‑ jo NGS. 9  Z akl juč ek V prispevku smo se osredinjali na molekularnogenetske preiskave staro‑ davne DNA, pridobljene iz človeških skeletnih ostankov, in ugotovili, da je po dosedanjih študijah v arheogenetiki najprimerneje vzorčiti skalnico senčni‑ ce (33) in vzorce shranjevati v hladnem in suhem okolju (66). Ker je v arheo‑ loških bioloških materialih zelo malo DNA in je močno poškodovana, se zlasti pri delu s starodavnimi človeškimi vzor‑ ci pojavijo težave, povezane s kontami‑ nacijo s sodobno DNA človeka. Zato je za zmanjšanje tveganja kontaminacije nujno upoštevati večje število standar‑ dnih previdnostnih ukrepov in prever‑ janje avtentičnost starodavne DNA (69). Področje raziskovanja starodavne DNA z genetskimi metodami je v zadnjih letih z uporabo tehnologije NGS naredilo velik preboj, saj lahko z uporabo nove tehno‑ logije preiskujemo bolj razgrajeno DNA in s tem starejše arheološke biološke ma‑ teriale. V uporabi nove tehnologije vidi‑ mo velik potencial za nadaljnje preiskave starodavne DNA pri nas (v tujini te pre‑ iskave v vrhunskih laboratorijih že nekaj časa potekajo), saj nam bodo omogočale preiskave količinsko izredno skromnih in razgrajenih vzorcev. Za identifikaci‑ je in ugotavljanje sorodstvenih povezav bomo lahko uporabljali identifikacijske označevalce SNP , katerih dolžina ne pre‑ sega 150 baznih parov (50). S tehnologijo NGS bomo lahko preiskovali fenotipske označevalce SNP , s katerimi bomo lahko določili barvo las in oči (56), a tudi bi‑ ogeografsko ali predniško poreklo (57) arheoloških skeletov. Tudi fenotipski in biogeografski označevalci SNP so bistve‑ no krajši in obetajo dobre rezultate pri preiskavah razgrajenih vzorcev staro‑ davne DNA (56,57). S tehnologijo NGS bomo veliko hitreje in enostavneje pre‑ iskovali označevalce SNP kromosoma Y in mtDNA starodavnih skeletov in do‑ ločali haploskupine, preko katerih lahko določimo filogeografsko poreklo, saj so ti označevalci geografsko zelo diferenci‑ rani (58). Zaradi zaprtih sistemov bodo te preiskave manj podvržena kontami‑ naciji in zato bolj primerne za analize človeške starodavne DNA. Pri mtDNA 186 Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 JAVNO ZDrAVS tVO (VAr StVO PrI DELU) bomo lahko preiskovali ne le kontrolno regijo, ampak tudi celoten mitohondrij‑ ski genom (81). Molekularnogenetske preiskave sta‑ rodavne DNA so v Sloveniji v povojih. Nekaj opravljenih preiskav je spod‑ budnih, za hitrejši razvoj tega področja pa bo vsekakor potreben interes in delo večjega števila raziskovalcev ter zadostno financiranje dragih preiskav. Prav tako bo potrebno v arheološki, konzervator‑ ski in muzejski stroki izdelati natančne smernice za ravnanje s posmrtnimi os‑ tanki, kadar obstajajo možnosti za pre‑ iskave starodavne DNA izkopanih ar‑ heoloških vzorcev ter skrbno načrtovati smiselne preiskave. Arheogenetika je in‑ terdisciplinarna veda, pri kateri je za sin‑ tezo in razumevanje vseh zbranih podat‑ kov potrebno sodelovanje strokovnjakov različnih področij. Arheogenetika tako danes zahteva tesno sodelovanje med molekularno genetiko, bioinformati‑ ko, arheologijo in paleozoologijo (49). Zaradi velikega pomena povezovanja in sodelovanja različnih strok bi bilo najprimerneje pridobiti vire financiranja interdisciplinarnih projektov, ki bi ob sodelovanju različnih inštitucij smiselno povezali rezultate različnih strok in pri‑ vedli do celostne interpretacije doblje‑ nih rezultatov. 10  Zahvala Za sodelovanje pri preiskavah sta‑ rodavne DNA se zahvaljujem Matiji Črešnarju (Oddelek za arheologi‑ jo Filozofske fakultete Univerze v Ljubljani in Javni zavod Republike Slovenije za varstvo kulturne dedišči‑ ne) in Tamari Leskovar (Oddelek za ar‑ heologijo Filozofske fakultete Univerze v Ljubljani) za pridobivanje dovoljenj in vzorčenje arheoloških skeletov. Živi Geršak (Medicinska fakulteta Univerze v Ljubljani) za raziskovalno delo v okviru študentske raziskovalne Prešernove na‑ loge (Določitev primernosti drobnih kosti nog in rok za molekularnogenetsko tipiza- cijo starih skeletnih ostankov) ter Barbari Gornjak Pogorelc in Katji Vodopivec Mohorčič za pomoč pri molekularno‑ genetskih preiskavah starodavne DNA v Laboratoriju za molekularno genetiko Inštituta za sodno medicino Medicinske fakultete Univerze v Ljubljani. Izredna zahvala gre Marcelu Obalu za preiskavo skeletov iz obdobja druge svetovne vojne in natančen ter obširen pregled relevan‑ tne literature, ki jo delno povzemam v preglednem članku. Zahvaljujem se tudi Komisiji Vlade Republike Slovenije za reševanje vprašanj prikritih grobišč za opravljene izkope žrtev druge svetovne vojne. Del študij, opisanih v preglednem članku je sofinancirala Javna agenci‑ ja za raziskovalno dejavnost Republike Slovenije (ARRS) iz državnega prora‑ čuna (projekt Določitev najprimernejših skeletnih elementov za molekularnoge- netsko identifikacijo starih človeških po - smrtnih ostankov, št. J3–8214 in program Metabolni in prirojeni dejavniki repro- duktivnega zdravja, porod II, št. P3–0124). Literatura 1. Márquez-grant n, Webster H, t ruesdell J, Fibiger l. Physical anthropology and Osteoarchaeology in euro- pe: History, Current t rends and Challenges. int J Osteoarchaeol. 2016;26(6):1078–88. 2. Bouwman a, rühli F. archaeogenetics in evolutionary medicine. J Mol Med (Berl). 2016 sep;94(9):971–7. 3. Baum da, Futuyma dJ, Hoekstra He, l enski re, Moore Ja, Peichel Cl, et al. the Princeton guide to evoluti- on. Princeton: Princeton University Press; 2013. pp. 477–9. 4. Hagelberg e, Quevedo s, t urbon d, Clegg JB. dna from ancient easter islanders. nature. 1994 May;369(6475):25–6. Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 187 Pregledni znanstveni članek 5. ingman M, kaessmann H, Pääbo s, gyllensten U. Mitochondrial genome variation and the origin of modern humans. nature. 2000 dec;408(6813):708–13. 6. sampietro Ml, gilbert Mt , lao O, Caramelli d, lari M, Bertranpetit J, et al. t racking down human contami- nation in ancient human teeth. Mol Biol evol. 2006 sep;23(9):1801–7. 7. Cooper a, Poinar Hn. ancient dna: do it right or not at all. science. 2000 a ug;289(5482):1139. 8. Obal M. Uporaba različnih skeletnih elementov za genetsko identifikacijo žrtev druge svetovne vojne [Master's thesis]. ljubljana: M. Obal; 2018. 9. ziętkiewicz e, Witt M, daca P, z ebracka-gala J, goniewicz M, Jarząb B, et al. Current genetic methodologies in the identification of disaster victims and in forensic analysis. J appl genet. 2012 Feb;53(1):41–60. 10. irwin Ja, Just rs, l oreille OM, Parsons tJ. Characterization of a modified amplification approach for impro- ved str recovery from severely degraded skeletal elements. Forensic sci int genet. 2012 sep;6(5):578–87. 11. anderung C, Persson P, Bouwman a, elburg r, götherström a. Fishing for ancient dna. Forensic sci int genet. 2008 Mar;2(2):104–7. 12. z upanič Pajnič i. Molekularnogenetska identifikacija skeletnih ostankov. Med razgl. 2013;52:213–34. 13. Campos PF, Craig Oe, t urner-Walker g, Peacock e, Willerslev e, gilbert Mt . dna in ancient bone - where is it located and how should we extract it? ann anat. 2012 Jan;194(1):7–16. 14. Putkonen Mt , Palo JU, Cano JM, Hedman M, sajantila a. Factors affecting the str amplification success in poorly preserved bone samples. investig genet. 2010 Oct;1(1):9. 15. Higgins d, austin JJ. t eeth as a source of dna for forensic identification of human remains: a review. sci Justice. 2013 dec;53(4):433–41. 16. Pruvost M, schwarz r, Correia vB, Champlot s, Braguier s, Morel n, et al. Freshly excavated fossil bones are best for amplification of ancient dna. Proc natl acad sci U sa. 2007 Jan;104(3):739–44. 17. Mundorff a, davoren JM. examination of dna yield rates for different skeletal elements at increasing post mortem intervals. Forensic sci int genet. 2014 Jan;8(1):55–63. 18. Hofreiter M, serre d, Poinar Hn, k uch M, Pääbo s. ancient dna. nat r ev genet. 2001 May;2(5):353–9. 19. kendall C, Høier eriksen aM, kontopoulos i, Collins MJ, t urner-Walker g. diagenesis of archaeological bone and tooth. Paleogeogr Palaeocl. 2018;491:21–37. 20. Mansour H, krebs O, sperhake JP , augustin C, koehne t , amling M, et al. Cementum as a source of dna in challenging forensic cases. J Forensic l eg Med. 2018 Feb;54:76–81. 21. kemp BM, smith dg. Use of bleach to eliminate contaminating dna from the surface of bones and teeth. Forensic sci int. 2005 nov;154(1):53–61. 22. Coulson-thomas YM, norton al, Coulson- thomas vJ, Florencio-silva r, ali n, elmrghni s, et al. dna and bone structure preservation in medieval human skeletons. Forensic sci int. 2015 Jun;251:186–94. 23. t urner-Walker g. the chemical and microbial degradation of bones and teeth. in: Pinhasi r, Mays s: advan- ces in Human Palaeopathology. John Wiley and sonds l td, 2008:1-29. 24. siriboonpiputtana t , rinthachai t , shotivaranon J, Peonim v, r erkamnuaychoke B. Forensic genetic analysis of bone remain samples. Forensic sci int. 2018 Mar;284:167–75. 25. Miloš a, selmanović a, smajlović l, Huel rl, katzmarzyk C, rizvić a, et al. success rates of nuclear short tandem repeat typing from different skeletal elements. Croat Med J. 2007 aug;48(4):486–93. 26. Prinz M, Carracedo a, Mayr Wr, Morling n, Parsons tJ, sajantila a, et al.; international society for Forensic genetics. dna Commission of the international society for Forensic genetics (isF g): recommendations regarding the role of forensic genetics for disaster victim identification (dvi). Forensic sci int genet. 2007 Mar;1(1):3–12. 27. edson sM, r oss JP, Coble Md, Parsons tJ, Barritt sM. naming the dead - Confronting the r ealities of rapid identification of degraded skeletal r emains. Forensic sci r ev. 2004 Jan;16(1):63–90. 28. Mundorff az, Bartelink eJ, Mar-Cash e. dna preservation in skeletal elements from the World t rade Center disaster: recommendations for mass fatality management. J Forensic sci. 2009 Jul;54(4):739–45. 29. andronowski JM, Mundorff az, Pratt iv, davoren JM, Cooper dM. evaluating differential nuclear dna yield rates and osteocyte numbers among human bone tissue types: A synchrotron radiation micro-Ct approa- ch. Forensic sci int genet. 2017 May;28:211–8. 30. Hines dz, vennemeyer M, amory s, Huel rl, Hanson i, katzmarzyk C, et al. Prioritizing sampling of bone and teeth for dna analysis in commingled cases. in: adams BJ, Byrd Je, editors. Commingled Human r emains: Methods in r ecovery, analysis, and identification. Oxford: elsevier science; 2014. pp. 275–305. 31. Pilli e, vai s, Caruso Mg, d’errico g, Berti a, Caramelli d. neither femur nor tooth: petrous bone for identi- fying archaeological bone samples via forensic approach. Forensic sci int. 2018 Feb;283:144–9. 32. Hansen HB, damgaard PB, Margaryan a, stenderup J, l ynnerup n, Willerslev e, et al. Comparing ancient dna Preservation in Petrous Bone and t ooth Cementum. Pl os One. 2017 Jan;12(1):e0170940. 33. Pinhasi r, Fernandes d, sirak k, novak M, Connell s, alpaslan-r oodenberg s, et al. Optimal ancient dna yields from the inner ear part of the human petrous bone. Pl os One. 2015;18:10(6):e0129102. 34. gamba C, Jones er, t easdale Md, Mclaughlin rl, gonzalez-Fortes g, Mattiangeli v, et al. genome flux and stasis in a five millennium transect of european prehistory. nat Commun. 2014 Oct;5(1):5257. 35. Jamieson a, Bader s. a guide to forensic dna profiling, Wiley, Hoboken, nJ, 2016:5-6, 15-18, 32-34, 37-38, 108-109, 115-117. 36. Butler JM. Forensic dna t yping: Biology, t echnology, and genetics of str Markers, 2nd edition, elsevier, zda, 2005:86-90. 188 Zdrav Vestn | marec – april 2020 | Letnik 89 JAVNO ZDrAVS tVO (VAr StVO PrI DELU) 37. anderson s, Bankier at , Barrell Bg, de Bruijn MH, Coulson ar, drouin J, et al. sequence and organization of the human mitochondrial genome. nature. 1981 apr;290(5806):457–65. 38. Fisher dl, Holland MM, Mitchell l, sledzik P s, Wilcox aW, Wadhams M, et al. extraction, evaluation, and amplification of dna from decalcified and undecalcified United states Civil War bone. J Forensic sci. 1993 Jan;38(1):60–8. 39. Holland MM, Fisher dl, Mitchell lg, r odriquez WC, Canik JJ, Merril Cr, et al. Mitochondrial dna sequence analysis of human skeletal remains: identification of remains from the vietnam War. J Forensic sci. 1993 May;38(3):542–53. 40. Hopwood aJ, Mannucci a, sullivan kM. dna typing from human faeces. int J l egal Med. 1996;108(5):237–43. 41. Pääbo s, Poinar H, serre d, Jaenicke-despres v, Hebler J, r ohland n, et al. genetic analyses from ancient dna. annu r ev genet. 2004;38(1):645–79. 42. Palo JU, Hedman M, söderholm n, sajantila a. r epatriation and identification of the Finnish World War ii soldiers. Croat Med J. 2007 aug;48(4):528–35. 43. z upanič Pajnič i, gornjak Pogorelc B, Balažic J. Molecular genetic identification of skeletal remains from the second World War konfin i mass grave in slovenia. int J l egal Med. 2010 Jul;124(4):307–17. 44. z upanič Pajnič i. Molecular genetic analyses of 300-year old skeletons from auersperg tomb [in slovenian]. z drav vestn. 2013;82:796–808. 45. z upanič Pajnič i, z upanc t , Balažic J, geršak ŽM, stojković O, skadrić i, et al. Prediction of autosomal str typing success in ancient and second World War bone samples. Forensic sci int genet. 2017 Mar;27:17–26. 46. z upanič Pajnič i, Petaros a, Balažic J, geršak k. searching for the mother missed since the second World War. J Forensic l eg Med. 2016 nov;44:138–42. 47. Cattaneo C, Craig Oe, James nt , sokol r J. Comparison of three dna extraction methods on bone and blood stains up to 43 years old and amplification of three different gene sequences. J Forensic sci. 1997 nov;42(6):1126–35. 48. Pilli e, Boccone s, agostino a, virgili a, d’errico g, lari M, et al. From unknown to known: identification of the remains at the mausoleum of fosse ardeatine. sci Justice. 2018 nov;58(6):469–78. 49. knapp M, lalueza-Fox C, Hofreiter M. r e-inventing ancient human dna. investig genet. 2015 May;6(1):4. 50. Mehta B, daniel r, Phillips C, Mcnevin d. Forensically relevant snaPshot® assays for human dna snP analysis: a review. int J l egal Med. 2017 Jan;131(1):21–37. 51. Balding d. Weight-of-evidence for Forensic dna Profiles. West sussex, england: John Wiley & sons; 2005. pp. 50–1. 52. gill P , ivanov Pl, kimpton C, Piercy r, Benson n, t ully g, et al. identification of the remains of the r omanov family by dna analysis. nat genet. 1994 Feb;6(2):130–5. 53. Jehaes e, t oprak k, vanderheyden n, Pfeiffer H, Cassiman JJ, Brinkmann B, et al. Pitfalls in the analysis of mitochondrial DNA from ancient specimens and the consequences for forensic DNA analysis: the historical case of the putative heart of l ouis Xvii. int J l egal Med. 2001 dec;115(3):135–41. 54. king te, Fortes gg, Balaresque P , thomas Mg, Balding d, Maisano delser P , et al. identification of the rema- ins of king richard iii. nat Commun. 2014 dec;5(1):5631. 55. kayser M, de knijff P. improving human forensics through advances in genetics, genomics and molecular biology. nat r ev genet. 2011 Mar;12(3):179–92. 56. Walsh s, liu F, Wollstein a, kovatsi l, ralf a, kosiniak-kamysz a, et al. the HirisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from dna. Forensic sci int genet. 2013 Jan;7(1):98–115. 57. Phillips C, Prieto l, Fondevila M, salas a, gómez-t ato a, alvarez-dios J, et al. ancestry analysis in the 11-M Madrid bomb attack investigation. Pl os One. 2009 a ug;4(8):e6583. 58. karafet tM, Mendez Fl, Meilerman MB, Underhill P a, z egura sl, Hammer MF. new binary polymorphisms reshape and increase resolution of the human Y chromosomal haplogroup tree. genome r es. 2008 May;18(5):830–8. 59. larmuseau MH, vanderheyden n, van geystelen a, van Oven M, kayser M, decorte r. increasing phylogene- tic resolution still informative for Y chromosomal studies on West-european populations. Forensic sci int genet. 2014 Mar;9:179–85. 60. larmuseau MH, Otten gP , decorte r, van damme P , Moisse M. defining Y-snP variation among the Flemish population (Western europe) by full genome sequencing. Forensic sci int genet. 2017 nov;31:e12–6. 61. kosoy r, nassir r, tian C, White P a, Butler lM, silva g, et al. ancestry informative marker sets for determi- ning continental origin and admixture proportions in common populations in america. Hum Mutat. 2009 Jan;30(1):69–78. 62. espregueira themudo g, smidt Mogensen H, Børsting C, Morling n. Frequencies of Hid-ion ampliseq an- cestry panel markers among greenlanders. Forensic sci int genet. 2016 sep;24:60–4. 63. Phillips C, salas a, sánchez JJ, Fondevila M, gómez-t ato a, alvarez-dios J, et al.; snPforid Consortium. inferring ancestral origin using a single multiplex assay of ancestry-informative marker snPs. Forensic sci int genet. 2007 dec;1(3-4):273–80. 64. kidd kk, speed WC, Pakstis aJ, Furtado Mr, Fang r, Madbouly a, et al. Progress toward an efficient panel of snPs for ancestry inference. Forensic sci int genet. 2014 May;10:23–32. 65. silvia al, shugarts n, smith J. a preliminary assessment of the Forenseq™ F gx system: next generation sequencing of an str and snP multiplex. int J l egal Med. 2017 Jan;131(1):73–86. 66. Fulton l t . ancient dna - Methods and Protocols: setting up an ancient dna laboratory. nJ: Humana Press inc; 2012. pp. 1–11. Molekularnogenetski vidiki preiskav starodavne DNA 189 Pregledni znanstveni članek 67. lindahl t . instability and decay of the primary structure of dna. nature. 1993 apr;362(6422):709–15. 68. salamon M, t uross n, arensburg B, Weiner s. r elatively well preserved dna is present in the crystal aggre - gates of fossil bones. Proc natl acad sci U sa. 2005 sep;102(39):13783–8. 69. r ohland n, Hofreiter M. ancient dna extraction from bones and teeth. nat Protoc. 2007;2(7):1756–62. 70. graham ea. dna reviews: ancient dna. Forensic sci Med Pathol. 2007 sep;3(3):221–5. 71. Jakubowska J, Maciejewska a, Pawłowski r. Comparison of three methods of dna extraction from human bones with different degrees of degradation. int J l egal Med. 2012 Jan;126(1):173–8. 72. amory s, Huel r, Bilić a, l oreille O, Parsons tJ. automatable full demineralization dna extraction procedure from degraded skeletal remains. Forensic sci int genet. 2012 May;6(3):398–406. 73. z upanič Pajnič i, debska M, gornjak Pogorelc B, vodopivec Mohorčič k, Balažic J, z upanc t , et al. Highly efficient automated extraction of dna from old and contemporary skeletal remains. J Forensic l eg Med. 2016 Jan;37:78–86. 74. Bender k, schneider PM, rittner C. application of mtdna sequence analysis in forensic casework for the identification of human remains. Forensic sci int. 2000 sep;113(1-3):103–7. 75. l oreille OM, diegoli tM, irwin Ja, Coble Md, Parsons tJ. High efficiency dna extraction from bone by total demineralization. Forensic sci int genet. 2007 Jun;1(2):191–5. 76. ewing MM, thompson JM, Mclaren rs, Purpero vM, thomas kJ, dobrowski Pa, et al. Human dna quanti- fication and sample quality assessment: developmental validation of the PowerQuant(®) system. Forensic sci int genet. 2016 Jul;23:166–77. 77. z upanič Pajnič i. extraction of dna from Human skeletal Material. in: goodwin W: Forensic dna t yping Protocols. Methods in Molecular Biology. Humana Press, new York, nY, 2016;1420:89-108. 78. z upanič Pajnič i, gornjak Pogorelc B, Balažic J, z upanc t , Štefanič B. Highly efficient nuclear dna typing of the World War II skeletal remains using three new autosomal short tandem repeat amplification kits with the extended european s tandard set of loci. Croat Med J. 2012 Feb;53(1):17–23. 79. geršak ŽM. določitev primernosti drobnih kosti nog in rok za molekularno genetsko tipizacijo starih ske- letnih ostankov [fakultetna Prešernova naloga]. ljubljana: ŽM. geršak; 2017. 80. Chaitanya l, Pajnič iz, Walsh s, Balažic J, z upanc t , kayser M. Bringing colour back after 70 years: predicting eye and hair colour from skeletal remains of World War ii victims using the HirisPlex system. Forensic sci int genet. 2017 Jan;26:48–57. 81. strobl C, eduardoff M, Bus MM, allen M, Parson W. evaluation of the precision id whole Mtdna genome panel for forensic analyses. Forensic sci int genet. 2018 Jul;35:21–5.